3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2011 sampai Juli 2011. Produksi kitosan mikrokristalin, analisis total plate count (TPC) rongga gigi dan mulut, kadar air, mineral, nitrogen serta rendemen kitosan mikrokristalin bertempat di labolatorium biokimia hasil perairan, mikrobiologi hasil perairan Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Institut Pertanian Bogor. Pengujian ukuran partikel kitosan mikrokristalin dengan SEM dilakukan di Laboratorium Geologi Kuarter, Institut Teknologi Bandung. Pengujian FTIR (Fourier Transform InfraRed) dilakukan di Laboratorium Terpadu, Universitas Islam Negeri, Tangerang. Pelaksanaan penelitian terdiri dari tiga tahap yaitu penelitian pendahuluan, penelitian utama dan serta analisis data. Penelitian pendahuluan berupa analisis mutu kitosan komersil. Sedangkan penelitian utama berupa produksi kitosan mikrokristalin serta analisis mutu kitosan mikrokristalin, produksi mouthwash kitosan mikrokristalin, dan pengujian penelitian dengan menguji efektifitas antibakteri mouthwash berbahan kitosan mikrikristalin terhadap bakteri gigi dan mulut. 3.2 Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi timbangan digital, planktonet, plastik, baskom, kertas label, karet pengikat, botol kaca. Alat-alat analisis yang meliputi pipet volumetrik, cawan petri, vortex, sudip, inkubator, erlenmeyer, magnetic stirerr, kompor listrik, gelas ukur, gelas piala, spray drying, FTIR, Scanning Electron Microscopy 5310LV (JEOL). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kitosan larut asam. Bahan yang digunakan untuk analisis yaitu kitosan mikrokristalin, aquades, saccharin, mint, K2SO4, HgO, H2SO4, aquades, NaOH 10 dan 40%, H3BO3, alkohol, K2SO4, HgO,H2SO4, heksana, tablet kjeldahl, HCl, NaCl dan media NA.
12
3.3 Tahapan Penelitian Tahapan penelitian yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari dua tahap, yaitu tahap penelitian pendahuluan dan tahap penelitian utama. 3.3.1 Tahap penelitian pendahuluan Penelitian pendahuluan ini bertujuan untuk mengetahui mutu kitosan yang akan digunakan pada penelitian utama. Mutu kitosan yang diamati meliputi pengujian kadar air, kadar mineral, kadar nitrogen, kadar protein dan derajat deasetilasi. 3.3.2 Tahap penelitian utama Tahap penelitian utama terdiri dari produksi kitosan mikrokristalin dan produksi mouthwash dengan zat antibakteri kitosan mikrokristalin. Penelitian utama bertujuan untuk menentukan efektivitas terbaik kitosan mikrokristalin dalam mouthwash dengan konsentrasi yang berbeda-beda (kontrol negatif (0%), 0,5, 1, 1,5% dan kontrol positif (mouthwash pembanding)) terhadap aktfitas penghambatan bakteri dalam rongga gigi dan mulut. Produksi Kitosan Mikrokristalin diawali dengan pelarutan kitosan dalam larutan asam asetat 2% yang selanjutnya larutan kitosan tersebut dihomogenizer agar memperoleh ukuran partikel yang jauh lebih kecil dengan menggunakan magnetic stiererr pada kecepatan 5000-10.000 rpm selama 1 jam. Tahap selanjutnya berupa penambahan secara perlahan Natrium Hidroksida 10% hingga terjadi proses presipitasi atau pengendapan partikel terlarut. Setelah partikel terlarut mengendap dilakukan proses pencucian hingga mencapai kondisi pH partikel netral. Tahap terakhir dari proses produksi kitosan mikrokristalin berupa proses pengeringan partikel kitosan mikro menggunakan spray dryer sehingga memeperoleh bubuk kitosan mikrokristalin. Kitosan mikrokristalin yang telah diproduksi kemudian dilakukan analisis mutu berupa analisis kadar air, kadar mineral, kadar nitrogen, derajat deasitilasi (DD) dengan alat FTIR (Forrier transformation Infra Red), perhitungan rendemen dengan timbangan digital, dan penentuan ukuran pertikel dengan alat SEM (Scanning Electron Microscopy). Tahap produksi mouthwash dengan zat antibakteri kitosan mikrokristalin diawali dengan proses pelarutan kitosan mikrokristalin dengan konsentarsi
13
masing-masing sebesar 0,5, 1, dan 1,5%. Selanjutnya ditambahkan
zat rasa
seperti sodium saccharin dan mint kedalam masing-masing larutan kitosan mikrokristalin tersebut. Mouthwash yang telah dihasilkan diuji efektivitas antibakteri dengan dikumurkan oleh dua orang probandus yang memiliki karakter gigi berlubang dan tidak berlubang, pengambilan sampel dilakukan pada selang waktu sebelum berkumur, setelah berkumur atau jam ke-0, jam ke-4 dan jam ke-8. Pengamatan efektivitas antibakteri kemudian dilakuan dengan perhitungan total plate count (TPC). Percobaan ini dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Data hasil perhitungna TPC kemudian diuji secara statistik. Diagram alir penelitian utama dapat dilihat pada Gambar 2. KITOSAN
Dilarutkan Dalam asam asetat CH3COOH 2%
Homogenizer (Magnetic stierer 5000rpm)
Presipitasi dengan penambahan NaOH 10% (0,5:1)
Penetralan
Kitosan Mikrokristalin
Pencucian Kitosan mikrokristalin
Spray Dryer
Tepung Kitosan Mikrokristalin
Analisis TPC mouthwash dengan zat antibakteri kitosan mikrokristalin konsentrasi (0%(kontrol negative), 0,5%, 1%, 1,5%, dan kontrol positif (mouthwash Pembanding)).
