Woord vooraf. Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden)

Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden)

Woord vooraf

Dit eindwerk is een laatste stap in het behalen van het bachelordiploma biomedische laboratoriumtechnologie, afstudeerrichting farmaceutische en biologische technieken. Hierbij kreeg ik de kans om mijn stage te doen in het onderzoekslabo van de Mariene biologie van de universiteit Gent. In de eerste plaats wil ik graag mijn stagementor, Dr. Marleen De Troch, en haar doctoraatsstudente, Clio Cnudde, bedanken voor de enthousiaste begeleiding en alle uitleg en informatie omtrent diatomeeën en copepoden. Beiden stonden altijd klaar om hulp te bieden of voor het beantwoorden van vragen en problemen. Ten tweede wil ik mijn stagebegeleider, de Heer Bart Quartier, bedanken voor de opvolging van de stage en voor de begeleiding en het verbeterwerk bij het schrijven van dit eindwerk. Ik wil ook graag Dirk Van Gansbeke bedanken voor het gebruik van het chemische labo en de begeleiding bij het uitvoeren van de verschillende analyses. Dirk stond ondanks het vele werk altijd klaar en bood veel uitleg en informatie over de verschillende gebruikte toestellen en technieken. Verder gaat er veel dank uit naar andere personen zoals Olga Chepurnova, van de onderzoeksgroep Protistologie en Aquatische Ecologie, die de startcultuur van de diatomeeën leverde en steeds bereid was om hulp te bieden bij vragen of problemen omtrent de diatomeeën of het maken van cultuurmedium. Ook naar Bart Beuselinck, Annick Van Kenhove, Annelien Rigaux en Prof. Dr. Tom Moens voor de hulp die zij boden binnen verschillende delen van het uitgevoerde onderzoek. En als laatste gaat er heel veel dank uit naar vrienden en familie, de mensen de je het vaakst omringen en soms ongemerkt de meeste hulp bieden.

1


Samenvatting

Het mariene voedselweb bestaat uit verschillende complexe interacties tussen trofische niveaus. Zo zijn er vele interacties tussen het fytoplankton dat aan de basis van het mariene voedselweb ligt en het zoöplankton. Het zoöplankton bestaat voor een groot deel uit copepoden of roeipootkreeftjes, deze voeden zich met het fytoplankton met diatomeeën of kiezelwieren als belangrijke vertegenwoordigers. De interacties tussen deze twee niveaus worden onderzocht in een functionele studie naar de interacties tussen mariene roeipootkreeftjes (Copepoda, Harpacticoida) en hun voornaamste voedselbronnen (kiezelwieren of diatomeeën, bacteriën). In het kader van deze studie werd onderzoek gedaan naar de verschillen in voedselkwaliteit van diatomeeën volgens hun groeistadium en welke effecten dit heeft op de begrazing door copepoden en de selectiviteit van deze grazers. Hiervoor werd gebruik gemaakt van de diatomee Seminavis robusta (stam 85A) en de harpacticoide copepode Microarthridion littorale, beiden zijn typische soorten uit getijdengebieden langs slibrijke Europese kusten. In een eerste deel van dit onderzoek werd de groei van diatomeeën dagelijks gevolgd en werden de optimale groeiomstandigheden bepaald door het opkweken van deze diatomeeën onder verschillende omstandigheden, zoals verschillen in beweging, lichtregime, temperatuur, groeioppervlakte en nutriënten (in het groeimedium). Via dagelijkse tellingen met een inversiemicroscoop werden de concentraties van het aantal cellen (aantal cellen/cm²) bepaald en werden groeicurves opgesteld. Deze groeicurves lieten blijken dat de beschikbare groeioppervlakte en de aanwezigheid van silica een positief effect hebben op de maximale hoeveelheid cellen in de stationaire fase. In een tweede deel werd de voedselkwaliteit tussen de verschillende groeifasen (lagfase, exponentiële fase en stationaire fase) van de diatomee bepaald door een reeks van biochemische karakterisaties. De uitgevoerde biochemische analyses waren vetzuuranalyses, pigmentanalyses, nutriëntanalyses, bepalingen van de C:N ratio, EPS bepalingen en karakterisatie van de bacteriële gemeenschap. Eén van de voornaamste conclusies is dat er verschillen optreden in de vetzuurconcentraties naargelang de groeifase. Het vetzuur DHA (docosahexaeenzuur) is enkel aanwezig in de stationaire fase, deze aanwezigheid kan de voedselselectivi2


teit van de copepoden gaan bepalen. De hoeveelheid chlorofyl a per cel neemt af naargelang de groei van de diatomeeën vordert. Dit lijkt logisch aangezien de chlorofyl a concentratie in diatomeeën wordt beschouwd als een maat voor de „versheid‟ van deze cellen voor de grazers, hoe ouder de cellen hoe minder vers. Tussen de bacteriële gemeenschappen van de verschillende groeifasen zijn belangrijke verschillen te zien. De diversiteit en densiteit van de gemeenschappen zijn substantieel verschillend tussen de groeifases waarbij de densiteit van de bacteriën het hoogst is bij verminderde diatomeeëngroei (lag en stationaire fase). Dit vormt een belangrijk gegeven naar de grazers toe en kan de voedselselectiviteit bepalen. In het derde en laatste deel werd er aan de hand van een voedingsexperiment gekeken naar de implicaties van deze verschillen in voedselkwaliteit voor mariene grazers zoals copepoden. Hieruit bleek dat de initiële aanrijking met het stabiele isotoop 13C het sterkst is tijdens de exponentiële groeifase. Dit resultaat voldoet aan de verwachtingen omdat deze groeifase gekenmerkt wordt door de snelste groei. De opname van 13C aangerijkte diatomeeën door de copepoden was het hoogst in de lag en de exponentiële fase. De verschillen in de initiële aanrijking tussen de diatomeeën zou moeten in rekening gebracht worden, dit was echter niet mogelijk omdat de koolstofgehalten niet gekend waren. Dit besluit dient met de nodige voorzichtigheid geïnterpreteerd te worden, gelet op het feit dat er bij de groei van de diatomeeën problemen zijn opgetreden.

3


Lijst met afkortingen en symbolen

AD: aqua destillata ASW: Artificial seawater DGGE: denaturing gradient gel electrophoresis DHA: docosahexaeenzuur DNA: desoxyribonucleïnezuur dNTP: desoxyribonucleotide trifosfaat EA-IRMS: elemental analyzer isotopenratio massaspectrometer EPA: eicosapentaeenzuur EPS: extracellulaire polymerische substanties FAMES: Fatty acid methyl esters GC: gaschromatografie HPLC: high performance liquid chromatography MS: massaspectrometer NSW: natural seawater PCR: polymerase chain reaction psu: practical salinity unit PUFA‟s: polyunsaturated fatty acids rpm: revolutions per minute TAE: Tris-acetaat-EDTA TCD: Thermal conductivity detector UV: ultra violet

4


Verklarende woordenlijst

Auxospore: een spore gevormd door aseksuele metamorfose van de protoplast van een cel, of het resultaat van seksuele samensmelting van 2 protoplasten of nuclei. Benthisch: op of in substraat levend, substraat is veelal de waterbodem Biofilm: een laag organismen door zelf-geproduceerd slijm vastgehecht op een oppervlakte. Deze slijmlaag wordt ook EPS of extracellulair polymeer substantie genoemd. Chlorofyl a: groene kleurstof die zich in chloroplasten bevind Chromatogram: een weergave van gescheiden stoffen verkregen door chromatografie Ciliaten: trilhaardiertjes, eencellige diertjes die zich d.m.v. trilharen voortbewegen C:N ratio: koolstof tot stikstof ratio Copepodiet: overgangsvorm tussen nauplii en volwassen copepoden Cyanobacteriën: blauwalgen of blauwwieren, bacteriën die net als planten fotosynthese toepassen om te kunnen leven Detritus: dood organisch materiaal Dinoflagellaten: microscopisch kleine eencellige eukaryoten met zweepharen (flagellen) Epifytisch: op planten groeiend Epipelisch: vrij op of in sediment levend Epitheca: de grootste klep van een diatomee Eukaryoten: bestaan uit cellen met een volledige celbouw, ze bezitten een celkern waarin het DNA is verpakt Exponentiële fase: logfase, groeifase waarin de cellen zich sterk gaan beginnen delen Frustule: omkapseling van diatomeeën (celwanden)

5


Fytoplankton: plankton dat voor zijn energievoorziening afhankelijk is van fotosynthese Heterotroof: een organisme is heterotroof als hij zijn organische celmateriaal opbouwt uit organische stoffen. Is dus afhankelijk van andere organismen Hypocingulum: de gordelbanden van een diatomee Hypotheca: de kleinste klep van een diatomee Interstitieel: tussenliggend Lagfase: groeifase waarin cellen zich nog moeten aanpassen waardoor de cellen niet onmiddellijk in aantal toenemen Meiofauna: Metazoa die door een 1mm zeef gaan maar achterblijven op een 32/38 µm zeef Metazoa: meercellige dieren die het grootste deel van het rijkdom der dieren uitmaken Milli-Q: water met een weerstand van 18,2 MΩ bij 25°C. Het totaal gehalte aan organische koolstoffen is kleiner dan 10 ppb. Mollusken: groep van schaaldieren Nauplli: eerste larven van de copepoden Nucleus: celkern Oöcyt: stadium in de ontwikkeling van eicellen Plastiden: Plantaardige organellen met pigmenten en/of reservestoffen Protoplast: cellichaam, celbestanddeel gelegen binnen de celwand Protosoom: vooreinde Spermatocyt: stadium in de ontwikkeling van zaadcellen Spermatofoor: het zaadpakketje van een mannelijk dier dat wordt afgedragen aan het vrouwelijk dier om bevruchting mogelijk te maken Stationaire fase: groeifase waarin het aantal levende cellen in een populatie niet meer toeneemt. De vorming van nieuwe cellen is gelijk aan de afsterving van cellen.

6


Taxonomie: definieert objectklassen en de onderlinge relaties in een hiërarchisch opgebouwd systeem. Urosoom: achtereinde Zoöplankton: verzamelnaam voor in water zwevende of drijvende organismen die zich niet voeden door middel van fotosynthese

7


Lijst van tabellen en figuren FIGUUR 2.1 EEN VOORBEELD VAN EN MARIEN VOEDSELWEB (PAULY, 1998) ................................................................... 15 FIGUUR 2.2 VERSCHILLENDE DIATOMEEËNSOORTEN (ENTWISLE ET AL., 1997) ................................................................. 17 FIGUUR 2.3 SEMINAVIS ROBUSTA (STAM 85A) (HTTP://WWW.PAE.UGENT.BE/COLLECTION/SEMINAVIS.HTM) ...................... 18 FIGUUR 2.4 SILICA FRUSTULE VAN EEN DIATOMEE (KUNKEL, 2002) ............................................................................... 20 FIGUUR 2.5 BOUW VAN EEN DIATOMEE (GENUS NAVICULA) (UNDERWOOD & PATERSON, 2003) ....................................... 20 FIGUUR 2.6 GEEL-BRUINE BIOFILM VAN DIATOMEEËN (LOCATIE: PAULINA, WESTERSCHELDE-ESTUARIUM, NEDERLAND) (FOTO: M. DE TROCH) ........................................................................................................................................... 21 FIGUUR 2.7 HARPACTICOIDE COPEPODEN VERZAMELD IN DE WESTERSCHELDE (FOTO: M. DE TROCH) ................................. 23 FIGUUR 2.8 VERSCHILLENDE LICHAAMSVORMEN VAN HARPACTICOIDE COPEPODEN (COULL, 1977) ...................................... 25 FIGUUR 2.9 LICHAAMSBOUW VAN EEN COPEPODE (HUYS ET AL., 1996) ......................................................................... 26 FIGUUR 2.10 ONTWIKKELING VAN PLANKTONISCHE COPEPODEN (CALANOIDA) (HTTP://WWW.ZEEINZICHT.NL/VLEET/INDEX.PHP?ITEM=ZEE&PAGEID=COPEPODEN.HTM&USE_TEMPLATE=VLEET_TEMPLA TE.HTML) .................................................................................................................................................. 27

FIGUUR 3.1 CULTUURFLESSEN EN WELL-PLATEN MET DIATOMEEËN ................................................................................ 31 FIGUUR 3.2 GC-MS (FOTO: M. DE TROCH) ............................................................................................................. 37 FIGUUR 3.3 SCHEMA SKALAR NUTRIËNTANALYZER ...................................................................................................... 41 FIGUUR 3.4 SCHEMA C/N ANALYZER (THERMO SCIENTIFIC, INFORMATIEBROCHURE) ........................................................ 44 FIGUUR 3.5 FLASH 2000 SERIES C/N ANALYZER (THERMO SCIENTIFIC, INFORMATIEBROCHURE) ......................................... 46 FIGUUR 3.6 PLAATS VAN STAALNAME (PAULINASCHOR, NEDERLAND) (FOTO: M. DE TROCH)............................................. 60 FIGUUR 4.1 GRAFIEK MET GROEICURVEN MET F/2 (MET SILICA) 20 ML/L........................................................................ 65 FIGUUR 4.2 GRAFIEK MET GROEICURVEN VAN VERSCHILLENDE OMGEVINGSFACTOREN (ASW: ARTIFICIAL SEAWATER, NSW: NATURAL SEAWATER)................................................................................................................................... 66

FIGUUR 4.3 GRAFIEK MET GROEICURVEN VAN DE VERSCHILLEN IN NUTRIËNTEN (ASW: ARTIFICIAL SEAWATER) ....................... 67 FIGUUR 4.4 CHROMATOGRAM LAGFASE (REPLICA 2) ................................................................................................... 68 FIGUUR 4.5 CHROMATOGRAM EXPONENTIËLE FASE (REPLICA 2) .................................................................................... 69 FIGUUR 4.6 CHROMATOGRAM STATIONAIRE FASE (REPLICA 2) ...................................................................................... 69 FIGUUR 4.7 OVERZICHT VAN DE NUTRIËNTEN IN HET MEDIUM NA DE VERSCHILLENDE GROEIFASEN ....................................... 72 FIGUUR 4.8 GRAFIEK VAN DE CONCENTRATIE AANWEZIG NITRAAT .................................................................................. 72 FIGUUR 4.9 GRAFIEK VAN DE CONCENTRATIE AANWEZIG NITRIET ................................................................................... 73 FIGUUR 4.10 SILICAATCONCENTRATIE IN DE VERSCHILLENDE GROEIFASEN ....................................................................... 73 FIGUUR 4.11 FOSFAATCONCENTRATIE IN DE VERSCHILLENDE GROEIFASEN ....................................................................... 74 FIGUUR 4.12 AMMONIUMCONCENTRATIE (GEMIDDELDE VAN 2 REPLICA’S) IN DE VERSCHILLENDE GROEIFASEN ...................... 74

8


FIGUUR 4.13 C:N RATIO IN DE VERSCHILLENDE GROEIFASEN ......................................................................................... 75 FIGUUR 4.14 HOEVEELHEID EPS PER CEL IN ELKE GROEIFASE (GEMETEN MET SPECTROFOTOMETER) ..................................... 76 FIGUUR 4.15 HOEVEELHEID EPS PER CEL IN ELKE GROEIFASE (GEMETEN MET VICTOR³MULTILABELREADER) ........................... 77 FIGUUR 4.16 DGGE-GEL ...................................................................................................................................... 78 FIGUUR 4.17 DENDROGRAM GEBASEERD OP DE DGGE RESULTATEN VAN DE VERSCHILLENDE GROEIFASEN ............................ 79 13

FIGUUR 4.18 Δ C WAARDEN DIATOMEEËN .............................................................................................................. 81 13

FIGUUR 4.19 ΔΔ C WAARDE COPEPODEN................................................................................................................ 81

TABEL 2.1 TAXONOMISCHE POSITIE VAN DE DIATOMEEËNSOORT SEMINAVIS ROBUSTA (HTTP://WWW.ITIS.GOV/INDEX.HTML) .. 18 TABEL 2.2 TAXONOMIE VAN DE HARPACTICOIDA (HTTP://WWW.ITIS.GOV/INDEX.HTML) ................................................... 24 TABEL 3.1 SAMENSTELLING PCR-MIX ...................................................................................................................... 52 TABEL 3.2 V3DOWN2 - PCR PROGRAMMA ............................................................................................................... 53 TABEL 4.1 OVERZICHT RESULTATEN VAN DE VETZUURANALYSE ...................................................................................... 70 TABEL 4.2 RESULTATEN PIGMENTANALYSE ................................................................................................................ 71

