iwerkplannen 1980 imtoni van leeuwenhoekhuis het nederlands kankerinstituut amsterdam april 1979

iWERKPLANNEN 1980 imtoni van leeuwenhoekhuis I

april 1979

het nederlands kankerinstituut amsterdam

W E R K P L A N N E N

ANTONI

VAN

1980

LEEUWENHOEKHUIS

het nederlands kankerinstituut amsterdam

Inhoudsopgave Inleiding I Fundamenteel biochemisch onderzoek II Chemische carcinogenese III Rol van het celoppervlak bij ontstaan, gedrag en bestrijding van tumoren IV Tumor immunologie V Virologische faktoren bij het ontstaan van tumoren bij mens en dier VI Genetische faktorpn bij het ontstaan van tumoren bij dier en mens VII Hormonale faktoren bij het ontstaan en de groei van tumoren VIII Experimentele chemotherapie en radiotherapie IX Ontwikkelingsresearch voor radiotherapie X Klinische oncologie

1 3 7 13 21 25 31 37 43 51 55

INLEIDING In de werkplannen worden voornamelijk ombuigingen in het onderzoek en nieuw onderzoek aangegeven. Een wetenschappelijk verslag in de Engelse taal wordt als Annual Report uitgegeven. De nummering van onderzoeksprogramma's en projekten is in werkplannen en Annual Report gelijk gehouden. Een nieuw onderzoeksgebied is de klinische farmacologie van cytostatica, dat gedeeltelijk als projekt van het Integraal Kankercentrum Amsterdam wordt uitgevoerd.

1

2

Sektie I 1.1

FUNDAMENTEEL BIOCHEMISCH ONDERZOEK

Analytisch centrifugeren.

W.S.Bont, W.L.van Es, M. de Vries, C.J.P. Slee Het werk met de analytische ultracentrifuge blijft voornamelijk beperkt tot service voor andere projecten. Een nieuw detectie systeem werd voltooid en wordt in de praktijk getest.

1.2

Scheiding van cellen.

W.S.Bont, W.L.van Es, J.E. de Vries, C.J.P.Slee • a Scheiding o.i.v. de zwaartekracht. De apparatuur ontwikkeld voor de scheiding van cellen bij 1 x g wordt nu vervaardigd door een instrumentenfabriek. Dit is van belang voor degenen buiten ons laboratorium, die deze techniek willen gebruiken. De aanpassing van de apparatuur aan de schaalvergroting (tot 2.109 leukocyten), die in sommige gevallen noodzakelijk is, wordt nu in samenwerking met de fabriek gerealiseerd. Zelf willen wij deze apparatuur gebruiken voor het scheiden van bloedcellen, beenmergcellen en leukemische celle~ • b Scheidingen met de elutriator rotor. Als aanvulling op de 1 x g methode werd het werk met de elutriator rotor gestart. Nadat een begin was gemaakt met de meest noodzakelijke aanpassingen kon dit apparaat reeds worden gebruikt bij het scheiden van bloedcellen en beenmergcellen. Er zal worden gewerkt aan de verdere ontwikkeling van het apparaat. Het zal dan in het bijzonder worden gebruikt voor de scheiding van bloedcellen en van beenmergcellen. • c Scheidingen m.b.v. electroforese. De eerste oriënterende experimenten met de scheiding van leukocyten naar een verschil in electroforetische mobiliteit verliepen bemoedigend. Het komende jaar hopen wij dit werk te kunnen uitbreiden. • d Een analytische sedimentatiekamer. Voor de analytische ultracentrifuge werd op ons Instituut door de heer Van Es detectie apparatuur ontwikkeld om het sedimentatieproces als functie van de tijd te kunnen volgen. De vraag werd gesteld of ook voor het sedimentatieproces o.i.v. de zwaartekracht detectie apparatuur te maken valt. Problemen verbonden met het gebruik van een analytische.sedimentatiekamer werden in het voorjaar van 1977 in het laboratorium van de Shell besproken. N.a.v. dit gesprek werd een speciale kwarts cuvet besteld. De theoretische problemen bij het gebruik van deze cuvet 3

worden in samenwerking met de afdeling Theoretische Natuurkunde van de Gemeente Universiteit van Amsterdam bestudeerd. Ook het belangrijkste probleem van deze apparatuur, n.l. het bouwen van de detector, moet weer door de heer Van Es worden opgelost.

I.3 Onderzoek naar de werking van selenotrisulfiden~ in het bijzonder selenodiglutathion (GSSeSGL,-9p. de eiwitsynthese L.N.Vernie, L.Karreman, M. de Vries, W.S.Bont, P.Emmelot Selenium is een essentieel spore-element. Een tekort aan selenium wordt o.a. in verband gebracht met een verhoogde gevoeligheid voor het ontstaan van tumoren en hartziekte~ . Een van de omzettingsprodukten van seleniumverbindingen in het dierlijk organisme is selenodiglutathion (GSSeSG) en het is deze verbinding waarvan door ons is aangetoond dat het de aminozuurinbouw zowel in het celvrije systeem als in cellen in weefselkweek remt. Gebleken is dat elongatiefactor 2 (EF2), het enzym dat betrokken is bij de translocatie van de polyribosomen langs het messengerRNA, door GSSeSG wordt geremd. Het onderzoek wordt voortgezet aan de hand van de volgende hoofdlijnen. • 1 Onderzoek naar het mechanisme van de remming door GSSeSG op de aminozuurinbouw in vitro via EF2. EF2 heeft 18 vrije SH groepen, welke in een gereduceerde staat moeten zijn voor de werking van het enzym. Door de reactiviteit van GSSeSG met SH groepen ligt het voor de hand te veronderstellen dat één of meerdere SH groepen door GSSeSG geblokkeerd worden en selenium wordt ingebouwd • 2 Onderzoek naar het groeiremmend effect van GSSeSG en andere selenotrisulfiden op cellen in weefselkweek (in samenwerking met J.G.Collard). • a Inmiddels is gebleken dat naast GSSeSG ook andere selenotrisulfiden, algemene formule RSSeSR, een remming van de aminozuurinbouw in cellen in weefselkweek te zien geven. Meerdere selenotrisulfiden moeten echter nog worden getest. Doel van het onderzoek is te komen tot selen~ trisulfiden welke stabieler zijn dan GSSeSG en een groter groeiremmend effect hebben. • b Bepaling van de gevoeligheid van groeiende en rustende cellen voor GSSeSG en andere selenotrisulfiden en de bepaling van de gevoeligheid van verschillende celtypen voor GSSeSG en andere selenotrisulfiden.

4

• 3 Onderzoek naar het groeiremmend effect van GSSeSG op ascites tumorcellen in vivo (in samenwerking met C.J.Homburg). Testen van GSSeSG en andere selenotrisulfiden op hun groeiremmend effect op ascites tumorcellen onder verschil.lende omstandigheden zoals tijdstip van toediening en afhankelijkheid van doses. De resultaten verkregen uit het onderzoek vermeld onder 3 zullen mede bepalend zijn voor deze experimenten. • 4 Onderzoek naar het mogelijk ontstaan van selenium deficiëntie bij het gebruik van cytostatica (in samenwerking met C.Benckhuijsen). Apart van bovenstaand onderzoek staat de vraag of bij de behandeling van patiënten met bepaalde cytostatica niet een tekort aan selenium zou kunnen optreden met als gevolg, niet als zodanig herkende, selenium deficiëntie verschijnselen. Bekend is dat verschillende cytostatica alkylerend werken en o.a. als zwavelverbinding worden. uitgescheiden. De overeenkomst tussen zwavel en selenium en de grotere reactiviteit van selenium dan zwavel t.o.v. alkylerende agentia maakt dat het ontstaan van een seleniumtekort na toediening van bepaalde cytostatica niet denkbeeldig is. Het ligt daarom in de bedoeling een onderzoek te starten naar een mogelijk verband tussen het langdurig gebruik van cytostatica en het seleengehalte in bloed.

5

6

Sektie 11. CHEMISCHE CARCINOGENESE 11.1 Interactie van N-acetyl-2-aminofluoreen (AAP)~ verwante aromatische aminen met nucleïnezuren in relatie tot de vorming van tumoren. E.Kriek, J.G.Westra, C.E.Spelt, A.Visser. Het onderzoek wordt voortgezet volgens de hoofdlijnen aangegeven in het vorige werkplan (zie werkplan 1979, 1, 2 en 4). Prioriteit heeft de bepaling van de structuur en eigenschappen van AF produkten in DNA in vivo en na modelreactie in vitro met N-hydroxy-AF en 2-nitrosofluoreen. Dit is noodzakelijk geworden door de resultaten van enkele onderzoekingen, die in de loop van 1978 in de literatuur zijn verschenen. Door Sakai et al. (Cancer Res. 38: 2058-2067, 1978) werden aanwijzingen verkregen, dat de mutagene activering van N-hydroxy-AAP in vitro door geïsoleerde leverkernen van rat en muis of door cytosol uit rattelever in hoofdzaak verloopt via deacetylering door membraan-gebonden amidase en acetyltransferase. De reactieve produkten die hierbij worden gevormd en verantwoordelijk zijn voor de covalente binding aan nucleïnezuren en eiwitten, zijn nog niet bekend. Gedacht wordt aan het nitroxyl radicaal Ar-NH-O of het arylnitrenium ion Ar-N+-H. . Getracht zal worden bovengenoemde produkten ook van verwante aromatische aminen in andere organen (nier, darmepitheel) aan te tonen. Uit eigen onderzoekingen met het lever- en niercarcinogeen N-acetyl-4-amino-4'-fluorobiphenyl (AABP4'F) is reeds gebleken, dat in het nier-DNA soortgelijke reactieprodukten ontstaan als met AAP in het lever-DNA (Chem.-Biol.lnteract. 21: 179-201, 1978). Er kunnen echter verschillen bestaan tussen tubulaire epitheelcellen en interstitiële cellen. Nagegaan zal worden: • a of deze verschillen tot uiting komen in vormingsen/of verdwijnsnelheid van bepaalde produkten; • b of in de nier dezelfde precancereuze lesies worden gevormd als door AAP en nitrosaminen in de lever (in samenwerking met E.Scherer).

11.2 Interacties van nitrosamines in doelwitorganen in relatie tot de vorming van tumoren L. den Engelse, B.G.J.Floot, E.J.Philppus Het onderzoek naar de gevolgen van persisterende carcinogeen-DNA interactieprodukten voor het functioneren van DNA zal worden voortgezet. Bij in vivo studies ligt het accent op de vorming van (m)ethylphosphotriësters in ratte (lever) DNA. Door van verschillende carcinogenen het tumor-inducerend vermogen te vergelijken met de vorming van alkylphosphotriësters kan vermoedelijk een uitspraak

7

worden gedaan over een mogelijke rol van (persistente) phosphotriësters bij de vorming van tumoren of voorstadia van tumoren. Dit onderzoek wordt verricht in samenwerking met project 11.3. Daarnaast zullen in vitro studies worden verricht naar eventuele effecten van persisterende carcinogeen-DNA adducten. Als carcinogeen zullen hierbij zowel (m)ethylerende produkten als aromatische amines worden gebruikt, dit laatste in samenwerking met projekt 11.1. De volgende experimentele benaderingen zullen worden gevolgd: • 1 effecten op "normale" DNA synthese en z.g. postreplicatieve DNA repairi mogelijke inductie van dit laatste proces; • 2 het vermogen van de cel om DNA-Iesies te herstellen zou kunnen worden geremd door nog in het DNA aanwezige persistente carcinogeen adducten. Nagegaan zal worden of door het aanbrengen van geheel andere schade (UV) een wederzijdse remming van de excisie-repair optreedt; • 3 bekeken zal worden of in het DNA achterblijvende persistente lesies op zich mutageen zijn of niet, en • 4 om na te gaan of persistente lesies.in het DNA een rol spelen bij de in vitro transformatie van cellen zal worden getracht om via "liquid holding" technieken cellen te verkrijgen die relatief verrijkt zijn aan deze persistente lesies. Na deze rustperiode zullen de cellen tot deling worden gestimuleerd.

11.3 Onderzoek van het carcinogene proces aan de hand van

~phologische voorstadia van de-kankercel in de lever.

E.Scherer, P.Emmelo"t, A.P.Steward. Chemische carcinogenen spelen hoogst waarschijnlijk een belangrijke rol bij de inductie van kanker in de mens. Wegens hun mutagene eigenschappen wordt verondersteld, dat alkylering van DNA een noodzakelijke eigenschap is voor de carcinogene werking van deze stoffen. Verschillende plaatsen in het DNA worden gemodificeerd. De vraag welke modificaties relevant zijn voor het carcinogene proces is echter nog onopgelost. Omdat het carcinogene proces meerdere stappen omvat (volgens de somatische mutatie hypothese is de moleculaire achtergrond van een stap een relevante mutatie), lijkt het verstandig, de relevantie van DNA modificaties voor elke stap afzonderlijk te bestuderen. Voor het onderzoek naar de rol van DNA modificaties in de inductie van de eerste stap van het carcinogene proces werd in de laatste jaren een geschikt systeem ontwikkeld door inductie, groeigedrag en belang voor het carcinogene proces te bestuderen van precancereuze lesies (eilandcellen) welke in de rattelever door een enkele applicatie van levercarcinogenen kunnen worden geïnduceer~ Deze lesies staan zeer waarschijnlijk in causale samenhang met de tumoren door targetcellen te zijn of te bevatten waarin de latere, voor het carcinogene proces 8

noodzakelijke stappen worden uitgevoerd .. Hoofdlijnen van het onderzoek zijn: • 1 kwantificeren van reactieprodukten tussen carcinogeen en lever DNA in vivo; • 2 vormings- en verdwijnkinetiek van de DNA modificaties in vivo; • 3 inductie en kwantificeren van precancereuze lesies (eilandcellen in de lever, en in andere organen (b.v. pancreas) ; • 4 meting van de bijdrage van een subcarcinogene dosis carcinogeen tot de ontwikkeling van levertumoren, en • 5 bestudering van het verba~d tussen precancereuze lesies en hyperplastische nodules zoals geïnduceerd volgens de DEN-AAFjhepatectomie methode van Farber (dit in samenwerking met Dr.v.d.Heyden, RIV, Bilthoven).

II.4 Celscheidingstechnieken carcinogenese.

toe~p'ast op~(chemische)

A . Tulp, 11. G. Barnhoorn De bezinkingsmethode (1 x g sedimentatie) zal in de loop der tijd worden aangewend voor de volgende deelonderzoeken: • 1 De in vivo binding van dimethylnitrosamine (Dr4N) aan de verschillende klassen van ratteleverkernen zal worden bepaald ná scheiden van deze kernklassen bij 1 x g. De binding zal worden bestudeerd als functie van de tijd. De specifieke binding van DMN aan DNA zal worden bepaald, nadat het DNA d.m.v. CsCl evenwichtssedimentatie uit de kernen"is gezuiverd (in si'lmenwerking met L.den Engelse en E. Philippus) . e 2 Kernen uit rattehersenen zullen worden gescheiden bij 1 x g. De binding van ethylnitrosourea aan de verschillende kernklassen zal worden bepaald (in samenwerking met C.Heyting). . • 3 Uitwisseling van membraanlipiden. Zoogdiercellen, met een relatief klein volume, zullen radioactief worden gelabeIed voor een bepaald plasmamembraan lipide. Na labeling worden de cellen geïncubeerd tezamen met een tweede celtype, dat een relatief groot volume heeft. Scheiding van de twee celtypen met behulp van sedimentatie bij 1 x g zal het mogelijk maken de uitwisseling van plasmamembraan lipide tussen deze celtypen te bepalen (in samenwerking met J.Collard). • 4 Chromosomen van de Chinese hamster en de munt jac zullen op sucrose-azijnzuur gradiënten bij 1 x g worden gescheiden. Om het tijdrovende fotograferen van de fracties te vermijden, zullen de condities worden bepaald, die de chromosomen geschikt maken voor lasercytometrie (in samenwerking met J.Aten, B.Kipp en J.Collard). Onderzocht zal worden of er wellicht een preferentiële binding van verschillende carcinogenen aan enig chromosoomtype bestaat. 9

o 5 Mogelijkheden om chromosoomtransformatie studies uit te voeren ~ullen worden onderzocht: o a kunnen gefractioneerde chromosomen in liposomen worden opgesloten ? • b kunnen micronuclei na scheiding bij 1 x g voor fusie experimenten worden gebruikt ? • 6 Menselijke chromosomen (b.v. van een Xeroderma pigmentosum lijn) zullen bij 1 x g worden gescheiden (in samenwerking met A. Jongsma) .

11.5 Perinatale carcinogenese van het zenuwstelsel van de rat door alkylerende agentia (K.W.F. annotation XV.7)

c.

Heyting, A. Huigen.

