17
3. METODOLOGI PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2011 sampai Maret 2012. Penelitian ini dilakukan di beberapa laboratorium yaitu, Laboratorium Kimia Pangan, SEAFAST Center, Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Analisis Pangan Departemen ITP, Institut Pertanian Bogor.
3.2 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel makanan berupa daging ayam bagian dada dengan berat per unit sampel 300 g, ikan bawal dengan berat per ekor 300 g, bumbu kuning (terdiri atas kunyit, lengkuas, bawang putih, bawang merah, kemiri, merica, garam, dan jahe) yang digunakan untuk penyiapan ayam panggang dan ikan bakar, standar komponen PAH, yaitu benzo(a)piren (BAP) dan dibenzo(a,h)antrasen (DBA), asetonitril HPLC-grade, diklorometan p.a., toluena, n-heksana p.a., akuades Mili-Q grade, NaOH, kolom solid phase extraction, yaitu kolom ekstrelut Merck® (diatomaceus earth), kolom PRS (propylsulphonic acid silica) dari SiliCycle® (SiliCycle Inc. Canada), dan silica gel for HPLC Merck®. Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas, pipet volumetrik, pipet mikro, alat pemanggang dengan menggunakan arang briket untuk penyiapan ikan bakar dan ayam panggang, food processor. Sedangkan peralatan yang digunakan untuk analisis PAH adalah instrumen HPLC Agilent 1200 series dengan detektor MWD merk Agilent yang diset pada panjang gelombang UV (Agilent Technologies, USA) dan kolom ODS (C18) dengan panjang 15cm, diameter 4.6 mm dan ukuran partikel 5 µm.
3.3 Tahapan Penelitian Penelitian dilakukan dalam tiga tahapan seperti yang ditunjukkan pada Gambar 3. Tahapan pertama adalah validasi metode analisis PAH (secara simultan untuk BAP dan DBA) dengan tandem SPE dan HPLC meliputi uji linearitas, uji kesesuaian sistem, penentuan limit of detection (LOD), penentuan limit of quantification (LOQ), akurasi uji recovery, dan uji repeatability. Tahapan
18
kedua dan ketiga adalah optimasi proses pembuatan ikan bakar dan ayam panggang yang rendah kandungan PAH dengan melakukan pengujian pada kombinasi konsentrasi bumbu yang digunakan, jarak pemanasan, dan lama pemanasan
3.4 Tahap Pertama: Validasi Metode Ekstraksi PAH Validasi metode analisis polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) dilakukan dengan cara melakukan uji linearitas dengan standar adisi dalam sampel, penentuan limit of detection (LOD), penentuan limit of quantification (LOQ), uji kesesuaian sistem, akurasi uji recovery, dan uji presisi atau repeatabilty dengan mengikuti metode EURACHEM (1998). Validasi dilakukan pada metode analisis yang dimulai dari tahap ekstraksi dengan SPE hingga analisis PAH dengan menggunakan HPLC-UV.
3.4.1 Uji linearitas Uji linearitas dilakukan dengan analisis hasil ekstraksi larutan standar PAH pada matriks pangan yang di-spiking dengan 7 konsentrasi PAH berbeda. Larutan standar
PAH
yang
digunakan
adalah
benzo(a)piren
(BAP)
dan
dibenzo(a,h)antrasen (DBA). Linearitas diukur dengan menggunakan nilai R 2 yang didapat dari plot antara luas area peak dari HPLC-UV dengan konsentrasi (dalam ppm atau µg/mL) untuk masing-masing BAP dan DBA. Nilai linearitas yang diharapkan adalah lebih dari 0.990.
3.4.2 Limit of detection dan limit of quantification instrumen Nilai limit of detection (LOD) dan limit of quantification (LOQ) instrumen ditentukan dengan menggunakan standar BAP dan DBA. Dilakukan enam penentuan dengan injeksi menggunakan konsentrasi 2 ug/mL kemudian diinjeksikan ke HPLC-UV. Hasil pengukuran kemudian diplotkan ke dalam kurva standar (masing-masing untuk BAP dan DBA) yang didapatkan dengan cara injeksi langsung standar PAH. Standar deviasi (SD) dari keenam penentuan tersebut dihitung. Nilai LOD alat dinyatakan sebagai 3 kali standar deviasi, sedangkan LOQ adalah 10 kali standar deviasi.