9


Inhoudsopgave Woord vooraf ........................................................................................................ 1 Samenvatting ........................................................................................................ 2 Lijst met afkortingen en symbolen ..................................................................... 4 Verklarende woordenlijst ..................................................................................... 5 Lijst van tabellen en figuren ................................................................................ 8 Inhoudsopgave ................................................................................................... 10 1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling ..................................... 13

2

Literatuurstudie ..................................................................................... 15

2.1

Het mariene voedselweb ......................................................................... 15

2.2

Diatomeeën ............................................................................................. 17

2.2.1

Taxonomische positie .............................................................................. 18

2.2.2

Algemene biologie ................................................................................... 19

2.2.3

Groei en voortplanting ............................................................................. 21

2.2.4

Silicagebruik ............................................................................................ 22

2.3

Copepoden .............................................................................................. 23

2.2.5

Taxonomische positie .............................................................................. 24

2.2.6

Harpacticoide copepoden ........................................................................ 25

2.4

Diatomeeën-copepoden interacties ......................................................... 28

2.4.1

Biochemische karakterisatie van de aanwezige vetzuren ........................ 28

2.4.2

De C:N ratio ............................................................................................. 29

2.4.3

De bacteriële gemeenschap .................................................................... 29

3

Materialen en methoden ........................................................................ 30

3.1

Groei van diatomeeën ............................................................................. 30

3.1.1

Invloed van beschikbare groeioppervlakte ............................................... 30

3.1.2

Invloed van de kweekomstandigheden .................................................... 30

3.1.3

Invloed van verschillen in nutriëntensamenstelling .................................. 31 10


3.2

Biochemische karakterisatie van diatomeeën in verschillende groeifasen 34

3.2.1

3.2.2

Vetzuuranalyse ........................................................................................ 35 3.2.1.1

Vetzuurextractie ......................................................................... 35

3.2.1.2

Vetzuuranalyse .......................................................................... 36

Pigmentanalyse en nutriëntanalyse ......................................................... 38 3.2.2.1

Pigmentanalyse .......................................................................... 38

3.2.2.2

Nutriëntanalyse ......................................................................... 40

3.2.3

Bepalen van C:N ratio.............................................................................. 44

3.2.4

Bepaling van de EPS productie ............................................................... 46

3.2.5

Bepaling van de bacteriële gemeenschap ............................................... 50 3.2.5.1

DNA-extractie ............................................................................. 50

3.2.5.2

V3PCR ....................................................................................... 51

3.2.5.3

Agarose-gelelektroforese ........................................................... 53

3.2.5.4

DGGE ........................................................................................ 55

3.3 Voedingsexperiment copepoden .................................................................... 60 4

Resultaten en discussie ........................................................................ 65

4.1


4.1.1

Invloed van beschikbare groeioppervlakte ............................................... 65

4.1.2

Invloed van de omgevingsfactoren .......................................................... 66

4.1.3

Invloed van verschillen in nutriëntensamenstelling .................................. 67

4.2


4.2.1.

Vetzuuranalyse ........................................................................................ 68

4.2.2.

Pigmentanalyse en nutriëntanalyse ......................................................... 71 4.2.2.1

Pigmentanalyse .......................................................................... 71

4.2.2.2

Nutriëntanalyse .......................................................................... 71 11


4.2.3.

Bepalen van de C:N ratio ......................................................................... 75

4.2.4.

Bepaling van de EPS productie ............................................................... 75

4.2.5.

Bepaling van de bacteriële gemeenschap ............................................... 77

4.3

Voedingsexperiment copepoden ............................................................. 80

5

Conclusie ............................................................................................... 83

5.1


5.2


5.3

Voedingsexperiment copepoden ............................................................. 84

Literatuurlijst ...................................................................................................... 85 Colofon ................................................................................................................ 87

12

Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden) Inleiding, situatieschets en probleemstelling

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

Een organisme leeft nooit volledig geïsoleerd. Ze leven in een ecosysteem en alle delen hiervan staan in verbinding met elkaar en interageren. Een duidelijk voorbeeld van complexe interacties is het mariene voedselweb dat gebaseerd is op de primaire productie door bijvoorbeeld fytoplankton dat onder andere diatomeeën of kiezelwieren omvat. Het fytoplankton zijn primaire producenten en dienen als voedsel voor de kleinste dieren in de waterkolom, het zooplankton. Dit zooplankton bestaat voor een groot deel uit copepoden (roeipootkreeftjes) en vormt een link in het voedselweb tussen het fytoplankton en de planktonetende vissen. De interacties binnen de delen van dit mariene ecosysteem kunnen de verspreiding en aanwezigheid van organismen en omgevingsfactoren beïnvloeden, ze zijn verantwoordelijk voor de organisatie van een gemeenschap en zijn verdere ontwikkeling (Stewart, 2005). Dit eindwerk werd geschreven naar een stage die plaats vond in het labo Mariene Biologie van de Universiteit Gent en kadert in het onderzoek rond een functionele studie van de interacties tussen mariene roeipootkreeftjes (Copepoda, Harpacticoida) en hun voornaamste voedselbronnen (kiezelwieren of diatomeeën, bacteriën). De hierbij geformuleerde vraagstellingen worden multidisciplinair onderzocht door een combinatie van tal van actuele technieken. Het uitgevoerde onderzoek vormt een deelaspect van deze studie en handelt rond de vraagstelling: „Verschilt de voedselkwaliteit van diatomeeën volgens hun groeistadium en welk effect heeft dit op de begrazing door copepoden?‟ Het onderzoek bestaat uit drie delen. In het eerste deel wordt er gekeken naar de groei van diatomeeën en worden de optimale groeiomstandigheden bepaald door het opkweken van diatomeeën onder verschillende omstandigheden, zoals verschillen in lichtregime, temperatuur, oppervlakte, nutriënten(medium) en het effect van eventuele schudbewegingen. In het tweede deel worden de diatomeeën in de verschillende groeifasen biochemisch gekarakteriseerd met als doel de verschillen in voedselkwaliteit van de diatomeeën te bepalen. 13

Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden) Inleiding, situatieschets en probleemstelling

In het derde en laatste deel wordt er gekeken naar de potentiële implicaties van deze verschillen in voedselkwaliteit voor de mariene grazers (copepoden)

14

Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden) literatuurstudie

2

Literatuurstudie

2.1

Het mariene voedselweb

Er is een onderscheid tussen een mariene voedselketen en het mariene voedselweb. In een voedselketen wordt er enkel gekeken naar wie wat eet en het houdt dus vooral rekening met voedsel-consument relaties. Een voedselweb (zie figuur 2.1) is samengesteld uit verschillende voedselketens, en vormt zo een gecompliceerd netwerk van voedselrelaties (Stewart, 2005).

Figuur 2.1 Een voorbeeld van en marien voedselweb (Pauly, 1998)

De basis van het mariene voedselweb wordt gevormd door het fytoplankton. Deze omvatten o.a. diatomeeën (kiezelwieren), dinoflagellaten en cyanobacteriën. Sommige van deze mariene planten zijn eukaryoten, andere zijn fotosynthetische bacteriën. Fytoplankton zijn primaire producenten doordat ze zonne-energie gebruiken om CO2 en nutriënten om te zetten in koolhydraten en andere moleculen die nodig zijn om te overleven. Het fytoplankton dient als voedsel voor de kleinste dieren in de waterkolom, het zooplankton. Deze verschillen in grootte van eencellige organismen tot grotere 15


multicellulaire organismen. Het kleinere zooplankton wordt gegeten door het grotere zooplankton. Zooplankton bestaat uit ciliaten of amoeben die nooit groot worden, copepoden, garnalen en de larvale stadia van mollusken, vissen en kwallen, die uitgroeien tot veel grotere dieren. De copepoden komen veel voor en domineren binnen het zooplankton. Ze vormen een link in het voedselweb tussen het fytoplankton en de planktonetende vissen. Bijna alle vissoorten zijn op een bepaald punt van hun leven afhankelijk van copepoden en andere garnaalachtigen (Stewart, 2005). Het zooplankton wordt gegeten door kleine predatoren. Deze bestaan uit grotere garnalen en krill, onvolwassen stadia van grotere dieren zoals kwallen en vissen en de kleinere vissoorten. Hierboven bevinden zich nog de grote predatoren, de volwassen kwallen, de grote vissoorten en mariene zoogdieren zoals, zeehonden, walrussen, dolfijnen en walvissen. Sommigen hiervan voeden zich met vis, maar anderen voeden zich direct met zooplankton. Verder behoren ook vogels zoals meeuwen, pelikanen, albatrossen en pinguïns tot de top van de predatoren. Helemaal bovenaan bevindt zich slechts één soort, de mens, als toppredator (Stewart, 2005).

16


2.2

Diatomeeën

Diatomeeën of kiezelwieren zijn eencellige eukaryoten. De diversiteit van deze organismen zette aan tot biologische studies (zie figuur 2.2). Heel lang werd er onderling vaak gedebatteerd over de taxonomie, terminologie, het mechanisme, de reproductie en nog vele andere aspecten van de diatomeeënbiologie. Oorspronkelijk kende men grote problemen om de organismen te kweken en in leven te houden. Daar kwam echter tegen het einde van de 19 de eeuw verandering in dankzij de intense veldstudies die de kennis van de ecologie en biologische aspecten vergroot hebben. Nog steeds wordt er verder gewerkt naar een grotere kennis van de diatomeeënbiologie (Shin, 1999).

Figuur 2.2 Verschillende diatomeeënsoorten (Entwisle et al., 1997)

17


2.2.1 Taxonomische positie Diatomeeën of kiezelwieren behoren tot het rijk van de planten, die verder onderverdeeld wordt in het subregnum Chromista en verder in het phylum Bacillariophyta (diatomeeën) (zie tabel 2.1). In dit onderzoek wordt slecht gebruik gemaakt van één soort van het genus Amphora (Seminavis), de Seminavis robusta (stam 85A) (zie figuur 2.3). Tabel 2.1 Taxonomische positie van de diatomeeënsoort Seminavis robusta (http://www.itis.gov/index.html)

Regnum Plantae Subregnum Chromista Phylum Bacillariophyta Classis Bacillariophyceae Ordo Thalassiophysales Familia Catenulaceae Genus Amphora (Seminavis) Species Amphora robusta (Seminavis robusta) Classis Coscinodiscophyceae Classis Fragilariophyceae

Figuur 2.3 Seminavis robusta (stam 85A) (http://www.pae.ugent.be/collection/seminavis.htm)

18


2.2.2 Algemene biologie Diatomeeën zijn meestal fotosynthetiserende micro-organismen, sommigen kunnen echter ook heterotrofisch leven (Shin, 1999). Ze vormen een wijdverspreide groep en komen voor in oceanen, zoetwater, bodems en op dampoppervlakten. De meeste leven in de diepzee, hoewel sommige ook leven in de oppervlaktefilms (biofilms) bij watersediment afzettingsgebieden (benthische) en zelfs in een vochtige atmosfeer (Mann, 1999). Deze unicellulaire algen zijn de grootste primaire producenten in vele aquatische habitats en staan volgens schattingen in voor 40% van de totale primaire productie in mariene ecosystemen (Underwood & Paterson, 2003). Eén van de indicaties voor hun grote diversiteit zijn de verschillende manieren waarop diatomeeën groeien en bestaan. Sommige diatomeeën leven als één enkele cel, anderen kunnen bestaan als clusters of filamenten die zich kunnen verankeren aan oppervlakten (Shin, 1999). De epipelische diatomeeën (vrijlevende of op sediment levende diatomeeën) scheiden een deel van de fotosynthetisch gefixeerde koolstoffen uit als extracellulaire polymerische substanties (EPS) die grotendeels bestaan uit koolhydraten. De diatomeeën worden ingebed in een matrix van EPS die zich vasthecht aan het sediment. Deze groenbruine dunne laag op het sediment vormt een belangrijke voedselbron voor andere organismen en wordt „biofilm‟ genoemd (zie figuur 2.6)(de Brouwer, 2002). De divisie Bacillariophyta (diatomeeën) wordt op basis van de celvorm verder onderverdeeld in twee grote taxonomische groepen. De ronde of centrische diatomeeën (radiaal symmetrisch) en de langwerpige of pennate diatomeeën (bilateraal symmetrisch) (Underwood & Paterson, 2003). Centrische diatomeeën zijn overwegend planktonisch, terwijl pennate diatomeeën planktonisch kunnen zijn, maar ook gebonden aan oppervlakten, of groeiende op en binnendringend in de bovenste lagen van sediment (Underwoord & Paterson, 2003). Bijna alle diatomeeën hebben dezelfde basiscelstructuur. Deze kan beschreven worden als een silica frustule of omkapseling (zie figuur 2.4). Ze bestaan uit 2 helften (kleppen of valves), een grotere (epitheca) en een kleinere (hypotheca) die samengehouden worden door gordelbanden (hypocingulum) (zie figuur 2.5). (Shin, 1999); (Underwood & Paterson, 2003) 19


Figuur 2.4 silica frustule van een diatomee (Kunkel, 2002)

De celinhoud van de diatomeeën is niet ongewoon vergeleken met andere eukaryotische algen. Het protoplast is volledig opgenomen in de silica-omkapseling (zie figuur 2.4) en het bevat een nucleus of celkern, mitochondriën, plastiden en verschillende andere organellen (Shin, 1999).

Figuur 2.5 Bouw van een diatomee (genus Navicula) (Underwood & Paterson, 2003)

Individueel gezien hebben de diatomeeën geen sterk zichtbare kleuring, als ze echter in groep worden bekeken wordt er een gele tot donkerbruine kleur waargenomen naargelang de grootte van de groep (zie figuur 2.6). Dit komt door de aanwezigheid van fotosynthetische plastiden. Er zijn ook diatomeeën die een blauwe of groene kleur hebben, maar deze vormen een uitzondering (Shin, 1999). De grootte van diatomeeën wordt meestal uitgedrukt in micrometers en kan sterk variëren. 20


Figuur 2.6 Geel-bruine biofilm van diatomeeën (Locatie: Paulina, Westerschelde-estuarium, Nederland) (Foto: M. De Troch)

2.2.3 Groei en voortplanting De groei van diatomeeën gebeurt unidirectioneel en resulteert in een gemiddelde groottevermindering bij elke divisie. De eenrichtingsgroei is een resultaat van de silica aard van de frustule, de silica-omkapseling kan zich niet uitbreiden. Doordat de cel zich niet direct binnen de frustule kan uitbreiden, moet het zich langs de gordel uitbreiden. Er is een vermindering van de gemiddelde grootte omdat elke nieuwe klep binnen de frustule van de ouder wordt geproduceerd. In het algemeen gaan de kleppen apart beginnen verschuiven wegens de bouw van nieuwe klepelementen binnen de oudercel. Om die verschuiving toe te staan wordt er constant hypocingulum toegevoegd. Als de mitose vervolledigd is, kan de cel gaan delen. De oudercel gaat zich opsplitsen in 2 dochtercellen door 2 nieuwe kleppen te vormen die elk op één van de oorspronkelijke kleppen passen (Shin, 1999). Door de algemene celverkleining heeft de diatomee een manier nodig om z‟n grootte terug te winnen als hij te klein wordt. Dit gebeurt door de vorming van een auxospore via seksuele reproductie. De vegetatief reproducerende cellen kunnen differentiëren naar spermatocyten en oöcyten. De auxospore is een cel die zich ontwikkelt en groeit, en uiteindelijk een nieuwe frustule produceert. De vorming

21


van auxosporen laat de diatomee toe om z‟n oorspronkelijke grootte te herwinnen en om opnieuw aan vegetatieve voortplanting te doen (Shin, 1999). 2.2.4 Silicagebruik Silica is één van de meest voorkomende elementen in de aardkorst. Ondanks het feit dat het in grote hoeveelheden aanwezig is, is het merendeel niet beschikbaar voor organismen, door de onoplosbare structuur. Als silica in oplossing is, is dit meestal onder de vorm van Si(OH)4. Aangezien diatomeeën silica nodig hebben om hun frustule te bouwen, worden ze meestal gevonden in regio‟s waar Si(OH)4 rijkelijk aanwezig is. Populaties van diatomeeën gaan snel aangroeien in de aanwezigheid van silica. Als deze echter opgebruikt is, gaan deze populaties snel dalen. Er is een variabiliteit tussen diatomeeën gezien aan de hoeveelheid silica die ze nodig hebben. Sommige diatomeeën kunnen verder leven zonder silica (Shin, 1999). Tijdens de volledige celcyclus is de hoeveelheid silica die wordt opgenomen verschillend. Het wordt sneller opgenomen tijdens de creatie van de frustules (Shin, 1999). Diatomeeën gebruiken silica voor twee doelen. Enerzijds wordt het gebruikt voor de silica componenten van de cel (valves en gordelelementen), anderzijds wordt het gebruikt voor hun metabolisme (Shin, 1999).