Om een verklaring te vinden voor de grote gevoeligheid van het ontwikkelende zenuwstelsel van de rat voor tumorinductie door ethylnitrosoureum (ENU) zullen de volgende punten worden onderzocht: • 1 Is er een verband tussen de verschillende weefsels wat betreft hun repairactiviteiten, en kan hierin een verklaring gezocht worden voor de grote gevoeligheid van het zenuwstelsel? De excisierepairactiviteit in de verschillende organen van pasgeboren al of niet met ENU behandelde ratten zal gemeten worden door autoradiografische detectie van. unscheduled DNA synthese. Hiertoe zullen oe in 1978 uitgeprobeerde methoden verder worden geoptimaliseerd. De postreplicatieve repair in de verschillende organen van pasgeboren ratten zal worden gemeten. Verder zal worden gezocht naar mogelijkheden om de betrouwbaarheid van verschillende repairprocessen in vitro te meten. • 2 Is het mogelijk de gevoelige cellen in het zenuwstelsel nader aan te wijzen? Uit de literatuur blijkt dat niet alle delen van het zenuwstelsel van de rat even gevoelig zijn voor tumorinductie. In de kleine hersenen ontstaan b.v. nauwelijks tumoren na ENU-behandeling. De ,'excisierepair, postreplicatieve repair en mogelijk ook de vormings- en verdwijnkinetiek van door ENU in het DNA geïnduceerde lesies zullen in de verschillende onderdelen van de hersenen apart worden gemeten. Verder blijkt uit de literatuur dat vrijwel alle door ENU in het zenuwstelsel geïnduceerde tumoren waarschijnlijk van gliacellen afgeleid zijn. In samenwerking met A.Tulp zal worden geprobeerd om de vormings- en verdwijnkinetiek van door ENU in het DNA geïnduceerde lesies te bepalen in verschillende kernenfracties van de hersenen. Wanneer uit de afzonderlijke

10

hersenkernfracties intakt DNA geIsoleerd kan worden, zal ook de postreplicatieve repair in de verschillende typen hersenkernen apart worden gemeten.

11

12

sèktie III.

ROL VAN HET CELOPPERVLAK BIJ ONTSTAAN, GEDRAG EN BESTRIJDING VAN TUMOREN

111.1 Onderzoek naar de samenstelling en eigenschappen van geisoleerde plasmamembranen uit normale- en tumorcellen. R.P. van Hoeven, W.J. van Blitterswijk, P. Emmelot, C.A. FeItkamp, G.M. Hengeveld, H.A.M. Hilkman, B. Jorritsma-Byham, J.H. Krol, J.M. Majoor, G.J.C.M. de Veer, M. de Vries. De dynamiek van het celoppervlak (antigeen expressie, receptor bewegelijkheid) staat in relatie tot de mate van vloeibaarheid van de lipide matrix van het plasmamembraan en dus ook tot chemische samenstelling, localisatie van lipideklassen over binnen- en bUitenzijde van het membraan, optreden van microdomeinen met andere samenstelling dan de gemiddelde, en lipide-eiwit interacties. Het isoleren van plasmamembranen en het vaststellen van de representativiteit van de verkregen preparaten (speciaal bij niet eerder onderzocht biologisch materiaal) blijft centraal staan. Hiervoor is enzymologisch en chemisch onderzoek naar "markers" en electronenmicroscopie onontbeerlijk. Meer in het bijzonder zullen de lipide analyses met chromatografische technieken verder uitgewerkt worden (in het bijzonder hogedruk vloeistof chromatografie). Als parameter voor de vloeibaarheid zal de fluorescentie polarisatie worden genomen. Aangezien het voor de erythrocyt aannemelijk is dat de buitenlaag van het membraan visceuzer is dan de binnenlaag, maar voor LM cellen (getransformeerde muizefibroblasten) het tegengestelde is gepubliceerd (F. Schroeder, Nature 276: 522, 1978), zal ons onderzoek naar een mogelijke asymmetrie in de lipidelocalisatie moeten leiden tot een uitspreaak over asymmetrie van vloeibaarheid. In ons modelsysteem (Novikoff ascites hepatoom) zal dus de localisatie van sphingomyeline en cholesterol (de voornaamste lipiden die tot de viscositeit bijdragen) moeten worden bepaald en vergeleken met controlecellen. Hieruit kan de vloeibaarheid worden gededuceerd. Teneinde ons niet op éen modelsysteem te fixeren, zullen andere celtypen, ondermeer GRSL cellen, bestudeerd worden met technieken die door deze meer fragiele cellen worden verdragen, onder andere fluorescamine-labeling. Pogingen om de viscositeit van het plasmamembraan van leukemische cellen op te voeren, waardoor antigene groepen meer geëxponeerd worden, zullen worden voortgezet (zie III. 5) .

Wat het glycoconjugaten onderzoek betreft, zal de meeste aandacht worden gegeven aan glycolipiden. De met hogedruk vloeistofchromatografie geisoleerde gangliosiden en neutrale glycolipiden zullen met behulp van o.m. capillaire gaschromatografie nader worden geidentificeerd. 13

Tenminste éen van de glycolipiden (ganglioside GMl) kan als differentiatie celoppervak-marker worden aangemerkt. Hiervan wordt de expressie gemeten in een cytotox-test met behulp van cholera toxine (GMI-receptor) en anti-cholera toxine, antisera (zie III.5). In samenwerking met III.2 en III.6 zal getracht worden om glycopeptiden met hogedruk te scheiden.

III.2 Glycoproteinen in het celoppervlakvan normale- en tumorcellen. W.P. van Beek, J. Breekveldt, P. Emmelot, J. van Hartingsveldt, J. de Weerd~ Het onderzoek van de laatste jaren heeft een duidelijke relatie aangetoond tussen een glycoproteine verandering van het celoppervlak, met name het voorkomen van snel eluerende glycopeptiden, en het tumorigene karakter van cellen. De vraagstellingen z~Jn nu welke determinanten verantwoordelijk zijn voor de snel eluerende eigenschappen, wat de primaire structuurverschillen van de betreffende glycopeptiden zijn, en in welke biosynthese-stap of stappen deze verschillen geintroduceerd worden. Voorlopige resultaten hebben uitgewezen dat mogelijk naast siaalzuur, gesulfateerde suikers betrokken kunnen zijn in de verandering in elutiegedrag. Deze mogelijkheid zal verder worden onderzocht. Het alternatief dat ongeladen suikers verantwoordelijk zijn zal in eerste instantie langs enzymatische weg onderzocht worden met behulp van exo- en endoglycosidases. Een nieuwe techniek maakt gebruik van RNA virussen (Sinbis, VSV) bij de analyse van verschillen tussen glycoproteinen van normale en maligne cellen. VSV bijvoorbeeld bezit slechts éen glycoproteine waarvan het koolhydraat-gedeelte met behulp van het cellulaire enzymsysteem gesynthetiseerd wordt. Wanneer bij infecteren van normale en maligne cellen genoemde verschillen gereflecteerd worden in de virus glycoproteinen, wordt.de analyse hiervan eenvoudiger dan die van het complex van cellulaire glycoproteinen. Na isolatie en zuivering van zowel virale als cellulaire glycoproteinen zal structuuronderzoek plaatsvinden. Dit in samenwerking met R. van Hoeven en H. Krol (project III.l) wat betreft zuivering met behulp van hogedruk vloeistofchromatografie en suikeranalyse met behulp van gasvloeistofchromatografie. Afhankelijk van de hoeveelheid en zuiverheid van de geisoleerde glycopeptiden zal in samenwerking met dr. H. Vliegenthart van de Rijks Universiteit .

* KWF-fellow 14

in samenwerking met dr. H. Vliegenthart van de Rijks Universiteit Utrecht, structuur onderzoek plaatsvinden met behulp van massa spectrometrie en electronspin resonantie. Ook zal contact en overleg plaatsvinden met projecten waarin zuivering van glycoproteinen eveneens een primaire stap vormt voor verder onderzoek (A. Kolk, project 111.6) . Met behulp van oppervlakte labelingstechnieken kan eindstandig. siaalzuur van glycoproteinen worden gelabeld door oxidatie met natrium metaperjodaat gevolgd door reductie met natrium boro (3H) hydride. Deze labeling zal o.a. worden toegepast bij het onderzoek naar een maligniteitscriterium waarbij geen referentiecel noodzakelijk is. Deze techniek zal eveneens gebruikt kunnen worden om uit het totaal van metabolisch gelabelde glycoproteine, de interne van de externe te onderscheiden; dit voor onderzoek van de diverse stappen in de biosynthese van fucosylglycoproteinen. Het onderzoek naar de kinetiek van het verschijnen van snel eluerende glycopeptiden op het celoppervlak na EBVinfectie van B-lyrnphocyten zal worden afgerond. Onder invloed van antilichamen worden glycoproteinen van de celmembraan afgestoten die een sneller elutiegedrag op Sephadex vertonen dan de membraan gebonden glycoproteinen. De langs deze weg geëxfolieerde glycoproteinen zullen op samenstelling worden onderzocht. (In samenwerking met W. van Blitterswijk, project 111.5). Leucocyten uit perifeer bloed van patiënten waarvan de klinische diagnose niet met zekerheid gesteld kan worden en van patiënten in complete remissie zullen worden onderzocht op het al of niet voorkomen van snel eluerende glycopeptiden. Controlecellen zoals granulocyten, welke een duidelijk afwijkend beeld geven wat betreft de glycopeptide samenstelling, zullen verder worden onderzocht o.a. na isolatie met behulp van de elutriatenrotor in samenwerking met W. Bont. Verder zal een begin gemaakt worden met het onderzoek aan humane marnrnatumoren. In het belang van de eventuele diagnostische waarde van de waargenomen glycopeptide verandering, zal onderzocht worden of de analyse techniek vereenvoudigd kan worden.

111.3 Rol van het celoppervlak

bij~groei-regulering_

III.3a Membraan lipide fluiditeit in relatie tot het groeicontro~e mechanisme van cellen. J.G. Collard, J.H. Hollander. In samenwerking met project 111.1 wordt het onderzoek over 15

celcyclus en celdichtheid afhankelijk veranderingen in fluorescentie polarizatie metingen afgerond door deze waarden te correleren met de lipide samenstelling van de cellen. In samenwerking met project 111.1 en 111.5 zal de mogelijke toepasbaarheid van de "photo bleaching" techniek onderzocht worden in het onderzoek over membraan fluiditeit en membraan receptor mobiliteit van normale en tumorcellen. In het onderzoek over cel-cel interacties en cel-cel communicatie zal het onderdeel over de uitwisseling van membraan lipiden (phospholipiden en cholesterol) gedurende celcontact worden afgerond. Hiernaast wordt de mogelijkheid onderzocht de mate en specificiteit van intercellulaire communicatie (transfer laag moleculaire stoffen via gapfunctions) tussen verschillende soorten normale en tumorcellen te bestuderen. Indien mogelijk wordt de rol die het cytoskelet speelt bij dergelijke celcontact reacties in het onderzoek betrokken. In samenwerking met project 11.4 wordt getracht geisoleerde chromosomen op grootte te fractioneren. Indien dit onderzoek bevredigende resultaten oplevert zal het een mogelijke voortgang vinden in chromosoom transformatie studies met gezuiverde chromosoom fracties gericht op o.a. het al of niet aanwezig zijn van genetisch vastgelegde groeigedragsfactoren bij cellen (selectie op o.a. getransformeerde groei; anchorage independency) .

III.3b Membraanglycoproteinen en celinteracties L.A. Smets, H. van Rooy, eh. Homburg. De centrale vraagstelling van dit projectonderdeel betreft de rol van membraanglycoproteinen in the sociale gedrag van normale en tumorcellen en de betekenins van tumorspecifieke veranderingen in deze moleculen. In het verslag wordt gerapporteerd over de onvolledige synthese van membraankoolhydraten door A9 cellen en de mogelijkheid om dit defect te complementeren in somatische celhybriden. De biologische specificiteit staat onder controle van het toegevoegde genoom. Door het herstel van verschillende biologische functies in deze hybriden te bestuderen (celcommunicatie, celadhesie) kan de biologische rol worden geanalyseerd van de membraanglycoproteinen die gesynthetiseerd worden onder controle van bekende genomen. Bovendien kan in dergelijke hybriden de genetische regulering van de synthese van tumorspecifieke koolhydraten worden bestudeerd zoals dat in het verslag is aangegeven. Dit onderzoek zal daarom worden gecontinueerd. Voor beide toepassingen geldt dat de onderzochte eigenschappen in beginsel

16

toegankelijk zijn voor chromosomale mapping door het vervolgen van segregerende populaties. Een eventuele uitbreiding met deze karyologische studies zal echter worden overwogen op basis van de nog te behalen resultaten. Ten behoeve van dit onderzoek zullen twee technieken worden ontwikkeld. Allereerst een techniek om celcommunicatie kwantitatief te bepalen d.m.v. het verSChijnsel van contact-feeding (de overdracht van geactiveerd 6-thioguanine aan cellen die 6-thioguanine niet om kunnen zetten in een toxisch product). Vervolgens zal de reaggregatie van dun gezaaide cellen bestudeerd worden als model voor specifieke isotypische en heterotypische celherkenning.

III.3c De rol van het cytoskelet oE-groei en groeicontrole van cellen H. Temmink, M. Spiele In steeds sterkere mate wordt het verband duidelijk tussen een groot aantal cellulaire processen en het functioneren van het cytoskelet. Dit geldt ook voor processen die zich op het celoppervlak afspelen of waarbij het celoppervlak betrokken is. Een deel van het onderzoek zal zich dan ook toeleggen op het vinden van verschillen in celoppervlakte verschijnselen tussen normale en getransformeerde 3T3 cellen die in verband gebracht kunnen worden met morphologische of functionele verschillen in het cytoskelet. Scanning electronenmicroscopie en labeling van celoppervlaktereceptoren enerzijds, labeling van cytoskeletaire elementen met antilichamen anderzijds, zijn de technieken waarmee dit probleem zal worden benaderd. Dezelfde technieken in combinatie met allerlei geinduceerde veranderingen in vorm en functie van het cytoskelet zullen tevens gebruikt worden voor een meer fundamentele bestudering van het cytoskelet van 3T3 cellen zelf. Beantwoording van de vele vragen die op dit terrein nog bestaan is namelijk een voorwaarde voor begrip voor de rol van hèt cytoskelet in getransformeerde cellen. De gehele problematiek lijkt van een dusdanige aard dat een meer multidisciplinaire aanpak zinvol is en de mogelijkheden daartoe zullen worden onderzocht.

111.4 Rol van het celoP2ervlak bij de metastasering_ E. Roos, I.V. van de Pavert samenwerking met dr. K.P. Dingemans, PathOlogisch Anatomisch Laboratorium, Universiteit van Amsterdam De interacties tussen hepatocyten en tumorcellen in vitro zullen nader gedefinieerd worden wat betreft afhankelijk-

17

heid van temperatuur, celmetabolisme, filamentsysteem, Ca 2 +, etc., in verband met literatuurgegevens over het effect van deze parameters op verschillende typen celceladhesie. Wellicht kunnen wij oppervlaktecomponenten van hepatocyten en:tumorcellen isoleren, waarmee deze interacties geremd kunnen worden. Varianten van tumor cellijnen, b.v. wel en niet metastaserende cellijnen WGAresistente varianten, etc., kunnen in dit systeem, getest worden op hun invasievermogen. Interacties tussen hepatocyten en normale cellen, met name leucocyten, en tussen tumorcellen en cellen uit andere organen zullen bestudeerd worden. Indien bij nader onderzoek mocht blijken dat galNac-terminale glycoconjugaten inderdaad betrokken zijn bij de phagocytose van tumorcellen door Kupffer cellen zal getracht worden deze conjugaten te isoleren m.b.v. affiniteitschromatografie. De aanwezigheid van deze conjugaten op tumorcellen zal getest worden met lectinen gekoppeld aan ferritine. Misschien kan phagocytose bevorderd worden door expositie van terminal galNac d.m.v. enzymatische of chemische behandelingen van cellen. De hypothese dat IgG uit normaal serum een rol speelt zal nader getoetst worden met behulp van geisoleerde Kupffer cellen in vitro.

III.5 Expressie en dy.namiek van celoppervlakte componenten bij leukemie in relatie tot de extracellulaire omgeving~ W.J. van Blitterswijk, P. Emmelot, C.A. Feitkamp, J. Hilgers, H. Hilkman, G. de Veer, M. de Vries. Door typering aan de hand van celoppervlakte markers zal worden getracht de T-cel leukemieën in de GR muizestam te "plaatsen" in de T-cel differentiatie reeks. Als nieuwe markers zullen het T200 antigeen (l.S. Trowbridge, J. Exp. Med. 148: 313-323, 1978) en de receptor voor peanut lectin worden gehanteerd. De dynamiek in het celmembraan, betreffende afscheiding en eventuele heropname van membraancomponenten/-blaasjes door de cel, en het daaraan ten grondslag liggende mechanisme zal nader worden bestudeerd. Er zal worden nagegaan of er domeinvorming in het membraan voorkomt waarin (tumor-)antigeen expressie en/of shedding van membraancomponenten (vesicles) hoger is dan elder in het membraan. Microvilli kunnen zullen domeinen zijn. De morphologievan afgescheiden blaasjes in relatie met het plasmamembraan zal. nader worden bestudeerd. Effecten van temperatuur en fixatieven en mogelijke artefacten hierdoor zullen worden nagegaan. Eveneens zal worden nagegaan of antigeen-expressie en/of shedding beinvloed wordt door de lipide fluiditeit (o.a. cholesterol gehalte) van het membraan en immuuninteracties. Analoog en parallel met het GRSL onderzoek zal in samenwerking met A. Kolk (project III.6) een aanvang gemaakt worden met het bestuderen van plasmamembranen en extracellulaire blaasjes van een humane leukemie (Molt 4 cellijn) . Dit systeem zal ook zoveel mo18

gelijk multidisciplinair (biochemisch, immunologisch en morphologisch) worden onderzocht.

III.6 Onderzoek naar van leu~emie cellen

membraanglycop~2tiden

(glycoproteinen)

A.H.J. Kolk, J. van Ramshorst, W.J. van Blitterswijk.

