INGEKOMEN 7 SEP. 1982: WERKPLANNEN A N TON I VAN LEE U WE_ N HO E K H U I S. het nederlands kankerinstituut amsterdam

INGEKOMEN

7 SEP. 1982:

WERKPLANNEN A N TON I

VAN

LEE U WE_ N HO E K H U I S

het nederlands amsterdam

kankerinstituut

in houdsopgave fundamenteel biochemisch onderzoek ....•..•••.......•.....•.•••.....•.. II

chemische carcinogenese. . . • • . . . . . . . . . . . . • . • • . . • . . . . . . • • • . . . . • . . . • • • • • .. 5

111

rol van het celoppervlak bij het ontstaan, gedrag en bestrijding van tumoren •.............•....•••....•.•...•••.•• 11

IV

tumor immunologie ..••.......••.•......•.•..•.........•.....••.........• 19

V

virologische faktoren bij het ontstaan van tumoren bij mens en dier ...•..........•..•..........•••.....•••....•••. 23

VI

genetische faktoren bij het ontstaan van tumoren bij mens en dier ....•...•...•..........•....•........•..•...•.• 27

VII

hormonale faktoren bij het ontstaan en de groei van tumoren ••......••.........•.............••.....•.•....••. 39

VIII experimentele chemotherapie en radiotherapie •....•...•..••. ; .....•.•....•........••.....•.....••••.... 43 'IX

ontwikkelingsresearch voor radiotherapie ....•.............•....... : ..•. 53

X.

klinische oncologie ..••...••......•••......••.....••......•••....••...•• 57

Sektie I

FUNDAMENTEEL BIOCHEMISCH ONDERZOEK

-----------------------------------------------1.1

Analytisch centrifugeren

W.S. Bont, W.L. van Es, M. de Vries, C.J.P. Slee De analytische ultracentrifuge (Spinco Model E) is beneden 3000 rpm niet te gebruiken. Aan de andete kant is analytisch centrifugeren in dit gebied van groot belahg i.v.m. tlet onderzoek van cellèn. Daarom wordt een bestaande laagtoerige centrifuge voorzien van de benodigde optiek, zodat we de beschikking krijgen over een analytische centrifuge die in het laagtoerige gebied te gebruiken is. We

1.2

willen deze apparatuur dan gebruiken ter bepaling van fysische constantes van cellen, zoals grootte en dichtheid, die van belang zijn voor hun scheiding. Mede het feit dat deze grootheden een belangrijke rol spelen bij de differentiatie van bv. beenmerg cellen (J. theor. Biol., in press) maakt voortzetting van onze experimenten in deze richting noodzakelijk.

Scheiding van cellen

W.S. Bont, W.L. van Es, C.G. Figdor, E. Martens, J. Leemans, C.J.P. Slee, J.E. de Vriès 8a Isolatie van bloedcomponenten ol Bij de ontwikkeling van celscheidingstechnieken staat het onderzoek van humaan bloed centraal. Het is de bedoeling de resultaten verkregen met gezonde donoren te vergelijken met die van tumorpatienten. Het apparaat om bloed in zijn' componenten te scheiden zonder deze te mengen met lichaamsvreemde stoffen, bleek hierbij van belang vooral ter bereiding van een ruw leukÇ>cyten preparaat. 02 De door ons ontwikkelde apparatuurvoldoet goed maar moet nog worden aangepast aan andere töepassings mogelijkheden, zoals het gebruik van kleine volumina bloed .. 83 De samenwerking om de apparatuurook in te schakelen bij de isolering van subpopulaties uit beenmergcellen wordt uitgebreid (Emma Kinderziekenhuis, Amsterdam: Dr. P. Voûte; Erasmus Universiteit', Rotterdam: Dr. E. Löwenberg; Radboud Ziekenhuis, Nijmegen: Prof. dr. C. Haanen) . eb

Scheidingen met de elutriator

~

el Nog steeds is de elutriator onmisbaar bij het isoleren van subpopulaties van leukocyten uit het perifere bloed via het ruwe leukocyten preparaat (zie a.l). Ook het komende jaar zal daar \'leer veel aandacht aan worden besteed. 82 Beenmergcellen zullen' verder worden onderzocht. Vooral in samenwerking met andere centra (zie a.3) zal gekeken worden naar funkties van subpopulaties en i.h.b. van stamcellen. 83 Gezien de belangrijke rol die de monocyt - macrofaag (bv. Langerhans cel) speelt in talloze gebieden is een verder onderzoek van subpopulaties van monocyten beslist . noodzakelijk. Gekeken zal worden wat de relevantie is van de door ons gevonden subpopulaties van monocyten. Zijn,het maturatiejdifferentiatie stadia en zo ja, in welke r'ichting verloopt dit proces dan via de-subpopulaties? Hiertoe zal o.a. gekeken worden naar de activiteit van LDH, lysQzyme, prostaglandine en naar chemoluminiscentie, zure phosphatase en antigeen presentatie. We hopen d.m.v. dit onder-

zoek atypische monocyten in patienten beter te kunnen_Dpsporen en karakteriseren. -4 Vooral bij het onderzoek van bloed van patienten is het van belang de cellen uit kleine volumina -bloed zo goed mogelijk te scheiden met een zo hoog mogelijke opbrengst. Daartoe is het noodzakelijk dat ,er zeer snel een monitor gebouwd wordt, die, de cellen tijdens het elutrieren kan tellen en karakteriseren. -5 Bovendien moet er een opstelling worden gemaakt waarmee het werken met twee rotoren in serie mogelijk wordt. Als ,deze opstelling funktioneert zal dat een aanzienlijke tijdsbesparing betekenen terwijl tevens verlies van cellen gereduceerd wordt. -6 Getracht zal worden,m.b.v. de elutriator rotor cel suspensies te maken van weefsel.

~pparatuur

voor onderzoek van ce_lmengsels d. m. v. sedimentatie

analy~

Een prototype kwam gereed. De verdere ontwikkeling van deze apparatuur richt zich nu vooral op het instellen en constant houden van de temperatuur. Nu de ijking van het apparaat zo goed als voltooid is, zal ook een aanvang worden gemaakt met het analyseren van celmengsels verkregen van gezonde donoren. Deze fase heeft ten doel de apparatuur te standardiseren en optimaliseren. Een manuscript met de tot nu toe behaalde resultaten is in voorbereiding.

I.3 Onderzoek naar de remmende werking van selenotrisulfiden op de eiwit sy.nthese in normale- en tumorcellen L.N. Vernie, M. de Vries, W.S. Bont, P. Emmelot Selenium is een belangrijk sporeelement. Het heeft met meerdere spore-elementen gemeen dat het voor mens en dier giftig bij een hoge en essentieel bij een lagere opname is. Daarbij komt de waarneming dat een verlaging van de zowel chemisch als viraal geinduceerde tumorincidentie is gevonden als extra selenium door het voer of drinkwater van proefdieren wordt gegeven. Ook epidemiologisch onderzoek geeft een vermindering van de tumorincidentie te zien bij een hogere selenium opname. Deze eigenschap'van selenium wordt veelal toegeschreven aan de antioxidant werking via het enzym glutathion peroxidase. Recentelijk is aangetoond dat ook zonder dat er sprake is van een verhoging van de glutathion peroxidase aktiviteit een daling van de chemiscIT geinduceerde tumorincidentie bij ratten wordt gevonden door toevoeging van selenium aan het voer (C. Ip en D. Sinha, Carcinogenesis 2:435-438, 1981). Dit betekent dat ook andere selenium bevattende verbindingen dan glutathion peroxidase aktief

zouden zijn. Wij hebben aangetoond dat reaktie produkten van seleniet met thlolen een remming van de 'eiwitsynthese in cellen in weefselkweek geven en,leiden tot celdood. Ook in vivo is door ons gevonden dat met twee van deze reaktie produkten, selenodiglutathion en selenodicysteiné, een reduktie van de ascites tumor celgroei kan worden bereikt. Door anderen zijn dergelijke experimenten verricht met o.a. seleniet. Deze auteurs schrijven hun resultaten toe aan het anti carcinogene voedingsaspekt van selenium terwijl onze interpretatie berust op de toxiciteit van de gevormde selenotrisulfiden. Een en ander sluit elkaar niet uit, maar maakt wel dat de omzettingsprodukten van selenium in vivo belangrijk zijn. ,Een van de metabolieten van seleniet in vivo is selenoglutathion, welk produkt in' vivo in erythrocyten gevormd wordt. Ook lyrnphocyten spelen een rol bij de omzetting van seleniet. Dit is voor ons o.a. reden om te veronder2

stellen dat deze cellen minder gevoelig zouden zijn voor de toxiciteit van bepaalde selenotrisulfiden. Meer aandacht zal daarom besteed worden aan het effekt van selenotrisulfiden op cellen van het bloedvormend systeem.

-2 Onderzoek naar het groeiremmend effekt van selenotrisulfiden op.___ cellen in weefselkweek Het groeiremmend effekt van selenotrisulfiden op tumorcellen zal worden vergeleken met die op bloed en beenmergcellen.

In grote lijnen zal het onderzoek worden voortgezet zoals hieronder aangegeven. Het onderzoek naar het ontstaan van seleniumdeficientie bij het gebruik van cytostatica zoals verricht bij twee groepen patienten zal worden afgesloten.

-3 Onderzoek naar het groeiremmend effekt van selenotrisulfiden op' tumorcellen in vivo ---Onder bepaalde omstandigheden wordt de groei van ascites tumorcellen bij de muis geremd door tOediening van GSSeSG. Deze experimenten zullen worden voortgezet met meerdere selenotrisulfiden.

&1 Onderzoek naar het mechanisme

van de inactivering van elongatiefaktor 2 door selenotrisulfiden De remming van de aminozuur inbouw berust op een specifieke inactivering van elongatiefaktor 2 (EF2). Het is zeer goed mogelijk dat de remming van EF2, zoals in vitro gevonden, geheel of ten dele ten grondslag ligt aan de toxische verschijnselen welke in vivo door selenium worden veroorzaakt .. Het ligt in de bedoeling ook de werking van selenotrisulfiden te testen op de aktiviteit van andere enzymen met naast elkaar gelegen SH groepen.

3

11

Sekbie II

CHEMISCHE CARCINOGENESE

II.l INTERACTIE V~~ N-ACETYL-2-AMINOFLUOREEN (AAF) EN VERWANTE AROMATISCHE AMINEN 1-1ET NUCLEINEZUREN IN RELATIE TOT DE VORrUNG VAN TUMOREN E. Kriek, J.G. Westra, A. Visser en.M. Welling II. MABP-carcinogenese

Het onderzoek zal worden voortgezet volgens de richtlijnen aangegeven in het Werkplan 1982.

• 1 De Q-methyl derivaten van 4aminobiphenyl (ABP) bezitten een zeer specifieke orgaanwerking. Het I. AAF-carcinogenese 2' ,3-dirnethyl-4-aminobiphenyl geeft bijvoorbeeld bij ratten overwegend • 1 Voortgaand op de resultaten vercolon tumoren, bij hamsters daarenkregen in het verslagjaar (Annual tegen blaastumoren. Uit recente Report 1981) zal de vormings- en onderzoekingen van o.a. Fiala et al. verdwijnkinetiek van de verschillen(Arnerican Health Foundation, Valhalde reactieproducten van A.~ (Nhydroxy-AAF) met DNA in hepatocyten la, NY) is gebleken dat deze. organoen niet-parenchyrncellen verder wortropie ten dele kan worden verklaard door verschil in relatieve uitscheiden bestudeerd (in samenwerking met ding van het reactieve metaboliet A. Tulp, project II.4). Meer aanN-hydroxy-N-glucuronide via urine dacht zal worden gegeven aan de en gal. De interacties van de vereffecten van meerdere doseringen van schillende metabolieten op molecuhet carcinogeen op de vorming van de lair niveau zijn echter nog onvol-, verschillende adducten. Te verwac~en doende onderzocht. Het onderzoek is, dat persisterende adducten in zal zich in eerste fase richten op het DNA zullen toenemen en uiteindede vorming en karakterisering van lijkhet hoofdbestanddeel vormen . DNA-adducten door de N-hydroxy devan het totaal gebonden carcinogeen. rivaten van 2',3-dimethyl-4-aminoEen dergelijk effect is reeds aanbiphenyl en 3-methyl-4-aminobiphenyL getoond voor aflatoxine BI (Croy en Een gedeelte van dit onderzoek zal Wogan,Cancer Res. 41: 197, 1981). worden uitgevoerd met de groep van Door1het beschikbaar komen van zeer Kadlubar (National Center for Toxigevoelige immunologische bepalingstechnieken voor de AAF-adducten is cological Research, FDA, Jefferson, AR, USA). Zodra een of meer DNAhet mogelijk geworden bovengenoemde adducten zijn geïdentificeerd, zal experimenten uit te voeren met nietworden getracht deze langs synthetiradioactief gemerkt AAF. sche weg te verkrijgen. Het doel • 2 In samenwerking met C.J.van der hiervan is om gebruik te kunnen maLaken (project II.6) w~rd een antiken van de immunologische detectie bij het bepalen van DNA-adducten in serum gemaakt tegen het ring-open product van dGuo-8-AF (Kriek & Westra, vivo zoals aangegeven in het WerkCarcinogenesis 1: 459, 1980). Wegens plan 1982. te hoge k~uisreactiviteit met dGuo-8-AF bleek dit serum niet • 2 Uit de resultaten die door Japanbruikbaar voor de bepaling van het se onderzoekers (Sugimura et al.) ring-open product in DNA. Betere zijn verkregen met mutageniteitsresultaten worden verwacht door de testen van pyrolyse producten van immunisatie uit te voeren met de aminozuren en eiwitten, is gebleken BSA/nucleotide complexen van beide dat steeds de 2-aminopyridine groeisomeren. Indien de conventionele pering de mutagene determinant is sera geen verbetering van de resulvan deze producten. 2-Arnino-5-pheqyltaten geven, zal worden overwogen pyridine is een pyrolyse product monoclonale sera te produceren. van phenylalanine. Ho~wel .het, tot de 5

zwakkere mutagenen gerekend moet worden, lijkt deze verbinding toch geschikt voor een vergelijkende studie met de, 4-aminobiphenyl derivaten omdat de structuur hiermee

grote overeenkomsten vertoont. Dit· onderzoek wordt gedeeltelijk uitgevoerd in samenwerking met het Lab. voor CarcinogenesejMutagenese van het R.I.V. te Bilthoven. _____________

Ir. 2 DNA-MODIFICATIES EN DNA-HERSTEL IN CELLEN NA BLOOTSTELLING AAN CHEMISCHE CARCINOGENEn. RELATIES MET BIOLOGISCHE EFFECTEN L. den Eng.else, R.--J. de Brij en B.G.J. Floot cyten met micronuclei, en (3) (in samenwe~king met project 11.5 en 11.6) 0 -ethylguanine enethylfosfotriesters. In samenwerking met Dr.A.Tulp (projéct 11.4) zal worden nagegaan of het mogelijk is om centro~obulaire hepatocyten te scheiden van perifere hepatocyten en of in deze cellen DNA-modificaties kunnen worden aangetoond.

Dit onderzoek richt zich op de vorming van DNA-modificaties door methylerende en ethylerende verbindingen. Hierbij wordt met name gekeken naar de persistentie van deze modificaties. • Allereerst zal met behulp van HPLC worden gekeken naar d~vor~ing en stabiliteit van op de 0 -, 0 en N-3-positie gemethyleerde thymidines en Tp(Me)T in rattelever DNA, na injektie met m1N en MNU. De hiertoe benodigde thymidine markers zullen worden gesynthetiseerd volgens Kusmierek en Singer (Nucl. Acids Res. 3: 989, 1976). De uitgewerkte bepalingsmethode zal vervolgens benut worden in project 11.7.

• Aangehaald is reeds dat MNU en mlli onderling bleken te verschillen in hun effect op-de verdwijnkinetiek van een door 14C-DMN gevormde hoeveelheid 06-methylguanine. In de door ons gebruikte ratten (Wistar d d) zal worden nagegaan of eenzelfde verschil bestaat tussen een voorbehandeling met DEN en een met ENU. De resultaten der bovenvermelde 10kaliseringsexperimenten zouden kunnen aangeven of lokalisatieverschillen voor een eventueel verschil in effect op 06-me thylguanine-herstel verantwoordelijk kunnen zijn.

• Gezien het feit dat alkylnitrosamides en dialkylnitrosamines,_ ook als ze tot een vrijwel identiek alkyleringspatroon van bulk lever-DNA leiden, toch verschillende biochemische of biologische gevolgen opleveren, lijkt het de moeite waard" om te zoeken naar meer kwalitatieve verschillen in hun alkyleringsreacties. Bekend is_ namelijk dat behandeling met MNU, in tegenstelling tot die met DMN geen effect heeft op 0 6 methylguanine herstel in de rattelever (Margison, Carcinogenesis 2: 431, 1981), terwijl DEN een ander clastogeen effect heeft op rattehepatocyten dan ENU (Tates et al., nog niet gepubliceerd). Hoewel een verschil in reactiviteit ten opzichte van bepaalde chromatinefrakties zou kunnen bestaan, lijkt het meest voor de hand liggende een ver9chil in lokalisatie binnen het leverlobje. Daarom zal allereerst na DEN en ~~U worden gekeken naar de lokalisatie binnen het lobje van (1) de toxiciteit, (2) hepato6

Il.) ONDERZOEK VAN HET CARCINOGENE PROCES AAN DE HAND VAN MORPHOLOGISCHE VOORSTADIA VAN DE KANKERCEL IN DE LEVER E. Scherer, P. Emmelot en H. Winterwerp • 7-(2-0xoethyl)guanine werd in het verslagjaar geïdentificeerd als hoofdmodificatie van lever-DNA van met ethyl carbamaat (urethaan) behandelde ratten en muizen (Scherer en· Emmelot, in druk). Er zijn sterke aanwijzingen dat d~t adduct in twee conformaties voorkomt, de aldehydevorm 7-(2-oxoethyl)guanine en d~ mogelijk promutagene ringvorm 0 ,7(l'-hydroxyethano)guanine (Scherer et al., CarcinogeneSis 2: 671-677, 1981). Voortgaand op deze resultaten zal samen met projekt II.6 worden geprobeerd een immunologische bepaling voor het gereduceerde, imidazolring geopende adduct op te zetten. Daarnaast zal de bepaling via reductie door (3H)-NaBH4 worden geoptimaliseerd. Met behulp van deze, en de radioactieve bepalingsmethode na (1-14C)ethyl carbamaat, zal de vormings- en verdwijnkinetiek van dit adduct worden bestudeerd. Er zal ook worden nagegaan in hoeverre dit adduct gevormd wordt door andere carcinogenen, die een vergelijkbare ethylgroep bevatten (b. v. ethionine).

Met behulp van de vergelijkende bepalcing van (a) DNA-modificatie en reparatie en (b) het carcinogene (initiërende) effect wordt in dit onderzoek nagegaan welke DNA-modificaties relevant zijn voor het initiërend effect van alkylerende carcinogenen. De vorming van precancereuze lesies (eilandcellen) , welke causale voorstadia zijn van het hepatocarcinoma (Emmelot en Scherer, Bioç:him .. Biophys. Acta 605: 247-304, 1980) wordt hierbij als maat voor het,initiërend carcinogene effect genomen. • o~-alkylguanine is een promutagene lesie die efficiënt uit ratteleverDNA in vivo verwijderd wordt. De verwijderingskinetiek echter maakt het·onwaarschijnlijk dat 06-alkylguanine rechtstreeks via misparing . tijdens de DNA-replicatie betrokken is bij de initiatie van leverkanker. 06-alkylguanine wordt door een induceerbare alkyltransferase activiteit aanwezig in ratte lever chromatine gerepareerd. Het proces van reparatie inductie zal nader worden bestudeerd in zijn tijds- en dosisafhankelijkheid voor enkele en herhaaldelijke applicaties van verschillende alkylerende carcinogenen. Er zal hierbij gebruik worden gemaakt van de immunologische detectiemethodeontwikkeld voor 06_e thylguanosine -(projekt II.6). Onder verschillende condities van reparatie inductie zal de vorming van precancereuze leverlesies bepaald worden met het oog op een eventuele rol van het induceerbare reparatieproces bij de initiatie van leverkanker. Waar mogelijk zullen ook metingen in discrete levercel(kern) populaties worden verricht (in samenwerking met project II.4).

IL4"

• De basenparingseigenschappen van 7-(2-oxoethyl)guanine tijdens replicatie van DNA zullen worden bestu~eerd in samenwerking met A.van Ooyen (projekt V.l). Mutaties geinduceerd in plasmide DNA door chloroethyleen oxide - een "uitimate metabolite" van vinyl chloride zullen worden gekarakteriseerd door basevolgorde analyse. Aan de hand van het verkregen spectrum vgn mutaties zal de hypothese, dat 0 ,7-(1'hydroxyethano)guanine codeert als adenine en dus aanleiding zal geven tot GC-TA transities, getoetst worden. Daarnaast zullen de basenparingseigenschappen in een gebruikelijk in vitro systeem (DNA-polymerase) worden bestudeerd. ___________

CELSCHEIDINGSTECHNIEKENTOEGEPAST OP DE (CHEMISCHE) CARCINOGENESE

A. Tulp en M.G.Barnhoorn krijgbaar. Deeltjes ter grootte van cellen als ook minideeltjes ter

De door ons ontwikkelde scheidingskame"rs zijn thans commercieel ver7

grootte van chromosomen kunnen bij 1 tot 90 x g worden gescheiden, zowel op grootte als op dichtheid. Dankzij de recente ontwikkeling van een electrophorese kamer, die werkt bij lage veldsterkte, is ons scheidingspotentieel aanzienlijk versterkt. De volgende scheidingsstudies zullen onderwerp zijn van onderzoek: o Chromosomen van mens, rat en muis zullen worden gescheiden, zodat m.b.v. de Southern blotting techniek tot lokalisatie van genen op bepaalde chromosomen kan worden besloten (in samenwerking met Dr.J.G.Collard, project lIl. 3) . • De binding van de chemische carcinogenen N-OH-AAF en AAP aan basen van het DNA, afkomstig uit endotheel-, Kupffer cellen en hepatocyten respectievelijk zal worden bepaald, nadat deze celtypen door centrifugatie elutriatie zijn gescheiden (in samenwerking met Dr.J.G.Westra, project II.l). o idem met betrekking tot de binding van DEN (Dr.E.Scherer, project 11.3). o In samenwerking met Drs,W.J.van Blitterswijk, project 111.5 zullen celpopulaties, die in de milt van leukemische muizen voorkomen, worden gescheiden. _e Eilandcellen, geïnduceerd door een Solt-Farber of Scherer-Emmelot regime, zullen worden gescheiden van no~male

parenchymale levercellen m.b.v. snelheidssedimentatie, evenwichtsdichtheids-centrifugatie en electrophorese. Als marker van de eiland~ cellen wordt het enzyme y-glutamyltranspeptidase (GGT) genomen. o Teneinde (fluorescerend gemaakte) eilandcellen m-. b. v .. de FACS cell sorter te kunnen scheiden, zal uit Novikoff tumorcellen het enzym GGT worden geïsoleerd. Antilichamen tegen dit enzym zullen worden opgewekt zodat - na koppeling met een fluorescerende stof - eilandcellen gelabeld kunnen worden. o Humane beenmergcellen zullen m.b.v. alle ons ten dienste staande scheidingstechnieken worden gescheiden t.b.v. project III.2 (Dr.W.P.van Beek). e Een laagtoerige elutriatiekamer van grote capaci tei t zal worden gebouwd, terwijl tegel.ijkertijd in hetzelfde apparaat een toroidale spiraal zal worden geplaatst, die tot doel heeft cellen m.b.v. 2-phase partition te scheiden. • In samenwerking met Dr. L. den Engelse (project 11.2) zal de mogelijkheid worden onderzocht of perifere en cent~olobulaire rattehepatocyten kunnen worden gescheiden zodat in deze gescheiden cellen DNA-modificaties kunnen worden bepaald.

11.5 IN VIVO/IN VITRO ONDERZOEK VAN DE DOOR ETHYLNITROSOUREUM GEïNDUCEERDE CARCINOGENE SE IN DE HERSENEN VAN DE -RAT C. Heyting, E. Kriek en A. Riethorst 1975) hebben de veranderingen in celmorfologie en proliferatievermogen bestudeerd in gekweekte ongefractioneerde hersencellen van ENUbehandelde rattefoeten. In deze kweken namen zij een vaste reeks van veranderingen waar, die niet optraden in hersencelkweken van 'onbehandelde foeten. Uiteindelijk ontstonden in de kweken van de met ENU behandelde foeten cellen die in zachte agar konden groeien, e·n die tumorigeen waren na injectie in isogene pasgeboren ratten. Met ditzelfde experimentele systeem willen wij de latente periode van de tumorinducti~

Dit is een nieuw project (NKI 82-2), in het kader waarvan de latente periode van tumorinductie in de rattehersenen zal worden onderzocht. De latente periode van de chemische carcinogenese kan goed worden bestudeerd aan de ENU-geïnduceerde inductie van hersentumoren bij de rat: Eén enkele toediening van ENU in de perinatale periode leidt tot inductie van tumoren van het centrale zenuwstelsel bij bijna 100% van de behandelde ratten (Ivankovic en Druckrey, Z. Krebsforsch. 71: 320~ 360, 1968). Laerum en Rajewsky (J. Natl. Cancer Inst. 55: 1177-1187, 8

meer~n

detailonderzoeken. De vragen·dié·hierbij aan de orde komen zijn'dé volgende:

lifereren in· afwezigheid van de zo~ genaamde glia~maturatie factor (GMF). In hersencelkweken van onbehandelde foeten is GMF hiervoor vereist (Lim en Mitsunobu, Science 185: 6368, 1974). Het verschijnen van dergelijke onafhankelijke cellen zou een stap kunnen zijn in het carcinogene proces. Daarom zullen wij speciaal hieraan aandacht besteden. Gedurende het eerste jaar van net onderzoek (1983) zal een.deel van de experimenten van Laerum en Rajewsky herhaald worden: Vervolgens zullen dezelfde experimenten worden uitgevoerd met gekweekte cellen uit de zogenaamde subependymale laag van de laterale ventrikels (SEL) , omdat deze cellen worden beschouwd als de target cellen van de ENU-geïnduceerde inductie van hersentumoren bij de rat (Lantos en Cox, Experientia 32: 1467-1468, 1976). Deze cellen kunnen betrekkelijk zuiver uitgesneden worden uit hersenen van 'pasgeboren ratten. Een belangrijke vraag is of het deze cellen zijn, waaruit de GMFonafhankelijke cellen ontstaan.

