111.
METODOLOGI PENELITIAN
A. WAKTU DAN TEMPAT PENELITIAN Penelitian dilakukan selama bulan Agustus 2000 hingga September 2001. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Pangan dan Ki~nia
Pangan, di Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi IPB, Laboratorium Mikrobiologi Pangan di Jurusan Teknologi Pangan dan Gizi Fateta IPB. B. BAHAN DAN ALAT 1. Bahan
Bahan yang digunakan adalah dadih yang difermentasi dalanl empat jenis bambu yaitu bambu betung, betung kuning, buluh (talang), dan gombong, yang diperoleh dari Kab. 50 Kota, Kab. Agam (Kodya Bukittingi), Kab Tanah Datar, dan Kab. Solok. Media yang digunakan untuk isolasi dan identifikasi serta uji biokimia, yaitu MRSB, Bacto Agar, Pewamaan gram, BCP (Brom Cresol Purple), Litmus Milk, MR-VP, Gibson semi solid, ekstrak khamir, trypton,
pepton, L-arginin monokhlorida, dan beberapa medium penunjang seperti; sukrosa, galaktosa, rafinosa, fruktoa, arabinosa, laktosa, xylosa, melibiosa, maltosa, mannosa, sorbitol, susu skim. Untuk pengujian aktivitas antimikroba digunakan media NA (Nutient Agar), dan NB (Nutrient Broth). Kultur bakteri patogen yang
digunakan adalah E. coli, S. aureus, S. typhimurium, yang diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi PAU.
23 Bahan kimia yang digunakan PBS (Phosphate Buffer Saline), Oxgal, Heksadekana, NaOH, HC1, KH2P04, K2HP04, NaCL, KC1, H202, metil merah, reagen Nessler, Tween, Gliserol, Urea, Alkohol, dan lainlain. 2. Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi refrigerator, inkubator, autoklaf, spektrofotometer, mikroskop, cawan petri, ose, pH meter, tabung reaksi, erlenmeyer, gelas ukur, gelas piala, coloni counter, jangka sorong, vortek, mikropipet, timbangan, batang pengaduk,
serta
alat-alat gelas lainnya.
C. METODOLOGI PENELITIAN Penelitian dilakukan dalam beberapa tahap yang meliputi ; tahap persiapan sampel, isolasi dan identifikasi BAL, pengujian aktivitas antimikroba, produksi senyawa antimikroba, dan pengujian sifat probiotik. Bagan penelitian secara keseluruhan dapat dilihat pada Garnbar 1. Gambar jenis-jenis bambu yang digunakan untuk fermentasi dadih pada masing-masing daerah sampel dapat dilihat pada Lampiran 1-2, sedangkan dadih hasil fermentasi dalam tabung bambu yang siap untuk diisolasi dapat dilihat pada Gambar 2.
Q Sampel
G=l w Isolasi dan Identifikasi
Pengujian Aktivitas Antimikroba
Pengujian Sifat Probiotik (pH 3 3 , Garam empedu)
Pengujian Senyawa Antimikroba (Asam, Bakteriosin)
Uji Koagregasi Uji Sifat Hidrofobisitas
e l Isolat unggul
Gambar 1. Bagan keseluruhan tahapan penelitian.
25
1. Persiapan sarnpel Tabung bambu dikumpulkan dari daerah Solok, Batusangkar, Kab. 50 Kota, dan Kodya Bukittinggi sehingga diperoleh 4 jenis bambu yaitu; gombong, betung, betung kuning, dan buluh, masing-masing dengan panjang 25 cm. Tabung bambu diletakkan terbalik selama satu malam, sebelum dilakukan pengisisan susu. Pengisian susu kerbau dilakukan di daerah Bukittinggi, dengan volume susu 150 mlltabung bambu. Kemudian tabung bambu ditutup dengan daun pisang, dan disusun dalam keranjang untuk selanjutnya dibawa ke Lab. Mikrobiologi Pangan PAU Bogor.
Gambar 2. Dadih dalam tabung bambu yang siap untuk diisolasi
2.
Isolasi Bakteri h a m Laktat Isolasi bakteii asam laktat dilakukan secara bertahap untuk mendapatkan berbagai jenis bakteri asam laktat. Metode isolasi bakteri asam laktat mengikuti metode Aryanyata (1991) dan Hayakawa (1992).