Molt cellen, het uitgangsmateriaal voor leukemische cellen, zullen in hoeveelheden van 8-15 liter gekweekt worden. De isolatie van normale T cellen uit perifeer bloed zal verbeterd moeten worden. Membranen zullen geisoleerd worden van grote hoeveelheden verse Molt cellen en normale T cellen. De isolatie van membranen is gewenst om in volgende stappen geen last te hebben van cytoplasmatisch en kern materiaal. De membranen in het kweekmedium van Molt4 en Molt4f zullen worden vergeleken met de uit de overeenkomstige cellen geisoleerde membranen. Ook spontaan oplosbaar materiaal dat door de cellen van beide cellijnen in het medium wordt afgestoten zal zowel onderling als met spontaan oplosbaar materiaal van de normale T cel vergeleken worden. De mogelijkheid of dit geschikt is als uitgangsmateriaal zal worden onderzocht. De verbetering van de technieken van gelfiltratie met zachte gels zoals Sephadex en BioGel gericht op scheiding van Molt4 glycopeptiden is bijna afgerond. Gelfiltratie met semirigide gels en rigide gels is in voorbereiding. Het is mogelijk om glycopeptiden met hogedruk vloeistof chromatografie te scheiden (in samenwerking met Van Beek en Van Hoeven). De resultaten zullen worden vergeleken met de tot nu toe gebruikte technieken van gelfiltratie. Naast de detectie door meting van 3H-fucose inbouw in glycopeptiden zullen ook andere detectie-mogelijkheden zoals optische dichtheid bij 206 nm onderzocht worden. Glycopeptiden zullen gescheiden worden door combinatie van lectinen Sepharose kolommen van verschillende suiker specifiteit. De mogelijkheid bestaat om met anti-B2 microglobuline HLA antigeen en mogelijk ook leukemie specifieke glycoproteinen te isoleren. De mogelijkheden om glycopeptiden te scheiden met behulp van ion uitwisselings chromatografie, polyacrylamide gel electroforese, iso-elektrisch focuseren en papier electroforese zullen worden nagegaan. De geisoleerde glycopeptiden uit Molt cellen zullen al of niet gebonden aan bovine serum albumine als drager worden ingespoten bij konijnen. De verkregen antisera zullen al of niet na absorptie met glycopeptiden uit normale T cellen op hun specificiteit worden beproefd.

* KWF

annotatie XV.5

19

20

Sektie IV

IV.l

TUMOR IMMUNOLOGIE

Immunologische onderzoekingen bij melanoom p'atiënten

IV.la Spontane cy.totoxiciteit en tumor sp.ecifieke immuunreactiviteit. J.E. de Vries, B. Honig, G. de Graaf, W.S. Bont el Het onderzoek naar mechanismen van spontane cytotoxiciteit (SC) en karakterisering van de effector cellen (in vergelijking met effector cel in ADCC testen) zal worden voortgezet. Het accent zal komen liggen op: .a de verhoogde SC welke gevonden wordt na het kweken van lymfocyten; .b wat de effecten van geactiveerde monocyten (via b.v. PME, LPS, CP en BCG) op de SC zijn. elI Er zal gestart worden met een onderzoek bij melanoom patiënten naar de generatie van specifiek cytotoxische T cellen in vitro d.m.v.: .a co-cultivatie van lymfocyten met autologe tumorcellen, eventueel enige malen herhaald; .b co-cultivatie van lymfocyten met autologe tumorcellen gevolgd door een kortdurende allogene stimulus met een pool van 20 verschillende lymfocyten donoren (pool sensitisatie) ; .C door pool sensitisatie alléén. eIII M.b.v. specifieke groeifactoren voor T lymfocyten zal getracht worden de onder 11 gegenereerde cytotoxische T cellen continu te laten prolifereren. Deze cytotoxische cellijnen kunnen vervolgens gekloond worden om zodoende tegen melanoom- en (door de pool sensitisatie geïnduceerde) tegen HLA gerichte cytotoxische Tcellen van elkaar te scheiden . • IV M.b.v. 1 x g scheidingstechnieken zal er nagegaan worden of er bij tumor patiënten suppressor cellen voorkomen die lymfocyten activatie d.m.v. mitogenen, antigenen en in MLC onderdrukken.

IV.ld Potentiëring en inductie van natural killer (NK) cel activiteit bij de muis d.m.v. BCG en tumorcellen H. Spits, J.E. de Vries, S. Pourier Het onderzoek naar de inductie en het potentiërend effect van het inspuiten van tumorcellen op de NK cellen zal worden voortgezet. Tevens zal getracht worden om iets meer over het mechanisme van inductie enjof potentiëring (via zowel BCG als tumorcellen) te weten te komen. Het accent 21

zal hierbij liggen op het onderzoek naar de rol van interferon in dit systeem. "

IV.le

Melanoom membraanantigenen

C. Vennegoor, A. Jonker, Ph. RÜffike, in samenwerking met M. Jonker, Primatencentrum Rijswijk Nieuwe ape-antisera tegen melanoom zullen worden getest op hun specificiteit. Antisera die in de complement afhankelijke cytotoxiciteitstest negatief zijn zullen met andere testen worden onderzocht (binding van I125- ge l a beld proteïne A of binding van FIT of I125- gelabeld F(ab)2 anti-rhesus Fc. In samenwerking met J. Hilkens (sektie V) zal begonnen worden met het maken van somatiscl:le hybriden van mUize-myelomacellen (P3-X63-Ag8 of P3-NSI/I-Ag4-1) en miltcellen van met melanoom geïmmuniseerde BALB/c muizen. De antilichamen die door deze hybriden worden geproduceerd zullen eveneens op hun specificiteit voor melanoom worden getest. Ook zal worden nagegaan of door middel van heterogene toediening van priming en boosting antigeen aan de BALB/c muis hybride celklonen kunnen worden geïsoleerd die algemeen met melanoom kruis reagerende antilichamen prodUceren. De" meest geschikte antilichamen zullen worden gebruikt voor verdere zui,rering en karakterisering van melanoom membraanantigenen.

IV.2

Membraanantigenen van leukemie cellen

A. Hekman, H. Pomp Als uitgangsmateriaal voor de isolatie van membraaneiwitten en glycopeptiden zullen twee leukemie cellijnen (Molt 4 en Molt 4F) op grote schaal gekweekt worden, in samenwerking met A. Kolk (project XV.5). Methoden voor de isolatie van plasmamembranen van deze cellen worden verbeterd in samenwerking met W. van Blitterswijk. In eerste instantie worden T lymfocyten uit perifeer bloed gebruikt als controle cellen. Het bezwaar van een vergelijking tussen gekweekte en niet-gekweektè cellen kan ondervangen worden door althans voor sommige experimenten T lymfocyten te gebruiken die gekweekt zijn in geconditioneerd medium afkomstig van met PHA gestimuleerde lymfocyten (Ruscetti et al., J. Immunol. 119:131, 1977). Uiteindelijk, en in ieder geval voor het testen van antisera, zullen ook niet-gekweekte leukemie cellen worden gebruikt. Membraaneiwitten - zo nodig gelabeld met radioactieve isotopen - zullen gefractioneerd worden door affiniteitschromatografie" aan lectines. Ook de toepassing van gebonden antistoffen tegen ~2 microglobuline zal worden onder22

zocht. Fracties van de diverse cellen worden vergeleken d.m.v. polyacrylamide gel electroforese en d.m.v. immunologische reacties met verschillende antisera tegen membranen en membraancomponenten. Deze antisera worden na absorptie met (combinaties van) normale lymfocyten, B cellijnen en de reciproke Molt cellijn getest op hun T cel dan wel leukemie cel specificiteit. Geïsoleerde glycoproteïnen die verschillen in de diverse cellen zullen worden afgebroken en op hun glycopeptide patroon worden onderzocht in samenwerking met A. Kolk.

IV.7 Het mechanisme van l~fadenopathie na chronische toediening van difenyl-hydantoine in muizen H. Gleichmann, F. Reinders Het is nu duidelijk dat door toediening van difenyl-hydantoine (DPH) structuren op het oppervlak van lymfolde cellen zodanig veranderd worden dat syngene lymfocyten ze als "niet-zelf" herkennen. De volgende experimenten zullen worden verricht: Ol Het aantonen van de aanwezigheid van DPH op het celoppervlak met behulp van een antiserum tegen DPH gekoppeld aan FITC en door evenwichts-dialyse. 82 Als DPH in de celmembraan verankerd is zal nagegaan worden of het preferent gebonden wordt aan een bepaalde component d.m.v. co-capping met antisera tegen antigenen van het MHC. -3 In vitro en in vivo proeven om vast te stellen welke cellen fungeren als responder en als stimulator cellen . • 4 Een analyse van de specificiteit van het suppressie effect dat geïnduceerd kan worden door voorbehandeling met DPH voor de PLN test. 85 Kinetiek van de suppressie. 86 Bepaling van de cellen of factoren die de suppressie bewerkstelligen . • 7 Follow-up studies om na te gaan of chronische opname van DPH een polyclonale B cel stimulatie en ernstige lymfadenopathie kan induceren.

23

24

Sektie V. VIROLOGISCHE FACTOREN BIJ HET ONTSTAAN VAN TUMOREN BIJ. DIER EN MENS V. 1

~ioleculaire

biologie van RNA tumorvirussen

R. Michalides, J.H. Daams, L. van Deemter, R. Nusse, A. Riethorst, E. Wagenaar, M. Zijlstra. De algemene doelstelling van het onderzoek binnen het project V.l is: op welke wijze is het muizen mammatumorvirus (MTV) betrokken bij de ontwikkeling van mamma tumoren bij de muis. Hierbij wordt in 1979 gewerkt aan de volgende werkplannen. -I Localisatie van de verschillende Mtv inductiegenen in het muizegenoom met behulp van: .a In situ hybridisatie, waarbij radioactief gemerkt MTVRNA wordt gebruikt om de I-itv genen te localiseren (Michalides, Zijlstra, i.s.m. Hilkens) . • b Selectieve fragmentatie van muizen DNA met behulp van restrictie enzymen gevolgd door hybridisatie met raà.ioactief gemerkt MTV-DNA. Hiermee wordt de relatieve plaats van de ~iTV-DNA copieën bepaald (Michalides) . Het deze techniek wordt ook de distributie van ~~TV-DNA copieën over de diverse muizen chromosomen in de somatische celhybriden E36 x GRSL nagegaan (i.s.m. Hilkens). 2_ Regulatie van de expressie van HTV . • a De grootte van de diverse MTV-RNA klassen van organen als mamma tumoren , melkklieren en milten van diverse muizenstammen wordt met behulp van moleculaire hybridisatie bepaald. Dit om na te gaan of de 3 HTV-RNA's (voor gag, env en "onc") in de diverse organen aanwezig zijn. Onderzocht worden organen van C3H, C3Hf, 020, C57BL en BP~B/c, al dan niet met hormonen of carcinogenen behandeld (materiaal reeds verzameld) (Michalides, van Deemter) . Translatie van op·.·sedimentatiesnelheid gescheiden intracellulaire MTV mRNA.' s. Dit experiment moet in vitro synthese van env eiwitten (vertaald van mRNA's kleiner dan het volledige 35S virion RNA) en eventueel van "onc" eiwitten mogelijk maken (Nusse, Michalides) . eb Nagegaan wordt in hoeverre de ~.TV expressie fluctueert met de hormonale status van de muis. Daartoe worden van de stammen C3H, C3Hf, C57BL, al dan niet met hormonen behandeld, melkklieren verzameld tijdens en tussen de diverse lactatiestadia. Deze worden onderzocht op hoeveelheid ~~.TV­ RNA en MTV-antigenen (Michalides, Nusse, van Deemter, i.s.m. Boot en Röpcke) . DC Het effect van H-2 haplotype expressie op de regulatie van MTV expressie wordt nagegaan door in terugkruisingen van (020 x OIR) x 020 de ~~TV-RNA expressie en H-2 status te bepalen (Michalides, van Deemter, i.s.m. Démant). -3 Onderzoek naar variante.n van MTV. Nieuwe technologische ontwikkelingen maken een hernieuwde aanpak hiervan mogelijk . • a Tryptic peptide analyse van ~~TV eiwitten, gescheiden 25

over SDS gels en in de gel gelabeled met 125 I . Er kan hier met kleine hoeveelheden van laag gezuiverde viruspreparaten gewerkt worden. ab Tl rNase oligonucleotide analyse van NTV-RNA's. Door RNA in vitro te labelen met 32p kan ook hier met geringe hoeveelheden ongelabeled materiaal worden volstaan (Nusse, i.s.m. Dr. J. Mol, Erasmus Universiteit, Rotterdam).

84 Controle over MTV expressie via vaccinatie van met formaline behandeld MTV. Het effect van vaccinatie met MTV, dat met formaline is behandeld, op de expressie van ~1TV en het optreden van mammatumoren wordt nagegaan in de muizenstammen C3H, C3Hf en_020. Deze stammen "lOrden al dan niet hormonaal gestimuleerd. In deze dieren wordt de humorale immuunrespons tegen ~1TV als ook de complement afhankelijke cytotoxische immuunrespons gericht tegen virale antigenen op mammatumorcellen op diverse leeftijden bepaald. Het verzamelen van sera van deze muizengroepen is bijna voltooid U1ichalides, "l'Tagenaar, i.s.m. Boot en Röpcke) . 85 Transformatie parameters van mammatumorcellen . • a Diverse transformatie parameters zullen worden nagegaan om verschillen te vinden tussen normale melkkliercellen, MTV geïnfecteerde melkkliercellen, hormonaal, chemisch of viraal geïnduceerde mammatumoren en spontane mammatumoren. Hiertoe zjn in het afgelopen jaar diverse cellijnen gemaakt, waaronder van melkklieren van C3Hf, BALB/cbehandeld met rö-straling en urethaaniviraal geïnduceerde mammatumoren, C3H, en BALB/c ingespoten met MTV (BALB/c) i en spontane mamma tumoren, BALB/c en GR. Deze cellijnen worden in eerste instantie onderzocht op groeisnelheid, celdichtheid, groei in of op ag ar al dan niet met "voedingslagen" van andere celtypen, con A binding, assays, en de aanwezigheid van een speciale groep glycopept~den, welke karakteristiek is voor tumorcellen (zie ook project III). Van belang is het in dit project na te gaan of l-1TV infectie v:an melkkliercellen verandering~n teweeg brengt, waardoor eventueel transformatie parameters herkenbaar worden in met HTV geïnfecteerde cellen (Michalides en Zijlstra, student, i.s.m. Smets) . ab Analyse van de totale eiwitsamenstelling van "normale" en "getransformeerde" melkkliercellen door middel van tweedimensionale electroforese, iso-electrisch focussing en SDS gel ,electroforese. Doel is identificatie van transformatie specifieke eiwitten, al of niet virus geïnduceerd (Nusse) . 06 Infectieweg van het MTV. In het komende jaar wordt in het onderzoek de nadruk gelegd op de opname van MTV in de darm en het transport van daar naar de melkklieren. Resultaten van het afgelopen jaar toonden aan dat MTV expressie plaatsvond in bloedvormende organen, milt, lever en vooral beenmerg van BALB/cfC3H, maar dat voor de leeftijd van 4 maanden geen expressie in de melkklieren tot uiting kwam. Dit laatste werd wel gevonden 26

in GR muizen; hier is waarschijnlijk het endogene GR-MTV bij de expressie betrokken. Het verdere onderzoek wordt als volgt voorgesteld: .a Nadere analyse van welke cellen MTV positief zijn in de bloedvormende organen van BALB/cfC3H. Hierbij worden bloed- en beenmergcellen van BALB/cfC3H muizen gefractioneerd met behulp van de "1 x g methode" (i.s.m. Bont) en vervolgens wördt bezien welke celtypen (bepaiing i.s.m. v.d. Valk) positief zijn voor de MTV expressie. eb Wanneer worden BALB/cfC3H positief voor ~·1TV expressie? GC Infectie-experimenten, waarbij zowel celextracten en totale cellen van bloenvormende organen van BALB/cfC3H ingespoten zullen worden in gevoelige BALB/c muizen.