1. Wàt zijn de eerste waarneembare veranderingen in celmorfologie en groeigedrag van rattehersencellen in vitro na een in vivo behandeli~g met ENU. 2. In welke celtypen treden deze veranderingen op. 3. Is er een verband tussen de persistentie van ENU-geïnduceerde DNAlesies in de afzonderlijke celtypen enerzijds, en het optreden van veranderingen die van belang zijn voor de tumorinductie anderzijds. 4. Welke veranderde celtypen hebben het vermogen om zich tot tumorcel te ontwikkelen. Eén van de vroegst waarneembare veranderingen in hersencelkweken van met ENU behandelde foeten is het verschijnen van gedifferentieerde astrocyten, die persisteren en pro-

II.6 IMMUNOLOGISCHE DETECTIE VAN DNA~BESCHADIGINGEN VEROORZAAKT DOOR CARCINOGENEN C.J.vander Laken, G.Hermsen, E.Kriek, E.Scherer en M.Welling toria opgewekt en gezuiverd zijn (06-ethyldeoxyguan_o.sine: J. Adamkiewicz, Institut ~ür Zellbiologie, Universität Essen,·F.R.G.; dG-8-AAF: R. Baan,· Medü;;.ch Biologisch Laboratorium, Rijswijk). Conventionele antilichamen-opgèwektin het konijn tegen de TpT -fQ~fotriester zullen op hun specifieke-eigenschappen worden .getest. Hierbij ,zal verder worden onderzocht in hoeverre de aanmaak van monoclonalè' antilichamen tegen dit product nOQdzakelijk is voor de herkenning van dè-',fosfotriesters van de andere basen '. '~evens zullen er antilichamen worden opgewekt tegen enkelstrengs-DNA. ·Deze antilichamen zullen gebruikt' gaan worden voor de aantoning van minimale hoeveelheden· DNA in bijvoorbeeld alkalische sucrose gradiënten (Annual Report 1980, p.20-21). Verder zullen alle verkregen a~tilicham~n, te weten

De modificaties die onder invloed van carcinogenen in DNA ontstaan kunnen door middel van antilichamen die tegen die specifieke adducten zijn opgewekt worden aangetoond. G.ebruik makend van de door ons ont-:wikkelde HS-ELISA (zeer gevoelige enzym-gebonden immunosorbent test) kunnen hoeveelheden van minder dan 1 fmol adduct in gedenatureerd DNA worden aangetoond. Deze resultaten· zijn verkregen met de aanwezige conventionele antisera tegen 06_ethyldeoxyguanosine en deoxyguanosine-8acetyl-aminofluoreen. Er zal "lOrden onderzocht in hOèverre het gebruik van monoclonale antilichamen tegen bovengenoemde adducten nog een verdere verbetering van de ELISA kan bewerkstelligen. Hierbij hopen we gebruik te kunnen maken van ons ter beschikking gestelde monoclonale ant:ilicham~Il q.ie ,op imdere labora9

tegen 06-EtdGuo, dGuo-8-AAF, even·tueel tegen TpT fosfostriesters, de imidazool-ring geopende producten van dGuo-8-AFen 7-(S-hydroxyethyl)dGuo getest worden op in vivo materiaal waarbij gekeken zal worden naar dose-response relaties, persistente niveau's en de verdwijnkinetiek van de verschillende adducten in zo mogelijk verschillende celpopulaties in o.a. de lever van de rat. Hierbij. zal worden sarrengewerkt

met 11.1, II.2A,II.2B, .11.3, -11.4 en 11.7. Met de gevoelige ELISA moet het mogelijk zijn DNA-adducten in bijvoorbeeld menselijk weefsel, waarvan het vermoeden bestaat dat er blootstelling heeft plaatsgevonden aan bepaalde carcinogenen, aan te tonen.

11.7 CHROMOSOOMBESCHADIGINGEN EN DNA-MODIFICATIES NA EXPOSITIE AAN. ALKYLERENDE- VERBINDINGEN EN MITOMYCINE-ANALOGA G.J ;Merikveld'èn L; " den Engelse (NKI), A.Bos enA.D.Tates (R. U.-Leiden) De clastogene' effé'citen van een aan·tal alkylerende' 'verbindingen (DMN, DEN, EMS,'MMS, 'ENU) op hepatocyten van'o'Wistar' ratten zijn onderzocht door Tates en medewerkers. Gegevens over lever-DNA alkylering (onder dezelfde experimentele omstandigheden) zijn tot op heden slechts (gedeeltelijk) bekend voor DMN, DEN en EMS. Daarom zullen allereerst de corresponderende kwantitatieve gegevens voor MMS. en· ENU worden verzameld en vergeieken met wat bekend is over hun clastogene (en carcinogene) effecten •. • Zowel voor MMS als ENU zullen in eerste instantie bepaald worden 3en 7~alkylpurines en 06_ a lkylguaninee e De hoeveelheid en stabiliteit van de door ENU gevormde fosfotriesters zullen worden bepaald in totale lever-DNA zowel met behulp van alkalische sucrose gradiëntsedimentatie als met HPLC.

10

• Na toediening van ENU, DEN en DMN zullen de hoeveelheden gealkyleerde thyrnidines (0 2 -, 0 4 - en N-3-) en hun persistenties worden bepaald • • Gezien de onderlinge verschillen in effecten van bovengenoemde vijf alkylerende agentia op lyrnfocytaire chromosomen, lijkt het de moeite waard om na te gaan of, en zo ja, hoeveel interactie er met DNA van perifere lymfocyten optreedt. Ook deze experimenten zullen worden gedaan met Wistar &&, omdat van deze dieren bekend is hoeveel chromosomale schade (SCE's) er in de perifere lymfocyten optreedt. Achtereenvolgens zal aandacht worden besteed aan een geschikte DNA-isolatie, een immunologische bepalingsmethode voor DNA in gradiëntfrakties (samen met C. J. van der Lak,en, project 11.6), het optreden en de persistentie van alkali-labiele plaatsen de bepaling .van 06_ethylguanine, en de eventuele samenhang met de clastogene effecten. _ _-'-_ _ _ _ _ _ _ __

Sectie 111. ROL VAN HET CELOPPERVLAK BIJ ONTSTAAN, GEDRAG EN .BESTRIJDING VAN TUMOREN

111.1 ONDERZOEK NAAR DE SAMENSTELLING EN EIGENSCHAPPEN VAN GEISOLEERDE PLASMAMEMBRANEN UIT NORMALE- EN TUMORCELLEN R.P. van Hoeven, P. Emmelot, G.M. Hengeveld, J.H. Krol, E.B. Pastoors eUitvroeger werk is duidelijk geworden, dat het gebruik van diphenylhexatriëen (DPH) als vloeibaarheidsprobe voor het celoppervlak, bij fluorescentie-polarisatie metingvan intacte cellen beperkingen heeft, omdat alle lipide-pools in de cellen worden mee-gemeten tot een gewogen gemiddelde. Slechts indien de endogene lipiden (endomembranen, lipide druppels) kwantitatief gering zijn ten opzichte van het plasmamembraan, enlof kwalitatief constant zijn gedurende het experiment, kan men (afhankelijk van het probleem) . relevante informatie verwachten over de piasmamembraanvloeibaarheid. Meer 'polaire lipide-probes, zoals de ri-(9-anthroyloxy)-gesubstitueerde vetzuren (n=2 -"16) en parinaarzuur zouden (vrij of na koppeling aan glucosamine of geïncorporeerd in een fosfolipide) na labelen van intacte cellen gelocaliseerd blijven in het plasmamembraan. Uit theoretische berekeningen is· echter gebleken dat de anthroyloxyvetzuren in onze proefopzet geen ordeparameter geven, die een maat is voor de membraanvloeibaarheid. Zij zijn voor het doel dus niet zondermeer bruikbaar. Onlangs (F.G. Prendergast en R.P. Haugland, Biophys. J. 33: 158a, 1981) is de aandacht gevestigd op 4-trimethylamino-DPH. Deze stof heeft spectrale eigenschappen overeenkomstig:aan die van DPH, en blijft bij labelen van intacte cellen beperkt tot het plasmamembraan. Te verwachten is bovendien, dat de stof meer gevoelig ial zijn voor' het gehalte aan cholesterol en veranderingen daarin dan parinaarzuur. Getracht zal worden om met deze nieuwe p·robe een routine-methode te ontwikkelen waarmee reeds met 10 6 cellen relevante informatie wordt verkregen. Naast DPH zelf kan het 4trimethylamino-DPH wellicht van nut zijn voor het opsporen van membraan-

lipide veranderingen o.i.v. diverse stimuli. .Met behulp van fluorescentie-polarisatiemetingen werden acute effecten (binnen 15 minuten) van phorbol en enige phorbol-diesters op intacte cellen en geïsoleerde plasmamembranen ervan bestudeerd. Twee soorten effect werden gevonden: i. een snelle fluidisering die permanent is en ii. een snelle fluidisering gevolg~door herstel en een gestadig toenemende rigidiserinq. Het eerste effect werd vertoond door het relatief hydrofiele phorbol en phorboldiacetaati het tweede· effect door phorbolmyristaatacetaat (PMA, TPA), 4-0methyl-PMA en phorboldibenzoaat, die meer hydrofoob zijn. In grote lijnen waren de gevonden ef-' fecten onafhankelijk van de lipidesamenstelling van het plasmamembraàn (Novikoff ascites hepatoom, GRSL ascites leukemie en ratlevercel) . Er is kennelijk ook geen relatie met tumorpromotor-activiteit. Het onder'zoek zal worden voortgezet met cellen waarvan de in vitro respons op de sterke tumorpromotor PMA (TPA) goed onderzocht is. Hiervoor lijken zeer geschikt fibroblasten (bv. 3T3) die tot proliferatie, en een humane promyelocyten leukemie (HL-60) die tot (schijnbare?) differentiatie worden aangezet. Bestudeerd zullen worden o.a. de effecten van de bovengenoemde phorbol-diesters op intacte cellen en geïsoleerde plasma~ membranen, zoals gemeten met DPH en 4-trimethylamino-DPH. Samenwerking zal worden gezocht met·anderewerkgroepen (111.2, III.4d, IV.la, Xrla e.a.) . eln diverse cellulaire systemen is aangetoond dat PMA de fosfolipase A2-activiteit van het plasmamembraan stimuleert, wat leidt tot verhoogde arachidonzuurvorming en uiteindelijk 11

prostaglandine-synthese en celproliferatie. In geïsoleerde plasmamembranen van lever en hepatomen werd echter geen enkel effect op de enzyme-activiteit waargenomen. Nagegaan zal worden of de werking van phorbol-diesters op target cellen met het vormen of openen van Ca++.poriën kan worden verklaard.

-Het onderzoek naar een mogelijke diagnostische betekenis van gangliosiden in serum van tumordragers heeft met nieuwe ent-hepatomen geen bevestiging gekregen. Naast kleine verschuivingen in de ganglioside patronen van sera van tumordragers, vergeleken met gezonde controles werd slechts bij één hepatoom een "abnormaal" ganglioside in het serum aangetroffen. Dit zou identiek kunnen zijn aan het in humane colorectaal carcinomen gevonden monosialoganglioside (J.L. Magnani c.s., Science 212: 55-56, î981). Nagegaan zal worden of voor mammatumoren, waarvoor e.e.a. oorspronkelijker is beschreven als toename van lipidegeassocieerd siaalzuur in het serum, wel een kwalitatief verschil bestaaL met de controles. Een andere benadering is om uit te gaan van serumlipoproteinen. Omdat deze bij rat en muis grote verschillen vertonen met die van de mens, zal hier uitsluitend met humaan materiaal worden gewerkt. Nagegaan zal worden (in samenwerking met III.5) of de glycolipiden in de circulatie zijn geconcentreerd in de HDL fractie enjof in de onlangs beschreven LDL-In fractie (L.K. Curtiss en T.S. Edgington, Cancer Res. 41: 3786, 1981). Voor het LDL-In is beschreven dat dit T-cellen remt en wel door polaire ·lipiden, waarschijnlijk glycolipiden. .

.Het onderzoek naar de expressie van tumorprogressie op het celoppervlak zal t.Z.t. worden uitgebreid met een reeks ent-hepatomen die onlangs zijn ontwikkeld en thans in hun ca. 20e transplantatie-generatie zijn. Zij zijn van het "minimal deviation"type, evenals T 143066 destijds was. Aan dit hepatoom is het verschijnsel ontdekt. eInde plasmamembranen Van twee sterk anaplastische hepatomen (muis .en rat) is door ons een "abnormaal" neutraal glycolipide gevonden, voorlopig aangeduid als GL 1!. Meer uitgebre·id onderzoek aan meer systemen zal moeten volgen om een tumorspecificiteit te kunnen aantonen van dit niet eerder gevonden lipide. Met name isolatie en nadere karakterisering zullen plaatsvinden. Een grote handicap blijft de uiterst geringe hoeveelheid materiaal die per proefdier beschikbaar komt i dit is in de orde van 10 nanogram. Het accent van verder onderzoek zal in eerste instantie liggen op het verlagen van de detectiegrens.

III.2 GLYCOPROTEINEN IN HET CELOPPERVLAK VAN NORMALE- EN TUMORCELLEN W.P. van Beek, G.J. Blanken, J.P. Breekveldt, L. Dorland,* H. van Halbeek* en J.F.G. Vliegenthart* De structuur bepaling, m.b.v. hoogfrequente lH-NMR spectroscopie en GLC van glycoconjugaten verkregen van het oppervlak van cellen werd in aanzienlijke mate bemoeilijkt door de aanwezigheid van storende substanties. De nu ontwikkelde voorzuivering en verdere scheiding met

behulp van ionenwisselaars maakt het mogelijk om tot gericht structuur onderzoek te.komen van de diverse oligosaccharide units· van het celoppervlak. Voorlopige resultaten duiden erop dat de volledigé structuur van het complexe type oligosaccharide niet eenduidig· bepaald kan worden met alleen hoog frequente 360 MHz l H-NMR spectroscopie, alhoewel de zojuist in gebruik genomen 500 MHz apparatuur mogelijkerwijs hiervoor meer mogelijkheden kan bieden.

* Organisch Chemisch Laboratorium, Rijks Universiteit, Utrecht. 12

In de loop van 1982 zal naar verwachting de methanolyse en GLC gekoppeld aan massa-spectrometrie toepasbaar gemaakt worden op de voor ons 'van belang zijnde structuren. Inde loop van 1983 zullen dezê technieken dan ingezet kunnen worden om de structuur van het complexe type oligosaccharide van BHK en PyBHK cellen verder te bepalen.

sommige na differentiatie in .vitro verdwijnen en anderen (de zgn.·snel eluerende glycopeptiden) juist ver~ rijkt worden (zie komend jaarverslag, Geven voor Leven project KOCA lII-09) . Vergelijking zal plaats vinden door grote hoeveelheden granulocyten te isoleren uit buffy-coats van gezonde donoren. Bij mogelijke structuur verschillen kunnen betreffende glycoconjugaten gebruikt worden voor het isoleren van hopelijk tumor specifieke monoclonale antilichamen (zie Annual Report 111.6).

Tevens zullen grote hoeveelheden promyelocyten leukemiecellen (HL-60) gekweekt worden. Hierin bevinden zich op het celoppervlak zeer interessante glycoèónjugaten waarvan

lII.3 ROL! VAN HET CELOPPERVLAK BIJ DE GROEIREGULERING IlI.3a SCHEIDING VAN CHROMOSOMEN EN GENETISCHE CONTROLE VAN GETRANSFORMEERDE GROEI .J.G. Collard,J.F. Schijven en J.W.G. Janssen In samenwerking met project 11.4 is een methode ontwikkeld om grote hoeveelheden metaphase chromosomen te scheiden via 30 g sedimentatie (zie Annual Report '80, '81). Doordat de FACS IV flow sorter nu beschikbaar is kunnen de chromosoom analyses aanzienlijk worden verbeterd, terwijl tevens de mogelijkheid bestaat chromosoom fracties verder op te zuiveren door middél van flowsorting.

nisme van integratie en multiplicatie van ge introduceerde DNAsequenties in het genoom van de gastheercellen. .2 Het DNA van de chromosomale fracties afkomstig van TK+ transformanten zal gebruikt worden om TK- cellen weer naar TK+ cellen te transformeren. Op deze manier hopen. wij aan te tonen dat genen, biochemisch gelocaliseerd in bepaa.1de chromosomale fracties, overgebracht kunnen worden in andere cellen en daar biologisch tot expressie kunnen komen. Tevens zullen experimenten gestart worden om middels DNA transfectie de genetische informatie welke getransformeerde groei en tumorigeniciteit induceert (oncogenen) te localiseren op bepaalde chromosomen. We· h·open zodoende meer inzicht tè krijgen in de chromosomale locatie. van cellulaire oncogenen. Mogelijk kan er verband gelegd worden tussen de activering van bepaalde oncogenen en het optreden van specifieke tumoren.

I

Het 'DNA van gefractioneerde chromosomen wordt voor verschillende doeleinden gebruikt: . • 1 Middels· recombinant DNA onderzoek verkregen gecloneerde genen kunnen als c-DNA probe worden gebruikt öm deze genen te localiseren op het DNA van gefractioneerde chromosomen via filter hybridizatie. Dat deze benadering mogelijk is hèbben wij aangetoond door gecloneerde stru.cturele ratte genen te localiseren op het DNA van gefractioneerde rattechromosomen (zie Annual Report 1981) . Een Iset thymidine kinase negatieve muizecellijnen, welke middels DNA transfectie getransformeerd zijn met hetthymidine kinase gen van Herpes simplex virus type 11 (HSV 11) wordt onderzocht op de chromosomale of extria-chromosomale locatie van het geintroduceerd~ TK gen. Deze benadering geeft inzicht in het mecha-

83 DNA van gefractioneerde chromosomen kan ook gebruikt worden als genverrijkingstap ·voor het cloneren van genen in bacteriën via recombinant DNA technieken. Op Qeze manier kunnen genenbanken geconstrueerd worden van het DNA van een enkel chromosoom. 13

In ~a~enwerking met de Fungo werkgroep Celgenetl.ca worden somatische éelhybriden onderzocht op de moge~ lijkheid de chromosomen hiervan te scheiden en het DNA van een bepaald menselijk chromosoom te isoleren voor clonerings experimenten. Voorlopige resultaten met een be-

paalde mens-muis celhybride, welke nog ·slechts 1 menselijk chromosoom bevat, tonen aan dat dit chromosoom practisch zuiver te ~soleren is. Deze benadering heeft het voordeel dat contaminatie van andere menselijke chromosomen uitgesloten is.

III.3b MEMBRAANEIGENSCHAPPEN VAN TUMORCELLEN .L.A. Smets, H. van Rooy, J.G.M. Bolscher* a) biosynthese Het structuuronderzoek van tumorgeassocieerde veranderingen in de koolhydraat keten van integrale membraaneiwitten door middel van virale probes zal worden afgerond. De nadruk zal liggen op de chromatografie van gedeeltelijk afgebroken (m.b.v. de enzymen Endo-H en neuraminidase) viraleglycopeptiden gesynthetiseerd in .normale en tumorcellen. Het onderzoek naar de rol van adenovirus 12 DNA fragmenten op het membraankoolhydraat fenotype zoals om. schreven in het werkplan 1982, zal de nadruk krijgen in dit projectonderdeel. Door middel van pulsechase experimenten met radioactieve bouwstenen wordt nagegaan in welke stappen van de biosynthese tumor.specifieke veranderingen optreden. ~) Somatische genetica van Betransformeerde groei De moleculair-genetische mechanismen van getransformeerde en neoplastische groei worden vooral bestudeerd in virus-getransformeerde modelsystemen. Op formeel.genetische gronden kan verdedigd worden dat deze modellen slechts tot op bepaalde hoogte representatief zijn voor de neoplastische transformatie bij de mens. In niet-viraal getransformeerde cellen is het tumorvormend vermogen dissocieerbaar van het getransformeerde fenotype. In somatische kruisingen blijken de deeleigenschappen van tumorcellen vaak recessief te zijn die in virale modellen dominant zijn. Onderzoek naar de formele somatische genetica van spontane of chemisch geinduceerde phenotypen van getransformeerde cq.

*KWF-fellow 14

tumorigene cellen is daarom geboden. In dit projectonderdeel zullen twee aspecten worden bestudeerd. e1 Somatische genetica van ongelimiteerde groei. Het vermogen tot ongelimiteerde groei in weefselkweek (infinite life-span) is de meest consistente verandering in getransformeerde cellen die reeds door Hayflick in 1962 werd beschreven. Een oorzaak op genniveau wordt door velen aangenomen maar experimentele resultaten te~ ondersteuning en a~ nalyse van deze veronderstelling, zijn schaars . Wij zullen somatische hybriden ma·ken tussen (normale) cellen met eindige levensverwachting en tumorcellen met oneindige levensverwachting in inter- en intraspecifieke combinaties. In de interspecifieke combinaties treedt preferentiële segregatie op van de chromosomen van één der partners. De frequentie waarmee hybride kolonies ontstaan maakt conclusies mogelijk t.a.v. de aard van de genetische factoren (dominant·-recessiefl die mogelijk de (on)eindige levensverwachting bepalen. Parallel aan deze experimenten zullen kunstmatig gevormde. heterokaryons van cellen met en zonder oneindige levensverwachting worden bestudeerd m.b.v. autoradiografie: Groeistimulering van· rustende celkernen dan wel groeirem~ ming van prolifererende kernen kan inzicht verschaffen in moleculaire mechanismen die hierbij een rol spelen. e2 Somatische genetica van tumorgeassocieerde membraankoolhydraten. Structurele veranderingen. in membraankoolhydraten hebben een grote, zo niet absolute correlatie met het maligne phenotype. Onderzoek met

met de,expressie van tumorigeniciteit. Studies met somatische celhybriden en met heterokaryons zullen dit onderzoek verder. aanvullen. Wij willen hierbij de volgende hypothesen testen. (a) Tumor-geasso~ cieerde veranderingen in membraankoolhydraten zijn een rec.e.ssieve eigenschap en (b) zij ontstaan door dissociatie cq. verlies van een gen dat controlerend werkt op normale structurele genen voor oligosaccharide synthese.

variante cellijnen en met somatische celhybriden heeft waarschijnlijk gemaakt dat deze veranderingen veroorzaakt worden door recessieve mutaties bij spontane of chemisch geinduceerde tumoren. In cellen getransformeerd door DNA fragmenten' Van het adenovirus 12 zijn echter eiwitproducten van de 7-15% regio betrokken bij dit verschijnsel. Het werkplan voorziet in een analyse van karakteristieke veranderingen in chromosoom 1 van Chinese hamstercellen die geassocieerd zijn

lIl. 4 TUMORCELMEMBRAAN EN METASTASERING III.4.a MODELLEN VOOR STAPPEN IN HET METASTASERINGSPROCES E. Roos en I.V. van de Pavert activiteit van Kup'ffercellen te verhogen en aldus, zo ·.mogelijk, levermetastasering te beïnvloeden. Hierbij wordt gedacht aan i.v. injecties van macrofaag activatoren ingekapseld in liposomen of erythrocyten-"ghosts". Het effect van deze behandelingen zal worden geëvalueerd in vitro (geïsoleerde Kupffercellen), in vivo, en in de geperfuseerde lever. Met het oog hierop is de perfusietechniek verbeterd om meet langdurige perfusies (8 à 12 uur) mogelijk te maken.

He]?atocyten .De interacties tussen tumorcellen en hepatocyten zullen nog nader gedefinieerd worden. Met name de invloed van insuline en dexamethason ophepatocyten en de mogelijke in~ vloed van prostaglandines op lymfosarcoomcellen krijgt aandacht. In samenwerking met III.4d zal onderzocht worden of colchicine, procaine, Ca-ionofoor en dibutyryl-· cyclisch AMP veranderingeninduceren in het membraan-geassocieerde cytoskelet, die te correleren zijn met het effect op adhesie.

In vivo modellen voor levermetasta~g-

Endotheelcellen Er zal onderzocht worden welke serumfactor(en} betrokken is (zijn) bij de adhesie tussen lymfosarcoomcellen en endotheelcellen. Het belang van deze interactie zal nader bestudeerd worden door zo veel mogelijk lymfoide tumoren te testen, waarvan het metastaseringsgedrag bekend is, of door ons is vastgesteld. In eerste instantie wordt gedacht aan muizelymfomen, maar hopelijk kan dit ook met humane cellen. Dit zou de positieve correlatie tussen adhesie aan endotheelcellen en levermetastasering, nu gevonden voor een beperkt aantal cellijnen, moeten bevestigen. In samenwerking met Dr. A. Tulp·zal getracht worden endotheelcellen verder te zuiveren.

Ter evaluatie van de effecten van specifieke antisera (III,4b) en macrofaag activatoren (zie boven) zullen in vivo modellen ontwikkeld worden.~edacht wordt aan s.c. geimplanteerde tumoren met specifieke levermetastasering, zoals Esb lymfoom en M5076 histiocytaire tumor. Beide zijn reeds in gebruik. Verder wordt gedacht aan injecties van darm- of mammatumorcellen in portaalvat of milt, mogelijk ook humane tumorcellen in naakte muizen. Dit gebeurt in samenwerking met Dr. K.P. Dingemans van het Wilhelmina Gasthuis.