22


2.3

Copepoden

Copepoden, roeipootkreeftjes of aquatische crustaceeën zijn zeer divers en zijn de meest voorkomende Metazoa in het waterleven (zie figuur 2.7). Ze kunnen zowel in marien als in zoet water voorkomen, ze kunnen benthisch, epifytisch of parasitair zijn. Ze zijn over de ganse wereld in bijna elk aquatisch systeem terug te vinden, van ondergrondse waterreserves tot opgehoopt water in Bromeliabladeren (subtropische planten), van stromen tot rivieren, meren en de sedimentlaag in open zee. Hun habitat gaat van de hoogste bergen tot de diepste oceanen, van het koude poolwater tot actieve hydrothermale bronnen. De gewoonlijke lengte van volwassen copepoden bedraagt één tot twee millimeter, maar volwassenen van sommige species kunnen 0,2 millimeter zijn en andere kunnen gaan tot tien millimeter (Walter, 2008).

Figuur 2.7 Harpacticoide copepoden verzameld in de Westerschelde (Foto: M. De Troch)

23


2.2.5 Taxonomische positie De subclassis Copepoda omvat 10 ordes, waarvan in dit onderzoek slechts een soort van de orde Harpacticoida gebruikt wordt in het uitgevoerde experiment: Microarthridion littorale (Poppe, 1881) (zie tabel 2.2). Tabel 2.2 Taxonomie van de Harpacticoida (http://www.itis.gov/index.html)

Regnum Animalia Phylum Arthropoda Subphylum Crustacea Classis Maxillopoda Subclassis Copepoda Infraclassis Neocopepoda Superordo Gymnoplea Ordo Calanoida Superordo Podoplea Ordo Cyclopoida Ordo Gelyelloida Ordo Harpacticoida Familia Tachidiidae Genus Microarthridion Species Microarthridion littorale Ordo Misophrioida Ordo Monstrilloida Ordo Mormonilloida Ordo Poecilostomatoida Ordo Siphonostomatoida Infraclassis Progymnoplea Ordo Platycopioida

24


2.2.6 Harpacticoide copepoden Harpacticoide copepoden behoren tot de meiofauna en zijn over het algemeen vrijlevend en benthisch (zie figuur 2.8). In mariene sedimenten zijn ze meestal zeer abundant (Hicks & Coull, 1983). Deze orde van copepoden kan verder worden opgedeeld in 2 groepen, de interstitiële en de epibenthische vormen. De interstitiële vormen komen voor in de interstitiële ruimten tussen de sedimentkorrels, dit is slechts tot op een bepaalde diepte, vanaf een bepaald niveau is het zuurstofgehalte te laag om te overleven. De epibenthische soorten zijn terug te vinden op het sediment of in de bovenste sedimentlaag, dit meestal in de buurt van algen of zeegrassen (Hicks & Coull, 1983). De soorten die op algen of zeegrassen voorkomen worden epifytisch genoemd.

Figuur 2.8 verschillende lichaamsvormen van harpacticoide copepoden (Coull, 1977)

Harpacticoiden vervullen een sleutelrol in het mariene voedselweb. Ze voeden zich met microalgen, bacteriën en detritus. Zelf zijn ze prooi van larvale en juveniele vissen, zo vormen ze een belangrijke link tussen de primaire producenten en hogere trofische niveaus zoals vissen, zeevogels en mariene zoogdieren en tenslotte de mens (De Troch et al., 1998; Hicks & Coull, 1983).

25


Ze hebben meestal een lineaire lichaamsvorm waarvan het protosoom breder is dan het urosoom (zie figuur 2.9) (Hicks & Coull, 1983).

Figuur 2.9 Lichaamsbouw van een copepode (Huys et al., 1996)

De voortplanting en ontwikkeling (zie figuur 2.10) begint met de copulatie. Aangezien er geen speciaal copulatieorgaan aanwezig is voor een interne bevruchting, wordt de term hier gebruikt voor het vasthechten van een spermatofoor op het genitale gebied van het vrouwtje. De spermatofoor bevat sperma en andere secreties, het wordt bij de mannetjes intern geproduceerd en vrijgegeven tijdens de copulatie.

26


Enkele uren of dagen na copulatie worden broedzakken gevormd door de vrouwen. De meeste soorten produceren gepaarde broedzakken. Deze worden buiten het lichaam gedragen, onder het abdomen. Het aantal eieren is afhankelijk van hun grootte en de levensstijl. Na enkele dagen beginnen de larven uit te komen. De eerste larven van de copepoden worden nauplii genoemd. Ze zijn zeer klein en worden in verschillende soorten habitat teruggevonden. Meestal zijn er zes naupliusstadia die gescheiden worden door een vervelling. Na het zesde naupliusstadium gaan ze over naar de eerste copepodiet, dit gaat gepaard met belangrijke morfologische veranderingen. De gelijkenissen met het volwassenenstadium zijn reeds groot, na vijf vervellingen zijn de copepoden geslachtsrijp en klaar voor reproductie (Dürbaum & Künnemann, 2000).

Figuur 2.10 Ontwikkeling van planktonische copepoden (Calanoida) (http://www.zeeinzicht.nl/vleet/index.php?item=zee&pageid=copepoden.htm&use_template=vleet_tem plate.html)

27


2.4

Diatomeeën-copepoden interacties

De harpacticoide copepoden kunnen zich voeden met een brede waaier aan voedselitems zoals microalgen, organische detritus en bacteriën, als geaggregeerde cellen of als detritus-associaten (Hicks & Coull, 1983). De centrale vraagstelling in deze studie is wat de invloed is van de biochemische karakterisatie van diatomeeën in verschillende groeifasen op de interacties tussen deze copepoden, diatomeeën en hun geassocieerde bacteriën. Deze biochemische karakteristieken en de bacteriën geassocieerd met de diatomeeën zijn waarschijnlijk bepalend voor de kwaliteit van diatomeeën als voedselbron voor copepoden. 2.4.1

Biochemische karakterisatie van de aanwezige vetzuren

Sinds 2000 is er een snel groeiende interesse in meervoudig onverzadigde vetzuren of PUFA‟s (polyunsaturated fatty acids). Hiertoe behoren onder andere eicosapentaeenzuur (EPA) en docosahexaeenzuur (DHA) die geïdentificeerd zijn als nutriënten die een grote invloed hebben op de voedselkwaliteit en een grote nutritionele waarde hebben in aquacultuur (Kainz et al., 2004) (Liang & Mai, 2005). Veel mariene dieren hebben een beperkte mogelijkheid om PUFA‟s, die belangrijk zijn voor een goede groei en overleving te synthetiseren. Hierdoor moeten ze opgenomen worden via het voedsel. EPA en DHA mogen dan niet essentieel zijn voor sommige van deze dieren, bij aanwezigheid in het voedsel zorgen ze voor een betere groei en overlevingskansen (Liang & Mai, 2005). De vetzuursamenstelling van diatomeeën is belangrijk, aangezien deze aan de basis van het mariene voedselweb liggen. De vetzuursamenstelling is afhankelijk van verschillende omgevingsfactoren, maar ook de groeifase waarin deze diatomeeën zich bevinden kan hierop een belangrijk effect hebben. De samenstelling van de vetzuren kan experimenteel onderzocht worden door diatomeeënstalen te verzamelen en deze via gaschromatografie te analyseren. (Liang & Mai, 2005)

28


2.4.2

De C:N ratio

Een andere belangrijke indicator voor voedselkwaliteit van diatomeeëncellen voor grazers is de C:N ratio. Deze kan bepaald worden door een C:N analyse uit te voeren op stalen van diatomeeën (Hillebrand & Sommer, 1999). 2.4.3

De bacteriële gemeenschap

De harpacticoide copepoden voeden zich niet enkel met diatomeeën, maar ook met bacteriën. De diatomeeën kunnen dienst doen als een groeibodem voor bacteriën. Grote densiteiten aan bacteriën kunnen worden teruggevonden op de muceuze kapsels van diatomeeën (Decho & Fleeger, 1998). De diatomeeën kunnen dus gegeten worden met als eigenlijk doel het eten van bepaalde diatomeeëngeassocieerde bacteriesoorten. Het fytoplankton (diatomeeën) heeft een eigen typische microbiële gemeenschap die bestaat uit vastzittende en vrijlevende bacteriën. De vastzittende vormen bestaan voornamelijk uit leden van de Flavobacteria-Sphingobacteria groep welke relatief divers waren. Het merendeel van de vrijlevende micro-organismen in diatomeeënculturen behoort tot de Roseobacter-groep binnen de α-proteobacteria. De bacteriële gemeenschap toont sterke verschillen naargelang de soort, de groeifase en de fysiologische toestand van de diatomeeën (Grossart et al.,2005). Om de bacteriële gemeenschap van diatomeeën te bepalen kan men een DGGE of “denaturing gradiënt gel electrophoresis” uitvoeren. DGGE is een algemeen gebruikte techniek in de moleculaire biologie en wordt vaak toegepast om microbiële ecosystemen te bestuderen (Green, 2005).

29

Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden) Materialen en methoden

3

Materialen en methoden

3.1

Groei van diatomeeën

Methode

In dit experiment wordt er één diatomeeënsoort gebruikt, Seminavis robusta (stam 85A), afkomstig uit de cultuurcollectie van de onderzoeksgroep Protistologie en Aquatische Ecologie, PAE, van de Universiteit Gent. De groei van de diatomeeën wordt bepaald door middel van dagelijkse tellingen van het aantal cellen (uitgedrukt in aantal cellen per cm²). Aan de hand van deze tellingen worden groeicurven (aantal cellen t.ov. tijd) opgesteld. Er wordt telkens gestart met een beginconcentratie van 50 cellen/cm². 3.1.1 Invloed van beschikbare groeioppervlakte Hier wordt de invloed van de beschikbare groeioppervlakte onderzocht door een reeks verschillende behandelingen te starten. Onder dezelfde omstandigheden (11±1°C, dag/nacht belichting (12u/12u)) worden 2 verschillende well-platen en 2 verschillende cultuurflessen gestart met hetzelfde f/2 groeimedium. Daarnaast wordt er ook een controle (zonder f/2 groeimedium) gestart (zie figuur 3.1). Behandeling 1: Controle: 12 well (3 replica‟s) Behandeling 2: ASW (artificial seawater) + f/2: cultuurfles (175 cm²) Behandeling 3: ASW + f/2: cultuurfles (75 cm²) Behandeling 4: ASW + f/2: 12 well (3 replica‟s) Behandeling 5: ASW + f/2: 6 well (3 replica‟s) 3.1.2 Invloed van de kweekomstandigheden Om de invloed van kweekomstandigheden te testen worden er een reeks behandelingen opgezet in 12 well-platen (3 replica‟s). Het effect van de temperatuur, belichting, schudbeweging en de verschillen tussen natuurlijk en artificieel zeewater worden tevens onderzocht. Behandeling 1: ASW + f/2; 11±1°C, dag/nacht belichting (12u/12u) Behandeling 2: NSW (natural seawater) + f/2; 11±1°C, dag/nacht belichting (12u/12u) 30


Behandeling 3: ASW + f/2; 15±1°C, dag/nacht belichting (12u/12u) Behandeling 4: ASW + f/2; 11±1°C, constante belichting Behandeling 5: ASW + f/2; 11±1°C, dag/nacht belichting (12u/12u), schudbeweging 3.1.3

Invloed van verschillen in nutriëntensamenstelling

Om de invloed van beschikbare nutriënten te testen worden een aantal behandelingen gestart in 12 well-platen. Dit gebeurt onder dezelfde omstandigheden (11±1°C, dag/nacht belichting (12u/12u)). Behandeling 1: ASW + 20 ml/L f/2 + 2 ml/L Si Behandeling 2: ASW + 10 ml/L f/2 + 2 ml/L Si Behandeling 3: ASW + 40 ml/L f/2 + 2 ml/L Si Behandeling 4: ASW + 20 ml/L f/2 + 4 ml/L Si Behandeling 5: ASW + 20 ml/L f/2 + 1 ml/L Si Behandeling 6: ASW + 20ml/L f/2

Figuur 3.1 Cultuurflessen en well-platen met diatomeeën

31


Bereiden van f/2 medium 

neem een emmer AD (aqua destillata)



voeg Instant Ocean toe en meet met een saliniteitsmeter tot een psu (practical salinity unit) van 30-32

 

filter het ASW, breng het over in duran flessen autoclaveer gedurende 20 minuten



laat afkoelen en voeg 20 ml/L f/2 concentraat (met silica) toe

Bereiden van f/2 medium + Si  

weeg 1,5 g Na2SiO3.9H2O af los op in 100 ml AD

 

filter en autoclaveer gedurende 20 minuten laat afkoelen en voeg 2ml/L silicium bij het gefilterd ASW



autoclaveer gedurende 20 minuten, laat afkoelen en voeg 20 ml/L f/2 concentraat toe

Bereiden van NSW + f/2 

neem natuurlijk zeewater, filter dit over een 0,2 µm filter, breng het in duran flessen



autoclaveer gedurende 20 minuten



laat afkoelen en voeg 20 ml/L f/2 concentraat (met silica) toe

Opstarten experimenten  

breng 200 ml medium in een cultuurfles van 175 cm² breng 50 ml medium in een cultuurfles van 75 cm²

 

breng 5 ml medium in een 6 well breng 2 ml medium in een 12 well



tel een fles met diatomeeën onder de inversiemicroscoop, reken om hoeveel cellen er hierin aanwezig zijn



reken hoeveel ml je moet nemen uit deze fles om de andere flessen en well-platen te starten met een concentratie van 50 cellen/cm²



schud de fles krachtig zodat de diatomeeën loskomen



breng met een micropipet de juiste hoeveelheid celsuspensie over

32


Materiaal



Saliniteitsmeter (Merk: WTW, Type: Cond 330i)

 

Instant Ocean (Merk: Aquarium systems, Lot: 0609701 en 081060) Filters (Merk: Whatman®)

 

Cultuurflessen (Merk: Sarstedt, Groeiopp.: 175 cm², Groeiopp.: 75 cm²) Well-platen (12 well en 6 well) (Merk: Cellstar®)



Guillard‟s (f/2) Marine Water (with silica), Enrichment solution 50x (Merk: SIGMA®, Type: G9903, Lot: 057K2317, Exp: 05/2009)



Guillard‟s (f/2) Marine Water, Enrichment solution 50x (Merk: SIGMA ®, Type: G0154, Lot: 098K2337, Exp: 09/2010)



Na2SiO3.9H2O (Merk: Merck)



Balans (Merk: Sartorius, Type: LP620P)



Inversiemicroscoop (Merk: Axiovert, Type: 40C)

33


3.2

Biochemische karakterisatie van diatomeeën in verschillende groeifasen

Methode

Staalname 

Start voor oogsten in de lag fase 22 cultuurflessen (175cm² - 200 ml f/2 medium) met de diatomee Seminavis robusta (stam 85A) in een beginconcentratie van 50 cellen/cm².