V.2 De biologie van de mawIDatumorvirussen Ph. Hageman, J. Calafat, J. Hilgers, A. Timmermans, A.A. Verstraeten, K. Weijer, D. Atsma, R. Beurs, E.M. Groeneveld, L. v.d. Mispel, S. Rueb. ol HTV in lage mammatumorstammen. Voor zover vaccinatie-experimenten kunnen worden uitgevoerd zullen de vaccinaties in de diverse projecten worden ~eco­ ordineerd. In 2.1 zullen muizen passief worden gelmmuniseerd door het toedienen van gammaglobulinen van· heteroloog anti-~~.TV aan pasgeboren muizen of aan zwangere dieren. Hiervoor worden BALB/c muizen gebruikt (geen HTV expressie) en C3Hf muizen (met MTV expressie). Beide stammen hebben als forcebreeders een mammatumorpercentage van ongeveer 40% zodat zowel dalen van het percentage als enhancement kunnen worden gemeten. Van tijd tot tijd zullen de dieren worden getoetst op de aanwezigheid van antilichamen tegen J)~.TV en ~~TV antigenen in de melk. 82 Gastheerreeks van J)1TV. In de nieuvle proefdie:rruimten zullen slechts enkele, meer geselecteerde proeven worden uitgevoerd. Het verschil tussen C3H-MTV and BALB/c-MTV zal worden bestudeerd, evenals het eventuele verschil in oncogeniciteit tussen ~'TV uit melk en uit mamma tumoren. Hiertoe zullen worden vergeleken oncogeniciteit en infectiviteit in de BALB/c van virus çreisoleerd uit melk van BALB/cfC3H, BALB/c-O en C3H muizen en uit individuele mamma tumoren van BALB/cfC3H en C3H. Het is ook mogelijk twee MTV varianten uit weefselkweek, met zeer verschillende oncogeniciteit, te vergelijken. -3 Mammatumoren van de rat. Enkele isolaten uit rattemammatumoren of weefselkweken van tumoren zullen worden getoetst op oncogeniciteit in jonge ratten met hypofysetransplantaat en in BALB/c muizen. Helk, organen en mammatumoren van enkele groepen U en R ratten zullen voor en na affiniteitschromatografie worden

27

getoetst op de aanwezigheid van met ~~TV kruis reagerende antigenen. Dit geïsoleerde materiaal bleek reeds jodeerbaar en immuunprecipiteerbaar. Na karakterisering van dit kruisreagerende antigeen willen wij een interspecies radioimmunoassay opzetten met gelabeled rattenantigeen en antimuizen M.TV serum. Deze RIA heeft in het algemeen een breder spectrum en zou daarom heel geschikt kunnen blijken te zijn voor het detecteren van met MTV verwante antigenen in andere diersoorten zoals de mens. Coupes van ratte-organen en mamma tumoren zullen worden getoetst op kruisreacties met antiMTV met immuunfluorescentie en immunoperoxidase tests. In de weefselkweek zullen de experimenten met IdrU en rattemammatumoren worden herhaald. Tevens zal worden getracht ratte-embryocellen of normale ratte-niercellen te infecteren met reeds uit de ;.reefselkweek geïsoleerde preparaten. Er wordt nagegaan of de hoeveelheid met MTV kruisreagerend materiaal hoger is in melkklieren van bestraalde of met urethaan behandelde U of R ratten, die immers in een hoge risicogroep vallen dan in de controle ratten. ~1ateriaal van deze dieren wordt bewaard voor eventuele moleculaire hybridisatie studies . • 4 Mammatumoren bij de kat. oa Virus aanwezig in mammatumoren determineren . • b Transmissie experimenten in pasgeboren katten, muizen en ratten. Het celvrij homogenaat moet niet te veel gezuiverd zijn (zoals in vorige transmissie experimenten) om te voorkomen dat ook virus uit het homogenaat verwijderd wordt. oC Door middel van RIA enlof RIP antilichamen tegen bekende oncornavirussen in sera van katten met mamma tumoren proberen aan te tonen (i.s.m. Dr. Arthur, Frederic Cancer Cente~ Haryland, USA) . • 5 Een mogelijk virale etiologie van menselijke mammatumoren. Van de reeds bepaalde menselijke melkmonsters zal in duplo monsters worden nagegaan of het antigeen deeltjes-gebonden is. Monsters die positief zijn in de RIA voor MTV p27 en gp 52 zullen ook worden getoetst in een RIA voor ~~.uLV p30 (moet negatief zijn) en in een RIA voor MTV antigeen bij andere antiserum concentraties. Het kruisreagerend antigeen zal nader worden gekarakteriseerd, in navolginq van het werk van R. Nusse met MTV. Coupes van menséli]ke mammatumoren zullen worden getoetst met diverse antisera met immuunperoxidase tests. Er zullen antigeen isolaties worden verricht uit pools van positieve mamma tumoren , waarna deze in ~~.TV RIA's worden getest. De voorlopige experimenten waarbij pleura/ascitesvochten werden gescheiden in immuuncomplexen/antistoffen en antigenen en waarbij de fracties werden getoetst op kruisreactie met gp52 en p27 van MTV zullen worden uit~ebreid. De fracties zullen verder getest ;'lorden met SDS-polyacrylamide gelelectroforese, immunoelectroforese en een radioimmunoprecipitatietest op endogene antistoffen. Met immunoaffiniteitschromatografie zal worden gezocht naar

28

tegen HTV reagerende antistoffen in sera van marnmacarcinoompatiënten.

V.3 Onderzoek naar het ontstaan van lymfosarcoom/leukemie door tumorvirussen K. Weijer, J. Calafat, J.H. Daarns . • Leukemie bij de kat oa Nadat de proteïne-A (solid-face) test en de fluorescentie-neutralisatie test geschikt zijn gemaakt om antistoffen tegen FeLVaan te tonen, zullen alle sera van katten die reeds in de FOC~~-test getest zijn en sera van katten uit onze vaccinatie experimenten, onderzocht moeten worden. Ook sera van bepaalde groepen mensen - mensen met leukemie, mensen die FeLV-positieve katten in bezit hebben of hebben gehad en andere mensen die met FeLV in contact komen, zoals dierenartsen en bepaalde laboranten - moeten met deze gevoelige tests onderzocht worden. Bovengenoemde katten- en mensensera zijn reeds in ons bezit. -b Verder ontwikkelen van een veilig vaccin tegen FeLV, dat voldoende bescherming biedt tegen infectie met FeLVen tegen ontwikkeling van lymfosarcoom/leukemie of andere met FeLV-geassocieerde ziekten . • c Onderzoek naar glycopeptiden van lymfocyten van FeLVnegatieve en FeLV-positieve (klinisch gezond of ziek) katten.

V.4 De chemische inductie van endogeen tumor muizenstammen

~~TV

in lage marnma-

J. Links, R. Hichalides, R. Nusse, O. Tol, E. Wagenaar. Ons doel is het mechanisme van de chemische inductie van endogeen MTV in vitro te bestuderen. 'V'7e maken hierbij gebruik van reeds eerder, chemisch in hun morfologie getransformeerde, B~1.KC (baby mouse kidney cell)lijnen, afgeleid van een aantal lage mammatumor (MT) muizenstammen (B~~B/c/Hei BALB/c/Crgli C57BL/Lii ~~i 020). Deze cel lijnen scheiden !l1:TV- en HuLV-virionen af in het medium (bewezen voor de eerste 3 genoemde muizenstammen) . De geïnduceerde ~~TV-varianten bleken adenocarcinomas van :de~_mèlkklier -in homologe vrouwelijke dieren te kunnen doen ontstaan. Onze B~C-lijnen zijn in zekere zin unieki er is qeen ander in vitro systeem bekend waarin endogeen ~TV geïnduceerd kon worden. Het onderzoek zal zich voorlopig toespitsen op de volgende vragen: ea Is de transformatie een noodzakelijke voorstap van de chemische virusinductie? 29

Experimenteel betekent dit: kunnen we MTV-antigenen ontdekken in de chemische (3-methylcholanthrene; 5-bromo-2deoxyuridine) behandelde BMKC voordat een morfologische verandering (transformatie) optreedt? Het cellen materiaal voor dit deel van het onderzoek is grotendeels reeds aanwezig; levend (diepgevroren) en dood (gefixeerd op glas) . Gebruikt zullen worden de indirecte immunofluorescentie (IIF) en een immunoperoxidase (IPA)- techniek. ob Bevatten de morfologisch getransformeerde en MTV (en MuLV) producerende BHKC behalve meer MTV-RNA ook meer HTVDNA dan de onbehandelde controles? Onderzoek in deze richting beantwoordt de vraag of er behalve derepressie van de reeds aanwezige (germinale) MTV-provirus copieën ook inbouw van nieuwe copieën (somatisch) MTV-provirus plaatsvindt als gevolg van de chemische inductie. oc Kan het aantal geïntegreerde MTV-DNA copieën per virus producerende cel met de tijd veranderen? Een aantal waarnemingen zou hier op kunnen wijzen. ~et de toename van de in vitro leeftijd van enkele MTV producerende BMKC-lijnen werd de verhouding MTV-productiejMuLVproductie duidelijk kleiner, terwijl de ])~uLV-productie per cel constant bleef of zelfs iets toenam. Een andere waarneming was, dat twee van de virus (])1TV en MuLV) producerenBMKC-lijnen, afgeleid van dezelfde partij BMKC en van dezelfde in vitro leeftijd, MTV en MuLV in geheel verschillende verhoudingen produceerden . • d Bestaat er een oorzakelijk verband tussen de dalende ])1TV productie en de ongeveer gelijkblijvende ~~uLV-produc­ tie? Korter geformuleerd: kan ])1uLV met ])~TV in de cel interfereren? oe Kan in homologe vrouwelijke muizen het percentage MT op jongere leeftijd als gevolg ván de Lp. injectie van HTVproducerende m·1KC verhoogd worderi -·tot een plafond-waarde? .f Welke zijn de variant-specifieke kenmerken van de 5 belangrijkste structurele antigenen van het recent beschikbaar gekomen C57BLjLi-MTV vergeleken met die van de reeds goed bestudeerde MTV-varianten uit de hoge M.T muizenstammen (C3H en GR)? Dit kan onderzocht worden door de electroforetogrammen (op polyacrylamide) van partiële hydrolyseproducten (door trypsiniseren verkregen peptiden) van de overeenkomstige antigenen te vergelijken.

30

Sektie VI. GENETISCHE FACTOREN BIJ HET ONTSTAAN VAN TUMOREN BIJ DIER EN ~~NS VI.l Genen die de inductie en replicatie van het mammatumor virus be Invloeden J. Hilgers, L.M. Boot, J. Hilkens, R. Michalides, R. van Nie, R. Nusse, G. Röpcke, ~~.A. van der Valk, A.A. Verstraeten, A. Bakker-Kerkhof, F. Buys- v.d. Schaaf, E. van Deemter, E.M. Groeneveld, J. de Moes, L. Rijswijk De genetische analyse van het onts'taan van mammatumoren in de muis wordt voortgezet. Naast genen, die de inductie en replicatie van het mammatUIfJ.Or virus be Invloeden , v!ordt ook gezocht naar genen die een rol spelen bij het ontstaan van hormonaal geInduceerde mamma tumoren. Getracht zal worden de genen éen voor éen te analyseren om uiteindelijk het samenspel van de genetische factoren in het proces van de tumorgenese te doorgronden. De twee genen die uitvoerig bestudeerd zijn is het Mtv-l in de C3Hf stam en Mtv-2 in de GR stam. De twee genen zijn gelegen op verschillende chromosomen, nl. Mtv-l op chromosoom 7 en Mtv-2 op chromosoom 18. Van Mtv-2 is bekend dat dit gen een aantaÏ DNA copieën van het MTV-PNA vertegenwoordigt. Onderzocht wordt of ~ltv-l ook aanwezig is in andere muizenstammen. De proeven met de DBAf stam zijn in een gevorderd stadium terwijl oriënterende proeven worden gedaan met muizen van de congene GR lijn. Tevens zal de stam SL in dit onderzoek worden betrokken. el 1:)e localisatieproeven voor ~·iTV-l in de C3Hf en DBAf stammen zullen worden afgerond. De loci voor expressie van endogene MTV's in de GR/Mtv-2- en SL stammen zullen bepaald worden. De ontwikkeling van een vollediq congene stam voor Mtv-2 zal met SPF dieren voortgezet wörden. Het effect van Mtv-2, niet alleen op de incidentie van mamma tumoren bij vrouwtjes en leukemie bij mannetjes, maar ook opeen aantal andere parameters zal m.b.v. de GR en GR/Mtv-2- stawmen onderzocht worden. Er wordt een begin gemaakt met de ontwikkeling van zogenaamde recombinant ingeteelde (RI) stammen tussen GR en ingeteelde Mus musculus molossinus muizen (~OL3). Deze stammen kunnen gebruikt worden voor een aantal doeleinden, zoals (1) localisatie van endogene ~1TV's en M.uIV's, (2) localisatie van genen voor gevoeligheid t.o.v. exogene M.TV' s en ~~uLV' Si (3) localisatie van nieuwe genetische markers, en (4) localisatie van genen voor eventuele spontane tumoren die in de P.I stammen zonder twij fel zullen optreden (mammatumoren, leukemie, levertumoren,etc.). e2 De experimenten met C3H-MTV in C3Hf bastaarden en terugkruisingsgeneraties worden in het komende jaar beëindigd en zullen dan uitgewerkt worden, alvorens gestart wordt met nieuwe proeven die in de toekomst hoogstwaarschijnlijk met RI stammen zullen worden ondernomen.

31

.3 De experimenten over het ontstaan van mamma tumoren onder invloed van hypofysetransplantaten zijn voorlopig afgesloten en worden nu uitgewerkt. Er zal een begin gemaakt worden met een serie recombinant ingeteelde stammen tussen de STS en de BALB/c stammen die gebruikt zullen worden om de genen te localiseren voor resistentie tegen hormoon geinduceerde mamma tumor en in de STS stam. Deze PI stammen zullen ook gebruikt worden voor het bepalen van genen .die de resistentie van de STS tegen exogeen MTV beïnvloeden . • 4 De genetica van de natuurlijke immuunrespons tegen MTV zal worden voortgezet met de door ons ontwikkelde radioimmunoprecipitatie test. De nadruk zal komen te liggen op de primaire respons, waarbij het 125I-ProtA als conjugaat vervangen wordt door 125I gemerkt anti/muis IgM(Fc)/7S. Er zal speciaal gekeken worden naar het mogelijk effect van l-ltv-1 op deze respons in de BALB/c x (BALB/c x C3Hf) BCI terugkruising . • 5 De genetica van de gevoeligheid voor het ontstaan van thymus leukemie in de ~~R stam wordt voortgezet met de door ons ontwikkelde congene stam STS/Akv-e. Daarnaast zal onderzoek plaatsvinden aan de FI bastaarden tussen 020 en AKR en wellicht C3H.NB en AKR. De nadruk zal liggen op het meten van de expressie van xenotroop MuLV, naast die van ecotroop l-luLV. De genetica van de expressie van endogeen MuLV in de BIO.Y zal zich toespitsen op het bepalen van de regio binnen het H-2 locus die deze expressie beïnvloedt. De immuunrespons tegen BIO.Y virus m.b.v. de door ons ontwikkelde RIP test wordt ook bekeken als functie van de H-2 regio, speciaal in hybriden met BIO.A, BIO.A(2R), BIO.A(3R), BIO.A(4R), BIO.A(5R). Een en ander wordt gecoördineerd met A. Colombatti (Universiteit van Padua) en in samenwerking uitgevoerd met A. Dux en P. Démant . • 6 De experimenten gericht op het vinden van genen die het ontstaan van sarcomen door MSV beïnvloeden worden voortgezet in het 020/0IR systeem. Het onderzoek naar sarcoom ontwikkeling door MSV infectie in de stammen van het NKI zal worden afgerond met een publicatie . • 7 De karakterisering van de serie somatische celhybriden tussen GRSLl3 en E36 wordt voortgezet. Getracht zal worden de genen voor endogeen MTV en ~~uLV te localiseren en wat betreft MuLV ook de genen die de expressie ervan regelen. De cholera toxine receptor zal zeer waarschijnlijk snel gelocaliseerd kunnen worden, samen met enkele nieuwe isoenzym markers. Een serie van latere hybriden geeft expressie te zien aan het celoppervlak van de thymus differentiatie antigenen, zoals TL, Thyl, Lyl en Ly2. Ze segregeren samen met H-2 expressie en allemaal tegelijkertijd. Het feit dat de GRSLl3 de antigenen Thyl, Lyl en Ly2 in gemaskeerde (door carbohydraten) vorm op het celoppervlak heeft en dat deze te voorschijn kunnen komen in bepaalde hybriden, maakt het aannemelijk dat de GRSLl3 een " prothymocyt" was die door 32

het tot expressie komen van MTV "gearresteerd" is in deze differentiatiestaat. Transformatie zou dan "arrest in differentiation" zijn. l'!1.b.v. de EGR hybriden kan bepaald worden hoeveel genen op welke chromosomen de differentiatiestap van prothymocyt naar thymocyt regelen. ~ellicht kan ook het effector cel stadium (T cel) in-rvitro bereikt worden. Deze onverwachte vondsten worden zo snel mogelijk genetisch geanalyseerd.