Kup.ffercellen We willen proberen de anti-tumor 15

III.4b DE ROL VAN ADHESIEMOLECULEN IN HET METASTASERINGSPROCES O.P. Middelkoop, P. van Bavel en E. Roos Wè beschikken inmiddels over meerdere antisera die de adhesie aan en 'infiltratie in hepatocytencultures door twee verschillende tumorceltypen en ook de adhesie aan endotheelcellen blokkeren. De volgende stap i~ het identificeren van de betrokken membraancomponenten. Dit dient te worden bereikt door voorbehande'ling van de antisera met (partieel) gezuiverde membraancomponenten, hetgeen dan al of niet de remmende werking opheft. Deze zuivering zal uitgevoerd worden met verschillende technieken zoals gel-, ionenuitwisselings- en affiniteitschromatografie,immuunprecipitatie, en diverse electroforese technieken. Onderzocht zal worden met welke extractie- en scheidingstechnieken het beste de relevante componenten geïsoleerd kunnen worden met behoud van hun

neutraliserende activiteit. Met de gezuiverde component kan dan een monospecifiek antiserum bereid worden. De"specifieke antisera zullen vervolgens gebruikt worden in het onderzoek genoemd onder III.4a, c en d. Waar deze componenten gelocaliseerd zijn zal worden vastgesteld m.b.v. geïsoleerde cellen, in intacte weefsels en optumorcellen. Op langere termijn kan gedacht worden aan een poging de vorming van "levermetastasen te blokkeren met de ,specifieke antisera. Hiernaast zal gezocht worden naar een (radioactieve) techniek waarmee sneller de mate van adhesie van tumorcellen aan het geëxposeerde hepatocytenoppervlak alsook de tumorcelinvasie kan worden bepaald.

III.4c DE ROL VAN DOMEINEN IN HET PLASMAMEMBRAAN BIJ DE METASTASERING C.A. Feltkamp en A.W.M. van der Waerden Een belangrijke nieuwe, ontwikkeling binnen de techniek van het vriesklieven is de mogelijkheid om op de vriesvlakken zelf met behulp van gelabelde antisera of lectinen componenten van het celoppervlak aan te tonen (Pinto da Silva e.a., Science 213: 230, 1 981; J. C . B . 91: 36'1, 1981). Ontwikkeling en toepassing van deze techniek zal zeer belangrijk zijn bij onderzoek naar domeinen in het plasmamembraan en localisatie van celoppervlak componenten , tijdens en na interacties tussen cellen. Dit zal, samen met roterend schaduwen en diep etsen toegepast worden bij het onderzoek naar de vorming van celcontacten tussen hepatocyten in een mono laag en' tussen hepatocyten en TA3 mamma tumor cellen. Uit onderzoek binnen III.4a,is gebleken dat behandeling van cellen met stoffen die reageren met tubuline invloed heeft op het adhesie gedrag. Dit gaat vaak samen met een vormverandering van de cel (o.m. uropodvorming bij lymfosarcoom cellen). Het is bekend dat de versprei-

ding van oppervlakte componenten beinvloed kan worden door vormverandering (de Petris, J. Ultrastruct. Res. 74, 267, 1981). Met behulp van labelingstechnieken zal worden on- ' derzocht of een verplaatsing van oppervlakte componenten mede een rol speelt bij de verandering in adhesie gedrag van lymfosarcoom cellen na behandeling met stoffen die met tubuline reageren. TA3 mammatumor cellen vertonen na een dergelijke behandeling niet een veranderd adhesie gedrag, maar wel een verandering in infiltrerende activiteit. Tussen TA3 cellen en hepatocyten worden uitgebreide complexen van celcontacten gevormd, die mogelijk medebepalend zijn voor adhesie' en infiltratie. De inv'loed van tubuline op de vorming van deze celcontacten zal eveneens worden onderzocht. In samenwerking ,met III.4d zullen met vriesklief en labelingstechnie'ken aspecten van vorming en afsnoering van coated pits, die belangrijk zijn voor receptor-geinduceerde endocytose, verder worden onderzocht. 16

Hierbij zullen vergeleken worden cellen met afwijkende aantallenenj of functioneren van de coated pits (zie III.4d). Met behulp van de vriesklieftechniek is waargenomen dat het plasmame~­ braan van hepatocyten die vrij lang zijn gekweèkt sterk verschilt van dat van 24 h hepatocyteh. Ook het adhesie gedrag tussen bepaalde tu-

morcellen en langer gekweekte hepatocyten is anders. Mogelijk zijn dergelijke veranderingen in morfologie en adhesiegedrag ook te induceren door aan- of afwezigheid van bepaalde hormonen in het kweekmedium. Getracht zal .worden morfologische veranderingen door veroudering of hormonen te corrèleren met gewijzigd adhesie gedrag._

III.4d DE ROL V;"N HET MEMBRAAN-GEASSOCIEERDE CYTOSKELET BIJ DE METASTASERING, DE RECEPTOR-GESTUURDE ENDOCYTOSE EN TUMOR CEL PROLIFERATIE D.A.M. Mesland en H. Spieie. logie van het membraanskelet en de receptor-gestuurde endocYtose. Gezien het belang hiervan zullen de volgende probleemstellingen worden aangepakt. - Is de receptor-gestuurde endocytose inderdaad afhankelijk van een intact membraanskelet. - Als cellen zijn gestoord in hun mechanisme van receptor-gestuurde endocytose welk effect hebben groeihormonen dan op de celproliferatie . -Immers geremde opname van het receptor-hormoon complex zou kunnen leiden tot een ongeremd groéisignaal. Deze problematiek zal worden aangepakt in samenwerking met dr. R. van Wijk in Utrecht met gesynchroniseerde H35 cellen, die alleen insuline behoeven om de delingscyclus in te gaan.

Er wordt thans gewerkt aan een procedure om het membraan-geassocieerde cytoskelet (kort: membraanskelet) immuun te labelen op EM niveau. Gecombineerd met bestaande labelingstechnieken voor membraan receptoren (o.a. met colloidaal goud) biedt droog-klieven de unieke mogelijkheid om direkte stereo waarnemingen te doen van receptoren en hun relatie met de structuur en samenstelling van het membraanskelet, onder versèhillende biologische omstandigheden en met uiteenlopende celtypen. Een aantal vraagstellingen m.b.t. de metaStasering zullen met deze methodiek' worden aangepakt. - Welke zijn de effecten op het membraanskelet van MB 6A lymphosarcoom cellen en TA3 mammacarcinoom cellen van drugs die de adhesie van deze cellen met de hepatocyt beinvloeden. - Welke locale veranderingen ondergaat het hepatocyt membraanskelet na aanbieding van latex bolletjes (of andere dragers) gecoat met tumorcel plasmamembraan of geisoleerde componenten hiervan. wat is de invloed van antitubuline drugs hierop. Deze studie kan starten met asialoglycoprotein-gecoate bolletjes.

Hiermee samenhangend loopt tenslotte al een onderzoek met drs. F.A. VythDreese. (X.1a) naar het effect van phorbol ester (TPA) op het membraanskelet van humane thymocyten. Het web verandert duidelijk van structuur na 1 dag incubatie. In aanwezigheid van PHA wordt in het web bovendien een toename van clathrine coat waargenomen. Ook hier lijkt de endocytose gestoord.

Het lopende onderzoek naar het membraanskelet van verschillende hepatoma cellen zal worden afgesloten. De resultaten van dit onderzoek suggereren een verband tussen de morfo-

17

III.5 EXPRESSIE EN DYNAMIEK VAN CELOPPERVLAK COMPONENTEN BIJ LEUKEMIE IN RELATIE TOT DE EXTRACELLULAIRE OMGEVING - -.- - - - - -- - ". . --.W.J. van Blitterswijk, P. Emmelot; H.A.M. Hilkmann, J.M.M. de Widt Het fenotype van een tumorcel, bij·voorbeeld.de expressie van oppervlakte antigenen, kan bepalend zijn voor de interactie met immuun systeem en de maligniteit. van de tumor. De vloeibaarheid van membraanlipiden en de factoren die deze bepalen staan in dit opzicht centraal in dit project. Er zal worden nagegaan in hoeverre modulatie van de lipide vloeibaarheid in het plasmamembraan van invloed is op de expressie van celoppervlakte antigenen. Hiertoe zullen GRSL cellen en evt. andere lymphoide cellen in vitroworden behandeld met cholesterylhemisuccinaat (dit rigidiseert het plasmamembraan). Er zal o.a. gebruik worden gemaakt van monoclonale antilichamen (in samenwerking met dr. J. 'Hilgers, project VI-3) om de expressie van differentiatie-antigenen en tumorgeassocieerde antigenen van verschillende moleculaire identiteit te meten. Tevens zal de antigene expressie op GRSL cellen gerelateerd worden aan de herkomst van de cellen (bv. milt, bloed,ascites, enz.). Zoals bekend, beinvloedt deze herkomst de membraan lipide fluiditeit (Van Blitterswijk et al, Cancer Res 41: 3670, 1981)

De diverse celtypen zullen in samenwerking met dr. A. Tulp (project 11.4) worden gescheiden op grootte en dichtheid. De rol van cholesterol bij kanker, in het bijzonder bij lymphoide tumoren, zal nader worden bestudeerd: .1 de experimenten betreffende de cholesterol biosynthese in normale en neoplastische lymphoide celtypen, zullen worden aangevuld met metingen van de activiteit van het enzym 3hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase. .2 Serum lipoproteinen, die membraanvloeibaarheid mede bepalen, zullen worden geïsolee:r:d uit bloedserum en ascitesplasma van tumordragende muizen. Ze zullen worden geanalyseerd m.b.t. eiwit, cholesterol (vrij en veresterd) phospholipiden en triglyceriden. Het electropherogram van deze lipoproteinen zal ver'geleken worden met dat van controle sera • • 3 In'pilot experimenten zal worden nagegaan in hoeverre ook anderé typen van tumoren.in muizen en ratten geassocieerd zijn met afwijkingen in serum lipoproteinen, in het bijzonder het gehalte aan cholesterol.

111.6 ONDERZOEK NAAR MEMBRAANGLYCOPEPTIDEN VAN LEUKEMIECELLEN A.H.J. Kolk en .J. van Ramshorst "Omdat over de voortzetting.van dit project nog geen zekerhei.d bestaat zijn de werkplannen hier niet opgenornen ...

18

Sektie IV

IV.I

TUMOR IMMUNOLOGIE

Immunologisch onderzoek bij tumor patienten

J.E. de Vries, B. Honing, W. v.d. KasteeIe, M. Poelen IV.l'. a Het onderzoek naar de in .vitro generatie van T cel klonen die specifiek cytotoxisch zijn voor autologe melanoom cellen zal worden voortgezet. Naast de generatie van cytotoxische T cellen in mixed leukocyte tumor cell cultures waarin autologe HLA DR+ melanoom cellen als:stimulator cel gebrUikt worden, zal dit onderzoek uitgebreid worden met de generatie van cytotoxische T cellen in mixed leukocyte cultures. Hiertoe zullen lymfocyten van:melanoom patienten gestimuleerd

worden met bestraalde EBV~getrans­ formeerde B cellijncellen (JY). Zodra de cytotoxische-T cel klonen verkregen worden zal m.b.v. blokkerings experimenten met monoclonale antistoffen gericht tegen melanoomgeassocieerde determinanten en T cel differentiatie antigenen, nagegaan worden welke determinanten zowel op de melanoom cel als op de cytotoxische T effektor cel een rol spelen in de cytotoxische T cel / melanoom cel herkenning en de cytotoxische reaktie.

IV.l.b In samenwerking met Sektie I (Dr. Bont en Drs. Figdor) zullen een tiental monocyten funkties van plaveisel cel carcinoom, basaal cel carcinoom, melanoom, long carcinoom en maag/darm carcinoom patienten bestudeerd worden. Het is de bedoe-

ling om na te gaan of de defekten in de verschillende monocyten funkties van deze patienten toegeschreven kunnen worden aan verschuivingen in de specifieke dichtheid, die mogelijk veroorzaakt .worden door stoornissen in de· late differentiatie van deze cellen. ___________

IV.I.c.· Produktie van monoclonale antistoffen ter karakterisatie van funktioneel verschillende monocyten subpQpulaties J.E.' de vries, J. Leemans Een eerste fusie experiment heeft een 4-tal (RUPI-I, 2, 4 en 5) goed gekarakteriseerde monoclonale anti~ stoffen opgeleverd die specifiek reageren met alle humane perifere bloed monocyten en granulocyten. Preliminaire resultaten hebben aangetoond dat RUPI-I en 5 mogelijk reageren met monocyten/granulocyten differentiatie antigenen. Dit laatste onderzoek zal verder worden uitgebreid door normale beenmerg preparaten uitgebreid te screenen met deze monoclonale antistoffen.

Bovendien zullen promonocyten afkomstig van de cellijnen HL-60 en U 937 gedurende hun differentiatie tot monocyten, welke bewerkstelligd wordt door phorbol ester, getest worden op hun reakties met RUPI-I, 2, 4 en 5. Tenslotte zal er een nieuwe serie monoclonale antistoffen gemaakt worden tegen monocyten subpopulaties, geïsoleerd m.b.v. elutriatie centrifugering.

19

IV.l.e

Melanoom antigenen

C. Vennegoor, F. van Buitenen, Ph. Rürnke Van de monoclonale antilichamen die tegen membranen van melanoom cellen zijn gemaakt reageren er twee (C3 en C4) met formaldehyde geffxeerde melanoom coupes. De reaktie op ,deze coupes is redelijk specifiek ge~ b~eken voor melanoom. Genoemde monoclonale antistoffen zullen daarom waarschijnlijk kunnen worden toegepast voorde diagnostiek, met name in twijfelgevallen waarin kans op melanoom bestaat. Omdat de monoclonale antistoffenC3 en C4 met alle onderzochte' primaire,'tumoren en de uitzaaingen ervan reageren, lijkt het interessant om de antigenen die hiermeerèageren biochemisch te karakteriseren. Dit zou het beste-kunnen worden uitgevoerd aan vers tumor materiaal, daar (in tegenstelling tot gekweekte melanoom cellen) melanoom weefsels uit patienten veel antigenen die met C3 en C4 reageren lijken te bevatten. De overige monoclonale antilichamen (C2, 5, 6, 7 en 8) die alleen met vriescoupes van melanoom reageren, lijken door hun specific~teit het meeste geschikt voor toepassing in een eventuele indirekte radio immuno assay (RIA) van sera van melanoom patienten (zie Werkplannen 1982). Hiervoor zijn biochemisohe karakterisering en goede zuiverings methodes van de reagerende antigenen noodzakelijk. Voor de zuivering van de antigenen zal waarschijnlijk affiniteits chromatografie worden toegepast, zo mogelijk met gebruikmaking van lectines die specifiek met de antigenen reageren (dit laatste moet nog worden , . onderzocht) •

spuiting met monoclonale antistoffen en gebruik van monoclonale antistoffen als therapeutisch middel dermate onbevredigend dat het voorlopigwein'ig opportuun iijkt om een toepassing van rnonoclonale antilichamen teg~n melanoom in deze richting te zoeken. Van de door ons gemaakte monoclonale antistoffen zijn C3 en 4 hiervoor zeker niet geschikt, omdat er in vriescoupes te veel reakties zijn gevonden met normale' weefsels. C2" 6 en 7 tonen in vriescoupes wat minder kruisreakties met normale weefsels. CS "en 8 z.ijn tot nu toe het meest specifiek bevonden, maar reageren ook het zwakste. Daarom zou het nodig kunnen zijn om nieuwe monoclonale antistoffen tegen melanoom te bereiden. Voor diagnostische doeleinden, b.v. in immunoperoxidase tests op'weefsel coupes en in de indirekte RIA, 'zouden deze het beste in de muis kunnen worden bereid, omdat zij dan het beste aan te tonen zijn. Mocht intussen blijken dat de vooruitzichten betreffende tumor lokalisatie door scintigrafie van patienten na inspuiting van radio-aktief gelabelde monoclonale antistoffen en therapie d.m~v. monoclonale antistoffen waaraan cytostatica zijn gekoppeld wat gunstiger zijn gewor-" den, dan zal hiertoe, in samenwerking met J. Hilgers c.s. (projekt VI.3f) worden gestart met het bereiden van menselijke monoclonale antistoffen tegen melanoom. Uit resultaten van bereiding van monoclonale antilichamen tegen melanoom, is gebleken dat het noodzakelijk is om in een vroeg stadium na de cel fusie op weefsel coupes te testen. Bij toekomstige fusies zal dit gebeuren in samenwerking met Ph. Hageman (projekt X.18).

Tot nu toe zijn de resultaten die in andere instituten en uit de literatuur bekend zijn over scanning van patienten na iri-

,IV.2

Membraan antigenen van leukemische en normale lymfoide cellen

A. Hekman, J.J. Sein immunisatie uit een leukemie cel~ lijn zijn nu 4 T-cel specifieke

Het werk met monoclonale anti~toffen

zal~ordenv~o~t~e~~t.

Door 20

monoclonale antistoffen verkregen, waarvan 3 dezelfde subpopulatie lijken aan te tonen. De reeks wordt uitgebreid door immunisatie met gekweekte leukemie cellen en met normale T-cel cloons (geïsoleerd door H. Spits). De antistoffen zullen worden getest op een aantal .leukemieën en worden gebruikt voor

bestudering van lymfoide differentiatie antigenen en hun rol bij cellulaire interacties (het laatste met J.E. de Vries, projekt IV.la). Ten behoeve van het werk met B-cel lymfomen (P.A. Vyth, projekt X.la) zullen een aantal monoclonale antistoffen tegen deze tumor cel worden gegenereerd. __________________

21

22

SEKTIE V

TUMOR VIROLOGIE

----------~--------------------------_._---------

V.I. Moleculaire biologie vanMMTV R. Michalides, L. van Deemter, V. Kwee*, R. Nusse, A. van Ooyen

en E. Wagenaar.

den gecloneerd. De verkregen DNA probes worden gebruikt om na te gaan of deze regio's ook worden overgeschreven in RN1,. Hierbij worden Northern blottipg en S-l analyse van DNA/RNA hybriden gebruikt. Deze probes worden ook gebruikt om in mamma tumoren met andere .species naar soortgelijke RNA transcripten aan te tonen.

1.·0nderzoek naar specifieke inte.gratie regio' s voor MMTV. In dit onderdeel zal worden bestudeerd of MMTV-DNA op min of meer specifieke gebieden in het cellulaire.DNA.van mammatumoren wordt aangetroffen. De achterliggende hypothese is dat dat specifieke gebied informatie bevat die relevant is voor de mammatumorontwikkeling. Door integratie van het MMTV provirus in dat gebied wordt expressie van deze cellulaire informatie geïnduceerd. In het geval van MMTV geïnduceerde mammatumoren bij BALB/cfC3H zijn hiervoor aanwijzingen gevonden (zie jaarverslag 1981). Dit onderzoek wordt verder uitgebouwd, verder wordt nagegaan of de regio specifieke integratie van MMTV provirussen ook geldt voor hormoon gevoelige en hormoon onafhankelijke tumoren van GR.

Met behulp van in vitro translatie technieken of door gebruik te maken van zgn. geschikte expressie vectoren zal worden nagegaan voor welke eiwitten deze specifieke integratie regio's coderen, hetg~en de mogelijkheid opent hiertegen antistoffen op te wekken. Onderzocht zal worden in hoeverre de transcriptie van cellulaire genen die naast MMTV liggen gevoelig· is voor steroïd hormonen. De transcriptie van MMTV zelf staat onder invloed van steroïd hormonen en het is niet denkbeeldig dat de door insertie geactiveerde cellulaire genen ook door steroïden kunnen worden . gestimuleerd.

Tevens wordt nagegaan of in mammatumoren met verschillende ontstaanswijzen (prolactine geïnduceerd, of met behulp van urethaan en röntgenstraling) dezelfde cellulaire DNA sequenties ·betrokken zijn als in het BALB/cfC3H model. In mamma tumoren van andere species, inclusief mens, zal worden nagegaan of een verwante DNA sequentie bij de tumorvorming is bétrokken.

3. Onderzoek naar transformatie.genen bij mammatumoren. Nagegaan wordt of DNA fragmenten van muizenmammatumoren (van GR en BALB/cfC3H), na overdracht naar geschikte testcellen (NIH3T3), in staat zijn deze cellen morfologisch te doen transformeren. Deze DNA fragmenten worden dan nader gekarakteriseerd met behulp van restrictie enzymen en, zo mogelijk, gecloneerd in bacteriofagen en plasmiden. Eveneens wordt nagegaan of cellulaire DNA fragmenten romdon de extra provirussen van het muizenmammatumor virus in de mammatumoren, als vermeld onder 1., in staat zijn na overdracht in geschikte testcellen, cellen te doen transformeren en of deze overeenkomen met bovengenoemde transformatiegenen.

Bij de muis zal de integratie regio opeen van de muizenchromosomen gelocaliseerd worden met behulp van somatische cel genetica, hetgeen gecorreleerd zou kunnen worden aan bepaalde chromosomale afwijkingen in ,tumoren. 2. Onderzoek naar (verhoogde) transcriptie van genen die rondom de in ~genoemde integratieplaatsen van MMTV liggen. Dein 1. aangeduide specifieke integratie regio's voor MMTV-DNA wor*NKI project 81-8

23

4. Analyse van transcrip.tie van de in GR stammen. DNA sequentie analyse heeft aangetoond, dat de Long Terminal Repeats van MMTV coderen voor een eiwit van 36.700 dalton, dat orf (Open Reading Frame) genoemd word~Noch het bestaan van dit eiwit, noch van het RNA dat ervoor codeert, is tot nu toe aangetoond. Het onderzoek zal zich toespitsen op functie en expressie van dit eiwit. Hiervoor zal in eerste instantie~ RNA van mamma tumoren en andere weefsels worden onderzocht op aanweziqheid van orf in mRNA. Dit gebeurt met nucleaseSlmapping technieken met behulp van de 4 geïntegreerde copieën van MMTV die in E.coli gecloneerd zijn en tot onze beschikking staan. Het is nodig elk provirus apart te bekij~p'rovirussen

ken omdat namelijk blijkt dat er tussen de orf eiwitten van de LTRs van de verschillende provirussen verschillen in volgorde bestaan, wat mogelijk met de functie van dit eiwit in verband staat. De functie van het eiwit kan bestudeerd worden door mutanten te construeren die deleties bevatten in dit gebied. Na transfectie in Lcellen kan b.v. gekeken worden naar hormoonafhankelijkheid van de RNA synthese, alsmede naar virus productie. Eventuele virusdeeltjes kunnen dan getest worden op inductie van tumoren in muizestammen. In het kader van deze experimenten zal ook de expressie van de verschillende provirussen in de stammen GR en GR mtv 2 - bestudeerd worden.

V.S.a. EXOGEEN MUIZEMAMMA-TUMORVIRUS (MMTV) ALS MITOGENEFACTOR IN GEKWEEKTÈ CELLEN . J. Links, O. Tol en Y. Schaap - da Silva de Freitas

Vroeger vonden we, dat MMTV in de vorm van gezuiverde virionen (Bdeeltjes) groeifactor (GF)-activiteit heeft in "in vitro" gekweekte muize- en hamstercellen. Terwijl dit verschijnsel ontdekt en herhaaldelijk weer aangetoond werd in klassieke, serum bevattende, media, vonden we kortgeleden (Annual Report 1981): 1. Primaire baby-muize-nier (BMK) cellen kunnen in een synthetisch basismedium (zonder hormonen of groeistoffen) gekweekt worden, mits insuline toegevoegd wordt. Insuline kan door prostaglandine E, (PGEli C20-vetzuur) vervangen worden. En niet door bijvoorbeeld transferrine. 2.MMTV heeft ook in primaire BMKcellen, gekweekt in het synthetische basismedium een GF-activiteit. Als naast MMTV ook insuline (of PGEl) toegevoegd wordt, is de totale GF-activiteit groter, maar minder dan de som van de 2 afzonderlijke GF-activiteiten. Het belang van vérder onderzoek naar de mi togene acti vi tei t van MMTV in zo'n chemisch gedefinieerd in vi ~r_o_ systeem werd reeds toegelicht

(Annual Report 1981). We voegen daar nog aan toe, dat de GF-activiteit van MMTV het enige morphologische effect van MMTV in gekweekte cellen is, dat (llbekend, (2) gemakkelijk reproduceerbaar en (3) snel te meten is (kwestie van dagen). Deze eigenschap kan als experimenteel middel dienen om verder iIi-het- mechäiïIsmè van de oncogene transformatie van epitheelcellen door MMTV door te dringen. Onderzocht zal nog worden: 1. De invloeden van o.a. EGF (epidermale groeifactor), de afzonderlijke chemische componenten van het MMTV-virion en andere combinaties van de hier genoemde stoffen met GF-activiteit in ons in vitro systeem. 2. De vraag of het MMTV-virion, of een component ervan, in.de cellen moet doordringen voor de GF-activiteit. 3. Vroegtijdige veranderingen in de celmembraan van de" door MMTV mitogeen gestimuleerde cellen. We denken aan eiwitfosforilisering, de grootte van de negatieve lading en de hoeveelheden collageen en fibronectine.