Start voor oogst in de exponentiële fase op dezelfde manier 13 cultuurflessen



Start voor oogst in de stationaire fase op dezelfde manier 10 cultuurflessen



Laat voor de lag fase de flessen 4 dagen groeien, voor de exponentiële fase 7 dagen en voor de stationaire fase 22 dagen, doe dit onder dezelfde omstandigheden (11±1°C, dag/nacht belichting (12u/12u))



Oogst deze diatomeeën door driemaal respectievelijk 7, 4 en 3 flessen te filteren over een vooraf gemoffelde filter (voor vetzuuranalyse, pigmentanalyse en C/N analyse)



Neem van elke fase driemaal 15 ml van het filtraat voor de nutriëntanalyse, vries deze in bij -20°C



Breng de filters in een petriplaat, verpak ze in aluminiumpapier en vries ze in bij -80°C



Schud van elke fase 1 fles, zet deze op een lichtbron en laat de cellen bezinken



Zuig een deel van het bovenliggende water af, schud de flessen opnieuw en breng van elke fles 1 ml suspensie in 3 epjes (DGGE) en 10 ml suspensie in 3 falcons van 15 ml (EPS-bepaling)



Vries de epjes in bij -20°C en vries de falcons in bij -80°C

Materiaal



Cultuurflessen (Merk: Sarstedt, Groeiopp.: 175 cm²)



Filters (GF/F, Glass Microfiber filters, Merk: Whatman® Schleiger & Schuell) 34


3.2.1 Vetzuuranalyse 3.2.1.1 Vetzuurextractie Principe

Er wordt een snelle screening-methode (Eppendorf methode) toegepast. Hierin gebeurt de hydrolyse en de methylatie in één stap, dit leidt tot de vorming van FAMES (Fatty Acid Methyl Esters). Methode

Staalvoorbereiding 

Haal de stalen uit de diepvries en laat deze ontdooien

Uitvoeren van de extractie 

Neem de nodige centrifugebuisjes en reinig deze grondig:

- 3x wassen met AD - 3x wassen met methanol - 3x wassen met hexaan 

Maak op dezelfde manier twee erlenmeyers schoon en bereid hierin methanol + 2,5% H2SO4 en 0,98% NaCl



Vouw de filters van de stalen en blanco‟s in 4, breng ze in de glazen centrifuge buisjes en duw ze naar onderen



Voeg 3,5 ml methanol + 2,5% H2SO4 toe aan alle stalen



Plaats in een warmwaterbad van 80°C gedurende 90 minuten



Laat het vervolgens afkoelen tot kamertemperatuur



Voeg 1,75 ml hexaan toe



Voeg 1,75 ml 0,98% NaCl toe



Vortex gedurende één minuut



Centrifugeer 2 minuten bij 1200 rpm (revolutions per minute)



Breng de bovenste laag met een hamilton spuit over in een vial met een micro-insert, sluit deze af



Bewaar bij -20°C

35


Materiaal



Methanol (Merk: Merck, CatN°: 1.06011.1000, Lot: 1409111.804)

 

n-hexaan (Merk: Fluka, CatN°: 52767, Lot: 1371674 50708170) Warmwaterbad (Merk: Lauda, Type: AL5, CatN°: LCB 0724, Serienummer: LCB0724-08) Vortex-toestel (Merk: Heidolph, Type: Reax Top, Serienummer: 541-1000000-0)

 

Centrifuge (Merk: eppendorf, Type: 5810R, Serienummer: 5811 06306)

 

Vials (Merk: VWR, CatN°: 548-0004, Lot: 21613) 0,1 ml Micro Insert (Merk: Grace Alltech, Lot: 22856)



Caps (Merk: VWR, CatN°: 548-0009, Lot: 23878)

3.2.1.2

Vetzuuranalyse

Principe

De vetzuurextracten worden gescheiden d.m.v. gaschromatografie (GC) en gedetecteerd met een massaspectrometer (MS) (figuur 3.2). Het staal wordt via de injectiepoort ingespoten en stroomt samen met het draaggas (helium) over de capillaire kolom die aan een maximum temperatuur van 250°C kan blootgesteld worden. De componenten worden gescheiden en vloeien één voor één van de kolom naar een massaspectrometer. Deze laat toe om de gescheiden componenten van het staal makkelijker te identificeren, veel kleinere hoeveelheden van de componenten kunnen worden gedetecteerd. De massaspectrometer zal de vrijgekomen ionen karakteriseren. Het zendt een elektrisch signaal uit dat met betrekking van een chromatografiedatasysteem omgezet wordt in een piek met een bepaalde oppervlakte die evenredig is met de concentratie. De bekomen grafiek wordt een chromatogram genoemd. Verder vindt er ook moleculeherkenning plaats, dit gebeurt aan de hand van de retentietijd en door vergelijking met een interne standaard.

36


Figuur 3.2 GC-MS (Foto: M. De Troch)

Methode

Uitvoeren van de vetzuuranalyse 

Breng de stalen in de insertieplaatsen (8)

 

Voer de namen van de stalen in in de software Start de analyse

Verwerken van de resultaten 

Open de chromatogrammen, laad een methode en vergelijk deze met vetzuurprofielen uit een databank (bv. Wiley bibliotheek)



Zet voor elk van de geïdentificeerde pieken de oppervlakte van de piek om naar de concentratie van het vetzuur, doe dit door vergelijking met een concentratiereeks van standaarden die reeds werden geanalyseerd (mix 37)

Concentratie onbekende= concentratie standaard x oppervlakte onbekende x 1,75 ml x 1000 oppervlakte standaard x volume gefilterd Materiaal



Gaschromatograaf (Merk: Agilent Technologies, Type: 6890 N, Serienummer: CN10524053)

 

Injector (Merk: Agilent Technologies, Type: 7683B series) MS detector: massaspectrometer (Merk: Agilent Technologies, Type: 5973 network, Productnummer: G1701DA, Revision code: D.02.00)



Kolom (Merk: Agilent Technologies, Type: HP-88, Part N°: 112-8867, Serienummer: US7497716H) 37




Software (Merk: Agilent Technologies, MSD Chemstation D.02.00.275 1989 – 2005)



Standaard, mix 37 (concentratie stock 10 mg/ml, 50 maal verdund en 1µl geïnjecteerd)

3.2.2

Pigmentanalyse en nutriëntanalyse

3.2.2.1

Pigmentanalyse

De pigmentanalyse en staalvoorbereiding werden niet zelf uitgevoerd, deze werden uitgevoerd door Dirk Van Gansbeke. Principe

HPLC of high performance liquid chromatography is een chromatografische techniek voor de analyse en quantificatiebepaling van mengsels van chemische componenten. Het is een scheidingstechniek waarin een mobiele fase samen met het staal aan hoge druk over de kolom wordt gestuurd. In de kolom bevindt zich een stationaire fase, deze bestaat uit een fijn verdeelde vaste stof. In HPLC wordt een kortere kolom gebruikt dan in GC omdat de scheiding hier veel efficiënter is. De verschillende componenten van het staal worden met een verschillende snelheid over de kolom gestuurd, dit komt door hun verschillende reacties met de stationaire en mobiele fasen. Ze komen op een verschillend tijdstip (retentietijd) van de kolom en worden vandaar naar een detector gestuurd. Deze meet de signaalverschillen tussen het solvent en het solvent en het staal. Het elektrisch signaal wordt gedigitaliseerd en naar het datasysteem gestuurd (Gunst, 2004). Methode

Staalvoorbereiding  

Haal de stalen uit de diepvries en vriesdroog ze Haal ze de volgende dag uit de vriesdroger



ga naar een verduisterde kamer met rode belichting (chlorofyl a breekt af bij daglicht)



Vouw de filter met staal dicht en breng deze in een testbuisje

 

Voeg hieraan 10 ml 90% aceton toe Gebruik ultrasoon om de cellen kapot te maken zodat het pigment vrij komt



Plaats het buisje in de koelkast

38




Neem een deel van de extractievloeistof en breng dit in een donkere glazen vial



Schroef deze dicht met een schroefdopje met een teflonmembraan

Uitvoeren van de analyse 

Plaats de vials in de sampler, start het toestel en laat lopen tot alle analyses zijn uitgevoerd.



Bereken chlorofyl a in µg/L

µg/L chlorofyl a = oppervlakte piek x richtingscoëfficiënt detector x volume extract (ml) volume filtratie (ml)

Materiaal

 

Freeze dry system (Merk: Labconco, CatN°: 77500-01, Serienummer: 981202152Q) HPLC-toestel (Merk: Gilson) Sample injector (Merk: Gilson, Type: 231) Pomp a en c (Merk: Gilson, Type: 306) Pomp b (Merk: Gilson, Type: 305) Dilutor (Merk: Gilson, Type: 401) Manometric module (Merk: Gilson, Type: 805) Dynamic Mixer (Merk: Gilson, Type: 811 B) Column heater (Merk: Alltech, Type 530)



Detectoren Diode array detector (Merk: Gilson, Type: 170) Fluorometer (Merk: Gilson, Type:121) Programmable absorbance detector (Merk: Applied biosystems, Type: 785A)



Kolom Nucleodur C18 Pyramid, 5µm (Merk: Macherey-Nagel, CatN°: 760202.46, serienummer: E8071881, Lot: 37658041, Particle size: 5µm, Length: 250 mm, interne diatmeter: 4,6 mm)



Software (Unipoint LC systems software)

39


3.2.2.2

Nutriëntanalyse

Principe

De Skalar nutriëntanalyzer bepaalt tegelijkertijd 5 verschillende nutriënten: nitraat + nitriet, nitriet, silicaat, fosfaat en ammonium. De geautomatiseerde procedure voor de determinatie van nitraat + nitriet is gebaseerd op de cadmium reductiemethode. Het staal gaat door een kolom die gegranuleerd koper-cadmium bevat om het nitraat te reduceren tot nitriet. Het nitriet wordt gedetermineerd door het om te zetten in een diazoverbinding met sulfanilamide, daarna wordt het gekoppeld met α-naphtylethyleendiamine dihydrochloride om een gekleurde azoverbinding te vormen die gemeten wordt bij 540 nm. De geautomatiseerde procedure voor de determinatie van nitriet is net zoals vorige reactie, het nitriet in het staal wordt rechtstreeks omgezet in een diazoverbinding en gekoppeld met α-naphtylethyleendiamine dihydrochloride. Hierdoor wordt een rood-paarse kleur geproduceerd die eveneens bij 540 nm wordt gemeten. De procedure voor de determinatie van silicaat is gebaseerd op een reactie waarin het staal aangezuurd en vermengd wordt met een ammoniummolybdaat oplossing. Hierdoor wordt molybdosilicic acid gevormd. Dit zuur wordt gereduceerd met ascorbinezuur tot een blauwe kleuring, deze wordt gemeten op 810 nm. Oxaalzuur wordt toegevoegd om interferentie met fosfaat te verhinderen. Voor de determinatie van fosfaat wordt een procedure gebruikt die gebaseerd is op een reactie waarin ammoniummolybdaat gekatalyseerd wordt door kaliumantimoontartraat, dit reageert in een zuur medium met het opgeloste fosfaat met vorming van een fosfo-molybdaat zuur complex. Dit complex wordt gereduceerd tot een intens blauw gekleurd complex door reactie met ascorbinezuur. Het bekomen complex wordt gemeten bij 880 nm. De geautomatiseerde procedure voor de determinatie van ammonium is gebaseerd op de Berthelot reactie, ammonium wordt gechloreerd tot monochloramine dat reageert met salicylaat naar 5-aminosalicylaat. Na oxidatie en oxidatieve koppeling wordt een groen complex gevormd. De absorptie van het gevormde complex wordt fotometrisch gemeten bij een golflengte van 660 nm (Skalar methods).

40


Figuur 3.3 Schema Skalar Nutriëntanalyzer nutriëntanalyzer

Methode

Voorbereidingen 

Maak alle Reagentia‟s voor de bepaling van nutriënten aan

Nitraat + Nitriet (10-500 ppb) Buffer oplossing:

Kleurreagens:

ammoniumchloride (NH4Cl) Bidest (H2O) Brij 35 Op pH 8,2 brengen met 25% NH4OH fosforzuur (H3PO4 (85%)) Sulfanilamide (C6H8N2O2S) α-naphtylethyleendiaminedihydrochloride (C12H16Cl2N2) Bidest (H2O) Bewaren in donkere fles

100g 2000 ml 6 ml 150 ml 10 g 0,5g 1000 ml

41


Ammonium (0,02-1ppm) Buffer oplossing:

Natrium salicylaat:

Natriumnitroprusside:

Na-dichloroisocyano:

Kaliumnatriumtartraat (C4H4O6Kna.4H2O) Natriumcitraat (C6H5O7Na.2H2O) Ethyleendiamine tetra azijnzuur 2Na (C10H14N2Na2O8.2H2O) Bidest (H2O) Brij 35 Op pH 5,2 brengen met HCl Natriumhydroxide (NaOH) Natriumsalicylaat (C7H5NaO3) Bidest (H2O) Bewaren in donkere fles Natriumnitroprusside (Na2[Fe(CN)5NO].2H2O) Bidest (H2O) Bewaren in donkere fles Na-dichloroisocyanuraat (C3N3O3Cl2Na.2H2O) Bidest (H2O) Bewaren in donkere fles

33g 24g

Zwavelzuur (H2SO4, 98%) Ammoniummolybdaat ((NH4)6MoO24.4H2O) Bidest (H2O) FFD6 Kalium antimoon tartraat Bidest (H2O) Ascorbinezuur (C6H8O6) Stockoplossing KSb tartraat Bidest (H2O)

40 ml 4,8g 1000 ml 2 ml 300mg 100 ml 9g 10 ml 500 ml

2g 1000 ml 3 ml 12,5g 40g 500 ml 0,25g 250 ml 1g 500 ml

Fosfaat (0,02-1ppm) Ammoniummolybdaat:

Stock opl. KSb tartraat: Ascorbinezuur:

Silicium (0,1-5 ppm) Zwavelzuuroplossing:

Ammoniummolybdaat:

Oxaalzuur oplossing:

Ascorbinezuur opl.:

Zwavelzuur (H2SO4, 98%) 5 ml Bidest (H2O) 1000 ml FFD6 2 ml ammoniummolybdaat ((NH4)6Mo7O24.4H2O) 10g Bidest (H2O) 500 ml FFD6 1 ml Bewaar in een polyethyleenfles, 1 dag houdbaar Oxaalzuur (C2H2O4.2H2O) 22g Bidest (H2O) 500 ml Bewaar in een polyethyleenfles Ascorbinezuur (C6H8O6.2H2O) 20g Bidest (H2O) 500 ml

42




Verbind alle darmpjes van het toestel met het juiste reagens

 

Start het toestel om alle darmen te spoelen Maak de werkstandaarden aan

 

Laad de stalen in de sampler van het toestel Start het toestel en laat lopen tot de analyse is afgerond

Materiaal

 

Ammoniumchloride (NH4Cl) (Merk: Merck, CatN°: 1.01145.1000, Lot: A974845 834, Exp: 31.05.13) Brij 35 (Merk: Skalar Analytical B.V., CatN°: 13900, Exp: 31/10/2009)

 

Fosforzuur (85%) (Merk: Merck) Sulfanilamide (Merk: Merck, CatN°: 1.11799.0100, Lot: L56132599 714)

 

α-naphtylethyleendiamine dihydrochloride (Merk: Merck) Kaliumnatriumtartraat (Merk: Merck, CatN°: 1.08087.1000, Lot: A476287 403)

 

Natriumcitraat (Merk: Merck, CatN°: 1.06448.1000, Lot: A385148 305) Ethyleendiamine tetra azijnzuur 2Natrium (Merk: Merck, CatN°: 1.08418.0250, Lot: K26936718001)



Natriumhydroxide (NaOH) (Merk: Merck, CatN°: 1.06498.1000, Lot: B428089 351) Natriumsalicylaat (Merk: PRS Panreac, CatN°: 141859.1209, Lot: 10516KGR)

   

Natrium nitroprusside (Merk: Merck, CatN°: 6541, Lot: 7490881) Natrium-dichloroisocyanuraat (Merk: BDH Analar, CatN°: 104502Q, Lot: K31107522 248) Zwavelzuur (98%) (Merk: Merck)



Ammoniummolybdaat (Merk: Merck, CatN°: 1.01182.0250, Lot: A197482 005)



FFD6 (Merk: Skalar Analytical B.V., CatN°: 13908)

  

Kaliumantimoontartraat (Merk: Vel, CatN°: 6191, Lot: 96015120) Ascorbinezuur (Merk: Analar Normapur, CatN°: 20150.231, Lot: 07D110021) Oxaalzuur (Merk: Merck, CatN°: 0054025)



AII systeem Skalar (Merk: Skalar, Type: ESD-1, Serienummer: 328) 43


3.2.3

Bepalen van C:N ratio

Principe

Bij analyse van totaal stikstof en organische koolstof varieërt de inweging van het monster, afhankelijk van de aard van het monster en de te verwachten gehalten. Van het gedroogde monster wordt een deel afgewogen in een Sn-cupje vervolgens worden ze met behulp van de monsterwisselaar in de verbrandingsbuis (900°C) geïntroduceerd, waar de verbranding (oxidatie) plaats vindt onder invloed van zuurstof en de katalysatoren Chroomoxide (Cr2O3) en verzilverd cobaltoxide (AgCO3O4). De verbrandingsgassen CO2, N2, NxOy, H2O en de rest O2 elueren door een verhitte kwartsbuis (600°C), die gevuld is met Cu-draad. Alle stikstofoxiden worden hier omgezet tot N2. Vervolgens wordt het water geabsorbeerd op magnesiumperchloraat. Daarna worden N2 en CO2 gescheiden op een GC kolom en tot slot gedetecteerd met behulp van een TCD detector (thermal conductivity detector of warmtegeleidbaarheidscel) (figuur 3.4) (Netherlands Institute of Ecology). Dit is een algemene detector die veel gebruikt wordt in gaschromatografie. Ze neemt veranderingen waar in thermische geleidbaarheid van het gas dat uit de kolom van de GC komt, deze wordt vervolgens vergeleken met een referentiestroom van het gebruikte draaggas (Gunst, 2004).