26 Isolasi bakteri asam laktat dilakukan dengan mensuspensikan 5 gr dadih (fermentasi 48 jam), kedalam 9 ml larutan 0,85% NaCl (pengenceran lo-'). Kemudian dibuat pengenceran berseri sampai 1 0 . ~ke dalam larutan garam fisiologis, 3 seri dari pengenceran terakhir diplating sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri steril. Tambahkan 15-20 ml media MRS untuk melihat pertumbuhan Lactobacillus dan bakteri asam laktat lainnya. Lakukan penggoyangan secara mendatar dan setelah agar membeku, diinkubasi pada suhu 37 OC selama 48-72 jam. Koloni yang diamati dengan penampakan rata dan bewarna kuning atau abu-abu sampai coklat disekitar koloni. Koloni dengan warna dan ukuran yang berbeda digoreskan kembali ke medium yang sama dengan goresan kuadran. Inkubasi dilakukan pada kondisi yang sama dengan di atas. Penggoresan dilakukan sampai didapat koloni yang seragam, koloni yang sudah mumi dipilih dan dilakukan pewamaan gram dan uji katalase (Hadioetomo 1998). Isolat terpilih dari pengamatan gram positif dan katalase negatif, dilakukan pengelompokkan berdasarkan bentuk sel (batang, bulat, oval), untuk mengidentifikasi genus bakteri asam laktat.
Selanjutnya isolat
ditumbuhkan selama dua hari dalam media agar semi solid MRS (0,7% agar) yang mengandung 0,2% CaC03 dalam bentuk agar tegak sebagai kultur stok. Kultur stok kemudian diawetkan pada suhu 5 OC, dan hams diperbarni setiap 2 bulan.
Bila akan digunakan pada
setiap tahap
pengujian bakteri asam laktat, kultur stok dipersiapkan menjadi kultur kerja.
3. Identifikasi Bakteri Asam Laktat Bakteri asam laktat diidentifikasi sampai tingkat spesies, langkah pertama yang dilakukan adalah mempersiapkan kultur kerja dari kultur stok. Caranya adalah dengan menginokulasikan sebanyak 3 - 4 ose kultur stok kedalam MRS broth, dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 OC. Kultur ini selanjutnya digunakan untuk mengidentifikasi spesies dari bakteri asam laktat. Identifikasi bakteri dilakukan berdasarkan pengamatan ciri-ciri fisiologis, dan sifat-sifat biokimia bakteri. Pengamatan ciri-ciri fisiologi dan sifat-sifat biokimia meliputi; (1) Uji katalase (Hadioetomol993); (2) pertumbuhan pada suhu berbeda (Hayakawa 1993); (3) pertumbuhan pada garam berbeda (Hayakawa 1993); (4) produksi amonia dari arginin (Nuraida 1988); (5) produksi diasetil dan asetoin (Fardiaz 1993); (6) reaksi pada Litmus milk (Nuraida 1988); (7) produksi C02 dari glukosa (Nuraida 1988); (8) Produksi dekstran dari sukrosa (Nuraida 1988); (9) fermentasi karbohidrat (glukosa, fruktosa, laktosa, sukrosa, maltosa) (Fardiaz 1987). Prosedur identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 3, selanjutnya hasil identifikasi dicocokkan dengan kunci identifikasi BAL Lampiran 4-8. Isolat hasil identifikasi diskrining berdasarkan perbedaan sifat-sifat biokimia, jenis bambu, daerah asal isolat.
Kemudian isolat terpilih
dilanjutkan dengan pengujian aktivitas antimikroba, dan sifat probiotik terhadap ketahanan pada pH 3,5 dan garam empedu.
4. Pengujian aktivitas antimikroba (Garriga et al. 1993)
Pengujian aktivitas antimikroba dilakukan dengan metode uji difusi sumur terhadap beberapa bakteri patogen yang senng menyebabkan gangguan pada sistem pencemaan manusia
antara lain: E. coli., S.
typhymurium, S. aureus.
Kultur bakteri uji terlebih dahulu ditumbuhkan pada medium Nutrien agar (NA), sebanyak 1 ose dan diinkubasi pada suhu 37 OC selama 24 jam.
Kemudian disegarkan ke dalam medium Nutrien broth (NB)
sebanyak 1-2
ose dan diinkubasi selama 18 jam.
diinokulasikan sebanyak 0,2%
Selanjutnya
ke dalam 20 ml media Nutrien agar,
sebelumnya dilakukan penghitungan jumlah bakteri uji yaitu lo7 per ml. Lakukan penggoyangan hingga homogen agar bakteri uji tercampur merata dengan media, kemudian tuangkan media ke dalam cawan petri steril, dan dibiarkan sampai padat, dan dibuat sumur dengan diameter 6 rnrn (5 sumur per cawan). Kultur bakteri asam laktat yang telah ditumbubkan dalam medium MRS Broth selama 24 jam pada suhu 37 OC, dimasukkan sebanyak 50 p1, satu sumur hanya dengan MRS saja (sebagai kontrol) dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 OC.
