Utilization of X-Chromosome Inactivation Assessment PAVEL ROZSÍVAL, EVA PAŘÍZKOVÁ Dětská klinika, LF UK a FN, Hradec Králové
SOUHRN Metoda stanovování inaktivace chromozomu X pomocí modifikace PCR specifické k metylaci s využitím polymorfismu v promotoru genu pro lidský androgenní receptor je elegantní rychlá metoda v porovnání s metodami dříve používanými. Je využitelná například ke screeningu přenašečství mutací způsobujících X-vázané choroby u rodinných příslušnic pacientů s X-vázanou chorobou. Článek nabízí stručný souhrn procesu inaktivace a popis této metody včetně jejího využití u různých onemocnění. Klíčová slova: inaktivace chromozomu X, PCR specifické k metylaci, CpG ostrůvky, X-vázané choroby, primární imunodeficience SUMMARY The method of X-chromosome inactivation assessment with a modification of methylation-specific PCR, utilizing the polymorphism at the promoter of the human androgen receptor gene, is an elegant and rapid method in comparison to methods formerly used. It is applicable e.g. for the screening of transmission of mutations causing X-linked diseases in female family members of patients with an X-linked disease. The article offers a brief summary of the inactivation process and description of this method, including its usage in different diseases. Key words: X-chromosome inactivation, methylation specific PCR, CpG islands, X-linked diseases, primary immune deficiencies
Úvod Kompenzace dvojnásobné genetické výbavy na chromozomu X je u žen dosahována inaktivací jednoho z chromozomů X. Tento děj nastává v časné fázi embryonálního vývoje a v buňkách embryoblastu je to proces náhodný se stejnou pravděpodobností inaktivace mateřského i otcovského chromozomu X. Nejčastěji je tedy výsledkem aktivní mateřský chromozom X v 50 % buněk a otcovský v 50 %. Podle Gaussovy křivky ale existují i zcela zdraví jedinci s velmi sešikmenou inaktivací (více než 90:10 % nebo 95:5 %, podle autora). Inaktivace je v průběhu života buňky ireverzibilní a z ní vzniklé buňky mají inaktivován stejný X chromozom (23). Proces inaktivace není dosud plně objasněn. Ví se, že jej řídí produkty oblasti označované jako XIC, X
inactivation centre, ze které pochází také gen XIST (X-inactive specific transcript). Jeho produktem je Xist RNA, která se přikládá k DNA chromozomu X a podmiňuje tak jeho inaktivaci (4, 8, 21). Jak přesně na chromozomu „drží“, není dosud známo. Velmi elegantní teorie Mary Lyonové (1, 14), podporovaná novými pracemi, předpokládá účast takzvaných dlouhých roztroušených úseků (LINEs – long interspersed elements). Ty by měly fungovat jako „háčky“, na které se Xist RNA „chytí“. LINEs je na X chromozomu mnohem více než na jiných chromozomech a např. uměle zkonstruovaný chromozom obohacený o LINEs byl pomocí Xist inaktivován. Samotný Xist však k udržení inaktivace nestačí. Na stálosti stavu se významně podílejí také metylace DNA inaktivního chromozomu a hypoacetylace histonů inaktivované DNA (2, 5, 6, 7, 15, 29). Opačnou roli proti XIST má gen nazvaný příznačně TSIX, což je sekvence začínající těsně za koncem XIST čtená v opačném směru, tedy „antisense“. TSIX a jeho kofaktor CTCF se podílejí na udržení jednoho X chromozomu v aktivním stavu (3, 13, 16, 17, 22, 26). Jakým způsobem je „vybrán“ X chromozom, který zůstane aktivní, zůstává dosud otázkou. Není jasné, jestli probíhá jakési „počítání“ X chromozomů a podle toho je exprimován XIST, nebo zda je náhodným způsobem zvolen jeden X chromozom a u něj je utlumena transkripce TSIX, což vede k jeho inaktivaci. Jak je vidět, samotná inaktivace zatím přináší kromě vzrušujících objevů také spoustu nezodpovězených otázek.