Figuur 3.4 Schema C/N analyzer (Thermo Scientific, informatiebrochure)

44


Methode

Voorbereiden van de stalen  

Haal de stalen uit de diepvries en vriesdroog deze Haal ze de volgende dag uit de vriesdroger



Maak een standby, doe een onbekende hoeveelheid standaard in een tinnen cupje vouw dit dicht en maak er een bolletje van



Maak een blanco, neem een tinnen cupje vouw het dicht en maak er een bolletje van



Maak enkele standaarden, weeg een tinnen cupje, zet de microbalans op nul. Breng een schepje van een standaard in het cupje, weeg het opnieuw, vouw het dicht en maak er een bolletje van



Maak enkele blanco filters, boor met een kurkboor enkele kleine rondjes uit een blanco filter, vouw deze op. Weeg een tinnen cupje, zet de balans op nul, breng de opgevouwen filter in het cupje, weeg deze af, vouw het cupje dicht en maak er een bolletje van.



Bereiden van de stalen, boor met een kurkboor enkele kleine rondjes uit de filters. Weeg een tinnen cupje, zet de balans op nul, vouw de filter op en breng deze in het cupje, weeg af, vouw dicht en maak er een bolletje van.



Bereken aan de hand van de afgewogen massa‟s van blanco filters en de filters met staal hoeveel massa van het staal er ongeveer op elke filter ligt.

Uitvoeren C/N analyse 

Breng de tinnen bolletjes in een gekende volgorde in de monsterwisselaar, voer in de software in, welk staal wat is, indien het een standaard is welke het is en de massa‟s.



Laat de ovens op temperatuur komen en start de analyse

Materiaal



Freeze dry system (Merk: Labconco, CatN°: 77500-01, Serienummer: 981202152Q)



L-Aspartic Acid standard (C4H7NO4) (Merk: Thermo, Lot: N13A)

  

Acetanilide standard (C8H9NO)(Merk: Carlo Erba Instruments) Sn-cups (Merk: Elemental Microanalysis, Type: 8x5mm D1008, Lot: 109332) Large Tin container (Merk: Thermo, Type: 252 08000)



Tin foil discs standard (Merk: Thermo, Lot: 134240) 45




Microbalans (Merk: Mettler, Type: M3)



C/N analyzer (Merk: Thermo Interscience) (figuur 3.5) Flash EA 1112+ Mas 200 : 2008F0146 Workstation for EA: 1HMRL3J Eager software 1000 AN.NC Soil/Sed/Fil.EA 1112: CNCT8BMLBE

Figuur 3.5 Flash 2000 Series C/N analyzer (Thermo Scientific, informatiebrochure)

3.2.4

Bepaling van de EPS productie

Principe

Bij fotospectrometrie wordt een oplossing bestraald met licht. De hoeveelheid licht die geabsorbeerd of doorgelaten wordt is recht evenredig met de concentratie van een oplossing. De lichtstraal wordt ook door een blanco-oplossing gestuurd. De gemeten waarde van deze blanco wordt afgetrokken van de waarden van de te meten stalen, zo verkrijgt men de waarde die overeenkomt met de concentratie aan gemeten stoffen.

46


Methode

Bereiden van de reagentia 

Neem voor alle stalen 30 ml ethanol (96%) in een falcon en plaats deze in de koelkast



Neem voor alle stalen 6 ml ethanol (96%) in een falcon en plaats deze in de koelkast



Maak 50 ml 0,05M H2SO4-oplossing H2SO4 = 1,84 kg/L → 1840 g/L / 98 g/mol = 18,76 mol (50 ml x 0,05 mol) / 18,76 = 133 µl H2SO4 133 µl H2SO4 aanlengen met AD tot 50 ml



Maak 20 ml 5% fenol Draag handschoenen om 1 g fenol af te wegen, breng deze in een maatkolf van 20 ml, vul aan met AD, los op.

Opstellen van de ijklijn 

Maak een stockoplossing van 0,05 M glucose, los hiervoor 0,9008 g glucose op in 100 ml AD



Maak 5 glucosestandaarden - 100 µl stockoplossing in 100 ml AD - 200 µl stockoplossing in 100 ml AD - 400 µl stockoplossing in 100 ml AD - 600 µl stockoplossing in 100 ml AD - 800 µl stockoplossing in 100 ml AD



Doe van elke standaard 200 µl in een epje (1,5 of 2 ml), voeg hierbij 200 µl 5% fenol en 1 ml H2SO4 (Dubois et al., 1956)



Vortex en incubeer deze vervolgens voor 35 minuten bij 30°C



Haal ze na 35 minuten uit het warmwaterbad, breng de inhoud van de epjes over in cuvetten zet deze om beurt in de spectrofotometer en meet de absorbantie bij 486 nm



Gebruik als blanco een cuvetje met AD

47




Breng voor de meting met de victor3multilabelreader de inhoud van de epjes in een 12 well, zet de well-plaat in het toestel en meet de absorbantie op 486 nm



Bereken hoeveel molair glucose elke standaard bevat



Stel voor beide technieken een ijklijn op (concentratie glucose t.o.v. absorbantie)

Voorbereiden van de stalen 

Haal de stalen uit de diepvries en laat ze ontdooien



Homogeniseer de stalen, centrifugeer 15 minuten bij 3500 xg

Isolatie van de verschillende EPS fracties 

oplosbare EPS: breng het supernatans van de gecentrifugeerde stalen volledig over in de falcons met 30 ml koude ethanol (96%)



Plaats deze overnacht bij -20°C



Extraheer gebonden EPS door de pellet opnieuw op te lossen in 2 ml AD, schud deze krachtig en incubeer gedurende 1 uur op 30°C.



Centrifugeer 15 minuten bij 3500 xg



Breng het supernatans over in de falcons met 6 ml koude ethanol (96%), plaats deze overnacht bij -20°C



Extraheer de glucans door 1 ml 0,05 M H2S04 toe te voegen aan de pellet, laat deze 2 uur staan en schud om de 30 minuten






Breng 200 µl van het supernatans over in een epje (1,5 of 2 ml)



Breng nu voor de rest van de koolhydraten 400 µl AD bij de pellet, resuspendeer deze en breng 200 µl over in een epje (1,5 of 2 ml)

Analyse van de verschillende EPS fracties 

Neem de epjes met 200 µl glucans en resterende koolhydraten voeg hierbij 200 µl 5% fenol en 1 ml H2SO4 (Dubois et al., 1956)




48




Haal ze na 35 minuten uit het warmwaterbad, breng de inhoud van de epjes over in cuvetten en zet deze om beurt in de spectrofotometer en meet de absorbantie bij 486 nm









Haal de volgende dag de falcons met oplosbaar en gebonden EPS fracties uit de diepvries






Zuig het supernatans af, droog de pellet



Voeg 400 µl AD bij de gedroogde pellet, vortex



Breng 200 µl van elk staal over in een epje (1,5 ml of 2 ml)



voeg hierbij 200 µl 5% fenol en 1 ml H2SO4 (Dubois et al., 1956)






Haal ze na 35 minuten uit het warmwaterbad, breng de inhoud van de epjes over in cuvetten zet deze om beurt in de spectrofotometen en meet de absorbantie bij 486 nm







Verwerking van de resultaten 

bereken aan de hand van de vergelijking van de trendlijn (ijklijnen) en de absorbantie van de stalen de concentratie glucose (mol/L)



Zet deze concentratie om in g/L (M glucose = 180,16)



Bereken het aantal cellen in elk staal, neem dit aantal cellen per 10 ml en bereken hoeveel EPS er in de verschillende fracties aanwezig is per cel

49


Materiaal



H2SO4 (98%) (Merk: Merck)



Glucose



Fenol



Centrifuge (Merk: Eppendorf, Type: 5810R, Serienummer: 5811 06306)



Vortex toestel (Merk: Heidolph, Type: Reax Top, Serienummer: 541-1000000-0)



Warmwaterbad (Merk: Lauda, Type: AL5, CatN°: LCB 0724, Serienummer: LCB0724-08)



Victor3multilabelreader (Merk: Perkin Elmer, Type: victor3multilabelcounter 1420)



Spectrofotometer (Merk: Shimadzu, Type: UV-1601, CatN°: 206-67001-34, Serienummer: A10753883585)

3.2.5

Bepaling van de bacteriële gemeenschap

3.2.5.1

DNA-extractie

Principe

Het is de bedoeling om DNA vrij te maken uit de cellen, één van de methoden hiervoor is alkalische lyse. Het geëxtraheerde DNA wordt later gebruikt om een PCR op uit te voeren. Methode

DNA extractie via alkalische lyse 

Laat de stalen ontdooien, centrifugeer deze kort zodat de cellen naar beneden zakken



Pipetteer de bovenstaande vloeistof weg



5 µl lysebuffer toevoegen aan de stalen en op en neer pipetteren



15 min op 95°C plaatsen



Kort centrifugeren (13000 tpm)



Lysaat op ijs plaatsen 50




45 µl HPLC water toevoegen



5 min centrifugeren op 13000 tpm



Bewaren bij -20°C

Materiaal



Pipetten (Merk: Eppendorf, Type: Research) 0,5-10 µl, Serienummer: 470718 2-20 µl, Serienummer: 446972 10-100 µl, Serienummer: 267440 20-200 µl, Serienummer: 420269 100-1000 µl, Serienummer: 3222363 0,1-2,5 µl (Merk: Eppendorf, Type: Reference, Serienummer: 5.511.433)



Centrifuge (Merk: Eppendorf, Type: centrifuge 5417 R, Serienummer: 0020305)

3.2.5.2

V3PCR

Principe

De PCR of polymerase chain reaction is een techniek die wereldwijd gebruikt wordt binnen de moleculaire biologie. Hierin wordt DNA gebruikt als een template voor replicatie. Als het DNA gegenereerd is komt een kettingreactie op gang, hierbij wordt het DNA exponentieel geamplificeerd. Op deze manier wordt er van een paar stukjes DNA met een verschillend aantal basenparen miljoenen kopieën gemaakt. Het grootste deel van de PCR methoden doorloopt verschillende thermische cycli, het PCR-product wordt afwisselend opgewarmd en afgekoeld volgens een bepaalde serie van temperatuursverschillen. Deze stappen zijn nodig om de strengen van de helix te scheiden. Door de temperatuurveranderingen kan het DNApolymerase het doelwit-DNA selectief amplificeren. De selectiviteit van een PCR is afhankelijk van de gekozen primers. Een PCR reactie bestaat meestal uit een aantal herhaalde cycli. Elke cyclus bestaat uit twee of drie temperatuursveranderingen. De meest gebruikte PCR bestaat uit drie stappen (met specifieke temperatuur): denaturatie stap, annealing stap en elongatie stap.

51


PCR‟s zijn opgebouwd uit een initiële denaturatiestap, hierin wordt het reactieproduct verwarmd tot een temperatuur van 94°C gedurende 5 minuten. Deze stap wordt enkel uitgevoerd indien gebruik wordt gemaakt van een DNA-polymerase die een hitte activatie nodig heeft. Vervolgens start de amplificatie met een denaturatie stap, deze is de eerste binnen een cyclus. Het reactieproduct wordt verwarmd tot 94°C (afhankelijk van de PCR). Hierdoor gaan de waterstofbindingen tussen de complementaire basen van de DNA strengen breken waardoor er enkelstrengig DNA wordt gevormd. Daaropvolgend komt de annealing stap, hierin wordt de temperatuur verlaagt tot 55-65°C zodat de primers aan het enkelstrengige DNA gaan binden. Stabiele bindingen worden enkel gevormd als de sequentie van de primer complementair is met deze van het DNA. Als laatste vind de elongatie stap plaats, de temperatuur is afhankelijk van het gebruikte DNA-polymerase. Het polymerase bindt op het primertemplate complex en kan zo de DNA synthese laten beginnen. Als alle cycli zijn afgelopen komt de eindelongatie, deze zorgt ervoor dat iedere streng volledig is. Daarna komt de definitieve stop, de PCR stopt en de reactieproducten worden op een vooraf ingestelde temperatuur gehouden tot ze uit het toestel gehaald worden. Methode

Bereiding van de reactiemix 

Bereid de PCR-mix (tabel 3.1)

Tabel 3.1 Samenstelling PCR-mix

PCR-buffer (10x) BSA (1x) dNTP (2mM) Forward primer (357GC) Reverse primer (518r) HPLC-water Top Taq polymerase (5 U/µl)



6 µl 2,5 µl 2,5 µl 2 µl 2 µl 33,75 µl 0,25 µl

Breng dit in een PCR epje en voeg hier 1 µl staal aan toe

Starten PCR 

Zet de epjes in een PCR-toestel



Kies het juiste programma (V3down2) (tabel 3.2) Lid = 105°C 52


Tabel 3.2 V3down2 - PCR programma

Initiële denaturatie Amplificatie

Finale elongatie

5 min

94°C 10 cycli

30 sec 94°C 30 sec 61°C (-0,5°C per cyclus, R=3,0°/s) 1 min 72°C 25 cycli 30 sec 94°C 30 sec 56°C 1 min 72°C 7 min 72°C Bewaren bij 20°C

Materiaal

 

PCR-buffer (10X) (Merk: Applied Biosystems) dNTP (Merk: Applies Biosystems)



Forward primer (F357GC) (Merk: Sigma-Genosys Ltd.) (sequentie: 5‟ CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GGC CCG CCG CCC CCG CCC CCC TAC GGG AGG CAG CAG 3‟) Reverse primer (R518) (Merk: Sigma-Genosys Ltd.) (sequentie: 5‟ ATT ACC GCG GCT GCT GG 3‟)

 

Top Taq polymerase (Merk: Applied Biosystems)



PCR-toestel (Merk: eppendorf, serienummer: 5332 52451)

3.2.5.3

Agarose-gelelektroforese

Principe

Na de PCR wordt er een agarosecheck uitgevoerd op de PCR-producten om te kijken of deze DNA bevatten van de juiste grootteorde. De agarosegel is een netwerk waardoor het DNA zich een weg baant. Migratie van DNA doorheen de gel vindt plaats onder invloed van een aangelegd spanningsveld. Aangezien DNA negatief geladen is zal het zich naar de positieve pool begeven met een snelheid die door zijn moleculair gewicht bepaald wordt. Hoe kleiner de fragmenten, hoe verder deze in de gel zullen migreren. Om het DNA te visualiseren wordt de gel na de elektroforese gekleurd met ethidiumbromide. 53


Methode

Maken van de gel 

Maak een 1% agarose-oplossing aan, 1 g agarose op 100ml AD verwarm en los op in de microgolfoven



Neem 30 ml in een falcontube en laat afkoelen tot je het kan vasthouden



Installeer de drager waarin de agarose-gel wordt gegoten, maak het schoon en plaats er een kammetje in



Giet de agarose-gel voorzichtig en laat 20 minuten stollen



Verwijder de kam, plaats de drager met de gel in het elektroforese-toestel (deze bevat TAE-buffer tot boven de gel)

Laden van de gel 

Bereid de stalen voor, voeg aan elk staal 10 µl loadingdye toe



Pipetteer in de buitenste slotjes 4 µl van de ladder en laad 4 µl van de stalen

Uitvoeren elektroforese 

Bevestig het deksel op het elektroforese-toestel, steek deze aan op 100 V gedurende 20 minuten

Kleuren van de gel 

Schakel het toestel uit, neem de gel met drager uit de bufferkamer, leg de gel op een aluminiumpapier en was de drager af



Breng de gel naar het ethidiumbromide-lokaal, doe een beschermende labojas en handschoenen aan, leg de gel in een bakje met Ethidiumbromide, doe de handschoenen uit voor je het lokaal verlaat



Laat de gel 30 minuten in het kleurbakje liggen

Foto nemen van de gel 

Maak het oppervlak van de UV-lamp nat met water, neem de gel uit de kleurbak en leg hem op de UV-lichtbak, leg hem in het midden en sluit de UV-lichtbak



Steek het UV-licht aan, open het programma „Quantity One‟, ga naar „Gel doc‟ 54




Druk op „Auto Expose‟, hierbij wordt de gel automatisch maximaal belicht, aanpassingen kunnen manueel gebeuren via de knop „manual expose‟, zoek de juiste belichting en sla de foto op en druk vervolgens af



Verwijder de gel, deponeer deze in de voorziene vuilnisbak en was de glasplaat van de UV-lamp af met water en papier, doe de handschoenen uit in dezelfde vuilnisbak, verlaat het lokaal zonder nog iets aan te raken

