Základy světelné mikroskopie

Základy světelné mikroskopie

Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006.

zvětšuje

cca 0,2 mm

max. 2000 ×

max. 1 000 000 ×

stovky nm

až desetiny nm

rozlišovací mez = nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, které daná soustava rozliší jako dva body

MIKROSKOP

Část mechanicka : i)stativ

Část optická

Část osvětlovací : i)zrcadlo

ii)nosič tubusu iii)makrometrický šroub iv)mikrometrický šroub v) stolek : i)okulár Huygensův [hajchenzův] okulár –H 4x,10x Periplanatický okulár-P10x 20x ii)objektiv geometrické zvětšení NA 6 0,15 20 0,45 45 0,65 100 1,3

ii) clona iii) kondenzor iv)filtr v)světelný zdroj

Optická soustava (světelného) mikroskopu Optický interval mikroskopu ( D ) Vzdálenost zadního ohniska objektivu (F) od předního ohniska okuláru (F1).

Celkové zvětšení = zvětšení objektivu × zvětšení okuláru by mělo ležet uvnitř intervalu užitečného zvětšení. Užitečné zvětšení (Abbé): interval 500×A – 1000×A Volba okuláru: Spodní mez 500×A: umožní oku využít potenciál objektivu

kondenzor

clona

Zaostření světla do roviny objektu

Překročená horní mez 1500×A: prázdné zvětšení (s použitím více zvětšujících okulárů – 20x, 25x) - větší zvětšení neumožňuje rozlišení dalších podrobností, nepřináší o objektu žádné další informace, obraz objektu je méně

zdroj světla

ostrý

Okuláry = optická soustava, která zvětšuje obraz vytvořený objektivem -zvětšení 5 - 25×; většinou dvě ploskovypuklé čočky oko -čočka očnicová (frontální) blíže k oku -čočka sběrná (kolektivní) blíže k objektu

Umístění ohniskové roviny, kde se tvoří obraz z objektivu

V ohniskové rovině mohou být -clona zorného pole -měřítko

-kruhová clona mezi čočkami

Číslo zorného pole okuláru – umožňuje zjistit velikost předmětového pole (P), jehož obraz pozorujeme určitým okulárem Okulár 10x CWHK10X-T/18L -u školního mikroskopu

číslo zorného pole okuláru P = [mm]

Mobj . kt P = průměr předmětového pole 18 = číslo zorného pole okuláru (údaj na okuláru) Mobj = zvětšení použitého objektivu kt = zvětšovací faktor tubusu (u Olympusu = 1) Číslo zorného pole okuláru

Charakteristiky objektivů

„10ד: zvětšení (obvykle 4 – 100×)

„/0.45“

NUMERICKÁ APERTURA (A)

A = n × sina

reálné a = 140º sin70º = 0,939 n(vzduch) ≈ 1 A = 0,94 Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006.

Rozlišovací mez (a)

/

rozlišovací schopnost (Ra) = 1/a

a = 0,61 l / A zlepšení „rozlišení“: kratší l nebo zvýšení A

Zvýšení A zvýšením n v A = n × sina

Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006.

Voda Imerzní olej

n = 1,33 n = 1,4 – 1,5

Sklo

n = 1,5 – 1,9

opticky homogenní prostředí

sina/sinb = n(2)/n(1)

(vodní obj.: A ≈ 1,25) (imerzní obj.: A ≈ 1,4)

„170

∞

/0,17“

předepsaná délka tubusu/ doporučená tlouštka krycího skla (v mm)

-Pracovní vzdálenost -Hloubka ostrosti (max. vzdálenost dvou ostře zobrazených rovin kolmých na optickou osu) -Světelnost objektivu (intenzita osvětlení zorného pole; úměrná A2)

„Plan Apo“

Optické vady čoček Vada barevná (chromatická): čočka má pro každou složku polychromatického světla jiné ohnisko (index lomu je fcí l)

barevná vada velikosti nebo polohy obrazu

KOREKCE - soustavy čoček Achromáty – korigovány pro žlutou a zelenou

Apochromáty – korigovány pro na takřka celé spektrum

Kondenzor = „převrácený objektiv“ soustava čoček s krátkou ohniskovou vzdáleností (průměr čoček větší, barevná a kulová vada neodstraněna) A(kondenzoru) = 1,2 – 1,3 (podobně jako imerzní obj.)

přesvětleno sníží kvalitu obrazu

správně

a ≈ sina

Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006.

Apertura (NA) kondenzoru má být shodná s aperturou objektivu (pankratický kondenzor – plynulá změna apertury od 0,16 do 1,4 v souhlase s použitým objektivem) - možná úprava na hodnotu shodnou s objektivem (snížení) pomocí irisové clony

Clony u kondenzoru regulace množství světla, přicházejícího do mikroskopu: polní clona – blíže zdroje světla irisová (aperturní) clona – pod kondenzorem

Cloněním ovlivňujeme: - kontrast - hloubku ostrosti - rozlišení podrobností -jas

Jednotlivé parametry nelze nastavit nezávisle Aperturní clona kondenzoru zcela otevřená zcela zacloněná

Kontrast Hloubka ostrosti malý malá velký velká

Rozlišení velké malé

Jas velký malý

Zvětšení mikroskopu ( M ) D . 250 M= f1 . f2

D = optická délka tubusu (tj. vzdálenost zadního ohniska objektivu od předního ohniska okuláru; tzv. optický interval) 250 = normální zraková délka (250 mm) f1 = ohnisková vzdálenost objektivu (v mm) f2 = ohnisková vzdálenost okuláru (v mm) V praxi: celkové zvětšení mikroskopu:

