VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

STANOVENÍ PALATINOSY V POTRAVINOVÝCH DOPLŇCÍCH

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS

AUTOR PRÁCE AUTHOR

BRNO 2014

MICHAELA RÁŽOVÁ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

STANOVENÍ PALATINOSY V POTRAVINOVÝCH DOPLŇCÍCH DETERMINATION OF PALATINOSE IN FOOD SUPPLEMENTS

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS

AUTOR PRÁCE

MICHAELA RÁŽOVÁ

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2014

PharmDr.Věra Špačková

Tato práce vznikla za podpory projektu BiochemNet - Vytvoření sítě pro podporu spolupráce biomedicínských pracovišť a zvýšení uplatnitelnosti absolventů biochemických oborů v praxi (registrační číslo CZ.1.07/2.4.00/31.0133). Projekt je realizován v rámci Operačního programu vzdělávání pro konkurenceschopnost, který je spolufinancovaný z Evropského sociálního fondu a státního rozpočtu ČR.

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-BAK0844/2013 Akademický rok: 2013/2014 Ústav chemie potravin a biotechnologií Michaela Rážová Chemie a technologie potravin (B2901) Biotechnologie (2810R001) PharmDr.Věra Špačková doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc.

Název bakalářské práce: Stanovení palatinosy v potravinových doplňcích

Zadání bakalářské práce: 1. Vypracujte literární přehled k dané problematice 2. Popište použité metody hodnocení 3. Zpracujte naměřené výsledky z experimentů 4. Zhodnoťte získané výsledky formou diskuze

Termín odevzdání bakalářské práce: 23.5.2014 Bakalářská práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.

----------------------Michaela Rážová Student(ka)

V Brně, dne 31.1.2014

----------------------PharmDr.Věra Špačková Vedoucí práce

----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty

ABSTRAKT Tato práce se zaměřuje na stanovení obsahu palatinosy v potravinových doplňcích za využití HILIC metody. Práce je systematicky rozdělena do několika oddílů. Obsahuje základní informace o sacharidech a metodách jejich stanovení, probírá vlastnosti analyzované palatinosy. Pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii je v práci vyčleněna samostatná kapitola. Experimentální část zahrnuje podmínky měření, metody příprav vzorků, vyhodnocená data a výsledky včetně diskuze. Pro tuto práci byly použity celkem čtyři reálné vzorky, z nichž dva měly deklarovaný obsah palatinosy výrobcem. Z dalších cukrů se nám podařilo identifikovat fruktosu, glukosu a sacharosu.

KLÍČOVÁ SLOVA HILIC, palatinosa, isomaltulosa, HPLC, ELSD

ABSTRACT This work focuses on the determination of palatinose in food supplements using HILIC method. The work is systematically divided into several sections. It contains a basic informations about saccharides including methods for their determination and discusses the characteristics of analyzed palatinose. A chapter s detached for high-performance liquid chromatogramy. The experimental part includes measurement conditions, methods of sample preparation evaluated data and results including the discussion. Four real samples were analysed, in two of them the content of palatinose was declared by producer. Other sugars that we identified were fructose, glucose and sucrose.

KEY WORDS HILIC, palatinose, isomaltulose, HPLC, ELSD

4

RÁŽOVÁ, M. Stanovení palatinosy v potravinových doplňcích. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2014. 36 s. Vedoucí bakalářské práce PharmDr.Věra Špačková.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a že všechny literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana FCH VUT ……………………………………… podpis studenta

Poděkování: Ráda bych poděkovala PharmDr. Věře Špačkové za odborné vedení a cenné rady při tvorbě bakalářské práce a Doc. RNDr. Jiřímu Pazourkovi PhD. za přínosné informace k dané problematice.

