5. Kinetika reakce enzymu se substrátem
parametry vlim (vmax) a KM, jejich význam odvození odvození rovnice Michaelise a Mentenové Mentenové metody stanovení stanovení parametrů parametrů MM rovnice software pro enzymovou kinetiku integrovaná integrovaná forma MM rovnice
Rychlost (v ) chemické reakce k v = k[A][B] A + B ⎯⎯→ AB jednotky rychlosti: mol l-1 s-1 k … kinetická kinetická rychlostní rychlostní konstanta, jednotky rů různé zné 1 1 1 (s , mol l s ) - tak, aby vž vždy vyš vyšly sprá správné vné jednotky pro rychlost c b a
signál
start
měří se počáteční rychlost (a) je sprá správně vně
čas
1
Chemická rovnováha
k1 ⎯⎯→ A + B ←⎯ ⎯⎯ AB k −1 rovnová rovnováha:
v1 = k1[ A][ B] v−1 = k −1[ AB]
v1 = v−1 = k1[ A][ B] = k−1[ AB]
kinetická kinetická rovnová rovnovážná asociač č n í konstanta: asocia kinetická kinetická rovnová rovnovážná disociač disociační konstanta:
KA = KD =
k [ AB] = 1 [ A ][ B] k −1
[ A][ B] k −1 −1 = = KA k1 [AB]
Řád reakce a molekularita
0. řádu 1. řádu 2. řádu
v = kc 0 = k v = kc v = kc 2 nebo v = kc AcB
monomolekulární bimolekulární
A⎯ ⎯→
A + B⎯ ⎯→ nebo A + A ⎯ ⎯→
pseudomonomolekulární
A + B⎯ ⎯→ pokud A >> B např. A je voda
2
Enzymová reakce rychlost zá závisí visí na koncentraci substrá substrátu pokud se za obvyklých podmí podmínek ([E] ([E] ~ 1 nM, [S] ~ 0.1 až 1 mM) mM) měří ěří kolem 60 s, tak spotř spotřeba substrá substrátu dosá dosáhne pouze ně několik procent - poč počáteč teční rychlost enzymové enzymové reakce
Reakce enzymu s jedním substrátem
k1
k2 ⎯⎯⎯ ⎯→ ES ⎯⎯→ E+S← E+P k −1
nejprve vzniká vzniká komplex enzymenzym-substrá substrát ES, který se ná následně sledně rozpadá rozpadá - buď buď za vzniku produktu, nebo zpě zpět do výchozí výchozího stavu zají zajímá nás rychlost vzniku produktu:
v ≡ v2 = k2 [ES]
zná známe ale pouze výchozí výchozí koncentrace [E] a [S], koncentraci [ES] nezná á me nezn předpoklad: vznik ustá ustálené leného stavu (steady(steady-state), kdy se koncentrace ES v čase nemě nemění (ale neví nevíme, jaká jaká je… je…); zavedli 1925 Briggs a Haldane platí platí, že rychlost vzniku ES je stejná stejná jako rychlosti rozpadu:
d [ES] =0 dt
v1 = v−1 + v2
3
Je ustálený stav oprávněný?
c (M) dc/d c/dt (M/s)
simulace: k1 = 106 M-1 s-1 k-1 = 1000 s-1 k2 = 10 s-1 [E]0 = 10-7 M [S]0 = 0.01 M t (s)
po krátké přechodové době (1 ms) ano
k1[E ][S] = k−1[ ES] + k2 [ES]
… takž akže po dosazení dosazení: zvá zvážení ení látkové tkové bilance enzymu:
[E] = [E]0 − [ES]
k1 ([E]0 − [ES])[S] = (k −1 + k 2 )[ES]
osamostatně osamostatnění [ES]:
k1[E ]0 [S] + k1[ES][S] = (k −1 + k 2 )[ ES] k1[ E]0 [S] = [ES](k −1 + k 2 + k1[S]) [ES] =
a dosazení dosazení do rovnice pro rychlost vzniku produktu:
[E ]0 [S] k1[E ]0 [S] = k −1 + k 2 + k1[S] k −1 + k 2 + [S] k1
maximální rychlost Vmax v = k 2 [ES] =
Michaelisova konstanta Km
k 2 [E ]0 [S] k −1 + k 2 + [S] k1
4
Km pokud je rozpad ES na produkt limitují limitujícím krokem, tj. platí platí k2 << k-1, tak se Km blí blíží výrazu k-1/k1, což což je vlastně vlastně disociač disociační konstanta KD pro komplex ES (neplatí (neplatí to ale př příliš liš obecně obecně…)
Rovnice Michaelise a Mentenové
v=
Vmax [S] K m + [S]
1913 Leonor Michaelis a Maud Mentenov á polož Mentenová položili základy teorie reakce enzymu se substrá á tem substr pro [S]=K [S]=Km dostá dostáváme úpravou v=Vmax/2 pro [S]<
