WERKPLANNEN het nederlands kankerinstituut amsterdam

WERKPLANNEN

ANTONI

VAN

1981

I

LEEUWENHOEKH.UIS

het nederlands kankerinstituut amsterdam

INLEIDING In de werkplannen worden voornamelijk ombuigingen in het onderzoek en nieuw onderzoek aangegeven. Een wetenschappelijk verslag in de Engelse taal wordt als Annual Report uitgegeven. De nummering van onderzoekprogramma's en projekten is in werkplannen en Annual Report gelijk gehouden. Een nieuw onderzoeksgebied is de klinische farmacologie van cytostatica, dat gedeeltelijk als projekt van het Integraal Kankercentrum Amsterdam wordt uitgevoerd.

Sektie I 1.1

FUNDAMENTEEL BIOCHEMISCH ONDERZOEK

Analytisch

centrifug~

W.S.Bont, W.L. van Es, M. de Vries, C.J.P. Slee Op zeer korte termijn moet onderzoek met de analytische U.C. nog beperkt blijven tot service voor andere projekten. Het onderzoek met membraanblaasjes wordt op het ogenblik voortgezet in samenwerking met de afdeling Biofysika van de Universiteit van Nijmegen. Men heeft daar onze resultaten kunnen bevestigen en uitbreiden. Als de nieuwe resultaten daartoe aanleiding geven, kan tot een voortzetting van onze eigen experimenten worden besloten. Het zal dan vooral belangrijk zijn analytisch te werken in het laag-toerige gebied.

1.2

Scheiding van cellen.

W.S. Bont, W.L. van Es, C.G. Figdor, E. Martens, C.J.P. Slee, J.E. de Vries • a Scheiding o.i.v. zwaartekracht. Apparatuur wordt ontwikkeld voor de simultane scheiding van meerdere celsuspensies op een apparaat, terwijl slechts een gradiënt behoeft te worden gemaakt. Een onderzoek wordt gestart naar de invloed van het medium op de resolutie. Dit is van groot belang voor o.a. de scheiding langs fysische weg van T- en B lymfocyten. • b Scheidingen met de elutriator rotor. Dankzij de verfijning van de methodiek is de elutriator rotor nu een zeer betrouwbaar apparaat, onmisbaar voor het onderzoek van bloed- en beenmergcellen. Omdat nu zeer grote hoeveelheden bloedcellen (2.10 9 mononucleairen) in één keer kunnen worden verwerkt, is het mogelijk cellen te verrijken die slechts in geringe hoeveelheden voorkomen. Tot de mogelijkheden die moeten worden benut behoren o. a. : • 1 Het scheiden van granulocyten in subpopulaties , en een vergelijkend onderzoek hiermee bij patiënt en normale donor. • 2 Het scheiden van mononucleairen in subpopulatiesi het testen van hun functies vormt hierbij een belangrijk aspect. • 3 Het scheiden van bacteriën in de fasen van de celcyclus. Dit in samenwerking met Dr Nanninga, van de afdeling EM van de Gemeente Universiteit van Amsterdam. • c Scheidingen m.b.v. electroforese. Het werk met de electroforese apparatuur kwam dit jaar, door onvoorziene omstandigheden niet tot verdere

1

ontwikkeling. Het blijft op ons programma staan. • d Apparatuur voor onderzoek van celmengsels d.m.v. sedimentatie analyse. De ontwikkeling van detectie apparatuur voor sedimentatie analyse vordert. De eerste metingen met goed gedefinieerde latex bolletjes wettigen de verwachting dat dit apparaat een waardevol hulpmiddel kan worden bij de analyse van een mengsel van cellen. Het spreekt vanzelf dat vergelijkend onderzoek van patiënt en normale donor centraal staat bij al dit werk.

I.3 Onderzoek naar de remmende werking van selenotrisulfiden op de eiwitsynthese in normale- en tumorcellen. L.N.Vernie, L.Karreman, M. de Vries, W.S.Bont, P. Emmelot Selen~um is een essentieel spore-element. Een tekort aan selenium wordt o.a. in verband gebracht met een verhoogde gevoeligheid voor het ontstaan van tumoren en hartziekten. Een van de omzettingsproducten van seleniumverbindingen in het dierlijk organisme is selenodiglutathion (GSSeSG). Door ons is aangetoond dat GSSeSG de aminozuur inbouw zowel in het celvrije systeem als in cellen in weefselkweek remt. De remming van de eiwitsynthese berust op een specifieke inactivering van elongatie factor 2 (EF2). Verder is gebleken dat niet alleen GSSeSG maar alle tot nu toe geteste selenotrisulfiden van het type RSSeSR een remming van de eiwitsynthese te zien geven. Dit geeft een mogelijkheid te zoeken naar selenotrisulfiden welke tumorspecifiek zouden zijn.

Het onderzoek wordt voortgezet aan de hand van de volgende hoofdlijnen. • 1 Onderzoek naar het mechanisme van de inactivering van elongatiefactor 2 door selenotrisulfiden. Omdat zovele selenotrisulfiden, tot nu toe zlJn 9 verschillende verbindingen getest, eenzelfde inactivering van EF2 te zien geven ligt het voor de hand te veronderstellen dat de gezamelijke groep -S-Se-S- hiervoor verantwoordelijk is. Maar ook de vorming van een gelijk tussenproduct door alle selenotrisulfiden is niet geheel uitgesloten. • 2 Onderzoek naar het groeiremmend effect van selenotrisulfiden op cellen in weefselkweek. Ten opzichte van de remming van de aminozuurinbouw in het celvrije systeem is in weefselkweek met verschillende selenotrisulfiden een veel grotere variatie in effect 2

gevonden. Het ligt in de bedoeling om ook de gevoeligheid van verschillende celtypen voor selenotrisulfiden te testen. I

• 3 Onderzoek naar het groeiremmend effect van selenotrisulfiden op tumorcellen in vivo. (In samenwerking met C.J. Hamburg, J. de Vries, W. Misdorp, K. Weyer) Onder bepaalde omstandigheden wordt de groei van ascites tumorcellen bij de muis geremd door toediening van GSSeSG. Deze experimenten zullen worden uitgebreid met andere selenotrisulfiden, maar ook zal het effect van deze verbindingen worden bekeken op spontane tumoren bij hond en kat • • 4 Onderzoek naar het mogelijk ontstaan van seleniumdeficiëntie bij het gebruik van cytostatica. (In samenwerking met C. Benckhuijsen en J.J.M. de Goeij van het Reactor Instituut te Delft) Apart van bovenstaand onderzoek staat de vraag of bij de behandeling van patiënten met bepaalde cytostatica niet een tekort aan selenium zou kunnen optreden met als gevolg, niet als zodanig herkende, seleniumdeficiëntie verschijnselen. Bekend is dat verschillende cytostatica alkylerend werken en o~a. als zwavel verbinding worden uitgescheiden. De overeenkomst tussen zwavel en selenium en de grotere reaktiviteit van selenium dan zwavel t.o.v. alkylerende agentia maakt dat het ontstaan van een seleniumtekort na toediening van bepaald cytostatica niet denkbeeldig is. Behalve een directe seleniumbepaling in bloed is ook de glutathionperoxidase activiteit als parameter gekozen. Dit enzym is selenium-afhankelijk terwijl de selenium bloed waarde goed is gecorreleerd met de glutathionperoxidase activiteit.

3

4

Sektie II. CHEMISCHE CARCINOGENESE II.l Interactie van N-acetyl-2-aminofluoreen (AAF) en verwante aromatische aminen met nucleïnezuren in relatie tot de vorming van tumoren. E.Kriek, J.G.Westra, M.Aarsman en A.Visser Het onderzoek wordt voortgezet volgens de hoofdlijnen aangegeven in het werkplan 1979 (1,2 en 4). • 1 Karakterisering van de reactieproducten van aromatische aminen met DNA in vivo en in vitro met behulp van synthetische model verbindingen. Het onderzoek over de chemische eigenschappen en conformatie van N-(deoxyguanosin-8-yl)-2-aminofluoreen (dGuo-AF) is vrijwel afgerond. Dit product wordt inderdaad gevormd in de ratte lever na toediening van (G- 3 H)AAF, maar wordt onder bepaalde condities omgezet tot een pyrimidine derivaat. Deze reactie verklaart mogelijk de hoge mutagene activiteit van arylhydroxylaminen in bacteriële testsystemen. Er zal worden nagegaan of deze omzetting ook in vivo plaatsvindt. Als nieuwe model verbindingen zullen worden bestudeerd het 3-methyl-4-aminobiphenyl en o-toluidine. Uit onderzoekingen in Japan is geblekeï1, dat door bepaalde behandeling van vlees en vis (roosteren op houtskool) heterocyclische aminen ontstaan die een mutagene werking bezitten. Diezelfde verbindingen konden worden geïsoleerd na pyrolyse van aminozuren (tryptofaan, glutaminezuur en phenylalanin~ . De ringsystemen van deze aromatische aminen vertonen sterke gelijkenis met AAF en 4-aminobiphenyli sommige bezitten een methylgroep in ortho-positie t.o.V. de aminogroep. Uit experimenten met proefdieren was reeds bekend, dat ~ methylarylaminen bij ratten darmtumoren kunnen induceren en bij de vrouwtjes ook mammatumoren. • 2 Herstel van schade aangebracht in DNA door carcinogene aromatische aminen in vivo. Doordat nieuwe technieken voor zowel de bepaling van N(guanin-8-yl)-AF en de snelle isolatie van DNA uit weefsels werden ontwikkeld, kan nu een aanvang worden gemaakt met het onderzoek van de persistentie van arylamine derivaten: • a Vormings- en verdwijnkinetiek van arylamine producten in DNA in vivo. • b Invloed van het metabolisme tot pyrimidine derivaten op de persistentie in vivo. • c Invloed van dosering en wijze van toediening op de vormings- en verdwijnkinetiek als onder a en b. • d De invloed van Se in het dieet op a, b en c, in samenwerking met L.N.Vernie (zie project I.3).

5

• 4 Verdeling van DNA-carcinogeen reactieproducten over de DNA-keten in het chromatine. Het doel van dit onderzoek is na te gaan hoe de structuur van het chromatine de verdeling beïnvloedt van de verschillende reactieproducten van AAF in het DNA. Hierbij wordt uitgegaan van een goed gedefinieerde verbinding, N-acetQxyAAP, waarvan de reactieproducten nu bekend zijn en geanalyseerd kunnen worden. In samenwerking met A.Tulp (zie project 11.4) zal de interactie van N-acetoxy-AAF met hamstercellen worden bestudeerd en de verdeling van de verschillende reactieproducten over de chromosomen.

11.2 DNA-modificaties en DNA-herstel in cellen na blootstelling aan chemische carCinogenen. Relatie tot tumorvorming. L. den Engelse, R.-J. de Brij, B.G.J.Floot Het onderzoek naar de gevolgen van persisterende carcinogeen-DNA interactieproducten voor het functioneren van DNA zal worden voortgezet. Bij in vivo studies ligt het accent op de vorming en persistentie van 02- me thylthymidine in rattelever DNA. Door deze te vergelijken met reeds door Scherer verzamelde gegevens over 02- e thylthymidine kan mogelijk een aanwijzing worden verkregen over de rol van deze substituënten bij vorming van (pre)neoplastische lesies in de rattelever (in samenwerking met project 11.3). Daarnaast zullen in vitro studies worden verricht naar eventuele effecten van persisterende carcinogeen-DNA adducten. Als carcinogeen zullen hierbij zowel (m)ethylerende producten als aromatische aminen worden gebruikt, dit laatste in samenwerking met project 11.1. De volgende experimentele benaderingen zullen worden gevolgd: • 1 nagegaan zal worden of in situ single-strand breuken optreden o.i.v. chemische carcinogenen en wat het vermogen is van diverse celtypen om deze breuken te herstellen. Door röntgenstraling veroorzaakte single-strand breuken zullen hierbij worden vergeleken (positieve controle) i • 2 bekeken .zul worden of in het DNA achterblijvende P01.-sistente lesies op zich mutageen zijn of niet. Hierbij zal worden getracht bijv. via "liquid holding" technieken, cellen te verkrijgen die verrijkt zijn aan deze persistente lesies. Na· deze rustfase zullen de cellen tot deling worden gestimuleerdi • 3 nagegaan zal worden of verschillende DNA-fracties uiteenlopende verschillen vertonen m.b.t. het herstel van bepaalde DNA-modificaties (m.n. 06- a lkylguanine).

6

11.3 Onderzoek van het carcinogene proces aan de hand van morphologische voorstadia van de kankercel in de lever E.Scherer, P.Emmelot, A.P.Timmer Chemische carcinogenen spelen hoogstwaarschijnlijk een belangrijke rol bij de inductie van kanker in de mens. Wegens hun mutagene eigenschappen wordt verondersteld, dat alkylering van DNA een noodzakelijke eigenschap is voor de carcinogene werking van deze stoffen. Verschillende plaatsen in het DNA worden gemodificeerd. De vraag welke modificaties relevant zijn voor het carcinogene proces is echter nog onopgelost. Omdat het carcinogene proces meerdere stappen omvat (volgens de somatische mutatie hypothese is de moleculaire achtergrond van een stap een relevante mutatie), lijkt het verstandig, de relevantie van DNA-modificaties voor elke stap afzonderlijk te bestuderen. Voor het onderzoek naar de rol van DNA-modificaties in de inductie van de eerste stap van het carcinogene proces werd in de laatste jaren een geschikt systeem ontwikkeld door inductie, groeigedrag en belang voor het carcinogene proces te bestuderen van precancereuze lesies (eilandcellen) welke in de rattelever door een enkele applicatie van levercarcinogenen kunnen worden geïnduceerd. Deze lesies staan zeer waarschijnlijk in causale samenhang met de tumoren door target cellen te zijn of te bevatten waarin de latere, voor het carcinogene proces noodzakelijke stappen worden uitgevoerd. Hoofdlijnen van het onderzoek zijn: • 1 Kwantificeren van reactieproducten tussen carcinogeen en lever DNA in vivo; naast DNA uit de gehele lever zal onder gebruikmaking van gevoeligere methoden (tezamen met project 11.6) ter detectie van de reactieproducten DNA uit leverkernpopulaties (tezamen met projekt 11.4) en precancereuze lesies worden onderzocht; • 2 vormings- en verdwijnkinetiek van de DNA-modificaties in vivo; • 3 inductie en kwantificatie van precancereuze lesies; • 4 bestudering van de verdeling van modificaties in DNA fracties, en • 5 meting van de bijdrage van een sub carcinogene dosis carcinogeen tot de ontwikkeling van levertumoren.

11.4 Celscheidingstechnieken carcinogenese

toeg~past

op de (chemische)

A.Tulp, M.G.Barnhoorn Snelheidssedimentatie bij 1 x g of bij 10-30 x g is een techniek, die ons in staat stelt deeltjes ter grootte van zoogdiercellen als ook minideeltjes ter grootte van chromosomen te scheiden. Met de recente ontwikkeling van een 10-30 x g sedimentatietechniek zijn we nu in staat nieuwe

7

wegen van onderzoek in te slaan. Op het gebied van de ontwikkeling van nieuwe apparatuur zullen twee nieuwe sedimentatiekamers worden gebouwd, alsmede een simultaanwerkend fractioneringsapparaat. Onderzocht zal worden of de deeltjesbelasting van de sedimentatiekamers kan worden opgevoerd door het sample in de vorm van een inverse gradiënt in de sedimentatiekamer te leiden. Daartoe zal een precisie minimixer worden ontworpen. Het hoofddoel van het onderzoek zal zijn: de scheiding van de chromosomen. Inherent aan de 20 x g sedimentatietechniek is de grote snelheid. Daarom kunnen nu chromosomen bij neutrale pH in hun grootte klassen worden gescheiden, zodat depurinatie, zoals optreedt in zuur milieu achterwege blijft. De mogelijk preferentiële binding van radioactief gelabeled N-acetoxy-Al\F zal worden gemeten aan de gescheiden chromosomen. Voorts zal deze binding worden bestudeerd met behulp van monoclonale antilichamen, als eenmaal de GuA(A)F antilichamen zijn bereid. De chromosoomscheidingen van hamster, Munt jak en mens zullen eveneens dienen om transformatiestudies en flblotting fl technieken volgens Southern te kunnen uitvoeren (in samenwerking met J .G. Collard, projekt ITL 3). Indien nodig -zullen de chromosomen met een fluorescence activated cell sorter 99% gezuiverd kunnen worden. Onderzocht zal worden in hoeverre chemische carcinogenen chromosoombreuken en translocaties in gekweekte cellen introduceren. De daartoe benodigde mathematische technieken zijn uitgewerkt door J.Aten van het Laboratorium voor Radiobiologie, Universiteit van Amsterdam. Onderzocht zal worden of het mogelijk is om uit gehepatectomeerde ratten na behandeling met vinblastine chromosoomsuspensies te isoleren, die geschikt zijn voor onze scheidingstechnieken. Aldus is een mogelijkheid geschapen om de in vivo binding van chemische carcinogenen aan chromosomen te bestuderen. De binding van het chemisch carcinogeen DEN aan verschillende klassen van leverkernen zal worden bestudeerd, nadat deze kernen m.b.v. 1 x g sedimentatie in hun plo idieklassen gescheiden zijn (in samenwerking met projekt Ir. 3) •

Onze bestaande 1 x g sedimentatietechniek is in staat stromale van parenchymale ratteleverkernen te scheiden. De populatie van stromale cellen bestaat evenwel uit von Kuppfer en reticulo-endotheelcellen. Teneinde de differentiële binding van chemische carcinogenen aan voornoemde celtypen te kunnen meten, zullen deze celtypen bij 10 x g gescheiden worden na in vivo toediening van N-OH-AAF.