5

OBSAH 1. ÚVOD .................................................................................................................................... 8 2. SACHARIDY......................................................................................................................... 9 2.1 Základní charakteristika ................................................................................................... 9 2.2 Rozdělení sacharidů ......................................................................................................... 9 2.2.1 Monosacharidy ........................................................................................................... 9 2.2.2 Oligosacharidy ......................................................................................................... 10 2.2.3 Polysacharidy ........................................................................................................... 10 2.3 Palatinosa® ..................................................................................................................... 10 2.3.1 Charakteristika ......................................................................................................... 10 2.3.2 Chemické a biochemické vlastnosti ......................................................................... 11 2.4 Izolace sacharidů ............................................................................................................ 12 2.5 Metody stanovení sacharidů ........................................................................................... 12 2.5.1 Chemické metody ..................................................................................................... 12 2.5.2 Fyzikální metody ...................................................................................................... 13 2.5.2.1 Gravimetrie......................................................................................................... 13 2.5.2.2 Refraktometrie .................................................................................................... 13 2.5.2.3 Polarimetrie ........................................................................................................ 13 2.5.3 Chromatografické metody ......................................................................................... 13 2.5.3.1 Chromatografie na tenké vrstvě .......................................................................... 14 2.5.3.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie .......................................................... 15 3. VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) .............................. 16 3.1 Základní principy .......................................................................................................... 16 3.1.1 Retenční čas, retenční objem ................................................................................... 16 3.1.2 Účinnost kolony ...................................................................................................... 17 3.2 Schéma kapalinového chromatografu ........................................................................... 18 3.2.1 Mobilní fáze ............................................................................................................ 18 3.2.2 Stacionární fáze ....................................................................................................... 18 3.2.2.1 Silikagel ............................................................................................................. 18 3.2.2.2. Diolová fáze ..................................................................................................... 19 3.2.3 Čerpadla a dávkovací zařízení................................................................................. 19 3.2.4 Kolony ..................................................................................................................... 20 3.2.5 Detektory ................................................................................................................. 20 3.2.5.1 Refraktometrický detektor (RI) ......................................................................... 21 6

3.2.5.2 UV –VIS detektor.............................................................................................. 21 3.2.5.3 Elektrochemický detektor ................................................................................. 22 3.2.5.4 ELS detektor ...................................................................................................... 22 3.3 HILIC metoda ................................................................................................................ 22 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ................................................................................................ 24 4.1 Využité materiály a zařízení ........................................................................................... 24 4.1.1 Chemikálie ............................................................................................................... 24 4.1.2 Vzorky ...................................................................................................................... 24 4.1.3 Přístroje .................................................................................................................... 24 4.1.4 Software ................................................................................................................... 24 4.2 HPLC analýza – podmínky ............................................................................................ 24 4.3 Příprava standardů .......................................................................................................... 25 4.4 Příprava kalibračního roztoku palatinosy ....................................................................... 25 4.5 Příprava vzorků .............................................................................................................. 26 5. VÝSLEDKY A DISKUZE .................................................................................................. 27 5.1 Identifikace sacharidů .................................................................................................... 27 5.1.1 Compress B.I.G. (Nutrend) ...................................................................................... 27 5.1.2 CarboJET TM Gain (Amix) ....................................................................................... 27 5.1.3. ISO drink (Nutrend) ................................................................................................ 28 5.1.4. Actions WheyGainer (Aminostar) .......................................................................... 29 5.2 Stanovení palatinosy ...................................................................................................... 29 5.2.1 Určení opakovatelnosti ............................................................................................. 29 5.2.2 Vzorky obsahujicí palatinosu ................................................................................... 30 6. ZÁVĚR................................................................................................................................. 32 7. SEZNAM LITERÁRNÍCH ZDROJŮ ................................................................................. 33 8. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK .................................................................................. 36

7

1. ÚVOD V posledních několika letech zaznamenává vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) výrazný rozvoj v oblastech vývoje specializovaných kolon, které uživatelům umožňují rozšířit spektrum analyzovaných látek. Díky nim tak lze provádět analýzu i silně polárních látek, jakými jsou např. peptidy, aminokyseliny či sacharidy. Separace silně polárních látek pro analýzu v HPLC není jednoduchá. Tyto látky jsou na rozdíl od látek méně polárních zadržovány v systému s obrácenými fázemi (HPLC-RP) velmi slabě a jejich detekce bývá prakticky nemožná. Na druhou stranu systém založený na normálních fázích (HPLC-NP) silně polární látky zadržuje až příliš dlouho, což opět není pro analýzu žádoucí. Za účelem separace takovýchto látek byla roku 1990 vyvinuta A. Alpertem metoda hydrofilní interakční kapalinové chromatografie (HILIC). Tato metoda patří mezi speciální techniky HPLC a je vhodná hlavně pro polární a hydrofilní látky. Další uplatnění nachází při analýze složek životního prostředí a potravin [6]. Tato práce je založena na stanovení sacharidů za využití HILIC metody. Konkrétně byla stanovována isomaltulosa (obchodní označení Palatinosa®) obsažená v potravinových doplňcích.

