19
3. METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret sampai Juni 2010 di Laboratorium
Mikrobiologi,
Biokimia
dan
Bioteknologi
Hasil
Perairan
Departemen Teknologi Hasil Perairan, Laboratorium Genetika Ikan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan dan Laboratorium Penyakit Hewan dan Laboratorium Kultur Jaringan Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan antara lain inkubator, autoklaf, erlenmeyer, pipet 10 ml, pipet mikro, bulb, tabung reaksi, cawan petri, gelas ukur, pemanas bunsen, jarum ose, gelas piala, kompor listrik, alat sterilisasi (autoklaf), mikroskop, gelas objek, aluminium foil, kapas, shaker, sentrifuse, vortex, thermocycler dan elektroforesis. Gambar alat yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 1. Bahan utama yang digunakan adalah ikan laut jenis tuna (Bluefin, Albacore, Bigeye dan Yellowfin) dan cakalang (Katsuwonus pelamis). Morfologi ikan tuna dapat dilihat pada gambar 7; 8; 9 dan 10. Masing-masing daging ikan diambil sebanyak 10 gram untuk dijadikan sampel. Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah media agar TSA (Tryptic Soy Agar), larutan garam fisiologis, aquades, media agar NB (Nutrient Broth), bahan untuk uji pewarnaan gram (Kristal violet, lugol iodine, safranin, etil alkohol dan akuades), TE, lisozim, agarosa, akuabidestilata, SDS10%, NaCl 5M, CTAB 10%, kloroform, isopropanol, etanol 70%, TBE, aquabides free nuclease, mix DNA, primer HdcForward dan Hdc-Reverse, primer 106-107 (Takahashi et al. 2003), tisu, etidium bromida, DNA (marker DNA) dan ethidium bromida. Cara pembuatan larutan dapat dilihat pada Lampiran 2.
20
Gambar 7. Ikan tuna albacore (Thunnus allalunga) Sumber: Koleksi pribadi (2009)
Gambar 8. Ikan madidihang (Thunnus albacore) Sumber: Koleksi pribadi (2009)
Gambar 9: Ikan tuna mata besar (Thunnus obesus) Sumber: Koleksi pribadi (2009)
Gambar 10: Ikan tuna sirip biru (Thunnus maccoyii) Sumber: Koleksi pribadi (2009)
21
3.3 Prosedur Kerja Prosedur kerja pada penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu isolasi bakteri; ekstraksi dan purifikasi DNA bakteri; amplifikasi DNA bakteri target; visualisasi DNA dengan elektroforesis gel agarosa dan DNA-Sequencing. 3.3.1 Isolasi dan karakterisasi isolat bakteri Isolasi bakteri terdiri dari 3 tahap yaitu: 1). Persiapan media dan persiapan sampel, 2). Pengenceran dan 3). Penuangan ke dalam cawan. (1) Isolasi bakteri (a). Persiapan media (Trypticase Soy Agar) dan persiapan sampel Untuk menstimulir pertumbuhan bakteri, medium yang digunakan harus mengandung komponen-komponen yang yang dibutuhkan oleh bakteri tersebut misalnya unsur karbon dan nitrogen. Sebanyak 10 gram sampel masing-masing diambil dari daging ikan tuna dan cakalang, kemudian dihaluskan dengan cara menggeruskan menggunakan mortar yang steril sampai halus. Sampel yang sudah dihaluskan dimasukkan ke dalam erlenmeyer yang sudah berisi larutan fisiologis sebanyak 9 ml. Langkah selanjutnya dilakukan pengenceran. (b). Pengenceran Sampel daging dengan berat masing-masing 10 gram yang sudah dihaluskan dimasukkan ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan larutan fisiologis sebanyak 9 ml. Sampel yang sudah diencerkan di pipet sebanyak 1 ml untuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi garam fisiologi 9 ml sehingga menjadi pengenceran 10-2 kemudian dihomogenkan. Selanjutnya sampel dipipet sebanyak 1 ml dari pengenceran 10-2 untuk dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi garam fisiologi 9 ml sehingga menjadi pengenceran 10-3 kemudian dihomogenkan. Demikian selanjutnya, dengan cara yang sama dibuat hingga pengenceran 10-8. Tujuan dari pengenceran ini adalah untuk menurunkan jumlah bakteri sehingga pada pengenceran akhir akan didapatkan isolat murni dengan jumlah koloni yang sedikit. Pada saat melakukan pengenceran semua alat dan lingkungan harus dalam keadaan steril agar tidak terkontaminasi oleh mikroorganisme lainnya.