8

II.S Perinatale carcinogenese van het zenuwstelsel van de rat door alkylerende agentia (K.W.F. annotatie XV.7) C. Heyting, A.Huygen Het onderzoek naar de mogelijke oorzaken van de grote gevoeligheid van het zich ontwikkelende zenuwstelsel van de rat voor tumorinductie concentreert zich op het herstel van door carcinogenen geïnduceerde DNA-beschadigingen in de verschillende organen. Geprobeerd wordt om na te gaan of de hersenen verschillen van de andere organen in (een van de) beide herstelmechanismen die voor eukaryote cellen zijn gepostuleerd, nl. excisie-herstel en postreplicatieve repair (PRR). • 1 Excisie-herstel Omdat binnen de verschillende organen lang niet alle cellen dezelfde gevoeligheid hebben voor tumorinductie, is begonnen met de lokalisatie van ENU-geïnduceerd excisieherstel in de verschillende weefsels. Dit gebeurt door de autoradiografische detectie van unscheduled DNA synthesis (UDS). Omdat gevonden is dat in jonge neuronen wel UDS kan worden geïnduceerd, maar in oudere niet, zal ook worden nagegaan hoe de lokalisatie van ENU-geïnduceerde UDS met de leeftijd verandert. Bovendien zal d.m.v. te ontwikkelen immuunhistochemische technieken worden geprobeerd om de inductie en het herstel van ENU-gëinduceerde DNA-beschadigingen te lokaliseren (zie ook project II-6) • Daardoor zal de functionele betekenis van de ENU-geïnduceerde UDS beter beoordeeld kunnen worden. • 2 Postreplicatieve rep air (PRR)_ Onder postreplicatieve repair verstaat men het verschijnsel dat na carcinogeenbehandeling de ketenverlenging bij de DNA-synthese aanvankelijk is geremd, maar dat die remming na verloop van tijd weer wordt opgeheven. Men heeft verondersteld dat de door carcinogeen geïnduceerde lesies zelf de ketenverlenging blokkeerden, en dat er na enige tijd een error-prone replicatiemechanisme werd geïnduceerd dat in staat was om lesies te passeren. Op dit moment rijzen er twijfels over deze interpretatie. Hoe dan ook, het is belangrijk om na te gaan wat er met de replicatie gebeurt, en of er bij de replicatie fouten gemaakt worden na carcinogeenbehandeling of niet. Met het onderzoek van de replicatie zelf is al een begin gemaakt. D.m.v. alkalische sucrose gradiënt sedimentatie zal worden onderzocht hoe de ketenverlenging verloopt in de verschillende organen, en of daarbij lesies worden gepasseerd. Met het onderzoek naar de betrouwbaarheid van de replicaties na carcinogeenbehandeling zal nu ook worden begonnen. Het gaat hierbij om de vraag of er mutaties ontstaan bij de replicatie van beschadigd DNA. Deze vraag kan niet met in vivo experimenten worden beantwoord, omdat gemuteerde cellen in vivo niet met zekerheid geidentificeerd kunnen worden. Als men de vraag in vitro zou willen onderzoeken, dan zou men gebruik kunnen maken

9

van celtypen, afkomstig van verschillende organen. Deze worden dan met carcinogeen behandeld, en men kijkt of er mutaties ontstaan. Deze aanpak heeft het nadeel, dat in de met carcinogeen behandelde cellen niet alleen het DNA, maar ook de replicatie- en eventuele reparatie enzymen beschadigd kunnen worden. Daardoor kunnen effecten van de DNA-beschadiging niet worden onderscheiden van die welke door beschadiging van replicatie- of reparatie-enzymen tot stand komen. Bovendien zijn niet in elk celtype mutaties even gemakkelijk te scoren. Een alternatief is misschien het gebruik van DNA-virussen als probe: daarmee kan men de effecten van schade aan het DNA en van schade aan enzymsystemen afzonderlijk bestuderen. Wanneer men de virussen behandelt met carcinogeen, en vervolgens verschillende celtypen, die zelf niet behandeld zijn, hiermee infecteert, dan kan men in het nieuw-geproduceerde virus kijken naar het resultaat van replicatie en reparatie van beschadigd DNA. Omgekeerd is het ook mogelijk om met carcinogeen behandelde cellen te infecteren met onbehandeld virus, om na te gaan of een met carcinogeen behandelde cel ook fouten maakt bij de replicatie van onbeschadigd DNA. Dit type proeven wordt door verschillende onderzoekers in Nederland gedaan; met een aantal daarvan zal eerst worden overlegd, voordat wordt besloten welke aanpak zal worden gevolgd.

11.6 Immunologische detectie van DNA-beschadigingen veroorzaakt door carcinogenen. -Immunochemicus, E.Kriek, E.Scherer, A.P.Timmer Dit is een nieuw aan te vangen projekt, dat gesubsidieerd wordt door het KWF (projekt nr. NKI 80-4). Er is een samenwerkingsverband met de afdelingen Immunochemie (Dr J. Nagel) en Pathologie (Drs C.A. van der Heyden) van het RIV. Genotoxische carcinogenen hebben de eigenschap in DNA blijvende veranderingen te veroorzaken. Deze veranderingen worden als de belangrijkste initiële stap in het carcinogene proces beschouwd. De specifieke carcinogeen-DNA interactieproducten kunnen nu ook immunologisch worden bepaald. Het belang van de immunologische methode is vooral gelegen in het feit dat persistente veranderingen in het DNA kunnen worden gedetecteerd. De methode is zeer gevoelig en bovendien behoeft geen gebruik meer te worden gemaakt van radioactief gemerkte carcinogenen. De methode is bovendien van belang voor het opsporen van stoffen die persistente DNA-producten vormen. De verkregen specifieke antisera zullen worden toegepast voor de detectie van DNA-carcinogeen adducten in levercellen, precancereuze lesies in de lever en andere organen, in hersen-

10

weefsel en indien mogelijk in chromosomen. Begonnen zal worden met interactieproducten waarmee reeds veel ervaring is verkregen jn de Sektie Chemische Carcinogenesei n.l. alkylerende verbindingen en N-acetyl-2-aminofluoreen. Het projekt kan een bijdrage leveren aan de risicoschatting van carcinogenen in menselijke situaties. Onderzocht kan worden of de vorming van bepaalde DNA-carcinogeen adducten bij de mens te correleren is met de vorming van deze adducten in het dierexperiment.

11

12

Sektie III. ROL VAN HET CELOPPERVLAK BIJ ONTSTAAN, GEDRAG EN BESTRIJDING VAN TUMOREN III.1 Onderzoek naar de samenstelling en eigenschappen van geisoleerde plasmamembranen uit normale en tumorcellen. R. P. van Hoeven, W.. J. van Bli tterswijk, P. Emmelot, C.A. FeItkamp, G.M. Hengeveld, H.A.M. Hilkmann, J.H. Krol, G.J.C.M. de Veer, M. de Vries en S. van der Waerden Tumorprogressie, bestudeerd op het niveau van het celoppervlak, is betrekkelijk schaars in de literatuur beschreven. Wij vonden dat het steeds sneller groeien van het muizehepatoom 143066 gepaard ging met verlies aan juncties, verlies van 5'-nucleotidase activiteit in de geisoleerde plasmamembranen en (vermoedelijk) verlies van glycolylgroepen in de plasmamembraan gangliosiden. Nagegaan zal nu worden of het hepatoom (oorspronkelijk "minimal deviated") ook eigenschappen van het anaplastische ratte-hepatoom 484A in de plasmamembranen vertoont, zoals hexokinase-activitei~ toeneming van de verzadigdheid van de fosfolipide-vetzuren en alkalische fosfatase-ac·tiviteit. Getracht zal worden om tumorpreparaten, sinds 1973 bewaard in vloeibare stikstof, op te kweken, om aldus het verloop van. een groter aantal plasmamembraaneigenschappen in de tijd te kunnen vervolgen. Het onderzoek naar de asymmetrie van de (fosfo) lipiden in het plasmamembraan zal voor de Novikoff ascites hepatoomcel worden afgerond met behulp van de niet-penetrerende probe sfingomyelinase. Pogingen om de asymmetrie van meer fragiele cellen, zoals GRSL, te bepalen zullen worden voortgezet met een nieuwe methode, nl. labeling van de geexposeerde amino-fosfolipiden met een complex van fluorescamine en cyclohepta-amylose. Eerdere pogingen met fosfolipase A2, vrij fluorescamine, trinitrobenzeensulfonzuur, taurocholaat en triton WR-1339 mislukten omdat de cellen de behandeling niet overleefden of de resultaten niet waren te interpreteren. De nieuwe methode wordt uitgetest met de veel minder fragiele erythrocyten en Novikoff cellen, waarvan de asymmetrie grotendeels bekend is. De door ons gebruikte vloeibaarheidsprobe diphenylhexatrieen heeft het nadeel dat de localisatie in het membraan niet te bepalen is, en dat intacte cellen totaal worden gelabeld. Met behulp van meer polaire lipideprobes, zoals een reeks anthroyl-gesubstitueerde vetzuren en parinaarzuur (vrij of gebonden in fosfolipiden) zal nagegaan worden of bij intacte cellen uitsluitend het celoppervlak wordt gelabeld. Misschien is het mogelijk uit de kinetiek van de labeling tevens inzicht te verkrijgen in vloeibaarheidsverschillen tussen binnen- en buitenlaag van het membraan.

13

Het kunstmatig veranderen van de lipidevloeibaarheid zal, in ,verband met de expressie van oppervlakte-(glyco)proteinen worden voortgezet (zie 111.5).

Veel aandacht zal worden besteed aan het optimaliseren van de gebruikte chromatografische technieken. "Post-column" derivatisering van met hogedruk-vloeistofchromatografie gescheiden fosfolipiden en glycolipiden is een mogelijkheid om de detectiegrens met u.v. absorptie of fluorometrisch ca 2 orden van grootte te verlagen. Dit is vooral van belang voor die gevallen waar de hoeveelheid biologisch c.q. klinisch materiaal gering is. Met behulp van monoclonale antisera zal de expressie worden nagegaan van glycolipiden in het celoppervlak, na labeling er van met'galactose oxidasejgetritieerd boorhydride al of niet voorafgegaan door neuraminidase-behandeling (zie III. 5) . Naast bestudering van de oligosaccharide-ketens van de qlVcolipiden uit de diverse plasmamembraan species, zullen ook de suiker-antennes van de glycoproteinen worden geanalyseerd (zie 111.2 en 111.6) . Het onderzoek naar niet-eiwit-gebonden siaalzuur (bv. gangliosiden) in serum als mogelijk diagnostisch hulpmiddel voor (vroege) opsporing van b.v. mammacarcinoom zal worden voortgezet. Na evaluatie aan. het proefdiermodel kan wellicht met klinisch materiaal een verdere toetsing van d~ waarde en de bruikbaarheid van de hypothesen worden verkregen.

111.2 Gly~proteinen in het celoppervlak van Dormale- en tumorcellen. W.P. van Beek, J. de Weerd*, J. Breekveldt en P. Emmelot Het onderzoek aan humane lymphoblastoide cellen naar verschijnen van snel eluerende glycopeptiden na infectie met EBV is vrijwel afgerond. Het meest onbevredigende aspect van dit onderzoek nl. het ontbreken van een goede controle cel, is enigszins weggenomen door de recentelijk ontstane *KWF-fellow

14

mogelijkheid humane lymphocyten van een gezonde donor tot langdurige proliferatie te brengen d.m.v. groeifactoren (J. de Vries en medewerkers). Aan de al onderzochte controle cellen nl. Pokeweed mi togen gestimuleerde humane lymphocyten zullen de resultaten van groeifactor gestimuleerde cellen worden toegevoegd. Het structuuronderzoek met behulp van hoogfrequent NMR in samenwerking met B. van Dorland en H. van Halbeek van het Organisch Chemisch Laboratorium van de R.U. Utrecht wordt bemoeilijkt door de relatief grote hoeveelheid glycoproteinemateriaal nodig_voor één bepaling (ca 1 mg) en de gevoeligheid van de techniek voor onzuiverheden in de vorm van o.a. serumcomponenten en enzymen. Door een grote hoeveelheid Py-BHK en BHK cellen te kweken (van ieder 1010 cellen) zal vermoedelijk voldoende materiaal ter beschikking komen dat na zuivering (eventueel in groter samenwerkingsverband met A. Kolk) mogelijkerwijs met behulp van NMR (groep Utrecht) en GLC (R. van Hoeven en J. Krol) informatie kan verschaffen omtrent structuurverschillen in glycoproteinen van beide celtypen. Na met dit veel beschreven Py-BHK en BHK systeem de zuiverings en analyse techniek gestandaardiseerd te hebben, zullen diverse andere celsystemen onderzocht worden waaronder de lymphoblastpide en Burkitt lymphoma cellen. Begonnen zal worden met een onderzoek naar de veranderingen in het koolhydraatgedeelte van glycoproteinen in relatie tot celdifferentiatie. Het onderzoek zal in eerste instantie plaatsvinden aan weefselkweek cellen. Gedacht wordt aan de volgende systemen .a) neuroblastoma, b) teratocarcinoma en c) Friend Leukemia.

Bovengenoemde structuurverschillen zullen ook worden onderzocht (J. de Weerd) met behulp van een virusprobe. Na infectie van diverse celsystemen (BHK, Py-BHKi 3T3, 3T3-T) met VSV blijken verschillen in glycoproteinen te worden gereflekteerd door het virusglycoproteine, dat wordt ge~ synthetiseerd met behulp van het cellulaire syntheseapparaat. Aangezien het bij dit systeem de analyse van slechts één glycoproteine betreft zal het structuuronderzoek naar verwachting vereenvoudigd worden. Tevens zal, na een stage verblijf hiertoe in de V.S. (J. de Weerd), nagegaan worden of de hybridomatechniek kan worden toegepast om monoclonale antilichamen te verkrijgen tegen tumor-specifieke glycoproteinen structuren.

15

III.3 Rol van het celoppervlak

bij~groei-regulering_._

III.3a Scheiding van chromosomen en genetische controle groei.

~getransformeerde

J.G. Collard, J.H. Hollander

Het onderzoek over celcyclus en celdichtheids veranderingen in fluorescentie polarisatie metingen (zie Annual Report 1979) is afgerond, terwijl het onderzoek over lipide uitwisseling gedurende celcontact in een afrondingsfase verkeert. In samenwerking met project 1I-4 werd in een nieuw onderzoek getracht geisoleerde metaphase chromosomen op grootte te fractioneren met behulp van de l-g sedimentatie techniek. De voorlopige resultaten hiervan zijn veelbelovend. Momenteel wordt het oplossend vermogen van de l-g sedimentatie techniek, al of niet fn combinatie met flow sorting, onderzocht met chromosomen van Munt jac, hamster, rat, muis en humane cellen. In de toekomst worden de gezuiverde chromosomen gebruikt in transformatie experimenten. Op deze manier is het mogelijk genen te mappen op individuele chromosomen. Het onderzoek zal gericht worden op het al of ni.et aanwezig zijn van genetisch vastgelegde veranderingen in groei gedrag van cellen. Tevens worden de chromosomen gebruikt om integratie van virale genomen op de gefractioneerde chromosomen te localiseren met de zg. "Southern blotting" techniek. Dit is nu mogelijk doordat grote aantallen chromosomen kunnen worden gefractioneerd waardoor geintegreerde virale genomen of genen op individuele chromosomen kunnen worden aangetoond.

III.3b

Membraang~ycoproteinen

en celinteracties.

L.A. Smets, L. de Leij*, H. van ROOy a) Biosynthese Muizen L cellen dragen een mutatie in de biosynthese van membraankoolhydraten die gecorreleerd is met hun onvermo*

KWF-fellow

16

gen om functionele cel contacten te maken en mogelijk ook met hun invasief en metastatisch gedrag. Wij hebben gronden (zie Annual Report) om aan te nemen dat deze cellen algemene eigenschap van tumorcellen op extreme wijze representeren. Deze hypothese zal getest worden aan een aantal systemen door differentiële labeling met radioactief mannose en fucose. Omdat voor deze test geen referenties nodig zijn zal de aandacht vooral uitgaan naar klinische toepassingen die voordien niet mogelijk waren door het ontbreken van passende controles. Aan modelsystemen in vitro zal de differentiële labeling nader worden bestudeerd m.b.v. de VSV techniek zoals beschreven in III.2. In samenwerking met project III.4 zal gezocht worden naar de biOlogische gevolgen van deze veranderingen in membraankoolhydraat. Aspecten van adhesie aan andere cellen, en de vorming van communicerende celverbindingen zullen worden bestudeerd in relatie tot eigenschappen van de oligosacchariden in het membraankoolhydraat. b) Genetische controle Het is onzeker of de analyse van somatische celhybriden met normale en leukemische humane cellen zoals beschreven in het Annual Report, duidelijke antwoorden kan geven over de genetische regulering van tumor-geassocieerde membraanglycoproteinen. De complexiteit van de analyse is vooral gelegen in het feit dat koolhydraatstructuren geen primaire genproducten zijn en dat de hybride cellen membraandeterminanten van beide partners kunnen produceren. Dit onderzoek zal daarom worden gecontinueerd in eenvoudiger systemen. Hiertoe worden revertanten geisoleerd en in hun chromosomale samenstelling vergeleken met de oudercellen. Bovendien zal het onderzoek van adenovirus-getransformeerde ratteniercellen worden uitgebreid (in samenwerking met A. van der Eb, Leiden). Door fragmenten van niettumorigene genomen te combineren met fragmenten van tumorverwekkende genomen, hopen wij in staat te zijn een virusproduct te identificeren dat verantwoordelijk is voor het verschijnen van tumor-specifieke membraan oligosacchariden.