8

2. SACHARIDY 2.1 Základní charakteristika Sacharidy neboli cukry představují významný zdroj energie pro živé organismy. Z chemického hlediska je lze označit za polyhydroxyaldehydy a polyhydroxyketony, které ve svých molekulách mají zabudované minimálně tři alifaticky vázané uhlíky. Fyzikální, chemické a biologické vlastnosti sacharidů závisí na jejich primární struktuře, dále pak na reaktivitě hydroxylových a karbonylových skupin. Fotoautotrofní organismy jsou schopné vytvářet sacharidy během fotosyntézy, heterotrofní organismy přijímají cukry ve formě potravy, případně mohou přeměňovat necukerné látky (aminokyseliny, glyceroly) na cukerné během procesu zvaném glukoneogeneze. Sacharidy jsou součástí pojivových tkání, fungují jako zásobník energie (glykogen, škrob) a patří mezi biologicky aktivní látky. Dle počtu cukerných jednotek v řetězci se sacharidy dělí na monosacharidy, oligosacharidy a polysacharidy [1, 2, 3].

2.2 Rozdělení sacharidů 2.2.1 Monosacharidy Monosacharidy představují aldehydové nebo ketonové deriváty polyhydroxyalkoholů a řadí se mezi jednoduché cukry. Podle funkční skupiny jsou monosacharidy rozlišovány na aldosy a ketosy. Utváří základní stavební jednotku oligo- i polysacharidů a jsou tvořeny pouze jednou molekulou. Podle počtu uhlíků v molekule se klasifikují na triosy, tetrosy, pentosy atd. Tyto krystalické látky s dobrou rozpustností ve vodě se mohou vyskytovat ve dvou základních strukturních formách, tj. v lineární a cyklické. Cyklické formu představují buď pětičlenné furanosy nebo šestičlenné pyranosy. Stavbu těchto jednoduchých cukrů dobře znázorňuje Fisherova projekce, pro popis cyklické struktury se využívá Haworthových vzorců. Přechod mezi těmito dvěma vzorci pak představují vzorce Tollensovy. Monosacharidy jsou opticky aktivní látky, tudíž jsou schopny stáčet rovinu polarizovaného světla. Na základě této aktivity můžeme pak monosacharidy rozdělit na izomery pravotočivé a levotočivé. Při vzniku cyklické formy monosacharidu se na chirálním uhlíku vytváří hydroxylová skupina, která může vůči ostatním substituentům zaujmout dvojí pozici (α- nebo β-anomer). Běžně se vyskytují ve všech potravinách, jejich složení se ale v různých typech surovin liší. Největší zastoupení mají v ovoci, nalezneme je ale i v mase, mléce a vejcích. Nejběžnějším a nejrozšířenějším monosacharidem je D-glukosa, též dextrosa nebo hroznový cukr. Volně se nachází v medu a sladkých plodech, z chemického hlediska se jedná o aldohexosu s jednou aldehydickou skupinou. Dalším zástupcem monosacharidů je Dfruktosa (levulosa, ovocný cukr). Ta patří mezi ketohexosy s jednou ketoskupinou, která se vyznačuje redukčními účinky. D-fruktosa je rychleji stravitelná než D-glukosa a je také nejsladším cukrem ze všech. Společně s D-glukosou tvoří disacharid sacharosu [1, 3, 4, 5].

9

2.2.2 Oligosacharidy Oligosacharidy ve svých molekulách obsahují dvě až deset monosacharidových jednotek navzájem spojených glykosidovou vazbou. Tato vazba vznikla při reakci poloacetalové hydroxylové skupiny cyklického monosacharidu s alkoholem. Podle vzniku této vazby rozlišujeme oligosacharidy na redukující (trehalosový typ) a neredukující (maltosový typ). Oligosacharidy jsou často součástí polypeptidů v glykoproteinech a také se objevují v buněčných biomembránách jako složka glykolipidů. Dle počtu monosacharidových jednotek klasifikujeme oligosacharidy na disacharidy, trisacharidy apod. Velice významným neredukujícím disacharidem je sacharosa neboli řepný či třtinový cukr. Sacharosa (α-D-glukopyranosyl-β-D-fruktofuranosid) je bezbarvá, krystalická látka, dobře rozpustná, při vyšší teplotě hnědne (karamelizace). Patří mezi nejpoužívanější sladidla vůbec a je rychlým zdrojem energie. Používá se také jako konzervační prostředek, protože za vyšších teplot inhibuje koncentraci mikroorganismů. Mezi negativní vlastnosti patří narušování zubní skloviny. V této práci sloužila sacharosa jako porovnávací prvek při určování chemických a biologických vlastností palatinosy, které je v této práci věnována zvláštní kapitola [1, 3, 28].

