24
3. METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2011-Juni 2012. Tempat penelitian untuk perlakuan irradiasi dilakukan di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi-Badan Tenaga Nuklir Nasional (PATIR-BATAN), untuk deteksi mutan secara morfologi, molekuler dan fitokimia dilaksanakan di Pilot Plant Propagasi Tanaman, Laboratorium Teknologi Gen dan Laboratorium Recovery Balai Pengkajian Bioteknologi, Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) di Kawasan PUSPIPTEK Serpong Tangerang.
3.2. Bahan dan Alat Penelitian Bahan yang digunakan adalah biji sambiloto koleksi dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) aksesi Kanigoro Karanganyar. Bahan yang digunakan untuk penanaman biji sambiloto berupa polibag ukuran 15x15 cm, pupuk kandang, tanah dan sekam bakar dengan perbandingan (1:1:1/v:v:v) dan hormon perakaran serta sungkup. Bahan yang digunakan untuk isolasi dan amplifikasi DNA berupa buffer Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), merkaptoetanol, Poly Vynil Poly Pyrrolidone (PVPP), larutan chloroform: isoamilalkohol (CIAA), 5M NaCl, 80% etanol, Tris EDTA, RNAse, pewarna Sybersafe, gel agarose, buffer tris-HCl, 10 primer ISSR yaitu SBLT2, SBLT3, SBLT5, SBLT8, SBLT13, SBLT14, SBLT15, SBLT17, SBLT18 dan SBLT19 (Lampiran 2), taq DNA polymerase (dreamtaq dari Fermentas), MgCl, buffer PCR, dNTP dan air bebas DNAse & RNAse. Bahan yang digunakan untuk ekstraksi dan analisa profil fitokimia adalah metanol (HPLC grade), air demineral, asetonitril, asam folat, standar andrographolide (Sigma). Alat yang digunakan dalam penelitian adalah Gamma Chamber Cobalt 60, mortal dan pestle, waterbath, sentrifuse, vortex, mikropipet, Polymerase Chain Reaction (PCR), mesin nanodrop, peralatan elektroforesis, shaker horizontal, centrifugal concentrator, High Performance Liquid Chromatography
25
(HPLC Alliance 2695 (Waters) with Photodiode Array Detector 2996 (Waters)) dan Kolom C-18.
3.3. Prosedur Penelitian Kerangka kerja pada penelitian ini dapat dilihat pada Gambar 7, dengan tahapan kerja adalah sebagai berikut: irradiasi biji sambiloto, germinasi dan penghitungan letal dosis irradiasi, penanaman bibit sambiloto hasil irradiasi, deteksi perubahan mutan secara morfologi, deteksi perubahan profil DNA mutan, dan deteksi perubahan profil fitokimia mutan.
Biji Sambiloto Irradiasi dengan Sinar Gamma Cobalt 60 Germinasi & Penghitungan LD50 Penanaman bibit sambiloto
deteksi secara morfologi
deteksi profil DNA
deteksi profil fitokimia
pengamatan morfologi
Isolasi DNA mutan
ekstraksi daun mutan
subkultur generasi M1V1-M1V3
Amplifikasi DNA dengan primer ISSR
penentuan profil fitokimia
Analisa Data Gambar 7. Kerangka kerja penelitian
26
3.3.1. Irradiasi Biji Sambiloto Biji sambiloto dimasukkan dalam plastik klip bersih dan diirradiasi pada mesin Gamma Chamber 4000A menggunakan sumber radiasi berupa Cobalt 60. Perlakuan dosis yang digunakan adalah dosis 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, dan 300 Gy.
3.3.2. Penghitungan Letal Dosis Irradiasi (LD50) Biji sambiloto hasil irradiasi sebanyak 100 biji direndam dalam larutan bakterisida dan fungisida 2 gr/L selama 24 jam. Biji dicuci bersih menggunakan air sampai larutan bakterisida dan fungisida tidak tersisa. Biji yang telah bersih ditanam pada pot tray dengan menggunakan media sekam bakar, pupuk kandang dan tanah dengan perbandingan 1:1:1 (v/v/v). Pertumbuhan biji diamati dan dihitung letal dosis radiation (LD50) berdasarkan persentase 50% kematian tanaman pada 4 minggu setelah tanam (MST). Data yang didapat dianalisa menggunakan analisa CurveExpert 1.3 untuk menentukan LD50.