V.5.b. HET MECHANISME VAN DE INDUCTIE VAN ENDOGEEN MUIZE-MAMMA-TUMOR-VIRUS (MMTV) IN LAGE MT-MUIZESTAMMEN J. Links en O. Tol

De rol van endogeen MMTV in lage marnmatumor (MT}-muizestarnmen bij het ontstaan van niet-viraal (d.i. niet door exogeen MMTV, maar wel bijv. door carcinogene stoffen, röntenstralen enz., of "spontaan") gelnduceerde MT is nog niet duidelijk. Verschillende onderzoekers neigen thans naar de overtuiging, dat endogeen MMTV geen noodzakelijke tussenschakel is en dat de vaak in deze MT aangetroffen zwakke MMTV-expressie (V-RNA en V-antigenen; zelden virionen) onafhankelijk gelnduceerd wordt door het niet-virale agens. Onze hypothese daarentegen is, dat endogeen MMTV spontaan gelnduceerd wordt - althans tot gedeeltelijke expressie kan komen - in een nu nog onbekend stadium van cellUlaire veranderingen nadat het oncogene transformatieproces in de mui zemamma door de niet-virale oorzaak in werking gesteld is. Daar onze kennis over de spontane inductie van endogeen MMTV in gekweekte muizecellen nihil en in de intacte muis fragmentarisch was bij het begin van het huidige onderzoek, concentreerden wij ons in eerste instantie op het zoeken naar een mogelijk voorkomen van spontane expressie van endogeen MMTV in gekweekte muizecellen. We gebruikten daarvoor "MMTV-vrije" baby-muize~nier (BMK) cellen, afgeleid van lag'e én hoge MT-muizestam-men: Ter vergelijking maten we steeds gelijktijdig ook de spontane inductie van endogeen MuLV in de cellen. Inductie van MuLV is reeds goed bekend en wordt elders uitgebreid bestudeerd. We hebben gevonden (Annual Report 1981) dat endo-

geen MMTV en endogeen MuLV spontaan gelnduceerd worden in BMK-cellen. MMTV en MuLV komen regelmatig tot een zwakke vroege expressie in primaire en secundaire BMK-cel-culturen. Als de BMK-celculture.n na het gaan door een ca. 2 maanden durende kwetsbare "rust"-periode (2e en 3e maand van de kweken) in snel groeiende epithelolde (permanente?) cellijnen zijn verande-rd, komt endogeen MMTV soms weer, maar nu wel krachtiger, tot expressie. Deze late spontane MMTV-expressie is minder duurzaam dan de, tot nu toe gelijktijdig optredende, late MuLV expressie. Onderzocht zal nog worden: 1. De invloed van de snelheid van de celproliferatie op de spontane inductie van MMTV. 2. De invloed van enkele sterolden peptide-hormonen (o.a. hydrocortison en insuline) op de spontane inductie van MMTV in een chemisch gedefinieerd medium (dus zonder serum). De door ons afgeleide (permanente?) BMK-cel~ lijnen kunnen in een chemisch gedefinieerd basismedium zonder hormonen, of groeifactoren gekweekt worden. 3. De concentratie van MMTV-cDNA in de BMK-cellijnen met en zonder MMTV-expressie, vergeleken met de vers bereide BMK-cellen. 4. De invloed van MuLV op de MMTV gen-expressie in de ·csllijnen.

------~-----------------------------------------

25

Sektie VI. GENETICA EH PROEFDIEREN VI. la ENDOGENE I'll1.i'\1MA'i'Ui-10R VIRUS GENEt\! IN RELA'i'IE TOT Ml'.I':Il1ATm10RIGENESE R. van Nie, J. Hilgers, J. Hilkens, R. Keesom, V. Kroezen, J. de Moes, A. Verstraeten In ons Instituut weiden vijf yerschillende loci die verantwoordelijk zijn voor de expressie vanr·1TV antigenen gevonden, namelijk Htv-l tot en met Mtv- 5. l-roleculaire biologische studies toonden aan dat i'll1'.rvprovirussen zijn geassocieerd met de genen ät:v-l en I1tv-2. Mtv-l op chromosoom 7, is aanwezig in de C3Hf en DBAfstammen en verantwoordelijk voor een late incidentie van mammatumoren. Expressie van het virus vlOrdt beïnvloed door een gen van de C57BL stam, Imv genoemd. Dit gen zou gelokaliseerd kunnen worden met behulp van Bailey' s re-. combinant ingeteeldestammen van de B6 x BALB/c serie. Dit zal gedaan worden door deze stammen te kruisen met C3Hf en in de bastaarden 4e expressie van MTV antigenen te bepalenmet radioimmunoassays en vervolgens het stam-distributiepatroon vàn Imv te vergelijken met het SD patroon van de tot nu toe bepaalde genen. Een en ander zal gecorreleerd worden aan de gevoeligheid van de stammen van deze RI serie voor exo":' -:. gene MTV's van verschillende stammen, zoals de C3H, RIII, HLL, BALB/c-O, etc. (zie ook VI. Ic) . De genen Mtv,2 en Mtv-3 zijn beide aanwezig in het genoom van GR muizen . .lY1tv-2 is een locus op chromosoom 18, dat verantwoordelijk is voor de ontwikkeling'van zwangerschapsafhankelijke mamma tumoren. Nagegaan wordt of dit gen ook een rol speelt bij het ontstaan van de hyperplastische knobbeltjes die de voorstadia zijn van de hormoonafhankelijke mammatumoren. IC1tv-3, eer.. locus op chromo-

soom Ll, werd gevonden in een partieelcongene GR iijn zonder het Mtv-2 locus aangeduid met GR/r-1tv-2-. Dit !-1tv-3 gen codeert voor een defectief HTV en speelt waarschijnlijk geen rol bij het ontstaan van de late mammatumoren in de lijn GR/ Mtv-2-. De werking van de M~v-2 en Mtv-3 genen wordt verder bekeken in muizen met verschillende genetische achtergronden. Hierbij wordt gebruik gemaakt van: . . . Oa een con gene 020 s~am waarin waarschijnlijk het Mtv-2 gen verantwoordelijk is voor het ontstaan van mammatumoreni eb twee partieel con gene lijnen BALB/c en D6 waarin het gen Mtv-3 wordt geïntroduceerd. De werking van Htv-2 en Mtv-3 zal zowel voor elk gen afzonderlijk als ook in combinatie nader worden onderzocht. De actie van deze genen zal verder ook' bestudeerd worden met behulp van een serie recombinant ingeteelde stammen tussen GR en een ingeteelde l-1us musculus molossinus stam, HOL3/ JA genaamd. Met behulp van deze serie stammen zal het ook mogelijk zijn die ~l'i'V-DNA kopieën in de GR stam, die niet tot expressie komen op de verschillende chromosomen te lokaliseren. Het l-1tv-2 gen blijkt· ook betrokken te zijn bij de thymus leukèmogenese in mannelijke GR muizen. De rol van Htv-3 in dit proces is nog niet vastgesteld.

VI.lb GENETICA VAN RESISTENTIE TEGEl< MM'lliATUHOREN RECOHBli.'1ANT INGETEELDE STAl-L.'\1EN

El~

LEUKEMIE

BES'i'U~EERD

ME'l'

J. Hilgers, J. Arends, G. Röpcke, J. Hilkens, R. Keesorn, Ph. Hageman en A. Verstraeten BALBjcByA x B6LByA serie Het ontstaan van mammaturnoren na toediening van exogeen MTV wordt ui tgezocht ,in de 7 RI sta:r;unen van

Bailey, in relatie tot de expressie van I·1TV in de melk (virale antigenen en infectieuziteit). Inmiddels zijn een aantal resultaten_behaald met 27

C3H-MTV die het noodzakelijk maken een serie Fl bastaarden tussÉm de RI stammen met intermediaire.gevoeligheid te testen. Deze experimenten worden in de loop van 1982 ingezet. Experimenten met. andere NTV's, zoals WLL":'MTV, DBA-MTV, BALB/c~aTV en RIII-UTV zijn minder duidelijk omdat het verschil in gevoeligheid van de BALB/CByA en B6/ByA stammen hiervoor minder groot is dan in het geval van C3H-MTV. . Zoals vermeld in VI.la zullen m.b.v. deze stammen kruisingen getest worden-met de C3H/HeAf s~am op expressie van MTV. antigenen om het Imv-gen te. lokaliseren. l'lellichtspeel t dit gen van de E6 ook een rol. bij de resistentie.tegen exogene 1'1TV' s . BALBjcHeA x STSjA serie Deze serie RI stammen wordt speciaal gemaakt om de resistentie. tegen mammatumorigenese met virus en hormonen genetisch verder te analyseren. Er zijn nu 15 stammen in de 16de en 17de inteelt generatie en het typeren voor genetische markers van deze RI serie is reeds gestart en zal in de loop van 1982 geïntensiveerd worden. Er zal begonnen worden met het

induceren van mamma tumoren met C3HMTV en door middel van hypofyse transplantaten. Deze strumaen zullen ook gepreserveerd worden door invriezen in het kader van project VI.6.

MOLj3JA x GRS/JL Een klein serie RI stammen is nu in de 10de generatie en een grotere serie in de 3de en 4degeneratie, omdat van deze eerste serie nogal wat stammen steriel bleken te worden omstreeks de 6de tot Sste generatie van inteelt ná de F2 generatie. Deze serie stammen zal gebruikt worden voor verder onderzoek naar de tumorigene actie van I>1tv-2en I1tv-3 en daarnaast zal het een ideale· combinatie.van stammen worden voor snel koppelingsonderzoek van een aantal genen zoals endogene virale sequenties van t·1TV en !·1tiLV, etc. AKRjFuRdA x 020jA Van deze serie is de 6de tot 7de generatie bereikt. Hij zal speciaal gebruikt worden om de multigene gevoeligheid van de AKR voor thymus leukemogenese verder te analyseren.

VI. 2a PRODUCTEN VAN HET H-2 Cm1PLEXi GENETISCHE EN BIOCHEMISCHE ANALYSE D. Iványi, P. Démant, W. v.d. 1'1eugheuvel De biochemische analyse van de MHC producten in ons laboratorium heeft aangetoond, in tegenstelling tot eerder gepubliceerde data van andere groepen, dat er een duidelijk verschiJ bestaat in het moleculair gewicht van H-2 antigenen (plm. 45.000 dalton) en Qa-2 antigenen (plm. 40.000 dalton). Een tot nu toe onbekend molecuul met het moleculair gewicht van 40.000 dalton werd ontdekt in sommige Qa-2 negatieve haplotypen. Omdat deze moleculen reageren met een aantal anti~H-2.2S sera, zijn ze serologisch verwant. ,4ij zullen het polymorfisme van deze moleculen onderzoeken en hun verwantschap bepalen met gebruik van peptide mapping.

In de voorafgaande periode werden de producten van de K en D regios in detail onderzocht en een aantal nieuwe H-2 moleculen ontdekt. In sommige haplotypen kunnen wij zes verschillende K en D producten aantonen. In het H-2 d haplotype vinden wij twee K regio moleculen (Kl, K2) en vier D regio moleculen (D, M, L, L2). De gegevens van de tests van mutante haplotypen suggereren, dat deze moleculen producten zijn van verschillende genen. In de komende periode will~n wij meer aandacht schenken aan de H-2 genen die nog niet geanalyseerd zijn, namelijk Kk en Db allelen, met gebruik van conventionele en monoclonale antilichamen, gedeeltelijk geproduceerd in ons laboratorium. De onderlinge relaties tussen de H-2, Qa en TL antigenen worden onderzocht, omdat wij onlangs hebben aangetoond dat sommige . anti-H-Z antiserareägeren -met Qa-2 moleculen.

28

VI.2b MHC ANTIGENEN IN NOru4ALE TUMOR CELLEN ~1.

Oudshoorn-Snoek, P. Démant

De regulatie van de expressie van sommige MHC producten is veranelerd in tumor cellen. Dit is duidelijk aangetoond voor TL en Qa-2 antigenen terwijl er ook aanwijzingen zijn dat dit het geval kan zijn met K, 0, en L antigenen. Hormoonafhankelijke veranderingen in de expressie van Ia antigenen zijn ook bekend. Het probleem met vele studies is het gebruik van transplanteerbare tmuor cellijnen 'met alle gevaren van ver~eerde identificatie, enz. Onze

studie wordt derhalve gedaan met primaire AKR thyrnomas, gebruikmakend van een uitgebre1de serie ,antisera en monoclonale antilichamen. De expressie van de producten van verschillende regios zal vergeleken worden met normale thymocyten en lymphkliercellen. Eventuele quant itat'ieve of qualitatieve verschillen worden verder gekarakteriseerd met meerdere immunologische en biochemische methoden.

VI.2c GENETISCH EN FUNCTIONEEL ONDERZOEK VAN H-2 GEKOPPELDE COMPLEMENT GENEN (KLASSE I~I PRODUCTENl M.H. Roos en P. Démant Het, onderzoek naar de genetische organisatie en structuur van de ~IC gekoppelde complement genen 'zal wor, den voortgezet. Bij de muis zal het door ons ontdekte sexuele, dimorfisme vanl factor B (BF), een H-2 gekoppelde factor van de alternatieve complement,weg, nader onderzocht worden; Ook zal het sex-limited protein (SIp, allotype van C4) bij de stam 020 (H-2PZ) nader bestudeerd worden. Het is gebleken dat he't niveau bij deze stam het hoogste is dat tot nu toe' gevonden is, 3x zo ,hoog a'ls de standaard stam BlO.A. Bij nadere genetische analyse bleek dat de achtergrond van de 020 stam een gr,o-; te invloed heeft op de hoogte van ' het SIp niveau en dat deze achtergrond ook een grote invloed heeft op het SIp niveau van het H-2 a haplotype, maar weer anders daIT bij het H-2pz haplotype. r4ede met de

congene stammen op 020 achtergrond zal. deze H-2 gekoppelde gevoeligheid voor de achtergrond nader bekeken worden. De componenten BF en SIp bieden dus een bijzonder goede mogelijkheid om de gen regulatie in het'H-2 gebied te bestuderen. De cross'reactie tussen muizen C4 en mensen C4 met antilichamen tegen deze beide componenten zal bestudeerd worden met de recent doo'r ons ontwikkelde blottings~ethode, een methode die veel gevoeliger is dan de tot nu toe gebruikte radiaire irnmunodiffusie of Ouchterlony methode. Wij hopen hiermee een beter inzicht te krijgen in de organisatie van de Complement genen en hopen op deze manier iets te \-,eten te komen over de samenhang van de complement genen met de andere H-2 qenen.

VI.2d,HISTOCOMPATIBILITEITSGENEN IN EUROPESE EN STANDAARD P. Dérnant, M.H. Roos,

w.

MUIZENST~~EN

v.d. r.1eugheuvel, 0,. Iványi en H. Oudshoorn-Snoek

HetI;1HC regio en de aangrenzende gebieden van het chromosoom 17 zijn bestudeerd in Europese stammen, omdat ,deze stammen een belangrijk model Ivormen voor de studies van tu29

mor resistentie, en omdat wij hebben aangetoond dat dez'e stammen zeer vaak andere MHC genen hebben dan de standaard Amerikaanse stammen. De nieuwe haplotypen, pz, bs, bp en dx, werden

geïdentificeerd en zijn nu uitvoerig geanalyseerd. Deze analyse heeft al een aantal nieuwe H-2 antigenen opgeleverd, een nieuw H-2 gekoppeld gen (rds) en de eerste bekende biochemïsche variant vÇl.n BF in de muis. Enkele nieuwe congene stammen en recombinante haplotypen zijn geprodu-

ceerd en naderen de voltooiïng. Deze stammen bieden nieuwe mogelijkheden_ voor de analyse van structurele (H-2, Ia, Qa antigenen) en functionele (tumor resistentie, hormoongevoeligheid) karakteristieken die tot nu toe niet toegankelijk gelrleest zijn voor genetische studies. _ _ _ _ _ __

VI.2e EXPRESSIE VAN Thy.l ANTIGENEN OP MuLVen VSV ENVELOP J. Calafat-en H. Janssen Zoals gerapporteerd in het Annual Report 1980 en 1981 (VI.2e) nemen RNA-virussen in het algemeen tijdens de budding geen glycoproteinen van de gastheer-celmembraan mee op hun envelop. Bovendien heeft Závàda (J-. gen. Virol. 15: 183-194, 1972) gevonden dat vesicular stomatitis virus (VSV) tijdens de budding gemakkelijk glycoproteinen van andere virussen in zijn envelop incorporeert en de zogenoemde pseudotypen "maakt. Gebaseerd op de volgende principes: virussen verwijderen tijdens de budding de glycoproteinen van de gastheer-celmembraan, maar -incorporeren wel glycoproteinen van andere soorten virus. Závàda et al. (Cold Spring-Harbor Symp. Quant. Biol. 39: 907-912, 1974) hebben VSV gebruikt on humane virus antigenen aan te tonen in humane tumor cellijnen. Het feit dat wij met monoclonale antistoffen tegen Thy.l gevonden hebben dat dit gastheer celmembraan glycoproteine aanwezig is op VSV en MuLV envelop verzwakt een van de bo. vengenoemde principes. Daarom willen

VI. 2f HISTOCOMPATIBILITEITSGENEN

wij de relatie tussen Thy.l en de virus envelop verder onderzoeken. ea Wij gaan met behulp van verschillende monoclonale antistoffen bestuderen of verschillende epi topen van Thy.l aanwezig zijn op de envelop van VSV en I-luLVi eb De aanwezigheid van Thy,1 op het virus envelop kan verklaard worden door de affiniteit van dit glycoproteine voor de virale glycoproteinen en indien deze affiniteit sterker is dan de krachten die de niet virale glycoproteinen van de plaats van budding verwijderen, dan kan dit bestudeerd worden met de VSV mutant ts45. Wanneer ts45 VSV geproduceerd wordt bij 39,5 0 C (nonpermissive teraperature) ,dan hebben de VSV deeltjes geen virale glycoproteinen op hun envelop." Als deze mutant ook negatief is voor Thy.l antigenen wijst dit er op dat bovengenoemde verklaring juist kan zijn.

EU RESISTENTIE TEGEN HA..'lfMATlJMOREN

A. Dux, G. Röpclce en P. Démant De MHC genen controleren de resistentie en gevoeligheid voor mamma tumoren geïnduceerd met exogeen MTV. Deze resistentie is virus-specifiek. Onlangs werd aangetoond dat ook de resistentie tegen hormonale inductie van mammatumoren onder MEC invloed staat. Het mechanisme van deze effecten is nog niet bekend. Door transplantatie van mammaklieren van gevoelige en van resistente stammen

in de Fl bastaarden en veryolgens met MTV infectie, willen wij onderzoeken, of de mechanismen van de resistentie systemische of weefsel (orgaan) specifieke werking hebben. Het polymorfisme van de resistentie tegen MTV en virus geïnduceerde mam~ matumoren zal onderzocht worden in een aantal voor dit doel geproduceerde stammen met recombinante haplotypen. Op deze manier zullen de ver~ 30

antwoordelijke r-lliC genen en hun onderlinge interacties, evenals hun

'interacties met non-r·lliC genen onderworden. ______________________---~ocht

VI.2g HISTOCOMPATIBILITEITSGENEN EN RESISTENTIE TEGEN LONGTUHOREN L.C.J.M. Oomen, P. Emmelot, M. van der Valk, P. Dérnant In ons Instituut werd aangetoond dat de H-2 genen invloed hebben op de incidentie, aantallen en groei van longtumoren. Dit effect is zichtbaar bij spontane tumoren evenals in carcinogeen behandelde dieren. De genetische studies tonen aan, dat verschillende MHC genen, in de K, I, en D regio betrokken kunnen zijn bij de resistentie. In de komende ueriode worden segregatie tèsts uitgevoerd om de koppeling met het MHC te bewijzen, en transplantati~proeven moeten aantonen of de resistentie '. verbonden is met veranderingen in

antigeniciteit van de tumoren, of in immune reactiviteit van de gastheren. De systemische vs. orgaan (weefsel) specifieke effecten van het M}IC worden ook onderzocht. Onderzocht zal worden of de MHC genen ook invloed hebben op andere t.umoren, bijvoorbeeld darmtumoren. Tests met een aantal andere congene stamrJ.en zullen dienen om te komen tot een nauwkeu~ige identificatie van de genetische factoren welke verantwoordelijk ~ijn voor de resistentie.

VI.2h HET Tl"t REGIO EN DE GENETISCHE CONTROLE VAN UORMALE EN MALIGNE DIFFERENTIATIE W. v.d. Meugheuvel en P. Démant Een aantal genen gekoppeld met het MHC hebben invloed op embryonale differentiatie en het gedrag van teratocarcinoma cellen. Dit project, dat gestart is in 1982, heeft als doel de genetische én functionele factoren, die verantwoordelijk zijn voor' deze phenomenen te karakteriseren. De verhouding tussen M}IC ge-

nen en de T/t genen zal onderzocht worden met behulp van immunologische en biochemische karakterisatie van hun producten. Verschillende muizens~ammen en teratocarcinoma cellijnen werden ingevoerd voor dit project en hun ~lliC en T/t genen worden gekarakteriseerd. I

VI.3 SOMATISCHE CELGENETICA, DIFFEREnTIATIE EU MO:NOCLONALE ANTILICHAAM PRODUCTIE VI.3a SOMATISCHE CELGENETICA VAN HET MUIZEGENOOI"1 J. Hilkens, A. Bakker, F. Buijs, J. Hilgérs, V. Kroezen, D. Schol, A. Sonnenberg en J .~I. van de Rijn. i latief gemakkelijk, omdat we nu besÓhikken over een goed gekarakteriseerd panel van clones voor dit doel. Dr. ~1eehra Kahn van' de Rij ksuni versiteit Leiden werkt in deze met ons ., samen. Behalve isoenzymen blijken ook somm~ge monoclonale antilichamen ge-

Er zal gezocht worden naar nieuwe markers voor de drie muizechromosomen 3, 13 en 15 waarvoor nog geen geschikte markers bekend zijn. Daarnaast zal getracht worden om het marker panel nog verder uit te breiden met nog niet gelokaliseerde markers. Dit kan waarschijnlijk re31

richt tegen antigenen zowel op het celoppervlak als in het ·oytGplasma zeer gêschikt als chromosoommarkers. ~iervoor komt het Pgp-1 antigeen op chromosoom 2 van de muis in aanmer.king. Een aantal andere antigenen, detecteerbaar met monoclonal.e anti-

VI.3b

lichamen, kunnen ook gelokaliseerd wEJrden met hetzelfde clone panel. Hiervoor heeft Dr. Th. August (John Hopkins University, Baltimore) ons een aantal mogelijk geschikte monoclonale antilichamen ter beschikking ge~teld.

LOKALISATIE VAN GENEN VOOR RECEPTOREN VAN HuLVen MTV

De lokalisatie van een recentor voor wrv (het C3H-MTV) is zo goed als afgerond. Een aantal experimenten moet nog worden afgewerkt in samenwerking met Dr. B. van der Zeijst (Rijksuniversiteit Utrecht). Hierna moet worden nagegaan of pseudotypes van andere mamma tumor virussen ook afhankelijk zijn van de aanwezigheid van hetzelfde muizechromosoom (16) voor succesvolle infectie. Verschillen die gevonden zijn voor de in vi'IIo infectie van Hri'V in de recombinant ingeteelde stammen kunnen zijn ontstaan ten gevolge van de receptor verschillen tussen· deze· stammen. ~ve zullen de in vivo en in vitro experimenten proberen tecorreleren. Infectieproeven met de verschillende .recombinant leukemie virussen zullen

worden voortgezet. Het is reeds duidelijk dat de recombinant vir~ssen een andere receptor gebruiken dan de amphotrope viru·ssen, en dat die op hun beurt weer een andere gebruiken als de ecotrope I·luLV' s. De vraag is nu~oTderecombïnant vIrussen, die vaak tumoren geven in verschille~de organen en geïsoleerd zijn uit verschillende muizenstammen en celtypen ook verschillende receptoren gebruiken. Hiervoor wordt gebruik gemaakt van het in VI.3a genoemde clone panel. Dit alles gebeurt in samenwerking met Dr. C. n.lelief en ·Drs. M. Zijlstra (Centraal Laboratorium van de Bloedt:i::ansfusiedienst) en Dr. U. Rapp (NIH, Frederick, USA)

VI. 3c DE LOKALISATIE VAN ENDOGENE HTV' s EN MuLV' s EN DE GENEN DIE DE EXPRESSIE HIERVAI~ CONTROLEREN De expressie van MTV in de somatische celhybriden zal verder bestudeerd worden. Er zal geprobeerd worden uit te zoeken of de regulatie van de expressie op DNA niveau plaats vindt b.v. door methylering van het provirale HTV. Ook za,l 9-e 14TV expressie bestudeerd worden in intralineage hybriden van muizemammaklier en muizemammatumor cellen. Er zal nagegaan worden m.b.v. monoclonale antilichamen welk type MTV in de EMT hybriden wordt geïnduceerd met dexamethasone. Eventueel kan geprobeerd worden de induceerbare MTV sequenties te lokaliseren, maar dit

lijkt moeilijk, omdat in veel gevallen maar een laag percentage cellen per clone induceerbaar is. Wat. betreft MuLV zullen we m.b.v. monoclonale antilichamen proberen vast te stellen of het GRSL-MuLV hetzelfde is als het EGR~MuLV en .of de hoge en lage 14uLV expressie hetzelfde reactiepatroon geeft met mo- .noclonale antilichamen tegen MuLV. Bovendien zal gepoogd· worden zowel het structurele gen als het regulatie gen voor MuLV expressie· te lokaliseren.

VI. 3d EXPRESSIE 'EN GENETICA VAN THYI1USCEL DIFFERENTIATIE HARKERS heeftJ.H. van de Rijn een serie

. In het. kader van een FuNGO project 32

monoclonale antilichamen geproduceerd tegen celmembraan antigenen van humane thymuscellen. l-1onoclonaal 66-IGIO bleek gericht te zijn tegen de transferrine receptor (OKT9). De ditributie van dit antigeen in normale en tumor weefsels werd bestudeerd in samenwerking met Dr. S. Poppema (Rijksuniversiteit Groningen) en Dr. T. Vroom-Feltkamp (Slotervaart Ziekenhuis). Dit onder zoele zal in de loop van 1982 gedeeltelijk worden afgerond met een manuscript. In samenwerking met Dr. A. GeurtsvanKessel (Erasmus Universiteit, Rotterdam) werd de regionale lolealisatie van het gen van de transferrine receptor uitgevoerd. Het gen blijkt te liggen op de q-arm van chromosoom 3 van de r.tens. Het gen voor. expressie van een antigeen (47Hl) op een glycoproteine van 130 kD werd, ook regionaal gelokaliseerd en wel op de p-arm van chromosoom 3. Het antigeen heeft, net als de transferrine receptor, brede weefsel distributie. Vier antilichamen producerende clon~s bleken OKT6-achtige monoclonalen te produceren (66-IVC8, 66-II C7, 66-IIB8 en 66-IIIE5). Het gen voor de expressie van het T6 antigeen (Tla locus in de muis) zal gelokaliseerd worden m.b.v. somatische celhybriden die geen T6 tot expressie brengen en wel door het isoleren van h~t gen via precipitatie van de

messenger, omgekeerde transcriptie van het RNA en clonering van het DNA in een plasmide, gevolgd 'door productie van een radioactieve probe Vroor studies van DNA preparaten van Eiomatische celhybriden die menselijke chromosomen segregeren. Een en ander wordt uitgevoerd door J .l·l. van de Rijn in het Sidney Farber Cancer Center (Harvard University, Boston) dnder leiding van Dr. C. Terhors·t. Een monoclonaal bleek gericht tegen een antigeen van 40 kD (66-IIG5) waarover.nog zeer weinig bekend is en waaraan een publikatie gewijd z;al worden. Van een aan·tal mono~lonalen is het antigeen nog niet nader onderzocht of nog niet bekend uit de literatuur (66-IIIFS, 66-IIC9) pe antigenen zullen gekarakteriseerd worden en hun weefseldistributie bes:tudeerd. !4onoclonaal 47F6 en 47C6 bleken tegen een 45 kD molecuul gericht te zijn met brede weefseldistributie. Er zal systematisch onderzocht worden wat de distributie van al deze antigenen is op verschillende tumoren van lyr.tphoide cellen. Wellicht zullende monoclonalen tegen T6 in de toekomst gebruikt worden voor lokalisatie in vivo van tumoren van de thymus cel en misscpien ook voor immunotherapeutische doeleinden in het kader van een Kv~ project voor dit soort onderzoekingen.