Využitelnost stanovování inaktivace chromozomu X K čemu je tedy dobré znát stav inaktivace X chromozomů? Klasické poučky genetiky říkají, že choroby vázané na X chromozom se projevují u mužů a ženy jsou přenašečky. Byly však popsány případy manifestace X-vázaných nemocí u žen s prokázanou mutací genu na X chromozomu, která se vyskytovala v rodině. Tyto případy jsou velmi vzácné, šlo by je však vysvětlit fungováním pouze postiženého X chromozomu, což se také u těchto pacientek opakovaně prokázalo. Podobným případem jsou také onemocnění s variabilní mírou projevů, které často u žen odpovídají poměru inaktivace patologické a normální alely (10, 19, 24, 27, 30). Jelikož samotný průkaz mutace jedné alely v tomto případě nestačí, je stanovení stavu inaktivace X chromozomů metodou diagnostickou. Dále je nutno vzít v potaz otázku genetického poradenství. Průkaz mutace pomocí sekvenace je často velmi obtížný a finančně náročný. Pokud se v rodině vyskytne dědičná choroba, je otázkou, s jakou pravděpodobností se může vyskytnout u dalších dětí. Vzhledem k tomu, že přenašečky mutací mají velmi často výrazně sešikmený poměr inaktivace X chromozomů v neprospěch X nesoucího patologickou alelu, stanovení inaktivace chromozomu X se jeví jako rychlá a méně finančně náročná metoda k odlišení přenašečství od de novo vzniklé mutace, která může vhodně doplnit možnosti genetického poradenství (11, 20, 25, 28). Zajímavou a intenzivně zkoumanou skutečností je porušená inaktivace X v buňkách některých nádorů, např. karcinomu prsu. Pro naše pracoviště se stanovování inaktivace chromozomu X jeví jako nejlépe využitelné pro rodiny s X-vázanými imunodeficity (X-vázaná těžká kombinovaná imunodeficience, chronická granulomatózní choroba, Brutonova agamaglobulinémie, hyper-IgM syndrom, Wiskott-Aldrichův syndrom), s možnostmi rozšíření a zavedení do širší klinické praxe pro onemocnění metabolická (X-vázaná hypofosfatémie, Fabryho nemoc, nefrogenní diabetes insipidus...), hematologická (idiopatická trombocytóza...) a další (Rettův syndrom...).
Metody použitelné ke stanovení inaktivace chromozomu X Metod použitelných ke stanovení inaktivace chromozomu X je několik. Aktivní a neaktivní chromozom lze odlišit podle času replikace, ovšem pouze v případech, že jsou oba X chromozomy strukturálně
odlišné. Existuje modifikace FISH, využívající sond do míst s odlišnou metylací, a dále metody PCR. Starší „PCR senzitivní na metylaci“, jejíž nevýhodou je nutnost dokonalého rozštěpení nemetylované DNA, jinak by totiž byla amplifikována a dávala falešně pozitivní výsledky. Naproti tomu „PCR specifická k metylaci“ je nezávislá na použití enzymů senzitivních na metylaci (9). V roce 1999 popsal Kubota modifikaci „PCR specifické k metylaci“ (12), která nejen velmi citlivě stanovuje poměr aktivity každého X chromozomu, ale také komplementárně kvantifikuje inaktivní chromozomy. Tato metoda je pro svou nenáročnost a přesnost nyní nejrozšířenější. Výhodou je použití lokusu HUMARA genu, neboť ten v sobě obsahuje krátké opakující se sekvence, tak zvané CpG ostrůvky (CpG islands) (18). Počet opakování je mezi jedinci velmi proměnlivý, s heterozygozitou haplotypů téměř 90 %. Zjednodušeně řečeno, každá žena má jeden X chromozom (v promotoru HUMARA) „dlouhý“ a jeden „krátký“. Díky tomu lze od sebe po amplifikaci lehce odlišit oba chromozomy a také (porovnáním délky CpG ostrůvků po doplnění amplifikací X chromozomů rodičů) odlišit otcovský a mateřský chromozom, a