3.3.3. Penanaman dan Perbanyakan Sambiloto Hasil Irradiasi Sebanyak 30 tanaman sambiloto hasil irradiasi (generasi M1V0) berumur 6 minggu setelah tanam dipindah dalam polibag berukuran 15x15 cm menggunakan media yang sama pada saat penyemaian. Setelah berumur 10 MST, sebanyak 30 tanaman sambiloto generasi M1V0 di perbanyak secara vegetatif dengan cara melakukan pemotongan pucuk-pucuk dengan ukuran ± 10 cm untuk dilakukan perbanyakan secara ex vitro. Pucuk-pucuk tersebut direndam dalam larutan bakterisida dan fungisida 2 gr/L untuk selanjutnya pada pangkalnya diolesi hormon perakaran dan ditanam pada polibag. Media yang digunakan untuk perbanyakan secara ex vitro ini sama dengan media pada saat penyemaian. Pucuk tanaman diinkubasi dalam sungkup selama 2 MST sampai terbentuk akar kemudian dipindah dalam screen house sampai berumur 8 MST. Hasil perbanyakan tanaman generasi M1V1 pada umur 8 MST dilakukan pemotongan kembali pucuk-pucuk dan dilakukan perbanyakan seperti cara diatas untuk mendapatkan tanaman generasi M1V2-M1V4.
27
3.3.4. Deteksi Perubahan Mutan secara Morfologi Pengamatan morfologi dilakukan pada mutan sambiloto generasi M1V0, M1V1, M1V2 dan M1V3. Parameter fenotipe generasi M1V0-M1V3 yang diamati adalah: tinggi tanaman, jumlah nodus, jumlah daun, panjang dan lebar daun serta jumlah cabang tanaman hasil irradiasi dibandingkan dengan kontrol. Data pertumbuhan tanaman di analisa dengan menggunakan analisis varian (ANOVA) dan jika data berbeda dilanjutkan dengan uji Tukey pada taraf kepercayaan P<0.05 menggunakan software Minitab 16.
3.3.5. Deteksi Perubahan Profil DNA Mutan dengan Penanda Molekuler Dari beberapa perbedaan karakter morfologi yang diamati pada generasi M1V2, diambil 31 tanaman dengan karakter dan dosis yang berbeda untuk dilakukan deteksi perubahan profil DNA pada mutan sambiloto dan 1 tanaman tanpa perlakuan irradiasi sebagai kontrol. Deteksi perubahan DNA profil mutan dilakukan dengan menggunakan penanda ISSR dengan tahapan sebagai berikut: isolasi DNA sambiloto hasil perlakuan irradiasi sinar gamma, amplifikasi DNA sambiloto dengan primer ISSR dan analisa molekuler data hasil amplifikasi DNA sambiloto.
Isolasi DNA Sambiloto Hasil Perlakuan Irradiasi Ke 31 sampel daun mutan tanaman sambiloto dengan berbagai perubahan karakter dan tanaman kontrol pada generasi M1V2 ditimbang sebanyak 200 mg. Daun kemudian diisolasi DNA-nya dengan menggunakan metode modifikasi CTAB. Tahapan isolasi DNA daun tanaman sambiloto dapat dilihat pada Lampiran 3. Kualitas DNA hasil isolasi yang telah didapat divisualisasikan dengan gel agarose 0,8% pada peralatan elektroforesis dengan 100 volt selama 30 menit menggunakan pewarna syber safe. Pita DNA dipaparkan pada sinar uv illuminator dan didokumentasi dengan GELDOC. Kuantitas DNA hasil isolasi diukur dengan menggunakan mesin nanodrop untuk menentukan konsentrasi dan kemurnian DNA.
28
Amplifikasi DNA Sambiloto dengan 10 Primer ISSR Amplifikasi DNA sambiloto dilakukan pada mesin PCR dengan menggunakan 10 jenis primer ISSR. Untuk reaksi PCR digunakan campuran larutan yang terdiri dari 200-300 ng DNA template, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM ISSR primer, 0.2 mM dNTP, 1X PCR buffer, 1U Taq DNA polymerase dan penambahan air bebas DNAse & RNAse sampai mencapai total volume 20 µL. Program amplifikasi dilakukan dengan urutan sebagai berikut: denaturasi awal pada kondisi 94ºC selama 2 menit, dilanjutkan dengan 40 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94ºC selama 30 detik, amplifikasi 52ºC selama 45 detik, dan extension pada 72ºC selama 2 menit. Setelah selesai 40 putaran selanjutnya diakhiri dengan final extension pada 72ºC selama 7 menit. Modifikasi suhu annealing dilakukan untuk mengoptimalkan reaksi primer ISSR yang digunakan. Visualisasi DNA hasil amplifikasi dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarose 1.5% dengan 100 volt selama 30 menit menggunakan pewarna Sybersafe. Pita DNA yang didapat dipaparkan pada sinar uv illuminator dan didokumentasikan dengan GELDOC.