III.4 Tumorcelmembraan en

metastasering~

Wij hebben aangetoond dat een stap in de vorming van levermetastasen, nl. de infiltratie van tumorcellen in het le--

17

verweefsel, bestudeerd kan worden in vitro, in cultures van geïsoleerde hepatocyten waaraan tumorcellen worden toegevoegd (zie Annual Report, 1979). De studie van dergelijke interacties tussen tumorcellen en normale cellen wordt voortgezet, zowel m.b.v. bovenstaand model als met andere, te ontwikkelen metastasemodellen (III.4a). Binnen het hepatocyten model wordt het onderzoek toegespitst op: adhesie tussen tumorcel en hepatocyt (III.4b) en de rol van het cytoskelet van beide celtypen in de interactie (III. 4c) . III.4a In vitro modellen voor stappen in het metastasering.,êproces. E. Roos, K.P. Dingemans (Pathologisch Anatomisch Laboratorium, Universiteit van Amsterdam), I.V. van de Pavert Interacties tussen hepatocyten en verschillende tumor cellijnen zullen nader bestudeerd worden met transmissie- en scanning-electronenrnicroscopie. Hierbij wordt gedacht aan muize-L-cellen (zie III.3b) en aan een vergelijking van 1) verschillende marnrnatumor cellijnen met geïsoleerde, normale borstkliercellen, 2) lymfoïde tumorcellen met diverse typen normale lymfoïde cellen en 3) metastasevarianten met hoge affiniteit voor de lever met de tumor cellijnen waaruit deze varianten otwikkeld zijn. Waar mogelijk zullen parallelle in vivo studies worden verricht. Genoemde varianten kunnen verkregen worden uit andere laboratoria, maar zullen ook zelf geïsoleerd worden door herhaalde malen intraportaal inspuiten en kweken VQn cellen uit levermetastasen. M.b.v. het in vitro model zal getracht worden variantlijnen te maken door selektieve destructie van tumorcellen, die niet in de ~e.patocyten cultures binnendringen. Omdat het hepatocyten model een aantal technische nadelen heeft, zal getracht worden naast hepatocyten ook beter hanteerbare cellen te gebruiken, b.v. niercellen (zie III.3b) of gedifferentieerde hepatomacellen. Eerst zal echter moeten worden aangetoond dat interacties van deze cellen met tumorcellen vergelijkbaar zijn met die van hepatocyten. Er zal getracht worden meer in vitro modellen te ontwikkelen, b.v. met cellen uit de bijnier (een belangrijk doelorgaan van metastasering) of met endotheelcellen uit verschillende organen. Ook hier wordt parallel in vivo onderzoek gedaan.

18

III.4b De rol van adhesie-comp.onenten van normale cellen en tumorcellen in het metastasering2proces E. Roos en O. Middelkoop Uit waarnemingen in het hepatocyten model is gebleken dat adhesie van tumorcellen aan hepatocyten een eerste stap is in het infiltratieproces. Bovendien is gebleken dat een aantal tumor-cellijnen, die weinig invasief zijn in de intacte lever, niet hechten aan geïsoleerde hepatocyten. Doel van dit onderzoek is daarom het identificeren van moleculen op tumorcellen en hepatocyten, die bt:trokken zijn bij hun onderlinge adhesie, in de verwachting dat de aanwezigheid van dergelijke componenten op tumorcellen gecorreleerd kan worden met metastasevorming in öe lever. De te gebruiken technieken zijn: 1) remming van adhesie met fab-fragmenten bereid uit antisera tegen hele cellen, plasmamembranen of culturesupernatanten, en neutralisatie van die remming met gezuiverde componenten, geï:30leerd uit membranen of supernatanten, 2) binding van cellen aan dergelijke componenten, die geïmmobiliseerd zijn op Sepharose, 3) agglutinatie van getrypsiniseerde, gefixE~erde cellen met dergelijke componenten; en verder remming van adhesie met suikers, of na enzymatische modificatiE~ van het celoppervlak. Verscheidene van deze technieken zijn door anderen succesvol toegepast bij de studie van homotypisch en heterotypisch specifieke adhesie van verschi:~lende typen cellen, waaronder hepatocyten en kippe-e~)ryocellen.

III.4c De rol van het cytoskelet in het proces (zie Annual Re20rt, III.3c)

metasta3ering~

D.A.M. Mesland, E. Roos, C.A. Feltkamp, H. Spiele De rol van het cytoskelet in de in vitro interactie van hepatocyten en lymfosarcoom cellen zal worden bestudeerd. Er wordt begonnen met de beschrijving van het microfilamenteuze en microtubulaire cytoskelet van geïsoleerde hepatocyten. Hiertoe zal gebruikt gemaakt worden van immunofluorescente microscopie m.b.v antilichamen tegen verschillende spiereiwitten (in samenwerking met dr. W. van Raamsdonk, Zoologisch Laboratorium, Universiteit van Amsterdam), alsmede van scanning- en transmissie electronenmicroscopie van kritisch punt gedroogde cellen waarin door mechanische en/of chemische technieken het cytoskelet waarneembaar is gemaakt. Zowel vers gelsoleerde als 24 uur gekweekte, gespreide hepatocyten zullen worden bestudeerd,

19

omdat in tegenstelling tot deze laatste bij de eerste geen adhesie optreedt met lymfosarcoom cellen. Behoudens andere factoren zou hiervoor de organisatie van met de membraangeassocieerde componenten van het cytoskelet verantwoordelijk kunnen zijn. Getracht zal worden om eventuele veranderingen in het membraan-geassocieerde cytoskelet tijdens de spreiding en tijdens de invaginatie door lymfosarcoom cellen te correleren met veranderingen van partikel patronen in de membraan m.b.v. replica's van kritisch punt gedroogde cellen.

1II.5 Expressie en dynamiek van celoppervlak componenten bij leukemie in relatie tot de extracellulaire omgeving_ W.J. van Blitterswijk, P. Emmelot, C.A. FeItkamp, J. Hilgers, H.A.H. Hilkmann, G.J.C.M. de Veer, S. van derWaerden Aan de hand van celoppervlakte markers zal worden getracht de T-cel leukemieënvan de GR muizestam nader te karakteriseren om daarmee de plaats van blokkering of ontsporing in het normale differentiatie proces van lymfoïde cellen te bepalen. Er zal hierbij in toenemende mate gebruik worden gemaakt van monoclonale antilichamen, welke zo mogelijk in eigen laboratorium of elders ontvlikkeld worden' (zijn) tegen zowel oppervlakte (glyco)proteinen als glycolipiden. Hierbij ligt een duidelijk accent op internationale samenwerking. Op dit moment lijkt het gebrek aan kennis omtrent de normale vroege differentiatiestadia de beperkende factor te zijn bij de voortgang. Daarom is zuivering en karakterisering van deze cellen (bijv. NK cellen) gewenst. "Uitstoting" van rigide blaasjes, verrijkt aan verschillende plasmamembraancomponenten waaronder tumorantigeen, van het oppervlak van GRSL cellen, zoals gevonden in de ascites vloeistof van GRSL dragende dieren, lijkt van belang bij de interactie tussen tumorcel en immuunsysteem. Dergelijke blaasjes zijn ook bij menselijke leukemieën gevonden in serum en pleuravocht. Het is van belang snelheid van ontstaan en afbraak/afvoer van de blaasjes in vivo te bepalen in verband met de vraag of de fluïde toestand van het GRSL membraan (mede) het gevolg is van de blaasjesvorming of omgekeerd. Daarom zal ook worden nagegaan aan vroege (en primaire) en late GRSL passages of blaasjesvorming correleert met een bepaalde fluiditeit. Aangezien bij blaasjesvorming een concentratie van bepaalde membraan componenten optreedt, of vorming geschiedt vanuit pre-existerende rigide domeinen, zoals microvilli, zullen de laatste worden geïsoleerd en worden vergeleken met membraanblaasjes (che20

misch, enzymatisch, antigeenexpressie, electronen-microscopisch, microfilamenten adhesie) . Het verzamelen en bewerken van humane serummonsters zal voorlopig worden voortgezet (zoeken naar membraanblaasjes en analyse van lipoproteinen). Voor een verantwoorde vergelijking van normale en pathologische monsters zullen de te volgen procedures zo optimaal mogelijk worden gestandaardiseerd. De rol van cholesterol bij leukemie zal nader worden geevalueerd. Nagegaan zal worden of, en in welke mate de verhoogde membraan fluiditeit (verlaagd cholesterolgehalte) in leukemische cellen van invloed is op de expressie van oppervlakte antigenen. LDL (low density lipoprotein) zal uit sera worden geïsoleerd en gelabeld, waarna receptorbinding en opname (endocytose) zal worden bepaald in normale en leukemische cellen in relatie tot de membraanfluiditeit. Endocytose van LDL receptoren en verschillende andere receptoren gaat gepaard met de vorming van "coated pii:S" en "coated vesicles" (J.L. Goldstein et al., Nature 279: 679-685, 1979) structuren die electroner~icroscopisch als functie van de fluiditeit in normale en leukemische cellen kunnen worden bestudeerd.

111.6 Onderzoek naar van leukemie cellen.

membraangly~~ptiden

(gly~proteinen)

A.H.J. Kolk, J. van Ramshorst, W.J. van Blitterswijk en P. Emmelot Glycopeptiden van leukemische en normale cellen zlJn nu door ons met behulp van uitwisselings chromatografie in drie hoofdfracties te scheidenj neutrale, zure en sterk zure glycopeptiden. Met deze techniek kunnen we verschuivingen aantonen in de neutrale en zure glycopeptiden tussen Molt cellen en normale T-cellen. Kwalitative verschillen werden met deze techniek nog niet aangetoond.

De geisoleerde fracties zullen met gelfiltratie kolommen verder gescheiden worden. Met behulp van polyacrylamide gel electroforese kan dan nagegaan worden of een zuiver glycopeptide is verkregen. Glycopeptiden van een bepaald molecuulgewicht en lading zullen dan gebruikt worden om hetzij konijnen antisera hetzij monoclonale antistoffen hiertegen te verkrijgen (in samenwerking met A. Hekman, project 1V.2). Getracht zal worden de neutrale glycopeptiden met ion-uit-

21

wisselings chromatografie te scheiden, door in aanwezigheid van boraat te elueren. Ook de zure glycopeptide kunnen mogelijk onder dergelijke omstandigheden door complex vorming met boraat verder worden opgesplitst. Een eerste begin is gemaakt naar een onderzoek of "Reversed phase" en "Ion-paar" chromatografie mogelijkheden bieden voor de scheiding van glycopeptiden. De mogelijkheid om de drie hoofdfracties op te splitsen met affiniteits chromatografie zal w.orden nagegaan. Het langs chemische weg labelen van hetzij intacte cellen of geisoleerde glycopeptiden zal worden onderzocht. Hiermee zou de kostbare metabole labeling voor een deel vervangen kunnen worden. Oxidatie van glycopeptiden met perjood zuur gevolgd door f~duct~e met getritieerd borohydride en de labeling met C en H gelabeld azijnzuuranhydride komen hiervoor in aanmerking. Naast deze methoden om glycopeptiden radioactief te labelen zal ook verder gezocht worden naar de verbetering van de detectie van glycopeptiden met behulp van fluorescentie technieken.

22

Sektie IV

IVo I

TUMOR IMMUNOLOGIE

Immunologische onderzoekingen bij melanoom patienten

IVala enalb Spontane en tumorgeassocieerde cellulaire immuun reaktiviteit. J.E. de Vries, B. Honing, B. de Glopper, M. Poelen la)al Het onderzoek naar het mechanisme van spontane cytotoxiciteit (SC) zal worden voortgezet. Het accent zal hierbij komen te liggen op de regulerende funktie van monocyten en de rol van door geaktiveerde monocyten geproduceerde oplosbare faktoren hierin. Tevens zullen SC en antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) van met phorbolmyristaat acetaat en lipopolysaccharide geaktiveerde monocyten bestudeerd worden. la)a2 M.b.v. I x g celscheidings technieken zal er worden nagegaan of er bij tumorpatienten suppressor cellen voorkomen die SC en lymfocyten aktivatie d.m.v. mitogenen en in mixed lymphocyte cultures (MLC) onderdrukken. De aandacht zal hierbij speciaal gericht zijn op suppressor mechanismen die de verhoogde SC bij met BCG behandelde melanoom patienten onderdrukken. lb) Het onderzoek naar de generatie van specifiek cytotoxische T cellen in vitro zal worden voortgezet. Hierbij wordt gebruik gemaakt van technieken waarbij lymfocyten van melanoom patienten samen gekweekt worden met autologe tumorcellen in de aanwezigheid van mîtogeen vrije T cel groeifaktor en "feeder" cellen. Gezien de overeenkomst in vraagstellingen zal er een samenwerkingsverband zijn met projekt X.la.

IVald Potentiëring en induktie van natura 1 killer (NK)___ cel aktiviteit bij de muis. J.E. de Vries, H. Spits, B. de Glopper Het onderzoek naar de verschillen in het mechanisme van de induktie van NK cel aktiviteit d.m.v. BCG of tumorcellen zal worden voortgezet. Omdat in het eerste geval macrofagen en interferon een regulerende rol spelen, zal worden nagegaan of dit ook geldt voor de door tumorcellen geïnduceerde NK cel aktiviteit.

23

IV-Ie

c.

Melanoom antigenen

Vennegoor, A. Jonker, Ph. Rümke

Onlangs zijn we begonnen met het maken van somatische hybriden van muize myeloma cellen en milt cellen van met melanoom geïmmuniseerde muizen. Antilichamen die door deze hybriden worden geproduceerd zullen worden getest op een serie melanoom cellen en controle cellen, o.a. huidfibroblasten en met EBV geïmmortaliseerde B cellijnen van patien ten waarvan de tumor is gebruikt voor het maken van hybriden. Er zal worden gekeken naar antilichamen tegen membraan antigenen, intracellulaire antigenen en antigenen die in het kweekmedium worden afgegeven. Bovendien zal worden onderzocht in hoeverre deze monoclonale antistoffen reageren met immuuncomplexen in sera en granulocyten van melanoom patienten. Indien dit laatste mogelijk blijkt, zal worden geprobeerd of er een radioirnrnunoassay kan worden opgezet om tumorgeassocieerde antigenen te meten bij melanoom patienten met immuuncomplexen.

IVo2

Membraan antigenen van menselijke leukemie cellen.

A. Hekman, J.J. Sein Op grond van de huidige kennis van celmembraan markers van leukemie cellen lijkt het aannemelijk dat het "membraan fenotype" van een leukemie cel een weergave is van het stadium waarin de normale differentiatie geblokkeerd is. Bestudering van de membraan antigenen van leukemie cellen kan dan niet alleen leiden tot een verfijndere herkenning van verschillende leukemie typen, maar ook een bijdrage leveren tot de kennis van de normale differentiatie antigenen van de lyrnfoide differentiatie reeks, speciaal van celtypen die moeilijk rechtstreeks te bestuderen zijn. De nu beschikbare antisera tegen (frakties van) Molt cellen zullen daarom op beide aspekten worden onderzocht. Ten eerste zullen andere leukemische cellijnen en cellen van leukemie patienten worden gebruikt om het reaktie patroon na absorptie met normale cellen vast te stellen. Ten tweede zullen de antisera na absorptie met B lymfocyten en B cellijnen worden getest op hun reakties met normale T cel subpopulaties. Voor de karakterisering van de betreffende antigenen worden in hoofdzaak 2 benaderingen gebruikt: preparatieve isolatie d.m.v. affiniteitschromatografie, en gel electroforese van immuunprecipitaten. In samenwerking met A. Kolk (projekt III.6) zal begonnen worden met het maken van monoclonale antistoffen d.m.v. "hybridomen". Hiervoor zal in eerste instantie de Molt cellijn worden gebruikt wegens de hiermee verkregen kennis en ervaring. In samenwerking met F. Vyth en J. de Vries

24

(projekt X.la en IV.lb) zullen antistoffen worden gemaakt tegen de door hen ontwikkelde T-CLL lijn. Hierbij zijn andere typen T cellen in kontinue kweek ter beschikking als test en controle cel.

IV-3 Cellulaire en humorale immuun reaktiviteit tegen neuroblastoom geassocieerde antigenen. H. Spits, B. de Glopper, J.E. de Vries -De ervaring en de kennis die zijn opgedaan met de generatie van cytotoxische T lymfocyten (CTL) tegen alloantigene B cellen (zie Annual Report 1979) zullen worden toegepast in een vergelijkbaar systeem waarin neuroblastoom cellen als stimulator cellen gebruikt zullen worden. In eerste instantie zal onderzocht worden onder welke kondities in allogene mixed lymphocyte tUmor cellcultures CTL's tegen neuroblastoom cellijnen geïnduceerd kunnen worden. In vitro geïnduceerde GTL's zullen met T cel groeifaktor en "feeder" cellen (bestraalde lymfoblastoide B cellen) in kweek gebracht worden. Het zal wellicht nodig zijn de tegen neuroblastoom gerichte CTL's te klonen om lymfocyten in handen te krijgen die alleen neuroblastoom geassocieerde antigenen kunnen herkennen. Verder zal onderzocht worden of bij neuroblastoom patienten suppressor cellen voorkomen, die de cytotoxische reaktie van CTL's tegen neuroblastoom cellen kunnen remmen. In tweede instantie zal worden nagegaan of lymfocyten van neuroblastoom patienten ook gesensitiseerd kunnen worden tegen autologe tumorcellen. -Onlangs is er in nauwe samenwerking met projekt IV.le een begin gemaakt met.de produktie van specifiek tegen neuroblastoom gerichte monoclonale antistoffen.

IV-7 Het mechanisme van l~fadenop'athie na chronische toediening van dip'henylhydantoine in muizen. H. Gleichmann, F. Reinders Het tot nu toe verrichte onderzoek heeft aangetoond dat lymfoide cellen zodanig door diphenylhydantoine (DPH) veranderd kunnen worden dat syngene lymfocyten ze als "nietzelf" herkennen. Afhankelijk van de experimentele opzet konden na toediening van DPH zowel proliferatie van lymfoide cellen geïnduceerd worden, als suppressie van de reaktie op een verdere injektie met DPH of met DPH behandelde syngene cellen.

25

De volgende vraagstellingen zullen worden onderzocht: -I Nagaan of de popliteale lymfklier (PLK) reaktie op s.c. injektie van DPH door loci van het histocompatibiliteitscomplex gekontroleerd wordt. -2 Door bepaling van de opname van i.v. toegediend 3H-thymidine of 125rUdR, aantonen of de PLK reaktie na s.c. injektie van DPH door proliferatie van cellen wordt veroorzaakt. -3 Na s.c. toediening van 14C-DPH zullen lokalisatie en kinetiek van de binding van DPH onderzocht worden met behulp van autoradiografische technieken op coupes van PLK. -4 Om de suppressieve mechanisme(n) te kunnen bestuderen, die door i.p. behandeling met DPH in muizen kunnen ontstaan, worden transfer experimenten met lymfoide cellen enjof hun oplosbare produkten uitgevoerd. -5 PLK assays met niet-Iymfoide cellen die in vitro met DPH behandeld worden. Zijn deze cellen ook in staat PLK vergroting te induceren? -6 Onderzoeken of een bepaalde subpopulatie van lymfoide cellen het meest geschikt is om PLK reakties te induceren. -7 Voortzetting van de follow-up studies om na te gaan in welke mate chronische toediening van DPH B cel stimulatie en ernstige lymfadenopathie kan induceren.