tím podpořit výpovědní hodnotu testu, neboť recesivní alelu by příslušná osoba měla obdržet v mateřském haplotypu, pokud je otec zdráv. Jak již bylo zmíněno, jednou z univerzálních charakteristik inaktivovaného X chromozomu je jeho metylace. Při ošetření denaturované DNA disulfidem sodným dochází k přeměně nemetylovaných cytosinů na uracily a tím k selektivní změně sekvence na aktivním chromozomu. Použitím dvou sad primerů pro sekvence aktivního a inaktivního lokusu dochází k jejich selektivní amplifikaci, dostáváme tak 4 různé produkty – „dlouhý“ aktivní, „dlouhý“ inaktivní, „krátký“ aktivní a „krátký“ inaktivní. Kvantifikací těchto produktů (peak image po gelové elektroforéze) dokážeme stanovit poměr aktivního a inaktivního stavu jednotlivých chromozomů. Velkou výhodou této metody je její nezávislost na použití speciálních restrikčních enzymů senzitivních na metylovaný stav bazí, které by bylo nutno použít bez předchozí změny sekvence pomocí disulfidu sodného.
Závěr Metoda stanovení inaktivace chromozomu X je perspektivní prostředek skýtající možnosti doplnění naší současné genetické diagnostiky (například X-vázaných imunodeficitů) i možnosti dalšího využití experimentálního chrakteru (například v onkologickém výzkumu).
MUDr. Pavel Rozsíval Dětská klinika, Fakultní nemocnice Hradec Králové 500 05 Hradec Králové
LITERATURA 1. Bailey JA, Carrel L, Chakravarti A, Eichler E. Molecular evidence for a relationship between LINE-1 elements and X chromosome inactivation: The Lyon repeat hypothesis. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 6634-6639. 2. Brockdorff N. X-chromosome inactivation: closing in on proteins that bind Xist RNA. Trends Genet 2002; 18: 352-358. 3. Chao W, Hyunh KD, Spencer RJ, Davidow LS, Lee JT. CTCF, a candidate trans-acting factor for X-inactivation choice. Science 2002; 295: 345-347.
4. Clemson CM, McNeil JA, Willard HF, Lawrence JB. XIST RNA paints the inactive chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol 1996; 132: 259-275. 5. Clemson CM, Chow JC, Brown CJ, Lawrence JB. Stabilization and localization of Xist RNA are controlled by separate mechanisms and are not sufficient for X inactivation. J Cell Biol 1998; 142: 13-23. 6. Cohen DE, Lee JT. X-chromosome inactivation and the search for chromosome-wide silencers. Curr Op Genet Dev 2002; 12: 219-224. 7. Csankovszki G, Nagy A, Jaenisch R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol 2001; 153: 773-783. 8. Hendrich BD, Plenge RM, Willard HF. Identification and characterization of the human XIST gene promoter: implications for models of X chromosome inactivation. Nucl Ac Res 1997; 25: 2661-2671. 9. Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation-specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islan ds. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 9821-9826. 10. Ishii T, Makita Y, Ogawa A, Amamiya S, Yamamoto M, Miyamoto A, Oki J. The role of different X-inactivation pattern on the variable clinical phenotype with Rett syndrome. Brain Dev 2001; 23: S161-S164. 11. Kubota T. A new assay for the analysis of X-chromosome inactivation in carriers with an X-linked disease. Brain Dev 2001; 23: S177-S181. 12. Kubota T, Nonoyama S, Hidefumi T, Masuno M, Imaizumi K, Kojima M, Wakui K, Shimadzu M, Fukushima Y. A new assay for the analysis of X-chromosome inactivation based on methylation-specific PCR. Hum Genet 1999; 104: 49-55. 