3. METODE PENELITIAN 3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian telah dilaksanakan di laboratorium BKP Kelas II Cilegon untuk metode pengujian RBT. Metode pengujian CFT dilaksanakan di laboratorium BBALITVET dan Bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor (IPHK FKH IPB). Pengujian I-ELISA dilaksanakan di BBUSKP. Penggunaan SDS-PAGE dilaksanakan di Bagian Mikrobiologi Medik IPHK FKH IPB. 3.1.2. Waktu Penelitian Waktu pelaksanaan dilakukan sejak bulan Januari sampai dengan Oktober 2008. Rangkaian kegiatan penelitian diuraikan pada Tabel 3 di bawah ini. Tabel 3. Jadwal kegiatan penelitian No 1
Uraian Pengumpulan
Waktu data Januari - Juni 2008
Tempat SKH Kelas II Merak
sekunder
2
Pengumpulan serum
Januari - Juni 2008
SKH Kelas II Merak
3
Pengujian RBT
Januari - Juni 2008
SKH Kelas II Merak
(sesaat pengumpulan)
Juni - Juli 2008
BKPKelas II Cilegon
Pengujian CFT
Maret - Juli 2008
Bagian Mikrobiologi Medik
4
Departemen
IPHK
FKH
IPB dan BBALITVET
5
Pengujian I-ELISA
Januari - Juli 2008
Laboratorium BBUSKP
6
Pengujian SDS-PAGE
Oktober 2008
Bagian Mikrobiologi Medik Departemen IPB
IPHK
FKH
3.2. Rancangan Penelitian Contoh serum diperoleh dari sapi dan kambing potong yang berasal dari kabupaten-kabupaten di provinsi Jawa Timur, Jawa Tengah, Daerah Istimewa Yogyakarta (DIY), Jawa Barat, Jakarta dan Banten yang dilalulintaskan melalui BKP Kelas II Cilegon. Sapi dan kambing potong berasal dari daerah yang tidak dilakukan vaksin, pemeliharaan dan pengelolaan kesehatan dilakukan secara konvensional. Jumlah contoh diperoleh secara bertingkat (multiple state), sesuai frekwensi pengeluaran dan populasi per alat angkut. Ukuran contoh untuk deteksi penyakit, dilakukan secara selektif dalam populasi hewan (Thrusfield 2005). n = [ 1- (1-a)1/D ] [ N- (D-1)/2 ] untuk : N= Populasi ; a= Konfidensi; n= besaran contoh; D= prevalensi (asumsi sebesar 5%) Tingkat selang kepercayaan sebesar 95%.
3.2.1. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah reagen RBT (BBALITVET), komplemen (konsentrasi 10%), hemolisin (dengan pengenceran 1:100), hemolisin (dengan pengenceran 1:150), sel darah merah (Red Blood Cell, RBC) domba (konsentrasi 4%), koagulan Na sitrat (Sigma) (konsentrasi 3,85%), NaCl (Oshaka) (konsentrasi 0,95 %), Kits indirect I-ELISA (SERELISA® Brucella OCB antibodi Mono Indirect), serum kontrol positif (BBALITVET), buffer perosidase substrate (PS) (SERELISA® Brucella OCB antibodi Mono Indirect), washing buffer (W) (SERELISA® Brucella OCB antibodi Mono Indirect), contoh diluent (SD) (SERELISA® Brucella OCB antibodi Mono Indirect), larutan dan gel pengumpul (stacking gel) (konsentrasi 4%) (Sigma Chemical), gel pemisah (separating gel) (konsentrasi 12%) (Sigma Chemical), running buffer (Promega) (konsentrasi 2,76%), phosphat Buffer Saline PBS (Promega), larutan penyangga contoh (Promega) (konsentrasi 25%), larutan pemucat (Promega) (kosentrasi 25%), larutan pewarna coomasie blue (Sigma Chemical) (konsentrasi 0,1%), dan marker protein antibodi mamalia (Promega). Alat yang digunakan adalah cawan metode RBT (WHO hemagglutination tray), pengaduk sucihama, singlechannel pipet 10-100 μl (Wiegthex), spuit 3ml (Trumo) yang sucihama, tabung kecil 1,5 ml (Eppendorf), tabung 10 ml (Pyrex),