26

Sektie V. VIROLOGISCHE FACTOREN BIJ HET ONTSTAAN VAN MAMMATUMOREN BIJ DIER EN MENS V.l Moleculaire biologie van RNA tumorvirussen R. Michalides, E. wagenaar, L. van Deemter, R. Nusse, L. Grijpvink-de Vries. Het ligt in de bedoeling de komende periode de structuur van de endogene MTV-DNA sequenties en de regulatie van de expressie van deze sequenties nader te bestuderen. Eveneens wordt een aanvang gemaakt met de structuuranalyse van het MTV genoom. el Nu uit vorig onderzoek bekend is welke MTV-DNA provirale sequenties vertegenwoordigd zijn in de Mtv-inductiegenen Mtv-l, -2, en -3, wordt dit jaar onderzocht welk mechanisme ten grondslag ligt aan het tot expressie komen van deze MTV-DNA sequenties in het targetorgaan, de melkklier. Hierbij worden 2 lijnen gevolgd: ea De overige, niet tot expressie te brengen MTV-DNA provirale sequenties zouden incompleet kunnen zijn. Hiertoe worden de restrictie-enzym fragmentatiekaarten van deze MTV-DNA sequenties met elkaar vergeleken. eb De rondom het MTV-DNA provirus gelegen cellulaire DNA sequenties worden gemodificeerd (b.v. gemethyleerd) bij die sequenties die tot expressie worden gebracht. Beide mogelijkheden worden m.b.v. restrictie-enzym analyse nagegaan. e2 In het MTV systeem z~Jn er 2 actieve messengers, het 35-S en het 24-S MTV-RNA. Het 35-S MTV-RNA levert het gag genproduct op, het 24-S MTV-RNA het env genproduct. Nu zijn er afwijkende systemen waarbij wel gag genproducten, maar geen env genproducten worden aangetroffen, b.v. in de stammen GR/Htv-2- en C57BL. Nagegaan wordt nu of in die systemen beide messenger MTV-RNA's, dan wel enkel een type MTV-RNA wordt gemaakt. . e3 Moleculair biologische analyse van het MTV genoom. In het bijzonder de volgende details: ea splicing sequenties in het MTV-RNA genoom; eb identificatie van operator en promotor sequenties inhet MTV-RNA genoom. Het MTV-RNA systeem biedt de mogelijkheid om bij verschillende MTV's na te gaan of de splicing sequentie binnen een groep van nauw verwante RNA's (MTV's) gehandhaafd blijft. In het MTV systeem zijn er 2 actieve messenger RNA's, het 35-S MTV-RNA dat bij in vitro translatie het gag genproduct en het 24-S RNA dat het env genproduct oplevert. Het 24-S MTV-RNA is afkomstig van het 35-S MTV-RNA, waarbij via een splicing mechanisme een gedeelte van het MTV-RNA genoom wordt 'uitgeknipt'. Het 5' einde van het genoom, dat de promotor en waarschijnlijk een operator bevat, is in beide messengers aanwezig. Dit onderzoek vereist de introductie van RNA sequentie analyse en recombinant DNA

27

technologie. Eén en ander wordt dit jaar aangevangen. -4 Virale eiwitten De glycosylering en fosforylering van de MTV eiwitten zal nader bestudeerd worden. In het bijzonder de gastheercelafhankelijkheid van de glycosyleringen. Gepoogd zal worden de mate van glycosylering te beïnvloeden door de groeicondities van de cellen te veranderen, b.v. serumconcentratie. Verder zal onderzocht worden in hoeverre de suikergroepen van de in kattecellen vermeerderde MTV varianten verschillen van de originele viruspreparaten. Dit kan aanwijzingen opleveren over het mechanisme van de virusinfectie, en de betrokkenheid van suikergroepen hierin. Getracht zal worden het proteine kinase van MTV te zuiveren, alsmede het belan~­ rijkste fosforeiwit, p21. Van het proteine kinase zal onderzochtworden in hoeverre het een virusgecodeerd enzym is. 85 MTV en cel trans formatie of tumorinductie M.b.v. tweedimensionale electroforese zal de eiwitsamenstelling van melkkliercellen, mammatumorcellen en virusgeinfecteerde cellen worden bestudeerd. Tumorspecifieke virale antigenen zullen m.b.v. eiwitblotting worden onderzocht. Voor deze techniek is het niet nodig dat de cellen t.b.v. immunoprecipitatie worden gelabeld. Men vermijdt dan het gebruik van weefselkweekcellen, die gemakkelijk gelabeld kunnen worden, maar hun getransformeerde karakter hebben verloren. Nu kunnen ook in echte mammatumorcellen tumorspecifieke antigenen worden onderzocht. 86 Interactie MTV - andere carcinogenen Opgezet wordt een experiment waarbij de invloed van MTV en hormonen op de tumorincidentie en de virusexpressie in de cs 7BL stam zal worden nagegÇl.an. -7 MTV varianten De virusvarianten uit C57BL, BALB/C en 020 stammen (Dr. J. Links) zullen worden vergeleken met de meer bekende MTV varianten (C3H, GR, RIII).

V.2 De biologie van de mammatumorvirussen Ph. Hageman, J. Calafat, A. Timmermans, A.A. Verstraeten, K. Weijer, D. Atsma, E.M. Groeneveld, L. van der Mispel. -I MTV in de muis Passieve immunisatie in de muizestammen C3H, C3Hf en BALB/c. Huebner et al. konden door toedienen van de IgG fractie van gei ten die tegen AKR-MuLV waren gevaccineerd de leukemie in AKR terugdringen van 60% op 300 dagen tot 4% op 300 dagen. Frensdorff en Wald gaven IgG uit geit-anti MTV aan pasgeboren RIII muizen. Zij vonden een reductie van 100% mammatumoren op 9 maanden in de dieren met controle IgG naar 25% mammatumoren in de dieren die anti MTV hadden gekregen.

28

In pilot experimenten zal worden nagegaan of een dergelijke passieve immunisatie ook werkt bij endogene MTV varianten. De proeven zijn uitvoerig beschreven in het vijfjarenplan van sectie V. 02 Mammatumoren in de rat Experimenten over het voorkomen van met MTV kruis reagerende antigenen in rattemammatumoren en rattemelk zullen worden afgerond. De biologische activiteit van het preparaat uit de permanente rattemammatumorcellijn zal worden getoetst in U ratten en in BALB/c muizen. 03 Mammatumoren van de mens De specificiteit van de reactie met anti MTV sera in dunne coupes van ingebed menselijk mammatumormateriaal zal worden bestudeerd. Bij gebleken geschiktheid zal deze test op grotere series mammatumoren worden uitgevoerd. Er zal worden nagegaan of een correlatie bestaat met het voorkomen van andere markers, zoals CEA, a en B HCG, hormoon receptoren, eventueel met het Thomson-Friedenreich antigeen, maar ook met de prognose, of het histologische type van de tumor. Om de specificiteit van de test na te gaan zal van een beperkte serie materiaal worden nagegaan of er een correlatie bestaat tussen metimmuunperoxidase test gevonden reactie en hetgeen in de RIA wordt aangetoond. Het werk over deze nietvirale antigenen wordt verricht in de werkgroep immuun-histochemie. . Van enkele grotere melkpools zullen met MTV kruis reagerende fracties worden bereid ten einde deze verder te karakteriseren. Enkele monsters zullen ter vergelijking worden opgezonden aan Dr. Arthur, Frederick Cancer Institute, die typen RIA's voor HTV antigenen kan uitvoeren die nog niet in ons instituut beschikbaar zijn. . Er wordt een methode uitgewerkt gebaseerd op het werk van Herbrink·et al. (Caneer Res., 1980, in press) om in serum en in pleuravocht van mammacarcinoompatienten antistof~en tegen MTV aan te tonen met een meer dan 100x grotere gevoeligheid dan voorheen mogelijk was. Het karakteriseren van kruis reagerende antigenen, zoals aangegeven in het Annual Report 1979, zal worden voortgezet. Voor de detectie van bovengenoemde kruis reagerende antigenen zal, naast de reeds gebrui~te radioimmunoassay, een enzym-immunoassay ontwikkeld worden (Proc. Nat. Acad. Bei. 76, 5336, 1979) I waarmee de gevoeligheid mogelijkerwijs met een factor 100 à 1000 verhoogd kan worden. 04 Mammatumoren bij de kat Hoewel door ons in 60% van de mammatumoren zowel virusdeeltjes als met FeLVen RD-114 kruisreagerende antigenen zijn aangetoond, is er tot nu toe geen virale etiologie van deze tumoren aangetoond. Om diverse redenen blijft het interessant/belangrijk om een mogelijk virale etiologie van mammatumoren bij de kat te onderzoeken, zij het op kleine schaal. EM onderzoek is hierbij onontbeerlijk. De redenen hiervoor zijn:

29

-mamma tumoren bij de kat komen in Nederland vergeleken met de rest van de wereld frequent voor. In de regio Amsterdam + 25 maligne mammatumoren/jaar. -Er bestaat een goed inzicht betreffende histologie en nistologisch gedrag van deze tumoren. -Het onderzoek van mammatumoren bij de kat ligt in de 'historische' lijn van het onderzoek van het NKI. -Het is bewezen dat er virus (sen) in 60% van de mammatumoren van de kat aanwezig is (zijn). -Sommige kweken van marnmatumoren van de kat scheiden in het medium deeltjes met reverse transcriptase activiteit af (niet met EM waargenomen) . Bij verder onderzoek wordt gedacht aan co-cultivatie van kattemammatumorcellen met baby mouse kidney cells en baby cat kidney celis.

V.3 Onderzoek naar het ontstaan van lymfosarcoom/leukemie door tumorvirussen K. Weijer, J. Calafat -Leukemie van de kat _a Verder onderzoek naar de ontwikkeling van een veilig vaccin tegen FeLV, dat voldoende bescherming biedt tegen infectie met FeLVen tegen ontwikkeling van lymfosarcoom/ leukemie of andere me"t FeLV geassocieerde ziekten. Tot nu toe zijn er nog geen goede vaccins tegen FeLV ontwikkeld. Vaccinatie van katten tegen kattenleukemie heeft niet alleen een duidelijk praktisch nut, maar dient tevens als modelsysteem voor de vaccinatie van andere zoogdieren tegen de werking van een leukemievirus. Dit modelsysteem is nu nog belangrijker geworden vanwege het feit dat non-producer lymfosarcoom/leukemie b~j katten hoogstwaarschijnlijk ook door FeLV veroorzaakt wordt. Deze 'non-producer' situatie zou ook bij de mens en hond mogelijk kunnen zijn. De resultaten van de vaccinatie experimenten zullen onderzocht worden door het aantonen van antistoffen gericht tegen FeLV antigenen en/of FOCMA. De testen die hiervoor beschikbaar zijn of worden: RIP-test voor FeLV-P30, RIP-test voor totaal FeLV, (fluorescentie) neutralisatietest en FOCMA-test. Als antistoffen kunnen worden aangetoond, zal virus-challenge worden toegepast door de gevaccineerde katten in éen ruimte te plaatsen samen met FeLV positieve katten. -b Met bovengenoemde testen zijn tot nu toe geen antistoffen aangetoond in het bloed van verschillende groepen mensen (mensen die wel of geen contact hebben gehad met FeLV positieve of -negatieve katten, leukemiepatienten) • Gepoogd zal worden deze testen gevoeliger te maken door het humane serum vooraf te concentreren. Met het afnemen van grotere hoeveelheden bloed (+ 100 mI) bij mensen is reeds een begin gemaakt. -c Serumtherapie en/of passieve immunisatie

30

Deze wordt o.a. toegepast om de kwetsbare periode v60r de ontwikkeling van het eigen immuunapparaat te overbruggen. Dit onderzoek vindt plaats i.s.m. Dr. V. Mönnig van het Institut für Virologie der Tierärztlichen Hochschule te Hannover.

\

31

... . ~

.32

Sektie VI GENETISCHE FACTOP.EN BIJ HET ONTSTAAN VAN BIJ DIER EN IImNS

TmlO~.EN

VI.l Genen die de inductie en replicatie van het mammatumor virus beïnvloeden J. Hilgers, J. Hilkens, R. Michalides, R. van Nie, R. Nusse, A.A. Verstraeten, E. Armée, A. Bakker-Kerkhof, F. Buysvan der Schaaf, E. van Deernter , E.M. Groeneveld , V. Kroezen, P. Moerkerk, J. de Moes,J.M. van de Rijn, A. Sonnenberg De klassieke genetica heeft tot nu toe drie genen voor endogeen MTV in de muis aan het licht gebracht, nl. Mtv-l (chromosoom 7, aanwezig in C3Hf en DBAf) , Mtv-2 (chromosoom 18, aanwezig in GR,en Mtv-3 (chromosoom 11, aanwezig in GR en GR/Mtv-2-). Mtv-l is verantwoordelijk voor late mammaturnoren, Mtv-2 voor vroege mammatumoren en Mtv-3 is niet betrokken bij de mammaturnorigenese. Er zal in de naaste toekomst gezocht worden naar meer Mtv genen, zoals in de SL stam (Mtv-4) en in de SHNf stam (Mtv-5). Indien er na vollediqe screening van onze stammen noq een qevonden wordt met 100% expressie van MTV antiqeen in de melk, zal ook hierin qezocht worden naar Mtv qenen. De analyse van genen bij de muis die expressie controleren van endogene retrovirussen, met name van het mammatumor virus, zal worden voortgezet m.b.v. klassieke genetische methoden. De nadruk zal niet meer vallen op de ontwikkeling van congene stammen voor dit soort loci, maar meer op de creatie van zogenaamde recombinant ingeteelde stammen. Het voordeel hiervan is dat niet alleen de genen voor expressie van de endogene virussen gelocaliseerd kunnen worden, maar ook de genen die resistentie dan wel gevoeligheid van het dier voor het betreffende oncogene virus controleren. Terwijl de congene stammen meer geschikt zijn om het effect van éen (vaak sterk dominerend) gen op de turnorigenese te bestuderen, zijn de RI. stammen speciaal ontworpen om de turnorigenese onder invloed van meerdere (meer gelijkwaardige) genen te bestuderen. Genen die resistentie tegen MTV geïnduceerde ~ammaturnori­ genese beïnvloeden, zullen speciaal bestudeerd worden met Bailey's RI stammen tussen BALB/c en C57BL/6. Dit is een voortzetting van een gedeelte van het werk van Mühlbock en Dux. Hiertoe zullen muizen van deze stammen gefosterd en ingespoten worden met een aantal varianten van het MTV, zoals C3H-MTV, GR-MTV, WLL-MTV, RIII-MTV,etc. De moleculaire hybridisatie techniek, waarbij gebruik gemaakt wordt van restrictie enzymen, is gebleken zeer bruikbaar te zijn om MTV-DNA sequenties op te sporen in het genoom van de muis .. Het is theoretisch nu mogelijk om ieder MTV-DNA stukje in iedere muizestarn te localiseren. Dit kan het snelst gebeuren met de zogenaamde RI stammen, waarvan de genetische kaarten reeds bekend zijn. De eerste combinatie van stammen waaraan dit zal gebeuren is de serie van Bailey tussen C57BL/6 en BALB/c. Er zal getracht worden voor dit onderzoek meer RI series te verkrijgen en het zal verder gedaan worden aan de RI stammen die in het NKI geproduceerd zullen worden.

33

Er zullen in ieder geval twee series RI stammen worden ontwikkeld, nl. _a tussen BALB/C en STS, omdat de laatste stam resistent is tegen iedere vorm van mammatumor inductie (met virus, met hypofyse in nier en spontaan), terwijl de eerste stam spontane mammatumoren krijgt en zeer gevoelig is voor hormonale inductie alsook virale inductie. De genetica van de resistentie tegen de drie vormen van mammatumor inductie kan dan in een model vergeleken worden. Een en ander zal gepaard gaan met het bepalen van de MTV-DNAsequenties in de ouderlijke stammen en de RI derivaten. -b tussen GR en MOL3, omdat deze stammen genetisch zeer ver van elkaar liggen, zodat de RI serie gebruikt kan worden voor vele doeleinden. In dit geval kan natuurlijk ook de correlatie tussen Mtv-2 en mammatumorigenese bestudeerd worden, terwijl daarnaast ook de genetische controle van het ontstaan van thymus lymphomen bekeken kan worden. De GRSL x Chinese hamster somatische celhybriden blijken uitermate geschikt voor de mapping van genen die betrokken zijn bij de virale mammacarcinogenese en leukemogenese. De localisatie van MTV-DNA met behulp van somatische celgenetica zal worden voortgezet aan de EGR hybriden en aan een nieuw te creëren serie van hybriden tussen E36 en primaire GR mammatumor cellen. Zeer belangrijk lijkt het om de zogenaamde 'specifieke' plaatsen van de geamplificeerde MTV-DNA sequenties in de EGR hybriden te localiseren. Een van de theoretische problemen die de aandacht verdienen in dit verband is waarom in mammatumoren géen amplificatie optreedt, of wél amplificatie maar dan naar willekeurige plaatsen in het genoom, terwijl in de GR thymus leukemieën amplificatie optreedt naar specifieke plaatsen van het GR genoom. In de toekomst zullen we ons meer met de expressie van differentiatie antigenen in mens-muis hybriden gaan bezighouden. Hierbij denken we aan twee systemen. -I Muizen mamma(tumor) cellen worden gefuseerd met menselijke mammatumor cellen, met als' doel het identificeren van genen noodzakelijk voor de expressie van differentiatie antigenen, zoals specifieke mamma-epitheel antigenen (b.v. het milkfatglobule antigeen van Ceriani) en van genen voor het mammatumor specifieke glycoproteine (MTGP van Edgingtom. Door fusies uit te voeren binnen de differentiatie lineage nemen we aan dat de expressie van specifieke differentiatie antigenen behouden blijft. Eventueel nieuwe mammatumor of epitheel specifieke antigenen hopen we op te sporen met nieuw te genereren monoclonale antilichamen. -2 In een ander systeem zal gebruik gemaakt worden van menselijke chromosomen segregerende hybride tussen muizen T lymphomacellen en menselijke T lymphocyten en T leukemieën. Het doel hiervan is de bestudering van de genetische achtergrond van reeds bekende T-cel differentiatie markers zoals Hu Tla, E rosette receptors, etc. en mogelijke nieuwe markers te detecteren met monoclonale antilichamen. Beide projecten moeten ons uiteindelijk meer inzicht verschaffen over de genetische achtergrond van het differentiatieproces. Eventuele nieuwe antigenen, detecteerbaar met monoclonale antilichamen kunnen gebruikt worden als diag-

34

nostische markers in de immunopathologie.