13. Lee JT, Davidow LS, Warshawsky D. Tsix, a gene antisense to Xist at the X-inactivation centre. Nature Genet 1999; 21: 400-404. 14. Lyon MF. X-chromosome inactivation: a repeat hypothesis. Cytogenet Cell Genet 1998; 80: 133-137. 15. Mermoud JE, Popova B, Peters AHFM, Jenuwein T, Brockdorff N. Histone H3 lysine 9 methylation occurs rapidly at the onset of random X chromosome inactivation. Curr Biol 2002; 12: 247-251. 16. Migeon BR, Chowdhury AK, Dunston JA, McIntosh I. Identification of TSIX, encoding an RNA antisense to human XIST, reveals differences from its murine counterpart: implications for X inactivation. Am J Hum Genet 2001; 69: 951-960. 17. Migeon BR, Lee CH, Chowdhury AK, Carpenter H. Species differences in TSIX/Tsix reveal the roles of these genes in X-chromosome inactivation. Am J Hum Genet 2002; 71: 286-293. 18. Nasir J, Fisher EMC, Brockdorff N, Disteche CM, Lyon MF, Brown SDM. Unusual molecular characteristics of a repeat sequence island within a Giemsa-positive band on the mouse X chromosome. Proc Natl Acad Sci USA 1990; 87: 399-404. 19. Nomura Y, Onigata K, Nagashima T, Yutani S, Mochizuki H, Nagashima K, Morikawa A. Detection of skewed X-inactivation in two female carriers of vasopressin type 2 receptor gene mutation. J Clin Endocrinol Metab 1997; 82: 3434-3437. 20. Orstavik KH, Orstavik RE, Halse J, Knudtzon J. X chromosome inactivation pattern in female carriers of X linked hypophosphataemic rickets. J Med Gen 1996; 33: 700-703. 21. Panning B, Dausman J, Jaenisch R. X chromosome inactivation is mediated by Xist RNA stabilization.
Cell 1997; 90: 907-916. 22. Pereira LV, Vasques LR. X-chromosome inactivation: lessons learned from transgenic mice. Gene 2000; 255: 363-371. 23. Racchi O, Mangerini R, Rapezzi D, Rolfo M, Gaetani GF, Ferraris AM. X chromosome inactivation patterns in normal females. Blood Cells Mol Dis 1998; 24: 439-447. 24. Shih LY, Lin TL, Dunn P, Wu JH, Tseng CP, Lai CL, Wang PN, Kuo MC. Clonality analysis using X-chromosome inactivation patterns by HUMARA-PCR assay in female controls and patients with idiopathic trombocytosis in Taiwan. Exp Hematol 2001; 29: 202-208. 25. Schmucker B, Meindl A, Achatz H, Mittermuller J, Kruger G, Hergersberg M, Spiegel R, Schinzel A, Belohradsky BH, Murken J. A PCR based X-chromosome inactivation assay for carrier detection in X-linked immunodeficiency using differential methylation of the androgen receptor gene. Immunodeficiency 1995; 5: 187-192. 26. Stavropoulos N, Lu N, Lee JT. A functional role for Tsix transcription in blocking Xist RNA accumulation but not in X-chromosome choice. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98: 10232-10237. 27. Sukegawa K, Matsuzaki T, Fakuda S, Masuno M, Fukao T, Kokuryu M, Iwata S, Tomasu S, Orii T, Kondo N. Brother/sister siblings affected with Hunter disease: evidence for skewed X chromosome inactivation. Clin Genet 1998; 53: 96-101. 28. Tsuge I, Matsuoka H, Abe T, Kamachi Y, Torii S. X chromosome inactivation analysis to distinguish sporadic cases of X-linked agammaglobulinaemia from common variable immunodeficiency. Eur J Pediatr 1993; 152: 900-904. 29. Wakefield MJ, Keohane AM, Turner BM, Graves JAM. Histone underacetylation is an aincient component of mammalian X chromosome inactivation. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94: 9665-9668. 30. Yurov YB, Vorsanova SG, Kolotii AD, Iourov IY. Molecular-cytogenetic investigation of skewed chromosome X inactivation in Rett syndrome. Brain Dev 2001; 23: S214-S217.