Zone penghambatan diukur berdasarkan
diameter areal bening yang terbentuk disekitar sumur dengan merataratakan pengukuran pada beberapa tempat.
29
5. Pengnjian Sifat Probiotik a. Ketahanan Terhadap pH Lambung (Conway et al. 1986 dan Jacobsen et at.1999) Ketahanan tiap kultur terhadap pH lambung dilakukan untuk mengetahui kemampuannya bertahan dalam lambung dan saluran pencemaan yang mempunyai pH yang asam. Sebanyak 0,l ml suspensi bakteri dari medium MRS Broth (24 jam) dimasukkan ke dalam satu sen tabung yang berisi 2 ml larutan PBS steril yang mempunyai pH 3,5 (pengatwan pH dilakukan dengan penambahan HCI). Jumlah bakteri yang tumbuh dihitung setelah inkubasi 0; 4; 7; dan 24 jam pada T 37 OC dengan plating sebanyak 100 pI pada MRS agar.
b. Ketahanan terhadap garam empedu (Gilliland et al. 1984) Medium steril MRS Broth 10 ml ditambah 0,3% oxgal, disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121
OC
selama 15 menit, juga dibuat untuk
kontrol yaitu tanpa oxgal. Kemudian sebanyak 1 ml kultur bakteri asam laktat diinokulasikan kedalarnnya dan diinkubasi pada suhu 37 OC. Ketahanan isolat terhadap garam empedu diamati dengan penghitungan jumlah bakteri yang mampu bertahan dengan plating pada MRS agar, setelah inkubasi 0; 4 ; 7; dan 24 jam.
Dari h a i l uji ketahanan pH 3,5 dan ketahan garam empedu kemudian dilakukan skrining ke I1 terhadap ketahanan relatif isolat (%) setelah inkubasi 24 jam yaitu dengan rumus log Nt/No. Isolat hasil skrining selanjutnya digunakan untuk pengujian produksi senyawa antimikroba.
30
6. Pengujian Senyawa Antimikroba Pengujian
senyawa
antimikroba
yang
dilakukan
meliputi
kemampuan memproduksi asam, dan uji bakteriosin.
a. Kemampuan memproduksi Asam Untuk menentukan kemampuan bakteri asam laktat dalam memproduksi asam, digunakan medium sintetik yang teridiri dari 50 g/l glukosa, 0,4% urea, 0,1% K2HP04 , 0,05% MgS04, 0,001% FeS04. 7H20, 0,05% KCI, dan 0,05% ekstrak khamir (Buchta 1983 dalam Wijantoro 1993). Kultur bakteri asam laktat yang telah ditumbuhkan dalam medium Broth selama 24 jam pada suhu 37 OC, diinokulasikan sebanyak 10% kedalam medium sintetik. Inkubasi dilakukan dalam inkubator bergoyang pada suhu 30 OC. Analisa terhadap asam laktat yang dihasilkan dilakukan setiap hari sampai hari ke 4 inkubasi. Analisa dilakukan dengan mengambil sejumlah media sintetik yang telah ditumbuhi oleh bakteri asam laktat secara aseptis, kemudian disentrifus pada 3000 rpm selama 10 menit. Tujuannya untuk memisahkan sel bakteri asam laktat dari hasil metabolit (padatan tidak terlarut). Filtrat hasil sentrifhs diencerkan sampai 50 kali, kemudian diambil sebanyak 10 ml filtrat untuk dititrasi dengan NaOH
0,01 N dengan indikator
phenolptalin 1%. Hasil titrasi dinyatakan sebagai total asam dalam % asam laktat % asam laktat = ml NaOH x N NaOH x 0.09 x fu x 100
ml sampel fp = faktor pengenceran
31 b. Uji bakteriosin (Wolf dan Gibbons 1996) Untuk melihat kemampuan isolat bakteri asam laktat dalam memproduksi bakteriosin digunakan uji difksi sumur. Kultur bakteri uji yang digunakan sama dengan pengujian aktivitas antimikroba. Terlebih dahulu bakteri uji digoreskan pada agar miring (Nutrien Agar) dan diinkubasi pada suhu 37 OC selama 24 jam. Untuk pengujian 1 ose kultur bakteri patogen dipindahkan kedalam Nutrien Broth, dan diinkubasi pada suhu 37 OC selama 18jam. Ke dalam Nutrien Agar steril yang belum membeku ditambahkan 0,2% kultur bakteri patogen yang telah ditumbuhkan dalam Nutrien Broth. Kemudian sebanyak 20 ml Nutrien Agar ini dituangkan dalam petri steril dan dibiarkan membeku. Setelah itu dibuat lubang-lubang sumur (5 sumur per cawan) dengan diameter 6 mm. Kultur bakteri asam laktat dalam MRS Broth (24 jam) dinetralkan dengan NaOH
0,01
N sampai pH 7.
