29
3. METODE PENELITIAN 3.1. Lokasi dan Waktu Penelitian Lokasi penelitian meliputi Laut Sulawesi, Selat Makassar, Teluk Bone, Laut Flores, Laut Banda, Teluk Tolo, Laut Maluku dan Teluk Tomini (Gambar 7). Waktu penelitian dilaksanakan selama bulan Maret 2010 – Oktober 2011. Analisis sampel dilaksanakan di laboratorium Genetika, Balai Penelitian Perikanan Laut, Muara Baru, Jakarta.
1 7
8 2 6 5
3
4
Gambar 7. Peta lokasi penelitian dan lokasi sampling. Keterangan: 1) Laut Sulawesi; 2) Selat Makassar; 3) Teluk Bone; 4) Laut Flores; 5) Laut Banda; 6) Teluk Tolo; 7) Laut Maluku dan 8) Teluk Tomini.
29
30
3.2. Bahan dan Alat Penelitian Data genetika yang digunakan berupa data polimorfisme fragmen dan situs restriksi yang diperoleh dari hasil analisis RFLP terhadap sekuen teramplifikasi dari genom mtDNA. Genom mtDNA diekstrak dari contoh jaringan daging bagian punggung ikan. Bahan-bahan kimia yang dipakai dalam analisis sampel adalah sebagai berikut: Pengambilan dan pengawetan sampel: •
Ethanol 70%
Ekstraksi dan purifikasi: •
PureLinkTM Genomic DNA Kits - Invitrogen
Isolasi dan amplifikasi (PCR): •
Primer TDKD dan PRO yaitu: -
primer HN20: 5’ – GTG TTA TGC TTT AGT – TAA GC – 3’, dan
-
primer LN20: 5’ – ACC ACT AGC ACC CAA AGC TA – 3’.
•
H2O
•
Pure taq ready to-go PCR beads
•
Bromophenol
Restriksi: •
6 jenis enzim restriksi, terdiri dari: Mbo I, Alu I, Hind III, Taq I, Rsa I dan
Xba I. •
Buffer dari masing-masing enzim
Elektroforesis: •
Bubuk agarose
•
SYBR SafeTM
•
TBE (Tris Borate EDTA)
31
•
Loading bromophenol
•
Marker DNA
Visualisasi: •
H2O
Peralatan yang digunakan dalam analisis DNA dengan metode RFLP adalah: gelas beker, pinset, pipet mikro, tube mikro, erlenmeyer, hot plate stirrer, gelas ukur, inkubator, sentrifuge, mesin PCR, Vortex, elektroforesis sistem, Blue Light transilluminator dan kamera.
3.3. Pengambilan Sampel Sampel yang diambil berupa jaringan ikan D. macarellus hasil tangkapan nelayan
one
day
fishing
(1
hari
operasi)
yang
beroperasi/melakukan
penangkapan pada lokasi penelitian. Sampel diambil secara acak pada setiap lokasi dengan perincian sebagai berikut: Laut Sulawesi 8 ekor, Selat Makassar 13 ekor, Teluk Bone 10 ekor, Laut Flores 10 ekor, Laut Banda 9 ekor, Teluk Tolo 8 ekor, Laut Maluku 8 ekor dan Teluk Tomini 8 ekor. Pada setiap ikan diambil jaringan daging bagian punggung. Spesimen (sampel jaringan ikan) disimpan dalam tabung mikro (micro tube) berukuran 1.500 µl dan diawet dengan ethanol 70% kemudian dibawa ke laboratorium untuk dianalisis lebih lanjut.
3.4. Analisis Sampel Analisis untuk mendapatkan data polimorfisme fragmen dan situs restriksi dilaksanakan
dengan
metode
RFLP
(Restriction
Fragment
Length
Polymorphism) dengan menggunakan 6 jenis enzim restriksi (restriction endonuclease). Restriksi dilakukan terhadap sekuen teramplifikasi dari control region DNA Mitochondria (mtDNA) D-loop. Genom mtDNA diperoleh melalui
32
ekstraksi jaringan daging bagian punggung ikan. Analisis dilaksanakan melalui tahapan sebagai berikut : -
Ekstraksi dan purifikasi
-
Amplifikasi (PCR)
-
Digesti (restriksi)
-
Elektroforesis
-
Visualisasi.
