Y Chromosome AZF Analysis System

TECHNICAL MANUAL

Y Chromosome AZF Analysis System

2800 Woods Hollow Rd.

Madison, WI USA

Medisch hulpmiddel voor invitrodiagnostiek

MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Duitsland

GEBRUIKSAANWIJZING VAN PRODUCT

Printed in USA Revised 3/14

MD1631

Part# TM252

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

3/13/2014

8:19 AM

Page 1

Y Chromosome AZF Analysis System Technische Handleiding TM252

1.

1.

Beoogde toepassing van het product.....................................................................................1

2.

Beschrijving ................................................................................................................................2

3.

Componenten van het product ..............................................................................................3

4.

Algemene punten van overweging .......................................................................................3 A. DNA-template monster...................................................................................................3 B. PCR-condities....................................................................................................................4 C. PCR-cyclusapparatuur ....................................................................................................4 D. Contaminatiebeheersing .................................................................................................5 E. Controlereacties................................................................................................................5

5.

Amplificatiereacties ..................................................................................................................5 A. Reactie-setup.....................................................................................................................6 B. Optimaal PCR-procedureprotocol voor het Perkin-Elmer Model 480 PCR-apparaat ................................................................................................8 C. Agarosegel-elektroforese.................................................................................................8 D. Gegevensanalyse—Controles.........................................................................................9 E. Gegevensanalyse—Onderzoekmonsters ....................................................................10

6.

Literatuurverwijzingen...........................................................................................................11

7.

Bijlage ........................................................................................................................................11 A. Samenstelling van buffers en oplossingen.................................................................11 B. Invuloverzichten ............................................................................................................12

NEDERLANDS

AANWIJZINGEN VOOR HET GEBRUIK VAN PRODUCT MD1631. Alle technische beschrijvingen kunnen ook op het internet worden geraadpleegd: www.promega.com Bezoek de website om te controleren of u de jongste versie van deze Technische Handleiding in handen hebt.

MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Duitsland

Beoogde toepassing van het product Het Y Chromosome AZF Analysis System(a) voldoet aan de vereisten van EU-richtlijn 98/79/EG betreffende medische hulpmiddelen voor in-vitrodiagnostiek. Het Y Chromosome AZF Analysis System biedt een veelzijdige, op PCR-reactie gebaseerde methode voor het beoordelen van de integriteit van de AZF-regio van het humane Ychromosoom. Het Y Chromosome AZF Analysis System is bedoeld voor gebruik als onderdeel van een diagnostisch onderzoek voor de typering van mannelijke onvruchtbaarheid. Diagnostische resultaten die zijn verkregen met gebruik van dit systeem moeten in combinatie met andere laboratorium- of klinische gegevens worden geïnterpreteerd. Deze informatie kan nuttig zijn voor patiënten die in-vitrofertilisatie overwegen, omdat microdeleties in de AZF-regio van het Y-chromosoom genetisch worden overgedragen aan mannelijke nakomelingen die middels in-vitrofertilisatie zijn verwekt, met als gevolg onvruchtbaarheid van het kind.

Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com Printed in USA. Revised 3/14

Part# TM252

Page 1

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

2.

3/13/2014

8:19 AM

Page 2

Beschrijving Het Y Chromosome AZF Analysis System biedt een methode voor detectie van de AZF-regio van het humane Y-chromosoom. Het systeem bestaat uit 20 primerparen die homoloog zijn met eerder aangetoonde en in kaart gebrachte sequence-tagged sites (STS; 1-7). Deze primers amplificeren niet-polymorfe korte DNA-segmenten van het Y-chromosoom wanneer zij in polymerase-kettingreacties (polymerase chain reactions, PCR; 6,8) worden gebruikt. De primers zijn gecombineerd tot vijf Multiplex Master Mix-sets die in meervoudige PCRprocedures kunnen worden gebruikt. Dit schept de mogelijkheid voor het aantonen van de aan- of afwezigheid van alle 20 sequence-tagged sites door gelijktijdige uitvoering van vijf PCR-amplificaties (afbeelding 1). Er is verband gelegd tussen Y-chromosoomdeleties in de door deze primersets geamplificeerde regio’s en mannelijke onvruchtbaarheid (1,2,6,9-17). Over het algemeen verschijnen aangrenzende regio’s van het Y-chromosoom niet als opeenvolgende amplificatieproducten binnen een enkele meervoudige amplificatiereactie. Uitzonderingen hierop zijn SY242 en SY208 van het DAZ-locus, die bij reacties met Multiplex B Master Mix wel als opeenvolgende amplificatieproducten verschijnen, en SY84 en SY86 van de loci DYS273 en DYS148, die bij reacties met Multiplex E Master Mix als opeenvolgende amplificatieproducten verschijnen. De Multiplex Master Mixes A-D bevatten een controle-primerpaar dat fragmenten van het crosslinked SMCX-locus amplificeert. De vijfde Multiplex Master Mix, Multiplex E, bevat een controle-primerpaar dat een unieke regio in zowel mannelijk als vrouwelijk DNA (ZFX/ZFY) amplificeert. Deze controle-primerparen zijn interne controles voor de meervoudige amplificatiereacties en zij testen de integriteit van het genomische DNAmonster. Ten slotte bevindt zich in Multiplex E Master Mix ook een primerpaar dat een regio van het SRY-gen amplificeert, als controle-amplificatie voor de testis-bepalende factor op de korte arm van het humane Y-chromosoom.