VI.2 Histocompatibiliteits genen en oncogene se P. Démant, J. Calafat, A. Dux, D. Iványi, R. Nusse, L. Oomen, l'!i. Snoek, P. Elsenburg, H. Janssen, A. van Oosterwijk, J. Shaw. Het tot nu toe verrichte onderzoek heeft aangetoond dat de histocompatibiliteits genen een duidelijke invloedop de tumorgenese kunnen hebben. In het bijzonder (maar niet uitsluitend) zijnhet genen die deel uitmaken van het "major histocompatibility complex" (HHC). Dankzij uitgebreide genetische studies van Prof. Hühlbock, Dr. Dux en medewerkers bestaat er een aantal gegevens betreffende de invloed van het H-2 complex op incidentie van mammatumore~ longtumoren en tumoren van het reticulo-endotheliale systeem. De gegevens zijn meestal gebaseerd op verschillen in tumorincidentie tussen H-2 congene muizenstammen. Een dergelijke relatie tussen tumorincidentie en H-2 genotype is onlangs ook aangetoond in segregerende populaties (terugkruisingen en F2 bastaarden). Sommige van de aangetoonde effecten blijken afhankelijk te zijn van het type en/of afkomst van het betrokken oncogene virus. In bepaalde gevallen was het mogelijk een bepaald deel (regio) van het H-2 complex voor die effecten verantwoordelijk te stellen. Het doel van verder onderzoek is een verklaring te vinden voor de reeds bekende oncologische waarnemingen mede door het bestuderen van de structurele en functionele karakteristieken en wederzijdse interacties van de producten van het l'!iHC en van de virale of andere factoren betrokken bij de oncogenese. Het onderzoek van de structuur en functie van het l'!lliC was de laatste tijd geconcentreerd op de K en D regio, die betrokken zijn bij een complex van phenomenen betreffende de immuunrespons tegen virale en tumor antigenen, bekend onder het samenvattende begrip "H-2 restrictie". In tegenstelling tot het toen algemeen heersende "two locus" model voor de K en D producten hebben "dj een nieuw locus, H-2L in de D regio, ontdekt en onderzocht. Dit onderzoek heeft geleid tot een nieuw model voor het systeem van H-2 antigenen. Omdat onze gegevens aantonen dat verdere complexiteit aanwezig is, wordt een nadere analyse uitgevoerd. Behalve het genetisch belang, geeft de analyse van de complexiteit van de genen en producten van de D regio (die betrokken is bij controle van resistentie tegen MTV) een mogelijkheid het complexe phenomeen van de "H-2 restrictie" in nader definieerbare processen op te splitsen 33

en de functie van aparte producten erin te bepalen. Wij zijn bezig te bepalen of er een physische associatie tussen H-2K, H-2D en H-2L producten en viraal geïnduceerde antigenen bestaat. Zo'n associatie was al aanqetoond op het celmew~raan van vaccina-virus geïnfecteerde cellen. De aanwezigheid van de H-2 antigenen op of binnen t1TV en MuLV deeltjes wordt onderzocht door electronenmicroscopie, radioimmunoprecipitatie en specifieke absorptie. Blijkens de gegevens van een aantal laboratoria hebben tuwnrcellen of virus geïnfecteerde cellen een abnormale expressie van ~lliC producten. In sommige gevallen staat dit phenomeen in een direct verband met de af,,!eerreacties van het organisme, en het ontbreken van deze abnormale expressie leidt tot verlaagde resistentie. Dit phenomeen en zijn mogelijke functie wordt nader onderzocht. Ons vorig onderzoek heeft aangetoond dat de functie van het ~1HC beschouwd moet worden als een uitkomst van complexe interacties van zijn verschillende componenten. Het onderzoek van de func~ ties van de I regio en de S regio is daarom van belang. In ~et bijzonder blijken de complement genen van ~HC, ontdekt en gelocaliseerd in de S regio door P. Démant, een goed aangepast model voor de analyse van regulatie en functie binnen het MHC te bieden. Het onderzoek van dit punt blijkt uiterst belangrijk voor dit prograwma. Dit zou de componenten C2, C4, BF betreffen, evenals de comrlement receptoren en hun integratie in het celmembraan met betrekking tot de al bekende ~HC producten. De analyse van de I regio zou geconcentreerd worden op de karakterisering en genetische analyse van de producten, die serologisch aantoonbaar zijn (Ia antigenen) en met behulp van cellulaire immunologie (MLC, C~~). Ook de functie van deze producten in de regulatie van de immunologische afweer tegen virale en tumor antigenen zal "7orden bestudeerd. Uiteindelijk moeten ook andere componenten van dit supergen (b.v. T/t, Qa, Tla, rds) bij het onderzoek betrokken worden.

VI.4 Incidentie en morphologie van spontane tumoren in muizen van ingeteelde stammen en van congeen resistente stammen M.A. van der Valk, A. Dux, R. van Nie In verband met de verhuizing zal in de nabije toekomst de aandacht vooral worden bepaald op het uitwerken van reeds verkregen gegevens en het verder bewerken van in het verleden verzameld materiaal. De histopathologische steun die verleend wordt aan drie projecten van ons Instituut (II.2, III.S en VI.I) en aan éen project van het Centraal Laboratorium van de Bloedtransfusie Dienst, wordt voortgezet. Indien de personele bezetting het toelaat zal speciale aandacht worden besteed aan een tweetal tumor typen i de

34

diagnostische criteria van de lymphoreticulaire tumoren zou uitgebreid kunnen worden met verschillende technieken: enzymhistochemie, enzymcytochemie (eventueel in samenwerking met P. van Heerde), en serologische technieken (differentiatieantigenen).Tevens zou een bestudering van de functie van de thymus in de ontwikkeling van T cel lymphomen en de organogenese van'de thymus een zinvolle bijdrage kunnen leveren. Daarnaast zou een uitgebreide studie naar de (de)differentiatie in mammatumoren kunnen worden opgezet. Dit in relatie tot het al of niet optreden van metastasen. Stammen die zich hiertoe lenen zijn: BALB/cfC3H/A, GRS/A., 020/A., DBA/LifA.

VI.S Genetische karakterisering, controle en preservering van ingeteelde stawmen van muis en rat J. Hilgers, L.H. Boot, P. Démant, J. Hilkens, F. van Nie, R.J. Nikkels, G. Röpcke. Na de verhuizing van ons Instituut naar de Plesmanlaan zijn nog een vrij groot aantal ~uizenstammen achtergebleven in het oude gebouw aan de Sarphatistraat. Deze stammen moeten via hysterectomie worden overgebracht naar het nieuwe Proefdiergebouw, waar alle stammen worden aangehouden onder gnotobiontische condities en regelmatig gecontroleerd op het voorkomen van ziekteverwekkende agentia. Speciale aandacht wordt besteed aan het herinfecteren van de zogenaamde "hoge mammatumor" stammen met het exogene mammatumor virus. Tevens zullen de enttumoren, die gebruikt worden in experimenten van diverse projecten, worden getest voordat zij worden ingevoerd in het nieuwe Proefdiergebouw. De overgebrachte muizenstammen zullen genetisch ,,!orden gecontroleerd met behulp van markers (isoënzymen, kleurgenen, enz.). De sanering van alle muizen- en rattenstammen zal nog veel energie en tijd vragen, maar zal, naar wij hopen, leiden tot een ziektevrij proefdierbestand. vlij hopen dat deze ingrijpende sanering een positieve bijdrage zal leveren voor het toekomstig experimenteel kankeronderzoek.

35

36

Sektie VII.

FACTOREN BIJ HET ONTSTAAN EN DE GROEI VAN TUMOREN

HOP~ONALE

VII.la Hormonale inductie van mammatumoren bij muis en rat. L.M. Boot, A.A. van der Gugten, H.G. Kwa, G. Röpcke, M. Sluyser, A.A. Verstraeten, R. Bakhuysen, T.F. Demmenie, S. Evers, C. de Goeij, E.M. Groeneveld, T.~~.. Luub, D.L.A. de Rond. In de loop van de laatste jaren zijn een aantal gegevens verzameld hoe via endogene hormonen en exogene hormoonbehandeling mammatumoren opgewekt kunnen worden bij de muis en de rat. Kwalitatief ligt de zaak vrij duidelijk, prolactine is een dominerende factor in dit proces; oestrogenen zijn nodig om de prolactine productie te stimuleren en progesteron heeft een sterk synergistische werking op de actie van prolactine, in ieder geval bij de muis. Kwantitatief zijn slechts gegevens voor handen betreffende prolactine, terwijl wat betreft de steroïd hormonen uiteraard wel de exogeen toegediende doseringen bekend zijn zonder dat gegevens over bloedspiegels, enz. beschikbaar zijn. In enkele gevallen zijn zelfs de resultaten met exogene hormoontoedieningen in tegenspraak met die gevonden in intacte vrouwelijke muizen. De hele problematiek dient meer uit het zuiver biologische vlak gehaald te worden en nader te worden bezien als biochemisch (en uiteindelijk moleculair biologisch) probleem. Voor de toekomst lijkt het daarom noodzakelijk de probleemstelling meer kwantitatief te benaderen, en wel in de volgende opzichten: ea meer bloedspiegel-bepalingen van prolactine en van prolactine-receptoren in de melkklieren, resp. de mammatumoren (A.A. van der Gugten en medewerkers) ; eb idem voor oestrogenen (exogeen en endogeen); ec idem voor progestogenen (exogeen en endogeen); De steroïd hormonen zullen bepaald worden door A.A. Verstraeten met medewerkers; en de stérold hormoon-receptoren door H. Sluyser en medewerkers. Gestart zal worden met de (C57BL x CBA)FI muis, waarbij in gecastreerde dieren verschillende hormoon-behandelingen toegepast zullen worden (hypofyse isotransplantaten in de nier, oestron in drinkwater en S.c. progesteron implantatie) . De verkregen gegevens zullen gecorreleerd worden met de reeds bekende mammatumor percentages. L.M. Boot en G. Röpcke met medewerkers zijn aansprakelijk voor het biologisch technische werk, d.w.z. tot en met het verzamelen van bloed en het mammaweefsel. Als zijlijn van dit onderzoek is er de vraag in hoeverre progesteron invloed heeft op het ontstaan van hypofysetumoren bij muis en rat, speciaal onder invloed van exogene oestrogenen.

37

VII.lb Verband tussen plasma prolactinespiegel en receptor concentratie in target örganen' bij de rat. A.A. van der Gugten, H.G. Kwa, A.A. Verstraeten,T.F. Demmenie, E.M. Groeneveld, T.M. Luub, F. Verhofstad. In het Annual Report 1978 is vermeld dat zowel behandeling als fysiologische achtergrond (geslacht, leeftijd, pariteit) van de rat invloed hebben op het dag/nacht ritme van de plasma prolactinespiegel. Onderzocht zal worden of deze schommelingen in verband te brengen zijn met mogelijke schommelingen in het aantal receptoren. Het doel van dit onderzoek is na te gaan of misschien een bepaalde prolactinepiek overeenkomt met verhoogde gevoeligheid van de mamma voor het hormoon, terwijl een volgende piek overeenkomt met een verhoogde gevoeligheid in een ander target orgaani en tevens of dit patroon door diverse hormonale ingrepen gewijzigd kan worden. Correlatie van plasma prolactinepieken met doelwit organen is relevant i.v.m. het onderzoek naar de plasma prolactine concentraties bij de mens.

VII.2 Onderzoek naar de bijdrage van prolactine aan het ontstäan en de groei van borstkanker bij de mens. H.G. Kwa, A.A. van der Gugten, A.A. Verstraeten, E.M. Groeneveld, T.F. Demmenie, A.M.A. Sanders, F. Verhofstad. De analyse van de resultaten van prolactine bepalingen van plasmamonsters (verzameld van 5000 vrijwilligsters in Guernseyin het kader van een prospectief onderzoek naar het ontstaan van borstkanker) bracht aan het licht, dat zulke plasmamonsters zich leenden voor een transversaal onderzoek naar een samenhang tussen verhoogde prolactine spiegels en een aantal factoren, die tot een verhooqd risico voor borstkanker leiden (zoals nullipariteiti moeder en/of zuster met borstkanker i post-menopausale obesitas, enz.). De bevindingen wijzen uit, dat het mogelijk moet zijn om bij vrouwen met een verhoogd risico door middel van een hormonale behandeling het ontstaan van borstkanker te/voorkomen. Omdat de genoemde samenhang tussen risico-factoren en borstkanker ontwikkeling gebaseerd is op een betrekkelijk klein aantal vrouwen - waarvan bovendien maar betrekkelijk weinig plasmamonsters waren afgenomen in de periode van de vroege.avondpiek in prolactine concentraties, terwijl voor bepaalde risico~factoren bovendien de voorwaarde geldt dat het bloedmonster tijdens de luteale fase van menstruele cyclus moet zijn afgenomen - werd naar een uitgebreider transversaal onderzoek uitgekeken. Op voorstel van Dr. Bulbraak wordt nu samengewerkt door de volgende drie groepen: Dr. Ph. Strax, Guttman Institute, New York, bekend vanwege zijn Health Insurance Project 38

waarin ~en groot aantal vrouwen regelmatig met mammografie gescreend wordt om vroeg borstkanker te detecteren; Dr. R.D. Bulbrook en zijn groep in London, en het Antoni van Leeuwenhoekhuis. Hierbij zullen omstreeks 30.000 serummonsters (éenmalige bloedafname), alle afgenomen tussen 17 en 20 uur over een periode van drie jaar ter beschikking komen. Deze 30.000 vrouwen zullen periodiek vervolgd worden; verwacht mag worden dat binnen vijf jaar een voldoende aantal vrouwen borstkanker ontwikkeld zullen hebben, dat in een vroeg stadium ontdekt zal zijn. De kernvraag hierbij zal zijn: kan men met behulp van endocrinologisch onderzoek uit het totaal onderzochte aantal vrouwen twee groepen onderkennen? Een "hoge risico-groep" welke hooguit 20% van de onderzochte vrouwen zou mogen omvatten, waarin 80% of meer van alle borstkankers gevonden werd, die op grond van specifieke hormonale patronen te onderscheiden zal zijn van de resterende 80 of meer procent van de onderzochte groep waarin maar 20% van de borstkankers zullen zijn ontstaan. Als "spin-off" zullen wij de beschikking hebben over een vele malen zo groot aantal serummonsters voor de bevestiging en uitbreiding van onze bevindingen gewonnen uit het transversale onderzoek op basis van het Guernsey materiaal. Wij hopen daarmee meer inzicht te verkrijgen in de hormonale pathogenese van borstkanker bij de mens. Voorts zal worden samen~ewerkt met Dr. P. Bruning en klinische medewerkers aan een longitudinaal onderzoek naar het 24-uurs ritme van vooral prolactine, progesteron en enkele androgenen bij normale vrouwen, risicodragers en patiënten met een mammatumor.

VII.3 Onderzoek van steroïdhormoon receptoren. M. Sluyser, S.G. Evers-Klaver, C.C.J. de Goeij. el Vergelijkend onderzoek van hormoon-afhankelijke en onafhankelijke cellen van mammatumoren. Doel: Van eventuele specifieke verschillen gebruik maken bij de detectie, diagnose en therapie van borstkanker. Materiaal: Modelsysteem van transplanteerbare mamma tumoren bij muizen van de GR stam, ter vergelijking eventueel aangevuld met materiaal van humane mammatumoren . • a Agglutinatie van tumorcellen m.b.v. lectinen. Onderzoek naar de mogelijkheid van scheiding van de cellen op Con ASepharose kolommen. Samenwerking met W.J. van Blitterswijk. • b Isolatie en zuivering van plasmamembranen van hormoongevoelige en ongevoelige tumoren. Vergelijkend onderzoek van de lipiden samenstelling, H-2 antigenen, membraanantigenen, peroxidase activiteit, microviscositeit. Samenwerking met R.P. van Hoeven, P. Démant en J. Hilgers. oc Adsorptie van 125Jodium aan mammatumoren. Onderzoek naar een mogelijke relatie met hormoon-gevoeligheid van de tumor . • d Scheiding van kernen van hormoon-gevoe~ige en ongevoe-

39

lige marnmatumoren teneinde de opname van hormonen in deze kernen nader te analyseren. Samenwerking met A. Tulp. oe Irnmunofluorescentie van marnmatumoren m.b.v. anti-prolactine antiserum teneinde hormoon-afhankelijke en onafhankelijke cellen te identificeren. of Onderzoek naar de bruikbaarheid van fluoresceïne-gekoppelde steroïden voor identificatie van hormoon-gevoelige cellen in marnmatumoren. -2 Invloed van chemische carcinogenen op hormoonreceptoren. Doel: Onderzoek naar een mogelijke invloed van chemische carcinogenen op de receptor activiteit van cytosols in vitro. Materiaal: Hormoon-gevoelige marnmatumoren van de GR muis; kalfs-uteri. Samenwerking met E. Kriek. -3 Interactie van dexamethason met DNA in vivo. Doel: Onderzoek naar de mogelijkheid dat het DNA van GR muizen levers (dat 12 copieën van het Mtv-gen bevat) meer dexamethason bindt dan lever DNA van de congene GR of C3H stam (die elk 4 copieën van het Mtv-gen hebben). Onderzoek naar de wijze van binding aan het DNA en identificatie van de bindingsplaats. Samenwerking met E. Philippus. Materiaal: GR, congene GR en C3H muizen. -4 Localisatie van de genen van dexamethason receptoren. Doel: Mogelijke relatie van deze genen met Mtv-genen na te gaan. Materiaal: Kweken van GRSL en E36 cellen. Samenwerking met J. Hilgers en J. Hilkens.

VII.4 Modelonderzoek over combineren van hormonale en cytostatische behandeling van marnmatumoren. C. Benckhuijsen, W.J. van Dijk en stafleden Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis. De vraag is centraal komen te staan hoe men voor chemotherapeutische behandeling met aniline mosterd optimaal profijt kan trekken van de toename van lysosomale enzymen, die in hormoon-gevoelige marnmatumoren ontstaan kan tijdens hormonaal geïnduceerde regressie (Annual Report 1978, VII.4.4a) - Verwacht mag worden dat de vroege GR marnmatumoren, die na force-breedingoptreden, een beduidende regressie zullen ondergaan na b.v. een 2e of 3e zwangerschap en een (door niet laten zogen) geforceerde involutie van de melkklieren. Afhankelijk van beschikbare mankracht en beschikbare kweek van SPF GR muizen, zal nagegaan kunnen worden of onder genoemde omstandigheden van regressie, een zodanig gehalte aan S-glucuronidase en andere lysosomale enzymen optreedt, dat dit model van nut zou kunnen zijn voor onderzoek op ruimere schaal van cytostatica die in vivo in belangrijke mate geglucuronideerd worden. - Voor DMBA-geïnduceerde marnmatumoren van de rat zal even40

eens aandacht gegeven moeten worden aan aanvullende en/of vervangende (anti-)hormonale maatregelen naast ovariëctomie, om een zo diep mogelijke regressie teweeg te brengen. Deze dient dan op het beloop van de stijging van lysosomale enzymactiviteiten onderzocht te worden en in verband daarmee op ontstane gevoeligheid voor aniline mosterd (project VIII.2 van deze werkplannen) . • Op korte termijn zal verder getracht worden om aan biopsie-materiaal van (vermoedelijk) hormoon-gevoelige menselijke mammatumoren gegevens te verzamelen of, te oordelen naar optredende gehaltes aan S-glucuronidase, chemotherapie met aniline mosterd in combinatie met hormonale behandeling, voor dergelijke tumoren in aanmerking zou komen.