Dalam amplifikasi digunakan 2 macam ‘primer’, yaitu primer TDKD dan PRO; sedang enzim restriksi yang dipakai 6 jenis, yaitu Mbo I, Alu I, Hind III, Taq I, Rsa I
dan Xba I. Ekstraksi DNA DNA ikan diekstrak dari 5-10 mg daging bagian punggung dengan menggunakan metode mini column, sebagai berikut: potongan daging ikan dimasukkan kedalam tabung 1,5 ml yang telah berisi 180 µl larutan PureLink Genomic Digestion Buffer dan 20 µl Proteinase K, kemudian diaduk dengan menggunakan vortex dan diinkubasi pada suhu 55oC sampai potongan daging/sirip hancur (1 – 4 jam). Setelah potongan daging/sirip hancur dilakukan proses sentrifuge dengan kecepatan maksimum (15.000 rpm) selama 3 menit sehingga diperoleh supernatan (lysate). Kemudian lysate tersebut dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuge yang baru. Sebanyak 20 µl larutan RNase A ditambahkan kedalam lysate dan diaduk dengan menggunakan vortex lalu diinkubasi pada suhu ruangan selama 2 menit. Kemudian ditambahkan 200 µl larutan PureLink Genomic Lysis/Binding Buffer dan diaduk dengan menggunakan vortex. Proses selanjutnya ditambahkan sebanyak 200 µl ethanol 96 – 100% ke dalam lysate dan aduk kembali dengan menggunakan vortex.
33
Lysate (~640 µl) dipindahkan ke dalam PureLink Spin Column dan disentrifuge pada kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit pada suhu ruangan. Collection tube (tube bagian bawah) diganti dengan PureLink Collection Tube yang baru (memindahkan mini column ke collection tube yang baru). Kemudian ditambahkan 500 µl larutan Wash Buffer 1 dan disentrifuge dengan 10.000 rpm selama 1 menit. Collection tube diganti lagi dengan yang baru lalu ditambahkan 500 µl larutan Wash Buffer 2 dan disentrifuge dengan kecepatan maksimum selama 3 menit pada suhu ruangan. Spin column dipindahkan ke dalam mikrotube 1,5 ml baru dan steril lalu ditambahkan 25 – 200 µl larutan PureLink Genomic Elution Buffer ke dalam colomn. Kemudian diinkubasi dalam suhu ruangan selama 1 menit lalu disentrifuge dengan kecepatan maksimum selama 1 menit. Cairan yang ada dalam mikrotube 1,5 ml tersebut telah mengandung DNA yang telah dipurifikasi dan akan dilakukan proses selanjutnya yaitu Amplifikasi. Kemudian column dibuang. Amplifikasi daerah mtDNA D-loop Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi daerah control region mtDNA D-loop adalah: - primer HN20: 5’ – GTG TTA TGC TTT AGT – TAA GC – 3’, dan - primer LN20: 5’ – ACC ACT AGC ACC CAA AGC TA – 3’. Penggandaan DNA (amplifikasi) dilakukan didalam mesin PCR (Polymerize Chain Reaction) dengan komposisi reaksi terdiri dari: 10 µg, 10 pmol setiap primer dan “pure taq DNA” (Promega) dengan total volume keseluruhannya 25 ul. Siklus PCR disetting seperti berikut: satu siklus denaturasi pada suhu 94oC selama 2 menit, 35 siklus penggandaan yang terdiri dari 94oC selama 1 menit, 48oC selama 1 menit dan 72oC selama 1 menit; selanjutnya satu siklus terakhir pada suhu 72oC selama 5 menit.
34
Restriksi dan Visualisasi Produk DNA yang diperoleh kemudian direstriksi dengan menggunakan enzim restriksi (restriction endonuklease) sesuai dengan prosedur standar perusahaan. Hasil restriksi kemudian dipisahkan secara elektroforesis dengan menggunakan gel agarose 1,5% dalam TBE-buffer (Tris-Boric-EDTA) dan diamati dengan blue-light illuminator serta di cetak gambarnya dengan kamera SLR.
3.5. Interpretasi dan Analisis Data Dari hasil visualisasi akan diperoleh pola-pola restriksi DNA dari setiap enzim restriksi pada tiap sample. Dari pola-pola tersebut dapat diduga ukuran fragmen dari marker mtDNA D-loop yang teramplifikasi, dan tipe-tipe haplotypenya. Selanjutnya ditentukan composite haplotype beserta frekuensinya masing-masing pada setiap populasi contoh sebagai dasar untuk menghitung parameter genetik (diversitas haplotype ‘h’; jarak genetik ‘D’). Kekerabatan antar populasi diduga berdasarkan Nei’s Jarak Genetik. Analisis uji untuk mengetahui perbedaan genetik diantara populasi contoh dilakukan dengan analisis moleculer varian (AMOVA) dan uji jarak berpasangan (F-st).
Diversitas haplotype atau
Diversitas gene dihitung berdasarkan Nei dan Tajima (1981) untuk mengamati tingkat variasi genetik yang ada. Kekerabatan antar populasi dianalisa dengan menggunakan Jarak Genetik, Nei (1973).
Analisis dibantu dengan software
TFPGA (Tools For Population Genetic Analyses) (Miller, 1997).