Sel dipanen dengan cara
mensentrifus kemudian disaring dengan menggunakan kertas milipore steril 2 pm. Sebanyak 50 p1 supematan yang diperoleh dispotkan ke dalam sumur, selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 OC selarna 24 jam dan sebagai kontrol digunakan medium Broth tanpa bakteri asam laktat. Pengamatan dilakukan dengan mengukur zona penghambatan berdasarkan diameter areal bening yang terbentuk disekitar sumur. Dari
hasil pengujian ini dilakukan skrining I11 terhadap isolat
berdasarkan kemampuannya dalam memproduksi senyawa antimikroba.
32 7. Uji Koagregasi (Vadervoorde et at!, 1992) Uji koagregasi dilakukan untuk menentukan besarnya kemampuan interaksi antar kultur bakteri untuk saling menempel, sehingga tidak mudah tercuci keluar akibat pergerakan usus. Pada metode ini digunakan kultur tunggal dan campuran
dengan perbandingan 1:1, dan koagregasi
dinyatakan dalam penurunan OD relatif antara bakteri yang dicampur dengan yang tidak (tunggal). Pengujian dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer uv. Kultur bakteri yang diambil adalah yang mempunyai nilai produksi asam tertinggi, kemudian ditumbuhkan pada MRS broth pada suhu 37
OC
selama 24 jam, dipanen dengan jalan mensentrifus pada 10.000 selama 10 menit. Kemudian dicuci 3 kali dengan larutan PBS (Phosphate Buffer Saline) steril yang mengandung NaCl 8 d l , KH2P04 0, 34 g/l, dan 1,21 g/l KzHP04. Kultur kemudian disuspensikan kembali pada buffer yang sama, dan dimasukkan kultur yang akan dicampur, dengan perbandingan yang sama. Setelah pencampuran, 4 ml suspensi dipindahkan kedalam kuvet dan dilihat penurunan OD 600 nm hingga mencapai OD akhir 0,6 (+ 0,02), diamati selama 4 jam pada suhu ruang. Hal yang sama juga dilakukan untuk kontrol pada kultur bakteri tunggal. Persen koagregasi dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : (O.D. 1 + O.D. 2) - 2 x O.D. 12 Persen koagregasi = Dimana : O.D. 1 O.D. 2 O.D. 1.2
= = =
x 100 (O.D. 1 +-O.D. 2) optical density spesies 1 optical density spesies 2 optical density campuran spesies 1 dan 2
33
8. Uji sifat hidrofobisitas (metode MATH Rosenberg 1980) Pengujian sifat hidrofobisitas dilakukan untuk mengukw distribusi sel antara fase hidrofobik dengan air (hidrofilik).
Sifat hidrofobisitas
menunjukkan kecenderungan bakteri untuk membentuk agregat dan selanjutnya akan mengkolonisasi atau menempel pada permukaan sel epitel. Prinsipnya pengujian ini adalah komponen-komponen yang bersifat hidrofobik akan bersatu dan terpisah dari yang non hidrofobik. Metode
BATH (Bacterial Adherence to Hexadecane) ini dilakukan dengan cara memanen sel bakteri dengan jalan mensentrifus dan dicuci dengan larutan PBS, pelet sel yang terendapkan diresuspensikan kembali pada buffer yang sama dan diukur optical density (OD) pada 600 nm antara 0,4-0,6 dengan menggunakan spektrofotometer (Spectronic 20). Kedalam 3 ml suspensi bakteri ditambahkan 150 p1 heksadekana kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan campuran divortek sebanyak 2 kali, masing-masing 30 detik dengan interval waktu 5 detik. Kemudian suspensi didiarnkan selama 10 menit pada suhu ruang agar terpisah dan diukur optical density. Presentase sel yang berpindah ke fraksi heksadekan digunakan untuk mengukur hidrofobisitas, dan dihitung dengan rumus : %/,=[I-(A/Ao)]
x 100
dimana : Ao Nilai 0.D.600suspensi bakteri awal
A Nilai 0.D.600 setelah suspensi dicampur dengan heksadekana