Obr. č. 1.: Schéma sacharosy. 2.2.3 Polysacharidy Velký počet monosacharidových jednotek spojených glykosidovou vazbou se označuje jako polysacharidy. Tento typ cukrů je špatně rozpustný ve vodě, častokrát v ní jen bobtná a nemá sladkou chuť. Monosacharidové jednotky mohou být buď stejného typu (homopolysacharidy) nebo typu rozdílného (heteropolysacharidy). Polysacharidy se již řadí mezi biopolymery a podle funkce se rozdělují na stavební a zásobní. Ze stavebních polysacharidů lze jmenovat celulosu nebo chitin, ze zásobních pak škrob a glykogen [1, 3].

2.3 Palatinosa® 2.3.1 Charakteristika Izomerizací sacharosy za použití enzymu isomaltulososyntasy se ze sacharosy získává palatinosa. Palatinosu lze charakterizovat jako bílý, krystalický cukr, jehož sladivost je asi o 60 % menší než u sacharosy. Palatinosa je běžnou součástí medu či extraktů z cukrové třtiny, nemá kariogenní vlastnosti a vhledem ke svému nízkému glykemickému indexu je vhodná i pro diabetiky. Ve srovnání s jinými sacharidy je schopná spálit více kalorií při fyzické zátěži, 10

tudíž je oblíbenou součástí potravinových doplňků, zejména instantních nápojů pro sportovce [1, 18].

Obr. č. 2.: Schéma izomerizace sacharosy [10]. 2.3.2 Chemické a biochemické vlastnosti Palatinosa je obchodní název pro volně se vyskytující isomaltulosu, která vzniká enzymatickým přesmykem ze sacharosy. Jedná se o disacharid s úplným chemickým názvem 6-0-alfa-D-glukopyranosyl-D-fruktofuranosa. Při přesmyku dochází ke změně glykosidické vazby mezi fruktosou a glukosou z polohy α-1,2 do polohy α-1,6. Molekuly sacharosy i isomaltulosy jsou stejně velké, nicméně struktura s vazbou α-1,6 je stabilnější. Katalytickou hydrogenací palatinosy se získává palatinol (isomalt), který často slouží diabetikům jako náhražka běžného konzumního cukru. Studie prokázaly, že je zcela hydrolyzovatelná a díky střevním disacharidasam i snadno absorbovatelná. Díky stabilitě je hydrolýza probíhající v tenkém střevě na rozdíl od sacharosy pomalá, což má za důsledek až pětkrát pomalejší uvolňování cukerné složky do krve a tím pádem je zajištěný dlouhotrvající přísun energie pro svaly i mozek. Isomaltulosa má ve srovnání se sacharosou nižší bod tání (120 °C – 128 °C), je odolnější kyselému prostředí. Vodné roztoky obou cukrů mají podobnou hustotu. Při kondenzaci za vyšších teplot jsou vlastnosti isomaltulosy srovnatelné s ostatními cukry [1, 18]. Obr. č. 3 nabízí porovnání závislostí koncentrací glukosy v krvi na čase. Šedá křivka představuje sacharosu, modrá palatinosu. Pro sacharosu je typický prudký nárůst a následně rychlý úbytek koncentrace glukosy, zhruba po hodině jsou zásoby glukosy vyčerpány. Výhodou palatinosy je nižší glykemický index neboli pomalý nárůst a pozvolné uvolňování cukrů do krve.

11

Obrázek č. 3.: Závislost koncentrace glukosy v krvi na čase [15].

2.4 Izolace sacharidů Nejběžnějším typem izolace sacharidů z potravin či potravinových doplňků je extrakce. Nejvhodnějším extrakčním činidlem je 80 % ethanol, který zabraňuje případným enzymatickým změnám. V jiných případech lze použít i vodu, ovšem s přídavkem chloridu rtuťnatého. Jelikož extrahované vzorky nejsou ještě použitelné k analýze z důvodu opticky aktivních látek obsažených v roztoku, nastupuje na řadu čiření, které má za úkol tyto látky z roztoku odstranit a zároveň směs i odbarvit. Typ čiřidla udává typ stanovovaného vzorku a metoda pro stanovení cukrů. Mezi nejčastěji používaná čiřidla patří hydroxid hlinitý nebo infusoriová hlinka. Obě tato čiřidla mají sice menší čířící efekt, na rozdíl od ostatních adsorbentů s vyšší účinností ale neadsorbují redukující cukry. Čiřidla lze rozdělit na chemická (octan olovnatý) a fyzikální (křemelina) [7, 8].