Materiaal



Agarose-poeder (Merk: InvitrogenTM, Categorienummer: 15510-027, Lotnummer: 3094245)



Loading dye



Merker (smartladder = moleculair gewicht merker)



Ethidiumbromide (150 μL EtBr (10 mg/ml) + 1500 mL 1x TAE)



Elektroforese-toestel (Merk: ADVANCE Mupid®-exu, Serienummer: 11137)

3.2.5.4

DGGE

Bepaling van de bacteriële gemeenschap rond de diatomeeën werd uitgevoerd via DGGE of Denaturing Gradiënt Gel Electrophoresis. Deze techniek werd uitgevonden door Leonard Lerman en Stuart Fischer toen deze werkzaam waren in the State University of New York. Het is een algemeen gebruikte techniek in de moleculaire biologie die vaak wordt toegepast om microbiële ecosystemen te bestuderen. De methode is krachtig en kan snel resultaten geven inzake de karakterisatie van de gemeenschapsdiversiteit en -samenstelling, verder kunnen ook verschuivingen in een populatie snel worden aangetoond (Green, 2005). Principe

DGGE scheidt PCR gevormde producten. Doordat deze eenzelfde grootte hebben, is het dus onmogelijk deze te scheiden door middel van agarose-gel elektroforese. DGGE voorkomt dit door de PCR-producten te scheiden op basis van sequentieverschillen en verschillende denaturerende kenmerken van het DNA (Toledo, 2004). Methode



Bereiden van de 0% en de 100% acrylamide-oplossing 55




Breng een magneet in de 100% acrylamide-oplossing, zet de magnetische roerder aan en laat twee uur roeren tot alle kristallen verdwenen zijn

Bereiding van de gelkamer 

Neem twee glazen platen, ontvet de platen met ethanol



Leg de twee platen op elkaar met de grootste aan de onderzijde en breng aan beide zijden, tussen de platen, spacers aan



Breng aan beide zijden een klem aan en schroef ze vast, kijk hierbij of ze onderaan perfect gelijk zijn



Plaats het geheel op de rubberstrook en draai het vast in de staander



Plaats de staander in zijn geheel op het waterpasplateau

Bereiding van de gradiënt gel 

Was de lage en hoge gradiënthouder en het slangetje door er milli-Q water door te pompen



Droog de kamers uit met papier, verwijder ook de vloeistof uit de sluis



Plak de naald vast tegen de grote plaat vlak boven de kleine plaat, zorg ervoor dat deze goed vastzit, alle vloeistof moet tussen de twee platen vloeien



Zet de pomp klaar en leg een pipet klaar



Bereid de lage en hoge gradiënt in de trekkast (35%-75%)



Neem voor de 35% oplossing 7.8 ml 0% oplossing en 4,2 ml 100% oplossing



Neem voor de 75% oplossing 3,6 ml 0% oplossing en 8,4 ml 100% oplossing



Voeg aan beide oplossingen 100 µl APS en 8 µl Temed toe



Breng deze al roerend naar de gradiëntvormer en breng de 35% oplossing in de connectie, sluit deze en zuig het restje in de hoge gradiëntkamer op



Vul beide kamers met de oplossing



Schakel de magnetische roerder aan



Open de sluis en druk tegelijkertijd de startknop van de pomp in 56




Nadat de gradiënt gevormd is, verwijder de naald en breng een laagje verzadigd isobutanol aan op de gel



Was alles uit met milli-Q water en droog uit



Laat de gel minstens één uur polymeriseren, bij voorkeur drie tot vier uur

Bereiding van de stackinggel 

Giet de laag isobutanol af en spoel de gel goed na met milli-Q, verwijder de resten milli-Q van tussen de platen met filtreerpapier



Plaats een kam tussen de glasplaten, zorg dat deze de gel niet raakt



Bereid de stackinggel voor 2 gels in de trekkast



Voeg 10 ml 0% oplossing, 100 µl APS en 10 µl Temed samen



Met een glazen pipet wordt er 5 ml naast de kam tussen de platen gebracht, vermijd luchtbellen

Voorbereidingen van het Dcode systeem 

Zet de elektroforesetank aan en verwarm deze voor tot 60°C



Zet de magnetische roerder aan

Laden van de gel 

Haal de kam uit de stackinggel en kuis deze af



Haal de platen met de gel uit de staander en leg hem neer, spoel met een spuit gevuld met 1xTAE-buffer de resten acrylamide uit de slotjes



Monteer de platen in het kernsysteem, doe altijd 2 gels



Zet het geheel recht en spuit warme 1xTAE-buffer op de kleinste plaat om lekken op te merken



Vul het bakje bovenaan met TAE-buffer



Bereid de stalen voor en voeg aan elke staal 10 µl loadingdye toe



Laad in de buitenste slotjes aan beide zijden loadingdye, 10 µl



Laad aan beide zijden naast de loadingdye en ergens in het midden, 10 µl van de merker

57




Laad vervolgens de stalen, de hoeveelheid is zelf te kiezen, afhankelijk van de sterkte op de agarose-gel



Alle slotjes moeten gevuld zijn, in alle slotjes die niet gebruikt worden voor stalen of merker wordt 10 µl loadingdye geladen

Starten van de DGGE 

Zet de elektroforese-unit af en wacht één minuut



Breng het kernsysteem in de tank en zorg dat er voldoende buffer aanwezig is



Sluit de tank, zet de pomp en de verwarmer terug aan



Sluit de elektroden aan en zet deze op 75 volt en 960 minuten



Start het systeem zodra de temperatuur opnieuw op 60°C staat

Kleuren van de gel 

Schakel de stroom uit, zet het toestel uit en haal het kernsysteem uit de tank



Klik de glasplaten uit het kernsysteem en verwijder de klemmen



Leg de platen in een bak en breng ze naar het EthidiumBromide-lokaal



Doe een labojas en handschoenen aan en ga het lokaal binnen en haal de nodige SYBR Gold baden uit de koelkast



Doe de handschoenen binnen uit en ga naar buiten, neem nieuwe handschoenen, wring een spacer los en kantel deze zodat de 2 platen los komen



Haal de kleine plaat ervan en ga enkel binnen met de grote plaat met de gel erop



Draai de grote plaat om zodat de gel naar het kleurbad gericht is, maak een hoekje los en probeer de gel voorzichtig in z‟n geheel in het kleurbad te brengen



Laat de gel nu minimum 30 minuten in het kleurbad staan

Foto nemen van de gel 

Maak het oppervlak van de UV-lamp nat met water, leg de gel erop, bevochtig de gel 58




Doe de UV-lichtbak dicht, steek het UV-licht aan, fotografeer de gel met de software en sla op in de computer en druk af. Verwijder de gel en was de lichtbak af. (zie methode bij agarose-gelelektroforese)

Afwassen van het materiaal 

Spoel alles af met milli-Q water lek uit, droog af en zet weg



Spoel de platen met gewoon kraantjeswater, was ze met alconox, spoel ze opnieuw, daarna met milli-Q en vervolgens met ethanol, zet ze recht in de bak en laat drogen

Materiaal



0% en 100% acrylamide-oplossing (reeds bereid)



N, N, N, N-tetramethylethyleendiamine of TEMED, bewaren bij 4°C



Ammoniumpersulfaat of APS, 10% oplossing, bewaren bij -20°C



Waterverzadigde isobutanol



50x TAE (Merk: Biorad)



Buffer in elektroforese unit (140 ml 50x TAE aanvullen met milli-Q tot 7 L)



Sybr gold (50 μl Sybr gold + 500 mL 1x TAE)



Gradiënt vormer (Merk: Biorad, Type: Model 385)



Magnetische roerder (Merk: Framo Gerätetechnik, Type: M21/1, FabrN°: 9475)



Pomp (Merk: Biorad, Type:EP-1 Econo Pump, Serienummer: 700 BR 09115)



Milli-Q toestel (Merk: Sartorius, Type: Arium 6IIDI, Serienummer: 14300517)



DGGE-toestel (Merk: Biorad, Type: DCodeTM, Universal Mutation Detection System, Serienummer: 374 BR 3068)

59


3.3 Voedingsexperiment copepoden Voor dit experiment werd gebruikgemaakt van één copepodensoort : Microarthridion littorale (Poppe, 1881). De gebruikte copepoden zijn afkomstig uit het Paulinaschor, Nederland (figuur 3.6). Ze werden in het veld verzameld kort voor de start van het experiment.

Figuur 3.6 Plaats van staalname (Paulinaschor, Nederland) (Foto: M. De Troch)

De bovenste centimeters van het sediment werden verzameld met een schopje en in kleine emmers gebracht. Dit gebeurde omdat in de diepere lagen van het sediment weinig leven mogelijk is door zuurstoftekort. De emmers werden bewaard in een klimaatkamer met een temperatuur van 12±1°C. Methode

Verzamelen copepoden  

Decanteer de emmers met slib, doe dit door ASW in een krachtige straal op het sediment te gieten Laat even het sediment bezinken en filter de waterige inhoud over een 38 µm zeef.



Spoel de zeef met ASW en breng het filtraat over in een bokaal



Plaats een koude lichtbron tegen de rand van de bokaal, net boven de laag sediment (normaal komen de copepoden hierop af) Verzamel de copepoden met behulp van een pipet, met grote opening, in een petriplaat



60


In dit experiment kwamen de copepoden niet af op de lichtbron, ze werden met de hand verzameld. 

Neem met een pipet een deel van het sediment in een petriplaat en bekijk onder een binoculair



pik de copepoden met een fijne glazen pipet uit en plaats ze in een andere petriplaat

Kweken diatomeeën Voor dit voedingsexperiment worden diatomeeën (Seminavis robusta (stam 85A)) gekweekt in 3 verschillende groeifasen. De diatomeeën worden aangerijkt met 13 C.  

bereid 13C-oplossing door 336 mg NaH13CO3 op te lossen in 100 ml milli-Q, bewaar deze op 4°C en in het donker bereid groeimedium bestaande uit ASW met 20 ml/L f/2 concentraat



start voor de stationaire fase 22 dagen voor het uitvoeren van het experiment 3 cultuurflessen (175 cm²) met onaangerijkt medium (controle) en 6 cultuurflessen (175 cm²) met 13C aangerijkt medium (10 ml van de 13Coplossing per 200 ml cultuurmedium) met diatomeeën in een beginconcentratie van 50 cellen/cm². Elke fles bevat 200 ml cultuurmedium (ASW met 20 ml/L f/2 concentraat).



start voor de exponentiële fase op dezelfde wijze 16 dagen voor het uitvoeren van het experiment 3 cultuurflessen (175 cm²) met onaangerijkt medium en 9 cultuurflessen met aangerijkt medium



start voor de lag fase op dezelfde wijze 5 dagen voor het uitvoeren van het experiment 3 cultuurflessen (175 cm²) met onaangerijkt medium en 12 cultuurflessen met aangerijkt medium



breng 200 ml van het groeimedium in de onaangerijkte cultuurflessen, breng 10 ml van de 13C-oplossing en 200 ml van het groeimedium in de cultuurflessen voor de aangerijkte culturen



Laat al deze culturen groeien onder dezelfde omstandigheden (12±1°C en dag/nacht belichting (12u/12u))

Wassen van de copepoden 

voor dit experiment zijn er 180 copepoden van de soort Microarthridion littorale nodig



bekijk de verzamelde copepoden onder een binoculair 61




pik de juiste soort uit met een fijne pipet en plaats deze per 20 in een nieuwe petriplaat



zet ze enkele keren over in vers ASW, verwijder zo het vuil dat rond hun lichaam hangt



indien er nog steeds vuil rond hun lichaam zit, verwijder dit dan met behulp van preparatienaalden



laat de copepoden 1 nacht hongeren voor het experiment start

Wassen van de diatomeeën     

schud de cultuurflessen krachtig zodat de cellen loskomen, zet ze daarna recht op een lichtbron, hierdoor gaan de cellen naar beneden zakken. Zuig als de cellen volledig gezakt zijn een deel van het bovenstaande groeimedium af en vervang dit door geautoclaveerd ASW Schud de flessen opnieuw, giet per fase zoveel mogelijk flessen samen Doe dit minsten 2-3 keer tot de inhoud van alle flessen in één fles per fase verzameld is Laat ze overnacht staan

Tellen diatomeeën 





Neem de aangerijkte flessen die dienen als voedsel voor de copepoden, zuig de bovenstaande vloeistof af, breng een kleinere gekende hoeveelheid ASW in deze flessen Schud krachtig, neem een gekende hoeveelheid vloeistof in een 96 wellplaat, tel onder de inversiemicroscoop hoeveel cellen er zich hierin bevinden Bereken vervolgens hoeveel cellen er zich in elke fles bevinden

Starten experiment 

Breng eenzelfde aantal cellen in alle petriplaten, neem voor elke fase 3 replica‟s



Breng in elke petriplaat 20 copepoden



Laat deze 4 dagen grazen in de platen onder gecontroleerde omstandigheden in een klimaatkamer (12±1°C, dag/nacht belichting)

Stoppen experiment 

Steek de petriplaten in een -20°C diepvries 62


Schoonmaken+drogen copepoden 

Haal de platen één voor één uit de diepvries en laat ontdooien



Bekijk ze onder een binoculair, pik de copepoden uit met behulp van een oognaald en plaats ze in een petriplaat met vers ASW

 

Maak de copepoden schoon met behulp van preparatienaalden Breng de schoongemaakte copepoden met behulp van een oognaald over in een tinnen cupje met een druppel water Plaats al deze cupjes in een multiwellplaat in een oven op 60°C

 

Vouw de cupjes de volgend dag met behulp van pincetten dicht en druk ze samen

Bereiden van de diatomeeën ter controle 

Neem de gewassen flessen met onaangerijkte en aangerijkte diatomeeën, zuig de bovenstaande vloeistof zoveel mogelijk af



Schud de flessen zodat de cellen loskomen in de resterende vloeistof, breng dit over in falcons van 15 ml Centrifugeer de falcons gedurende 15 minuten

    

Zuig de bovenstaande vloeistof af Breng de overgebleven pellets met behulp van een pipet in de tinnen cupjes Plaats de cupjes in een oven op 60°C Vouw de cupjes de volgende dag met behulp van pincetten dicht en druk ze samen

Uitvoeren EA-IRMS (Elemental Analyzer - isotopenratio massaspectrometer) 

De stalen werden door Prof. Dr. Tom Moens meegenomen en geanalyseerd in de VUB

Materiaal



Cultuurflessen (Merk: Sarstedt, Groeiopp.: 175 cm²)



Balans (Merk: Sartorius, Type: LP620P)



NaH13CO3 (Merk: Cambridge Isotope Laboratories, Inc., CatN°: 87081-581, Lot: PR-16878A)



Inversiemicroscoop (Merk: Axiovert, Type: 40C)



38 µm zeef (Merk: Interlab Laboratorium equipment B.V.) 63




Binoculair (Merk: Leica Microsystems, Type: M5, Serienummer: 54112)



Tinnen cups (Merk: Elemental Microanalysis Limited, Lot: 103421)

64

Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden) Resultaten en discussie

4

Resultaten en discussie

4.1


De groei van de diatomeeën wordt elke dag bepaald door middel van dagelijkse tellingen van het aantal cellen (uitgedrukt als aantal cellen per cm²). Aan de hand van deze tellingen worden groeicurven (aantal cellen t.o.v. tijd) opgesteld. 4.1.1

Invloed van beschikbare groeioppervlakte

Om de invloed van de oppervlakte van de cultuurfles te testen worden er onder dezelfde omstandigheden (11±1°C, dag/nacht belichting) twee verschillende wellplaten en twee verschillende celcultuurflessen (75 en 175 cm²) gestart met hetzelfde f/2 groeimedium (met silica), en eenzelfde startconcentratie aan cellen van de diatomeeënsoort Seminavis robusta (stam 85A). De gestandaardiseerde resultaten, bekomen door inversiemicroscopie, van deze vier behandelingen worden samen met een controle (zonder f/2 groeimedium) voorgesteld in figuur 4.1.