A B M 1 2 M 3 4

C M 5 6

D M 7 8

E M 9 10 M

500 – 400 – 300 –

– 500 – 400 – 300

200 –

– 200

100 –

– 100

50 –

– 50

4322TA09_3A

bp

Afbeelding 1. Voorbeeld van amplificatie van male genomic DNA. Amplificatie van male genomic DNA (MD115A) (stroken 1, 3, 5, 7, 9) en een negatieve DNA-controle (stroken 2, 4, 6, 8, 10) voor elk van de vijf Multiplex Master Mixes.

Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com Part# TM252

Page 2

Printed in USA. Revised 3/14

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

3.

3/13/2014

8:19 AM

Page 3

Componenten van het product Product Y Chromosome AZF Analysis System

Hoeveelheid 25 reacties

Cat. nr. MD1631

Niet te koop in de Verenigde Staten. Alleen voor export bestemd. Het Y Chromosome AZF Analysis System bestaat uit: –10°C

Verklaring van symbolen

–30°C

MD154A MD155A MD156A MD157A MD158A M300C P119F G452C MD115A G190B

Multiplex A Master Mix Multiplex B Master Mix Multiplex C Master Mix Multiplex D Master Mix Multiplex E Master Mix GoTaq® DNA Polymerase(c) Nuclease-Free Water 50bp DNA Step Ladder (340ng/µl) Male Genomic DNA (50ng/µl) Blue/Orange 6X Loading Dye

500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 500 µl 200 u 1,25 ml 90 µg 2,5 µg 1 ml

Medisch hulpmiddel voor in-vitrodiagnostiek

–10°C

–30°C

Bewaren bij –10 tot –30°C

Opslagcondities: bewaar alle componenten bij -10 tot –30°C. Vermijd veelvuldige cycli van bevriezing en ontdooiing. MDSS GmbH Schiffgraben 41 30175 Hannover, Duitsland

4.

Inhoud voldoende voor 'n' tests

Algemene punten van overweging A.

DNA-template monster De dichtheid, zuiverheid en grootte van het DNA zijn belangrijke succesfactoren voor de resultaten van onderzoek met het Y Chromosome AZF Analysis System. DNA van slechte kwaliteit kan een verhoogde achtergrondwerking of mislukte amplificatie tot gevolg hebben. Falen van de amplificatie kan zich manifesteren als een volledig ontbreken van amplificatie van alle banden bij alle Multiplex Master Mixes of als uitval van subpopulaties van de allelen in afzonderlijke master mixes. Dit kan worden vermeden door alleen gebruik te maken van DNA van hoge kwaliteit met een A260/A280 absorptieverhouding van ≥1,8. Het DNA mag niet gekliefd zijn en het moet vrij zijn van contaminatie door eiwitten, ethanol of zouten (vooral EDTA; de EDTA-dichtheid mag niet groter zijn dan 0,4 mM).

Bevoegd vertegenwoordiger

Kwantificeer het DNA voordat het in het Y Chromosome AZF Analysis System wordt gebruikt, aangezien toevoeging van te veel of te weinig DNA oorzaak kan zijn van falende reacties. Voor het schatten van de DNA-concentratie kan gebruik worden gemaakt van spectrofotometrische (absorptie-) waarnemingen bij 260 nm (A260), waarbij 1 Au = 50 µg dubbele-streng-DNA per ml. In elke meervoudige PCR-amplificatiereactie moet vijftig nanogram DNA worden gebruikt. Wanneer de A260/A280-verhouding laag is of wanneer de absorptiewaarde laag is (minder dan 0,1), kan de DNA-concentratie met spectrofotometrie te hoog worden geschat.