2.5 Metody stanovení sacharidů 2.5.1 Chemické metody K nejvyužívanějším chemickým metodám pro stanovení sacharidů patří titrační stanovení založené na redukujících vlastnostech sacharidů. Pokud jsou k dispozici pouze cukry bez redukující funkce, musí se nejdříve převést na cukry redukující a to nejlépe pomocí enzymů, případně se stanovují pomocí fyzikálně-chemických metod. V praxi se lze nejčastěji setkat s Bertrandovou titrací. Metoda využívá redukce Fehlingova činidla, k níž dochází během varu s čirým vzorkem. Vzniká červený komplex Cu2O, který se následně rozpustí přídavkem okyseleného Fe2(SO4)3. Uvolněné Fe2+ ionty, představující ekvivalentní množství zoxidovaných měďných iontů, se poté stanoví manganometricky v silně kyselém prostředí. Celková spotřeba KMnO4 je úměrná vyredukovanému Cu2O a tedy i množství stanovovaných sacharidů [7, 8].

12

2.5.2 Fyzikální metody 2.5.2.1 Gravimetrie Mezi fyzikální metody se řadí gravimetrie, jmenovitě pak metoda dle Raska sloužící ke stanovení škrobu, ve které se škrob převádí do roztoku pomocí kyseliny chlorovodíkové a následně se vysráží ethanolem. Dále lze gravimetricky určit celulosu a za využití enzymových preparátů i vlákninu. Obecně pro gravimetrická stanovení platí jednotné principy, a to takové, při kterých je analyt kvantitativně pomocí vhodných srážecích činidel převeden na málo rozpustnou látku, obsah analytu se poté stanovuje ze zvážené hmotnosti oné látky a z předem známého stechiometrického složení [7, 8, 9]. 2.5.2.2 Refraktometrie Refraktometrické metody nacházejí uplatnění zejména při detekci cukrů v čistých cukerných roztocích. Principielně je tato metoda založena na měření indexu lomu látek. Dopadá-li paprsek na fázové rozhraní, může docházet buď k odrazu paprsku, nebo k jeho lomu, k tzv. refrakci. Lom je způsoben rozdílnými rychlostmi šíření mezi dvěma různými fázemi, kterými paprsek prochází. V praxi tato prostředí nejčastěji představují analyzovaný roztok a vzduch. Měření se provádí pomocí refraktometru a tuto metodu lze zařadit do metod optických [9, 23]. 2.5.2.3 Polarimetrie U polarimetrie jsou využívány schopnosti látek stáčet rovinu polarizovaného světla. Tato schopnost je vyvolána přítomností asymetrického uhlíku v molekule. Díky optické otáčivosti lze stanovit sacharidy ve směsích s opticky neaktivními látkami. Úhel, o který se rovina otočí, je závislí na charakteru přítomné látky, tloušťce vrstvy, koncentraci roztoku a také na vlnové délce použitého světla. Měřítkem optické aktivity látek je tzv. měrná otáčivost, která je definována jako úhel, o který se otočí rovina polarizovaného světla při tloušťce vrstvy 1 dm3 a koncentraci roztoku 1 kg · dm-3. Pro měření bezbarvých roztoků je vhodné použít roztok dichromanu draselného nebo zdroj monochromatického světla, jakým jsou např. sodíkové výbojky. Stejně jako refraktometrie i polarimetrie patří k metodám optickým. Detekce probíhá pomocí polarimetru [9, 23]. 2.5.3 Chromatografické metody Chromatografie je souhrnné označení pro separační metody, ve kterých probíhá separace molekul analytu mezi mobilní a stacionární fázi na základě rozdílné distribuce směsi. Obě fáze jsou vzájemně nemísitelné, mobilní fáze je pohyblivá, stacionární nikoli. Jedná se současně i o metodu analytickou, která nám poskytuje jak kvalitativní, tak kvantitativní informace o vzorku. Existuje hned několik kritérií, podle kterých lze chromatografii rozdělit. Nejjednodušším a nejčastěji využívaným je rozdělení podle mobilní fáze a to na chromatografii plynovou a kapalinovou, dále můžeme chromatografii klasifikovat dle uspořádání stacionární fáze (sloupcová, plošná) případně i podle jejího složení. V poslední řadě lze chromatografii charakterizovat podle fyzikálně-chemického principu dělení (adsorpční, rozdělovací, gelová, iontově výměnná). Přehled o všech typech dělení udává Tabulka č. 1. Pro separaci sacharidů, zejména mono- a disacharidů, je vhodná chromatografie na tenké vrstvě (TLC). V poslední době je však tato metoda častěji nahrazována vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s HILIC technologií, méně často se pak k detekci využívá chromatografie plynové [7, 11, 13]. 13

