3. METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Waktu dan tempat Penelitian Penelitian telah dilaksanakan dari bulan Agustus 2006 sampai Juli 2007, bertempat di Laboratorium Bioteknologi Hasil Perairan Departemen Teknologi Hasil Perairan Institut Pertanian Bogor. 3.2. 3.2.1.
Bahan dan Peralatan Bahan Bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah tanaman
X. granatum terdiri dari akar, batang, daun, daging buah dan biji yang diperoleh dari Pulau Bakau, desa Muara Kintap Kabupaten Tanah Laut Kalimantan Selatan. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah heksana, etil asetat dan metanol untuk ekstraksi senyawa bioaktif X. granatum. Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan bakteri S. aureus dan E. coli (klinis dan non klinis), media Mueller Hinton, paper disc, ekstrak metanol X. granatum, kloramfenikol dan ampisilin sebagai kontrol positif. Uji
fitokimia
meliputi
uji
alkaloid
menggunakan
kloroform,
amonia, pereaksi Dragendorff (kalium tetraiodobismutat), Meyer (kalium tetraiodomerkurat) dan Wagner (iodium dalam kalium iodida).
Uji saponin
menggunakan akuades, uji flavonoid menggunakan H2SO4 pekat dan uji tanin menggunakan FeCl3.
Penapisan ekstrak kasar menggunakan CHCl3, H2SO4,
MeOH dan NH3OH. Penapisan alkaloid menggunakan EtOH, NH3OH, CHCl3 dan HCl. Flavonoid penapisannya menggunakan akuades panas, heksana, CHCl3, Et2O, dan butanol. Penapisan tanin menggunakan heksana, aseton, akuades, asam askorbat, CHCl3 dan EtOAc. Pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I menggunakan gel agarosa dan pewarnaan dengan etidiumbromida, buffer TAE/Tris Acid EDTA, MgCl2, Enzim DNA topoisomerase I dari TopoGen, serta comptothecin sebagai kontrol positif inhibitor topoisomerase I .
18 3.2.2. Peralatan Alat-alat yang digunakan yaitu timbangan digital dan peralatan gelas. Alat untuk ekstraksi senyawa bioaktif yaitu waring blender, hot plate, pengaduk magnit, erlemenyer, evaporator vakum. Elektroforesis
digunakan
untuk
pengujian
aktivitas
inhibitor
topoisomerase I. Pengujian aktivitas antibakteri menggunakan tabung reaksi, vortex, cawan petri, lemari pendingin, inkubator. 3.3.
Prosedur Penelitian Penelitian penapisan antibakteri dan inhibitor topoisomerase I dari
X. granatum terdiri dari beberapa tahap yaitu: 1) ekstraksi senyawa bioaktif akar, batang, daun, daging buah dan biji X. granatum dengan pelarut heksana, etil asetat dan metanol, 2) pengujian
inhibitor topoisomerase
I terhadap
semua
ekstrak
kasar
X. granatum, 3) pengujian fitokimia dan antibakteri terhadap ekstrak kasar metanol akar, batang, daun, daging buah dan biji X. granatum, 4) penentuan minimum inhibitor topoisomerase I terhadap ekstrak kasar metanol batang X. granatum, 5) penapisan senyawa kimia dari ekstrak metanol batang X. granatum, 6) penapisan fraksi alkaloid, flavonoid dan tanin dari ekstrak metanol batang X. granatum, 7) pengujian aktivitas antibakteri dari fraksi alkaloid, flavonoid dan tanin ekstrak metanol batang X. granatum. Diagram alir keseluruhan tahapan penelitian penapisan antibakteri dan inhibitor topoisomerase I dari X. granatum disajikan pada Gambar 9.