Part# TM252

Page 3

NEDERLANDS

• • • • • • • • • •

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

3/13/2014

B.

8:19 AM

Page 4

PCR-condities Bij opslag bij –20°C kan in de Multiplex Master Mixes een concentratiegradiënt ontstaan. Vortex de buisjes, na ontdooiing volgens de aanwijzingen, gedurende 10–15 seconden voordat ze worden gebruikt. Verwarm het instrument voor tot 94°C voordat de buisjes erin worden geplaatst. Gebruik niet meer dan 1 eenheid GoTaq® DNA-polymerase per meervoudige PCR-amplificatiereactie. De standaard PCReindvolumes zijn bij gebruikmaking van het Y Chromosome AZF Analysis System 25 µl. PCR-volumes van 12,5 µl kunnen uitval van meerdere banden tot gevolg hebben en dienen daarom niet te worden gebruikt.

C.

PCR-cyclusapparatuur Het Y Chromosome AZF Analysis System is ontwikkeld met gebruikmaking van de Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480. Wanneer andere PCR-apparaten worden gebruikt, dient het protocol te worden geoptimaliseerd en gevalideerd door de gebruiker. Gebruik voor PCR-amplificatie uitsluitend dunwandige buisjes. Gebruik voor het Perkin-Elmer Model 480 PCR-apparaat dunwandige GeneAmp® reageerbuisjes van 0,5 ml. 1.

PCR-apparaten met verwarmde kap t.o.v. die met onverwarmde kap. Er zijn PCR-apparaten verkrijgbaar met verwarmde en met onverwarmde kap. Bij PCR-apparaten met onverwarmde kap (b.v. de Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480) moet de reactieoplossing met een overlay van minerale olie worden afgedekt, om verdamping van de reactieoplossing tijdens de thermische PCR-procedure te voorkomen. Bij PCR-apparaten met verwarmde kap is een overlay van minerale olie niet nodig. De verwarmde kap van deze PCR-apparaten voorkomt verdamping van de reactieoplossing tijdens de thermische PCR-procedure. Men dient echter wel steeds te controleren of de verwarmde kap goed functioneert. Wanneer bij uw in een PCR-apparaat met verwarmde kap geamplificeerde buisjes condensatie in de dop en rond de bovenkant van het reageerbuisje optreedt, kan dat aanduiden dat de verwarmde kap niet goed werkt, en dit kan de werking van de amplificaties van het systeem hebben geschaad. Als u twijfel hebt over de kalibratie van uw verwarmde kap of condensatie in het reageerbuisje waarneemt, moet een overlay van minerale olie worden toegevoegd.

2.

Verloopsnelheid verwarming/afkoeling PCR-apparaat. De tijd die het PCR-apparaat nodig heeft voor het verwarmen en afkoelen tussen de denaturering-, annealing- en extensietemperaturen van de PCR-procedure (vaak omschreven als 'ramp time') kan invloed hebben op de efficiëntie van de PCR-amplificatie. De snelheid van het cyclische verloop in het thermische cyclusprofiel tussen de temperaturen is afhankelijk van merk en type van het apparaat. Het meegeleverde PCR-procedureprotocol is geoptimaliseerd voor het Perkin-Elmer Model 480 PCR-apparaat. Wanneer andere PCR-apparaten worden gebruikt, dienen de gebruikers de 'ramp time' te valideren.

3.

Kalibratie van de apparatuur. Het succes van PCR-amplificatie is, vooral bij meervoudige PCR, afhankelijk van nauwkeurigheid in de thermische cyclus. Zorg dat de PCR-apparatuur die u met het Y Chromosome AZF Analysis System gebruikt, altijd is gekalibreerd.


Page 4


TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

D.

3/13/2014

8:19 AM

Page 5

Contaminatiebeheersing De preventie van DNA-contaminatie van reactiecomponenten is van essentieel belang. Om contaminatie te voorkomen moeten de pre- en post-amplificatieomgevingen worden geïsoleerd, bij voorkeur in afzonderlijke werkruimtes. Gebruik altijd pipetten met aërosolresistente tip, afzonderlijke pipetten voor het opnemen van reactieoplossing, schone wegwerphandschoenen, en vermijd overdrachtcontaminatie van stockoplossingen. Reinig werkstations en pipetten voor en na gebruik met een niet-agressieve bleekmiddeloplossing.

E.

Controlereacties

5.

1.