Tabulka č. 1.: Přehled chromatografických metod [12]. Mobilní Stacionární fáze Metoda fáze Kapalina Plynová rozdělovací Pevná látka Plynová adsorpční Plyn Plynová na molekulových Pevná látka sítech

Separační mechanismus Rozdělování Adsorpce

Kapalina Pevná látka

LLC Rozdělování

Papírová a tenkovrstvá Gelová permeační Kapalinová adsorpční Tenkovrstvá Ionexová Afinitní a bioafinitní

GLC GSC

Sítový efekt

Kapalinová rozdělovací Kapalina

Zkratka

Sítový efekt Adsorpce Výměna iontů Biospecifické reakce

PC, TLC GPC LSC TLC IEC AC

2.5.3.1 Chromatografie na tenké vrstvě V porovnání s ostatními chromatografickými metodami je TLC metoda velmi jednoduchá i rychlá a je ji možno realizovat jak v klasické, tak ve vysokoúčinné (HPTLC) podobě. Vzorky rozpuštěné v těkavém rozpouštědle se nanáší na start ve formě malé kulaté skvrny, chromatogram se poté vyvíjí v uzavřené komoře, která obsahuje páry mobilní fáze. Jednotlivé separované analyty jsou pak charakterizovány tzv. retardačním faktorem Rf, který je určen jako vzdálenost středu skvrny analytu od startu ku vzdálenosti mobilní fáze od startu. Pokud je mobilní fází organické rozpouštědlo, jsou hodnoty Rf pro sacharidy malé z důvodu nízké rozpustnosti sacharidů v takovýchto rozpouštědlech. Na základě porovnání zjištěných hodnot retardačních faktorů s tabulkovými jsme pak schopni určit, o jaký druh sacharidu se jedná. Jako stacionární fáze se pro TLC nejčastěji využívá silikagel, oxid křemičitý či celulosa. Fáze se nanáší buď na skleněnou desku, nebo na hliníkovou fólii. Podle typu použitého sorbentu je nutno cukry obsažené ve vzorku převést na vhodné deriváty. Pro mobilní fázi se využívají směsi organických kyselin a rozpouštědel, např. butanol : pyridin : voda v poměru 6 : 4 : 3. Principy chromatografie na tenké vrstvě lze využít i pro chromatografii papírovou [16, 17].

14

Obr. č. 4.: Schéma TLC [19]. 2.5.3.2 Vysokoúčinná kapalinová chromatografie HPLC metoda se vyznačuje vysokou účinností, dobrou opakovatelností i robustností. Využívá se k detekci proteinů, sacharidů, vitamínů, organických kyselin, sloučenin rozpustných ve vodě a v nepolárních organických rozpouštědlech [13]. Protože tento typ chromatografie byl v naší práci stěžejním bodem, je mu věnována následující samostatná kapitola.

15

3. VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) 3.1 Základní principy Jako u všech typů chromatografie, i zde je podstatou rovnovážná distribuce vzorku mezi dvě fáze. Aby tomu tak skutečně bylo, musí mezi těmito dvěma fázemi existovat určité fázové rozhraní. Při separaci dochází k opakované tvorbě rovnovážných stavů separovaných látek. Tuto distribuci popisuje distribuční konstanta KD, která je definována jako poměr rovnovážných koncentrací separované látky A ve dvou fázích, přičemž platí, že:

KD =

[A]s = (nA )s × Vm , [A]m (nA )m Vs

(1)

kde:

(nA )s - látkové množství distribuované látky A ve stacionární fázi [ mol ] (n A )m - látkové množství distribuované látky A v mobilní fázi [ mol ]

V s - objem stacionární fáze [ m 3 ] Vm - objem mobilní fáze [ m 3 ]. Během separace dochází k interakcím jak mezi analytem a mobilní fází, tak mezi analytem a stacionární fází a dokonce k interakcím mezi fázemi samotnými. Zóny dělných analytů se během postupu kolonou rozšiřují, zóna v chromatogramu se nazývá pík nebo také eluční křivka a vyjadřuje závislost koncentrace na čase. Šířka píku se udává v délkových nebo v časových jednotkách [11, 13]. 3.1.1 Retenční čas, retenční objem Nejzákladnější charakteristikou chromatografického procesu je retenční (eluční) čas. Jedná se o časový úsek, který uplyne od nástřiku sledované látky po dosažení maxima eluční křivky. K retenčnímu času se váže i retenční objem, což je objem, který proteče kolonou právě za onen retenční čas. Tento vztah lze zapsat jako:

VR = Fm × t R ,

(2)

kde: VR - retenční objem [ m 3 ] t R - retenční čas [ s ]