22
(c). Penuangan ke dalam cawan Penuangan larutan sampel ke dalam cawan petri dilakukan dengan tujuan untuk menumbuhkan koloni bakteri dari sampel ikan tuna dan cakalang. Langkah dalam melakukan penuangan sampel yang sudah diencerkan ke dalam cawan yaitu, sampel dari pengenceran 10-4-10-8 sebanyak 1 ml dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah berisi Trypticase Soy Agar (TSA) beku sementara itu sekelilingnya dipanaskan menggunakan bunsen agar tidak terkontaminasi. Pengenceran 10-1-10-3 tidak dituangkan ke dalam cawan petri karena dianggap jumlah mikroba pada pengenceran tersebut masih tinggi atau tidak dapat dihitung (TBUD). Selanjutnya dilakukan inkubasi selama 24 jam. (2) Karakterisasi isolat bakteri Setelah dilakukan inkubasi selama 24 jam, koloni bakteri yang memiliki bentuk, warna dan ukuran dominan kemudian diisolasi untuk mendapatkan isolat murni bakteri. Untuk menyatakan isolat tersebut sudah murni dilakukan uji pewarnaan gram. Koloni-koloni yang telah terpisah tunggal diinokulasi kembali ke agar miring kemudian diinkubasi. Selanjutnya dilakukan uji pewarnaan gram. Proses isolasi dan pengujian isolat bakteri dapat dilihat pada Gambar 11. Penimbangan sampel sebanyak 10 gram
Penghalusan dengan mortar dan homogenisasi dalam larutan fisiologis
Pengenceran hingga 10-8
Penuangan ke dalam cawan petri kemudian inkubasi selama 24 jam
Inokulasi bakteri pada agar miring kemudian inkubasi selama 24 jam
Pengamatan morfologi sel bakteri
Gambar 11. Proses isolasi bakteri
23
(a) Morfologi koloni Pengamatan morfologi koloni dilakukan untuk mengetahui bentuk koloni dari atas, bantuk tepi, bentuk elevasi dan warna koloni secara visual. (b) Morfologi sel Pengamatan morfologi sel meliputi bentuk sel dan pewarnaan gram. Hasil preparat bakteri yang telah dibuat kemudian diamati bentuk selnya secara mikroskopik sehingga dapat diketahui bentuknya (kokus, batang atau spiral). Pewarnaan
gram
ini
bertujuan
untuk
menentukan
karakteristik
mikroskopik setiap galur bakteri seperti bentuknya. Proses pewarnaan gram menggunakan empat jenis larutan, yaitu zat warna basa (Kristal violet), mordant (lugol), pencuci zat warna (alkohol), dan zat warna lain (safranin). Tahap-tahap pewarnaan gram adalah sebagai berikut: mula-mula kaca objek dibersihkan dengan kapas yang telah diberi alkohol. Selanjutnya diberi kode (label) sesuai jenis sampel yang digunakan. Biakan bakteri pada agar miring diambil menggunakan jarum ose steril dan dipindahkan di bagian tengah kaca objek yang sebelumnya telah ditetesi larutan garam fisiologis steril. Kemudian preparat tersebut dikeringkan dengan cara fiksasi di atas bunsen. Kemudian ditetesi dengan larutan kristal violet dan dibiarkan selama 1 menit. Selanjutnya dibilas dengan akuades dengan cara memegang kaca objek pada posisi miring dan dikeringkan. Preparat tersebut selanjutnya ditetesi dengan lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu dibilas dengan akuades. Kemudian preparat ditetesi larutan pemucat warna yaitu alkohol 95%, selanjutnya dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Preparat ditetesi larutan safranin selama 2 menit lalu dibilas dengan alkohol dan dikeringkan dengan menggunakan kertas tissu secara perlahan-lahan. Kemudian diamati bentuk selnya menggunakan mikroskop dengan pembesaran 100x10. Sebelumnya preparat ditetesi dengan minyak imersi. Bakteri dinyatakan bersifat gram negatif apabila warna selnya merah dan dinyatakan gram posistif apabila warna selnya ungu. Proses pewarnaan gram bakteri dapat dilihat pada Gambar 12.