VI.2 Histocompatibiliteiten neoplasia P. Démant, D. Iványi, M. Oudshoorn-Snoek, M. Roos, L. Oomen, H. Daams, J. Calafat, R. Nusse Evenals in de voorgaande, jaren zullen zich in het onderzoek binnen het project twee hoofdlijnen aftekenen. Als eerste, het onderzoek naar de organisatie van de histocompatibiliteitsgenen en de regulatie van hun expressie, de structuur en functie van hun producten en indirect de evolutionaire krachten en mechanismen die leidden tot de huidige situatie. En als tweede, de studie naar de rol die de histocompatibiliteitsgenen spelen in de regulatie van de gevoeligheid en resistentie voor tumoren, waarbij hoofdzakelijk de modellen van de H-2 afhankelijke resis,tentie voor mammatumoren in MMTV geïnfecteerde dieren, de spontane reticulo-endotheliaIe tumoren, longtumoren en MuLV infecties gebruikt zullen worden. Het Uiteindelijke doel is inzicht te krijgen in deze phenomenen in het kader van de functie van de MHC producten. De analyse van de structuur en producten van het MHC zal zich concentreren op de K, D en S regio; hieraan heeft onze groep in het verleden-reeds belangrijke bijdragen geleverd. De nieuwe moleculen die door deze regio's geproduceerd worden en die onlangs door ons beschreven zijn, zullen in een aantal haplotypes geanalyseerd worden met als doel de moleculaire organisatie van het systeem van de H-2 antigenen ,in zijn algemeenheid te ,begrijpen. De monoclonaIe antilichamen zullen in meerdere mate gebruikt gaan worden, ook in de functionele studies met betrekking tot deze regio's. Onder deze studies vallen ook de analyses van de mogelijkheid dat de MHC producteninqebouwdworden in virionen van MTV en MuLV, de ruimtelijke 'relatie tussen MHC producten en virale antigenen op het celoppervlak en de rol hiervan in 'cell-mediated' antivirale immuniteit. Onderzoek naar de onlangs ontdekte abnormale expressie van histocompatibiliteitsgenen op tumorcellen zal in combinatie met onderzoek naar de normale expressie tot verder begrip moeten leiden van dit phenomeen, dat van,het allergrootste belang is voor het begrijpen van de genetische structuur van het nmc en de genen die de expressie reguleren van de MHC producten, alsook voor het verband tussen de werking van deze genen en het proces van retrovirale infectie en maligne transformatie. Dit onderzoeksgebied staat op het ogenblik in de belangstelling van een groot aantal onderzoekers, zoals blijkt uit het feit dat er binnen 15 maanden tenminste 3 gespecialiseerde internationale symposia aan dit onderwerp gewijd zijn. Wij zijn van plan ons toe te leggen op enkele geselecteerde modellen die voor dit systeem relevant zijn. We zullen de experimenten uitvoeren in nauw contact met de groep van het London Hospital Medical College. Van onschatbare waarde binnen dit programma zal de directeanalyse van het MHC genoom zijn, gebruik makend van gen 'cloning' technieken. Andere functionele aspecten van het MHC

35

in relatie tot de oncogene se die bekeken zullen worden, zijn de regulatie van immuunresponse bij MTV en MuLV infectie en bij tumordragende muizen en het verband tussen histocompatibiliteitsgenen en de hormonale factoren en tumorgenese. Een nieuwe waardevolle aanvulling op dit programma is de analyse van de S regio (complement) genen die van belang zijn voor een aantal van de bovengenoemde problemen, in het bijzonder de locatie en de functie van regulerende en structurele genen, de interactie met hormonen en functionele ontleding van de MHC-gekoppelde immuno-idio- syncrasia's, welke geassocieerd zijn met toegenomen gevoeligheid voor MuLV infectie. Niet te scheiden van deze studies is de verdere genetische ontleding van het histocompatibiliteitsgenoom door middel van productie e~/of analyse van nieuwe of voorheen onbekende haplotypes. Dit werk is gekoppeld aan het maken van nieuwe congene muizestammen, waardoor het mogelijk wordt de gevoeligheids- en resistentiefactoren beter te localiseren. In de afgelopen 2 jaar zijn in het NKI verscheidene ~lliC-gekoppelde factoren gevonden, die invloed uitoefenen op de differentiatie. Naast het feit dat zij interessante genetische markers zijn, zullen zij hulp kunnen verlenen bij de studie naar de relatie tussen genre.qulatie tijdens de differentiatie en maligne transformatie voor twee belangrijke problemen in de algemene - en tumorbiologie.

VI.4 Incidentie en morphologie van spontane tumoren in muizen van ingeteelde stammen en van congeen resistente stammen M.A. van der Valk, A. Dux, R. van Nie Dit project zal in de toekomst meer omvatten dan de huidige titel aangeeft. Hierbij zal een grotere nadruk vallen op de morphologische typering en de experimentele pathQlogie. ol Controle/screening bepaling van tumorincidenties bij: - geselecteerde nieu'ioJ ingevoerde stammen, - van een aantal geselecteerde stammen zal de tumorincidentie in het G-gebouw verg.eleken worden met de oude gegevens verkregen in de Sarphatistraat, - AXC rat: bijzondere tumoren, dysgenesie en acrenesie van organen. -2 Bewerking van histologisch materiaal afkomstig van geselecteerde oude proeven De nadruk zal vallen op de mammatumoren en lymphomen. Bewerking van de reeds aanwezige mammapreparaten afkomstig van verschillende muizestammen. Verschillen in groei en differentiatie. -3 Histopathologische steun aan projecten binnen ons instituut. -4 Uitbreiding en verdieping van de volgende onderwerpen: - vergelijkend onderzoek mammatumoren (muis/rat/hond/kat/ mens) ,

36

- nadere typering lymphomen

-klassifikatie Kiel -antigeen determinatie -peroxidase/antiperoxidase techniek - nauwgezette verouderingsproeven zonder arbitraire leeftijdslimiet. -5 Experimenteel onderzoek zal verricht worden omtrent: - thymusinductie in de naakte muis, - differentiatie biologie van het complex adenoma van de hond in de naakte muis/mamma/kraakbeen/been) , - embryologie.

VI.5Genetische karakterisering, controle en Rreservering_ van ingeteelde stammen van muis en rat J. Hilgers, P. Démant, J. Hilkens, R. van Nie, R.J. Nikkels, G. Röpcke, A. Timmermans -I Controle op ziekteverwekkende agentia: bacteriologische controle, virologische controle, pathologische controle. -2 Genetische karakterisering van de muizen- en rattenstammen: specifieke genen, H2 haplotype, kleurgenen, biochemische markers, enz. -3 Preservering: danhouden stammen in vivo, bewaren van bevruchte eicellen in vloeibare stikstof.

37

38

Sektie VII. HORMONALE FACTOREN BIJ HET ONTSTAAN EN DE GROEI VAN TUMOREN VII.la De invloed van het GR mammatumorvirus (Mtv-2) hormoongevoeligheid van de mamma

op~

G. Röpcke, A.A. van der Gugten, H.G. Kwa, M. Sluyser, A.A. Verstraeten, T.F. Demmenie, S. Evers, C. de Goeij, E.M. Groeneveld, T.M. Luub. Het is onduidelijk of tijdens de inductie van mammatumoren in de GR muis de transformerende werking van het virus wordt uitgeoefend bij een verder normale hormonale regulatie, dan wel of de transformerende werking berust op verandering van de hormonale regulatie, b.v. het gevoeliger maken van de cel voor de hormonale stimuli. Om hierin enige duidelijkheid te brengen zullen bepalingen van hormoonspiegels in het plasma en van hormoonreceptoren in de melkklier worden uitgevoerd van vrouwelijke dieren van de GR stam (Mtv-2+) en de GRz(congeen) stam (Mtv-2-). Omdat een mogelijk verschil tussen GR en GRz(congeen) veroorzaakt kan zijn door de BlO achtergrond van GRz(congeen) (m.a.w. de congeniciteit is nog geen 100%), wordt ook de BlO stam bij dit onderzoek betrokken. Primair komen oestrogenen, progesteron en prolactine, die alle een rol spelen bij het manifest worden van de tumor, in aanmerking voor het onderzoek. Er worden twee groepen van experimenten g'evormd. 1. Zwanqere dieren: vergelijken van de hormoonspie:gelS en receptor bestand op dag 8-10 van de eerste zwangerschap (d.w.z. vóor het verschijnen van een voorstadium ~an de mammatumor), en op dag 18-20 van de zwangerschap (d.w.1z. bij aanwezigheid van early mammary tumors; uiteraard [n de GR stam) . 2. Geovariëctomeerde dieren, die behandel~ worden met· oestron + progesteron, oestron of progesteron, met of zonder hypofyse implantaat. I De verdeling van het experimentele werk verloopt zoals'vermeld in Werkplannen 1980. I

VII.lb De invloed van hormonen, betrokken bij de carcinogenese van de melkklier in de rat, op de prollactine receptoren A.A. van der Gugten, T.F. Demmenie, T.M. luub ol Karakterisering van het Plasmamembraani preparaat. Ge-

zien het aantal dieren dat bij het onderzoek naar de prolactine receptoren is betrokken, moet worren uitgegaan van de eenvoudig te bereiden plasmamembraan p~eparaten (100.000 x g pellet van het 15.000 x g supernatanti van het te onderzoeken orgaan). De kwaliteit van het preparaat uitgaande van vers of ingevroren materiaal is ident~ek. Het preparaat zelf is heterogeen van samenstelling. De bindingskarakteristieken van dit preparaat zijn uitgaandl van ingevroren materiaal identiek met die van meer gedeflinieerde plasma-

I

39

membraan preparaten (Methods in Enzymology 31: 75, 1974). Het vergelijken tussen beide methoden van isoleren zal ook met vers materiaal worden uitgevoerd, om te zien of ook hier de bindingskarakteristieken overeenkomen. -2 De invloed van fysiologische schommelingen, of geïnduceerde schommelingen van de plasma prolactinespiegel op de bindingsplaatsen voor prolactine zal worden voortgezet (dag/nacht ritme; oestrus-cyclus, castratie, oestrogeen behandeling) .

-3 De rol van progesteron bij het ontstaan van mammatumoren is niet duidelijk. Bij de muis werkt het synergistisch met prolactine (Röpcke & Boot). Gegevens die op de menselijke situatie betrekking hebben wijzen eerder een andere kant uit. gebruik van een progestageen bevattende pil zou beschermend werken tegen het ontstaan van benigne mammatumoren (MRC rapport in Lancet, 1979). Bovendien wordt bij premenopausale vrouwen de risico factor om borstkanker te ontwikkelen groter naarmate de progesteronspiegel in het plasma tijdens de luteale fase lager is. Bij de rat tenslotte wordt bij (met kortdurend hoge dosis oestron behandelde) dieren de (daarop volgende) uitgroei van de hypofyse en de stijging van de plasma prolactinespiegel geremd door progesteron behandeling. De mammatumor incidentie wordt evenwel niet beïnvloed. Nagegaan zal worden of de werking van progesteron tweeledig is, d.w.z. of naast de remmende invloed op de prolactine afgifte, progesteron ook de mamma gevoeliger maakt voor prolactine (verhoging van het aantal receptoren) .

VII.2 Onderzoek naar de bijdrage van prolactine aan het ontstaan en de groei van borstkanker bij de mens H.G. Kwa, A.M.A. Sanders, F. Verhofstad In samenwerking met Dr. Ph. Strax (New York) en Dr. R.D. Bulbrook (Londen) zal getracht worden een richtlijn te vinden welke kan bepalen of vrouwen regelmatig moeten worden onderzocht met mammografie (op het voorkomen van borstkanker). Hierbij zijn in totaal 30.000 vrijwilligsters over een periode van 3 jaar betrokken, die door periodieke mammografie gescreend worden teneinde borstkanker in een vroeg stadium op te sporen (Strax, New York). Verder zal tijdens de eerste screening een serummonster worden afgenomen, tussen 17.00 en 20.00 u. Om de fase van de cyclus op het moment van afname vast te kunnen stellen zal de dag van de eerstvolgende menstruatie geregistreerd worden. Van de serummonsters uit de luteale fase van de cyclus zullen steroidhormoon- (Bulbrook) en prolactinespiegels (Kwa) worden bepaald. Het is te verwachten dat er binnen 5 jaar genoeg 'early stages of cancer' gevallen zullen zijn (door mammografische screening ontdekt) voor een retrospectieve analyse 40

van de relatie tussen de verschillende hormoonspiegels en het optreden van borstkanker. Voorts zal de samenwerking met Dr. P. Bruning en klinische medewerkers aan een longitudinaal onderzoek naar het 24uurs ritme van vooral prolactine, progesteron en enkele androgenen bij normale vrouwen, risicodragers en patienten met een marnrnatumor worden voortgezet.

VII.3 Onderzoek van steroidhormoon receptoren in relatie met het ontstaan en de groei van marnrnatumoren M. Sluyser, S.G. Evers, C.C.J. de Goeij Het onderzoek naar de reden waarom hormoon gevoelige marnrnatumoren bij de GR muis op den duur ongevoelig worden, zal worden voortgezet. Het mechanisme van progressie zal wor- . den bestudeerd, met name de vraag of de hormoon-onafhankelijke tumorcellen al vanaf het begin aanwezig zijn, of tijdens de groei van de tumor uit hormoonafhankelijke cel-' len ontstaan. Indien dit laatste het geval is, hoe verloopt dit proces? Welke factoren spelen een rol bij de selectiedruk waarbij de onafhankelijke cellen de overhand krijgen? Tevens zal worden onderzocht of tijdens de progressie cellijnen ontstaan die relatief meer resistent zijn tegen cytostatica, en zo ja, waar dit mee samenhangt. Wat zijn de eigenschappen van deze cellijnen? Het vergelijkend onderzoek tussen hormoongevoelige en ongevoelige marnrnatumoren van de GR muis zal worden voortgezet. Het is mogelijk gebleken om plasmamembranen uit dit tumormateriaal in redelijk zuivere vorm te isoleren. De preparaten zullen worden gebruikt ter bestudering van de membraansamenstelling, in casu de fosfolipiden en de mogelijke aanwezigheid van prolactine receptoren en H-2 antigenen. Ook zal worden onderzocht of er antigenen zijn die als markers kunnen dienen voor hormoon-gevoeligheid, ~esp. ongevoeligheid. De tumoren van de GR muis zullen ook betrokken worden bij een onderzoek naar de betrouwbaarheid van de cytochemische methode van S.H. Lee (Cancer 44: 1-12, 1979) ter bepaling van oestrogeenreceptor-positieve cellen in een marnrnatumor. De methode zal vergeleken worden met andere technieken. Tenslotte zal een poging ondernomen worden om monoclonale antilichamen te bereiden tegen oestrogeen receptor en progesteron receptor uit marnrnatumoren van de GR muis. Deze antilichamen zouden eventueel later ook gebruikt kunnen worden bij de bovengenoemde cytochemische bepaling.

41

VII.4 Modelonderzoek over combineren van hormonale en cytostatische behandeling van mammatumoren C. Benckhuijsen, R.P. Beurs, A. Timmermans Tijdens hormonale regressie stijgt in hormoongevoelige mammatumoren het gehalte van een aantal lysosomale enzymen, o.a. S-glucuronidase (zie Annual Report 1978 en 1979). Het aniline mosterd, dat als S-glucuronide van de gehydroxyleerde verbinding in het lichaam circuleert, wordt door Sglucuronidase geactiveerd. Ons onderzoek heeft tot doel na te gaan hoe er voor aniline mosterd behandeling optimaal profijt getrokken kan worden van dit verschijnsel, dat voor het overige nader bestudeerd wordt in project VIII.2 . • Hormonale aspecten Vastgesteld is dat in een kortdurend experiment tamoxifen behandeling van ratten met DMBA tumoren minder remissies (complete + partiële) gaf dan ovariectomie. Ook dat bromocriptine, hoewel werkzaam, geen synergisme toonde met ovariectomie of met tamoxifen, wat betreft % remissies na 3 weken. -Om het praktische klinische belang daarvan moet meer onderzoek worden gedaan over het gebruik van tamoxifen in plaats van ovariectomie als middel tot inductie van tumorregressie en van een stijging van lysosomale enzym(en). Met name ligt het in de bedoeling een eventuele herhaalbaarheid van het effect van tamoxifen na te gaan, bij hogere dosering. -De combinatie van anti-steroid met anti-prolactine behandeling wordt onderzocht om na te gaan of een snellere regressie (zie Annual Report 1979) gunstig is voor de inductie van lysosomale enzymen . • Cytostatische behandeling In verband met het tijdsbeloop in de stijging van lyso$omale enzym(en) na hormonale behandeling is het aangewezen het behandelingsschema voor aniline mosterd hieraan aan te passen. Hierdoor kan de effectiviteit van de combinatie behandeling beter worden nagegaan. Er doet zich vertraging voor door wat schijnt een verminderde gevoeligheid voor DMBA van de inteelt SD ratten van het NKI, samenhangend met het opnieuw kweken onder SPF condities in het nieuwe proefdierenverblijf. Het verbeteren van mogelijkheden tot inductie van hormoongevoelige mammatumoren bij SD ratten onder SPF condities wordt in samenwerking met de proefdierkundigen onderzocht.