41

42

Sektie VIII

EXPERIMENTELE CHEMOTHERAPIE EN RADIOTHERAPIE

VIII la De invloed van de interactie van cytostatica met DNA op het proces van DNA replicatie.

J. van der Steen, F.A.M. Buuron, C. Benckhuijsen Zoals aangegeven in het Annual Report 1978 kon publicatie van het tot dusverre verrichte onderzoek nog niet tot stand komen. Het nader uitwerken van de nog voorlopige plannen voor een zinvolle voortzetting van het onderzoek vindt om dezelfde reden vertraging, maar zal in de eerstkomende tijd plaats vinden.

VIII.lb Biochemische en cytologische toetsing van nieuwe derivaten van 5-fluorouracil. F.A.M. Buuron, C. Benckhuijsen De door de tijdelijke stagnatie van project VIII.la ontstane gelegenheid om aandacht te besteden aan een mogelijke analoog van de geactiveerde vorm van 5-fluorouracil, is benut door met waardevolle steun van de Universiteit van Amsterdam (Prof. U.K. Pandit en Dr. G.J. Koomen, Laboratorium voor Organische Scheikunde) dit derivaat te bereiden. Verwacht mag worden dat het in staat zal zijn celmembranen te passeren. Dit in tegenstelling tot de geactiveerde vorm van 5-fluorouracil zelf (zie Annual Report 1978, project VIII.lb). Het NMR spektrum van de verbinding gaf een bevredigende uitkomst; micro-analyse wordt verricht. Met de beschikbare hoeveelheid materiaal hopen wij de eventuele remmende werking van de verbinding op het enzym thymidylaat synthetase te onderzoeken, alsmede de mogelijke cytotoxiciteit tege~over cellen in weefselkweek. Het hangt van deze eerste gegevens af of verder onderzoek zinvol is; dit zal eventueel elders ondergebracht kunnen worden. De experimen~ele er~aring met onderzoek van remstoffen op geïsoleerde thymidy+aat synthetase zal ook aangewend worden in een overeengekomen samenwerking met de research groep van het Laborátorium voor Organische Scheikunde van de Universiteit vanlAmsterdam, welke geïnteresseerd is in de synthese van nieuwe derivaten van 5-fluorouracil.

I

43

VIII.2 ChemotheraRie gebaseerd oR het. gedrag van lysosomale enzymen tijdens hormonale regressie in DMBA-geïnduceerde mammatumoren bij de rat. C. Benckhuijsen, H.G.J. ter Hart,

(E.P. Beem)

De vraagstelling van dit project vloeit voort uit project VII.4b van het Annual Report 1978, waarin de versterkte werking van aniline mosterd wordt beschreven tegen hormoongevoelige mammatumoren bij de rat, tijdens regressie na ovarïectomie. Over het tijdsbeloop van het gehalte aan '-glucuronidase in tumorweefsel na inductie van regressie door endocriene ablatie, bestaan literatuurgegevens die erop wijzen dat een chemotherapie-schema waarin aniline mosterd van de 3e t/m 7e dag gegeven wordt, wellicht het meest werkzaam zou zijn. Aanslui t'end kan dan nog een wekelijkse dosis gegeven worden. Bij intacte ratten werd inmiddels een toxiciteitsstudie gedaan om de dosis vast te stellen die met dit schema verdragen wordt. Andere hormonale maatregelen, zoals anti-hormonen al dan niet na ovarïectomie, komen in aanmerking voor onderzoek naar grootte en tijdsbeloop van de stijging van lysosomale enzymen in DMBA tumoren. Gegevens hierover kunnen tevens als vergelijkingsmateriaal dienen bij voorgenomen bepalingen van enzymgehaltes in menselijke tumoren, zoals opgenomen in de werkplannen van project VII.4. Er zijn pogingen in het werk gesteld om drs. E.P. Beem, biochemicus, in de gelegenheid te stellen in 1979 voor 4 maanden naar Prof.Dr. C.M. Szego in Los Angeles te gaan ter voorbereiding van onderzoek over de intracellulaire verdeling van lysosomale enzymen in hormoon-gevoelige weefsels. Dit naar aanleiding van gegevens van Prof. Szego die erop wijzen dat het tot het normale werkingsmechanisme van o.m. oestrogene hormonen zou behoren om een translocatie te bewerken van lysosomale enzymen naar de kern van de cel.

VIII.3 Farmacokinetisch en toxicologisch onderzoek ten behoeve van het gebruik van adriamycine bij regionale perfusie van de extremiteiten. S.C. van 't Hoff*, C. Benckhuijsen, W.J. van Dijk In 1979 zal het onderzoek afgerond kunnen worden wat betreft het bepalen van de verhouding locale toxiciteit/therapeutische effectiviteit voor regionale chemotherapie met adriamycine in vergelijking met de ratio LD10/ED90 voor systemische toediening. De behandeling vindt plaats voor een in de gastrocnemius-spier geïnoculeerd Yoshida sarcoom. *K.W.F. fellow 44

Onder voorbehoud dat hiervoor financiële steun wordt verworven, kan daarna het zeer wenselijke onderzoek naar de aard van de locaal-toxische werking van adriamycine in het rattemodel ter hand worden genomen. Nader onderzoek hiernaar, en naar de farmacokinetiek van adriamycine in regionale perfusie, zal uitsluitsel kunnen geven over de onbegrepen wisselende toxiciteit die een belemmering vormt voor klinische toepassing van adriamycine in perfusies wegens sarcomateuze tumoren in de extremiteiten (zie project VIII.4, Annual Report 1977). Een werkhypothese die o.m. onderzocht moet worden, is dat over-oxygenatie van perfusaat, c.q. weefsels, zoals. die klinisch gemakkelijk op kan treden, de toxiciteit van adriamycine verhoogt. Het is bekend dat adriamycine in verschillende weefsels reversibel omgezet kan worden in een vrije radicaal dat zijn ene electron gemakkelijk overdraagt op vrije zuurstof. Indien het gevormde superoxide radicaal ion niet snel ontgift wordt, kan het via een kettingreactie veel radicalen doen ontstaan die direkte schade veroorzaken in levend weefsel.

VIII.4

Regionale perfusie van ledematen met cytostatica.

J. Wieberdink, E.A. van Slooten, S.J. van Coevorden, S.P. Israëls, H.R. Marcuse, C. Benckhuijsen, S.C. van ' t Hoff*, en stafleden van de Daniel den Hoed Kliniek, Rotterdam oa In de komende tijd moeten de waarnemingen, die gedaan worden om de dosimetrie van cytostatica bij regionale perfusie te verbeteren, voortgezet worden, steunend op: ol volume bepalingen van de te doorstromen regio's; -2 beoordeling van de reacties van de normale weefsels naar ons graderingssysteem (Annual Report 1977; zie ook "Physiological considerations regarding isolation perfusion of the extremities" door J. Wieberdink). Metingen van "aanvangs"concentraties van melphalan in het perfusaat (vgl. oc) zullen de ontwikkeling van de dosimetrie kunnen ondersteunen. ob Een vergelijking van toelaatbare doseringen bij, en klinische resultaten van, normotherme (37 - 3S o C) en hypertherme (41 - 42 o C) perfusies is aangewezen. Factoren, die schijnbare verschillen kunnen veroorzaken, moeten vermeden worden. oc Voorzieningen van hoge druk vloeistof chromatografie en fluorometrische bepalingen zijn getroffen voor meting van tijd/concentratie verhoudingen voor melphalan en adriamycine in het perfusaat, teneinde de optimale tijdsduur voor perfusies te kunnen bepalen. *K.W.F. fellow 45

_d In verband met de veronderstelling dat een hoge 02 spanning in de weefsels het gevaar voor toxiciteit van adriamycine zou verhogen (zie Annual Report 1978, project VIII.3) worden bloedgas-bepalingen van het perfusaat urgent geacht, en worden de voorzieningen daarvoor aangepast aan de snelle informatieverschaffing die tijdens het instellen van de perfusie vereist is. Verder onderzoek over de toxiciteit van adriamycine bij regionale perfusie zal hopelijk kunnen plaatsvinden in samenhang met project VIII.3.

Samenwerking in de vorm van deelname aan gemeenschappelijke trials, zo mogelijk op internationaal niveau, vraagt veel voorbereiding. Aan het scheppen van de primaire voorwaarde daarvoor: goede overeenstemming over de basis-techniek van regionale perfusie-chemotherapie, zal alle aandacht blijven krijgen.

VIII.5 Celkinetisch onderzoek van leukemieën in verband met chemotherapie. L.A. Smets, J. Blok, M. Brouwer, in samenwerking met K.J. Roozendaal* en H. Behrendt**. Zoals gerapporteerd in het Annual Report bevindt het onderzoek zich in een fase van evaluatie voor een aantal grote onderdelen. Hierbij zal het aantal metingen geleidelijk worden beperkt. In afwachting van de volledige evaluatie en het formuleren van een nieuw werkplan, ligt het in de bedoeling de vrijkomende tijd te besteden aan de voortgang van het verwante project VIII.5b (K.W.F. annotation XV.4). In dit laatste project zullen naast cytosine arabinoside, een aantal andere cytostatica getest worden volgens de in het verslag beschreven methode. Deze resultaten zullen worden vergeleken met de overlevingscurves en met metingen waarbij het effect op de DNA synthese bepaald wordt zonder gebruik te maken van gelabelde precursors, d.m.v. de isotopen-verdunningsmethode. Naar verwachting zal op beperkte schaal klinisch materiaal in de studie worden opgenomen.

*Afdeling Hematologie, Onze Lieve Vrouwe Gasthuis en Wilhelmina Gasthuis, Amsterdam **Studiegroep Kindertumoren, Emma Kinderziekenhuis en Nederlands Kanker Instituut, Amsterdam 46

VIII~6

Cel kinetische p'arameters

A.P.M. Jongsma, K. Breur Het onderzoek is gericht op cytologische en celkinetische parameters die predictief kunnen zijn voor het sukses van chemo- en/of radiotherapie. Voor het belang van de individuele patient dienen de te gebruiken technieken te worden aangepast aan de beperkende factoren welke inherent zijn aan het onderzoek. op mensel·ijk weefsel. Dat wil zeggen dat de bepalingen met weinig materiaal en binnen korte tijd uitgevoerd moeten kunnen worden . • Cytologisch onderzoek Morfologische karakteristieken z~Jn slecht kwantificeerbaar en blijken vaak zeer gevoelig voor bestraling en chemotherapie. Ofschoon geschikt voor diagnostische bepaling worden vervolg-studies met dergelijke parameters gedurende en na behandeling sterk bemoeilijkt. Een morfologisch kenmerk dat in veel mindere mate door behandeling wordt beïnvloed blijkt de kern/cytoplasma ratio van cellen te z~Jn. Vanwege het discriminerend karakter tussen normale en vele tumorcellen zal deze parameter een belangrijke plaats in ons onderzoek innemen. Nieuwe fluorescentie kleuringstechnieken die ontwikkeld werden ten behoeve van geautomatiseerde analyse leveren parameters op die kwantificeerbaar zijn en mogelijk interessant om te vervolgen in een tumorproces. Een aantal hiervan zullen worden bestudeerd . • Celkinetisch onderzoek Het afgelopen jaar werd enige ervaring opgedaan met autoradiografische technieken. Met behulp van een continue labeling met 3H- t hymidine werd het mogelijk om een goede schatting van kinetische parameters te maken in een exponentieel groeiende cellijn (celcyclus tijd, labelings index, fractie S-cellen en groeisnelheid). De techniek wordt nu verfijnd en klaargemaakt om op aspiratiebiopten voor menselijke tumoren te worden uitgevoerd. Wanneer we erin zullen slagen om een redelijke LI te krijgen in stukjes weefsel door deze onder 02 spanning te labelen, zullen ook in hechte solide tumoren kinetische parameters kunnen worden bepaald. Een belangrijk probleem waar nu aan gewerkt wordt is de bepaling van de fractie niet-prolifererende cellen, een parameter die van belang is om de groei snelheid van het weefsel te kunnen schatten en een prognose te maken voor het gedrag van de tumor tijdens en na behandeling. Tenslotte zullen deze parameters direkt gecorreleerd worden aan het klinisch verloop van de patient. In vervolgstudies hopen we de respons van tumorweefsel op de behandeling aan de hand van deze parameters te schatten . • ~veefselkweek Opnieuw zal getracht worden kortdurende kweken uit menselijk tumormateriaal op te zetten. De bedoeling hiervan is om een testsysteem in handen te krijgen waarin de respons

47

van het weefsel op verschillende therapeutische agentia (straling, chemotherapeutica) in vitro kan worden getest.

VIII.7 Biochemische en klinische farmacologie van antimetabolieten. H.N. Pinedo, A. Leyva, H. Nederbragt, J. Lankelma, J. Buesa-Perez, M. Vooijs, H. Posthumus, H. Appel In maart 1979 is een nieuwe werkgroep klinische en biochemische farmacologie geformeerd. Deze groep, onder leiding van Prof. H. Pinedo, is uit Utrecht overgekomen, waar reeds een drietal projekten met K.W.F. subsidie waren gestart. De werkgroep heeft zich in 1977 en 1978 beperkt tot het onderzoek naar de invloed van nucleosiden op het cytotoxisch effect van methotrexaat op normale cellen en op tumorcellen. Deze studie die zowel in vitro als in vivo werd verricht is nog niet afgesloten. De in vivo onderzoekingen worden bij de muis en bij patiënten uitgevoerd. Teneinde deze studies adequaat te kunnen verrichten, werd een HPLC methode ontwikkeld voor de bepaling van nucleobasen en nucleosiden in plasma. De werkplannen zijn: -I Rescue van normale weefsels tegen methotrexaat cytotoxiciteit met behoud van de toxiciteit voor de tumor. De bestudering van selectieve rescue van normale weefsels tegen methotrexaat toxiciteit bij de muis wordt gecontinueerd. Methotrexaat en rescuemiddelen worden via de staartvene van de DBA/2 geïnfundeerd. Daarbij wordt gekeken naar het effect van de therapie op geïmplanteerde L 1210 cellen en op de normale weefsels. De therapie geschiedt onder controle van de plasma methotrexaat concentratie en van de concentraties van nucleo-basen en nucleosiden. Het doel van dit onderzoek is de bestudering van de mogelijkheid tot bescherming van de normale weefsels met behoud van het anti-tumor effect. -2 Anti-tumor eigenschappen van thymidine. Uit 1 resulteerde het onderzoek naar de factoren die de thymidine toxiciteit in vitro en in vivo beïnvloeden. De invloed van purine nucleosiden op de thymidine toxiciteit wordt in suspensiekweken bestudeerd. Het blijkt, dat de thymidine toxiciteit toeneemt in aanwezigheid van een toenemende hoeveelheid purines. Parallel aan dit onderzoek wordt een farmacokinetisch onderzoek verricht met thymidine bij de mens (fase I studie). Behalve de plasmaconcentraties thymidine wordt ook de invloed van thymidine op de plasma purines bestudeerd. Uiteindelijk ligt het in de bedoeling na te gaan of gelijktijdige toediening van inosine de cytostatische werking van thymidine doet toenemen.

48

-3 Antitumor eigenschappen van PALA. PALA is een nieuwe antimetaboliet die zeer vroeg in de pyrimidine synthese aangrijpt. PALA is vooral bij experimentele tumoren zeer effectief gebleken (o.a. het Lewis longcarcinoom). Helaas zijn tot nu toe de resultaten in fase 1-11 studies teleurstellend gebleken. Het doel van onze studie is na te gaan wat het effect van PALA op het celmetabolisme is en welke invloed het celmetabolisme zelf op het anti-tumor effect van PALA heeft. Daarbij wordt een bepalingsmethode voor PALA ontwikkeld, waarmee farmacokinetische studies zullen worden verricht bij patiënten die in fase 11 studies worden behandeld (b.v. mammacarcinoom) . 04 Klinische farmacologie van adriamycine. Ten behoeve van klinische farmacologische studies met adriamycine wordt een HPLC bepalingsmethode voor adriamycine en metabolieten ontwikkeld. Er wordt daarbij gebruik gemaakt van een fluorescentie detector. Er zal in het bijzonder worden nagegaan of gefractioneerde toediening van kleine doses adriamycine leidt tot een veranderd metabolisme bij de patiënt. Wij vonden aanwijzingen hiervoor bij het konijn. Bij gefractioneerde toediening van adriamycine werd relatief minder adriamycinol gevormd. In een Langendorff systeem bleek de cardiotoxiciteit in een Langendorff opstelling minder ernstig na chronische toediening met de gefractioneerde methode dan met de gebruikelijke toedieningswijze.