Aplikasi oleh 2 orang probandus (gigi berlubang dan tidak berlubang) Usia 21 tahun
Produksi mouthwash (saccharin+ mint + Aquades) dalam suhu 800C
Kitosan Mikrokristalin dilarutkan dalam 0,5% CH3COOH jenuh (0,5%, 1%, dan 1,5%)
Analisis Rendemen Analisis Proksimat Derajat Deasetilasi Analisis Ukuran Partikel (SEM)
Gambar.2 Diagram Alir Penelitian Utama
14
3.4 Analisis Penelitian Prosedur analisis meliputi analisis perhitungan rendemen, analisis kadar air, analisis kadar mineral, analisis kadar protein, analisis ukuran partikel dengan alat Scanning Electron Microscopy (SEM), analisis derajat deasetilasi (DD) dengan alat FTIR (Forrier transformation Infra Red)dengan, dan uji mikrobiologi atau total plate count. 3.4.1 Analisis Pengukuran rendemen Banyaknya rendemen dapat dihitung dengan menggunakan persamaan:
Keterangan: a = Berat hasil proses b = Berat awal bahan 3.4.2 Analisis kadar air (SNI 2006) Analisis kadar air dilakukan mengacu pada SNI 01-2356-2006. Cawan porselen dikeringkan dalam oven selama 30 menit, lalu didinginkan dalam desikator selama 15 menit. Selanjutnya sampel ditimbang sebanyak 5 g dalam cawan dan dikeringkan dalam oven pada suhu 100 oC dalam tekanan tidak lebih dari 10 mmHg selama 5 jam atau sampai beratnya konstan. Cawan beserta isinya kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Perhitungan kadar air dapat dilihat sebagai berikut :
Keterangan : A = berat cawan kosong (g) B = berat cawan + sampel awal (g) C = berat cawan + sampel kering (g)
3.4.3 Analisis kadar mineral (AOAC 2005) Cawan pengmineralan dikeringkan di dalam oven selama 1 jam pada suhu o
105 C, kemudian didinginkan selama 15 menit di dalam desikator dan ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Sampel sebanyak 5 g dimasukkan ke
15
dalam cawan pengmineralan dan dipijarkan di atas nyala api bunsen hingga tidak berasap lagi. Setelah itu dimasukkan ke dalam tanur pengmineralan dengan suhu 600 oC selama 1 jam, kemudian ditimbang hingga didapatkan berat yang konstan. Kadar mineral ditentukan dengan rumus:
Keterangan :
A = Berat cawan porselen kosong (g) B = Berat cawan dengan sampel (g) C = Berat cawan dengan sampel setelah dikeringkan (g)
3.4.4 Analisis kadar protein (AOAC 1980) Tahap-tahap yang dilakukan dalam analisis protein terdiri dari tiga tahap yaitu destruksi, destilasi, dan titrasi. Pengukuran kadar protein dilakukan dengan metode mikro Kjeldahl. Sampel ditimbang sebanyak 0,25 g, kemudian dimasukkan ke dalam labu Kjeldahl 100 ml, lalu ditambahkan 0,25 g selenium dan 3 ml H2SO4 pekat. Contoh didestruksi pada suhu 410 oC selama kurang lebih 1 jam sampai larutan jernih lalu didinginkan. Setelah dingin, ke dalam labu Kjeldahl ditambahkan 50 ml akuades dan 20 ml NaOH 40%, kemudian dilakukan proses destilasi dengan suhu destilator 100 oC. Hasil destilasi ditampung dalam labu Erlenmeyer 125 ml yang berisi campuran 10 ml asam borat (H3BO3) 2% dan 2 tetes indikator bromcherosol green-methyl red yang berwarna merah muda. Setelah volume destilat mencapai 40 ml dan berwarna hijau kebiruan, maka proses destilasi dihentikan. Lalu destilat dititrasi dengan HCl 0,1 N sampai terjadi perubahan warna merah muda. Volume titran dibaca dan dicatat. Larutan blanko dianalisis seperti contoh. Dengan metode ini diperoleh kadar nitrogen total yang dihitung. Kadar protein dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan :Faktor konversi alat = 2,5 Keterangan : Faktor konversi = 6,25