VII.5 Hormonale risicofactoren en mammacarcinoom P.F. Bruning, H.G. Kwa, K. Jonker, J.P. Persijn, A.A.M. Har4 E. Engelsman, F.J. Cleton Het onderzoek is gericht op het vinden van hormonale facto-

42

ren gecorreleerd met mammacarcinoom bij de mens met speciale interesse voor de betekenis van een abnormale diurnale variatie van plasma-prolactine bij vrouwen 'at risk'. Meer specifiek betekent dit: verder longitudinaal onderzoek van de diurnale plasma-prolactine variatie bij risicodraagsters, normale vrouwen, vrouwen met mammaca'rcinoom of benigne proliferatieve lesies om te komen tot selectie van vrouwen 'at risk' voor verdere screening. Met de onderzoeksresultaten als uitgangspunt wordt gedacht aan een prospectief onderzoek waarbij vrouwen 'at risk' profylactisch worden behandeld met medicamenten die hetzij onvoldoende corpus luteum werking compenseren, hetzij abnormale plasma-prolactine variaties onderdrukken.

43

44

Sektie VIII

EXPERIMENTELE CHEMOTHERAPIE EN RADIOTHERAPIE

VIII.l De invloed van de interaktie van cytostatica met DNA op~proces van DNA replikatie. J. van der Steen, F.A.M. Buuron, C. Benckhuijsen

Zoals gerapporteerd in het Annual Report wijzen deresultaten van ons werk erop dat de groep van stikstofmosterd derivaten geen effekt heeft op de elongatie van nieuw gesynthetiseerd DNA maar dat daarentegen de initiatie van de synthese van primaire dochter-DNA fragmenten geremd wordt. Ook uit recente literatuur blijkt dat initiatie, d.w.z. het ontstaan van het DNA-eiwit komplex die leidt tot de vorming van een replikatie-vork, een uiterst kwetsbaar proces is dat door een grote verscheidenheid van cytostatische agentia verstoord kan worden. De aandacht zal derhalve gericht worden op de vroegst herkenbare stappen van DNA replikatie. el Getracht zal worden de analytische methode volgens Probst, waarmee replicerend DNA gescheiden wordt van inaktief DNA (probst et al., Biochim. Biophys. Acta 254:15, 1971) verder uit te werken voor kwantitatieve toepassing. Het replicerend DNA is gekarakteriseerd door de hoge inbouw van gelabeld thymidine na korte pulse labelling. Gewenste aanpassingen zijn: ea standaardiseren van de methode door de hoeveelheden DNA in de frakties met behulp van van te voren ingebouwd 14Cthymidine te kwantificeren, in plaats van met de minder gevoelige absorptie bij 260 nm; eb nagaan welke invloed voorbehandeling van kernen met micrococcen nuclease na pulse labelling heeft op het chromatografisch gedrag van DNA bij de sCheiding volgens Probst; ec als de recovery van de kolom voldoende blijkt zal de hoeveelheid replicerend DNA berekend kunnen worden in % t.o.v. het inaktieve DNA. Doel is om te vergelijken met het percentage aktief t.o.v. inaktief DNA na behandeling met cytostatica waarvan vaststaat dat ze zeer vroeg in of net voor het begin van DNA replikatie aangrijpen. -2 Inbouw van nieuw DNA in chromatine. De kortste nieuwe DNA fragmenten (Okazaki fragmenten) die bij pulse labelling ontstaan, blijken al direkt geordend te worden tot nucleosomen, nog voordat zij door ligasen aan elkaar gekoppeld worden (Hildebrand & Walters, Biochem. Biophys. Res. Commun. 73:157, 1976). Een nucleosoom omvat een stukje DNA ter lengte van 140 baseparen dat om een kern van histonen gewonden is. De verbindende stukken DNA tussen nucleosomen zijn meer gevoelig voor splitsing door micrococcen nuclease dan intranucleosomaal DNA. Onderzoek van het voorkomen van gelabelde nucleosomen (mono-, di-, trimeren) na inwerking van micrococcen nuclease op pulse-gelabelde kernen of chromatine maakt het mogelijk eventuele

45

effekten van cytostatica op zeer vroege stappen in de DNA replikatie na te gaan. Gezocht zal worden naar remming van de inbouw van Okazaki fragmenten in nucleosomen, resp. het ontbreken van deze ultrakorte stukken DNA. -3 Indien er aanwijzingen gevonden worden dat met name de voorbereiding van replikatie (ontwinding) gestoord is zodat er geen replikatie-vorken ontstaan, kan geprobeerd worden na te gaan welke van de diverse vormen van DNA beschadiging door alkylerende middelen hiervoor verantwoordelijk t~ stellen zou zijn.

VIII.lb Biochemische en cy~gische toetsing van nieuwe derivaten van 5-fluorouracil. F.A.M. Buuron, C. Benckhuijsen 5-Fluorodesoxyuridine 5'-methylfosfonaat werd gesynthetiseerd en getoetst als remstof van geïsoleerde thymidylzuur synthetase uit L.casei. Het onderzoek is verricht met de spectrofotometrische methode van Friedkin en Wahba (J. Biol. Chem. 237:3794, 1962) zoals gewijzigd door Myers et al. (Cancer Res.34:2682, 1974). Het kweken van L5178Y leukemie cellen in halfvaste agar, dat aanvankelijk wisselende resultaten gaf, lijkt nu goed te lopen, zodat de relatie dosis/celoverleving binnenkort bepaald zal kunnen worden met behulp van de kloon techniek. Indien de resultaten bemoedigend zouden zijn verdient het aanbeveling om radioaktief gemerkt 5'-methylfosfonaat van 5-fluorodesoxyuridine te bereiden om celopname studies te kunnen doen. Ook voor vergelijkende gegevens over 5-fluorodesoxyuridine monofosfaat zou radioaktief uitgangsmateriaal vereist zijn. De lopende technieken van aktiviteitsmeting van geïsoleerde thymidylzuur synthetase en in vitro celoverlevingsstudies zijn beschikbaar voor nieuwe analogen van 5-fluorouracil bereid in het Laboratorium voor Organische Scheikunde van de Universiteit van Amsterdam (Prof. Dr. U.K. Pandit, Dr. G.J. Koomen). Het moet dienstig zijn om te trachten met thymidylzuur kinase van veelbelovende chemisch bereide nucleoside analogen het nucleotide te bereiden ten behoeve van de meting van remmende werking ten opzichte van thymidylzuur synthetase.

46

VIII.2 Chemotherap.ie gebaseerd op~gedrag van lysosomale enzymen tijdens hormonale regressie in DMBA~geIndu­ ceerde mammatumoren bij de rat. C. Benckhuijsen, E.P. Beem*, H.G.J. ter Hart Tijdens hormonale regressie stijgt in hormoon-gevoelige mammatumoren het gehalte aan een aantal lysosomale enzymen, o.m. ~-glucuronidase (zie Annual Report 1978, 1979). Het cytostaticum aniline mosterd, dat als ~-glucuronide in het lichaam circuleert, wordt door ~-glucuronidase geaktiveerd. Ons onderzoek heeft ten doel combinatie behandeling te onderzoeken van aniline mosterd met hormonale behandeling van hormoon-gevoeliqe mammatumoren. De hormonale aspekten, ' en. de synergistische werking tussen hormonale regressie en cytostatlsch ettekt op DMBA tumoren in vivo, worden in projekt VII.4 onderzocht; in dit projekt worden biochemische aspekten bestudeerd. -I Het gedrag van ~-glucuronidase tijdens hormonale regressie. De bepaling van de gemiddelde stijging van het enz.ymgehalte na ovariectomie, tamoxifen en/of combinatie met antiprolactine is nog in gang, o.m. om het tijdsbeloop van het totaalgehalte aan ~-glucuronidase in het tumorweefsel te vervolgen. Er treedt 4 dagen na ovariectomie een significant verhoogd gehalte op, maar de individuele waarnemingen overlappen elkaar. Misschien kan er een grens vastgesteld worden waarboven wel of waaronder geen cytostatisch effekt van aniline mosterd te verwachten is. Ook enkele andere hydrolytische enzymen die een hormoon afhankelijkheid tonen worden oriënterend onderzocht. Dit om de mogelijkheid na te gaan dat naast het in vivo gevormde ~-glucuro­ nide, ook synthetische conjugaten van gehydroxyleerd aniline mosterd dienst zouden kunnen doen als cytostaticum. -2 Hormonale regressie en intracellulaire verdeling van lysosomale enzymen. Er zijn enkele aanwijzingen dat er meer specifieke faktoren in het spel moeten zijn dan het totaalgehalte aan ~­ glucuronidase in de tumoren: -soms wordt een abnormaal hoog gehalte aan ~-glucuronidase gevonden in tumoren van onbehandelde dieren, terwijl van aniline mosterd als enige behandeling geen effekt gevonden werd. Deze discrepantie wordt met enzymhistochemie nader bestudeerd om de verdeling in het weefsel te bezien; -de gemiddelde stijging in ~-glucuronidase aktiviteit is betrekkelijk gering, terwijl het waargenomen cytostatische effekt van aniline mosterd in combinatie met ovariectomie aanzienlijk was (zie Annual Report 1979, VIII.2); -in de literatuur is beschreven dat de verhouding tussen extra-Iysosomaal enzym en lysosomaal gebonden enzym in hormoon-gevoelige tumoren verhoogd wordt door endocrine ablatie. *K.W.F. projekt NKI 80-3

47

Het voorgenomen onderzoek naar specifieke faktoren die de intratumorale aktivering van geconjugeerd cytostaticum door ~-glucuronidase in vivo zouden bepalen, omvat: ea De eventuele invloed van hormonale behandeling op de eigenschappen van de lysosomale membraan. Hiervoor is de ervaring in het werken met geïsoleerde lysosomen, opgedaan door E.P. Beem tijdens zijn verblijf in het Institute of Molecular Biology, bij prof. Szego, DC Los Angeles, zeer dienstig. eb Onderzoek naar een eventuele toename tijdens hormonale behandeling van ~-glucuronidase aktiviteit in de microsomale fraktie van DMBA tumoren. In een pilot experiment werd bij onbehandelde tumoren een aanmerkelijke aktiviteit gevonden in de microsomale fraktie; deze bleek nog te onderscheiden in een wel of niet met detergentia in oplossing te brengen fraktie. Het ligt in de bedoeling na te gaan in hoeverre de induktie van enzym door ovariectomie een (tijdelijke) relatieve toename zou veroorzaken van aktief enzym in het endoplasmatisch reticulum.

ec Eventuele invloed van hormonale behandeling op de lokalisatie van lysosomen: Het is bekend dat in bijv. de zeer lysosoomrijke preputiale klieren van de rat oestrogenen de verdeling van lysosomen in de cel beïnvloeden; welke invloed anti-steroid behandeling eventueel heeft is niet bekend. Bij gecastreerde 99ratten treedt in vivo in de preputiale klieren na een uiterst geringe i.v. dosis oestrogeen in de celkern een verhoogd gehalte aan ~-glucuronidase en andere lysosomale enzymen op. Het lijkt van belang na te gaan of antisteroid behandeling, eventueel ook endocrine ablatie, invloed zou hebben op de lokalisatie van lysosomen in de nabijheid van de kern en op overdracht van lysosomale enzymen naar de kern.

VIII.3 Farmacokinetisch en toxicologisch onderzoek over het gebruik van adriamycine bij regionale Rerfusie van de extremiteiten. S.C. van ' t Hoff*, W.J. van Dijk, C. Benckhuijsen Bij de lopende toxiciteitsonderzoekingen bleek uit de gemeten adriamycine concentraties dat er een aanzienlijke opname plaats vindt in de erythrocyten. Evenwicht is na 10 min pas bereikt, de ratio cellen/plasma is 1.7; de opname is reversibel. Omdat de bereikte ratio per concentraat erythrocyten enigszins wisselt zijn voor het vastleggen van de relatie tussen dosis en toxisch effekt per *K.W.F. projekt NKI 80-5

48

keer concentratie metingen nodig. Groepen van 6 ratten worden geperfundeerd voor de toxische en de therapeutische dosis-effekt relaties. Het onderzoek over het mechanisme van de lokale toxiciteit van adriamycine heeft vooral betrekking op aanwijzingen voor en preventie van toxische zuurstof radikalen. Het is bekend dat de chinon struktuur van adriamycine in vivo reduktie en autoxidatie kan ondergaan en daarbij superoxide radikalen opwekt. Voorwaarden voor perfusie met adriamycine lijken vooral het vermijden van overmatige vorming van zuurstof radikalen en gunstige omstandigheden voor de detoxificatie daarvan. Glucose geeft bij oxidatie in de hexosemonofosfaat shunt NADPH. In de afweer tegen zuurstof radikalen is NADPH uiterst belangrijk, omdat het vereist is voor reduktie van glutathion disulfide. Dit laatste ontstaat doordat de H202 die tengevolge van een overmaat superoxide wordt gevormd, met glutathion perioxidase gereduceerd wordt. Bij de afweer tegen zuurstof toxiciteit is behalve de oxygenatiegraad van de weefsels ook de voorziening van glucose en glutathion van groot belang. Het is in geperfundeerde lever aangetoond dat bij tekortschietende reduktie van glutathion disulfide, dit laatste uit de cellen wordt uitgestoten. Dit proces is irreversibel. Bij afweer tegen zuurstofschade is snelle intracellulaire regeneratie van gereduceerd glutathion vooral essentieel omdat deze ver~ binding niet van buitenaf opgenomen kan worden; bij depletie moet herstel tot stand komen door nieuwsynthese van het tripeptide. Omdat er aanwijzingen zijn dat normale weefsels meer afweer hebben tegen zuurstof radikalen dan tumoren, heeft het zin om optimale omstandigheden uit te zoeken voor lokale toediening van adriamycine: men mag een goede therapeutische breedte verwachten, terwijl de toxiciteit waarschijnlijk te beheersen is door goede chirurgie en goede voorzorgen ten aanzien van de lokale toxiciteit. Concrete vragen van het onderzoek zijn: -is versterf van weefsel na de perfusie gecorreleerd met extra 02 verbruik tijdens de perfusie? Dit zou op superoxide radikaal vorming wijzen; -kunnen ook heel kort durende hoge concentraties adriamycine in het perfusaat al verantwoordelijk zijn voor weefselversterf na de perfusie? Van praktisch belang voor de werkwijzen bij de klinische perfusie; -neemt de toxiciteit duidelijk toe bij remming van de enzymen die voor de toxificatie van superoxide radikalen zorgen? -bij welke hoogte van de dosis adriamycine wordt vrijkomen van glutathion disulfide waargenomen: sublethale of (supra) lethale doses voor de normale weefsels? Zou GSSG een waarschuwingsteken kunnen vormen tijdens klinische perfusies? _ zijn extra insuline (voor stimulatie van glucose opname) en uitgangsstoffen voor glutathion synthese van nut?

49

_is extra bescherming met radikaal vangers van nut? -ondersteunend morfologisch onderzoek zal verdere aanwijzingen kunnen geven over de meest kwetsbare weefselcomponenten in de geïsoleerd doorstroomde extremiteit.

VIII.4

Regionale perfusie van ledematen met cytostatica.

J. Wieberdink, C. Benckhuijsen, F.A.M. Buuron, in samenwerking met E.A. van Slooten, S.J. van Coevorden, F.J. Cleton, Ph. Rümke, S.P. Israels, H.R. Marcuse, E.P. van der Esch, S.C. van ' t Hoff (Antoni van Leeuwenhoekhuis) en G.A.A. Olthuis, J.G. van Andel, J.J.A.M. Handels, J.H. Mulder en B.B.R. Kroon (Rotterdams Radiotherapeutisch Instituut) De klinische research bij de regionale perfusies, zoals in een 4-tal punten voor 1980 opgesteld, zal redelijkerwijs voor 1981 ook nog geldig zijn. Daarnaast zal aan het volgende aandacht worden gegeven: .a Volume bepalingen van het perfusaat in extremiteit en extracorporaal systeem, met hiervan afgeleid tempi voor de toediening van cytostatica (melphalan, adriamycine), die beogen toxische bijwerkingen te onderdrukken. Een motorpomp, die deze toediening intraärterieel nauwkeurig naar wens kan verrichten wordt vervaardigd . • b Wijzigingen in het. extracorporale systeem, waardoor het volume van het perfusaat zoveel mogelijk beperkt wordt en de spiegel van het cytostaticum zoveel mogelijk opgevoerd kan worden. -c Voortzetting van het farmacokinetische onderzoek over melphalan. _d Wijzigingen in de chirurgische techniek, die de uitschakeling van collateralen bij re-perfusies eenvoudiger en veiliger maken. -e Nauwkeuriger, met name langduriger follow-up van de reakties van de normale weefsels, vooral van de spieren. -f De afsnoering (isolatie) van het perfusiegebied. De behoefte aan een gekwantificeerde verhoging van de weefseldruk in het grensgebied is groot omdat hierdoor redelijkerwijs de kans op lekkage (in twee richtingen) en weefselbeschadigingen (vooral van de zenuwen) verkleind kan worden. Een duidelijke benaderingswijze van dit belangrijke vraagstuk weten wij overigens op dit ogenblik nog niet.

50

VIII.S Onderzoek ten behoeve van de chemotherapie bij__ leukemie. VIII.Sa

Cel kinetisch onderzoek van leukemieën.

L.A. Smets, J. Homan Zoals vermeld in het Annual Report zal ndg slechts een beperkt aantal leukemie patienten nieuw opgenomen worden in deze studie, nl. AML patienten en patien~en bij wie vroegtijdig resistentie kan worden opgespoord.1 Dit stelt ons in de gelegenheid het resistentie onderzo1ek uit te breiden naar de categorie van de maligne lymfomen. In deze groep blijkt ca. 20% klinisch niet te reageren\op een eerste behandeling met chemotherapie. Getracht zal worden deze groep te herkennen op basis van celkinetische kriteria m. b. v. autoradiografie en puls-cytofotomeltrie. De volgende kriteria komen daarbij aan de orde: I -a delingsaktiviteit vóór behandeling, -b veranderingen in de DNA per cel verdel~ng kort na het begin van de behandeling, -c tumorcel aneuploidievan het DNA per cel gehalte als mogelijk prognostische parameter.

I

I.

Vanwege de bestaande organisatie vorm van .deilymfömen club hopen wij een pilot:-studie naar de mogelidkhedenvan deze benadering binnen 2 jaren te kunnen voltooien.

VIII.Sb

Gevoeligheid voor chemotherapeutica bij leukemie.