M = zvětšení okuláru . zvětšení objektivu

Optické filtry matné skleněné filtry různé hustoty- rovnoměrně osvětlené zorné pole o vhodné světelnosti světle modrý filtr - žárovkové světlo- denní

žlutozelený filtr – použití s achromáty -propouští jen světlo těch vlnový délek (červené, modré), pro kterou jsou objektivy korigovány filtry pro fluorescenci – excitační a bariérové, dichroické (jiná barva pro odražené a propuštěné světlo) polarizační – polarizace světla

Úlohy

Co dnes (ne)uvidíme Struktura/Organela

SM (procházející světlo)

Buněčná stěna Cytoplasmatická membrána Jádro a jadérko Endoplasmatické retikulum Golgiho aparát Lyzosom, peroxisom Vakuola Mitochondrie Chloroplast (chromoplast, leukoplast) Ribosom Mikrotubulus Střední filamenta Aktinová mikrofilamenta Inkluze

ano ne (tlouštka 5 nm) ano (lépe barvení) ne ne ne ano (nepřímo i přímo) ano (lépe barvení) ano ne (rozměr 20-50 nm) ne (síla 25 nm) ne (síla 10 nm) ne (síla 7 nm) ano

Fixace a barvení Fixace zastaví metabolické děje v buňce buď jejich zpomalením nebo denaturací enzymů a zachová morfologii a topologii biologických struktur. • Fyzikální metody: Teplo (mikrovlnná trouba) Zmražení (tekutý dusík – 170 oC) • Chemické metody: Imerzní (ponoření do fixační tekutiny) Perfuzní (nástřik cév) precipitují proteiny (chlorid rtuťnatý, kyselina pikrová, kyselina trichloroctová…)

denaturují a síťují proteiny kovalentní modifikací (formaldehyd, glutaraldehyd – vazba na NH2 skupiny) fixační směsi FAA (65% ethanol, 5% k. octová, 1% formaldehyd) Bouinův roztok (kyselina pikrová, formaldehyd, kyselina octová, voda) Zenkerův roztok (formaldehyd, dvojchroman draselný, chlorid rtuťnatý, voda) roztoky glutaraldehydu a formaldehydu EM – glutaraldehyd + oxid osmičelý

BARVENÍ většina barviv – nabité molekuly s afinitou k různým buněčným strukturám nebo se selektivní rozpustností

bazofilní (objekty „kyselé povahy“ - nesou záporný náboj – např. DNA, RNA ,glykosaminoglykany) -barvíme bazickými barvivy (toluidinová a methylenová modř, hematoxylin)

acidofilní – eosinofilní (objekty „bazické povahy“ - nesou kladný náboj – obecně cytoplasma, některé granuly) -barvíme kyselými barvivy (oranž G, eosin, kyselý fuchsin)

Vitální barvení: neutrální červeň (kyselé prostředí vakuoly, lysozomu… => červená) Janusova zeleň (oxidovaná [mitochondrie] zelená, redukovaná - leukoforma) Sudan III Řada fluorochromů, Ab-fluorochom…

Úloha : Pozorování buněčných stěn, jader, jadérek, mitochondrií, vakuol a cytoplasmy

http://www.sci.muni.cz/~anatomy/

Epidermis dužnaté suknice cibule kuchyňské (nativní prep.)

barvení - neutrální červeň (vitální) Lugolův roztok, rhodamin B methylenová modř (po fixaci ethanolem)

Vymětalová V.: Laboratorní cvičení z biologie, VŠCHT Praha, 2001.

Lugolův roztok

methylenová modř

Úloha : Pozorování a drůz šťavelanů vápenatého

+ 5% H2SO4

buňky suché suknice cibule kuchyňské Vymětalová V.: Laboratorní cvičení z biologie, VŠCHT Praha, 2001.

.

CaSO4 . ½ H2O

Úloha 1: Mikroskopování škrobových zrn brambor

brambor / iod

kukuřice

Úloha 5: Pozorování chromo- a leukoplastů

bobule papriky roční

Vymětalová V.: Laboratorní cvičení z biologie, VŠCHT Praha, 2001.

mrkev obecná http://www.sci.muni.cz/~anatomy/

amyloplasty/ Lugolův roztok

plod růže šípkové

Vymětalová V.: Laboratorní cvičení z biologie, VŠCHT Praha, 2001.

Úloha : Mikroskopování prvoků

Euglena gracilis

Úloha : Mitóza v primárním meristému rostlin ve světelném mikroskopu materiál: apikální meristem kořínků čočku jedlé nebo cibule kuchyňské 1. Fixace (Farmer: 70% ethanol, 25% k. octová) 2. Macerace (50% ethanol, 18% HCl) 3. Vymytí macerační tekutiny 4.

Roztlak v 1% nigrosinu v 45% k. octové (tzv. acetonigrosin, váže se na chromatin)

cibule kuchyňská

čočka jedlá

Úloha : Pozorování preparátu kvasinek a plísni

Úloha : Plasmolýza a stanovení osmotické hodnoty buněk Semipermeabilní cytoplasmatická membrána umožňuje přechod molekul vody z nebo do kompartmentu tak, aby aH2O (nebo konc. rozpůštěných, tzv. osmoticky aktivních látek) uvnitř a vně kompartmentu byly shodné (rovnováha)

Prostředí: izotonické aH2O vně = aH2O uvnitř hypotonické aH2O vně > aH2O uvnitř hypertonické aH2O vně < aH2O uvnitř

izotonické http://www.sci.muni.cz/~anatomy/

plasmolýza smrštění protoplastu nepřímý průkaz cytoplasmatické membrány

hypertonické Mnium affine

Elodea canadensis

Allium sp.