16
3.4.5 Analisis SEM (Lin et al. 2002) Pengamatan terhadap ukuran partikel mikrokristalin kitosan diamati dengan Scanning Electron Microscopy (SEM). Prinsip alat ini yaitu pancaran elektron yang diradiasi terhadap spesimen akan menyebabkan adanya elektron yang meloncat dan sebagian yang lain diserap. Jika sampel tidak memiliki konduktivitas elektrik, elektron yang diserap akan memberikan arus pada spesimen. Hal ini menyebabkan terjadinya kesalahan pengamatan. Sehingga untuk menghindari kesalahan ini dilakukan pelapisan metal dalam ruang hampa, pengamatan dengan accelerating voltage rendah, dan pengamatan dalam tingkat kehampaan untuk mencegah spesimen menerima arus. Analisis ini menggunakan alat SEM (JEOL JSM 5310 LV Scanning Microscope). Preparasi sampel untuk pengamatan ini dimulai dengan pengeringan sampel dengan sprei drying sampai kadar air mencapai 4 % atau kurang. Setelah preparasi, sampel diletakkan pada logam yang dilapisi karbon untuk selanjutnya dilakukan pelapisan emas (Au) 300 Å di dalam Magnetron Sputtering Device yang dilengkapi dengan pompa vakum. Pada proses vakum terjadi loncatan logam emas ke arah sampel, sehingga melapisi sampel. Sampel yang telah dilapisi emas diletakkan pada lokasi sampel dalam mikroskop elektron, dan dengan terjadinya tembakan elektron ke arah sampel, maka akan terekam ke dalam monitor dan kemudian dilakukan pemotretan. 3.4.6 Analisis Pengukuran Derajat Deasetilasi (Domsay 1985) Kitosan Mikrokristalin sebanyak 0,2 gram digerus dengan KBr dalam mortar agate sampai homogen, kemudian dimasukkan dalam cetakan pelet, dicetak dengan dipadatkan dan divakum sampai optimum, selanjutnya pelet titempatkan dalam sel dan dimasukkan ke dalam tempat sel pada spektrofotometer inframerah IR-408 yang sudah dinyalakan dan stabil, Kemudian tekan tombol pendeteksian,
akan
muncul
histogram
FTIR
pada
rekorder
yang
memunculkankan puncak-puncak dari gugus fungsi yang terdapat pada sampel kitosan. Histogram yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif misalnya analisis kuantitatif derajat deasetilasi dari kitosan. Pengukuran derajat deasetilasi berdasarkan kurva yang tergambar oleh spektrofotometer. Puncak tertinggi (P0) dan puncak terendah (P) dicatat dan
17
diukur
dengan garis dasar yang dipilih. Nisbah absorbansi dihitung dengan
rumus: Log P0 A= P
Keterangan:
P0 = Jarak antara garis dasar dengan garis singgung antara dua puncak tertinggi dengan panjang gelombang 1655cm-1 atau 3450 cm-1. P = Jarak antara garis dasar dengan lembah terendah dengan panjang gelombang 1655cm-1 atau 3450 cm-1.
Perbandingan absorbansi pada 1655cm-1 dengan absorbansi 3450 cm-1 digandakan satu per standar N-deasetilasi kitosan (1,33). Dengan mengukur absorbansi pada puncak yang berhubungan, nilai persen N-deasetilasi dapat dihitung dengan rumus: A1655 % N-deasetilasi =
1-
X A3450
Keterangan:
1 1,33
A1655
= Absorbansi pada panjang gelombang 1655 cm-1.
A3450
= Absorbansi pada panjang gelombang 3450 cm-1.
1,33
= konstanta untuk derajat deasetilasi yang sempurna.