19 X. granatum akar, batang, daun, daging buah & biji) Heksana Etil asetat Metanol Ekstrak kasar dalam heksana, etil asetat & metanol Ekstraksi sampel
Pembersihan ekstrak Ekstrak heksana
Ekstrak etil asetat
Pencucian berulang Ekstrak metanol
Uji inhibisi Topo. I Uji fitokimia Uji MIC Topo. I
Ekstrak metanol
Uji antibakteri
Ekstrak metanol batang Penapisan senyawa kimia Penapisan fraksi
Fraksi alkaloid
Fraksi flavonoid
Fraksi tanin
Uji fitokimia & antibakteri Fraksi terpilih Gambar 9
Diagram alir keseluruhan tahapan penelitian penapisan antibakteri dan inhibitor topoisomerase I dari X. granatum
3.3.1. Ekstraksi komponen aktif Ekstraksi komponen aktif dari X. granatum menggunakan tiga macam pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu heksana (non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Proses ekstraksi senyawa aktif dari tanaman X. granatum disajikan pada Gambar 10 dan prosedur ekstraksi pada Lampiran 1.
20 Sampel X. granatum Maserasi dengan heksana selama 24 jam Penyaringan
Filtrat
Residu
Evaporasi Ekstrak heksana
Maserasi dengan etil asetat selama 24 jam Penyaringan
Filtrat
Residu
Evaporasi Ekstrak etil asetat
Maserasi dengan metanol selama 24 jam Penyaringan
Filtrat
Residu
Evaporasi Ekstrak metanol
Gambar 10 Proses ekstraksi bahan aktif (Hostetman et al. 1997) 3.3.2. Pembersihan ekstrak kasar Teknik pembersihan ekstrak dilakukan dengan cara menambahkan pelarut asal pada ekstrak dan dilakukan partisi secara berulang sampai tidak didapatkan residu pada kertas saring. Prosedur kerja pembersihan ekstrak X. granatum (akar, batang, daun, daging buah dan biji) adalah sebagai berikut: 1) ekstrak hasil evaporasi dicuci dengan menambahkan pelarutnya dengan perbandingan ekstrak dan pelarut 1:2 atau ekstrak sampai terendam, dihomogenkan dengan seker selama 1 jam dan selanjutnya didiamkan selama 24 jam dalam lemari pendingin (suhu 5oC) dan didapatkan 2 bagian terpisah yaitu bagian filtrat dan residu, 2) dilakukan penyaringan dengan kertas saring untuk memisahkan filtrat dengan residu selanjutnya filtrat diuapkan dengan evaporator untuk memisahkan pelarutnya,
21 3) ekstrak yang diperoleh dicuci ulang dengan menambahkan pelarutnya kembali dan langkah selanjutnya sama dengan pencucian pertama, pencucian dilakukan minimal 3 kali, 3.3.3. Pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I Ekstrak X. granatum (akar, batang, daun, daging buah dan biji) dalam pelarut heksana, etil asetat dan metanol dilakukan uji inhibisi enzim DNA topoisomerase I.
Pengujian antikanker secara in vitro bertujuan untuk melihat
kemampuan sitotoksik ekstrak dalam menghambat enzim DNA topoisomerase I. Prosedur pengujian aktivitas inhibitor topoisomerase I disajikan pada Lampiran 2 dan visualisasi gel agarose dengan marker serta kontrol pada Lampiran 3. 3.3.4. Pengujian fitokimia Uji fitokimia merupakan salah satu cara untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder pada suatu ekstrak tanaman atau merupakan uji pendahuluan untuk mengetahui keberadaan senyawa kimia spesifik seperti senyawa alkaloid, fenol (termasuk flavonoid), tanin, dan saponin. Prinsip dan prosedur pengujian alkaloid, flavonoid, tanin dan saponin disajikan pada Lampiran 4. 3.3.5.