>K konstantní v=Vmax (saturace [S]>>Km je rychlost konstantní enzymu substrá substrátem) k2 se často nazývá nazývá kcat pomě poměr kcat/Km reprezentuje specificitu dané daného enzymu, vlastně ě m á význam rychlostní í konstanty: vlastn rychlostn
v=
k cat [E]0 [S] Km
5
Závislost počáteční rychlosti enzymové reakce na koncentraci substrátu Vmax
lim v = vlim
v
[ S ]→∞
Vmax 2
[0,0]
= Vmax
hyperbola (asymptoty pro v=Vmax a [S]=[S]=-Km) KM
[S]
Vlim … limitní limitní rychlost (obč (občas alternativně alternativně) Vmax … maximá maximální lní rychlost (Vmax-v)(K )(Km+[S])=V +[S])=VmaxKm … rovnice hyperboly
Enzymy a difuse k2 kk = 1 2 ≤ k 1 ≤ kdif = 4000πN A ( DE + DS )( rE + rS ) K m k −1 + k2 pro výraz k2/Km je limitují limitující rychlost vzniku komplexu ES, tj. konstanta k1 ta je zase limitová limitována četností etností srá srážek mezi molekulami enzymu a substrá substrátu, danou konstantou kdif některé které enzymy dosahují dosahují katalytické katalytického maxima… maxima…
6
Jak určit parametry MM rovnice ze závislosti počáteční rychlosti v0 na (počáteční) koncentraci [S] [S]
v0
chyba
1.0
5.2
0.4
1.5
6.4
0.2
2.0
8.1
0.6
3.0
9.5
0.5
5.0
13.2 1
7.0
13.9 0.6
10.0 14.8 1.2
15
v0 10
5
0
0
5
[S]
10
naměř ená á a zná naměřen znázorně zorněná data
Klasické "grafické" metody transformace MM rovnice na rovnici př přímky y=a+bx metoda dle Lineweavera a Burka - dvojná dvojnásobný reciproký výnos - převrá evrácená cená MM rovnice
1 K m + [S] Km 1 = = + v Vmax [S] Vmax [S] Vmax
1 1 K 1 = + m v Vmax Vmax [S] y
úsek
smě směrnice x
7
Další transformace Eadie a Hofstee (Scatchard)
1 v Vmax = − v [S ] Km Km
Hanes a Woolf (reciproká (reciproká MM rovnice x [S]) [S])
[S] K m 1 = + [S] v Vmax Vmax Woolf, Augustinson a Hofstee (reciproká (reciproká MM x vVmax)
v = Vmax − K m
v [S]
Přímý výnos (Cornish a Bowden)
15
v0 10
parametry Km a Vmax odpoví odpovídají dají -x-ové é a yové ov y ové souř souřadnici mediá mediánu prů průseč sečíků
5
0
0
5
[S]
10
8
Nelineární regrese programy pro zpracová zpracování vědeckých dat zadají ená á data, zadá zadají se naměř naměřen zadá se vhodný model program urč určí parametry tak, aby vypoč vypočtená tená závislost byla co nejblí eným datů ch čtverců nejblíže naměř naměřeným datům (metoda nejmenší nejmenších tverců) přímo implementová implementováno v enzymologických programech
15
v0 Data: Data1_C Model: Hyperbl Equation: y = P1*x/(P2 + x) Chi^2/DoF = 0.22472 R^2 = 0.98726
10
P1 P2
5
0
5
19.51472 ± 0.86862 2.86976 ± 0.32181
[S]
Vmax = 19.51 ± 0.87 Km = 2.87 ± 0.32
10
Software pro enzym. kinetiku Dynafit -
NLLS analýza kinetiky
(enzym, chem., ligandligand-receptor) - vstupní v0), nebo vstupní data ([S], ([S],v přímo časové asové záznamy zadá zadá se př přímo model procesu vč včetně etně rychlostní rychlostních konstant: Monomer + Monomer <==> Enzyme : k1 k2 Enzyme + Inhibitor <==> Complex : k3 k4 Enzyme + Substrate <==> ReactiveX : k5 k6 ReactiveX --> --> Product + Enzyme : k7 k8
program konstanty urč určí, pod Windows, na bá bázi skriptů skriptů akademická akademická licence zdarma
http://biokin.com/dynafit/index.html
9
Enzyme Kinetics!Pro http://www.chemsw.com/16029.htm
(300 USD, lze demo)
další… EZEZ-Fit http://www.jlc.net/~fperrell/webps04.htm 250 USD Systan - enzym. modul pro SigmaPlot http://www.systat.com/downloads/?sec=d0012 VisualEnzymics (SoftZymics) http://softzymics.com/index.htm 100 - 350 USD Enzyme Lab - virtuá virtuální lní enzymová enzymová laboratoř laboratoř, J. Chem. Educ. http://jchemed.chem.wisc.edu/JCESoft/Issues/Series_D/5D1/pro g1g1-5D1.html "ká "kádinka" s pufrem, enzymem a substrá substrátem, mí míchadlo a fotometr KINSIM (simulace) a FITSIM (hledá (hledání parametrů parametrů) http://www.biochem.wustl.edu /cflab/message.html