pipet 1-10 ml (Pyrex), multichannel mikropipet 0,1-1 μl, 10-200μl dan 100-1000 μl (Wiegthex), sentrifus (Hamle) dengan kecepatan 2500-5000 putaran per menit dan spuit 1 ml dan 3ml yang sucihama multichannel mikro pipet 10-100 μl, shaking (Biotek), penangas air (Biotek) dan (Memmert), ELISA reader (Biotek ELX 808), elektroforesis (Sigma), dan lempeng kaca (Parmacia-Biotek). 3.2.2. Pemeriksaan Serologik Pemeriksaan serologik serum sapi dan kambing potong yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan RBT, CFT dan I-ELISA. 1. RBT RBT adalah reaksi pengikatan antigen yang telah dilemahkan dan diwarnai dengan antibodi dari contoh serum. Pengikatan antigen permukaan dengan antibodi menyebabkan terjadinya aglutinasi. Bila tidak terjadi aglutinasi, ini memiliki arti tidak ada antibodi dalam contoh serum tersebut. Pengambilan contoh serum dari sapi dan kambing potong sebanyak 235 contoh serum, masing-masing dilakukan menggunakan spuit 3 ml (Trumo) yang sucihama. Serum dikemas dalam tabung kecil (Eppendorf) dan diberi label yang jelas. Sebanyak 25 μl contoh serum sapi dan kambing potong diambil menggunakan singlechannel pipet 10-100 μl (Wiegthex) dan dicampurkan dengan 25
μl
reagen
RBT
(BBALITVET)
di
dalam
sumur
cawan
(WHO
hemagglutination tray). Larutan dicampur hingga rata menggunakan pengaduk yang sucihama. Reaksi aglutinasi diamati setelah 4-5 menit. Hasil dinilai positif (+++) jika terjadi agglutinasi sempurna, cairan jernih dan tampak jelas. Hasil dinilai positif (++) jika terjadi agglutinasi berupa pasir halus, cairan agak jernih dan batas cukup jelas. Sedangkan RBT dinilai positif (+) jika terjadi aglutinasi berupa pasir halus, cairan tidak jernih dan batas cukup jelas. 2. CFT CFT merupakan reaksi pengikatan komplemen untuk mengukur kadar antibodi serum ataupun antigen. Prinsip reaksi ini adalah adanya kompleks antigen dan antibodi yang homolog, menarik komplemen untuk berikatan dengan bagian Fc dari antibodi sehingga melisiskan RBC. Reaksi pengikatan komplemen terdiri dari dua tahap. Tahap pertama adalah reaksi pengikatan sejumlah
komplemen menggunakan komplemen (dengan konsentrasi 10%) untuk memperoleh komplek antigen dan antibodi. Tahap kedua adalah penghancuran eritrosit yang telah dilapisi hemolisin (sistem indikator) dengan menggunakan hemolisin (dengan pengenceran 1:100) dan hemolisin (dengan pengenceran 1:150). Reaksi komplemen dan hemolisis dilakukan dalam tabung reaksi 10ml (Pyrex). Domba yang akan diambil darahnya disuntik antigen B. abortus dalam jangka waktu dua minggu sebelum pengambilan darah. Sehingga, darah domba yang diperoleh nantinya adalah darah domba yang telah mengandung antibodi terhadap B. abortus. Pengambilan darah domba dilakukan menggunakan spuit yang berisi antikoagulan Na sitrat (Sigma) (konsentrasi 3,85%) dengan perbandingan 0,5 ml antikoagulan untuk 3ml darah domba. Darah disentrifugasi dengan kecepatan 2500-5000 putaran per menit. Selanjutnya dicuci menggunakan NaCl berkonsentrasi 0,95 % untuk memperoleh sel darah merah. Sistem indikator atau hemolisin terdiri dari RBC domba (konsentrasi 4%) yang mengandung antibodi terhadap B. abortus. Titrasi hemolisin dilakukan dengan menggunakan tabung reaksi sebanyak dua belas tabung yang disusun menjadi dua baris (A dan B). Baris A diberi nomor ganjil, yaitu 1, 3, 5, 7, 9 dan 11 dan baris B diberi nomor genap, yaitu 2, 4, 6, 8, 10 dan 12. Baris A dan baris B merupakan gambaran titrasi hemolisin. Larutan dari ke enam tabung dihomogenkan dengan cara menggoyang rak tabung reaksi, kemudian diinkubasikan dalam penangas air selama 30 menit pada suhu 37 oC.