19
3.4.3 Uji kesesuaian sistem Uji kesesuaian sistem ditentukan dengan cara melakukan enam kali injeksi standar dengan konsentrasi tertentu dari larutan standar BAP dan DBA ke dalam sistem HPLC-UV. Larutan standar BAP dan DBA yang digunakan adalah 2 ppm. Kemudian dihitung standar deviasi dan standar deviasi relatif (RSD) dari waktu retensi dan luas area hasil pengukuran dengan menggunakan HPLC-UV. Nilai standar deviasi relatif yang diperbolehkan menurut JECFA adalah 2%.
3.4.4 Uji recovery dan repeatabilty Uji recovery dilakukan dengan menggunakan sampel ayam panggang dan ikan bakar yang di-spike (ditambahkan) dengan larutan standar Benzo(a)piren (BAP) dan Dibenzo(a,h)antrasen (DBA) pada konsentrasi yang telah diketahui. Konsentrasi yang digunakan pada penelitian ini adalah 5 µg/g atau 5 ppm. Percobaan spiking dilakukan sebanyak 7 ulangan. Sampel yang di-spiking ini kemudian mengalami proses ekstraksi dan clean up sama seperti sampel tanpa spiking dan dianalisis kandungan PAH dengan HPLC-UV. Recovery dari metode dapat dihitung dengan rumus: Recovery (%) = konsentrasi yang ditemukan – konsentrasi tanpa spiking x 100% konsentrasi spiking Dari 7 ulangan yang didapat, dihitung rata-rata recovery dan standar deviasi relatif (RSD). Nilai RSD ini digunakan sebagai repeatability dari metode ekstraksi.
3.5 Tahap Kedua:
Optimasi kombinasi variasi pembumbuan, lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap kandungan PAH ikan bakar
Formulasi bumbu ikan bakar dilakukan dengan menggunakan bumbu kuning yang sudah umum digunakan oleh pedagang ikan dan ayam panggang. Pembuatan ikan bakar dilakukan dengan menggunakan alat pemanggang dengan sumber panas dari briket batu bara. Penentuan kombinasi konsentrasi bumbu, jarak pemanasan dan lama pemanasan dilakukan dengan menggunakan desain response surface methodology (RSM) dengan variabel independen seperti terlihat pada Tabel 2. Presentase bumbu merupakan perbandingan konsentrasi bumbu dengan berat basah daging ikan maupun ayam.
20
Proses pembakaran dilakukan pada suhu 250-300 °C. Pengukuran suhu pembakaran dilakukan pada 6 titik sebanyak 4 kali selama proses pembakaran (Gambar 4). Ikan yang digunakan adalah ikan bawal berukuran 250-300 g. Bumbu kuning yang digunakan terdiri dari kunyit (2.5% dari total berat bumbu), lengkuas (15.0%), bawang putih (12.5%), bawang merah (50.0%), kemiri (2.5%), merica (2.5%), garam (2.5%), dan jahe (2.5%). Bumbu yang digunakan dalam pembuatan ikan bakar juga digunakan dalam pembuatan ayam panggang. Respon yang digunakan untuk optimasi proses pembakaran adalah konsentrasi BAP, DBA dan total PAH, kadar air, dan intensitas warna (nilai L dan °Hue). Tahap akhir adalah verifikasi respon dari kombinasi perlakuan yang dihasilkan dari software. Tabel 2 Variabel independen yang digunakan dalam desain RSM Simbol
Variabel Independen
A
Nilai minimum
maksimum
Jarak Pemanasan
2.0 cm
8.0 cm
B
Lama Pemanasan
28 menit
40 menit
C
Konsentrasi bumbu
0%
15.0%
* Konsentrasi bumbu yang digunakan dihitung dari bobot ikan atau ayam mentah
3.6 Tahap Ketiga:
Optimasi kombinasi variasi pembumbuan, lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap kandungan PAH ayam panggang
Formulasi bumbu ayam panggang dilakukan dengan menggunakan bumbu yang sudah umum digunakan oleh pedagang di pinggir jalan. Bumbu yang akan digunakan untuk ayam panggang adalah bumbu kuning yang sama dengan bumbu yang digunakan pada tahap 2. Pembuatan ayam panggang dilakukan dengan menggunakan alat pemanggang (Gambar 4) dengan sumber panas dari briket batu bara. Penentuan kombinasi konsentrasi bumbu, jarak pemanasan, dan lama pemanasan dilakukan dengan menggunakan desain percobaan response surface methodology (RSM) dengan variabel independen kombinasi bumbu, lama pemanasan, dan jarak pemanasan seperti terlihat pada Tabel 2. Jumlah ulangan dan pengacakan didapat melalui program Design Expert® 8. Sebelum dilakukan proses pembakaran, ayam terlebih dahulu dikukus selama 30 menit mengikuti proses yang biasa dilakukan di masyarakat dan penjual ayam panggang.