VI. 3e DIFFERENTIATIE HARKERS VOOR l<-IELKKLIEREN EN MAl·1J.\:lATUHOREU De proQuctie van monoclonale antilichamen tegen humane melkvet membranen is gecontinueerd. Er zijn nu drie fusies gedaan waaruit met succes een serie antilichamen gemaakt werden, nl. fusie nr. 40, 67 én 115. Dit leverde stabiele lijnen en tumoren op in ongeveer 20 gevallen. De serie antigenen die aangetoond wordt heet Ham-·l, - 2, -3 etc. l-lam- 5 bleek lactoferrine te zijn; van de andere antigenen is wel het molecuulgewicht soms bekend, maar niet de functie van dit molecuul. Waarschijnlijk zijn een aantal moleculen aantoonbaar, met. deze antilichamen, nog niet: eerder beschreven. ' Mam-3 is een zeer belangrijk antigeen,voor klassificatie van mammatumoren, hetgeen mogelijk is m.b.v.

de immunoperoxidase test op formaline-gefixeerde, paraffine ingebedde tumoren. Ongeveer de helft van alle menselijke mammatumoren is positief. In samenwerking met Dr. Ph. Hageman (Sectie X), Stichting Samenwerkende Delftse Ziekenhuizen (Dr. Lindeman en Dr. Meijer), en. de Deense Breast C~ncer Registry (Dr. Rasmussen en Dr. Thorpe) wordt nagegaan wat positiviteit voor Ham-3 betekent in termen van prognose en diagnose. Hammatumoren van lagere differentiatiegraad blijken een lagere frequentie van positiviteit te hebben en dit zou wijzen op een betere prognose als Mam-3 aanwezig is. De laatste serie van monoclonalen, f~sie nr. 115, leverde o.a. antilichamen op die wellicht reageren , 33

met hetzelfde molecuul als het a~G molecuul waartegen Dr.Taylor-Papadimitriou monoclonalen h:eef-t- gemaakt (deze worden reeds gebruikt bij in Vivo lokalisatie proeven in patienten, na labeling met radioactief jodium, in GUy's Hospital) . Behalve uitgebreide distributiè studies, o.a. met de nieuwe serie, zal begonnen worden met het zuiveren van moleculenzoal~dat aantoonbaar met IJJam-3. Wellicht kunnen RIA' s ontwikkeld worden voor dit soort antigenen in de circulatie van mamrnatumor patienten. Inmiddels is een monoclonaal verkregen van Dr. Lennox (Cambridge) dat reageert met CEA en dat ook bruikbaar is voor klassificatie van mamrnatumoren. In samenwerking met Dr. Nooyen (Klinische Chemie) en Drs. Arends en Ir. K. Verstijnen (Rijksuniversiteit Limburg) zullen CEA bepalingen opgezet worden op basis van dit monoclonaal. Overigens zijn veel monoclonalen gema'akt tegen HMFG membranen die ook bruikbaar zijn voor de ,klassificatie van andere tumoren dan die welke uitgaan van de melkklier, b.v. colon carcinomen en longcarcinomen. 'Er is samenwerking met verschillende clinici, zoals Dr. McVie en Dr. Pinedo

op het gebied van de klassificering, terwijl ook een groep uit Leiden interesse heeft (Dr. Osanto). De distributie studies zijn noodzakelijk om te komen tot een selectie van de meest bruikbare monoclonalen voor in vivo lokalisatie en theraoie onderzoek. Voor dit laatste type ~ onderzoek is nu een project van het K~VF beschikbaar, dat zich echter vooralsnog concentreert op modelwerk in proefdieren. Dit neemt niet weg dat er reeds vergevorderde plannen bestaan voor het injiceren van gezuiverde antilichamen gelabeld met 131J (zie ook proj ect VI. 3d) ... Wat betreft de genetica van de expressie van deze antigenen zal'gepoogd worden somatische celhybriden te genereren met humane melkklieren mamrnatumorcellen, speciaal interlineage hybriden met muizenmelkklieren, tumorcellen. Een en"'ander wordt uitgevoerd mede in het kader van een project in het Scripps Instituut (Dr. T. Edgington, Dr. J. Hilgers en Ir. J. Hilkens).

VI.3f MONOCLONALE ANTILICH.fu\ffiN- TEGEU HUMAAN ZURE a-GLUCOSIDASE kunnen worden gedetecteerd. Voor deZE! doeleinden worden blockingtests opgezet. Nu gebleken is dat tenminste 3 epitopen aanwezig zijn op het enzym, zullen uiterst gevoelige sandwich assays worden opgezet voor detectie van het enzym op immunologische basis.

In samenwerking met Prof.dr. J.' Tager (Universiteit van Amsterdam) is door onze groep een aantal monoclonale antilichamen gemaakt, tegen zure a-glucosidase. Het ,behulp van ,deze antisera zal het molecuul verder gekarakteriseerd vlorden. Allereerst zal getracht worden vast te stellen hoeveel epitopen er op deze wijze

VI.4 PATHOLOGIE VAN TUMOREN BIJ PROEFDIEREN 'M.A. van der Valk, J. de Moes, E. van Muylwijk" -L. Kuyper

R. van Nie, L. Rijswijk,

met eerder en elders verkregen resultaten. Op, het begrip "tumor incidentie", gerelateerd aan een bepaalde stam en de afhankelijkheid hiervan van de Îactor "tijd" zal dieper worden ingegaan middels een onderzoek m.b.t. de groeisnelheid van

Van de in de afgelopen jarèn verzamelde gegevens m.b.t. de overleving, tumor in'cidentie en tumor typen, alsmede de overige pathologie van een tiental muizenstamrnen zal de uitwerking plaatsvinden en, zo daar aanleiding toe bestaat, worden vergeleken 34

In het kader van het S-jarenplan van sectie X.16.S zal gepoogd worden enkele typen mamma tumoren van de hond te transplanteren in "nude"-muizen teneinde differentiatie vari deze tumoren te kunnen bestuderen. Hierbij zullen vooral conventionele histologische/morfologische technieken worden gebruikt, aangevuld, waar nuttig, met immuunhistologische en histochemische technieken (lectinen) - zie werkplan X.16.S Morfologische en biologischeaspecten van 10 verschillende transplantabele hypofyse tumoren worden bestudeerd in de muis. Zeven tumoren zijn nu in de 2e transplantatie generatie en 3 tumoren in de 3e transplantatie generatie. Primair zijn deze tumoren ontstaan door transplantatie van hypofysen afkomstig van STS/A muizen ~nder het nierkapsel van vrouwelijke (STS xBALB/c}F1 hybride muizen. De morfologie van een aantal reticulum-cel-turüoren (nomenclatuur Th. Dunn) afkomstig van onbehandelde BALB/c muizen wordt nader bekeken. Nagegaan wordt of syngene transplantatie van het vergrote orgaan (meestal milt) een bijdrage kan leveren bij' het morfologisch onderzoek.

chemisch (transplacentair) geïnduceerde longtumoren in,enkele H-2 congene stammen. Dit onderzoek geschiedt in samenwerking met Drs. L. C. J. ];1. Oomen (zie werkplannen sectie VI.2) en wordt uitgevoerd met behulp van in C3H- l nude" muizen getransplanteerde primaire longtumoren met elk een sterk verschillende omvang en identieke "leef"-tijd. Het in 1980 opgezette werk aan de embryonale, neonatale en adulte dif~ ferentiatie en tumorvorming van een klein aantal organen/orgaansystemen wordt voortgezet en nu reeds toegespitst op de man~a van rat, mens, hond, kat en vooral de muis. Doel hierbij is de nadere uitwerking van enkele hypothesen betreffende de mamma als orgaan met vele hyperplastische en neoplastische variaties vaak min of meer diersoort-specifiek - te toetsen. Een eerste aanzet hiertoe is reeds gegeven in de productie van een uitgebreide serie GRS/A transplantatie mammatumoren waarbij vooral de invloed op het histologisch beeld door hormonale en geslachtsgenetische factoren alsmede de transformatie tot anaplastische en sarcomatoïde groeivorm zullen worden bestudeerd. Ook het metastaserend vermogen van deze tumoren in een semi-"in vivo" situatie zal in deze opzet worden betrokken.

VI.S GENETISCHE KARAKTERISERING VAN PROEFDIEREN J. Hilgers, J. Hilkens, V. Kroezen en R. Keesom :

Het genetisch typeren van de ingeteelde muizenstammen wordt voortgezet. Hierbij wordt vooral aandacht besteed aan genetische verschillen tussen de 3 combinaties van stammen die gebruikt worden voor de ontwikkeling van recombinant ingeteelde stammen, te weten BALB/cHeA en STS/A: r·10L3/JA en GRS/M 020/A en AKR/FuRdA. Wat ,betreft de isoenzymen zal speciaal gezocht worden naar polymorfisme voor amylase. In het serum is reeds een· polymorf.isme gevonden van een Amy locus, maar er is nog niet bekend met welke loci, waarbij amylase bekeken werd in speekselklieren en pancreas, dit overeenkomt. Er zal nagegaan worden of AKp en Sep-1 zelf bepaald kunnen worden en wellicht Sas-1 marker ook hier opgezet 35

zou kunnen worden. Inmiddels zijn er een aantal monoclonale antilichamen voor verschillende allelen van Lyt en Lyb antigenen en andere celmembraan markers. Onze stammen' zijn destijds getest voor Ly-1, Ly-2, Ly-3 en Ly-S door de groep van Dr. E. Boyse in SloanKettering (New York, USA), maar ze zukken gedeeltelijk opnieuw getest. worden m.b.v. monoclonale antilichamen verkregen van elders. Er zijn op dit moment reagentia tegen Lyt-1.1, Lyt-1.2, Lyt-2.1, Lyt-2.2, Lyb-2.1, Lyb-2.3, Ly-S.1 en Ly-S.2 (Ly-S is aanwezig op het zogenaamde T200 molecuul). Waarschijnlijk kunnen ook antilichamen tegen Pgp-1 a en Pgp-1 b verkregen worden. Het testen van onze stammen zal gebeuren met

serologische technieken in samènwerking met de groep van Dr. P. Démant (Project VI.2). De samenwerking met de verschillende buitenlandse groepen wordt gedeeltelijk voortgezet. Dr. O. von Deimling in Freiburg (West-Duitsland) zal het typeren voor de nieuwe esterase lbci continueren (voorlopig Es-9, Es-Il, ES-14, "Es-16, ES-17, Es-IS, Es-20, Es-24). Hij zal ook gaan typeren voor de zogenaamde esterproteases (Prt-4 en Prt-5). Dr. vandeBerg (San Antonio, USA) zal vooral de varianten in het alpha-mannosidase bestudere-n en de rol van Hap-'-2 (=Neu-l) hierbij uitzoeken. Dit gebeurt sneciaal met de GRS/A, GR-r-1tv-2- /A,020/A en CBA/BrA stammen. Dr. R. Holrnes (Griffith Universiteit, Brisbane, Australië) zal het Sdh-l c type van de C57BL/LiA stam bestuderen. Dr. L. Lundin (Uppsala, Sweden) zal helpen met de bepaling van de Bgl-5, Gus-l en Taw-l loci.

"Nieuwe samenwerkingsverbanden zlJn inIliiddels opgezet met verschillende andere buitenlandse groepen, en een groot aantal nieuwe markers worden momenteel getest voor het merendeel" van de stammen in het NKI. Er zal een begin gemaakt worden met het isoleren van DNA en het testen van de verschillende stammen voor MTV en MuLV sequenties die kunnen dienen als genetische markers. Een begin zal gemaakt worden met het karakteriseren van de stammen die voor de recombinant ingeteelde series worden gebruikt. Een en ander zal gebeuren in overleg met de moleculair biologen (zie Project V.l).

VI.6 PROEFDIERKUNDE R.J. Nikkels, W.F. de Jong, U. Peter, J. Arends, J. Hilgers, G. Röpcke, P. Handgraaf, M. van den Bersselaar, B. de Graaf, E. van Gelderop, - C. Spaans, R. Beurs-én F. Klein waterbuizen en invoering van een continue doorstroming met behulp van een pomp en filtratie van het teruggevoerde water zal getracht worden het systeem te verbeteren. Een bijkomend voordeel van het bacteriefilter in de retourleiding is dat aan zuren of chloreren niet meer nodig zal zijn. De laatste moeilijkheden met de mammoet-isolatoren worden verholpen. In de eerste helft van 1982 zullen alle vier de mammoet-isolatoren in gebruik worden. genomen.

Preservering van muizen- en rattenstammen door invriezen van bevruchte eicellen De procedure van het invriezen is ver gevorderd. Veel aandacht zal nu gegeven worden aan het onder controle krijgen van de techniek van het implanteren van in diepgevroren s·taat bewaarde eicellen in uteri van pleegmoedermuizen. Verbetering van de p'roductie van naakte muizen Om de opbrengst van naakte dieren per worp te verhogen zal de techniek toegepast moeten worden van fokken met homozygote (naakte) mannelijke muizen, die door implantatie van thymusweefsel van heterozygote nestgenoten, meer fertiel worden. Verbetering van het automatisch drinkwatersysteem van muizen- en rattenstellingen Het drinkwatersysteem geeft nog te vaak aanleiding tot sterfte van dieren: door verstopping of lekkage van de nippels. Door wijziging van de drink36

Planning-Eroefdiergebruik De in 1981 gestarte planning. van de voor experimenten benodigde proefdieren zal verder worden verbeterd en de aanpassing van de fok aan de behoefte zal scherper .worden afgestemd. De aantallen onbenutte proefdieren zullen hierdoor verder afnemen en daardoor tevens de relatieve exploitatiekosten van de afdeling proefdieren.

Verbeter·ing kooien wasser~J Door technische aanpassingen van de tunnel wasmachine en organisatorische wijzigingen zullen verbeteringen

·37

worden verkregen in de wasafdeling waardoor enige mankracht vrij zal komen.

38

Sektie VII. HORMONALE FACTOREN BIJ HET ONTSTAAN EN DE GROEI VAN TUMOREN

-------------------------------------------------

VII.l DE INVLOED VAN PROLACTINE EN STEROID GROEI VAN MAJ.'IMATUMOREN BIJ MUIS EN RAT

HOR~ONEN

OP HET

ONTSTAP~

EN DE

A.A. ,van der Gugten, H.G. Kwa, G. Röpcke, A.A. Verstraeten, P. van Balen, E.M. Groeneveld, T.~L Luub, F. Verhofstad. ec Onderzoek aan structurele varianten van prolactine in muis en rat. Het door de hypofyse geproduceerde prolactine is heterogeen. Het bestaat uit e~n aantal varianten met verschillende biologische en immunologische eigenschappen, terwijl ook de release patronen in vitro verschillend zijn. De fysiologische betekenis is onbekend. Getracht zal worden de varianten te isoleren en te karakteriseren voor wat betreft: (1) hun biologisch effect in vitro en in vivo; (2) de fysiologische relatie met het optreden van mamma tumoren; (3) de interactie met membraan-gebonden lactogeen receptoren (zie VII.lb); (4) de volgreactie na de hormoon-receptor interactie.

ea De interact:i..e tussen het ~ltv-2 locus en de hormoongevoeligheid van de muizemamma. De experimenten zullen ~orden voortgezet zoals staat aangegeven in de werkplannen 1982. Inmiddels worden ook de steroid hormonen progesteron, oestron en oestradiol radio immunologisch bepaald. Daar er ged~rende de eerste zwangerschap tussen de GR-stam en de GRMtv-2- stam verschillen in hormoonspiegels en grootte van de melkklier zijn gevonden, die mogelijk wijzen op een interactie van het GR mammatumorvirus en hormonen, zullen ook de stammen 020 en 020-atv-2+ op deze verschillen worden onderzocht. eb De rol van de prolactine receptor in de hormonale carcinogenese _ van de rattemamma. De prolactine receptor bepaling is gebaseerd op de gelijkheid van affiniteit van 125 1gelabeld en ongelabeld hormoon voor receptor. De affiniteit van het gelabeld hormoon neemt evem'lel af 0 J.. • v. twee onafhankelijk van elkaar optredende processen, m.n. chemische beschadiging tijdens de joderin~spro­ cedure en beschadiging door y-straling van het ingebouwde 125 1. Hoewel intra-assay variaties bijzonder klein zijn, worden om bovengenoemde redenen de inter-assay variaties dusdanig, dat zij onderling vergelijk 'van experimentele groepen be-' moeilijken. Getracht zal worden, in kortdurende kweek, rattehypofyses uit 3H-gelabelde aminozuren intern gelabeld prolactine te laten produceren, en d~t te zuiveren. Hierdoor kunnen eerder genoemde beschadigingen wor-den vermeden.

.d Monoclonale antisera tegen prolactine (varianten). Deze zullen worden ontwikkeld teneinde (1) 'varianten van prolactine'in plasma te kunnen aantonen; (2) eventuele blokkade van hormoon-receptor binding te kunnen bestuderen; (3) de invloed, na inspuiting in vivo, op de werking van te onderscheiden varianten van prolactine te kunnen nagaan.

39

VII.2 ONDERZOEK NAAR DE BIJDRAGE VAN PROLACTINE·AAN HET ONTSTAAN EN DE GROEI VAN BORSTKANKER BIJ DEM~N§ ~}:l;-C;.

Kwa~ .. ~~A.:...Verstraeten,

E.M. Groeneveld, A.M.A. Sanders, F. Verhofstad

Het onderzoek wordt voqrtgezet zo. als aangegeven in vorige werl5:plannen. Inmiddels was het aantal gevallen van borstkanker in het Guernsey materiaal groot genoeg voor een eerste retrospectieve analyse (zie Annual Report .1981). Dezeanalyse laat zich als volgt samenvat-· ten: plasma prolactine spiegels van pre~menopausale pre-kanker gevallen zijn random verdeeld rond het gemiddelde van de controles; er is echter wel een positieve correlatie met de leeftijd. Peri-menopausale prolactine spiegels van pre-kanker geva~len daarentegen· vertonen een grote variabiliteit en zijn niet random verdeeld rond het gemiddelde van de controles; dit zou kunnen wijzen op een ander reguleringsmechanisme tussen deze groep en hun controles. Post-menopausale. ··prolactine spiegels van pre-kanker gevallen zijn wel duidelijk verhoogd met gemiddel.den boven het 72-e percentile.

Hoewel het aantal pre-menopausale gevallen 22 pre-kanker gevallen bevat is dit niet genoeg om significante conclusies te trekken. De bevindingen bij de acht peri-menopaus ale pre-kanker gevallen suggereren dat het verschil in het prolactine-reguleringsmechanisme aan het licht treedt doordat in de perimenopausale periode een adaptatie plaatsvindt van het proces aan de verandering van de· hormoonspieg.els. Er zal worden nagegaan of het groeihormoon (HGH) hierbij betrokken is. Ook zal de mitogene werking van de 20K structurele variant van HGH getoetst worden in muizemamma's in kortdurende kweek (zie VII. Lc) . Verder z~l de medewerking aan het longitudinaal onderzoek naar ritmes van verschillende hormoonspiegels waaronder prolactine - (KWF project 80-1 en werkplannen VII.S) worden . voortgezet.

VII. 3 ONDERZOEK VAN STEROIDHORMOON RECEPTOREN IN RELATIE MET HET ONTSTAAN EN DE GROEI VAN MAMr-ffiTUMOREN . M. sluy'ser, C.C.J. de Goeij, S.G. Evers oa In samenwerking met de kliniek zál het GR mamma tumor testsysteem gebruikt worden om de therapeutische waarde van nieuwe geneesmiddelen te onderzoeken. Hun effect op hormoon-afhankelijke en -onafhankelijke tumoren zal worden vergeleken. Óok diverse manieren van behandeling (bijv. continu vs. onderbroke~ zullen worden vergeleken. ob De relatieve gevoeligheid voor hormonen van mammáklieren afkomstig van verschillende muizestammen zullen worden vergeleken. De methode die gevolgd wordt is een kweek van melkklierweefsel in de aanwezigheid van verschillende hormooncombinaties; op dag 2 en dag 3 van de kweek wordt dan. de DNA synthese gemeten. De resultaten tot dusver suggereren dat bij muizestammen met e~n~~e gevoeligheid voor borst-

kanker, de melkklieren wat DNA synthese betreft beter reageren op bepaalde hormonen of tumorpromotoren. Onderzocht zal worden of dit een algemeen verschijnsel is, en of dit testsysteem dus een methode is om de gevoeligheid van mammaweefsel voor tumorvorming te bepalen. Het bovengenoemde systeem zal tevens worden toegepast om de expressie van diVerse provirale .genen van het muize mammatumorvirus (MMTV) te bestuderen.

.c Uit eerder onderzoek is gebleken dat mammatumoren bestaan uit diverse celpopulaties met een veFschillend~ gehalte aan hormoonreceptoren, een verschillende gevoeligheid voor chemotherapie, etc. Een onderzoek zal worden ingesteld naar eventuele markers om deze verschillende celtypen te onderscheiden. In samen-

_d Isolatie van glucocorticoid receptoren uit muizelever. Enkele voorstudies zijn reeds verricht waaruit bleek dat labelen met triamcinolon beter gaat dan met dexamethason omdat eerstgenoemd ligand langer aan de receptor blijft zitten tijdens de isolatie. Bezien zal worden of preparatieve iso-electrofocussing een sn-elle isolatie oplevert. Tegen de receptor preparaten zullen antisera (zowel normale als monoclonale) bereid worden.

werking met dr. A. Kaye van het Weizmann Instituut (Israel) zullen creatine kin~se isozymen worden bepaald in de dellen; voorlopige resultaten sug~ereren dat bepaalde isoenzymen verhoogd zijn in de'hormoon-onafhankelijke tumorcelpopulaties. Met dr. R. Ceriani (Oakland, California) worden in de tumoren ConA receptorgehaltes bepaald m.b.v. antisera. De scheiding van de diverse celtypen zal· verder worden uitgewerkt. Voor de fractioneripg zal gebruik worden gemaakt van centrifugatie bij laag toe~ental (in samenwerking met A. _Tulp), en van de cell sorter (FACS) •

VII.4 MODELONDERZOEK OVER COMBINEREN VAN HORMONALE EN CYTOSTATISCHE BEHANDELING VAN ~ll1ATUMOREN A. Timmermans, C. Benckhuijsen Ovarlectomie en toediening van aniline mosterd aan ratten van de 'SD-stam met hormoongevoelige mammatumoren, gelnduceerd met 10 mg DMBA gaf een complete remissie van 62.5% in geovariectomeerde dieren en een complete remissie van 90% na ovariectomie plus aniline mosterd in een 5daagse kuur, van dag 3 tlm dag 7. Aniline mosterd in hetzelfde schema aan intacte dieren toegediend, gaf 10% complete remissies. Het therapeutisch resultaat van de combinatiebehandeling was beter dan eerder verkregen was met een wekelijkse behandeling met aniline mosterd na ovariectomie (72% complete remissies). In een aansluitend experiment worden de effecten van aniline mosterd en melfalan vergeleken, beide middelen vanaf de 3e dag na ovariectomie in een 5-daagse kuur gegeven. De kuur wordt na 10 dagen rust gevolgd door een dosis eens per week gedurende 6 weken. Uit voorlopige gegevens blijkt dat ovariectomie een remissie van 62.5% geeft, aniline mosterd 5%, melfalan 11%. Daarentegen geeft de behandeling door ovariectomie met respectievelijk aniline mosterd en melfalan 86% en 94% complete remissies. Het opvallend gunstige effect van een melfalankuur kort na ovari~ ectomie zal verder worden onderzocht. Er zal ter bevestiging een experiment worden ged'aan met hormoon-ge41

voelige mammatumoren geïnduceerd met methylnitrosoureum, om een kuur melfalan na ovariectomie- te vergelijken met een kuur aniline moste-:i:"d. Daarnaast zal i~ 1 experiment het optimale wekelijkse doseringsschema voor melfalan, 6 weken toegediend, vergeleken worden met een optimale 5daagse kuur melfalan plus aansluitend gedurende 4 weken 1 dosis per week~

Uit literatuurgegevens blijkt dat na toediening van medroxy-progesteron acetaat (MPA) aan ratten hypersecretie optreedt in de melkklier. Hormöongevoelige tumoren kunnen beelden van melksecretie vertonen. Beschreven is dat daarbij het glucuronidase gehalte van de tumoren toeneemt. Het ligt in de bedoeling te onderzoeken of MPA een geschikte hormonale behandeling is voor gecombineerde be~ handeling met aniline mosterd dan wel melfalan. Het lijkt dat na toediening van 7.5 mg DMBA een breder scala tumoren ontstaat van zeer hormoon-gevoelige tot vrijwel -ongevoelige mammatumoren dan na 10 mg. Er zal worden vergeleken of de toegepaste dosis DMBA invloed heeft op de mate van hormoongevoeligheid van de mammatumoren die geïnduceerd worden. Indien een lagere dosis minder sterke hormoongevoe-

ligheid zou veroorzaken,. zal deze toegepast om de ~~~~t~qhe "

situatie zoveel mogelijk te benadé-

~orden

VII.5 HORMONALE RISICOFACTOREN EN

ren.,~----------------------------------

MÀ~CARCINOOM

P. F. Bruningi H. Bonfrer, H~G ..Kwa, A.A.M:' Ha,J:t, M. de Jong.,.,Bakker, W. Nooyen Het doel van het project is de bestudering van hormonale factoren die verband houden met mammacarcinoom, met speciale aandacht voor de rol van afwijkingen in het diurnale ritme van de prolactine plasmaconcentratie bij vrouwen "at risk". Meer specifiek betekent dit: .verder longitudinaal onderzoek van diurnale plasma prolactine patronen bij premenopausale vrouwen met een bekend verhoogd risico voor het krijgen van mammacarcinoom, in vergelijking tot normale "matched controls" en vrouwen behandeld voor mammacarcinoom of benign'e proliferatieve lesies als middel om te komen tot selectie voor verdere 'screening van vrouwen "at risk". . -onderzoek van de plasmaconcentratie patronen van progesteron en oestrogenen (totale en "available" fracties), i.v.m. hun potentiële relatie ~ot prolactine spiegels en van cortisol i.v.m. de belangrijke invloed van "stress" op plasma prolactine. -de resultaten van dit onderzoek kunnen de basis vormen voor een prospectief onderzoek waar vrouwen "at risk" profylactisch worden behandeld met medicamenten, die onvoldoende corpus luteumfunctie ondervangen of subtiele diurnale prolactine-afwijkingen tegengaan. Het belangrijkste ,doel van het onderzoek is de bevestiging en uitbreiding, 'van Kwa's gegevens over de "vroege

avondpiek" van het plasma prolactine (gevonden bij vrouwen:'a,t risk" in een "cross-sectional" onderzoek op Guernsey) bij de volgende groepen premenopausale vrouwen gedurenae de luteale fase van de mens'truele cyclus. (1) Vrouwen "at risk" vanwege hun familiaire belasting (n=20) i om reproduceerbaarheid en mogelijke seizoensinvloed beter te leren kennen wordt het onderzoek bij' deze groep binnen 6-9 maanden herhaald. (2) Normale controles gematched met groep 1 (n=20) (3) Vrouwen met histologisch bewezen benigne proliferatievemamma afwij'kingen (n=20) (4) Vrouwen minstens 6 maanden tevoren curatief behandeld voor mamma- , carcinoom TINOMO. In 1983 zal het onderzoek naar de diurnale variatie van de plasma prolactine concentratie d.m.v. continue veneuz'e bloedafname worden voortgezet. Tegelijkertijd worden gegevens verzameld over het concentratie x tijd product van diverse andere (steroid) hormonen. Het onderzoek zal naar verwachting medio '84 na 4 jaar kunnen worden afgesloten.