24
3.3.2 Ekstraksi dan purifikasi DNA isolat bakteri Ekstraksi DNA bakteri target menggunakan metode CTAB 10% (Sambrook et al. 2001). Purifikasi DNA bakteri menggunakan beberapa bahan kimia seperti SDS, lisozim, NaCl, kloroform dan etanol. Sel bakteri dikultivasikan ke media Nutrient Broth (NB) cair 50 ml. Proses inkubasi dilakukan pada suhu ruang dan digoyang (shaker) selama 24 jam. Kultur hasil inkubasi kemudian disentrifugasi untuk memisahkan antara pelet sel bakteri dan supernatannya. Supernatan yang dihasilkan dibuang. Pelet kemudian diresuspensi dengan penambahan 500 µl buffer TE dan 40 µl lisozim dan diinkubasi 37 0C selama 1 jam. Kemudian ditambahkan 100 µl SDS 10%, 100 µl NaCl 5M, 80 µl CTAB 10% dan diinkubasi pada suhu 68 0C selama 10 menit. Suspensi yang telah diinkubasi diekstrak dengan menggunakan kloroform (1:1) kemudian tabung dibolak-balik beberapa kali dan selanjutnya disentrifuse 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan ke tabung mikro 1,5 ml baru yang steril. Selanjutnya ditambahkan isopropanol dengan volume 2/3 dari jumlah supernatan. Suspensi tersebut kemudian disentrifuse selama 5 menit 13.000 rpm. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan dilakukan pencucian dengan etanol 70% 100 µl. Kemudian suspensi disentrifuse 13.000 rpm selama 1 menit, supernatan dibuang dan pelet yang telah merupakan kromosom bakteri diinkubasi selama 24 jam di dalam freezer. Proses ekstraksi dan purifikasi DNA isolat bakteri dapat dilihat pada Gambar 13. 3.3.3 Amplifikasi DNA bakteri target Tahapan yang kedua dari proses identifikasi adalah melakukan PCR dengan menggunakan dua jenis primer spesifik dengan gen target yaitu hdc (histidin dekarboksilase) pada panjang basa 709 bp dengan urutan basa primer forwardnya adalah 5’-TCHATYARY AACTGYGGT GACTGGRG-3’ dan urutan basa
primer
reversenya
5’-CCCACAKCATBARWGGDGTRTGRCC-3’.
Sedangkan panjang basa DNA target dari primer 106-107 adalah 534 bp. Urutan basa primer 106 adalah 5’AAYTCNTTYGAYTTYGARAARGARG 3’ dan primer 107 adalah 5’-ATNGGNGANCCDATCATYTTRTGNCC-3’ (Takahashi et al. 2003). Berikut ini adalah tabel jumlah bahan yang digunakan untuk masing-
25
masing primer dalam reaksi PCR dan diagram alir proses amplifikasi PCR dengan menggunakan alat thermocycler yang disajikan pada Gambar 14. Tabel 3. Jumlah bahan yang digunakan untuk amplifikasi DNA bakteri Bahan Aquabidestilata free nucleic DNA Taq polymerase Primer forward Primer reverse DNA bakteri Total
Jumlah (µl) 8,5 12,5 1 1 2 25
Persiapan alat dan bahan
Pemindahan 1 ose bakteri ke kaca objek dan kemudian difiksasi
Penambahan dengan larutan Kristal violet
Pembilasan dengan aquades
Penambahan dengan larutan lugol
Pembilasan dengan aquades
Penambahan dengan alkohol 95%
Pembilasan dengan aquades
Penambahan dengan larutan safranin
Pembilasan dengan alkohol dan pengeringan dengan kertas tissu
Pengamatan
Gambar 12. Proses pewarnaan gram isolat bakteri
26
Kultivasi isolat bakteri ke media cair
Inkubasi pada suhu ruang selama 18-24 jam sambil digoyang (shaker)
Pemindahan 100µl isolat ke dalam tabung mikro 1,5 ml