M. Brouwer*, L.A. Smets De aandacht bij het ontwikkelen en toepassen van laboratorium technieken voor het vaststellen van de relatieve gevoeligheid voor geneesmiddelen zal voorlopig geconcentreerd worden op steroide hormonen, Het ontbreken van een duidelijke korrelatie tussen binding en biologische aktiviteit maakt de ontwikkeling van bioassays noodzakelijk. Op basis van vergelijkende waarnemingen is de remming van deoxyglucose opname gekozen als te onderzoeken parameter voor de werkzaamheid van verschillende steroiden en hun aktieve metabolieten, al dan niet in kombinatie met Vincristine. De resultaten met model systemen zullen vergeleken worden met waarnemingen aan klinisch materiaal met verschillende gevoeligheden voor deze groep van cytostatica.

*Geven voor Leven projekt XV-4

51

VIII.6

Cel kinetische p'arameters

A.P.M. Jongsma, E.F.E.I. Rijnders, K. Breur -Celkinetisch onderzoek Met behulp van gemerkte DNA-precursors is het mogelijk binnen kort tijdsbestek een indruk over de groeikarakteristieken van een celkultuur te verkrijgen. Met de nu ontwikkelde techniek zal worden onderzocht of en hoe de duur van stralingseffekten in relatie staan met de gegeven dosis, teneinde bij gefraktioneerde bestralingen een optimaal effekt te verkrijgen. Een tweede lijn van onderzoek beoogt het geschikt maken van deze techniek voor de analyse van tumorgroei aan de hand van biopten. De belangrijkste problemen zijn groeiverstoring tijdens de preparatie methode en moeilijkheden bij de identifikatie van cellen. De resultaten van het celkinetisch onderzoek zullen worden gekorreleerd aan regressie metingen in de kliniek (zie in Sektie X: meting van tumorregressie tijdens radiotherapie). -Cytologisch onderzoek In medio '80 zal de fluorescentie-meet opstelling gereed zijn zodat dan begonnen kan worden met kwantitatieve histochemische en morfologische bepalingen per cel. Verbeteringen in de preparatieve methoden zullen worden voortgezet en een aantal kwantitatieve parameters zullen worden gemeten aan patienten materiaal en gekorreleerd met klinische bevindingen.

VIII.7 Biochemische, exp,erimenteleen klinische farmacologie van cytostatica H.M. Pinedo, A. Leyva, J. Lankelma, M.P. Uitendaal, J. van Maanen*, P. Smith, H. Appel, I. Kraal, P. Penders (K.W.F. code AUKC 80-2, 80-3) Er bestaat inmiddels een goede samenwerking tussen deze groep en de afdeling interne geneeskunde. Per jaar worden circa 3 klinische farmacokinetische studies van cytostatica uitgevoerd. Voor de experimentele farmacologie van cytostatica is het van belang te melden dat we nu beschikken over een systeem waarmee de muis continu kan worden geïnfundeerd via de staartvene. Met dit systeem kan een groot aantal muizen gelijktijdig gedurende circa een week worden geïnfundeerd. Het systeem leent zich voor ieder experimenteel farmacologisch onderzoek dat beoogt het effekt van de plasma concentratie van een middel en de duur van de blootstelling *K.W.F. fellow

52

eraan op normale weefsels, tumoren en circulerende metabolieten (zoals nucleosiden) te bestuderen. De huidige werkplannen zijn: -I Purine en pyrimidine biochemie en farmacokinetiek van PALA. Tot nu toe zijn de klinische resultaten van de behandeling met PALA teleurstellend. De aandacht richt zich in de kliniek o.a. op de kombinatie van PALA met antimetabolieten. De farmacokinetische studies van PALA worden voorlopig voortgezet. In het komende jaar wordt bijzondere aandacht besteed aan de studie van het effekt van PALA op de synthese van mono-, di- en tri-nucleotiden van zowel purines als pyrimidines. Deze studies geschieden in suspensie kweken van tumorcellen. Er is nu een HPLC bepalingsmethode operationeel voor de ribonucleotiden. De deoxyribonucleotiden worden met radiochemische technieken bepaald. Een aantal cellijnen wordt bestudeerd, die in gevoeligheid voor PALA verschillen. Het effekt op de nucleotide synthese en de cytotoxiciteit van PALA zal worden vergeleken. Ook de effekten van de kombinaties met andere antimetabolieten op de synthese van nucleotiden en op de cytotoxiciteit worden bestudeerd. Onze tweede benadering is de bestudering van de invloed van intermediaire metabolieten van de de novo pyrimidine synthese en van de nucleotiden op de remming van het enzym aspartaat transcarbamylase. Voor dit onderzoek werd recent een HPLC bepalingsmethode opgezet voor orotaat en dihydroorotaat. Tevens werd het enzym complex bestaande uit carbamyl fosfaat synthetase, dihydroorotase en as partaat transcarbamylase partiëel gezuiverd. -2 Thymidine als cytostaticum. De deoxynucleoside thymidine vormt het substraat voor de synthese van de thymine nucleotide (dTTP) via de salvage pathway. In hoge concentraties remt dTTP de DNA synthese, waarschijnlijk door remming van het ribonucleotide reductase. Hierdoor wordt de synthese van dCTP geblokkeerd. De grootte van de dCTP pool in een cel lijkt gekorreleerd te zijn aan de mate van gevoeligheid van die cel voor thymidine. In dit projekt zal in eerste instantie het effekt van thymidine op normale en op tumorcellen in kweek worden bestudeerd. Daarbij gaat het ons om korrelaties op te sporen tussen cytotoxiciteit en biochemische parameters waaronder a) de intracellulaire deoxynucleotide pools, b) het intracellulaire metabolisme van thymidine in intakte cellen en cel-vrije extracten, c) de invloed van' andere purines en pyrimidines, en d) karakteristieken van de kinases die thymidine omzetten in dTTP. De tweede en derde fase van dit projekt bestaan resp. uit de experimentele en klinische chemotherapie (en biochemische farmacologie) van thymidine.

53

-3 Experimentele en klinische farmacologie van adriamycine en adriamycine analoga. In de kliniek zijn recent in EORTC verband verschillende studies met analoga van adriamycine begonnen. De belangrijkste analoga die voor studie in aanmerking komen zijn carminomycine, epi-adriamycine, aclacinomycine en quelamycine. Ieder van deze cytotstatica kan met de HPLC worden bepaald. Er zijn nog geen farmacokinetische gegevens van de analoga beschikbaar. In de kliniek zal m.b.v. nucleair geneeskundig onderzoek de cardiotoxische bijwerking van ieder van deze cytostatica worden geëvalueerd, terwijl wij de kinetiek van deze middelen zullen vastleggen.

Bovendien wordt in samenwerking met Dr. J. Feyen (TH Twente) onderzoek gedaan naar de cardiotoxiciteit van adriamycine polymeren in de rat waarbij tevens de kinetiek van adriamycine na injektie van deze polymeren zal worden bestudeerd. Het doel van dit onderzoek is de plasma piek van het vrije adriamycine te elimineren aangezien de cardiotoxiciteit gekorreleerd is met het voorkomen van deze piek. -4 Farmacokinetiekvan mitomycine C en analoga. Mitomycine C vindt steeds meer klinische toepassing. Het nadeel van dit cytostaticum is de ernstige beenmerg toxiciteit. Er is nog geen eensluidende mening over de beste toedieningswijze. Ook de farmacokinetiek van deze stof en de aanwezigheid van eventuele metabolieten is nog onbekend. Er wordt gewerkt aan een HPLC bepalingsmethode waarmee wij mogelijk tot een toedieningswijze op een meer rationele basis kunnen komen. Prof. D. Reinhoudt (TH Twente) heeft een eenvoudige synthese methode ontwikkeld voor mytomycine C waarmee hopelijk minder toxische analoga kunnen worden gesynthetiseerd. Deze analoga worden op het NCI op hun antitumorwerking gescreend waarna eventueel het toxiciteitsonderzoek volgt. Bij het vinden van aktieve analoga volgt selektie van de meest aktieve stof die voor e·en fase 1 studie (inklusief farmacokinetisch onderzoek) in aanmerking komt.

-s De humane tumorstamcel assay voor ovariumtumoren. Recent ontwikkelde Salmon een humane tumorstamcel assay met het doel deze te gebruiken voor de in vitro selektie van effektieve cytostatica. Men zou m.b.v. deze methode kunnen komen tot een meer gerichte behandeling. Vele soorten humane tumorcellen blijken kolonies in dit agarsysteem te vormen. De waarde van deze methode dient nog vastgelegd te worden, alhoewel voorlopige resultaten elders hoopgevend zijn. In samenwerking met de klinici zal worden getracht ovariumcarcinoomcellen in agar te kweken. Eerst zal worden nagegaan of gekweekte kolonies overeenkomst tonen met de oorspronkelijk tumor. Dit zal geschieden door cytologisch onderzoek en door inspuiting van de gekweekte cellen in naakte muizen. Na standaardisatie van de kweektechniek volgt studie van de invloed van de preinkubatie met cytostatica van de cellen in suspensie, aan54

gezien deze tijd vrij willekeurig op één uur is gesteld. Het ligt in de bedoeling dat er een in vivo - in vitro prospectief onderzoek volgt waarbij de resultaten van de stamcel assay worden vergeleken met die in de kliniek.

55

56

Sektie IX. ONTWIKKELINGSRESEARCh VOOR RADIOTHERAPIE IX.2 Computer programmatuur voor bestralingsplanning. R. van der Laarse, J.J. Battermann, I.A.D. Bruinvis, A. Hegeman, H. Meertens. In samenwerking met het Laboratorium voor Medische Fysica, Universiteit van Amsterdam: Prof. dr. J. Strackee. ea De ingebruikname op de afdeling radiotherapie van de Bvaluskop, het computer gestuurde bekijkcentrum van patiënt doorsneden verkregen met de CT-scanner, maakt het mogelijk CT-informatie te koppelen aan bestralingsprogrammatuur. Patiëntomtrekken en weefselverzwakkingsfactoren zijn uit deze informatie, opgeslagen in de pixel matrices, te verkrijgen. Gebruikmakend van deze gegevens zal met de hiertoe uitgebreide computer van de Evaluskop een interaktief bestralingsplanningsysteem ontwikkeld worden, voorzien van de optimalisatieprogrammatuur voor uitwendige bundels. Deze programmatuur komt dan beschikbaar voor computers van de PDPll-serie van Digital Equipment, een in de bestralingsplanning veelvuldig toegepaste computer. eb Ook zal MFELC, het programma voor bestralingsplanning van electronenbundels, op deze computer verder ontwikkeld worden om routinematige bestralingsplanning voor de kliniek mogelijk te maken. Hoewel de theoretische problematiek van de beschrijving van electronenbundels nu opgelost is voor onregelmatige velden, geeft de praktische uitwerking ervan nog problemen. De verwachting is dat deze dit jaar opgelost zullen worden.

ec Het computer bestralingsplanningsysteem voor interaktief optimaliseren van gynaecologische radiotherapie met de Selectron afterIoader zal verder vervolmaakt worden, o.a. zullen wolfraam afschermingen in de ovoiden in rekening gebracht kunnen worden en zal een interrupt routine aangebracht worden. Verder zal nagegaan worden in hoeverre de ontwikkelde software aangepast kan worden voor dosisberekeningen rond Iridium mamma-implantaties. Voor dit computer planningssysteem bestaat nationaal en internationaal veel belangstelling. ed Hopelijk zal dit jaar de computer aanpassing van uitwendige bestralingsvelden aan de inwendig afgegeven dosisverdeling bij de radiotherapie van gynaecologische tumoren gerealiseerd kunnen worden.

ee De programmatuur voor intracavitaire en interstitiële radiotherapie (MFlMA) zal worden uitgebreid met de normeringsvoorschriften van het Parijse dosimetriesysteem (Pierquin), zodat klinische resultaten van de conservatieve mammatherapie met Iridium implantaties in Amsterdam en Parijs onderling vergelijkbaar zijn.

57

IX.3 Klinische toepassing van snelle neutronen. K. Breur, J.J. Battermann, H. Haringa, B.J. Mijnheer. ]\.angezien het projekt ln de huidige vorm in de loop van 1980 eindigt, is het weinig zinvol een werkplan voor 1981 op te stellen. Wel zullen de fysische en biologische metingen verder uitgewerkt worden en de trials statistisch bewerkt worden. De resultaten zullen tot publikaties verwerkt worden.

IX.4 Behandeling van toegankelijke tumoren met gesloten bronnen. J.M.V. Burgers, B.N.F.M. van Bunningen, E. van Elderen, P.G. Groote, R. van der Laarse, H. Meertens, T.M.C. Wilmering. ea Uitwerken van de gegevens tot nu toe verkregen over de dosispatronen rond geïmplanteerde bronnen met betrekking tot dosis en doseringssnelheid, in relatie met het klinisch resultaat. Tevens zal een aantal model implantaten, berekend met het programma MFIMA (IX.2 d) van R. van der Laarse, worden bestudeerd om de voorschriften van Paterson-Parker en Pierquin over de uitvoering van implantaten, te vergelijken met elkaar en met de methode die in het Antoni van Leeuwenhoekhuis gebruikt wordt. eb Het komend jaar zal door de Groupe Européen des Curiethérapeutes een vergadering in Warschau worden belegd, waar een der twee te bespreken onderwerpen blaasimplantaten zal betreffen. Prof. A.H. Tierie en J.M.V. Burgers zijn tot coördinatoren van dit programma-onderdeel benoemd. Wij hopen dat daar een bruikbare methode voor blaas implantaties met Iridium zal worden gemeld. . .

ec Het aanpassen van de uitwendige bestralingsvelden aan de inwendig afgegeven dosisverdeling met een z.g. gynaecologische wig zal verder uitgewerkt worden.

IX.5 Fysische aspekten van radiotherapie. R. van der Laarse, I.A.D. Bruinvis, J. de Gans, H. Heertens. Aangezien dit projekt in leven is geroepen om ad hoc aktiviteiten met wetenschappelijke aspekten te kunnen rapporteren, is het aangeven van een werkplan niet mogelijk.

58

Sektie X. KLINISCHE ONCOLOGIE X.la Maligne lymfomen; karakterisatie van mononucleaire cellen in lymfoomweefsel en perifeer bloed van patienten met non-Hodgkin's lymfoom. F.A.Vyth-Dreese, T.A.M. de Jong Het onderzoek naar de karakterisering van lymfoïde cellen bij non-Hodgkin's lymfoom patienten zal worden gericht op de volgende punten: -De methode die ontwikkeld is om in een celsuspensie per cel zowel membraandeterminanten als DNA-gehalte te meten, zal worden gebruikt om prolifererende maligne cellen in lymfoomweefsel te detekteren. Materiaal van een serie patienten zal worden getest om na te gaan of de methode buikbaar is als criterium voor diagnose en therapie. _De natuurlijk voorkomende suppressorcellen bij lymfoom patienten en gezonde donoren zullen verder worden gekarakteriseerd. Met name zal gekeken worden naar de prostaglandine-geïnduceerde suppressie gemeten in mixed lymphocyte culture (MLC). eDe mogelijkheid om met behulp van T-cel groeifaktor (TCGF) niet-stimuleer bare lymfocyten aan te zetten tot proliferatie, zoals aangetoond bij een patient met T-cel chronische lymfatische leukemie, zal bij een andere T-cel maligniteit onderzocht worden. Membraanmarkers en funktionele testen zullen gebruikt worden om te onderzoeken of TCGF ook verantwoordelijk is voor maturatie van de cellen. -Verder zal in samenwerking met J.E.de Vries (zie werkplannen 1981, projekt IV.l.a) het onderzoek voortgezet worden naar de generatie van specifiek cytotoxische T cellen in MLC en het effekt van TCGF hierop. Getracht zal worden T cellen van B-cel lymfoom patienten specifiek cytotoxisch te maken tegen autologe tumorcellen.

X.lh Hodgkin'sdisease:EORTC-trial H I. J.M.V.Burgers, P.van Heerde en R.Somers Doorgaan met verzamelen van follow-up gegevens met het accent op de ontwikkeling van tweede tumoren of andere late complicaties van de behandeling. X.lc Hodgkin's disease: EORTC-trial H TI. Doorgaan met het verzamelen van follow-up gegevens van deze patienten. Bijstand verlenen aan het voorbereiden van een EORTC publikatie over dit materiaal.

59

X.ld EORTC-trial non-Hodgkin lymphoma 20751 R.Somers, B.N.F.M.van Bunningen, J.M.V.Burgers,E.Hamersma, P.van Heerde. Het verzamelen van patienten in stadium I, III en IV zal doorgaan tot de dag dat de volgende trial (L-R lIl) kan beginnen. Gegevens van alle patienten in de studie, ongeveer 100, moeten regelmatig naar het Data Center in Brussel worden opgestuurd. Tezamen met M.M.Qasim uit het R.R.T.I. in Rotterdam zal J.M.V.Burgers in Brussel meewerken aan de evaluatie van de verkregen informatie en helpen de ontbrekende informatie te verkrijgen van achterstallige centra. De gegevens over stadium II zullen apart worden bewerkt en zoveel mogelijk gecompleteerd in een poging de verschillende interpretaties van de slechte overleving in deze groep op te helder en door bijv. vaststelling van verschillen in P.A.-typen of verschillen in gedrag, afhankelijk van het klinisch beeld (onder het diafragma beginnend ten opzichte van Waldeyer's ring). Het KNO-materiaal van het Antoni van Leeuwenhoekhuis wordt bewerkt door K.J.F.Plantenga (X b f) tezamen met P.van Heerde. X.le Hodgkin's disease: EORTC-trial H V J.M.V.Burgers, B.N~F.M.van Bunningen, E.Hamersma, P.van Heerde, R.Somers. Doorgaan met het verzamelen van patienten in EORTC-verband tot 400 à 500 patienten zijn verzameld. Ook het komend jaar kan de analyse van deze patientengroep maar zeer voorlopig zijn. De doeleinden van deze trial zijn pas na een aantal jaren te bereiken. Deze kunnen als volgt worden samengevat: ea Verlichting van behandeling bij patienten met gunstige prognostische kenmerken. eb Kennis van de toestand van de milt behoeft behandeling niet te beïnvloeden als er reeds andere minder gunstige kenmerken voor handen zijn. ec Voor patienten met minder gunstige prognostische factoren uitgebreide bestraling vergelijken met kombinatiebehandelingvan chemotherapie met radiotherapie, wat betreft remissiepercentage en remissieduur, verdraagbaarheid en late komplikaties, zoals steriliteit en tweede tumoren. De komende 2 jaar zal in EORTC-verband ook bezinning nodig zijn over een volgende studie. Deze zou zich kunnen beperken tot patienten die nog problemen opleveren. Te noemen valt een zeer breed mediastinum of B-symptomen in kombinatie met hoge BSE. Nog weinig is bekend over de relatie tussen afmetingen van de tumorpakketten en de prognose, of over kenmerken van patienten die een lokaal recidief zullen ontwikkelen. Het herkennen van zulke faktoren en het kwantificeerbaar maken voor een prospectieve studie zullen als eerste de aandacht gaan vragen.