------------------------------------------------

42

Sektie VIII.

EXPERIMENTELE CHlli40THERAPIE EN RADIOTHERAPIE

VIII.2 LYSOSOMALE ENZYMEN IN CARCINOGEEN-GEïNDUCEERDE MAMMATUMOREN VAN DE RAT EN DE MOGELIJKE BESCHIKBAARHEID VAN DEZE ENZYMEN VOOR ACTIVERING VAN GECONJUGEERDE CYTOSTATICA. E.P •. Beem*, M. Hillebrand*, C. Benckhuijsen MNU-geInduceerde marnrnatumoren bij-de rat vertonen regressie na ovariectomie: een complate remissie wordt binnen 16-20 dagen na de behandeling bereikt. Gelijktijdig vertoont de intratumorale activiteit van S-glucuronidase gemeten aan ongefractioneerde tumorhomogenaten een optimumcurve met een maximale waarde bij 45% regressie. Orndat een meervoudige localisatie van het enzym aannemelijk is, wordt in deze studie ge'tracht de (veranderingen in de) intracellulaire verdeling van S-glucuronidase gedurende regressie na te gaan, in verband met de mogelijke beschikbaarheid voor intracellulaire activering van geglucuronideerd aniline mosterd.

waarschijnlijkheid afkomstig van adherente lysosomen. Studie-aan 'uI tra' zuivere kernen, yTaarbij deze van hun buitenste enveloppe ontdaan zijn, zullen naar verwachting uitsluitsel geven over de eventuele betrokkenhe~d van de 'nucleaire' activiteit van S-glucuronidase bij tumorregressie. Bekend is dat verschillen in homogenisatie procedures de kwaliteit van de rnicrosomale fractie kunnen be Invloeden vanwege een verschillend effect op vesicle-vorrning van membranen. De relatieve efficiëntie van deze methodes in het volledig verwijderen van rnicrosomale elementen uit het cytosol zal worden nagegaan. Indien een waargenomen latentie van S-glucuronidase in het cytosol bij beginnende regressie niet op een artefact berust, dient deze bijzondere latentie in het cytoplasma verder onderzocht te worden.

Subfractionering van onze experimentele tumoren heeft tot resultaten geleid welke wijzen op een rechtstreekse route van S-glucuronidase vanaf de plaats van synthese (voleindigd in het Golgi-apparaat) naar het cytoplasma van de cel. Volledige zekerheid over deze veronderstelling zal worden verkregen wanneer experimenteel vastgesteld kan worden dat géénivan de S-glucuronidase-bevattende fracties van de cel significant.bijdraagt tot de voorraad van vrij I enzym in het cytoplasma.

Naast de lopende tests· voor de verschillende lysosomale enzymen zullen andere worden ingevoerd voor enzymen die karakteristiek zijn voor het Golgi-apparaat en voor microsomen. Gecombineerd met nog in te voeren procedures van electronen microscopie zullen deze biochemische methoden naar verwachting antwoord geven op onze vraagstelling of S-glucuronidase-bevattende structuren betrokken zijn bij de synthetische route van het enzym naar het oplosbare deel van de cel.

Door: ons is al vastgesteld dat tum-orlysosomen een noge stabiliteit bezitten en deze behouden tot tenminste 80% regressie (zie Ann. Rep. 1981). Ivlogelijk structurele verschi~len tussen lysosomale subpopulaties en de implicaties daarvan op verschillend functioneel gedrag zullen worden onderzocht via verfijnde 'ultra'zuiveringstechnieken. Een relatief hoog percentage S-glucuronidase activiteit is teruggevonden in 4e kernfractie, naar alle .

Een aantal studies.zullen worden opgezet ter directe karakterisering van S-glucuronidase in cytoplasma vergelijkend met het enzym in andere fracties. Door gel-electroforese toe te passen op het S-glucuronidase zoals aanwezig in de verschillende fracties gedurende tumorregressie hopen we de verschillende isoenzymen van rnicrosomale en/of lysosomale aard aan te tonen.

*N.K.I. projekt 80-3 43

Synthetisch O-glucuronide Vall_Rhydroxyaniline mosterd.zal ~orden getest als substraat voor S-glucuronidase in de verschillende cellulàire fracties. We hopen hiermee tevens uitsluitsel te verkrijgen omtrent.eventuele intralysosomale deconjugering van het glucuronide gevolgd door een uitstoting van geactiveerd product. Vergelijkbare studies dienen opgezet te worden voor hetlysosomale Nacetyl-glucosaminidase. In mammatumoren van de rat zijn hoge gehaltes van dit enzym waargenomen gedurende regressie. De synthese van een conjugaat van N-acetylglucosamine met_p:hydroxyaniline mosterd lijkt relatief eenvoudig. Behandeling van het proefdier met Tamoxifen of 2-Br-a-ergocryptine,

zowel afzonderlijk als gecombineerd, induceert tumorregressie. Het effect van een dergelijke behandeling op intratumorale S-glucuronidase activiteit zal worden nagegaan om een eventueel voordeel daarvan boven ovariectomie op te sporen. De resultaten tot nu toe hebben ons er toe gebracht om een uitgebreide studie te overwegen aan menselijk tumormateriaal. Het voordeel van studie aan de cytosolfractie boven dat aan ongefractioneerde tumorhomogenaten stelt ons voor de vraag in hoeverre microprocedures VOOr celfractionering van tumorbiopsieën mogelijk zijn. Een aangepaste versie van de benodigde apparatuur voor celdisruptie door N2-cavitatie zou daarvoor ontworpen moeten worden.

VIII.3 FARMACOKINETISCH EN TOXICOLOGISCH ONDERZOEK OVER HET GEBRUIK VAN ADRIAMYCINE BIJ REGIONALE PERFUSIE VAN DE EXTREMITEITEN S.C. van ' t Hoff*, W.J. van Dijk, W.J.A.M. Buys*, C. Benckhuijsen In eén rattemodel voor perfusie chemotherapie van de extremiteiten wordt onderzoek gedaan naar faktoren die de lokaal-toxische werking van adriamycine bepalen. Er werd een dosis-afhankelijke acute ontstekingsreaktie waargenomen na perfusie met adriamycine; bij hogere doses werd deze gevolgd door sterke atrofie van de spieren en misvorming vàn het bot. Gangreen van de poot was ook strict dosis-afhankelijk en trad niet onverwacht op. Bij 1 jaar observatie werd een sterk tumorigene werking van adriamycine waargenomen. Tumoren ontstonden 29 + 6 weken na perfusie in 16/33 rattën, oOk na lage doses adriamycine. De tumoren waren sterk infiltratief groeiende sarcomen; epitheliale tumoren werden niet waargenomen. De reduktieautoxidatie van de chinon-struktuur die adriamycine in in vivo systemen kan ondergaan, en waardoor zuurstof radikalen ontstaan, is waarschijnlijk betrokken bij de tumorigenici·teit·ende lokaal-toxische werking op spierweefsel.

*K.W.F. project 80-5

Het onderzoek over het fysiologische mechanisme van afweer· tegen zuurstof radikalen zal worden voortgezet, om na te gaan of bepaalde perfusie omstandigheden de ontgifting zouden kunnen belemmeren of versterken. In dit verband wordt gezocht naar eventuele stoornissen in de glutathion stofwisseling in de spieren. Totaal glutathion, bepaald met de katalytische methode volgens Tietze, GSSG bepaald met dezelfde methode maar na wegvangen van GSH met 2-vinylpyridine, en de specifieke activiteit van glutathion peroxidase worden als parameters bestudeerd. Onder de werking van zuurstofradikalen kunnen lipiden peroxidatie ondergaan. Het optreden van het eindprodukt daarvan, malondialdehyde, wordt onderzocht in door stikstofdisruptie verkregen spierhomogena-' ten. Normale spier bleek met deze methode een verWaarloosbare blancowaarde te ,geven. Bij bescherming·van het normale weefsel bij regionale perfusie met adriamycine moet gedacht worden aan maatregelen tijdens de perfusie, of aan vóór- of nabehandeling. Enkele mogelijkheden die onderzocht worden

(zijn) : • Het geleidelijk toevoegen van adriamycine aan het perfusaat. Adriamycine accumuleert voor ongeveer 60% in de erythrocyten van het, perfusaat; het evenwicht stelt zich in ongeveer 10 min in. Door geleidelijke toevoeging of door pre-equilibreren van het perfusaat met adriamycine kunnen hoge piekconcentraties worden vermeden. Dit werd bij klinische perfusies bevestigd door meting van de plasmaconcentraties adriamycine equivalenten • • Nagegaan wordt of een lagere zuurstof spanning in het perfusaat dan gebruikelijk een vermindering van de toxiciteit van adriamycine ten gevolge zou kunnen hebben.

bindingen bereikt, die tegen acute lethaliteit en tegen harttoxiciteit beschermt. Naar verwacht zal dit principe bij regionale perfusie ook werkzaam kunnen zijn. • Bij acute zowel als chronische systemische toediening van adriamycine blijkt de verbinding ICRF-187 protectie te geven tegen hartspierbeschadiging. Waarschijnlijk berust deze op het wegvangen van Fe++ionen die katalyserend werken bij radikaal reakties. Indien bescherming tegen lokale toxiciteit wordt bereikt zal worden onderzocht of de antitumor werking van adriamycine bij perfusie in het rattemodel door beschermende maatregelen al dan niet benadeeld wordt. Het IM-getransplanteerde Yoshida sarcoom vertoont een groei remming bij doseringen die door de rattepoot nog worden verdragen en kan als indicator dienen voor een eventuele vergroting van de therapeutische breedte door beschermende maatregelen.

Uit onderzoekingen over hescherming tegen harttoxiciteit van sytemisch toegediend adriamycine zijn aanwijzingen voorhanden dat deze tot stand gebracht kan worden door: • voorbehandeling met N-acetylcystein of cysteamine. Met deze SHverbindingen wordt een tijdelijke verhoging van de weefselconcentraties van klein-molekulaire SH-ver-

VIII.4

REGIONALE PERFUSIE VAN LEDEMATEN MET CYTOSTATICA

J .Wi:eberdink, C.Benckhuijsen, in samenwerking met E.A. van Slooten, Ph. Rümke, H.R.Marcuse, B.B.R.Kroon, E.P.van der Esch, F.J.Varossieau en S.C.van ' t Hoff* (Antoni van Leeuwenhoek-Huis, Amsterdam), en R.P.Braat,. G.A.A.Olthuis, J.G.van Andel, J.J.A.M.Handels en J.H.Mulder (Dr Daniël den Hoed Kliniek, Rotterdam) I

De samenwerking tussen de perfusie teams van het Antoni van LeeuwenhoekHuis en de Dr Daniël den Hoed Kliniek. over de regionale perfusie van de l~dematen onder de gezamenlijke projektleider wordt voortgezet. Klinisch onderzoek in beide ins tituten wordt gecombineerd met een klinisch-farmacologische studie die in het research laboratorium van het Van Leeuwenhoek-Huis wordt verricht aan monsters die door beide instituten worden ingebracht. 1. Het bemoedigende therapeutische resultaat dat verkregen werd met 3 "triple perfusies" maakt uitbrei-

:*KWFprojekt 80-5 45

ding van onze ervaring op dit gebied gewenst. De regels die gekozen zijn voor de indicatie-stelling (patiënten bij wie tenminste één melanoomhaard als parameter voor anti tumor-effekt kan dienen) en voor de techniek (melfalan: 7.5 mg per L per keer met intervallen van 4, hoogstens 6 weken) worden voorlopig gehandhaafd. 2. De resultaten van de spiegelbepalingen van melfalan tijdens perfusie die bij ongeveer 90 patiënten verkregen zijn zullen worden bewerkt Het principe van de vaste dosis (10 mg melfalan per L doorstroomd weefsel) zal hierdoor kunnen worden getoetst aan nauwkeurige gegevens over het beloop van de spiegel in het perfusaat-plasma gedurende 1.uur.

Door de grote spreiding van volumina van weefsel (1.7 tot 16.5 L) lopen de beginconcentraties melfalan in het praktisch constante volume perfusaat sterk uiteen. Getracht wordt uit ,de farmacokinetische gegevens af te leiden of, en in welke mate, de opname van het cytostaticum per volume-eenheid weefsel beïnvloed wordt door de beginconcentratie die in het perfusaat tot stand komt bij wisselende totale dosis.

3. Coördinatie met oncologen die dezelfde farmaco-chirurgische beginselen volgen, blijft gewenst teneinde verantwoorde meningen te kri~ gen over de merites van regionale perfusie bij melanomen en bij sarcomateuze aandoeningen van de ledematen. Voor dit doel worden reeds gelegde contacten met centra in Israël en Indonesië uitgewerkt.

VIII.4a DOSIS-EFFEKT RELATIES VOOR CYTOSTATISCHE BEHANDELING VAN HUMANE MELANOOMCELLEN IN VITRO A.-M. Osman*, C. Benckhuijsen 1. De variabiliteit in gevoeligheid van bestaande of nieuw ontwikkelde melanoomcellijnen voor behandeling met fenylalanine mosterd (melfalan) wordt bestudeerd. De gevoeligheid wordt gekwantificeerd met de 00 en de 0 37 waarden.

2. Een aantal cellijnen wordt getoetst op gevoeligheid voor glu'ç:ocorticosteroid hormoon, omdat bij één cellijn een cytotoxischewer~ king van dit hormoon gevonden werd. Er werd aangetoond dat de kloningsefficiency met 37% verlaagd werd. 3. Er zal onderzoek worden gedaan naar de samenhang tussen de werking van glucocorticosteroid hormöonen het effect van melfalan. Er worden twee schema I s van behandeling bestudeerd: gelijktijdige behandeling gedurende 1 uur en 24 uur voorbehandeling met hormoon, gevolgd door 1 uur melfalan. Er is een versterkte werking van beide gecombineerde behandelingen gevonden. Het effekt is na 1 uur additief, na 24 uur voorbehandeling synergistisch. Om de versterking te kwantificeren schiet de vergelijking van 00 en 0 37 tekort1 een 010 of Dl' d.w.z. een LOgO of LOgg d~ent te worden gebruikt. 4. Onderzocht zal worden of de remming van de kloonvorrning door glucocorticosteroid hormoon ten dele (langzaam) reversibel is, zo*Uitgezonden door de Universiteit van Cairo 46

als gesuggereerd wordt door de aanvankelijke experimentele uitkomsten. Hierbij valt te denken aan een effekt op de duur van de celcyclus. Het impuls-cytofotometrie zal worden nagegaan of een ophoping optreedt in een bepaalde celcyclusfase (Gl?) en of deze reversibel is dan wel (gedeeltelijk) irreversibel. Naar een samenhang van de waargenomen hormoon-geïnduceerde celdood en een eventueel effekt op de verdeling , van de cellen over de celcyclus~en zal worden gezocht. Een vertraagde passage door de celcyclus zou een vermindering van het cytotoxische effekt van melfalan tengevolge kunnen hebben. Echter blijft staande dat de netto-uitkomst een duidelijke versterking is van het celdodende effekt van de gecombineerde behandeling. 5. Oe mögelijke betrokkenheid van receptor voor glucocorticosteroid hormoon bij het cytotoxisch effekt op een melanoomcellijn zal worden bestudeerd. Vergelijkend onderzoek naar het receptorgehalte, en eventueel receptorgedrag, van de hormoon-gevoelige cellijn en h6rmoonongevoelige lijnen zal kunnen bijdragen aan het inzicht aan,welke voorwaarden een melanoomcel moet voldoen om gevoelig te zijn voor cytotoxiciteit van glucocorticosteroid hormoon.

~

--_._---_.-

VIII.5

--"'~-'----'--"""'---

ONDERZOEK TEN BEHOEVE VAN DE CHEMOTHERAPI' BIJ LEUKEMIE

L .A. Smets, J. Homan-Blok, • 1 Celkinetische aspecten van hooggedoseerd Ara-C bij de behandeling va~ ANLL van jeugdigen. Vanuit dit project zullen de celkinetische parameters worden bepaald vóor de uitvoering van een pilot-studie door de Stichting Nederlandse Werkgroep Leukemie bij Kinderen (SNWLK, yuliana Kinderziekenhuis, Den Haag). Deze stu~ie voorziet in een geïndividualiseerde behandeling van patiënten op basis van i::elkinetische parameters zoals beschréven in het Annual Report 1981'. . Nade~ onderzoek zal worden verricht naar' de relatie tussen delingsaktiviteit vóór behandeling en de mate, en het tijdstip van de recrutering als gevolg van een eerste Ara-C injectie. Tevens zullen geselei::teerde meting,en tijdens de behand~ling worden uitgevoerd om inzichtte krijgen in 'de continuïteit van het recruteringsmechanisme.

Gelijktijdig wordt retrospectief nagegaan of celkinetische parameters ook prognostische betekenis hebben voor maligne lymfomen bij jeugdigen. Uitbreiding van dit onderzoek zal worden overwogen indien de resultaten met het beschikbare materiaal dit rechtvaardigen. Bij geselekteerde patiënten met een vermoedelijk hoge resp. lage risikoklassifikatie zullen klinische'en celkinetische parameters tijdens inductietherapie worden vergeleken om een inzicht te krijgen in de mogelijke mechanismen die aan dit verschil ten grondslag liggen. • 3 Fase 1 studie bij resistente lymfomen en AML van volwassenen (begeleidend onderzoek t.b.v. Dr.J.Schornagel, AZRU, Utrecht, en Dr.G.McVie, NKI, Amsterdam). Celkinetisch onderzoek zal worden verricht bij patiënten met resistent lymfoom of AML als onderdeel van een fase 1 protocol. Dit protocol is gebaseerd op een alternatieve toediening van hoog gedoseerd Ara-C als bolus injectie,en conti-' nue perfusie met thy.mi,d,ine. De te onderzoeken parameters zijn: ' a) rel-atie tussen delingsaktiviteit vóór, ,behandelinq en de klinische effec'ten, b) vaststellen van persisterende resistentie in een vroeg stàdium van behandeling, en c) het "vastleggen van verschijnselen van synchronisatie en recrutering als' 'mogelijke factoren in de klinische response.

• 2 Prognostische factoren bij ALL van jeugdigen (in samenwerking met Dr.H.Behrendt, Emma Kinderziekenhuis, Amsterdam). Hoge' delingsaktiviteit van leukemische cellen in het perifere bloed lijkt een nieuwe risico-factor te zijn voor vroegtijdig recidief bij jeugdige ALL patiënten. Wij willen deze conclusie bevestigen door een retrospectief onderzoek aan diepgevroren monsters van het perifere bloe,d van alle Nederlandse ALL patiënt jes opgenomen tot 1979. Hierdoor zal het aantal evalueerbare, patiënten met een observatieperiode van 24 of meer maanden tot ca • .100 kunnen worden uitgebreid.

VIII,.6

CELKINETISCHE PARAMETERS

A.P.M • .:rongsma, P.J.van der Kolk-Schaap, A.M.Duyvestijn*, Y.Köhler starten met een analyse van de preparaten die uit biopsieën vóór en tijdens de behandeling worden afgenomen. In vrijwel alle patiënten werd een afname van de proliferatieve fractie na een bestraling van 10 Gyge-

• Klinisch onderzoek. Het aantal patiënten met cervix carcinoom dat in dit onderzoek is opge,nomen is nu groot genoeg om te

*K.W~F. project 81-13

47

vonden. Daarentegen zagen we vaak een verhoging van de metabolische aktiviteit van het tumorweefsel, en soms van het tumorbed. Morfologische kenmerken moeten nog gekwalificeerd worden. De discriminerende kenmerken'zullen worden getoetst op hun eventueel prognostische waarde door ze te correleren aan de klinische gegevens. Een belangrijke belemmering van het onderzoek is de mogelijke heterogeniteit van het tumorweefsel. Door verschillende doorsneden van het biopt te vergelijken zal worden getracht om aan te geven of de betreffende coupe als representatief voor het weefsel kan worden beschouwd. Het accent van het onderzoek zal dit jaar liggen op een nauwkeurige omschrijving en zo mogelijk kwantificering van de morfologische en celkinetische parameters die uit dit materiaal te halen zijn. Aan het eind van dit jaar zal de follow up van de eerste patiënten voldoende zijn om klinische- en laboratorium-gegevens te correleren.

VIII. 7 BIOCHEMISCHE,

EXPERIME~TELE

• Onderzoek in celkweekmodellen. De tumor response op bestraling is behalve van milieufactoren in en om het tumorweefsel - pH, de aanwezigheid van zuurstof, voedselvoorziening en immunologisch systeem - ook afhankelijk van de intrinsieke gevoeligheid van de tumorcel. Cellijnen die onder dezelfde kweékomstandigheden verschillen in strálingsgevoeligheid worden als model gebruikt om morfologische kenmerken te onderzoeken die mogelijk met deze gevoeligheid geassocieerd zijn. • Weefselkweek. Het is ons nog niet gelukt weefsel van cervixtumoren met succes in kweek te brengen voor in vi tro onderzoek. Slechts in enkele gevallen konden we een prolifererende populatie langer dan 3 weken kweken. Ook het komend jaar zal onze aandacht op de celkweek gevestigd blijven omdat een dergelijk patiënt gebonden systeem bij uitstek geschikt lijkt om de cytostatischeen stralingsgevoeligheid van het weefsel te testen. ____________________

EN KLINISCHE FARMACOLOGIE

H.M. Pinedo, A. Leyva, .J. Lankelma, M.P. Uitendaal, G. McVie, J. van Maanen, H. Weenen, H. Appel, I. Kraal, G. Voortman De samenwerking tussen deze groep en de clinical research unit van het NKI en de afdeling Interne Oncologie van het Academisch Ziekenhuis der Vrije Universiteit, heeft duidelijke vormen aangenomen. Dankzij de'aanwezigheid van een chemotherapie-research verpleegkundige op elk der afdelingen worden de klinische research protocollen exact volgens de voorschriften gevolgd. Het betreft veelal studies van nieuwe medicamenten die in de respectievelijke afdelingen en in EORTCverband worden bestudeerd. De in vitro kweekmethode waarbij monolayer cellen in een doorstroomsysteem groeien, is verder ontwikkeld. Het uiteindelijke doel van dit model is, dat de cellen worden blootgesteld aan een medium (100 urn dikte), dat gedurende het, experiment niet uitgeput raakt. Dit doorstroomsysteem zal w~rden 48

gekarakteriseerd aan de hand van biologisch- en stroom dynamische parameters en voor diverse cytostatica gebruikt. De huidige werkplannen zijn: el Purine en pyrimidine biochemie van PALA ,(KWF project AUKC-Onc. 803) •

Dit project gaat nu het laatste jaar in. PALA is in de kliniek niet effectief gebleken. Wel heeft het experimentele gedeelte van het project veel inzicht verschaft in de mogelijke mechanismen tot remming van de vroege de novo pyrimidine synthese en de "rescue" van de cel tegen de effecten daarvan. De blokkade van de pyrimidine synthese door PALA, resulteert in een vermindering van de respectievelijke nucleotiden in de cel. In het laatste jaar zal worden getracht meer inzicht te krijgen in de relatie tussen duur van de blootstelling aan PALA, de hoeveelheid

nucleotiden in de cel en het uitstel van :de groei van de tumorcel in vivo. Deze experimenten wordenverricht met de B1G melanoomcel,lijn.