Naast de monsters moeten altijd amplificatiereacties met gebruikmaking van de bijgeleverde positieve controle Male Genomic DNA als template worden gerund. PCR-amplificatie van de meegeleverde positieve controle Male Genomic DNA moet altijd de verwachte amplificatieproducten opleveren (zie voor de verwachte groottes hoofdstuk 7.B, tabel 1).

2.

Ook moet tegelijk met de monsters een negatieve controle-PCR-amplificatiereactie zonder DNA worden gerund, om te verifiëren dat de reagentia niet met DNA zijn gecontamineerd. PCR-amplificatie van een controle zonder DNA mag geen amplificatieproducten opleveren.

NEDERLANDS

Bij elk onderzoek moeten passende controlereacties worden gebruikt.

Amplificatiereacties Door de gebruiker te verschaffen materialen (Zie voor de samenstelling van de oplossingen de bijlage, hoofdstuk 7.A.) • • •

• • • • •

nucleasevrije lichte minerale olie PCR-apparaat dunwandige amplificatiebuisjes • Gebruik voor de Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480 GeneAmp® dunwandige reageerbuisjes van 0,5 ml (Applied Biosystems ond. nr. N801-0737, N801-0611 of N801-0537) geprefabriceerde agarosegel: 4% NuSieve® 3:1 plus TBE-buffer agarose geprefabriceerde Reliant® minigels (Cambrex catalogusnr. 54927, 54928 of 54929) 1X TBE-buffer ethidiumbromide aërosolresistente pipettips UV-transilluminator


Part# TM252

Page 5

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

3/13/2014

A.

8:19 AM

Page 6

Reactie-setup Afbeelding 2 toont een schematisch overzicht van het reactie-setup-protocol. In deze procedure worden deeltjes van de DNA-monsters in een reageerbuisje geschonken. Afzonderlijk wordt aan elk van de Multiplex Master Mixes Taq DNA-polymerase toegevoegd. Daarna wordt de Multiplex Master Mix met Taq DNA-polymerase toegevoegd aan de reageerbuisjes met het DNA-monster. Elk DNA-monster wordt met elk van de vijf Multiplex Master Mixes geanalyseerd.

Verdun DNA-monster (in Nuclease-Free Water) en bereid controles Bereid Multiplex Master Mix en Taq DNA polymerasemengsels, éé n voor elke Multiplex Master Mix.

DNAmonster

Positieve controle Male Genomic DNA

Negatieve controle zonder DNA

Bereid de reacties: 1. Schenk DNA-monster of controle in reageerbuisjes. 2. Voeg Multiplex Master Mix en Taq DNA polymerasemengsel toe.

Multiplex Master Mix bij alle monsters

A

B

Taq DNA polymerase bij alle monsters

C

D

E

DNAPositieve Negatieve monster controle controlel A

B

C

PCR-cyclusprocedure

D

E

3856MA10_2A

Agarosegel-elektroforese

Afbeelding 2. Schematische weergave van het Y Chromosome AZF Analysis System assay.


Page 6


3/13/2014

8:19 AM

Page 7

1.

Ontdooi de Multiplex Master Mixes, het Nuclease-Free Water en het Male Genomic DNA op ijs. Bewaar de preparaten na ontdooiing op ijs. Vortex de Multiplex Master Mixes 5-10 seconden voordat ze worden gebruikt.

2.

Bepaal het aantal reacties van elke Multiplex Master Mix door de hieronder afgedrukte tabel in te vullen. Voor elk DNA-monster zijn er vijf reageerbuisjes, één voor elke Multiplex Master Mix. Voeg aan elke Multiplex Master Mix een positieve Male Genomic DNA-controle en een negatieve controle zonder DNA toe.

Multiplex Master Mix A B C D E

Aantal DNAmonsters

Positieve controle Male Genomic DNA 1 1 1 1 1

Negatieve controle zonder DNA 1 1 1 1 1

Totaal reageerbuisjes

3.

Plaats en etiketteer het benodigde aantal reageerbuisjes zoals hierboven is berekend. Gebruik dunwandige amplificatiebuisjes. Zet de reageerbuisjes op ijs.

4.

Verdun elk DNA-monster met het meegeleverde Nuclease-Free Water in een afzonderlijk buisjes tot 10 ng/µl. Meng het preparaat door 5-10 seconden te vortexen. Voeg 5 µl verdund DNA toe aan de geëtiketteerde, op ijs geplaatste reageerbuisjes.