Fm - objemová rychlost [ m 3 × s -1 ]. Dále se pak setkáváme s pojmy mrtvý retenční čas a mrtvý retenční objem. Obě tyto veličiny představují část složky, která není v koloně nijak zadržována a její rychlost je srovnatelná s rychlostí mobilní fáze. Mírou retence separovaných látek je retenční faktor k a díky němu lze utvořit pro tyto dvě retenční veličiny následující vztahy:

VR = V0 (1 + k )

(3)

t R = t 0 (1 + k ) ,

(4)

16

kde: t 0 - mrtvý čas [ s ]

V0 - mrtvý objem [ m 3 ]. Kombinací rovnic (3) a (4) je poté možno odvodit vztah pro výpočet retenčního faktoru:

k=

t R - t 0 VR - V0 = . t0 V0

(5)

Z rovnice (5) je patrné, že separované látky se liší pouze dobou strávenou ve stacionární fázi, nikoli však dobou, kterou stráví ve fázi mobilní, protože zde je čas pro všechny dělené látky stejný. Doba strávená ve stacionární fázi je označována jako redukovaný retenční čas t´R a je definována rovnicí:

t´R = t R - t 0

(6)

3.1.2 Účinnost kolony Šířka píku v chromatogramu odpovídá separační účinnosti kolony, přičemž účinnost může být vnímána jako ukazatel kvality chromatografické separace. Platí, že čím větší účinnost, tím užší pík. Mírou účinnosti je tzv. počet teoretických pater n, pro který platí vztah:

æ t n = 5,54 × çç R ç w1 è 2

2

ö ÷ ÷÷ , ø

(7)

kde: t R - mrtvý retenční čas [ s ] w 1 - šířka píku v polovině výšky [ s ]. 2

Pokud je známá i délka kolony, lze spočítat i výškový ekvivalent teoretického patra H [11,13]. H=

kde: L - délka kolony [cm] n – počet pater

17

L , n

(8)

3.2 Schéma kapalinového chromatografu

Obr. č. 5.: Schéma kapalinového chromatografu [24]. 3.2.1 Mobilní fáze Mobilní fázi u HPLC může tvořit např. voda, metanol nebo acetonitril, často se využívá i jejich směsí či pufrů. Pro účinnou separaci sacharidů je ve vodně-organické fází udáván nejméně 70 % podíl acetonitrilu. Fáze jsou umístěny ve skleněných lahvích, které fungují jako zásobníky. Lahve musí být dobře uzavřeny, aby z nich odcházela pouze kapalina a nikoliv i její páry, zároveň je třeba zabránit vnější kontaminaci. V zásobnících jsou obsaženy filtry, které brání vstupu tuhých částí do HPLC systému. Dále je nutno provést odplynění mobilní fáze, protože plyny by mohly způsobit nežádoucí odchylky při měření retenčních časů. Odplynění je možné provést pomocí probublávaného helia, častěji se však využívá vakuových degaserů. Fáze je možné automaticky mísit v různých poměrech, poměry jednotlivých mobilních fází mají výrazný vliv na kvalitu celé separace [11, 13]. 3.2.2 Stacionární fáze Stacionární fáze představuje náplň chromatografické kolony. Může jí být pevná látka, ale i film kapaliny navázaný na tuhou matrici (nosič). Existuje několik hledisek, podle kterých lze typy stacionárních fází třídit. Běžným kritériem je polarita (polární, nepolární a amfoterní), výjimkou ovšem není ani dělení na základě chromatografického módu (normální, reverzní, ionexy, HILIC). Pokud je stacionární fáze polárnější než fáze mobilní, jedná se o systém s normálními fázemi (NP-HPLC), pokud je tomu opačně, mluvíme o systému s obrácenými fázemi (RP-HPLC). U chromatografie s normálními fázemi vzrůstá retence s rostoucí polaritou stacionární fáze a klesající polaritou mobilní fáze. Polární látky jsou tak v systému zadržovány déle než látky méně polární. U reverzních fází je tomu naopak [11, 13,28]. 3.2.2.1 Silikagel Nejrozšířenějším polárním absorbentem je nemodifikovaný silikagel. Lze ho využít v systémech s normálními fázemi a v HILIC, po navázání ligandu i v systému s obrácenými fázemi. Komerčně dostupné silikagely se mohou lišit čistotou v důsledku odlišných výrobních technologií. Je odolný vůči vysokým tlakům i organickým rozpouštědlům. Aktivní centra na povrchu představují silanolové skupiny, které dávají silikagelu jeho polární charakter. Navíc utváří slabě kyselý povrch. Limitujícím faktorem pro silanolové skupiny je teplota, při teplotách nad 500 °C získává silikagel hydrofobní vlastnosti. 18