3.4.7 Uji mikrobiologi atau Total Plate Count (TPC) (Fardiaz 1992) Prinsip kerja dari analisis TPC adalah perhitungan jumlah koloni bakteri yang ada di dalam sampel dengan pengenceran sesuai keperluan dan dilakukan secara duplo. Seluruh pekerjaan dilakukan secara aseptik untuk mencegah kontaminasi yang tidak diinginkan dan pengamatan secara duplo dapat meningkatkan ketelitian. Jumlah koloni bakteri yang dapat dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara 30-300 koloni. Sebanyak 1ml sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 90 ml larutan NaCl 0,85% (larutan garam fisiologis/garfis) sehingga didapatkan
18
pengenceran 10-1. Sebanyak 1 ml dari larutan tersebut dipipet, kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang telah berisi 9 ml larutan garam fisiologis untuk memperoleh pengenceran 10-2. Pengenceran dilakukan sampai didapat pengenceran 10-5 dan disesuaikan dengan pendugaan tingkat koloni bakteri gigi dan mulut. Dari setiap tabung reaksi pengenceran tersebut diambil dengan menggunakan pipet sebanyak 1 ml selanjutnya dimasukkan ke dalam cawan petri yang sudah disterilkan. Setiap pengenceran dilakukan secara duplo. Kemudian setiap cawan tersebut digerakkan secara melingkar di atas meja supaya media NA merata. Setelah NA membeku, cawan petri diinkubasi dalam inkubator selama 48 jam pada suhu 300C, cawan petri tersebut diletakkan secara terbalik. Setelah masa inkubasi, koloni yang tumbuh pada cawan petri dihitung dengan jumlah koloni yang dapat diterima 30-300 koloni percawan. Nilai TPC dapat dihitung dengan memakai rumus berikut:
Unit per ml atau gram = Jumlah koloni per cawan X
3.5 Rancangan Percobaan dan Analisis Data (Steel dan Torrie 1993) Rancangan percobaan pada penelitian utama digunakan untuk mengetahui pengaruh perlakuan konsentrasi kitosan terhadap parameter subjektif dan objektif yaitu rancangan acak kelompok in time (RAK in Time). Rancangan ini adalah percobaan yang melibatkan pengamatan berulang terhadap satu obejek. Disamping perlakuan yang dicobakan, diharapkan juga mampu melihat perkembangan respon selama penelitian berjalan. Sehingga pengaruh waktu akan sangat bermanfaat untuk dikaji disamping perlakuan yang diberikan. Perlakuan yang diberikan yaitu konsentrasi kitosan mikrokristalin. Perlakuan konsentrasi kitosan mikrokristalin terdiri dari 5 taraf, yaitu Kontrol Negatif (berkumur tanpa menggunakan antibakteri), Kontrol positif (berkumur dengan mouthwash komersil), Mouthwash kitosan mikrokristalin 0,5%, 1%, dan 1,5%. Menurut Steel dan Torie (1993) dengan model uji rancangan acak kelompok in time sebagai berikut :
19
Yijk = µ + αi + βl + δijk + ωk +αωkj + γjk +εijkl Keterangan : Yijk
= nilai respon pada faktor A taraf ke-i, ulangan ke-j dan waktu ke-k.
μ
= nilai rata-rata
αi
= pengaruh faktor A taraf ke-i,
δijk
= komponen acak perlakuan,
ωk
= pengaruh waktu pengamatan ke-k,
αωkj
= pengaruh interaksi waktu dengan faktor A,
γjk
= komponen acak waktu pengamatan,
εijk
= komponen acak dari interaksi waktu dengan perlakauan.
βl
= nilai respon terhadap kelompok ke-l. Perlakuan yang diberikan pada penelitian ini terdiri dari 1 perlakuan yaitu
penambahan kitosan mikrokristalin dengan konsentrasi yang berbeda. Perlakuan mouthwash terdiri dari 5 taraf, yaitu : 1. Kontrol negatif (kitosan 0%) 2. Kitosan 0,5% 3. Kitosan 1% 4. Kitosan 1,5% 5. Kontrol positif (mouthwash komersil) Selanjutnya dicobakan pada 2 orang probandus usia 21 tahun dengan perbedaan karakter gigi, probandus 1 (gigi tidak berlubang) dan probandus 2 gigi berlubang. Sampel dari masing-masing probandus diambil pada rentan waktu sebelum berkumur, jam ke-0, jam ke-4, dan jam ke-8. Data dianalisis dengan menggunakan analisis ragam oneway ANOVA. Apabila hasil analisis ragam memberikan pengaruh yang berbeda nyata (tolak Ho), maka dilanjutkan dengan uji lanjut Duncan. Analisis mutu kitosan mikrokristalin menggunakan uji deskriptif. Uji deskriptif dilakukan untuk melihat pengaruh modifikasi kitosan menjadi kitosan mikrokristalin terhadap beberapa parameter yang diamati, berupa analisis kadar air, kadar abu, kadar nitrogen, dan derajat deasetilasi. Sedangkan analisis mikropartikel kitosan mikrokristalin dilakukan pengamatan menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM)