NEDERLANDS

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

Positieve controle DNA-monster: voor het monster met positieve controle Male Genomic DNA moet het Male Genomic DNA worden verdund tot 10 ng/µl door toevoeging van 6 µl Male Genomic DNA aan 24 µl NucleaseFree Water. Meng het preparaat door 5-10 seconden te vortexen. Voeg 5 µl toe aan de geëtiketteerde, op ijs geplaatste reageerbuisjes. Monster negatieve controle zonder DNA: voeg voor de negatieve controle (zonder DNA) 5 µl Nuclease-Free Water toe aan de op ijs gezette geëtiketteerde reageerbuisjes. 5.

Bereid vijf Multiplex Master Mix/GoTaq® DNA polymerasemengsels op ijs, één voor elke Multiplex Master Mix. Vortex de Multiplex Master Mixes alvorens ze te gebruiken. Component Multiplex Master Mix GoTaq® DNA polymerase (5 u/µl) eindvolume

Volume per reactie 20 µl 0,2 µl 20,2 µl

Volume per 10 reacties 200 µl 2 µl 202 µl

6.

Meng het preparaat door middel van vortexen.

7.

Voeg 20 µl van het mengsel van Multiplex Master Mix/GoTaq® DNApolymerase toe aan de betreffende reageerbuisjes met het DNA-monster of de controles, op ijs.

8.

Meng het preparaat door voorzichtig te vortexen.

9.

Centrifugeer de buisjes kort om de inhoud naar de bodems van de buisjes te drijven. Zet de reageerbuisjes op ijs totdat ze gereed zijn voor de PCR-procedure.


Part# TM252

Page 7

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

3/13/2014

10.

B.

8:19 AM

Page 8

Bij PCR-apparaten met onverwarmde kap (bijvoorbeeld de Perkin-Elmer Model 480) moet de reactieoplossing in de buisjes met een overlay van minerale olie worden afgedekt. Kantel de buisjes, laat een druppel olie op de zijkant van het buisje vallen en laat de olie langs de zijkant van het buisje stromen.

Optimaal PCR-procedureprotocol voor het Perkin-Elmer Model 480 PCR-apparaat Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor het Perkin-Elmer Model 480 PCRapparaat. Indien een ander PCR-apparaat wordt gebruikt, is de gebruiker verantwoordelijk voor de optimalisering en validering van het protocol. Het is van cruciaal belang dat het instrument wordt voorverwarmd tot 94°C voordat de buisjes erin worden geplaatst. PCR-apparaat Model 480

C.

Reageerbuisjes GeneAmp®

0,5 ml dunwandige reageerbuisjes

DNA Polymerase

PCR-condities

GoTaq®

94°C, 2 minuten; daarna: 94°C, 1 minuut 57°C, 30 seconden 72°C, 1 minuut 35 cycli herhalen; daarna: 72°C, 5 minuten 4°C weken

DNA Polymerase

Agarosegel-elektroforese 4% NuSieve® 3:1 Plus TBE-buffer geprefabriceerde Reliant®-minigels (Cambrex cat. nr. 54927, 54928 of 54929) benodigd voor elektroforese en daarop volgende optimale visualisatie van amplificatieproducten. 1.

Verdun molecuulgewichtmarker als volgt: Component 50bp DNA Step Ladder Blue/Orange 6X Loading Dye Nuclease-Free Water

Volume 12 µl 4 µl 8 µl

2.

Voeg aan elk van de amplificatiebuisjes 2,5 µl Blue/Orange 6X Loading Dye toe en meng het preparaat.

3.

Leg 10 µl van de verdunde molecuulgewichtmarker op het eerste gelbuisje.

4.

Voeg aan elk buisje 10 µl van elk monster toe.

5.

Leg 10 µl verdunde molecuulgewichtmarker op het laatste gelbuisje.

6.

Run de gel in 1X TBE met 0,5 µg/ml ethidiumbromide bij 5V/cm (gemeten als de afstand tussen de elektrodes) totdat het front van bromofenol blauwe kleurstof naar de onderkant van de gel migreert.

7.

Fotografeer de gel met een UV-transilluminator (320 nm).


Page 8


TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

D.

3/13/2014

8:19 AM

Page 9

Gegevensanalyse—Controles

1.

Negatieve controle zonder DNA: er mogen zich geen specifieke amplificatieproducten bevinden in de stroken met de negatieve controlereacties zonder DNA. Er kan sprake zijn van enkele banden met een laag molecuulgewicht of van vlekvorming. Deze zijn het gevolg van interactie van primers. De resultaten moeten als ongeldig worden beschouwd wanneer er amplificatieproducten in de negatieve controlereacties zonder DNA worden waargenomen. Dit duidt op contaminatie door DNA en het onderzoek moet dan worden herhaald, met speciale aandacht voor het vermijden van contaminatie.