49

50

Sektie IX. ONTWIKKELINGSRESEARCH VOOR RADIOTHERAPIE IX.2 Computer programmatuur voor bestralingsplanning. R.van der Laarse, H.Meertens, I.A.D.Bruinvis, J.J.Battermann, A.van Amstel (student-ass.), A.Hegeman. In samenwerking met het Laboratorium voor Medische Fysica, Universiteit van Amsterdam: Prof.Dr.J.Strackee. Aan de tweede fase in de ontwikkeling van MFELC zal begonnen worden: het opstellen van het algorithme van de correctie voor niet overal op de patient aansluitende electronentubi. De derde fase zal bestaan uit het in het programma aanbrengen van de correctie voor inhomogeniteiten. Zodra de tweede fase voltooid is,. zal de dan beschikbare programmatuur gestroomlijnd worden voor routine klinisch gebruik, aangezien de voltooiing van de derde fase waarschijnlijk niet meer in dit jaar gerealiseerd zal kunnen worden. Gebaseerd op de uitgebreide klinische ervaring met de optimalisatie van dosisverdelingen met megavolt fotonen bundels, zullen nieuwe scoringsfuncties voor de beoordeling van dosisverdelingen in het optimalisatie programma MFOPT worden ontwikkeld. De aanpassing van uitwendige bestralingsvelden aan de inwendig afgegeven dosisverdeling bij de radiotherapie van gynaecologische tumoren, zoals vermeld in IX.4.c, zal ook veel werk binnen dit project met zich meebrengen.

IX.3 Klinische toepassing van snelle neutronen. B.J.Mijnheer, K.Breur, J.J.Battermann, P.A.Visser, Tj.Wieberdink (student-ass.), J.de Gans,T.C.M.Wilmering, P.Groote . • Fysische metingen. Het onderzoek naar de eigenschappen van dosimeters gebruikt in neutronenvelden, in samenwerking met het Radiobiologisch Instituut TNO, zal worden voortgezet. De experimenten ter bepaling van het effectieve centrum van ionisatiekamers zullen worden uitgevoerd bij verschillende fotonen en neutronenenergie~n. De N.K.I. referentie ionisatiekamer, gebruikt voor de bepaling van dosisverdelingen in patienten, zal worden vergeleken met soortgelijke systemen in gebruik in andere instituten. Dit zal gebeuren via de set referentiekamers van CENDOS (Collection and Evaluation of Neutron Dosimetry Data) en door Dr. J.C. McDonald van het Memorial Sloan Kettering Cancer Center met behulp van calorimeterjionisatiekamer-metingen. Ook zal nagegaan moeten worden of in E.O.R.T.C.-verband via ECNEU (European Clinical Neutron Dosimetry Group) naast het opstellen van een Europees protocol voor neutronen dosimetrie t.b.v. patientenbestralingen, ook dosi51

metrievergelijkingen tussen de verschillende centra noodzakelijk zijn. Voor de Amsterdamse bundel zal worden nagegaan of in sommige gevallen versmalling van de halfschaduw mogelijk is door het aanbrengen van extra afschermmaterialen. Tevens zullen de stralenbeschermingsaspecten dan opnieuw worden bekeken. oBiologische metingen. De uitbreiding van het onderzoek naar veranderingen van RBE d.m.v. inducties van chromosoom aberraties, zal worden voortgezet. Ook zal besproken dienen te worden of in E.O.R.T.C.-verband of tussen een beperkt aantal instituten, RBE vergel.ijkingen nodig zijn, teneinde de neutronendosis toegediend in de verschillende instituten op elkaar af te stemmen. OEvaluatie klinische resultaten. Tot en met 1980 zal geprobeerd worden zoveel mogelijk patienten volgens de trial hoofdjhalstumoren en bekkentumoren te bestralen. Daarnaast zal het onderzoek naar de resultaten bij de hersentumoren afgerond worden. Het lijkt mogelijk tegen die tijd ook RBE waarden voor schade aan huid, darm en tumor te kunnen geven.

IX.4 Behandeling van toegankelijke tumoren met gesloten bronnen. J.M.V.Burgers,A.H.Tierie, R.van der Laarse, H.Meertens, T.C.M.Wilmering, P.Groote, E.van Elderen, B.N.F.M.van Bunningen. oa Voortzetting van de bestudering van dosis patronen rond geïmplanteerde of geappliceerde gesloten bronnen en correlatie ervan met het klinisch resultaat. Wat betreft de radium implantaties in tong en blaas zal in het bijzonder worden gewerkt aan het testen van het concept van Cumulative Radiation Effect van Kirk met de beschikbare gegevens, vooral die omtrent de dosis gradiënt in samenhang met volume. ob Voor blaas implantaten zal verder worden gezocht naar de mogelijkheid het radium te vervangen door iridium. Voor de mamma implantaten zal worden getracht de maximale grootte te bepalen waarin een dergelijk implantaat een goed resultaat kan geven. Daar het aantal indicaties voor interstitiële therapie nog gering blijft, is het moeilijk te schatten wanneer deze studie kan worden afgesloten. oc De mogelijkheden om de dosisafgifte aan het rectum te beperken door extra afscherming in de ovoïden, zal verder onderzocht worden.

De met de computer bepaalde optimale verdeling van de

52

bronnen in de vaginale cylinders met 3 catheters zal technisch gerealiseerd moeten worden. Het nut van in vivo rectum metingen wanneer gedetailleerde computer berekeningen beschikbaar zijn, zal nader onderzocht moeten worden. Het aanpassen van de uitwendige bestralingsvelden aan de inwendig afgegeven dosisverdeling met een z.g. gynaecologische wig,zal echter de hoogste prioriteit krijgen. Behalve veel experimenteel dosimetrisch werk zal ook een koppeling tot stand moeten worden gebracht tussen de programmatuur voor uitwendige bestraling en de programmatuur voor inwendige bestraling.

IX.5 Fysische aspecten van radiotherapie. R.van der Laarse, I.A.D.Bruinvis, J.de Gans,H.Meertens. Aangezien dit project in leven is geroepen om ad hoc activiteiten met wetenschappelijke aspecten te kunnen rapporteren, is het aangeven van een werkplan niet mogelijk.

53

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ~

11 11

54

11 11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ~

1

Sektie X. KLINISCHE ONCOLOGIE X.la Maligne lymfomen. P.van Heerde, A.Bom-van Noorloos~ F.J.Cleton, C.A.Feltkamp, Th.M.Feltkamp-Vroom;*J.Koudstaal~ C.J.M.Meliefr R.Somers, H.Spiele, F.A.Vyth-Dreese. Sinds 1973 wordt de diagnostiek van de non-Hodgkin lymfomen op multidisciplinaire wijze bedreven, d.w.z. naast de gebruikelijke lichtmicroscopie wordt het lymfoomweefsel electronenmicroscopisch, immunologisch en enzymhistochemisch bewerkt. De door deze bewerking verkregen betere celtypering kan belangrijke gevolgen hebben voor beloop en therapie van de aandoening. Dit onderzoek is inmiddels bij meer dan 100 lymfomen (waarvan 87 non-Hodgkin lymfomen) verricht. Follow-up studies zullen dit jaar (1979) worden gestart. Gedurende de laatste jaren zijn de resultaten van dit onderzoek in de vorm van vele voordrachten, poster sessions en publicaties weergegeven. T.A.W.Splinter heeft een deel van het immunologisch onderzoek in een proefschrift bewerkt. A.Bom-van Noorloos legt de overige immunologische technieken en resultaten vast in een proefschrift. P.van Heerde zal de morfologische aspecten in correlatie met de overige disciplines voor een proefschrift bewerken. Wat betreft de analyse van mononucleaire cellen in bloed en lymfoomweefsel worden de volgende punten onderzocht: el verdere karakterisering van de suppressorfunctie; -2 naast mitogene stimulatie wordt het effect van meer specifieke stimuli bekeken; -3 de invloed van de suppressor cel fractie op (generatie van) cytotoxische cellen; -4 uitwerken en toepassen van twee parameter-analyse op patienten materiaal. Er is een begin gemaakt met het zoeken naar correlaties tussen de gegevens van het bewerkte materiaal en de klinische gegevens.

X.lb Hodgkin's disease: E.O.R.T.C.trial H I. J.M.V.Burgers, A.H.Tierie, R.Somers, P.van Heerde, E.Hamersma. Doorgaan met verzamelen van follow-up gegevens met het accent op de ontwikkeling van tweede tumoren of andere late complicaties van de behandeling.

*Centraal Laboratorium voor de Bloedtransfusiedienst, **31otervaart Ziekenhuis, Amsterdam 55

X.lc Hodgkin's disease: E.O.R.T.C.trial H II. J.M.V.Burgers, B.N.F.M.van Bunningen, A.H.Tierie, R.Somers, E.Hamersma. Doorgaan met verzamelen van follow-up gegevens met extra aandacht voor complicaties van de behandeling, die ook zo veel mogelijk zullen worden gecodeerd. In 1979 zal een uitgebreide analyse van het materiaal plaatsvinden,waarvoor het noodzakelijk is dat eerst zo veel mogelijk gegevens worden gecompleteerd zoals P.A.-revisie, lymfografie-revisie, recent bijgewerkte follow-up. Dit materiaal zal dan de basis kunnen vormen van een publicatie over deze trial. X.ld Lymfosarcomaen re·tiCulumcel sarcoma:E.O.R.T.C. trial Ret-Ly. J.M.V.Burgers, A.H.Tierie, R.Somers, P.van Heerde, E.Hamersma. Voortgaan met verzamelen van follow-up gegevens van deze patienten. Nu het P.A.-materiaal beoordeeld is, kan het verder geanalyseerd worden wat betreft correlaties met de andere prognostische factoren, zoals stadium, orgaan localisatie (beperkt tot hoofd-hals gebied in deze studie), leeftijd en beloop na het eerste recidief. Deze analyse zal worden uitgevoerd in het INSERM, de statistische afdeling verbonden aan het Institut Gustave-Roussy. Het is de bedoeling deze gegevens in 1979 tot een artikel te verwerken. X.lf E.O.R.T.C. trial omtrent non-Hodgkin's lymfoma(2075l). R.Somers, J. M.V. Burgers , B.N.F.M.van Bunningen, P.van Heerde, E.Hamersma,N.Blom (poli chemotherapie), assistent Be etage en C.C.E.Schaake-Koning. Voortzetting van de trial minstens tot eind 1979. Stimuleren van de centrale beoordeling van lymfograrnrnen en van pathologische anatomie. Evaluatie van de in Brussel ontvangen gegevens via een speciaal formulier. Begeleiden van de uitwerking van deze gegevens. Aan de hand daarvan, in het licht van recente literatuur, komen tot definitief voorstel voor nieuwe trial. Bespreking daarvan in april 1979. Meehelpen bij het schrijven van het definitieve protocol. De grootste patientenbijdrage bij het huidige protocol komt uit Amsterdam. X.lg Hodgkin's disease: E.O.R.T.C.trial H V. J.M.V.Burgers, R.Somers, B.N.F.M.van Bunningen, A.H.Tierie, P.van Heerde, E.Hamersma, N.Blom (poli chemotherapie) en assistent Be etage. Doorgaan met behandeling van patienten in vroege stadia van de ziekte volgens dit protocol. Nagaan in hoeverre 56

verlenging van de totale behandelingsperiode nadelig is voor de kans op genezing van de patient. Nagaan in hoeverre ook via consulten in omliggende ziekenhuizen, selectie, van patienten voor deze trial optreedt, en resultaten bij de uitgesloten patienten analyseren.

X.2 Melanomen. Ph. Rümke, J.M.V.Burgers, E.P.van der Esch, S.P.lsraëls, H.Neering, E.A.van Slooten, J.Wieberdink. De trials over melanomen in WHO- en E.O.R.T.C.-verband worden voortgezet.

X.3 Schildkliercarcinoom. C.C.Delprat, P.F.Bruning, P.Cohen, J.F.M.Delemarre, H.R.Marcuse, J.Robbert, J.B.v.d.Schoot~

M.Heidendal-Jeune~

De follow-up gegevens van de patienten in registratie bij de "Thyroid group" van de E.O.R.T.C. zullen worden bijgehouden. Het TNM systeem is aangepast en uitgebreid. In de komende tijd zal worden getoetst of thans aan de eisen van een classificatie wordt voldaan. Protocollen voor de behandeling met chemotherapie van patienten met ongedifferentieerde en parafolliculaire carcinomen zijn nog in discussie.

X.4 Mammacarcinoom. J.A.van Dongen, P.Cohen, F.S.A.M.van Dam,J.F.M.Delemarre, E.Engelsman, E.Hamersma, A.A.M.Hart, J.P.Persijn, A.H.Tierie, H.Venekamp. Het werk aan de in het Annual Report beschreven projecten betreffende: oretrosternale lymfoscintigrafie, .retrospectieve beoordeling behandelingsresultaten, .computer registratie van mammacarcinoom patienten, .hormonale karakterisering van patienten met mammacarcinoom, .genetische studies, .groeisnelheid metastasen mammacarcinoom zal worden gecontinueerd, evenals de deelname aan een aantal meest in E.O.R.T.C.-verband plaatsvindende therapie trials.

*Wilhelmina Gasthuis, Amsterdam 57

Ook in E.O.R.T.C.-verband en in samenwerking met een aantal Engelse centra zullen in het komende jaar een aantal nieuwe trials worden gelnitieerd (o.a. ter beoordeling van de mogelijkheid van mammasparende therapievorm en ter beoordeling van de optimale therapie bij locaal zeer uitgebreide processen). In UKC Amsterdam-verband zal het werk aan de betere karakterisering van de nog als benigne beschouwde proliferatieve lesies worden voortgezet. De psychosociale studies t.a.v. de acceptatie van mamma amputatie, het gedrag van patienten tijdens en na reconstructie procedures zullen worden uitgebreid.

X.5 Werkgroep Kindertumoren. C.Albus-Lutter, K.Breur, B.N.F.M.van Bunningen, J.M.V.Burgers, J.F.M.Delemarre, O.A.van Dobbenburgh, A.J.M.van Unnik, P.A.Voûte, J.E.de Vries. Voor de Wilms' tumor is een nieuwe trial in ontwikkeling. De medulloblastoom trial is tussentijds gereviseerd en op basis hiervan wordt gedacht aan een nieuwe pilot studie. De rhabdomyosarcoom trial wordt gecontinueerd. De morfologie studies over de 'V'1ilms' tumor worden voortgezet. Aan de opzet van een studiecentrum voor solide tumoren bij kinderen wordt gewerkt.

X.6 Hoofd-halstumoren. J.A.Bangert, G.M.M.Bartelink, R.Bergman, K.Breur, J.F.M.Delemarre, O.A. van Dobbenburgh, A.A.M.Hart, F.J.M.Hilgers, J.Kruisbrink, P.L.M.Lichtveld, P.F.Schouwenburg, E.A.van Slooten, F.D.van Steenbergen. In E.O.R.T.C.-verband wordt nog steeds meegewerkt aan de lopende trials. In 1979 start het onderzoek naar het mogelijke verband tussen Epstein-Barr virus en hoofd-hals tumoren. De aanvraag bij het KWF voor technische hulp werd gehonoreerd, zodat per 1 maart 1979 gestart kan worden. In internationaal verband wordt samengewerkt met G.Klein in Stockholm en G.de Thé in Parijs/Lyon. Verder worden opnieuw verschillende retrospectieve analyses verricht van de behandeling van enkele groepen tumoren in het hoofd-hals gebied.

X.7 Tumoren van bot en weke delen. P.Cohen, C.E.Albus-Lutter, S.J.van Coevorden, O.A.van Dobbenburqh, C.A.FeItkamp, J.Grauwen-v.d.Heul, W.Misdorp, R.Somers, W.Ternede, A.H.Tierie. 58

In E.O.R.T.C.-verband wordt medewerking verleend aan een drietal klinische trials. Bij de behandeling van het osteosarcoom van de extremiteiten worden de resultaten van 3 vormen van adjuvant therapie vergeleken en wel: el uitsluitend radiotherapie van de longen; 82 uitsluitend chemotherapie; 83 een combinatie van radio- en chemotherapie. De trial betreffende chemotherapie van het gemetastaseerde weke delen sarcoom loopt goed. Hierbij worden twee verschillende schema's vergeleken. De derde trial, welke de waarde toetst van adjuvant chemotherapie bij de primaire behandeling van weke delen sarcomen aan de extremiteiten gaat moeizaam door gebrek aan geschikte patienten. Er zal via goede voorlichting getracht worden de chiruraen uit de krincr Noord-Holland nauwer bij dezebehandeïing te betrekkén. De hoop bestaat dat dan het aantal patienten met weke delen sarcomen dat voor eerste behandeling wordt aangeboden, zal toenemen. Extremiteiten perfusie met adriamycine moest wegens ernstige toxische complicaties worden afgebroken. Men overweegt echter deze therapie voorzichtig te hervatten waarbij met lage en eventueel later opklimmende doses adriamycine begonnen zal worden (Phase I studie). Hierbij zal nauw worden samengewerkt met C.Benckhuijsen (afd. Biochemie) en haar medewerkers die met locale perfusie bij de rat de experimentele basis zullen verzorgen. Toepassing van het Electronen microscopische onderzoek wordt voortgezet. Begonnen werd met het uittesten van antiserum tegen myofibrillen. Later zal dit worden toegepast bij het onderzoek van humane tumoren. Dit antiserum werd ter beschikking gesteld door de heer van Raamsdonk van het Zoölogisch Laboratorium van de Universiteit van Amsterdam. Ten behoeve van het werk in de E.O.R.T.C. wordt verdere medewerking verleend aan de revisie van histologische coupes van diverse sarcomata. Onderzoek van bottumoren door middel van grote coupes wordt voortgezet. Een aantal van deze tumoren betreft de hond.