21
21
Tahapan Penelitian
Kegiatan
Luaran
Tahap I: Validasi metode ekstraksi polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) dengan menggunakan ekstraksi solid phase extraction (SPE) dan analisis dengan HPLC-UV
Validasi metode ekstraksi meliputi uji linearitas, penentuan limit of detection (LOD), Penentuan limit of quantification (LOQ), uji recovery dan uji repeatability.
Diperoleh nilai koefisien linearitas metode, LOD alat, LOQ metode, recovery metode dan repeatabilitas metode
Tahap II: Studi efek kombinasi dari variasi pembumbuan, lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap kandungan PAH ikan bakar
Pengujian pengaruh kombinasi dari variasi penambahan bumbu, lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap PAH dari ikan bakar. PAH diekstraksi dengan metode SPE dan dianalisis dengan HPLC-UV.
Kadar dibenzo(a,h)antrasen (DBA) dan benzo(a)piren (BAP) dari ikan bakar pada berbagai variasi pembumbuan, lama pemanasan, dan jarak pemanasan
Tahap III: Studi efek kombinasi dari variasi pembumbuan, lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap kandungan PAH ayam panggang
Pengujian pengaruh kombinasi dari variasi penambahan bumbu, lama pemanasan, dan jarak pemanasan terhadap kadar PAH dari ayam panggang. PAH diekstraksi dengan metode SPE dan dianalisis dengan HPLCUV.
Kadar dibenzo(a,h)antrasen (DBA) dan benzo(a)piren (BAP) dari ayam panggang pada berbagai variasi pembumbuan, lama pemanasan, dan jarak pemanasan
Gambar 3 Diagram alir tahapan penelitian. 21
22
Gambar 4 Alat pembakaran yang digunakan pada penelitian. 3.7 Analisis Optimasi 3.7.1 Perancangan percobaan response surface methodology Perancangan percobaan dilakukan dengan menggunakan bantuan software Design Expert® 8. Penentuan proses pembakaran optimum dilakukan dengan menggunakan rancangan Response Surface. Desain percobaan yang digunakan pada Design Expert® 8 adalah Box-Behnken. Tahapan awal percobaan adalah menentukan faktor dalam percobaan dan respons yang akan diamati. Faktor yang akan dioptimasi adalah jarak dan lama pemanasan, serta konsentrasi bumbu yang digunakan. Respon yang dianalisis adalah konsentrasi BAP, DBA dan total PAH (ng/g sampel), analisis warna (L dan °Hue), dan kadar air. Penentuan jarak, lama, dan konsentrasi bumbu yang akan diujikan dilakukan dengan melakukan beberapa uji coba pendahuluan dan dilakukan pengamatan perbandingan. Dari hasil uji pendahuluan didapatkan kisaran minimum dan maksimum untuk masing-masing faktor percobaan adalah jarak pemanasan 2-8 cm, lama pemanasan 28-40 menit, dan konsentrasi bumbu 0-15%. Kisaran jarak pemanasan, lama pemanasan dan konsentrasi bumbu pada optimasi pembakaran ayam dan ikan mengikuti rancangan pada Tabel 3. 3.7.2 Analisis permodelan dan optimasi Setelah didapat seluruh respon yang diperlukan, dilakukan analisis hubungan antara masing-masing respon dengan parameter independen yang digunakan dan dibuat permodelannya dengan menggunakan software Design Expert® 8. Program Design Expert® 8 akan memberikan persamaan matematika yang sesuai pada masing-masing input respon penelitian. Persamaan matematika yang terdapat pada software ini adalah mean, linear, quadratic, dan cubic.