60

Werkplan X.lf E.O.R.T.C.-trial non-Hodgkin lymphoma 20751 R. Somers, B.N.F.M. van Bunningen, J.M.V. Burgers, E. Hamersma en P. van Heerde Het verzamelen van patiënten fn stadium I, III en IV zal doorgaan tot de dag dat de volgende trial (L-R lIl) kan beginnen. Gegevens van alle patiënten in de studie, ongeveer 100, moeten regelmatig naar het Data Centre in Brussel worden opgestuurd. Tezamen met dr. Qasim uit het R.R.T.I. in Rotterdam zal J.M.V. Burgers in Brussel meewerken aan de evaluatie van de verkregen informatie en helpen de ontbrekende informatie te verkrijgen van achterstallige centra. Gezien de goede overlevingscijfers en de duidelijke verschillen samenhangend met de Kiel classificatie zal een publikatie worden voorbereid in 1980 door Somers, Qasim en Burgers. Daarnaast is het nodig de gegevens over stadium II apart te bewerken en zoveel mogelijk te completeren in een poging de verschillende interpretaties ove.r de slechte overleving in deze groep op te helderen door bijv. vaststelling van verschillen in P.A.typen of verschillen in gedrag, afhankelijk van het klinisch beeld (onder het diafragma beginnend ten opzichte van Waldeyers ring). Het k.n.o.-materiaal van het Antoni van Leeuwenhoekhuis wordt bewerkt door K.J.F. Plantenga (X B f) tezamen met dr. van Heerde. Deze studie zal volgend jaar worden afgerond in het bijzonder betreffende het verband tussen histologie (Kiel classificatie) en prognose. De patiënten die in het Antoni van Leeuwenhoekhuis bekend zijn met een reticulose lokalisatie in de maag, zijn bestudeerd door E. Boven. Een publikatie over dit materiaal is in voorbereiding.

X.3 Metingen van tumorregressie tijdens radiotherapie. H.Bartelink, K.Breur, B.van Bunningen, A.Jongsma,R.Kröger. A.van Leeuwen, R.Veen. Tijdens radiotherapie zullen regressiemetingen worden verricht bij patienten met mammatumoren, lymfkliermetastasen van plaveiselcelcarcinoom in het hoofd-hals gebied en cervix carcinoom. Deze regressiemetingen zullen worden verricht met behulp van schuifmaat, echografie en CT-scan. Voorafgaand aan bestraling, en ook op regelmatige tijdstippen tijdens bestraling, zullen cytologische punkties en zonodig biopsieën worden genomen. Het verkregen materiaal zal in het laboratorium van de afdeling Experimentele Radiotherapie onderzocht worden op celkinetische parameters.

61

Na verzamelen van voldoende patienten en een follow-up periode van circa 2 jaar zal gezocht worden naar korrelaties tussen het al of niet optreden van een recidief in het bestralingsveld, de regressie snelheid van de tumor en de celkinetische parameters.

X.4 Mammacarcinoom J.A.van Dongen, H.Bartelink, R.Bergman, P.F.Bruning, P.Cohen, F.S.A.M.van Dam, J.F.M.Delemarre, E.Engelsman, E.Hamersma, A.A.M.Hart, K.Hoekman, J.P.Persijn Het werk aan de in het Annual Report beschreven projekten betreffende: -retrosternale lymfoscintigrafie, _retrospectieve beoordeling behandelingsresultaten, -computer registratie van mammacarcinoom patienten, -hormonale karakterisering van patienten met mammacarcinoom (zie VII) -genetische studies -deelname aan een aantal meest in EORTC-verband plaatsvindende therapie trials. In EORTC-verband en in samenwerking met een aantal Engelse centra worden in het komende jaar een aantal nieuwe trials aangevangen (o.a. ter beoordeling van de mogelijkheid van mammasparende therapievorm en de optimale therapie bij loc aal zeer uitgebreide processen) . In UKC Amsterdam-verband zal het werk aan de betere karakterisering van de als benigne beschouwde proliferatieve lesies worden voortgezet. De psychosociale studies t.a.v. de acceptatie van mamma amputatie, het gedrag van patienten tijdens en na reconstructie procedures zullen worden voortgezet.

X.7 Tumoren van bot en weke delen P.Cohen, C.E.Albus-Lutter, H.Bartelink, S.J.van Coevorden, O.A.van Dobbenburgh, C.A.FeItkamp, W.Misdorp, E.A. van Slooten en R.Somers. Bij de behandeling van het osteosarcoom zal verder in EORTC-verband worden meegewerkt aan een drietal klinische trials. Zoals bekend mag worden verondersteld (zie Annual Report 1978), worden tijdens de primaire behandeling bij localisatie aan de extremiteiten 3 vormen van adjuvant therapie vergeleken. Voor de behandeling van het gemetastaseerde osteosarcoom wordt medewerking verleend aan een fase II EORTC-studie waarin de resultaten van "lage" (conventionele) tegenover hoge doses MTX worden vergeleken.

62

Indien het effect van deze behandeling onvoldoende is kan worden meegewerkt aan een phase 11 studie met Cis-platinum. Het ligt in de bedoeling een quantitatief-vergelijkend onderzoek aan te vangen naar aantal en groeisnelheid van de longmetastasen afhankelijk van de toegepaste electieve behandeling in de a3-trial. K.Breur en P.Cohen zullen zich met deze metingen gaan bezighouden. Ook de behandeling van het gemetastaseerde weke delen sarcoom zal verder in EORTC-verband worden voortgezet. Bij behandeling met PALA zullen de plasma concentraties van.dit middel in het N.K.I. worden bepaald. Er zal door de werkgroep een beslissing worden genomen over voortzetting van regionale perfusie met adriamycine bij patienten met sarcomateuse aandoeningen van de extremiteiten. Deze beslissing is vooral afhankelijke van de uitkomsten van het experimentele onderzoek naar perfusie met dit middel in de afdeling pharmacologie. (zie sektie VIII) Electronen microscopische bewerking van weke delen sarcomen zal worden voortgezet met de nadruk op Epithelioid sarcomen en Ewing sarcomen. Ten behoeve van het werk in de EORTC zal met het retrospectieve onderzoek van sarcomen worden doorgegaan. Speciale aandacht zal worden besteed aan rhabdomyosarcoom bij kinderen. Onderzoek van bottumoren door middel van grote coupes wordt voortgezet. Een aantal van deze tumoren zijn van honden afkomstig. Hopelijk kan gestart worden met een therapie-trial voor osteosarcomen van de hond. (zie X.16.4)

X.ga Prospectief onderzoek naar bestralingsveranderingen in de darm met betrekking tot preventie en vroege behandeling. F.C.A.den Hartog Jager Doel van dit onderzoek is inzicht te krijgen in het effekt van bestraling op dunne en dikke darm, voor wat betreft de functie, struktuur en de resulterende klachten. Voortzetting van het ingevoerde protocol in zowel de uitgebreide vorm met bepàling van vet, eiwit, galzure zouten in de faeces, als ook in een minder uitgebreide vorm waarbij röntgen, rectoscopisch en bloedonderzoek voor en na de bestraling worden verricht. X.gc Pre-operatieve bestraling bij patienten met een operabel lijkend cardiacarcinoom. E.Gortzak, H.Bartelink, F.C.A.den Hartog Jager. Voortzetting van het protocol waarbij patienten met een operabel lijkend cardia- en distaaloesoPhaguscarcinoom worden voorbestraald met 30 gray/3 weken, in de hoop de uiterst slechte prognose te verbeteren.

63

Bij de in dit protocol toegepaste uitgebreide screening op metastasen (o.a. laparoscopie) blijken slechts weinig patientenvoor operatie in aanmerking te komen. Verwacht wordt daarom dat de studie nog enige jaren zal moeten worden voortgezet. X.9d Post-operatieve bestraling van galblaas en galwegcarcinoom H.Bartelink, E.Gortzak, F.C.A.den Hartog Jager Bij een pilot study naar het effect van bestraling op de klachten en prognose van patienten met een irradicaal geopereerd galblaas- of galwegcarcinoom bleek dat de behandeling in het algemeen goed verdragen werd. De studie wordt voortgezet. X.lO.l. Onderzoek naar de betekenis van de radiotherapie bij de behandeling van de lies- en bekkenkliermetastasen van het vulvacarcinoom. E.J.Aartsen, Ch.Albus-Lutter, B.N.F.M.van Bunningen Lymfkliermetastasen en met name doorgroei van metastatisch carcinoomweefsel door de lymfklierkapsel doen de prognose van het vulvacarcinoom dalen tot 25%. Door middel van een prospectief onderzoek wordt nagegaan of aanvullende radiotherapie op het kleine bekken en het paralumbale gebied de behandelingsresultaten van het vulvacarcinoom kan verbeteren. Bij tumoruitbreiding buiten de kapsel van de klieren wordt ook de lieshuid in het bestralingsveld opgenomen. Het betreft een project dat reeds enkele jaren loopt. Gezien het geringe aantal per jaar in te brengen patienten (3 à 4) is de tijdsduur niet te schatten. X.lO.2. Een onderzoek naar prognostische factoren bij het melanoma vulvae. E.J.Aartsen, E.P.van der Esch, E.Tasseron. De prognose van het melanoma vulvae is slecht. Er werden tot nu toe + 30 patienten met deze kwaal in ons ziekènhuis behandeld. Dit materiaal zal retrospectief aan een nadere analyse worden onderworpen met als prognostische factor o.a. de gemeten dikte van de primaire tumor. De geschatte tijdsduur van het onderzoek is ~ 1 jaar. X.lO.3 E.O.R.T.C. trials voor het ovariumcarcinoom. E.J.Aartsen, Ch.Albus-Lutter, B.N.F.van Bunningen, O.A. van Dobbenburgh, E.Engelsman. In E.O.R.T.C.-verband zijn thans 5 trial protocollen operationeel geworden . • Protocol 55771 betreft de stadia IA2, IB en IIA. Bij de

64

nabehandeling wordt gerandomiseerd tussen melphalan en bestraling van het kleine bekken. _Protocol 55773. In de nieuwe versie werd protocol 55772 opgenomen. Na de stageringslaparotomie met debulking ontstaan 2 groepen, die elk apart worden gerandomiseerd voor melphalan versus adriamycine met endoxan. De eerste groep, waarvan een betere prognose wordt verwacht, bestaat uit de stadia IC, IIB en lIlA (pelvis). De tweede qroep uit lIlA (abdomen), IIIB en IV. _Protocol 55774. Dit is een phase 2 trial voor VP16. Er zijn slechts 20 patienten nodig met een stadium 111 en IV. -Protocol 55775. Idem voor infusie met bleomycine. _Protocol 55781. Dit protocol is voor patienten stadium 111 en IV, die niet voldoen aan de stagerings- en debulkingseisen van protocol 55773. Vele patienten met stadium 111 en IV worden pas na een laparotomie, elders verricht, voor verdere behandeling verwezen. Zij kunnen zonder relaparotomie met uitgebreide stagering en debulking, niet in protocol 55773 worden opgenomen. Er wordt gerandomiseerd tussen de combinaties endoxanadriamycine en endoxan, adriamycine en Cis-platinum (C.A.P.). Recidieven of progressie na endoxan-adriamycine krijgen Cis-platinum. Recidieven of progressie na CAP krijgen Hexamethyl melamine.

X.13 Psycho-sociale zorg en pijnbestrijding F.S.A.M.van Dam,F.BOoIT.~ C.Linssen, D.paalman~ J.Schulkesv.d.Pol. In samenwerking met het Psychologisch Laboratorium afdeling Persoonlijkheidsleer, Universiteit Amsterdam. In 1981 staan de ontwikkeling van meetinstrumenten voor de operationalisatie van aspekten van het begrip "quality of life", en studie van de consequenties op psychosociaal gebied van therapieën.centraal. . Speciale aandacht zal besteed worden a.an een meetinstrument op grond waarvan beslissingen over individuele patienten mede gebaseerd kunnen worden. Onderzoek naar het effekt van analgetica zal in samenwerking met de pijnwerkgroep verder ter hand worden genomen. ' Naast deze "langere termijn" plannen i zal getracht worden zoveel mogelijk vragen uit de kliniek te vertalen in onderzoekbare vraagstellingen. X.16 Vergelijkende oncologie ,

W.Misdorp, E.F.J.Groesbeek, A.A.M.Hart, P.van Heerde, J.G.Kootstra, W.Ternede, M.van der Valk, J.de Vries, K.Weijer. . -1 Voortzetting locale immunotherapie van onvolledige verwijderde tumoren: mastocytomen en fibrosarcomen hond en mammacarcinomen kat (zie Annual Report 1979) •

65

-2 Voortzetting pilotstudy naar toxiciteit (phase I-studie) en werkzaamheid van Selenium-di, propaanthiol 2 en evt. andére Selenium verbindingen (phase 11) bij muizen, katten en honden (zie ook werkplan van L.N.Vernie, Biochemie). In een vroeger experiment heeft een (andere) Selenium verbinding goede werkzaamheid getoond tegen de ascites-vorm van leukemie bij muizen. De vraag is nu of spontane tumorziekten bij dieren, locaal, regionaal en systemisch te beinvloeden zijn. -3 Vergelijkend onderzoek van mammatumoren van muis, rat, hond, kat en mens (zie ook ons 5-jaren plan) . Er lijken verschillen te bestaan in het biologisch gedrag (o.a. de metastasering) tussen mammatumoren in verschillende species. We stellen ons voor deze verschillen nader te analyseren i.v.m. de modeifunctie van mammatumoren bij de knaagdieren (muis, rat) en huisdieren (hond, kat), dit o.a. in verband met therapiestudies. De volgende karakteristieken zullen worden onderzocht en vergeleken: groeiwijze, grootte (absoluut en in relatie met de grootte van het individu) differentiatie, polymorfie, mitosenindex. Begonnen zal worden met de karakterisering van mamma tumoren bij de muizenrassen in ons instituut, hetgeen hopelijk zal leiden tot een nieuw classificatiesysteem. Daarna zal bezien worden, of experimenteel opgewekte mamma tumoren via dit of een aangepaste classificatie kunnen worden onderverdeeld. Indien betrouwbare technieken voor het aantonen van tumormarkers beschikbaar komen, zullen deze toegepast worden bij het vergelijkende onderzoek. Dit onderzoek (zie ook werkplan van der Valk, Sectie Proefdieren en Genetica) zal ongeveer 4 jaar duren.

-4 Experimentele therapie van spontane tumoren bij de hond. A.Osteosarcomen. Zeer waarschijnlijk zal de internationale gerandomiseerde WHO-trial voor osteosarcoom bij de hond van start gaan. De trial is opgesteld in overleg met medische bestralingsdeskundigen (Breur, Bleehan, Stjernsward). Honden waarvan tenminste de helft van de cortex ter plaatse van de tumor, intact is, zullen worden bestraald op de primaire tumor, resp. met en zonder voorbehandeling van radiosensitizer. Ook de longen zullen i.v.m. de micrometastasen worden bestraald al of niet na voorbehandeling met radiosensitizer. De resultaten zullen gemeten worden aan de tumor-vrije interval en overlevingstijd. Vermoedelijk nemen instituten uit de U.S.A., U.S.S.R., Engeland en Nederland aan dit onderzoek, dat ongeveer 4 jaar zal vergen, deel. De histologische diagnostiek van de biopsieën en de bestraalde longen, zal door ons geschieden.

*

Slotervaart Ziekenhuis, Amsterdam

66

B. Mammacarcinoom hond (eventueel ook kat) Het biologisch gedrag van het mammacarcinoom bij de hond komt in veel opzichten (recidivering, metastasering) met dat bij de vrouw overeen. De opzienbarende resultaten (zie O.Bostock en Gprman, Eur. J.Cancer 14, 879-883, 1978) van intraveneuze BCG toediening in aansluiting aan chirurgische verwijdering van de primaire tumor, waren aanleiding om een nieuwe trial op te stellen (WHO). Ten eerste diende het resultaat van de eerste studie met BCG bevestigd te worden, en ten tweede diende een immunostimulator getest te worden (celwandfactor van C-parvum) , die bij de mens beter toepasbaar lijkt dan BCG. De voorgestelde trial bestaat uit 3 armen: Na operatie van de tumor: -I herhaalde BCG - intraveneuze injecties. e2 herhaald Cp-celwand intraveneus -3 herhaald placebo intraveneus. De histologische verificatie zal door ons geschieden. Geschat wordt, dat deze trial 3-4 jaar zal duren.

X.17 Voeding van de kankerpatient P.F.Bruning, F.S.A.M.van Dam, A.C.G.Linssen, A.Schoot en diëtisten vacature) . Verbetering van de voedingstoestand van kankerpatienten vraagt om de beantwoording van drie vragen: ea wat eten kankerpatienten (zo goed mogelijk onderscheiden naar aandoening en behandeling) kwantitatief en kwalitatief? eb welke navolgbare voedingsadviezen cq. maatregelen sluiten aan op de gegevens die verkregen kunnen worden door· beantwoording van vraag a? ec wat is het rendement van voedingsadviezen en -maatregelen beoordeeld aan 1. verbetering van lichamelijke en geestelijke fitheid ("performance") en 2. vermindering van toxiciteit van de radiotherapie of chemotherapie en 3. verbetering van met slechte voeding gekarreleerde vermindering van cellulaire immuunresponse. In een onderzoek worden antwoorden gezocht op bovenstaande vragen voor enkele groepen patienten in ons Instituut. Een en ander gebeurt in samenwerking van medici, diëtisten, psychologen, fysiologen en voedingsdeskundigen van CIVO, Zeist, en Landbouw Hogeschool, Wageningen.

67