2.

Positieve controle Male Genomic DNA: het aantal en de grootte van de amplificatieproducten staan voor elke Multiplex Master Mix aangegeven in tabel 1 (hoofdstuk 7.B). De positieve Male Genomic DNA controlereactie voor elk van de Multiplex Master Mixes moet over alle banden beschikken die voor die Multiplex Master Mix zijn aangegeven (hoofdstuk 7.B, tabel 1). De grootte van de amplificatieproducten kan worden geschat door vergelijking met de 50bp DNA Step Ladder marker die op de gel is gerund. Wanneer niet alle verwachte banden in de reactie met positieve Male Genomic DNA-controle aanwezig zijn, of wanneer er prominent extra banden te zien zijn, duidt dat op een probleem met de amplificatiereagentia of met het PCR-apparaat. De resultaten moeten als ongeldig worden beschouwd indien er verwachte amplificatieproducten ontbreken in de reacties met de positieve Male Genomic DNA-controle.

3.

Controleprimer in Multiplex Master Mixes: in reacties met Multiplex A, B, C en D Master Mix moet het kleinste amplificatieproduct (83bp) voortkomen uit een crosslinked locus (SMCX). In Multiplex E Master Mix moet het grootste (496bp) amplificatieproduct voortkomen uit de ZFY/ZFX-genen. Indien deze producten ontbreken, duidt dat op een probleem met die specifieke meervoudige PCR-amplificatie. Indien deze controlebanden aanwezig zijn in de positieve controle Male Genomic DNA, maar niet in het DNA-monster, kan dat betekenen dat er een probleem is met het genomic DNA dat als template is gebruikt. Bij het DNA-monster kunnen zich de volgende problemen voordoen: de aanwezigheid van onzuiverheden, onnauwkeurige DNA-kwantificering of DNA van slechte kwaliteit. Controleer de DNA-template op agarosegel voordat u de amplificatie herhaalt. Herhaal de amplificatie met alle DNA-monsterreacties waarin het controleproduct niet voorkomt. Het kan nodig zijn, genomic DNA-template weer te isoleren.

NEDERLANDS

Controleer, voordat u uw monsters analyseert, of de controlereacties de verwachte resultaten hebben opgeleverd. De meegeleverde invuloverzichten (zie hoofdstuk 7.B, tabel 1) kunnen worden gebruikt voor het analyseren van zowel de controles als de onderzoekmonsters.


Part# TM252

Page 9

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

3/13/2014

E.

8:19 AM

Page 10

Gegevensanalyse—Onderzoekmonsters Voor het analyseren van onderzoekmonsters kan gebruik worden gemaakt van de invuloverzichten in de bijlage, hoofdstuk 7.B. Bepaal of de verwachte PCRproducten wel of niet aanwezig zijn (hoofdstuk 7.B, tabel 1). Indien er producten van de reacties ontbreken, kunnen deze in kaart worden gebracht met behulp van het invuloverzicht Y-chromosoomkaart (hoofdstuk 7.B, tabel 2). Alle deleties moeten opeenvolgend zijn. Indien er bij een monster meerdere amplificatiebanden ontbreken en indien deze banden op de kaart niet aansluiten op aangrenzende regio's van het Y-chromosoom (hoofdstuk 7.B, tabel 2), zijn dit uitgevallen banden en geen deleties. In dit geval moet de test worden herhaald. Een enkele ontbrekende amplificatieband in een monster kan een uitgevallen band zijn en de test moet worden herhaald om te bevestigen dat de locus niet wordt geamplificeerd. Denk eraan dat een locus in een monster mogelijk niet wordt geamplificeerd als er een mutatie aanwezig is in een van de primer binding sites van de locus. Diagnostische resultaten die zijn verkregen met dit systeem dienen uitsluitend in combinatie met andere laboratorium- of klinische gegevens te worden geïnterpreteerd. Afbeelding 3 toont een voorbeeld van gel-analyse van een DNA-monster met een Ychromosoomdeletie van kaartposities 15 tot 20. A

B 3 M

C 4

5 M

D 6

7 M

E 8

9 M 10

4534TA

1 M 2

Afbeelding 3. Voorbeeld van gel-analyse van Y-chromosoomdeletie. Afgebeeld zijn de amplificatieproducten van Multiplex A-E Master Mix reacties. Een Multiplex Master Mix wordt gebruikt voor het amplificeren van monsters Male Genomic DNA (MD115A) (stroken 1, 3, 5, 7, 9) en een overeenkomend monster met Y-chromosoomdeleties (stroken 2, 4, 6, 8, 10). Banden die tot stand zijn gekomen door het amplificeren van positieve Male Genomic DNA-controle worden vergeleken met banden voortkomend uit amplificatie van de testgenomische DNA met Y-chromosoomdeleties (merk op dat de deletiebanden in al deze stroken voorkomen, met uitzondering van Multiplex E). De marker (strook M) is de 50bp DNA Step Ladder die van het systeem deel uitmaakt.