10
Srovnání metod jeden soubour naměř ených hodnot ([S],v) naměřených ([S],v) byl vyhodnocen různými metodami, nalezené nalezené parametry:
Metoda LineweaverLineweaver-Burk 1/v - 1/[S]
Vmax (umol
l-1
min-1)
29 ± 15 (52)
Woolf, Augustinson, Hofstee, 20,3 ± 4,9 v - v/[S] (24) Hanes a Woolf [S]/v - [S]
27,3 ± 5,4 (20) 25,4 ± 4,0 (16)
Nelineá Nelineární rní regrese
Km (mM) 2,9 ± 1,6 (55) 1,7 ± 0,6 (35) 2,6 ± 0,7 (27) 2,33 ± 0,55 (24)
zpracová zpracování má vliv na př přesnost i sprá správnost
Když probíhá zpětná reakce… k1 k2
⎯⎯⎯ ⎯→ E + P ⎯⎯⎯ ⎯→ ES ← E+S← k −1
k −2
k1k2 [S] − k −1k −2 [ P] [ E ]0 k1[S] + k2 [ P] + k −1 + k −2 r s Vmax Vmax [S] − [ P] K m ,S K m ,P za rovnováhy v=0: v= [S] [ P] r + +1 [ P]eq Vmax / K m ,S k2 / K m ,S K m ,S K m ,P v = k2 [ ES] − k −2 [ E][ P] =
K=
[S]eq
= s = Vmax / K M ,P k −2 / K M ,P
Haldanův vztah - souvislost mezi termodynamikou a kinetikou enzymové katalysy
11
Když není [S] konstantní… úbytek substrá eníí nelze zanedbat (> substrátu v prů průběhu měř měřen (> cca 5%) neměř neměříí se poč počáteč teční rychlost když když reakce běž běžíí ireverzibilně ireverzibilně (neprobí (neprobíhá zpě zpětná tná reakce), lze sledovat úbytek koncentrace substrá substrátu - označ označí se x (platí (platí vlastně vlastně x = [P] př při stechiometrii 1:1) [S]0
start
sleduje se kontinuá kontinuálně lně koncentrace substrá substrátu (např (např. barevný fotometricky) v reakč reakční smě směsi s enzymem v urč určitých intervalech se zaznamená zaznamená jeho úbytek výsledek měř eníí - soubor měřen hodnot (t (ti, xi)
x1
[S]
x2
t0=0 t1 x0=0
t2
čas t
Integrovaná MM rovnice do MM vztahu se dosadí dosadí aktuá aktuální lní koncentrace substrá substrátu pro daný okamž okamžik: v
=
dx Vmax ([S]0 − x ) = dt K m + ([S]0 − x )
diferenciá diferenciální lní rovnice, řeší se integrací integrací (separace promě proměnných, meze poč počátek [0,0] až až po obecně obecně [t,x]) t ⎛ Km ⎞ ∫0 ⎜⎜⎝ [S]0 − x + 1⎟⎟⎠dx = Vmax ∫0 dt x
[ − K m ln([ S ]0 − x ) + 1]0x = Vmax [t ]t0 K m ln
K m ln
[S]0 + x = Vmax t [S]0 − x
[S]0 + [ P] = Vmaxt [S]0 − [ P]
alternativní alternativní forma, zá záměna x ≈ [P]
12
Integ. MM pro určení parametrů provede se linearizace: V 1 [S]0 1 x ln = max − t [S]0 − x K m K m t dostatek bodů bodů se zí získá ská v prů eníí průběhu jediné jediného měř měřen
Vmax/Km
-1/Km (smě (směrnice) (1/t)ln [([S]0)/([S]0-x)] 1/t)ln[([S] Další Další aplikace Integ. MM - "plá "plánová nování" enzymové enzymové reakce [0,0] - řešení ení otá otázek typu za jak dlouho zreaguje pož požadovaná adovaná část substrá substrátu, kolik enzymu se musí musí přídat, aby za daný čas s danou aktivitou max zreagovalo žádané dané množ množství ství S - vztah aktivita a max. rychlost:
V
=
Prestacionární kinetika užiteč itečná při řešení ení slož složitě itějších ších mechanismů mechanismů
d[ P] = k2 [ ES] dt
Vmax
x/t
a V
k1[S]([ E ]0 − [ ES])
d[ ES] = k1[ E]0 [S] − ( k1[S] + k −1+ k2 )[ ES] dt
d 2 [ P] d[ ES] = k2 = k2k1[ E]0 [S] − ( k1[S] + k −1+ k2 )k2 [ ES] 2 dt dt d 2 [ P] d[ P] + ( k1[ S ] + k −1 + k2 ) − k1k2 [ E]0 [S] = 0 2 dt dt pokud [S] ≈ [S]0 = konst., tak lze integrovat
tlag =
[P]
1 k1[ S ] + k −1 + k2 prodleva
t
13