Analisa Molekuler Data Hasil Amplifikasi DNA Sambiloto Analisa data dilakukan dengan menghitung produk DNA hasil amplifikasi dengan 10 primer ISSR. Pita DNA yang dihasilkan dinilai dengan cara diubah ke bentuk data biner: jika ada pita diberi nilai 1 dan jika tidak ada pita diberi nilai 0 pada setiap profil pita DNA hasil elektroforesis. Data biner tersebut digunakan untuk menghasilkan matrik data biner dengan bantuan program Numerical Taxonomy and Multivariate System (NTSYS) versi 2.02i. Dari matrik data biner diturunkan menjadi matrik kesamaan genetik (similarity matrix) dengan menggunakan koefisien DICE. Matrik kesamaan genetik ini dibuat menggunakan Similarity for Quantitative Data (SIMQUAL) yang merupakan sub-program Similarity and Dissimilarity. Berdasarkan nilai matrik kesamaan genetik yang didapat dilakukan analisa pengelompokan (cluster analysis) menggunakan Unweighted Pairgroup Method with Arithmetic Average (UPGMA). Analisa pengelompokan ini dilakukan dengan sub-program sequential agglomerative hierarical nested cluster analysis (SAHN). Hasil analisis pengelompokan
29
UPGMA menggunakan tree-display yang merupakan sub-program Graphics Program NTSYS. Dendrogram yang diperoleh digunakan untuk mengevaluasi jarak genetik dari mutan-mutan yang terbentuk.
3.3.6. Deteksi Perubahan Profil Fitokimia Mutan dengan HPLC Deteksi perubahan profil fitokimia dilakukan pada mutan generasi M1V4. Sebanyak 4 mutan, yang didapat dari dendrogram hasil profil DNA dengan jarak genetik yang terjauh dan ditengah dari normal, diambil dan dilakukan deteksi perubahan profil fitokimia. Sebagai pembanding dilakukan juga deteksi profil fitokimi pada kontrol. Deteksi perubahan profil fitokimia mutan dilakukan pada alat HPLC dengan tahapan sebagai berikut: (1). Ekstraksi daun sambiloto, dan (2). Penentuan profil fitokimia mutan dan kontrol dengan HPLC.
Ekstraksi Daun Sambiloto Ekstraksi daun sambiloto dilakukan dengan cara: daun sambiloto dikeringkan dalam oven bersuhu 60 oC selama 4 jam sampai didapatkan simplisia kering. Simplisia kering ditimbang sebanyak 0.05 gram dan dihaluskan. Serbuk halus dimasukkan kedalam tabung falkon 15 mL kemudian diekstraksi dengan menggunakan larutan metanol (pa) sebagai solven ekstraksi sebanyak 2.5 mL. Kemudian simplisia kering dan metanol dalam tabung falkon digojok secara horizontal dalam shaker dengan kecepatan 300 rpm selama 30 menit. Selanjutnya ekstrak di sentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan simplisia diekstrak ulang dengan cara diatas. Supernatan yang terkumpul dari dua kali ekstraksi di pekatkan dengan menggunakan centrifugal concentrator sampai kering selama 2 jam. Ekstrak kering kemudian dilarutkan dalam larutan metanol sebanyak 1 mL dan siap disuntikkan pada alat HPLC.
Penentuan Profil Fitokimia Mutan Penentuan perubahan profil fitokimia mutan dilakukan dengan alat HPLC dengan detektor berupa Photodiode Array Detector (PDA). Kurva kalibrasi dilakukan
untuk
mendapatkan
regresi
linier
berdasarkan
area
puncak
30
menggunakan
larutan
standar
andrographolide
(Sigma).
Fase
stationer
menggunakan kolom Symmetry C18 (150x4.6 mm) ukuran 5 µm. Fase gerak adalah air dengan pH 3.0 (asam format): acetonitrile dengan perbandingan (70:30 v/v). Kolom diseimbangkan dengan fase gerak selama satu jam. Elusi isokratik dilakukan pada suhu ruang dan di pompa pada kecepatan aliran 1 mL/menit. Deteksi dilakukan pada panjang gelombang 230 nm. Larutan yang disuntikkan sebanyak 10 µL. Evaluasi dilakukan berdasarkan waktu retensi dan area puncak yang terbentuk dengan regresi linier. Kromatogram dari standar andrographolide dibandingkan dengan mutan dan kontrol dari tanaman sambiloto. Setelah itu dihitung kadar andrographolide yang terbentuk dari masing-masing mutan.