De bevindingen met deze studies aan gedeeltelijk gezuiverde eniympreparaten zullen, in het geval van de gekweektecel'lijnen, in verband worden gebracht met gegevens over het dThd metabolisme in intacte cellen, die in het lopende jaar zullen worden verzameld. Bovendien zullen dThd metabolisme en enzymprofielen in·snelgroeiende en stationaire cellen worden -yer~eleken in gekweekte fibroblasten en melanoomcel'len.

Het onderzoek waarbij experimentele en humane tumoren worden ge-karakteriseerd naar de ratIo uridine kinase/uridine fosforylase wordt voortgezet. 02 Thymidine als cytostaticum (KWF project AUKC 80-4). De studie naar de profielen van enzymen, die betrokken zijn in het thymidine metabolisme, in normale en tumorcellen zal worden voortgezet. De enzym~n dThd kinase, dThd phosphorylase. dTMP kinase, dTMPase en dTTPase zullen worden bestudeerd. Omdat uit celkweek en uit voorlopige resultaten met patiëntenmateriaal blijkt, dat melanomen een afwijkend enzympatroon hebben, zullen bovengenoemde enzymen in nog zes melanoomcellijnen onderzocht worden. De enzymen van normaal weefsel (placenta) zullen worden vergeleken met tumorweefsel (melanoom) .

83 Klinische farmacokinetiek,van anthracycline analoga. De farmacokinetiek van nieuweanthra cycline analoga zal worden bestu7 deerd aan de hand van concentraties in plasma, urine en andere lichaamsvloeistoffen, na toediening van deze stoffen aan patiënten. De farmacokinetische paràmeters die zo kunnen worden bepaald, zullen worden geanalyseerd op mogelijke correlaties met klinische effecten van individuele patiënten. De rol van de aanwezige metabolieten zal op eenzelfde manier worden bestudeerd. Hiervoor zal de bestaande HPLC scheidingsmethode moeten worden geoptimaliseerd en zullen de individuele metabolieten moeten . worden geïsoleerd en geïdentificeerd.

De enzym karakterisering zal worden uitgezocht op die enzymen, die een beslissende factor blijken te zijn voor de mate waarin dTTP wordt gestapeld bij dThd behandeling. De enzymen dThd phosphorylase en dTTPase blijken het meest in aanmerking te komen voor nadere bestudering, terwijl dit voor dTMP kinase nog wordt overwogen. De affiniteit van substraat en remmers voor de enzymen zal worden gemeten in gedeeltelijk gezuiverde preparaten. De resultaten zullen worden vergeleken met die van anderen, verkregen met enzymen uit andere bronnen. Deze kinetiekgegevens zullen inzicht verschaffen in de regulering van het dThd metabolisme en kunnen wellicht tot manipulatie daarvan leiden.

De klinisch farmacokinetische studies zullen verder worden ondersteund door in vitro studies naar cytotoxiciteit van de individuele metabolieten. Ook zouden in vitro incubaties van biopten en/of cellijnen kunnen worden uitgevoerd, teneinde belangrijke informatie te verkrijgen omtrent mogelijke correlaties tussen gevoeligheid voor een bepaald anthracycline en metabolisme. 4'Epi-adriamycine, op dit moment een van de beste anthracycline analoga, wordt veronderstelt te verschillen van adriamycine door een ander metabolisme en/of andere farmacokinetiek. Een vergelijkend onderzoek zal daarom worden uitgevoerd om de v'erschillen op te helderen tussen deze twee analoga, die wat molecuulstructuur betreft zoveel overeenkomst vertonen.

Ook fysische grootheden zoals molecuulgewicht en isozympatroon zullen worden bepaald met behulp van respectievelijk gelfiltratie en ionen wisselings chromatografie. Dergelijke studies kunnen mogelijk verklaringen geven voor verschillen in erizym-kinetiek tussen verschillende weefsels in cellen.

-4 Farmacokinetiek van mitomycineC (MMC) en analoga (KWF project 'THT 80-1). Deze studie geschiedt in samenwer49

king met de afdeling Organische Chemie van de TH in Twente (Hoofd: Prof. dr. D. Reinhoudt) , alwaar ~ordt gewerkt aan de synthese van MMC en nieuwe analoga. Deze analoga worden op hun effect bij tumordragende muizen bestudeerd. Gelijktijdig is in samenwerking met de afdeling Analytische Pharmacie van de RU in Utrecht, een bepalingsmethode ontwikkeld voor MMC en metabolieten. De farmacokinetiek van MMC zal ,daarmee worden bestudeerd aan de hand van plasma en urineconcentratie vs tijd-curves. Grote individuele verschillen zijn gevonden en aanwijzingen voor correlaties tussen farmacokinetische parameters en klinische gegevens zullen nader worden bestudeerd. De aanwezigheid van metabolieten is nog slechts zeer onvolledig onderzocht en zal verder worden bekeken. Hiertoe zal de HPLC scheidingsmethode moeten worden aangepast, en met behulp van gesynthetiseerde mogelijke metabolieten zal aan dit aspect meer aandacht worden gegeven. De hele analyse methode zal 'verder op een systematische manier worden onderzocht om de bijdrage van alle individuele stappen to~ mogelijke artefacten te evalueren.

bevattend medium verandert. Naast tumorcellenzullen van elke patiënt ook beenmergcellen worden gekweekt en in vitro met cytostatica behandeld, om zo tot een voorspellende in vitro test voor de therapeutische-rndex te komen. De nu reeds op gang gekomen samenwerking met drs.E. Boven, die op de Vrije Universiteit te Amsterdam menselijk ovariumtumor materiaal in naakte muizen kweekt, zal verder worden uitgebouwd. .6 Metabolisme studies aan podophyllotoxine derivaten VP 16-213 en VM 26 (KWF project NKI 81-15). Het metabolisme van VP 16-213 en VM 26 wordt verder bestudeerd. Hierbij worden de volgende deelonderzoeken met behulp van rattelever preparaten gepland: a. Vorming van het hydroxy'zuur van VP 16-213. Het mechanisme van de vorming van de belangrijkste metaboliet van VP 16-213 -het hydroxyzuur- wordt verder bestudeerd m.b.v. esterase(s) en esterase-remmers. b.- Bindingsst,udies met subcellulaire fracties. In voorgaande experimenten is gebleken dat na incubatie van gelabeld VP 16-213 met levermicrosomen een gedeelte van de radioactiviteit in de microsomale pellet achterbleef. De binding van gelabeld VP 16-213 aan rattelevermicrosomen en nuclei zal in detail bestudeerd worden om te onderzoeken of bioactivering in de lever plaats vindt tot producten die een irreversibele binding met eiwitten aangaan. Deze produkten zouden voor de werking met VP I6-213 verantwoordelijk kunnen zijn (binding aan DNA). In deze bioacteriveringsstudie zullen remmers en inducers van cytochroom P-450 en P-448 gebruikt worden. c. Studie naar de mogelijke vorming_ van een vrij radicaal. Experimenten met electrochemische detectie suggereren de mogelijkheid van vorming van een vrij radicaal in ring E van VP 16-213. Daar gerapporteerd is, dat het vermogen single-strand breuken te induceren in DNA in HeLa cellen' afhankelij~ is van de aanwezigheid van een hydroxylgroep op positie C-4' in ring E, is het mogelijk dat de interactie van VP 16-213 met DNA

-5 De humane tumor clonogene cell assay voor ovariumtumoren (KWF project NKI 81-11). De door Hamburger en Salmon opgezette clonogene assay voor in vitro selectie van actieve cytostatica--tegen individuele tumoren wordt de laatste jaren door veel groepen toegepast. Daardoor zijn ook enige problemen met de assay duidelijk naar voren gekomen. Zowel het aantal patiënten, bij wie de test lukt, alsook het aantal cytostatica, dat per tumor getest kan worden, ligt te laag doordat de cloning efficiency (het aantal kolonies, gevormd per 5 x 105 geplate, levende cellen) onvoldoende is. Menselijk celvrij ascitesvocht blijkt kolonievorming in belangrijke mate te stimuleren. Getracht zal worden deze kolonie stimulerende component in meer gezuiverde vorm in handen te krijgen, waarna getest zal worden of de gevoeligheid voor cytostatica van de tumorcellen niet door groei in stimulerende factor

50

voorafgegaan wordt door de vorming van een vrij radicaal in ring E. De mogelijke vorming van een vrij radicaal zal bestudeerd worden door het gebruik van spinlabels en electronspinresonantie . _______________________________

----------------------------------------------~-

51

I 11

52

I

IX RADIOTHERAPIE

'--~----~-----------~----------------------------

IX .• 2 . COMPUTER PROGRAMMATUUR VOOR BESTRALINGSPLANNING R. van der Laarse, J.J. Battermann, I.A.D. Bruinvis, A. Hegeman, H. Meertens In samenwerking met het Laboratorium voor Medische Fysika, Universiteit van Amsterdam: Prof. dr. J. Strackee

MFOPT EN MFEXT: COMPUTER PROGRAMMA'S VOOR HET OPTIMALISEREN EN BEREKENEN VAN DOSISVERDELINGEN Voor de omzetting van MFEXT naar een de correctie voor luchthoudende in3-dimensionaal programma voor behomogeniteiten,zoals longen. Het is stralingsplanning met megavolt nog steeds niet duidelijk welke van fotonenbundels zullen vele software de gangbare correctiemethoden de modulen aangepast worden aan nieuwe voorkeur behoort te krijgen. Eigen mogelijkheden voor invoer en presenonderzoek zal noodzakelijk zijn tatie van patiëntdoorsneden en (IX.S). Ook zal de invloed op de dosisverdelingen. Ook zal gebruik dosisverdeling van een wigfilter in gemaakt worden van CT-informatie de lengte richting van de patiënt, voor het bepalen van patiënt- en toegepast voor de compensatie van tumoromtrekken, voor de ligging en sterk veranderende patiëntdoorinvloed van inhomogeniteiten op sneden door MFEXT berekend moeten worden. _________________________________ dosisverdelingen bepaald in waterfantomen. Aparte vermelding verdient MFELC: COMPUTERPROGRAMMA VOOR HET BEREKENEN VAN ELECTRONEN DOSISVERDELINGEN De bepaling van bundel gegevens voor programma ontwikkeld worden, die MFELC, het programma voor bestradoor de planniriglaboranten routine~ lingsplanning met megavolt elecmatig gebruikt kan worden. tronenbundels, zal voor alle beschikbare electronenenergieën De berekening van de output faktor (6-20 MeV) uitgevoerd worden. Ook de bij onregelmatig gevormde velden zal parameters die de invloed van elk vervolgens ',bestudeerd worden. Ook de van de 12 collimatoren op de dosisinvloed op de dosisverdelingen van verdelingen hebben, zullen in MFELC luchtafstanden tussen het uiteinde ing'evoerd moeten worden. Gebaseerd van de collimator en het patiëntop deze gegevens zal vervolgens een oppervlak ial berekend moeten klinisch bruikbare versie van het worden. __~--~------------------__----_ MFIMF:COMPUTER PROGRAMMA'S VOOR HET BEREKENEN VAN! DOS ISVERDEL INGEN ROND GYNAECOLOGISCHE APPLICATOREN taten en IPS: planning systeem voor Voor :de reeds ontwikkelde planningjodiumzaadjes) zullen systeembesystemen voor therapie met gesloten schrijvingen en gebruikershandleiradioaktieve bronnen (SPS: Selectron dingen geschreven moeteIT worden. Planning Systeem, MPS: planning I systeem voor iridiumdraad implan-

IX.3 KLINISCHE TOEPASSING VAN SNELLE NEUTRONEN J.J. Battermann, B.J. Mijnheer,·P.C. van Wijk

zover dat nog niet gebeurd is, verwerkt worden in publikaties of in andere rapporten. Zo zijn ondermeer

De ge'gevens verkregen tijdens het neutronen therapie projekt, dat eind 19 81be.ë_i!ldi9.d werd, zullen voor 53

fysische meetresultaten betreffende de neutronengevoeligheid van GeigerMüller telbuizen en aktiveringsproblemen tijdens neutronentherapie in bewerking. Van de radiobiologische proeven zijn de berekeningen van de relatieve biologische effektiviteit (RBE) als funktie van de positie in

de patiënt vrijwel afgerond. De re~ sultaten van de klinisch vergelijkende onderzoeken van neutronenbestralingen van tumoren in het hoofd/ halsgebied en uitgebreide rectum- en blaastumoren zullen zowel in eigen beheer als in E.O.R.T.C. verband verder bewerkt worden. _ _ _ _ _ _ __

IX.4 BEHANDELING VAN TOEGANKELIJKE TUMOREN MET GESLOTEN BRONNEN J.M.V. Burgers, G.M.M. Bartelink, J.J. Battermann, B.N.F .• M. van Bunningen, R. van der Laarse T.e.M. Wilmering

Nieuwe behandelingsmogelijkheden met gesloten bronnen voor toegankelijke tumoren worden gezocht. Wat betreft het blaascarcinoom wordt er gedacht aan uitbreiding van de indikatie tot grotere tumoren (T3) in combinatie met uitwendige bestraling. Ook wordt-er nog steeds gezocht naar een techniek waarbij radiumnaalden kunnen worden vervangen door een afterloading techniek. Voor het hoofdjhalsgebied lijken technieken met iridiumdraad in nylon geleiders geschikt voor meerdere lokalisaties, en tevens meer flexibel

dan de tot nu toe gehanteerde iridium haarpennen. Een techniek wijziging in deze zin zal worden bestudeerd. De mogelijkheden om met jodium-125 zaadjes implantatie behandeling uit te voeren voor prostaat- en pancreascarcinoom zal nader worden onderzocht. De implantaties als booster behandeling van mammacarcinoom zullen in aantal blijven toenemen. De geleidelijke groei in het aantal blaasimplantaties zai zich naar verwacht ook voortzetten.

IX.5 FYSISCHE ASPEKTEN VAN DE RADIOTHERAPIE H. Meertens, LA.D. Bruinvis, B.J. Mijnheer

MEGAVOLT RADIOGRAFIE Beelden op normale diagnostische röntgenfilms kunnen gedigitaliseerd worden en opgeslagen in de beeldmatrix van de CT-viewing console. Indien deze beelden verkregen zijn met de toestellen waarmee patiënten bestraald worden (megavoltradiografie) treedt een aanzienlijke kontrastvermindering op. Daarom zijn enkele eenvoudige filteralgorithmen ontwikkeld om kontrastversterking d.m.v. window-instelling te verkrijgen. Programma's voor digitaliseren en filteren zijn tot nu toe alleen ontwikkeld om principes te testen. De procestijden zijn echter te lang voor routinegebruik.

De verwachting is dat met de introduktie van CT-informatie voor radiotherapie en steeds betere computerplanning systemen, de zwakke schakel in de radiotherapie keten zal worden het reproduceerbaar 'bestralen van het doelgebied gedurende een groot aantal ,zittingen. Gezien deze ontwikkelingen zal de megavolt radiografie in de toekomst wellicht steeds belangrijker worden. Nagegaan zal worden of er andere detektiesystemen dan de röntgenfilm denkbaar zijn, welke gedigitaliseerde beeldinformatie rechtstreeks naar de computer kunnen zenden, waarna beeldrekonstruktie en bewerking kan volgen.

STANDAARDISATIE VAN DOSIMETRIE BIJ MEGAVOLT FOTONEN- EN ELEKTRONENBUNDELS Na de introduktie en regelmatige bundels van verschillende energiekontrole van de nieuwe sekundaire en. Korrektiefaktoren o.a. voor standaard voor fotonenbundels, zal verzadiging zullen ook voor elekdeze ook vergeleken worden met het tronenbundels bepaald worden. huidige systeem voor elektronen54

DOSIMETRIE BIJ TOTALE LICHAAMSBESTRALING voordoen indien drie tot vier maal De huidige procedure bij totale liçhaamsbestraling zal vergeleken per dag bestraald wordt Lp. v. één worden met die', in 'andere ,instituten langdurige 'bestraling, zullen bestuwaar deze techniek wordt· toegepast. deerd worden. Speciale problemen die zich kunnen' ' IN-VIVO DOSIMETRIE Dosimetriesystemen geschikt voor het nauwkeurig meten van de dosis tijdens of na een bestraling van een patiënt, zullen met elkaar vergeleken worden. Hiervoor is nodig dat een aantal eigenschappen van deze systemen (o.a. nauwkeurigheid, energie- en temperatuur afhankelijkheid) in fantoommateriaal onderzocht wordt. 'Indien bekend is welk systeem

onder bepaalde klinische omstandigheden het best bruikbaar is, zullen voor een aantal bestralingssituaties op of in de patiënt de doses worden gemeten en vergeleken met de planning. Aan de hand van de verkregen in-vivo resultaten kunnen korrektieprocedures voor dos,isverdelingen in of bij inhomogeniteiten, bijvoorbeeld longen, worden opgesteld.------

ONTWIKKELING APPARATUUR T.B.V. RADIOTHERAPIE De ontwikkeling van een gebruiksalgorithme voor isodosis- en isovriendelijk en accuraat apparaat zwartingslijnen. Ook in samenwerking voor het bepalen van lichaamsomtrekmet Nucletron zal een afterIoader ken (body contour device) zal opvoor iridium-192 draad worden getest nieuw ter hand genomen worden. Teop zijn bruikbaarheid voor mammasamen met de firma Nucletron b.v. tumor implantaties als onderdeel van zal ,een isodosis- / isoz\vartingsvolger de borstsparende behandeling (zie ontwikkeld worden, gebaseerd op het projekt IX.4) • op onze afdeling ontwikkelde volg

IX.6 TUMORVOLUMEMETINGEN H. Meertens, R. van der Laarse, T. Minderhoud, G.M.M. Bartelink

Volumemetingen van borst- en cervixtumoren met behulp van röntgen CTbeelden zijn tijdens een pilot study vergeleken met metingen uitgevoerd met andere technieken, zoals ultrasound, mammografie en klinische waarneming, indien mogelijk met de schuifmaat. Resultaten van een in-vitro studie leverden de scan parameters voor de CT-techniek als een funktie van de gewenste nauwkeurigheid van de volumemetingen. Het oppervlak van de tumor in een serie CT-sneden en de positie van deze sneden zijn nodig voor de volumeberekeningen.

lokalisatie is daarom vaak subjektief en afhankelijk van de waarnemer. Teneinde een meer objektieve beoordelingstechniek te vinden om CT-beelden te analyseren, wordt een computerprogramma ontwikkeld, gebaseerd op een goed bekende statistische methode. Uitgegaan wordt van een goed gedefinieerd gebied dat de tumor bevat, waarna ditzelfde gebied in een serie CT-beelden genomen voor, tijdens en na behandeling zal worden gevolgd. De veranderingen in verdeling van CT-getallen in dit gebiedje zullen weer worden vergeleken met klinische waarnemingen in patiënten behandeld voor borst- en cervixkanker. Hieruit kan dan een standaardmethode voor het'meten van tumorvolumina met behulp van CTbeelden worden verkregen. De bewerkingen van deze metingen geschieden in nauwe samenwerking met de pro-

In-vivo is het echter dikwijls moeilijk de tumorcountour te lokaliseren. De CT-data over het tumorgebied zijn niet konstant en verschillen soms weinig ten opzichte van het omliggende normale weefsel. Tumor55

jekten X.3 en VIII.6, welke eveneens deel uitmaken van het onderzoek ·naar groei- en regressiegedrag van tumoren tijdens en na. behandeling.

methode te benutten voor het bepalen van tumorvolumina. De nauwkeurigheid van tumorvolumemetingen-uitgaande van NMR beelden, dient te worden vergeleken met de bovengenoemde technieken, beginnend met enkele goed bestudeerde diermodellen.

De snelle ontwikkeling van de kernspinresonantie (NMR) afbeeldings~echniek maakt het gewenst ook deze

IX.7 MULTIFRAKTIONERING J.J. Battermann, B.J. Mijnheer

Tot de ·mogelijkheden tot vernieuwing en wijziging van radiotherapeutische behandelingsmethoden behoren veranderingen in het fraktioneringsschema van éénmaal daagse bestralingen naar minder -enkele dagen per week- of meer, -twee tot vier maaldaags-. In enkele centra wordt met deze multifraktionering ervaring opgedaan. De totale dosis wordt in een beperkt aantal dagen toegediend, hetgeen een bekorting van de opnameduur kan betekenen. Op theoretische gronden kan, bij verkleining van .de fraktie grootte, een verhoging van de tolerantiedosis worden verwacht, vooral voor tumoren met een hoge proliferatie in gebieden waar de tolerantiegrens bepaald wordt door weefsel met een lage proliferatie, bijvoorbeeld vaatstrukturen. Een model hiervoor is recentelijk opgesteld door Barendsen. Eksperimenteel werk van Gonzalez en anderen bevestigen dat darmepitheel een betrekkelijk grote gevoeligheid heeft voor multifraktioneringsschema's.

In het Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis wordt een groot aantal patiënten met inoperabel rectumcarcinoom gezien. Ook bij het inoperabel blaascarcinoom zijn de resultaten van radiotherapie tot nu toe teleurstellend. Beide lijken daarom een goede groep om de waarde van de multifraktioneringstechniek na te gaan. De tolerantieproblemen voor deze tumorsoorten verschillen slechts weinig. Beide werden voorheen in een gerandomiseerde studie met neutronenbestraling behandeld. Na uitbreiding van de megavoltcapaciteit medio 1982 zullen beide tumor typ en met multifraktionering worden behandeld. De patiëntenselektie en het onderzoek voor de behandeling, o.a. in verband met de darmtolerantie, zullen aansluiten bij de eerdere neutronenstudie.

56

Sektie X. KLINISCHE ONCOLOGIE

------------------------------------------------

X. la Maligne lymfomen; karakterisering van mononucleaire cellen in lymfoomweefsel en perifeer bloed van patiënten met een nonHodgkin lymfoom. P.van Heerde, F.J.Cleton, T.A.M.Dellemijn, C.A.FeItkamp, M.A.Koolman-Schellekens, C.J.M.Melief, R.Somers, H.Spiele, J.E.de Vries, Th.M.Vroom en F.A.Vijth-Dreese. den om specifiek cytotoxische T cellen te genereren tegen autologe tumor B cellen. Dit onderzoek zal in nauwe samen~erking gedaan worden met projekt IV. la waarbij van de daar opgedane ervaring met he't opzetten en kweken van specifiek cytotoxische T cel clonen gebruikt zal worden gemaakt. oOm beter inzicht te krijgen in differentiatie stadia van B cel lymfo'men zullen monoclonale antistof~ fen tegen B cellen geproduceerd worden (in samenwerking,met projekt IV.2). Deze reagentia zullen bij de diagnose op histologische coupes van,lymfoomw€efsel en tevens bij functionele studies toegepast worden, in een later stadium mogelijk ook bij screeningsonderzoek in patiënten. _De produktie van monoclonale antistoffen tegen T cel determinanten op de T-CLL cel (gestart in samenwerking met projekt IV.2) zal afgerond worden. De onder projekt IV.2 en VI. 3d verkregen anti-T cel reagentia zullen eveneens getest worden op hun specificiteit voor T regulator cel funkties betrokken bij B cel differentiatie processen. Tevens zullen de effekten van monocyten (subsets) en monoclonale antistoffen daartegen (geproduceerd in projekt IV.la en I.2) in dit onderzoek opgenomen worden.

De multidisciplinaire bewerking, te weten lichtmicroscopie, electronenmicroscopie, immuunhistochemisch onderzoek van ingevroren weefsel en immunologisch onderzoek van celsuspensies en perifeer bloed, eilectronenmicroscopisch en immuunhistochemisch onderzoek vinden op indicatie plaats, te weten bij diagnostische problemen of bij zeldzaam voorkomende lymfoide of echte histiocytaire tumoren. Deze laatste groep tumoren, uitgaande van.histiocytenjmakrofagen, is bewerkt en wordt binnenkort ter publicatie aangeboden. Ook de korrelatie tussen lichtmicroscopische (vooral cytologische) criteria en de overige parameters (incl.klinische) is in bewerking. De kennis en het inzicht verkregen bij het onderzoek naar de in vitro proliferatie capaciteit van T-cel leukemieën en lymfomen zal toegepast worden in het vervolgonderzoek dat opgesplitst kan worden in de volgende punten: .De proliferatie en Interleukine-2 (IL-2) produktie capaciteit van non B-non T cel tumoren na stimulatie met de phorbol ester TPA zal nader bestudeerd worden. Met name zal de reagerende celpopulatie m.b.v" monoclonale antistoffen getypeerd worden en zal de geproduceerde groeifaktor nader biochemisch geanalyseerd worden. Uit dit onderzoek zal volgen of TPA inderdaad vroege, ongedifferentieerde cellen uit laat rijpen en differentieren. Naast TPA zal ook gekeken worden naar het effekt van meer fysiologische reagentia zoals thymosine, retinoiden enlymfokines. In een later stadium zal dit onderzoek ui.tgebreid worden in de richting van B .lymfomen . • De mogelijkheid zal onderzocht wor57

X.lb Hodgkin's disease:E.O.R.T.C.-trial H I. J.M.V.Burgers, P.van Heerde, R.Somers Dborgaan met het verzamelen van follow-up gegevens met het accent op de ontwikkeling van tweede tumoren of

andere late handeling.

complic~t~es

van de be-

X.lc Hodgkin's disease: E.O.R.T.C.-trial H II. J.M.V.Burgers, B.N.F.M.van Bunningen, E.Hamersma, P.van Heerde en R.Somers. Doorgaan met het verzamelen van follow-up gegevens met het accent op de ontwikkeling van tweede tumoren of

X.ld Non-Hodgkin

ly~phoma

andere late complicaties van de behandeling.

E.O.R.T.C.-study L R I.

J.M.V.Burgers en E.Hamersma. Studie afgesloten. ______________________________

X.lf E.O.R.T.C.-trial non-Hodgkin

ly~phoma

~

________________________________

20751.

R.Somers, B.N.F.M.van Bunningen.J.M.V.Burgers, E.Hamersma en P.van Heerde. Voortgaan met het verzamelen van follow-up gegevens van de 102 patiënten die door het N.K.I. in de studie zijn ingebracht. Zorgdragen voor zo volledig mogelijke dokurneilta·tie in het Data Centrein Brussel,· inclusief.revisie van P.A. en eventueel lymfogram. Meewerken aan de evalutatie van de individuele patiëntengegevens. Publikatie wordt voorbereid.