Sebanyak 0,25 ml komplemen 10%
ditambahkan ke masing-masing tabung, diikuti dengan menambahkan 0,25 ml RBC domba 4%. Tabung reaksi disusun kembali menjadi satu baris dengan nomor yang berurutan (1-12), larutan dihomogenkan dan diinkubasikan kembali selama 30 menit pada suhu 37 oC. Adanya antigen dan antibodi yang homolog akan ditandai dengan adanya pengendapan eritrosit dari sistem indikator yang berarti terjadi reaksi pengikatan komplemen. Sebaliknya, tidak adanya kesesuaian antara antigen dan antibodi akan ditandai dengan lisisnya eritrosit dari sistem indikator (reaksi komplemen negatif). Tabung reaksi sebanyak enam buah disusun dalam satu baris dan diberi nomor berurut dari 1 sampai 6. Larutan dihomogenkan dengan cara menggoyang rak
tabung reaksi, kemudian diinkubasikan dalam penangas air selama 10 menit 37oC. Pada reaksi pengikatan komplemen dilakukan titrasi serum yang diuji. Pengenceran serum mengakibatkan perubahan reaksi pada masing-masing tabung, yaitu dari pengendapan (reaksi positif) sampai lisisnya eritrosit (reaksi negatif). Adanya antigen dan antibodi yang homolog, ditandai dengan pengendapan eritrosit dari sistem indikator (reaksi pengikatan komplemen positif). Hasil CFT positif dengan titer 150 IU. 3. I-ELISA ELISA adalah merupakan pemeriksaan serologik yang menggunakan dengan enzim untuk mendeteksi ikatan antigen dan antibodi. Enzim semula tidak berwarna ketika penambahan substrat (chromogen, peroxidase dan lain-lainnya). Namun, bila enzim mengikat komplek antigen-antibodi, maka enzim akan mengubah substrat menjadi produk yang berwarna (adanya ikatan antigenantibodi). I-ELISA dapat melacak keberadaan antigen atau antibodi dalam contoh serum. Contoh serum sapi dan kambing potong diinaktifkan dalam penangas air pada suhu 53 oC selama lima menit. Kemudian serum dilarutkan dengan contoh diluent (SD) dengan perbandingan 1:200. Serum dimasukkan ke dalam sumur dengan volume 100 μl menggunakan multichannel mikropipet 10-100μl. Diinkubasi selama satu jam pada suhu 37 oC. Setelah masa inkubasi dicapai, dilakukan pencucian sebanyak empat kali dengan washing buffer dengan perbandingan 1:10. Setelah pencucian, ditambahkan konjugat sebanyak 100 μl dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 oC. Setelah masa inkubasi dicapai, dilakukan pencucian sebanyak empat kali dengan washing buffer atau washing revelation, selanjutnnya dilakukan penambahan buffer perosidase substrate (PS) sebanyak 100 μl dan agar tercampur sempurna maka dilakukan pengocokan dengan menggunakan shaker (Biotek). Diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 o
C. Setelah masa inkubasi dicapai, ditambahkan stop solution sebanyak 50 μl dan
dilakukan pengadukan. Pengukuran dilakukan menggunakan ELISA reader dengan sinar bicromatic pada panjang gelombang 450 nm dan 630 nm, atau monocromatic pada 450 nm. I-ELISA positif, jika nilai alfa (α) lebih kecil dari OD. Nilai α
adalah hasil perkalian 0,6 dengan OD positif. OD positif diperoleh dari pengukuran serum kontrol positif pada panjang gelombang 450 nm dan 630 nm (bikromatik) atau 450 nm (monokromatik). 4. SDS - PAGE Serum sapi dan kambing potong yang CFT positif dikarakterisasi menggunakan teknik ekektroforesis SDS-PAGE. Contoh dilarutkan dengan larutan penyanggah contoh berkonsentrasi 25% dengan perbandingan 1:10. Campuran ini selanjutnya dipanaskan pada suhu 60 oC selama lima menit dalam penangas air. Campuran tersebut dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis yang terdiri dari gel pemisah berkonsentrasi 12% dan gel pengumpul berkonsentrasi 4%. Contoh serum sapi dan kambing potong sebanyak 10 µl dimasukkan ke dalam masing-masing sumur. Kemudian, perangkat elektroforesis dijalankan dengan arus 50 mA dan daya 100 volt selama kurang lebih tiga jam. Elektroforesis berakhir apabila running buffer berkonsentrasi 2,76% telah mencapai batas 0,5 cm dari bagian bawah gel. Setelah elektroforesis berakhir, gel diangkat dari lempeng kaca dan dicuci dengan phosfat buffer saline (PBS) pada pH 7. Gel diirendam dalam pewarna coomasie blue 0,1%. Pewarnaan gel dilakukan selama 1-3 jam pada suhu 25 oC sambil diagitasi secara perlahan. Pewarna yang tidak terikat pada protein dihilangkan dengan cara merendam gel dalam larutan pemucat 25% yang terdiri dari methanol dan asam asetat. Gel akan berwarna bening dan pita-pita protein yang telah terbentuk terlihat jelas. Marker protein antibodi mamalia memiliki ukuran berat molekul berurutan 225, 175, 150, 100, 75, 50, 35, 25, 15,10 kDa. Berat molekul protein diukur dari mobilitas relatif protein yang disesuaikan dengan marker (Promega) dan membandingkan jarak migrasi molekul protein dari garis awal separating gel sampai ujung stracking gel. 3.3. Analisis Data hasil pemeriksaan RBT, CFT, I-ELISA dan SDS-PAGE dianalisa dengan menggunakan metode statistika deskriptif.