Groeicurven f/2 met silica 20mL/L 16000 14000

# cellen/cm²

12000 10000

Fles 175 cm²

8000

Fles 75 cm²

6000

Controle

4000

12 well 6 well

2000 0 0

100

200

300

400

500

600

700

800

tijd in uren Figuur 4.1 Grafiek met groeicurven met f/2 (met silica) 20 ml/L

In deze grafiek kan men zien dat de beschikbare oppervlakte enige invloed heeft op de diatomeeëngroei. In de celcultuurflessen met grote oppervlakte gaat de groei trager en duurt het langer tot de cellen beginnen af te sterven dan bij deze in 65


de well-platen. Met andere woorden, de diatomeeën bereiken later de stationaire fase. De concentratie in de fles met een oppervlakte van 175 cm² ligt hoger dan deze in de fles van 75 cm². In de well-platen ligt de concentratie aan cellen hoger in de 6 well dan in de 12 well, ook hier kent de well met de grotere oppervlakte een hogere concentratie aan cellen. Aan de hand van deze resultaten wordt er gekeken in welke groeifase de diatomeeën zich op een bepaald moment bevinden. Deze gegevens worden verder gebruikt in het tweede en derde deel van dit onderzoek (zie 4.2 en 4.3). Daarin is het nodig om opnieuw diatomeeën te kweken en te oogsten in de 3 verschillende groeifasen, namelijk de lag fase (na 4-5 dagen), de exponentiële fase (na 15 dagen) en de stationaire fase (na 22 dagen). 4.1.2

Invloed van de omgevingsfactoren

Om de invloed van verschillende omgevingsfactoren te testen worden er een reeks behandelingen opgezet in 12 well-platen. Het effect van de temperatuur, belichting, schudbeweging en de verschillen tussen natuurlijk en artificieel zeewater worden onderzocht (zie figuur 4.2).

Groeicurven verschillende omgevingsfactoren 14000 12000 ASW + f/2 met silica 20mL/L

#cellen/cm²

10000 8000

NSW + f/2 met silica 20mL/L

6000

ASW + f/2 met silica 20mL/L, 15°C

4000 2000

ASW + f/2 met silica 20ml/L, constante belichting

0

ASW + f/2 met silica 20mL/L, schudden 0

100

200

300

400

500

600

tijd in uren Figuur 4.2 Grafiek met groeicurven van verschillende omgevingsfactoren (ASW: artificial seawater, NSW: natural seawater)

66


In deze grafiek kan men zien dat de verschillende omstandigheden wel kleine verschillen in de groei vertonen maar over het algemeen verlopen deze gelijkaardig. Opvallend is wel dat de gewone behandeling in ASW (f/2 (met silica) 20ml/L) een minder grote concentratie aan cellen heeft in de stationaire fase dan de andere behandelingen. 4.1.3

Invloed van verschillen in nutriëntensamenstelling

Om de invloed van verschillen in de nutriënten te testen worden een aantal behandelingen gestart in 12 well-platen. Hierbij wordt er gekeken naar verschillen tussen de gewone behandeling (ASW, f/2 (met silica) 20ml/L) en de behandeling met ASW met f/2 20ml/L + Si 2ml/L. Verder worden er nog veranderingen aangebracht in de hoeveelheden toegevoegd f/2 of silica (zie figuur 4.3).

Groeicurven verschillen in nutriënten 20000 18000 16000 #cellen/cm²

14000 ASW + f/2 20ml/L + Si 2ml/L

12000

ASW + f/2 10ml/L + Si 2ml/L

10000 8000


6000


4000


2000

ASW + f/2 met silica 20ml/L

0 0

200

400

600

800

tijd in uren Figuur 4.3 Grafiek met groeicurven van de verschillen in nutriënten (ASW: artificial seawater)

In deze grafiek (figuur 4.3) kan men zien dat de verschillen in hoeveelheid nutriënten kan leiden tot groeiverschillen. Het meest opvallende resultaat is dat een toevoeging van 4 ml/L silica zorgt voor een veel hogere concentratie aan cellen en een iets tragere groei, een logisch gevolg is dat de toevoeging van slechts 1ml/L silica zorgt voor een lagere concentratie aan cellen. In de andere behandelingen werden geen grote verschillen waargenomen, deze vertoonden een gelijkaardige groei. 67


4.2


4.2.1.

Vetzuuranalyse

Vetzuuranalyse wordt uitgevoerd via GC-MS (gaschromatografie - massaspectrometrie) op de diatomee Seminavis robusta (stam 85A) in 3 verschillende groeifasen: lagfase, exponentiële en stationaire fase (telkens 2 replica‟s). De aanwezigheid van vetzuren speelt een belangrijke rol in hun voedingswaarde voor copepoden. Voor elk van de geïnjecteerde stalen worden de pieken van het chromatogram geïdentificeerd door de totale ionensamenstelling te vergelijken met deze in de aanwezige bibliotheek. Verder wordt bij elk geïdentificeerd vetzuur de “response”waarde (oppervlakte van de piek) omgezet naar de concentratie van het vetzuur. Dit gebeurt door vergelijking met een reeds geanalyseerde concentratiereeks van standaarden (Mix 37, een aangekochte stockoplossing met 37 verschillende vetzuren in een gekende concentratie) In figuur 4.4, 4.5 en 4.6 zijn de chromatogrammen van de analyses van de 3 groeifasen weergegeven.

Figuur 4.4 Chromatogram lagfase (replica 2)

68


Figuur 4.5 Chromatogram exponentiële fase (replica 2)

Figuur 4.6 Chromatogram stationaire fase (replica 2)

Een overzicht van de aanwezige vetzuren en de concentratie is te zien in Tabel 4.1.

69


Tabel 4.1 Overzicht resultaten van de vetzuuranalyse

Naam C12:0 C14:0 C14:1 C15:0 C16:0 C16:1 C16:1 C17:0 C18:0 C18:1n9t C18:1n9c C18:3n3 C18:3n3 C20:5n3 EPA C22:6n3 DHA

conc ng/ml lag 1 2,199022 1,359587 1,066631

conc ng/ml exp1 2,995845 2,332052

conc ng/ml exp2 0,616743 0,889737 0,387914

conc ng/ml stat1 5,902495 51,86157 2,793829

13,15029 4,770585 20,52499

23,96184 7,31066 41,53949

8,686121 2,851064 17,02469

359,9644

2,027846 21,47948 3,214315 1,617337

3,534076 32,57795 10,28874 4,436221

1,575656

3,000504

1,203419 12,77519 4,083684 2,05079 0,359359 1,461448

4,413223 33,38489 17,86012 29,56542 55,2823 136,546 23,13108

525,8591

conc ng/ml stat2 3,246158 18,9178 1,361726 89,52848 8,709207 129,2168 3,582503 1,814344 14,74788 8,859663 13,34344 3,412445 8,825886 15,54952

Legende: C#: aantal C-atomen :#: aantal dubbele bindingen n#: plaats van eerste dubbele binding, geteld vanaf de CH3 eindgroep c of t: cis of trans binding

Deze resultaten tonen de verschillen in de vetzuursamenstelling tussen de verschillende groeifasen van de diatomee. De meest voorkomende vetzuren zijn C16:0 (palmitinezuur), C16:1 (palmitoliezuur) en EPA (eicosapentaeenzuur), maar hun concentratie verschilt sterk naargelang de cultuurleeftijd. EPA en DHA (docosahexaeenzuur) vormen twee belangrijke vetzuren door hun nutritionele waarde in aquatische culturen. Ze behoren tot de PUFA‟s (“polyunsaturated fatty acids”, onverzadigde vetzuren). Veel mariene dieren hebben de beperkte mogelijkheid om PUFA‟s, die belangrijk zijn voor een goede groei en overleving, te synthetiseren. Hierdoor moeten ze opgenomen worden via het voedsel. EPA en DHA mogen dan niet essentieel zijn voor sommige van deze dieren, bij aanwezigheid in het voedsel zorgen ze voor een betere groei en overlevingskansen (Liang & Mai, 2005). EPA is in alle groeifasen aanwezig, het vetzuur DHA is enkel aanwezig in de stalen van de stationaire fase.

70


4.2.2. 4.2.2.1

Pigmentanalyse en nutriëntanalyse Pigmentanalyse

Chlorofyl a is een maat voor de hoeveelheid biomassa aan plantaardig materiaal (fytoplankton) dat aanwezig is in een staal. De hoeveelheid wordt bepaald via HPLC (high performance liquid chromatography). In dit experiment is de concentratie chlorofyl a van de diatomeeën eveneens een maat voor biomassa en een maat voor de „versheid‟ van de cellen voor grazers zoals copepoden. Verder is van elk staal het aantal cellen gekend, hieruit kan worden nagegaan of de chlorofyl a concentratie wijzigt tijdens de groeicyclus. De pigmentanalyse werd uitgevoerd op cellen van de diatomeeënsoort Seminavis robusta (stam 85A), er zijn drie stalen, afkomstig uit de drie verschillende groeifasen. De resultaten van de drie groeifasen zijn te zien in tabel 4.2. De hoeveelheid chlorofyl a per cel daalt naarmate de groei van de cultuur vordert. De chlorofyl a concentratie per cel is het grootst in de lag fase en het kleinst in de stationaire fase. Tabel 4.2 Resultaten Pigmentanalyse

Groeifase Lag Fase Exponentiële Fase Stationaire Fase

4.2.2.2

Chlorofyl a (µg/L) 1,697 4,696 157,886

#cellen/L 62700 296520 17724000

Chlorofyl a /cel (µg) -5 2,7065.10 -5 1,5837.10 -6 8,908.10

Nutriëntanalyse

De nutriëntanalyse wordt uitgevoerd met een Skalar nutriëntanalyzer op telkens 2 replica‟s van het originele cultuurmedium (f/2 groeimedium) en op het door de diatomeeën reeds gebruikte groeimedium (3 groeifasen). De bepaalde nutriënten zijn nitriet, nitraat, silicaat, fosfaat en ammonium. De verwerkte resultaten van deze bepalingen zijn te zien in figuur 4.7. Hieruit kan men stellen, dat het gemeten nitraat vooral afkomstig is van het originele groeimedium (f/2). Het is niet aanwezig als een nutriënt, maar als een volwaardig bestanddeel. Als men kijkt naar de samenstelling van f/2 concentraat kan men zien dat deze een behoorlijke concentratie NaNO3 bevat.

71


Overzicht Nutriënten 300000 250000 200000 150000 100000 50000 0

gemiddelde f/2 medium gemiddelde lag fase gemiddelde exponentiële fase gemiddelde stationaire fase

Figuur 4.7 Overzicht van de nutriënten in het medium na de verschillende groeifasen

In de onderstaande grafiek zijn de resultaten van de bepaling van nitraat gedetailleerder zichtbaar (zie Figuur 4.8). Hierin kan men zien dat de concentratie nitraat geen grote verschillen toont tussen de verschillende groeifasen.

Nitraat, ppb N/NO3 300000 280000

gemiddelde f/2 medium

260000

gemiddelde lag fase

240000

gemiddelde exponentiële fase

220000

gemiddelde stationaire fase

200000

Figuur 4.8 Grafiek van de concentratie aanwezig nitraat

De onderstaande grafiek toont de concentratie nitriet aan, in het originele cultuurmedium is hiervan een kleine concentratie aanwezig (zie Figuur 4.9). In de reeds door diatomeeën gebruikte media is deze concentratie nitriet bijna volledig verdwenen.

72


Nitriet, ppb N/NO2 30


25

gemiddelde lag fase

20 15


10 5


0

Figuur 4.9 Grafiek van de concentratie aanwezig nitriet

Figuur 4.10 toont de aanwezige concentraties silica aan waarbij men kan vaststellen dat de hoeveelheid silica vermindert naargelang de diatomeeën langer aanwezig zijn en groeien in het medium. Dit valt te verklaren doordat diatomeeën silica o.a. nodig hebben om hun frustule te bouwen, als de diatomeeën groeien of zich voortplanten gaan ze silica uit de omgeving opnemen (Shin, 1999). Hoe langer de diatomeeën groeien hoe meer silica er wordt verbruikt.

Silicaat, ppb Si 5000 4000


3000

gemiddelde lag fase

2000


1000


0

Figuur 4.10 Silicaatconcentratie in de verschillende groeifasen

Figuur 4.11 rapporteert het fosfaatconcentraat in de groeimedia van de verschillende groeifasen. De concentratie aan fosfaat is in alle media gelijkaardig, het fosfaat wordt door de diatomeeën noch verbruikt noch omgezet.

73


Fosfaat, ppb P/PO4 4400 4200


4000

gemiddelde lag fase

3800


3600


3400

Figuur 4.11 Fosfaatconcentratie in de verschillende groeifasen

De ammoniumconcentraties (Figuur 4.12) tonen aan dat er in het originele cultuurmedium een lage concentratie ammonium aanwezig is, in het door diatomeeën gebruikte medium is er geen ammonium meer aanwezig. Een mogelijkheid kan zijn dat de diatomeeën het ammonium verbruiken of afbreken. Een andere mogelijkheid is dat het ammonium wordt afgebroken door de bacteriën die mogelijks rond deze diatomeeën leven (zie 4.2.5 Bepaling van de bacteriële gemeenschap).

Amonia, ppb NH4/N 80 60 40 20 0

gemiddelde f/2 medium gemiddelde lag fase gemiddelde exponentiële fase gemiddelde stationaire fase

Figuur 4.12 Ammoniumconcentratie (gemiddelde van 2 replica’s) in de verschillende groeifasen

74


4.2.3.

Bepalen van de C:N ratio

De C:N analyse wordt uitgevoerd met gebruik van een CN elemental analyzer op telkens 3 replica‟s van stalen van de diatomee Seminavis robusta (stam 85A), deze stalen zijn afkomstig uit drie verschillende groeifasen: lag, exponentiële en stationaire. De C:N ratio werd bepaald op de diatomeeëncellen zelf en niet op het medium. C:N ratio is een maat voor de voedselkwaliteit van deze cellen voor grazers (zie 4.3). De resultaten van de 3 groeifasen zijn te zien in onderstaande grafiek (zie Figuur 4.13).

C/N ratio 12,00 10,00

Lag Fase

8,00 6,00 4,00

Exponentiële Fase

2,00

Stationaire Fase

0,00 1 Figuur 4.13 C:N ratio in de verschillende groeifasen

De C:N ratio ligt iets hoger in de lag fase dan in de exponentiële en de stationaire fase. De C:N ratio geeft de hoeveelheid koolstof ten opzichte van de hoeveelheid stikstof. Het wordt uitgedrukt als een nummer en het geeft weer hoeveel meer koolstof er aanwezig is dan stikstof. Bij grotere nummers is er meer koolstof aanwezig dan stikstof. Hoe meer koolstof, hoe hoger de voedselkwaliteit.

4.2.4.

Bepaling van de EPS productie

Epipelische diatomeeën (vrijlevende of op sediment levende diatomeeën) scheiden een deel van de fotosynthetisch gefixeerde koolstoffen uit als extracellulaire polymerische substanties (EPS) die grotendeels bestaan uit koolhydraten. De diatomeeën worden ingebed in een matrix van EPS die zich vasthecht aan het sediment. Deze groenbruine dunne laag op het sediment vormt een belangrijke voedselbron voor andere organismen en wordt „biofilm‟ genoemd (de Brouwer, 2002). 75


De EPS productie van de diatomeeën wordt bepaald in 3 replica‟s van de drie groeifasen. Dit gebeurt op twee verschillende manieren, enerzijds wordt de absorbantie gemeten met een spectrofotometer, anderzijds met de victor3 multilabelreader. Deze twee toestellen werden gebruikt om na te gaan of er een verschil is tussen de resultaten van beide. Het is mogelijk dat de bepaling van de oplosbare EPS (Soluble EPS) niet correct is. Bij de staalname gaan de cellen bezinken en wordt de bovenste waterlaag afgezogen, mogelijks werd hierbij een deel van de oplosbare EPS verwijderd. Grafiek 4.14 geeft de gemiddelde resultaten, gemeten met de spectrofotometer, weer per EPS fractie en per groeifase. Hierin kan men zien dat de hoeveelheid EPS per cel het grootst is in de lag fase en het kleinst in de stationaire fase. Hoe meer cellen er aanwezig zijn, hoe minder EPS iedere cel afzonderlijk aanmaakt. Dit resultaat lijkt logisch, de diatomeeën gaan EPS produceren om zich in te bedden in een matrix van EPS. Hoe meer diatomeeën, hoe meer oppervlakte er reeds bezet is door diatomeeën en hoe minder EPS er per cel moet worden aangemaakt om een netwerk te vormen. Als er minder diatomeeën zijn is er meer lege oppervlakte en moeten de diatomeeën per cel ook meer EPS produceren om een biofilm te vormen. De hoeveelheid oplosbaar EPS is het hoogst in de lagfase, het is tevens de grootste hoeveelheid binnen alle fracties en groeifases.