(Schrijfcomité:Somers, Qasim, Burgers). Voor de non-Hodgkin lymfomen die primair.in lymfklieren beginnen, zijn nieuwe trials geactiveerd voor alle stadia. Er wordt overwogen een trial te beginnen voor patiënten met de primaire haard in de maag.

X.lg Hodgkin's disease: E.O.R.T.C.-trial H V. J.M.V.Burgers, B.R.F.M.van Bunningen, E.Hamersma, P.van Heerde en R.Somers. Doorgaan met het verzamelen van patiënten voor deze studie in E.O.R.T. C.-verband tot zeker medio 1982.

58

X.lh Non-Hodgkin

ly~phoma

trial 20751 stadium I, 20801, 20802.

R.Somers, B.N.F.M.van Bunningen, J.M.V.Burgers, E.Hamersma en P. van Heerde. Deze studies zijn in 1981 gestart. In intercollegiaal overleg en mogel;i..jk in voordrachten zal opnieuw aandacht voor deze s~udies gevraagd

moeten worden, zodat een passend aantal patiënten kan worden opgenomen.

Xl0 E.O.R.T.C.-trial 20811, M.Hodgkin stadium IIIB en IV. R.Somers, B.N.t.M.van Bunningen, J.M.V.Burgers, C.C.E.SchaakeKoning, E.Hamersma en P. van Heerde. Somers is studiecoördinator in de E.O.R.T.C. In deze trial zal de re-

aktie op chemotherapie prospektief worden vast·gesteld. _ _ _ _ _ _ _ _ __

X.lp E.O.R.T.C.-trial H 6. J.M.V.Burgers, B.N.F.M.van Bunningen,R.Somers, E.Hamersma en P.van Heerde. Een . nieuwe trial, H 6', voor patiënten met M.Hodgkin, stadium I en 11. Voor de patiënten met gunstige prognostische faktoren zal de waarde van la.parotomie, die belangri jke prognostische informatie verschaft, worden nagegaan. Er zal worden vergeleken met een zwaardere behandeling bij een groep zonder laparotomie.

Voor patiënten met minder gunstige prognostische faktoren zal ten dele het schema van de trial H V worden overgenomen'. Gecombineerde chemotherapie en radiotherapie zal worden g·egeven, waarbij MOPP en ABVD zullen worden vergeleken, voor.al wat betreft hun late effekten (vruchtbaarheid en sekundaire'tumoren) . _______________~---~

X.2 Melanoom. Ph.RÜIDke, J.M.V.Burgers, E.P.van der Esch, S.P.lsraels, E.A. van Slooten en J.Wieberdink.

H.N~ering,

Adjuvant trials in "high risk" stadium I en stadium 11 patiënten en phase 11 chemotherapie trials in WHO en EORTC verband worden voortgezet, evenals een eigen phase 11 studie waarin bij gemetastaseerde patiënten nagegaan wordt of locale behandeling met DNCB op cutane metastasen het effekt van een maand later te geven DTIC verbetert. Onderzoek naar morfometrische criteria die van belang kunnen zijn .voor de prognose van stadium I en 11 melanoom pa~iënten wordt door de afdeling Pathologie verricht in

samenwerking met het WHO Melanoom Centrum in Milaan en met Dr.J.Baak, patholoog-anatoom in Delft. In het kader van samenwerking in de lKA Melanoom Werkgroep wordt het enquête onderzoek naar patiënten en dokters "delay" voortgezet. Dit onderzoek wordt uitgevoerd door Dr. F.Rampen van de afdeling Dermatologie van het Àrnsterdams Medisch Centrum.

59

X.3 Clinical Research Unit. J.G.McVie, G.P.C.Simonetti, M.M.de Planque, W.W.ten BokkeI Huinink. Het komende jaar zal in eerste in'stanti,e aandacht geschonken worden aan de volgende onderwerpen:

8Als uitgangspunt voor verder onderzoek zal de histologie van skeletspierweefsel van patiëntenbehandeld met anthracyclines worden bestudeerd. -Onderzoek naar dosering en toedieningsschema van mitomycine, etoposide, teniposide en cytosinearabinoside zal worden voortgezet. eHet toxiciteitsonderzoek met, betrekking , tot platinum zal verder worden uitgebreid '(nierfunktie pnderzoek middels hippuranklaring, antiemetica en onderzoek naar het ontstaan van anemie). -Twee nieuwe KWF projekten zullen worden geëffektueerd. a.PlXE meting van platina en andere sporeëlementen in weefsel. b.het gebruik van microspheres als drug carriers voor intra-arterie Ie chemotherapie.

eAfronden van het phase I onderzoek Van TNO-6 en N-methylformamide. eEr zal een aanvang gemaakt worden met phase I studies van JM-40, 4OH-androstenedion en een nieuwe' radiosensitizer. (NSC-347503) . 8Het klinisch pharmacologisch onderzoek van carminomycine, 4'-epidoxorrubicine en Bisantrene zal worden voltooid. .Ejectie fractie bepalingen middels gated equilibrium blood pool scintigraphie zullen met hulp van de afd. Nucleaire Geneeskunde worden bekeken ten aanzien van nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en variabiliteit. Vervolgens zullen schema's worden vastgesteld voor meten van acute en chronische cardiotoxiciteit.

X.4 Mammacarcinoom. J.A.van Dongen, H.Bartelink, R.Bergman, p.F.B'runing, , P.Cohen, F.S.A.M.van Dam, J.P.M.Delemarre., E.Engelsman, E.Hamersma, A.A.M.Hart, C.Modder, J.P.Persijn en R.Veen. De verschillende trials (voor het grootste gedeelte in EORTC verband) ter beoordeling van optimale therapiekeuze zullen worden voortgezet. Nieuwe prospectieve studies ten aanzien van variaties in mammasparende therapie bij stadium I patiënten zullen worden voorbereid. De computer registratie van gege~ vens van vroege behandelde patiënten wordt verder afgerond, terwijl het gebruik van continue computer registratie, van data van nièuwe patiënten verder zal worden getoetst. De data verkregen van het retrospectieve onderzoek zullen worden gebruikt o.a. voor de studie over factoren die de locale recidiefkans beïnvloeden. De gegevens verkregen bij de uitgebreide retrospectieve computer registratie, zullen ook worden gebruikt voor het opbouwen van matched historical controle

gróepen voor die patiënten bij wie nieuwe therapieën worden getoetst maar die niet in 'een prospectief onderzoek vallen. Een methodologisch onderzoek zal worden uitgevoerd, waarbij de waarde van matched historical controles uit het computer databestand vergeleken zal worden met die van de gerandomiseerde controles. Het onderzoek naar de waarde van verschillende technieken om de tu-· morgrootte te beoordelen zal worden afgerond. De bepaling van hormoon receptoren op microniveau '(op cytologische punctaten) zal als routine worden ingevoerd. Verdere ervaring met progesteron receptor bepalingen zal worden opgebouwd. Vragen vanuit de kliniek om het nut van het bepa60

leri van progesteron receptoren oestrogeen receptoren aan te tonen zullen worden geformuleerd.

De toetsing van de methoden ter beoordeling van de quality of life, die van groot belang zijn bij de evaluatie van nieuwe, minder mutilerende mammacarcinoom behandelingen, zal worden afgerond.

na~st

Het onderzoek naar het belang van de morphometrischebestudering van prognostische kenmerken (methode Baa'k) zal worden voortgezet.

De werkplannen voor de voortzetting van hetonderzoek om beter inzicht te krijgen in de hormonale karakterisering van toekomstige mamma carcinoom patiënten worden be" schreven in hoofdstuk VII. '

Studies gericht op de herkenning van risico-faktoren voor het ontstaan van mammacarcinoom bij benigne proliferatieve laesies zullen in de komende jaren worden gekontinueerd.

, X.s' SITIp Nephroblastoma Studyon Morphology. Na voorlopige afsluiting van de studie betreffende de trials 1 - 2 en 5 (febr.'81) zijn van een groot aantal gevallen van SlOP 5 patienten nog preparaten ontvangen. Deze studie wordt per 7-1-1982 afgesloten wat betreft het aantal patienten. De panel van pathologen zal deze preparaten tesamen reviseren waarna de eindresultaten van, de studie naar de correlatie van verschillende morphologische kenmerken met recidief vrije en actuariële overleving, alsmede met de localisatie verschillen van de metastase-

ring bewerkt zullen worden. Speciale studies worden verricht betreffende bijzondere typen van nephroblastomen zoals het multicysteuze en fibroadenomateuze type en het tubulaire type. Op basis van de resultaten van, voorafgaande studies zal een plan gemaakt worden voor de morphologische studie van de patienten van SlOP 6 t r i a l : - - - - Een vergelijkend onderzoek vindt plaats naar de morphologische gevolgen van preoperatieve behandeling i.c. radiotherapie versus chemotherapie.

X.7 Tumoren van bot en weke delen. P.Cohen, C.E.Albus-Lutter, H.Bartelink, C.Benckhuijsen, J~M.V. Burgers, R.Somers, C.A.FeItkamp, W.Misdorp, E.A. van Slooten en J.Wieberdink. zullen vinden. De lopende trial van de primaire behandeling van het osteosarcoom met drie electieve modali tei ten' (EORTC protocol nr.2078l) zal gecontinueerd worden. Samen met Vanel uit Villejuif zal Cohen de röntgenfoto's van de primaire tUmor blijven reviseren. In de vorige jaren zijn daarbij geen bijzondere facetten naar voren gekomen. Helaas blijkt slechts in een sporadisch geval de groeisnelheid van longmetastasen gemeten te kunnen worden. Dit ligt voor het belangrijkste deel aan het feit dat meestal geen observatie termijn in acht wordt genomen na het

Deelname tesamen met andere Europese kankercentra aan klinische EORTC trials voor de behandeling van het osteosarcoom en van het gemetastaseerde weke delen sarcoom zal ook in 1982 gerealiseerd worden. Met enige voldoening kan geconstateerd wor'den dat de inbreng van trià'l patiënten uit het Antoni van Leeuwenhoek Ziekenhuis in aantal relatief het grootst is. Voor behandeling van het gemetastaseerde weke delen sarcoom zijn een drietal verschillende protocollen voor chemotherapie in studie. Verwacht mag worden dat weer enkele nieuwe Phase II onderzoeken plaats 61

extremiteiten zal meer ,aandacht worden geschonken aan een chirurgische behandeling die öp het behoud van de betreffende ledemaat gericht is. Dit komt neer op een locale tumorresectie met reconstructie, meestal voorafgegaan door chemotherapie. Hiertoe is een,gemeenschappelijke EORTC/SIOP trial in voorbereiding (van Slooten) .

ontdekken van de metastasen. In het algemeen wordt dan onmiddellijk met therapie begonnen, hetzij als chemotherapie hetzij als metastatec-' tornie. Overwogen kan worden in hoeverre het aanbeveling verdient om i.p;v. de groeisnelheid, tijdens en ria chemotherapie de regressiecurven nader te analyseren. Hiertoe zal door Cohen het nodige initiatief ondernomen worden. Verdere medewerking zal wo~den verleend aan de behandeling van longmetastasen volgens door de EORTC opgestelde protocollen ten aanzien van chemotherapie. Gezien voorafgaande ervaring (C.A. Hoefnagel, P.F.Bruning et al.Diagnos tic imaging 50: 277-284, 1981) zal worden doorgegaan met routine scintigrafie voor een vroegtijdig opsporen van longmetastasen. Hierbij wordt gebruik gemaakt van 99mTcMethyleen-Diphosphonaat. In geselecteerde gevallen van osteosarcoom gelocaliseerd aan de

De afdeling Pathologie zal de samenwerking met de afdeling Pathologie ",an deRijksuniversiteit te Utrecht continueren met betrekking tot het retrospectieve onderzoek van weke delen sarcomen. In probleemgevallen wordt hierbij tevens gebruik gemaakt van electronen microscopie. Het door het KWF goedgekeurde project voor de identificatie van spiersarcomen d.m.v. immunologische technieken is van start gegaan en zal zich in 1982 verder dienen te ontwikkelen.

X.8 Metingen van regressie en celkinetische parameters aan tumoren tijdens radiotherap.ie. H.Bartelink, B. van Bunningen, A.Jongsma, R.Krüger, C.Schaake en R.Veen. Tijdens de betralingsperiode zullen metingen worden verricht aan tumoren om de regressie snelheden te bepalen. De metingen met echografie en de CT-scan zullen op diezelfde dagen verricht worden. Klinisch zal de regressie worden gemeten met een ~chuifmaat. of bij patiënten met een cervix-of rectum carcinoom, door middel van vaginaal-en rectaal toucher. Deze klinische regressiemetingen zullen tijdens de bestraling wekelijks geschieden. Gelijktijdig worden op de dag voorafgaand aan de radiotherapie en ook 7 dagen na het begin van de bestraling, indien mogelijk en toelaatbaar, proefexcisies verricht voor bepaling van celkinetische parameters.

In aanmerking komen patiënten met: oa marnrnatumoren, mettumor nog in situ eb cervixcarcinomen stadium IIB t/m IV. rectumcarcinomen.

_c

Het materiaal van de punkties en proefexcisies wordt in het laboratorium in kortdurende kweek gezet teneinde celkinetische paramaters zoals DNA en RNA synthese te meten. Uit deze en morfologische gegevens zal retrospektief de prognostische waarde van deze parameters voor de regressiesnelheid van de tumor tijdens ·de bestraling en het al dan niet recidiveren van de tmnor worden be.paald.

62

X.9 Palliatieve endoscopische plaatsing vaneen prothese bij_ _patiënten met een maagcarcinoom. F.e.A.den Hartog Jager en G.M.Tytgat. In samenwerking met de afdeling Gastro-enterologie van het Wilhelmina Gasthuis wordt geprobeerd het bestaande intrumentarium te verbeteren en uit te breiden. In samenwerking met de technische dienst, afd.

experimenteel werk wordt nieuwe apparatuur ontwikkeld; voor intubatie ook bij zeer distale maaglaesies en bij uitgebreide tumorgroei door de gehele maag.

X.9a. Pre-operatieve bestralin~j_patiënten met een distaal cg. cardia carcinoom.

~phagQs

E.G?rtzak, H.Bartelink en F.e.A.den Hartog Jager. Uitwerking en follow-up van de studie die in 1982 zal worden afgesloten'. Evaluatie van de definitieve resultaten.

X.9b. Post-operatieve bestraling van galblaas en galweg carcinoom. H.Bartelink, E.Gortzak en F.e.A. den Hartog Jager. galwegcarcinoom bleek d'at de behandeling in het algemeen goed verdragen werd. De studie wordt voortgezet. __________

Bijeen pilot study naar het effect van bestraling op de klachten en prognose van patiënten met een irradicaal geopereerd galblaas-of

X.9c. Vergelijkend onderzoek naar de resultaten van palliatieve behándeling van het inoperabele oesophaguscarcinoom: radiothè~pie jinbrengen van een Ty',9on buis. H.Másselink, R.van Roessel, F.S.A.M.van Dam en F.e.A.den Hartog Jager.

X.9d. International adjuvant study in gastric cancer. Studie chirurgie t.o.v. chirurgie ~FAM (5 FU, Adriamycine, Mitomycine e) •

X.13. Psycho-sociale

zorg~pijnbestrijding~

F.S.A.M. van Dam,C.Linssen, J.Schulkesv.d.Pol. In samenwerking met het Psychologisch Laboratorium afdeling Persoonlijkheidsleer, Universiteit Amsterdam. 63

Een groot deel van het onderzoek binnen de SMD zal ook in 1983 gewijd zijn aan het ontwikkelen van gedragsmaten voor het vastleggen van de psychosociale consequenties van kankertherapieën i.h.b. in het kader ·van klinische trials. Een en ander geschiedt in samenwerking met het.psych~logisch Laboratorium

van de Gemeentelijke Universiteit van Amsterdam, de EORTC en de WHO. Daarnaast zal in 1983 onderzoek naar het effect van anti-emetica worden voortgezet en uitgebreid.

X.16. Vergelijkende oncologie W.Misdorp,· K.Bijleveld, G.Hart, M.A.van der Valk, J.de Vries en K.Weijer 81 Vergelijkend onderzoek van proliferatieve- en neoplastische laesies· van de mamma. Aan de hand van een gestandaardiseerd systeem zal door een internationale werkgroep (Faulkin, Jensen, Wellings te Davis, Sass en Stewart, Washington, Squartini te Pisa, Mis.dorp-L van der Valk, Hampe en Weijer te Amsterdam) de vergelijkende studie voortgezet worden, betreffende de verschillende typen afwijkingen in de mamma van mens, muis, rat, hond en kat. De bedoeling van deze studies is om te leren in hoeverre er overeenkomsten en verschillen bestaan tussen vooral de groeipatronen van de spontane mammalaesies~ij ·de verschillende species en mogelijk daarna, ook die van de geinduceerde laesies. Speciale aandacht zal besteed worden aan type van intraductale-en intralobulaire groei, infiltratie en reactie van de gastheer (fibrose lymfoeieten) . 82 Het vergelijkende onderzoek naar de invloed van BCG i.v. en C-Parvum i . v. op het ziektevrije interval en de overlevingstijd van honden met mammacarcinoom wordt voortgezet. 83 In een voortgezette studie· zal bij runderen metoogcarcinoom het effect van intratumoraal toegediend (levend) BCG vergeleken worden met dat van NCG celwand vaccin. Tumoren welke niet in regressie gaan of recidiveren zullen met herhaalde injecties behandeld worden. Nagegaan wordt in hoeverre zich specifieke immuniteit ontwikkelt. (Sa-. menwerking met RIV en Fac.der Dier. geneeskunde) .• 64

.4 De vergelijkende studie naar de effecten van cryochirurgie resp. locale immunotherapie metNCG bij paarden met loc aal maligne fibrotumoren (z.g.sarcoiden) zal worden voortgezet in samenwerking met het RIV en de Fac. der D.iergeneeskunde. 85 Er zal gepoogd worden om door het gebruik van markers meer inzicht te verkrijgen in de pathogenese van marnrnacarcinomen va~ de kat. De ontwikkeling vanrnonoclonaIe antilichamen tegen FeLV-en FOCMAantigenen (in minstens 30% van de marnrnacarcinomen in het NKI aangetoond) en het gebruik van mogelijk kruis reagerende muizen- en humane monoclonalen tegen mamma-resp.mamatumorantigenen kan hierbij van belang zijn. 86 De samenwerking met het Exp.Cytologische Laboratorium van het Wilhelmina Gasthuis ·(Dr.Prop) zal worden voortgezet. Het betreft hier een studie haar de effecten van verschillende cytostatica (MTX, SFU, adriamycine, vincristinesulfaten en 4-hydroxycyclophosphanide) op gekweekte marnrnacarcinoomcellen van de kat. Aan de hand van in vitro resultaten zal nagegaan worden hoe de gevoeligheid van katten in vivo is. Dit model lijkt geschikt te· zij.n om. een "single-agent" therapie te testen, hetgeen bij de mens veel moeilijker te verwezenlijken is.

X.17

Voeding van de kankerpatiënt.

P.F.Bruning, F.S.A.M. van Dam, A.Schoot, E.Klein Poelhuis, A.Halling, M.Taks en A.Gooskens Verbetering van de voedingstoestand van kankerpatiënten vraagt om de beantwoording van drie vragen: ea wat eten kanpatiënten (zo goed mogelijk onderscheiden naar aandoening en behandeling)kwantitatief en kwalitatief? eb welke navolgbare voedingsadvie~ zen cg.maatregelen sluiten aan op de gegevens die~ verkregen kunnen worde'n door beantwoording van vraag a? ec wat is het rendement van voedingsmaatregelen beoordeeld aan Ie: verbetering van lichamelijke en ,geestelijke fitheid ("performance")

en 2e: vermindering van to~iciteit van de radiotherapie of chemotherapie. In een onderzoek worden antwoorden gezocht op bovenstaande vragen voor enkele groepen patiënten in ons Instituut. Een en ander gebeurt' in samenwerking van medici, diëtisten, psychologen, fysiologen en voedingsdeskundigen van CIVO. Zeist. Het in oktober 1981 met KWF subsidie begopnen projekt NKI 81~4 wordt~in 1983 voortqezet.

X.18 Immuunhistochemie. A.Bakker, D.Atsma, J.F.M.Delemarre (samen met J.Calafat, M.v.d.Valk, W.Misdorp, J.Hilgers, C.Vennegoor, E.v.d.Esch, Ph.Rümke,J.Hilkens). el. Mammatumoren Immuunhistologische reacties met monoclonale antistoffen tegen mamatumoren en differentiatieantigenen van de human'e mamma zal worden verricht op coupes van proliferatieve ' laesies van de mamma en van mammatumoren van bekendedifferentiatiegraad. Getracht zal worden correlaties te leggen met histologie en prognose en met andere eigenschappen van de tumoren zoals de aanwezigheid van receptoren van lectines en van hormonen. Indien noodzakelijk, zullen ook tests worden verricht met goed-gekarakteriseerde conventionele antistoffen zoals anti-HCG, anti-SPI' of anti-CEA, zoals vermeld in het vorige werkplan. Reacties met diverse lectines (met als eerste keus peanut agglutinine) zullen worden verricht op mammatumoren van verschillende differentiegraad, waarbij aan hetzelfde materiaal de resultaten van electronenmicroscopisch en lichtmicroscopisch onderzoek zullen worden vergeleken ten einde de aard van de __ . reagerende cellen en het type van de reactie vast te stellen. Aandacht zal! hierbij wor~en besteed zowel aan de reactie met tumorcellen als met b~ndweefsel. Getracht zal worden

cortelaties~e leggen met histologie en prognose. Bij proliferatieve laesies van de mamma wordt een dergelijk onderzoek voortgezet aan een zeer beperkt aantal gevallen, waarbij getracht zal worden, het herkennen van bepaalde histologische fenomenen zoals -Scarles~ons te vergemakkelijken door het toepassen van lectines.

82 Melanomen. Dè toepassingsmogelijkheden van de diverse beschikbare monoclonale antistoffen tegen melänomen zullen worden uitgewerkt, vooral voor problemen in de pathologie. In het NKI zijn antistoffen gegenereerd, die melanoom-geassocieerde antigenen herkennen in gefixeerd en ingebed materiaal. De reacties op vriescoupes zullen worden uitgevoerd met de antistoffen van het NKI (C.Vennegoor) en met antistoffen die van andere groepen in de EORTC melanoom-groep worden verkregen. O.a. zal worden nagegaan of metastasen van een onbekende primaire tumor kunnen worden herkend en of reacties met antistoffen hulp kunnen bieden in gevallen waar de tyrosinase test geen uitkomst biedt. Voor alle typen monoclonale anti65

stoffen geldt dat de immuunhistologische tests zullen worden aangepast aan de vraagstelling~ bij de differentiaaldiagnostiek voor de p.a. zal de reactie van een panei van monoclonalèantistoffen met de onbekende metastase of tumor worden vergeleken met reacties van een serie bekende metastasen. Bij een mogelijke toepassing van de monoclonale antistoffen in vivo,

hetzij voor scanning hetzij voor therapie zal voor ieder antilichaam vooral de reactie-met een serie vriescoupesvan vele organen van verschillende donoren worden getoetst ten einde ongewenste kruisreacties met normale weefse~ vast te stellen.

X.19 Nucleaire Geneeskunde. H.R.Marcuse en C.A.Hoefnagel. Verwacht wordt dat een aanvang kan worden gemaakt met het ontwikkelen van de software nodig om scintigrafis·che longmetingen in verband met oncologische behandeling te evalueren op pulmonaire schade.

routineonderzoek zal moeten worden verbonden c.q. of de klinische vraagstelling dient te worden bijcjesteld . . .1~ Scintigrafisch onderzoek der parasternale lymfklierketens t.b.v. de keuze van het doelgebied bij radiotherapeutische behandeling. e2. Schatting van de stràlendoses die bereikt worden bij behandeling van folliculaire en papillaire carcinomen en hun funktionerende metastasen.

Twee hierna genoemde pilotstudies zullen waarschijnlijk voldoende informatie hebben opgeleverd om te kunnen konkluderen hoelang de studies moeten worden gekontinueerd, en. welke konsekwenties er aan het:

X.20

Neuro-oncolo~ie

B.W.Ongerboer de Visser, G.J.McVie, E.Hamersma, R.Somers, W.J.Nooijen, van Zanten, A.Twijnstra (Maastricht) en E.van Eerden (Med.drs.Amsterdam) . «13 Tumbrmerkersin de liquor.

ol AZQ-phase 11 studie over de behandeling van recidiverende gliomen: EORTC trial 26811. De studie is nog niet afgerond.

Gegevens bij een controlegroep, patiënten met metastasen in het hersenparenchym en patiënten met meningea~ Ie metastaseringen worden nagegaan. Een publicatie is in voorbereiding.

02 Behandeling van meningeale metastasering met intraventriculair toegediend MTX. .

84 Prospectief neurologisch onderzoek Cis Platinum en Methyl-Melanine polyneuropa thie-. De studie wordt voortgezet.

De behandeling zal gecontinueerd worden. De behandeling lijkt een gunstig effect te hebben wat palliatie betreft en geeft voor een aantal mensen een duidelijke verlenging van de overleving. De algemeen oncologische toestand speelt een belangrijke rol bij zowel palliatie als overleving. Er zijn 2 voordrachten gehouden en een publiqatie is in voorbereiding.

05 Prospectief pilot-onderzoek over de uitkomsten van bestralingsbehandeling voor epidurale metastasering met myelumcompressie. Het blijkt dat de algemene oncologische conditie een rol speelt bij

66

de uiteindelijke overleving en de effecten op de motoriek en de pijn. Bij de patiënten, die aan de neurologische gevolgen (decubitus, infecties, thrombo-embolische complicaties) overlijden is de overleving dezelfde als bij wie aan de metastase-

67

ringen buiten de epidurale ruimte sterven. Bij een vergelijkend behandelingsonderzoek dient de algemeen oncologische toestand betrokken te worden. Een publicatie is in voorbereiding.