X.8 U.K.C. Werkgroep urologische tumoren. A.H.Tierie, J.J.Battermann. Voortgezette registratie en computerisatie van alle blaascarcinoompatienten (+ 1200). Over ongeveer 3 jaar publicatie van de statistische analyse van tumor-gastheer factoren van belang voor de prognose en resultaten van de behandeling.

59

X.9a Prospectief onderzoek naar bestralinasveranderinaen in de darm met betrekking tot preventie en vroege behandeling. F.C.A.den Hartog Jager. Een klinisch protocol werd opgezet om een beter inzicht te krijgen in het effect van bestraling op dunne en dikke darm. De patient is zijn eigen controle door het protocol vóór en na de bestraling uit te voeren. Nagegaan wordt het effect op functie en structuur van de darm door middel van röntgenonderzoek en uitvoerig urine en faeces onderzoek en biochemie. Resorptie van vetten, koolhydraten, eiwitten en vitamines wordt bekeken, waarbij getracht zal worden op den duur tot richtlijnen te komen voor dieet en medicamenteuze behandeling. X.9b Palliatieve behandeling van patienten met een obstruerend oesophagusjcardia.carcinoom door endoscopische positionering vaneenplastîc buis. F.C.A.den Hartog Jager, J.F.W.M.Bartelsman~ G.N.Tijtgat~ In samenwerking met de afdeling Gastro-enterologie werd een techniek uitgewerkt om endoscopisch een eigen gemaakte individueel aangepaste buis onder plaatselijke verdoving in te brengen bij patienten met een ernstige passagebelemmering voor voedsel door carcinoom in de slokdarm of maag. Sinds augustus 1975 werden meer dan 230 patienten op deze manier palliatief behandeld met in het algemeen een goed resultaat. X.9c Pre-operatieve bestraling bij patienten met een mogelijk operabel cardiacarcinoom. E.Gortzak, G.M.M.Bartelink, F.C.A.den Hartog Jager. Daar patienten met een obstruerend cardiacarcinoom een zeer slechte prognose hebben wordt ná selectie (patienten jonger dan 70 jaar, tumor kleiner dan 6 cm, geen metastasen klinisch en ná laparoscopie) een voorbestraling van 3 weken/3000 rad gegeven in de hoop fixatie van de tumor te verminderen en cellen te divitaliseren. Sinds februari 1978 werden 12 patienten, meer dan verwacht werd, in de studie opgenomen. Slechts 2 bleken ook ná vObrbestraling operabel. Meer patienten zijn nodig om iets relevants te kunnen zeggen; een invloed op de selectiecriteria voor operatie wordt verwacht. X.9d Post-opera·tieve bestralina van galblaas en galweg-

carcinoom. G.M.M.Bartelink, E.Gortzak, F.C.A.den Hartog Jager.

*Wilhelmina Gasthuis,Amsterdam,afd.Gastro-enteroloqie. 60

Gezien de goede, casuïstische resultaten in de literatuur werd begonnen met een pilot studie naar het effect van bestraling op klachten en prognose van patienten met een irradicaal geopereerd galblaas of galweg carcinoom. Gezien de zeldzaamheid van de tumor zal het even duren voor er een serie bij elkaar is. Contacten met andere klinieken werden gelegd. X.IO.I. Onderzoek naar de betekenis van de radiotherapie bij de behandeling van de lies- en bekkenkliermetastasen van het vulvacarcinoom. E.J.Aartsen, Ch.Albus-Lutter, B.N.F.M.van Bunningen. Lymfkliermetastasen en met name doorgroei van metastatisch carcinoomweefsel door de lymfklierkapsel doen de prognose van het vulvacarcinoom dalen tot 25%. Door middel van een prospectief onderzoek wordt nagegaan of aanvullende radiotherapie op het kleine bekken en het paralumbale gebied de behandelingsresultaten van het vulva carcinoom kan verbeteren.Bij tumoruitbreiding buiten de kapsel van de klieren wordt ook de lieshuid in het bestralingsveld opgenomen. Het betreft een project dat reeds enkele jaren loopt. Gezien het geringe aantal per jaar in te brengen patienten (3 à 4 ) is de tijdsduur niet te schatten. X.IO.2. Onderzoek naar de invloed van cytostatische behandeling op de ovariumfunctie. E.J.Aartsen, M.Pel. Het is bekend, dat cytostatica een ongunstige invloed kunnen hebben op de ovariumfunctie. Dit kan zich uiten als oligo- en amenorrhoe. Zowel beschadiging van de theca- als van de eicel, wordt als mogelijke oorzaak genoemd. Of deze veranderingen reversibel zijn, zou mede bepaald worden door de duur van de behandeling. In ons ziekenhuis doet deze problematiek zich voor bij jonge vrouwen, die een cytostatische behandeling moeten ondergaan, b.v. wegens M.Hodgkin. Zij willen informatie over de toekomst. Is er nog een mogelijkheid om kinderen te krijgen? Moet er, als amenorrhoe is ontstaan, nog anticonceptie worden toegepast? Door een retrospectieve analyse van ziektegeschiedenissen hopen we wat meer inzicht te krijgen in deze problematiek. X.IO.3 E.O.R.T.C. trials voor het ovariumcarcinoom. E.J.Aartsen, Ch.Albus-Lutter, B.N.F.M. van Bunningen, O.A. van Dobbenburgh, E.Engelsman. In E.O.R.T.C.-verband zijn thans 5 trial protocollen operationeel geworden . • Protocol 55771 betreft de stadia IA2, IB en IIA. Bij de nabehandeling wordt gerandomiseerd tussen melphalan en bestraling van het kleine bekken.

61

~-~---~~

---------------------~

.Protocol 55773. In de nieuwe versie werd protocol 55772 opgenomen. Na de stageringslaparotomie met debulking ontstaan 2 groepen, die elk apart worden gerandomiseerd voor melphalan versus adriamycine met endoxan. De eerste groep, waarvan een betere prognose wordt verwacht, bestaat uit de stadia IC, IIB en lIlA (pelvis). De tweede groep uit lIlA (abdomen) , IIIB en IV . • Protocol 55774. Dit is een phase 2 trial voor VP16. Er zijn slechts 20 patienten .nodig met een stadium III en IV . • Protocol 55775. Idem voor infusie met bleomycine . • Protocol 55781. Dit protocol is voor pat~enten stadium III en IV, die niet voldoen aan de stagerings- en debulkingseisen van protocol 55773. Vele patienten met stadium III en IV worden pas na een laparotomie, elders verricht, voor verdere behandeling verwezen. Zij kunnen zonder relaparotomie met uitgebreide stagering en debulking, niet in protocol 55773 worden opgenomen. Er wordt gerandomiseerd tussen de combinaties endoxanadriamycine en endoxan, adriamycine en Cis-platinum (C.A.P.). Recidieven of progressie na endoxan-adriamycine krijgen Cis-platinum. Recidieven of progressie na CAP krijgen Hexamethyl melamine. X.lO.4. Evaluatie van de waarde van het scoring systeem van Bagshawe bij trophoblastaire aandoeningen. E.J.Aartsen, Ch.Albus-Lutter, R.Steinmetz. Bagshawe (1976) ontwierp een scoring systeem voor de behandeling van trophoblastaire aandoeningen. Aan de hand hiervan is het mogelijk, voordat met de behandeling wordt begonnen, de patient te plaatsen in een low-medium en high risk groep. Dit bepaalt mede de keuze van de chemotherapie. Het scoring systeem kwam tot stand door retrospectieve analyse van patienten materiaal, verzameld over een lange periode (1957-1973). Het lijkt daarom belangrijk om na te gaan of de criteria van Bagshawe ook gelden voor patienten series uit andere klinieken. Ons materiaal bestaande uit + 60 patienten zal ter evaluatie volgens de criteria van Bagshawe worden gecodeerd, waarna de resultaten zullen worden vergeleken. Dit onderzoek wordt in 1979 afgesloten. X.lO.5. Onderzoek naar de psychosexuele problematiek, die kan ontstaan na chirurgische behandeling van het vulvacarcinoom. E.J.Aartsen. In een "pilot· study" worden patienten en echtgenoten geenqueteerd. Na beëindiging hiervan (+ 10 patienten) zal zonodig een prospectief onderzoek worden opgezet. Het vooronderzoek wordt in 1979 afgesloten.

62

X.12. Geautomatiseerde data-verwerking. R.v.d.Laarse, O.A. van Dobbenburgh, A.A.M.Hart,G.WentBoerman. Vanaf april 1979 zullen de patienten gegevens van 1978 in het geautomatiseerde systeem worden ingebracht. . De computer terminal die toegang zal geven tot de computer bij SARA en op de afdeling radiotherapie geplaatst zal worden, zal in de eerste helft van 1979 operationeel worden. Eventuele vragen kunnen dan rechtstreeks aan het . computergeheugen gesteld worden en de antwoorden zullen dan binnen enkele minuten ter beschikking staan. Omdat faciliteiten van de afdeling radiotherapie en de Universiteit van Amsterdam kunnen worden gebruikt zijn er geen kosten aan de hardware ontwikkeling verbonden. Het gebruik van computertijd en het op ponskaart brengen van de gegevens vallen buiten deze faciliteiten.

X.13 Psycho-sociale zorg en pijnbestrijding. F.S.A.M.van Dam, F.Boom~ C.Linssen, D.Paalman~ J.Schulkesv.d.Pol. In samenwerking met het Psychologisch Laborator.ium, afdeling Persoonlijkheidsleer, Universiteit Amsterdam. Onderzoek naar de biologische beschikbaarheid van codeine in de mengpoeders van het Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis en de analgetische werking van deze mengpoeders. Ervaringen van patienten die een cytostatische behandeling krijgen. (In samenwerking met de interne afdeling) Satisfactie van patienten na een mamma-reconstructie. (In samenwerking met R.Bergman, plastisch chirurg) Effect van diëten op het algemeen welbevinden van patienten die met cytostatica, c.q. radiologisch behandeld worden. (In samenwerking met P.Bruning en L.de Boer, diëtiste) Consumptie van alternatieve geneeswijzen voor kanker. (In samenwerking met Studiecentrum voor Sociale Oncologie, Rotterdam, Dr.W.J.A.van den Heuvel)

X.16 Vergelijkende oncologie. W.Misdorp, E.F.J.Groesbeek, A.A.M.Hart, P.van Heerde, J.G.Kootstra, W.Ternede, M.van der Valk, J. de Vries, K.Weijer.

*Slotervaart Ziekenhuis, Amsterdam 63

el Lopend onderzoek. De intratumorale immunotherapie van het mammacarcinoom bij de hond met C.parvum wordt voortgezet. Dit geldt eveneens voor het oogcarcinoom van het rund waarbij intratumorale toediening van BCG (dood en levend) en chirurgische therapie in vergelijking met een controlegroep worden geëvalueerd.

e2 Immunotherapie van onvolledig verwijderde tumoren. Het optreden van locaal tumorrecidief na primaire chirurgische therapie vormt bij de mens nogal'eens een probleem dat maar ten dele door aanvullende therapie (heroperatie, bestraling, chemotherapie) is op te lossen. Locaal recidief ontstaat door uitgroei van tumorcellen na een door wat voor oorzaak ook, niet-radicale primaire behandeling. Immunotherapie, mits zo vroeg mogelijk na niet-radicale operatie toegepast lijkt ons een betrekkelijk eenvoudige mogelijkheid om locaal recidief te voorkomen, respectievelijk te vertragen. Gebleken is dat toediening van het bacterievaccin Coparvax (C.parvum) in mammacarcinomen van honden sterke ontsteking veroorzaakt, waarbij vooral macrofagen en via deze cellen ook lymfocyten een rol spelen. Bij de hond en kat komen enkele tumortypen voor die door hun sterk infiltratieve groeiwijze vaak recidief veroorzaken. Wij stellen ons voor deze tumoren - het mastocytoom en de hemangiopericytomateuse variant van het fibrosarcoom bij de hond en het mammacarcinoom bij de kat - als model voor immunotherapie te gaan gebruiken. ea Randomisering. Dieren welke geopereerd zijn aan één van de genoemde tumor varianten en waarbij via microscopisch onderzoek gebleken is dat de tumor onvolledig is verwijderd, worden door ons gerandomiseerd. Op advies van Ir.Hart moeten de aantallen in de proefgroep en in de controlegroep zich verhouden als 2 : 1. eb Inspuiting. De inspuiting geschiedt 10-12 dagen na de eerste operatie, wanneer de hechtingen verwijderd worden. De inhoud van een ampul Coparvax wordt subcutaan ingespoten over de gehele lengte van het operatie gebied in de hoop dat er een interactie optreedt met de daar nog aanwezige tumorcellen. ec FOllow-up. De dieren uit proef- en controlegroep worden regelmatig gecontroleerd op het optreden van locaal recidief volgens het schema l~ - 3 - 5 - 8 - 12 - 18 - 24 maanden na operatie . • d Heroperatie. Bij het optreden van recidief dient heroperatie en aansluitend microscopisch onderzoek te geschieden. ee Evaluatie. Er kan per tumor-categorie op 15-20 patienten met onvolledig verwijderde tumoren per jaar gerekend worden. Na 3 - 4 jaar kan evaluatie geschieden. Als vergelijkingscriteria gelden: eaan- of afwezigheid van recidief; elengte recidiefvrije interval. 64

e3 Immunologische studie bij honden met solitaire primaire mammatumoren welke ingespoten worden met C.parvum. In samenwerking met enkele groepen veterinairen in de regio Amsterdam en het Gooi loopt er op het ogenblik een klinische trial bij honden m~~ solitaire primaire mammacarcinomen. In deze trial wordt het effect van intratumoraal toegediend C.parvum gevolgd door chirurgie, vergeleken met chirurgie alléén. Evaluatie van het C.parvum effect vindt tot nu toe plaats via overlevingstijd en de tijdsintervallen die verlopen tussen behandeling van de primaire tumor en het ontstaan van recidieven. Er bestaat echter behoefte om eventueel effecten van C.parvum immunologisch te monitoren. Het accent van deze immunologische evaluatie zal in eerste instantie liggen op een onderzoek naar de rol van natural killer (NK) cellen in dit proces. NK activiteiten worden n.l. bij muizen en mensen zowel bij gezonde individuen als bij tumordragers gemeten. Inzicht in NK cel activiteiten is van groot belang voor een zinvolle interpretatie van eventuele tumorspecifieke cellulaire cytotoxiciteit in vitro. De biologische functie van de NK cellen is nog onbekend, maar aan de hand van recente waarneming neemt men aan dat ze een belangrijke rol kunnen spelen in de afweer tegen virussen en kanker. Er zal daarom getracht worden een antwoord te vinden op de volgende vraagstellingen: ea Kunnen NK cellen aangetoond worden bij de hond? Hiertoe zullen gezonde en tumordragende honden getest worden op de aanwezigheid van lymfocyten die spontaan cytotoxisch zijn voor in vitro groeiende tumorcellen (K562, T2a en allogene (event.autologe) mammatumor cellen). Indien er cytotoxiciteit gemeten wordt zal er m.b.v. ros et te- en andere depletie technieken nagegaan worden welke lymfocyten subpopulatie hiervoor verantwoordelijk is. eb Heeft C.parvum een potentiërend effect op NK activiteit? Het is bekend dat BCG een potentiërend effect heeft op NK activiteit. Bij muizen vindt maximale activatie plaats 4 dagen na het toedienen van BCG. Nagegaan zal worden of C.parvum (net zoals BCG) een NK activiteit potentiërend effect heeft en wanneer na inspuiting een maximale activiteit gevonden wordt. ec Mechanisme van C.parvum potentiëring van NK activiteit. Activering van NK activiteit bij muizen zou mogelijk gemedieerd kunnen worden via door BCG gelnduceerde productie van interferon. Incubatie van NK cellen met interferon leidt namelijk tot een enorme toename van de cytotoxische capaciteit van deze cellen. Dit is dan ook de reden dat we na willen gaan of C.parvum ook synthese van interferon induceert en of interferon de oorzaak is van een eventuele verhoging van NK acti vi tei t . · .. _d Hebben C.parvum geactiveerde monocyten anti-tumor effecten in vitro? Aangezien één van de anti-tumor effecten van C.parvum toeaeschreven wordt aan de activa tie van macrofagen zal nagegaan worden of perifere bloed monocyten van met C.parvum behandelde honden (qescheiden via 1 x g sedimentatie technieken volgens methode Bont-de Vries) anti-tumor effecten in vitro hebben. 65

oe Leidt intratumoraal

van C.parvum tot activatie van specifiek cytotoxische T cellen? Inductie van specifieke cytotoxische T cellen na inspuiting met C.parvum zijn beschreven. Echter alléén als C.parvum intratumoraal of in combinatie met tumorcelleningespoten werd. T cel activiteiten van met C.parvum ingespoten honden zullen in vitro getest worden op mamma tumor cellen. of Monitoring van NK cel, monocyten en T cel activiteiten, gedurende het verdere verloop van de ziekte. NK cel, monocyten en T cel activiteiten zullen op verschillende tijdstippen (al of niet na het toedienen van C.parvum) gemeten worden om na te gaan of deze cytotoxische activiteiten eventueel als parameter qebruikt kunnen worden voor het klinisch verloop van de ziekte.

66

i~spuiten

.

, ..

~