Hoeveelheid EPS (g/cel) 3,5E-08 3E-08 2,5E-08 2E-08 1,5E-08 1E-08 5E-09 0

Lag Fase Exponentiële Fase Stationaire Fase

Figuur 4.14 Hoeveelheid EPS per cel in elke groeifase (gemeten met spectrofotometer)

76


De onderstaande grafiek geeft de gemiddelde resultaten, gemeten met de victor3miltilabelreader, weer per EPS fractie en per groeifase (zie grafiek 4.15). Hier kan men eveneens zien dat de hoeveelheid EPS per cel het hoogst is in de lagfase en het kleinst is in de stationaire fase, hoe groter de celdensiteit, hoe kleiner de hoeveelheid geproduceerd EPS per cel. Als je de resultaten van beide toestellen vergelijkt kan je zien dat de algemene trend van de resultaten ongeveer gelijk is. Maar als je kijkt naar de gemeten hoeveelheden zie je dat de resultaten bekomen door spectrofotometrie veel lager liggen dan deze bekomen bij de victor3multilabelreader. Bij beide technieken werd de absorbantie gemeten op 486 nm, waar het verschil in metingen vandaan komt is niet gekend.

Hoeveelheid EPS (g/cel) 7E-08 6E-08 5E-08 4E-08 3E-08 2E-08 1E-08 0

Lag Fase Exponentiële Fase Stationaire Fase

Figuur 4.15 Hoeveelheid EPS per cel in elke groeifase (gemeten met Victor³multilabelreader)

4.2.5.

Bepaling van de bacteriële gemeenschap

DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis), werd uitgevoerd op telkens 3 replica‟s van de stalen uit de drie verschillende groeifasen (zie hoger). Het resultaat van deze 9 stalen is te zien op Figuur 4.16

77


M LA1 LA2 LA3 EA1 EA2 EA3 M SA1 SA2 SA3

M

Legende: M = Merker LA1 = Lag Fase replica 1 LA2 = Lag Fase replica 2 LA3 = Lag Fase replica 3 EA1 = Exponentiële Fase replica 1 EA2 = Exponentiële Fase replica 2 EA3 = Exponentiële Fase replica 3 SA1 = Stationaire Fase replica 1 SA2 = Stationaire Fase replica 2 SA3 = Stationaire Fase replica 3

Figuur 4.16 DGGE-Gel

De resultaten werden vergeleken met het software programma Bionumerics (versie 4.61, Applied Maths, Sint-Martens-Latem, België). Alle gelijkaardige stalen worden hierin met een bepaald percentage aan elkaar geclusterd in een dendrogram (Figuur 4.17).

78


Figuur 4.17 Dendrogram gebaseerd op de DGGE resultaten van de verschillende groeifasen

Uit het dendrogram kan men afleiden dat de 3 replica‟s van de exponentiële fase bij elkaar clusteren met een similariteit van 100%. Deze 3 replica‟s hebben dus een bacteriëngemeenschap die volledig identiek is. Verder werden ook 2 replica‟s van de stationaire fase geclusterd met een similariteit van 100%. Het derde replicaat werd hieraan geclusterd met een similariteit van meer dan 85%. De bacteriëngemeenschappen van 2 van de 3 replica‟s zijn volledig identiek, de derde vertoont enkele kleine verschillen. De grootste verschillen zijn waar te nemen bij de 3 replica‟s van de lagfase, replica 2 wordt met meer dan 85% similariteit geclusterd aan de exponentiële fase. De andere replica‟s van de lagfase hebben een similariteit van >80%. Verder worden deze twee replica‟s met een similariteit van >70% geclusterd met de exponentiële fase en replica 2 van de lag fase. De grote verschillen binnen de lag fase kunnen te wijten zijn aan het feit dat de lag fase de eerste fase is en slechts enkele dagen duurt. Alle reacties en interacties starten pas, hierdoor is het mogelijk dat deze bij het ene replica sneller of trager verlopen dan bij het andere.

79


4.3

Voedingsexperiment copepoden

In dit voedingsexperiment voor copepoden werden diatomeeën opgekweekt met een cultuurmedium waaraan het stabiele isotoop 13C (in de vorm van NaH13CO3) in oplossing werd toegevoegd. Later werden deze diatomeeën in de drie groeifasen geoogst en vervolgens werden er copepoden aan toegevoegd om deze te begrazen. Na 4 dagen grazen werden de copepoden verzameld en verwerkt om de isotopenratio te bepalen. Dit heeft als doel het verband tussen de diatomeeën als voedselbron en de copepoden als begrazers aan te tonen en de opnamen van diatomeeën door de copepoden te traceren. Van elke groeifase werden 3 replica‟s genomen en geanalyseerd. De diatomeeën werden in cupjes gebracht en gedroogd, daarna werden de stalen door Prof. Dr. Tom Moens meegenomen en geanalyseerd te Brussel (VUB). Deze analyse gebeurde met een EA-IRMS (Elemental analyzer – isotopenratiomassaspectrometer). De bekomen resultaten van dit experiment zijn niet betrouwbaar. Het opkweken van de diatomeeën is niet optimaal verlopen. Toen de diatomeeënculturen voor het oogsten werden geteld, bleek dat de exponentiële en stationaire fase onvoldoende gegroeid waren. De precieze oorzaak hiervan is niet bekend, vermoedelijk is er een fout gebeurd bij de bereiding van het medium. Ondanks de omstandigheden werd het experiment toch verder gezet en werden de stalen geanalyseerd. Naast diatomeeën voor het graasexperiment werden er ook diatomeeën met 12C en 13C als controle opgekweekt. Aan de hand van deze resultaten kan men zien of de gebruikte diatomeeën wel degelijk aangerijkt zijn en of er verschillen zijn tussen de aanrijking van de verschillende groeifasen. De gemiddelde waarden hiervan zijn te zien in figuur 4.18 . De δ13C waarden geven het verschil in duizenden tussen 13C/12C ratios in de onderzochte stalen en diezelfde regio‟s in de anorganische wereld.

80


δ ¹³C waarden diatomeeën 2500,00

Controle diatoms lag fase¹²C

2000,00

controle diatoms lag fase ¹³C

1500,00

controle diatoms exponentiële fase ¹²C

1000,00

controle diatoms exponentiële fase ¹³C

500,00

controle diatoms stationaire fase ¹²C

0,00 1 -500,00

controle diatoms stationaire fase ¹³C

13

Figuur 4.18 δ C waarden diatomeeën

De diatomeeën in de exponentiële fase hebben de grootste hoeveelheid 13C opgenomen. In de exponentiële fase is de groei het grootst en dit verklaart waarom net in die fase het meeste 13C geïncorporeerd wordt bij de groei.

Δδ ¹³C waarden copepoden 160,00 140,00 120,00 100,00 Copepoden lag fase

80,00

copepoden exponentiële fase

60,00

copepoden stationaire fase

40,00 20,00 0,00 1 13

Figuur 4.19 Δδ C waarde copepoden

81


De Δδ13C waarden van de copepoden zijn zeer laag in vergelijking met eerdere studies, dit komt waarschijnlijk doordat er onvoldoende aangerijkte diatomeeëncellen aanwezig waren om te begrazen. Toch kan men zien dat er meer 13C uit de lag en de exponentiële fase werd opgenomen.

Om dit onderzoek verder af te werken zouden enkele experimenten onder andere omstandigheden of opnieuw kunnen worden uitgevoerd. Zo zouden de experimenten voor de biochemische karakterisatie van de diatomeeën opnieuw kunnen worden uitgevoerd met stalen van een latere exponentiële fase, de stalen die nu gebruikt zijn, zijn na 7 dagen geoogst en dit is pas een beginnende exponentiële fase. Verder kan de bepaling van de bacteriëngemeenschap verder worden afgewerkt door de afzonderlijke bandjes te isoleren en te zuiveren door nogmaals een DGGE uit te voeren. Indien de bandjes volledig gezuiverd zijn, kunnen deze gesequeneerd worden. Hierna kan men via sequentiedatabases gaan kijken met welke bacteriesoorten deze sequenties overeen komen. Zo kan men bepalen welke bacteriën zich in welke groeifasen op en rond de diatomeeën bevinden. Als laatste kan het voedingsexperiment met de copepoden volledig worden hernomen; Dit experiment zal worden uitgevoerd door Dr. Marleen De Troch en Drs. Clio Cnudde.

82

Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden) Conclusie

5

Conclusie

5.1


Na het vergelijken van alle bekomen groeicurven van de diatomee Seminavis robusta (stam 85A) kan besloten worden dat er tussen de meeste onderzochte omstandigheden slechts kleine verschillen te zien zijn. De onderzochte omstandigheden bestaan uit verschillen in het bruikbare groeioppervlak, omgevingsverschillen (temperatuur, belichting,…) en verschillen in nutriënten. Uit de resultaten blijkt dat het beschikbare groeioppervlak een invloed heeft op de maximale concentratie aan cellen die bereikt wordt in de stationaire fase. Hoe groter het beschikbare groeioppervlak, hoe groter de maximum concentratie cellen per cm² tijdens de stationaire fase. De aanwezigheid van silicium in het groeimedium heeft het grootste effect op de groeicurve. Hoe groter de concentratie aanwezig silicium, hoe groter de concentratie aan cellen in de stationaire fase. Indien lagere concentraties silicium aanwezig zijn, is de concentratie aan cellen in de stationaire fase opmerkelijk lager. Gelet op het belang van silicium voor de aanmaak van de frustule van diatomeeën, voldoet dit resultaat aan de verwachtingen en is silicium een groeibepalende factor. 5.2


Uit de vetzuuranalyse blijkt dat er verschillen optreden in de vetzuurconcentraties naargelang de cultuurleeftijd (groeifase). Daarenboven werd het vetzuur DHA (docosahexaeenzuur) enkel gekwantificeerd in de stationaire fase. Dit vetzuur kan een effect hebben op de groei en de overlevingskansen van grazers die zich voeden met deze diatomeeën. De aanwezigheid van DHA tijdens de stationaire groeifase kan zelfs de voedselselectiviteit van de grazers bepalen (zie 5.3). De resultaten van de chlorofyl a bepaling en de C:N analyse tonen geen opmerkelijke verschillen. Wel kan besloten worden dat de hoeveelheid chlorofyl a per cel afneemt naargelang de groei vordert. Chlorofyl a concentratie in diatomeeën wordt beschouwd als een maat voor de „versheid‟ van deze cellen voor grazers zoals copepoden. De bekomen resultaten ondersteunen deze stelling want de „versheid‟ (chl a) neemt af naarmate de cellen ouder worden.

83

Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden) Conclusie

De C:N ratio ligt iets hoger in de lagfase, in de andere twee groeifasen is deze ongeveer gelijk. De C:N ratio wordt algemeen aanvaard als een maat voor de kwaliteit van het voedsel (diatomeeën) voor de grazer (copepoden). De fotospectrometrische bepalingen van de EPS concentraties geven aan dat de diatomeeëncellen tijdens hun groei steeds relatief minder EPS per cel produceren. Dit resultaat lijkt logisch omdat de cellen zich steeds op eenzelfde oppervlakte bevinden en hoe minder cellen er zijn hoe meer EPS ze moeten produceren om een biofilm te vormen over het ganse oppervlak. EPS vormt een kleefstof om de cellen samen te houden in een biofilm. Uit de bepaling van de bacteriële gemeenschap kan afgeleid worden dat er belangrijke verschillen zijn tussen de bacteriëngemeenschappen van de verschillende groeifasen. De diversiteit en densiteit van de gemeenschappen zijn substantieel verschillend tussen de groeifases waarbij de densiteit van de bacteriën het hoogst is bij verminderde diatomeeëngroei (lag en stationaire fase). Dit gegeven is zeker belangrijk naar de grazers toe en kan tevens hun voedselselectiviteit bepalen. Om verdere conclusies te kunnen trekken uit deze resultaten zouden de bacteriesoorten verder moeten gekarakteriseerd worden door middel van sequenering.

5.3

Voedingsexperiment copepoden

De initiële aanrijking met het stabiele isotoop 13C was het sterkst tijdens de exponentiële groeifase. Dit resultaat voldoet aan de verwachting omdat deze groeifase gekenmerkt wordt door de snelste groei en er worden dus sneller nutriënten opgenomen en geassimileerd. De opname van 13C aangerijkte diatomeeën door de copepoden vertoonde echter een ander patroon. Er werden meer 13C uit de lag en de exponentiële fase opgenomen. De verschillen in initiële aanrijking tussen de diatomeeën zou moeten in rekening gebracht worden, maar dit was niet mogelijk omdat er geen koolstofgehaltes beschikbaar waren. Dit besluit dient met de nodige voorzichtigheid geïnterpreteerd te worden, gelet op het feit dat er bij de groei van de diatomeeën problemen zijn opgetreden om nog onbekende redenen.

84


Literatuurlijst

de Brouwer, J.F.C., Dynamics in extracellular carbohydrate production by marine benthic diatoms, 2002 Decho, A.W. & Fleeger, J.W. (1998). Ontogenetic feeding shifts in the meiobenthic harpacticoid copepod Nitocra lacustris. Marine Biology., 97, 191-197 De Troch, M., Mees, J., Wakwabi, E.O., (1998). Diets of abundant fishes from beach seine catches in seagrass beds of a tropical bay (Gazi Bay, Kenya). Belg. J. Zool., 128, 135-154 Dubois, M., Gilles, K.A., Hamilton, J.K., Rebers, P.A. & Smith, F. (1956) Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical Chemistry. 28, 350-365 Dürbaum, J. & Künneman, T.D., Biology of Copepods: An Introduction [www], 20 juni 2000, Carl von Ossietzky University Oldenburg. URL: http://www.uni-oldenburg.de/zoomorphology/Biologyintro.html Gezien d.d. 15 april 2009 Green J., Don‟t panic, a guide to DGGE [WWW], 28 december 2005 URL: http://ddgehelp.blogspot.com/2005/11/dgge-guide.html gezien d.d. 17 april 2009 Grossart, H.P., Levold,F.,Allgaier,M.,Simon,M. & Brinkhoff,T.,(2005). Marin diatom species harbor distinct bacterial communities. Environmental Microbiology.,7(6), 860-873. Gunst,D., Analytische chemie Deel I: gaschromatografie, KHBO, Oostende, 2004 Gunst,D., Analytische chemie Deel II: vloeistofchromatografie, KHBO, Oostende, 2004 Hicks, G.R.F., Coull, B.C. (1983). The ecology of marine meiobenthic harpacticoid copepods. Oceanography and Marine Biology an Annual Review. 21, 67–175. Hillebrand, H. & Sommer, U.,(1999). The nutrient stoichiometry of benthic microalgal growth: Redfield proportions are optimal. Limnology and Oceanography., 44(2), 440-446.

85


Kainz, M., Arts, M.T. & Mazumder, A.,(2004). Essential fatty acids in the planktonic food web and their ecological role for higher trophic levels. Limnology and Oceanography. 49(5), 1784-1793 Liang, Y., Mai, K. (2005). Effect of growth phase on the fatty acid compositions of four species of marine diatoms. Journal of Ocean University of China. 4(2), 157162. Mann, D. G. (1999). The species concept in diatoms. Phycologia. 38, 437-495. Shinn, J. , Diatoms Introduction [www], 1999, Monterey Bay Aquarium Research Institute URL: http://www.mbari.org/staff/conn/botany/diatoms/jennifer/intro.htm Gezien d.d. 10 april 2009 Stewart, R.R., Marine Fisheries Food Webs [www], 2005, Department of Oceanography, Texas A&M University URL: http://oceanworld.tamu.edu/resources/oceanography-book/marinefoodwebs.htm Gezien d.d. 16 april 2009 Toledo, Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) [Pdf], Laboratory for Microbial Ecology Department of Earth, Ecological and Environmental Sciences University of Toledo, 12/2004 URL: http://www.eeescience.utoledo.edu/Faculty/Sigler/RESEARCH/Protocols/D GGE/DGGE.pdf gezien d.d. 17 maart 2009 Underwood, G.J.C., Paterson, D.M. (2003). The importance of extracellular carbohydrate production bij marine epipelic diatoms. Botanical Research. 40, 183–240. Walter C., The World of Copepods [www], 28 oktober 2008, Smithsonian institution URL: http://invertebrates.si.edu/copepod/ Gezien d.d. 15 april 2009

86

Colofon Dit eindwerk werd uitgewerkt met behulp van: Microsoft Corporation, Office voor Thuisgebruik en Studenten 2007  

Word Excel

Microsoft Corporation, Windows vista, Home Edition De koppen van de hoofdstukken zijn uitgewerkt in het lettertype Arial Vet 14 pts. De lopende tekst is uitgewerkt in het lettertype Arial 12 pts. De bijschriften zijn uitgewerkt in het lettertype Arial Vet 9 pts.

87

Woord vooraf. Biochemische karakterisatie van de diatomee Seminavis robusta in verschillende groeifasen: implicaties voor mariene grazers (copepoden)

Recommend Documents