Wij hebben enkele aspecifieke banden waargenomen die boven of onder de verwachte amplificatieproducten op de agarosegel verschijnen, in het bijzonder een zwakke band in Multiplex D op ongeveer 150bp en in Multiplex E boven de controle. Verifieer dat in uw negatieve controles (monsteramplificaties zonder DNA) geen detecteerbare PCR-amplificatieproducten waarneembaar zijn. Zolang in uw negatieve controles geen PCR-amplificatieproducten waarneembaar zijn, hebben deze aspecifieke banden geen invloed op de analyse. OPGELET: een positief SY133 signaal is waargenomen bij enkele personen met een bevestigde AZFb-deletie, wat suggereert dat de SY133 locus elders aanwezig kan zijn in het chromosome van deze personen. Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com Part# TM252

Page 10


TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

Page 11

Literatuurverwijzingen 1. 2.

3. 4. 5. 6.

7. 8. 9. 10.

11. 12.

13. 14. 15.

16.

17.

7.

8:19 AM

Vollrath, D. et al. (1992) The human Y chromosome: A 43-interval map based on naturally occurring deletions. Science 258, 52-9. Reijo, R. et al. (1995) Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nature Genet. 10, 383-93. Foote, S. et al. (1992) The human Y chromosome: Overlapping DNA clones spanning the euchromatic region. Science 258, 60-6. Affara, N. et al. (1996) Report of the second international workshop on Y chromosome mapping 1995. Cytogenet. Cell. Genet. 73, 33-76. Kent-First, M.G. et al. (1996) Gene sequence and evolutionary conservation of human SMCY. Nat. Genet. 14, 128-9. Kent-First, M.G. et al. (1999) Defining regions of the Y-chromosome responsible for male infertility and identification of a fourth AZF region (AZFd) by Y-chromosome microdeletion detection. Mol. Reprod. and Dev. 53, 27-41. Vogt, P.H. et al. (1997) Report of the third international workshop on Y-chromosome mapping 1997. Cytogenet. Cell Genet. 79, 1-20. Skaletsky, H. et al. (2003) The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Nature 423, 825-37. Pryor, J.L. et al. (1997) Microdeletions in the Y chromosome of infertile men. New Eng. J. Med. 336, 534-39. Kent-First, M.G. et al. (1996) The incidence and possible relevance of Y-linked microdeletions in babies born after intracytoplasmic sperm injections and their fathers. Mol. Hum. Reprod. 2, 943-50. Kostiner, D.R., Turek, P.K. and Reijo, R.A. (1998) Male infertility: Analysis of the markers and genes on the human Y chromosome. Hum. Reprod. 13, 3032-8. Kuroda-Kawaguchi, T. et al. (2001) The AZFc region of the Y chromosome features massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men. Nat. Genet. 29, 279-86. Lahn, B.T. and Page, D.C. (1997) Functional coherence of the human Y chromosome. Science 278, 675-80. Reijo, R. et al. (1996) Severe oligozoospermia resulting from deletions of azoospermia factor gene on Y chromosome. Lancet 347, 1290-3. Repping, S. et al. (2002) Recombination between palindromes P5 and P1 on the human Y chromosome causes massive deletions and spermatogenic failure. Am. J. Hum. Genet. 71, 906-22. Saxena, R. et al. (1996) The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose from an autosomal gene that was transposed, repeatedly amplified and pruned. Nat. Genet. 14, 292-9. Simoni, M. et al. (1999) Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Ychromosomal microdeletions. Int. J. Androl. 22, 292-9.

NEDERLANDS

6.

3/13/2014

Bijlage A.

Samenstelling van buffers en oplossingen TBE 1X buffer 89 mM Tris-basis 110 mM boorzuur 2 mM EDTA


Part# TM252

Page 11

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

3/13/2014

B.

8:19 AM

Page 12

Invuloverzichten

Tabel 1. PCR-amplificatieproductenprofiel voor onderzoekmonsters.