Sentrifuse untuk pengambilan pelet (endapan)
Penambahan 500µl TE dan 40µl lisozim
Inkubasi selama 1 jam pada suhu 370C
Penambahan 100µl SDS 10%, 100µl NaCl 5M dan 80µl CTAB 10% Inkubasi selama 10 menit pada suhu 680C
Ekstraksi dengan kloroform (1:1)
Sentrifuse 13.000 rpm selama 10 menit
Pemindahan supernatan ke dalam tabung mikro 1,5 ml baru yang steril
Penambahan isopropanol 2/3 dari jumlah supernatan
Sentrifuse 13.000 rpm selama 5 menit
Pembuangan supernatan
Pencucian pelet dengan etanol 70% sebanyak 100µl
Sentrifuse 13.000 rpm selama 1 menit dan pembuangan supernatan
Penyimpanan di dalam freezer
Gambar 13. Proses ekstraksi dan DNA isolat bakteri dengan metode CTAB 10%
27
Persiapan dan sterilisasi alat dan bahan
Penambahan aquabidestilata ke dalam tabung PCR steril
Penambahan DNA Taq polymerase
Penambahan primer forward
Penambahan primer reverse
Penambahan DNA bakteri target
Amplifikasi dengan alat thermocycler
Gambar 14. Proses amplifikasi DNA dengan menggunakan alat thermocycler 3.3.4 Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel agarosa Proses visualisasi DNA hasil ekstraksi dengan menggunakan agarosa 2%. Sebanyak 2g agarosa dimasukkan ke dalam erlenmeyer, selanjutnya dilarutkan dengan 100 ml TBE 1x yang telah diukur dengan gelas ukur dan diaduk merata. Gel agarosa tersebut dimasukkan ke dalam microwave selama 5-7 menit sampai semua agarosa terlarut. Setelah agak dingin, gel agarosa dimasukkan ke dalam cetakan. Setelah benar-benar dingin agarosa diangkat dari cetakan. Agar yang sudah mengeras dipindahkan dari bak pencetak ke dalam elektroforesis yang sudah berisi larutan buffer TBE 1x hingga terendam. Elektroforesis dihubungkan ke power supply yang diatur pada tegangan 400 volt dan dijalankan selama 1 jam untuk melajukan partikel DNA sampai dicapai resolusi yang diinginkan. Pengamatan terhadap hasil elektroforesis dilakukan dengan menggunakan sinar UV. Hasil positif ditunjukkan dengan adanya pita berpendar pada saat penyinaran. Proses visualisasi ini bertujuan untuk mengetahui adanya keberadaan dari gen target penghasil histamin dari
28
bakteri yang telah diisolasi sebelumnya. Keberadaan dari gen target tersebut ditandai oleh pita yang berwarna terang pada agarosa. Proses
elektroforesis
akan
menganalisis
dan
memisahkan
DNA
berdasarkan berat atau panjang DNA. Molekul DNA bergerak dari elektroda negatif menuju elektroda positif. Kecepatan pergerakan DNA berdasarkan berat dan panjang DNA. DNA yang berukuran kecil akan lebih cepat bergerak, sedangkan DNA dengan berat molekul lebih besar akan semakin sulit melewati pori atau rongga agar . 3.3.5 DNA-Sequencing Metode ini dilakukan untuk mengetahui urutan basa nitrogen dari gen bakteri yang mampu memproduksi enzim histidin dekarboksilase (hdc) yang telah diisolasi pada awal penelitian. Proses sequencing terhadap DNA bakteri pengkode enzim histidin dekarboksilase dilakukan pada suatu lembaga penelitian biologi molekuler “Macrogen Inc” yang berlokasi di Korea. Hasil sequencing dicocokkan dengan bank data National Center for Biotechnolgy Information (NCBI).