23
Tabel 3 Rancangan percobaan optimasi proses pembakaran Jarak Pemanasan (cm) 5.0 2.0 2.0 8.0 5.0 5.0 5.0 8.0 5.0 5.0 5.0 8.0 5.0 2.0 2.0 8.0 5.0
Lama Pemanasan (menit) 34 28 34 40 40 40 34 34 34 34 28 28 28 34 40 34 34
Konsentrasi bumbu (%) 7.5 7.5 0 7.5 0 15.0 7.5 15.0 7.5 7.5 0 7.5 15.0 15.0 7.5 0 7.5
Penentuan persamaan matematik yang akan digunakan didasarkan pada analisis ANOVA dari model (dalam hal ini hasil signifikan pada uji signifikansi model dan tidak signifikan pada uji lack of fit). Selain itu dilakukan perbandingan nilai “adjusted R-squared” dan “predicted R- squared” dari model yang dihasilkan. Model kemudian ditampilkan dalam countour-plot grafik 2 Dimensi dan 3 Dimensi. Analisis lanjut dilakukan pada grafik kenormalan residual dan perbandingan prediksi model dan nilai aktual. Seluruh model yang dihasilkan digunakan untuk penentuan optimasi proses untuk reduksi PAH pada software Design Expert® 8. Optimasi dilakukan dengan menentukan target dari masing-masing respon yang diharapkan. Target yang ditenukan dapat berupa in range, maksimum, minimum, atau target pada nilai tertentu. Selain itu ditentukan importance dari respon yang ditentukan dengan range 1-5 dimana 1 adalah rendah dan 5 paling tinggi. Formula optimasi ditentukan oleh nilai desirability atau kesesuaian formula yang dihasilkan dengan target yang ditentukan. Nilai desirability ditunjukkan dengan nilai 0-1 dimana semakin tinggi nilai desirability, semakin sesuai proses optimum dengan yang diinginkan.
24
Tahap akhir adalah verifikasi respon yang dihasilkan oleh proses optimum. Verifikasi dilakukan dengan membandingkan hasil respon aktual dengan perkiraan dari proses optimum oleh Design Expert® 8. Verifikasi proses optimum diterima jika nilai aktual masuk ke dalam kisaran 95% prediction interval. 3.8 Analisis Statistik Analisis korelasi dilakukan pada respon (BAP, DBA, total PAH, L, °Hue, kadar air) yang dihasilkan pada proses optimasi pembuatan ayam dan ikan bakar. Analisis korelasi dilakukan dengan analisis pearson correlation dengan menggunakan software SPSS 17®. 3.9 Analisis Kimia 3.9.1 Pengukuran kadar air (AOAC 2005) Pengukuran kadar air dilakukan dengan menimbang sampel daging yang telah dihomogenkan sebanyak 1 g ke dalam cawan yang telah dikeringkan. Cawan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam oven dengan suhu 110 °C selama 3 jam kemudian didinginkan dengan cara dimasukkan ke dalam desikator selama 15 menit. Sampel kemudian ditimbang lalu dimasukkan kembali ke dalam oven selama 30 menit dan didinginkan. Pengeringan dengan oven dihentikan saat didapat bobot yang stabil. Kadar air sampel dihitung menggunakan rumus berikut:
kadar air
(berat cawan sampelawal ) (berat cawan sampelsetelah oven ) 100% (berat cawan sampelawal ) berat cawan kosong
3.9.2 Pengukuran intensitas warna dengan chromameter CR-300 Analisis warna dilakukan dengan menggunakan alat Minolta Chromameter CR-300. Sebelum dilakukan pengukuran nilai L, a, dan b, dilakukan kalibrasi alat menggunakan plat standar putih. Kemudian sampel diukur di 4 titik pengukuran. Nilai °Hue dihitung menggunakan rumus °Hue = tan-1 (rasio (nilai b/nilai a)). Hubungan °Hue dan warna sampel ditunjukkan pada Tabel 4.
25
Tabel 4 Hubungan °Hue dan warna sampel. ˚Hue 18˚ - 54˚ 54˚ - 90˚ 90˚ - 126˚ 126˚ - 162˚ 162˚ - 198˚ 198˚ - 234˚ 234˚ - 270˚ 270˚ - 306˚ 306˚ - 342˚ 342˚ - 18˚
Warna Sampel Merah merah-kuning kuning kuning-hijau hijau hijau-biru biru biru-ungu ungu merah-ungu
Sumber: Hutching (1999).