Noteer de aanwezigheid (+) of het ontbreken (-) van de PCR-amplificatieproducten voor alle onderzoekmonsters. Multiplex A Master Mix STS SY254 SY157 SY81 SY130 SY182

Monsters (+/-) Grootte van product (bp) 380 290 209 173 125 83

Kaartpositie 18 20 2 11 5 Controle

Grootte van product (bp) 362 274 233 140 83

Kaartpositie 7 9 16 17 Controle

Grootte van product (bp) 228 190 143 124 83

Kaartpositie 10 6 14 19 Controle

Grootte van product (bp) 177 125 109 83

Kaartpositie 12 15 8 Controle

Grootte van Locus product (bp) ZFX/ZFY 496 SRY 400 DYS224 303 DYS148 232 DYS273 177

Kaartpositie Controle 1 13 3 4

Locus DAZ DYS240 DYS271 DYS221 KAL-Y SMCX

Multiplex B Master Mix STS SYPR3 SY127 SY242 SY208

Locus SMCY DYS218 DAZ DAZ SMCX

Monsters (+/-)

Multiplex C Master Mix STS SY128 SY121 SY145 SY255

Locus DYS219 DYS212 DYF51S1 DAZ SMCX

Monsters (+/-)

Multiplex D Master Mix STS SY133 SY152 SY124

Locus DYS223 DYS236 DYS215 SMCX

Monsters (+/-)

Multiplex E Master Mix STS SY14 SY134 SY86 SY84

Monsters (+/-)


Page 12


RBMY1, RBAY2 (cluster) DAZ (cluster)

Page 13

SMCY DYZ19 (herh.)

8:19 AM

TSPY AMELY Centromeer KAL-Y

3/13/2014

SRY RPS4Y ZFY

CSF2RA IL3RA ANT3 ASMT XE7 MIC2p MIC2

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

Yp

Yq Euchromatine

Heterochromatine pseudo-autosomaal

NEDERLANDS

pseudo-autosomaal

AZFa

AZFb

AZFc ZFX SMCX

SMCX

SMCX

SMCX ZFY

Control Multiplex A

Control Multiplex B

Control Control Multiplex Multiplex D C

Control Multiplex E

4320MA09_3A

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

SY14 SY81 SY86 SY84 SY182 SY121 SYPR3 SY124 SY127 SY128 SY130 SY133 SY134 SY145 SY152 SY242 SY208 SY254 SY255 SY157

SRY DYS271 DYS148 DYS273 KALY DYS212 SMCY DYS215 DYS218 DYS219 DYS221 DYS223 DYS224 DYF51S1 DYS236 DAZ DAZ DAZ DAZ DYS240

SRY

proximaal AZFc/AZFd

Tabel 2. Invuloverzicht Y-chromosoomkaart. Zie voor meer gedetailleerde gegevens de toegevoegde afbeelding 2 van literatuurverwijzing 8. Palindromen 8, 7, 6, 5 en 4 verschijnen in de proximale richting van SY121 en in de distale richting van SY182 (1). SY121 bevindt zich op de distale grenslijn van P4 (8). AZFb steekt uit P5 naar proximale P1 (8). AZFc omvat P1 en P2 (8). Ten minste één kopie van SY157 valt buiten de AZFc-grens. OPGELET: een positief SY133 signaal is waargenomen bij enkele personen met een bevestigde AZFb-deletie, wat suggereert dat de SY133 locus elders aanwezig kan zijn in het chromosome van deze personen. Promega Corporation · 2800 Woods Hollow Road · Madison, WI 53711-5399 USA · Toll Free in USA 800-356-9526 · Phone 608-274-4330 · Fax 608-277-2516 · www.promega.com Printed in USA. Revised 3/14

Part# TM252

Page 13

TM252NL.0314:TM252.0404.qxd

3/13/2014

8:19 AM

Page 14

(a)U.S. Pat. No. 6,242,235, Australian Pat. No. 761757, Canadian Pat. No. 2,335,153, Chinese Pat. No. ZL99808861.7, Hong Kong Pat. No. HK 1040262, Japanese Pat. No. 3673175, European Pat. No. 1088060 and other patents pending.

© 2012, 2013, 2014 Promega Corporation. All Rights Reserved. GoTaq is a registered trademark of Promega Corporation. GeneAmp is a registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. Reliant is a registered trademark of CBM Intellectual Properties, Inc. NuSieve is a registered trademark of Lonza Sales AG. Please contact Promega Technical Services or access our web site at www.promega.com for the most up-to-date information on Promega products.


Page 14


Y Chromosome AZF Analysis System

Recommend Documents