Pengujian antibakteri Pengujian aktivitas antibakteri ekstrak metanol X. granatum (akar, batang,
daun, daging buah dan biji) terdiri dari tahap persiapan dan pembuatan media, penyegaran bakteri uji dan uji aktivitas antibakteri. Metode yang digunakan pada pengujian aktivitas antibakteri adalah metode difusi agar dengan teknik agar tuang. Prinsip metode ini, yaitu ekstrak akan berdifusi langsung dalam media agar yang telah mengandung bakteri uji. Bakteri uji yang digunakan adalah
S.
aureus (bakteri Gram positif) dan E. coli (bakteri Gram negatif). Uji aktivitas antibakteri ekstrak metanol X. granatum pada Gambar 11 dan tahapan pengujian antibakteri disajikan pada Lampiran 5.
22 Bakteri sebanyak 20 µl, OD600 nm= 0.68 (S. aureus) dan 0.59 (E. coli), dimasukan dalam 15 ml media agar Divortex hingga homogen Dimasukkan dalam cawan petri Dibiarkan memadat (±15 menit) Disimpan dalam pendingin (30 menit) Penambahan ekstrak 20 µl (300 µg/ paper disc), kloromfenikol 10 µg/paper disc, ampisilin 25 µg/paper disc
Paper disc diletakkan pada cawan petri berisi bakteri
Disimpan dalam lemari Pendingin (30 menit) Diinkubasi pada suhu 37OC (12-18 jam) Pengamatan dengan mengukur Zona bening yang terbentuk Gambar 11
Pengujian aktivitas antibakteri (Schlegel dan Schmidt 1994)
3.3.6. Penapisan ekstrak kasar Penapisan ekstrak kasar metanol batang X. granatum untuk target pemurnian senyawa kimia, dengan metode spesifik yaitu penggunaan pelarut yang tepat dengan tujuan untuk menghilangkan komponen pengotor dan mendapatkan fraksi murni. Pemurnian atau isolasi senyawa target untuk memperoleh senyawa yang memiliki bioaktifitas terbaik dari 3 golongan senyawa target yaitu alkaloid, flavonoid dan tanin. Alasan pemilihan metode isolasi spesifik karena kesulitan mendapatkan eluen yang cocok untuk memisahkan ekstrak dengan metode kromatografi lapis tipis dan kolom serta fraksinasi dengan metode ini
23 Diagram alir penapisan, pemurnian
memerlukan waktu isolasi yang lama.
alkaloid, flavonoid dan tanin ekstrak metanol batang X. granatum disajikan pada Gambar 12, 13 dan 14. Ekstrak kasar Maserasi selama 24 jam dalam metanol dan air (4:1) Penyaringan Filtrat Evaporasi suhu 40oC sampai 1/10 volume awal Pengasaman dengan asam sulfat 2M (pH 3-4) Ekstraksi 3x dengan kloroform Lapisan kloroform Evaporasi
Lapisan air-asam Pembasaan dengan amoniak (pH 10)
Ekstrak pertengahan polar/ EPP/Fraksi alkaloid
Ekstraksi 2x kloroform-metanol (3:1)
Lapisan kloroform dan metanol Evaporasi
Lapisan air-basa Ekstraksi dengan metanol
Ekstrak basa/EB Ekstrak polar/EP Gambar 12 Penapisan ekstrak kasar (Harborne 1987) dan Pemurnian alkaloid (Martono 1983)
24 Ekstrak metanol batang Pelarutan dengan akuades panas Penyaringan Residu
Filtrat Partisi dengan heksana Partisi dengan kloroform Partisi dengan etanol Partisi dengan etil asetat Partisi dengan butanol Fraksi butanol
Fraksi flavonoid
Evaporasi
Gambar 13 Pemurnian flavonoid (Budzianowski 1985) Ekstrak metanol batang Partisi dengan heksana Fraksi heksana Ekstraksi dengan aseton dan air (7:3) + asam askorbat 0,1% Filtrat
Residu
Evaporasi Ekstrak Partisi dengan kloroform Partisi dengan etil asetat Fraksi etil asetat
Evaporasi
Fraksi tanin
Gambar 14 Pemurnian tanin (Makker dan Becker 1995)