3.9.3 Analisis PAH Ekstraksi dan clean-up komponen PAH dengan teknik solid phase extraction (SPE) (Modifikasi Janoszka et al. 2004 dan Riverra et al. 1996) Masing masing sampel daging, baik ayam panggang maupun ikan bakar, dihomogenkan dengan menggunakan food processor. Ekstraksi mengikuti prosedur pada Gambar 5. Sampel kemudian ditimbang sebanyak 1 g lalu dilarutkan dalam 1 mL larutan NaOH 1M dingin untuk saponifikasi. Sampel kemudian dimasukkan ke dalam 1.5 g ekstrelut lalu diisikan ke dalam kolom solid phase extraction-propylsulphonic acid silica (SPE-PRS) dan sampel dielusi dengan fasa gerak 12 mL diklorometana-5% toluena. Untuk membantu proses ekstraksi digunakan vacuum chamber dengan laju alir eluen 1-5 tetes/menit. Ekstrak diklorometan yang didapat kemudian diuapkan dengan gas nitrogen pada suhu ruang dan residu yang tertinggal dilarutkan dalam 2 1 mL n-heksana. Setelah itu dipersiapkan kolom berisi silika gel yang telah teraktivasi untuk ekstraksi berikutnya. Aktivasi silika gel dilakukan dengan memanaskan silika gel dalam oven pada suhu 200 °C selama 12 jam lalu kolom dikondisikan dengan cara dielusi dengan 5 mL n-heksana sebelum digunakan untuk ekstraksi. Fraksi PAH dalam n-heksana kemudian diekstraksi ke dalam kolom tersebut dengan menggunakan eluen campuran n-heksana dan diklorometana 60:40 (v/v) sebanyak 10 mL. Ekstrak PAH yang didapat kemudian diuapkan dengan gas nitrogen pada suhu ruang. Ekstrak PAH kemudian dilarutkan dalam 2 0.5 ml asetonitril dan dipindahkan ke dalam vial untuk kemudian diuapkan pelarutnya dengan gas
26
nitrogen pada suhu ruang. Residu yang tertinggal dalam vial kemudian dilarutkan dengan 200 μL standar PAH (campuran BAP dan DBA) dengan konsentrasi 2.5 µg/mL, lalu dianalisis kandungan PAH-nya dengan HPLC-MWD. Penentuan konsentrasi komponen PAH dengan menggunakan HPLC-UV Penentuan jumlah PAH dilakukan dengan menggunakan HPLC Agilent 1200 series dengan detektor MWD yang diset pada panjang gelombang UV. Analisis dilakukan secara isokratik mengikuti kondisi pada Tabel 5. Luas area yang digunakan untuk perhitungan kandungan PAH dalam sampel adalah selisih dari luas area yang terbaca pada sampel dengan luas area yang terbaca pada standar PAH (campuran BAP dan DBA) 2.5 µg/mL. Luas area ini kemudian dimasukkan ke dalam persamaan dari kurva standar hasil injeksi berbagai konsentrasi standar PAH. Kandungan PAH baik BAP maupun DBA (µg/g sampel) dihitung dengan menggunakan rumus berikut: kandungan PAH dalam sampel ( g/g sampel)
0.2 mL PAH dari kurva standar ( g/mL) berat sampel (g)
Tabel 5 Kondisi analisis PAH dengan HPLC-UV Kriteria
Kondisi
Kolom
C18 (ODS), ukuran partikel 5 μm, panjang 15 cm, diameter dalam 4.6 mm
Suhu running
Suhu ruang
Fase gerak
Asetonitril-aquades MilliQ (80:20, v/v), isokratik
Laju aliran fase gerak
1.0 mL/menit
Deteksi
UV 280 nm
Sampel loop
20 μL
27
Daging dibakar dengan formula bumbu, lama, dan jarak pemanasan menurut rancangan RSM
Pisahkan Daging (Sampel) dari Tulang
Homogenisasi dengan Food Processor
Ambil 1 g daging
Campurkan dengan 1 mL NaOH 1 M
Tambahkan dengan Ekstrelut 1.75 g
Masukkan ke dalam Kolom PRS dengan kapasitas 6 mL
Larutkan dengan 1 mL n-heksana
Fraksi PAH diuapkan dengan N2
Masukkan dalam kolom berisi Silika gel teraktivasi
Analisis [PAH] dengan HPLC-UV
Uapkan acetonitril dengan N2 Larutkan dalam 200 µL standar PAH 2.5 µg/mL
Elusi dengan 12 mL Diklorometan: Toluen 5%
Elusi dengan 10 mL n-heksana : diklorometan 60 : 40
PAH diuapkan dengan N2 Larutkan dalam 1 mL acetonitril
Gambar 5 Diagram alir ekstraksi PAH dari sampel daging (modifikasi Janoszka et al. 2004)
27