U výrobců je kvůli svým vlastnostem velice oblíbený silikagel typu A vyrobený srážením částic solu oxidu křemičitého. Póry tohoto typu jsou uspořádanější, pórovitost je menší a gel se v alkalickém prostředí rozpouští pomaleji. Dalším druhem gelu je silikagel typu B. Tento gel je vyrobený z organického solu za přístupu vzduchu a na rozdíl od typu A obsahuje velmi malé množství kovů. Účelem výroby toho typu je snaha dosáhnout co nejčistších silikagelů a zvýšit tak separační účinnost. Silikagel lze jednoduše modifikovat pomocí chemicky navázaných ligandů. Výhodou takových vazeb je například minimalizace vymývání stacionární fáze z nosiče a nebo odolnost vůči tepleným změnám či změnám mobilní fáze. Příkladem chemicky upravené stacionární fáze je silikagel modifikovaný aminopropylovou skupinou nebo fáze diolová. Díky kyselému povrchu může silikagel fungovat i jako iontoměnič [13, 28,29]. 3.2.2.2. Diolová fáze Stacionární fázi na bázi diolu lze plně využít jak v systémech s normální fází, tak v systémech s fází reverzní. Výjimkou využití není ani iontově výměnná chromatografie. Kromě nezreagovaných silanolových skupin neobsahuje žádné jiné ionizovatelné skupiny a je tedy vhodná i pro HILIC metodu. Tato fáze je charakterizována vysokou polaritou a schopností utvářet vodíkové můstky, z hlediska polarity se nejvíce podobá nezmodifikovanému silikagelu. Výhodou diolové fáze je menší reaktivita a možnost přechodu z jednoho módu do druhého bez větších potíží. Oproti silikagelu je méně citlivá k přítomnosti vody v mobilní fázi [13, 25, 26, 27].

Obr. č. 6.: Diolová fáze vázaná na silikagel [31]. 3.2.3 Čerpadla a dávkovací zařízení U metody HPLC nachází nejširší využití čerpadla pístová. Princip je založený na konstantním průtoku mobilní fáze, kdy je vznikem podtlaku kapalina nasávána přes dva ventily, z nichž je jeden napojený na zásobník mobilní fáze a druhý na kolonu. Značnou nevýhodou jsou zde tlakové pulsy, které vznikají během vytlačování a nasávání, dá se jim však zabránit zabudováním tlumiče. Dalšími typy čerpadel jsou např. čerpadla vysokotlaká, membránová, pneumatická nebo čerpadla injekčního typu. Čerpání mobilní fáze může být buď izokratické (stejné množství a složení mobilní fáze po celou dobu) nebo gradientové (složení i množství lze regulovat). Dávkování vzorku na kolonu lze uskutečnit buď pomocí ventilu s dávkovací smyčkou nebo automatickým dávkovačem tzv. autosamplerem. Automatický dávkovač je spojený se zásobníkem vzorků, obsahuje nosič s vialkami. Vialky jsou malé nádobky, nejčastěji o objemu 2 ml. Jsou vyrobeny z plastu nebo ze skla a jsou uzavíratelné šroubovacím víčkem, které obsahuje pryžové septum. Přehledný popis funkce autosampleru podává Obr. č.7. V bodě A dochází k separaci, v bodě B se jehla naplňuje vzorkem, v bodě C je pak vzorek dávkován do systému [11, 13]. 19

Obr. č.7.: Schéma automatického dávkovače Agilent 1090,HPTS [24]. 3.2.4 Kolony Kolona představuje nejdůležitější část celého separačního zařízení. Lze si ji definovat jako kapiláru, která je uvnitř vyplněna stacionární fází. Plášť kolony musí být chemicky inertní a musí odolávat vysokým tlakům, často se proto při výrobě používá nerezová ocel, výjimkou ovšem nejsou ani kolony skleněné. Kolona pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii obsahuje kovový plášť, uzavřený kovovou fritou, jejímž úkolem je zajišťování plynulého průtoku mobilní fáze a zároveň udržování stacionární fáze uvnitř kolony. Taktéž zajišťuje těsnění. Oba konce kolony jsou opatřeny ochranným kroužkem s hlavicí. Hlavice pak ještě obsahují otvor pro kapiláry vedoucí ze zásobníku do kolony, případně pak z kolony do detektoru. Kapiláry mohou být buď kovové nebo polyetherketonové (PEEK). Pro snížení tlaku a k ochraně kolony se využívá tzv. předkolon, které jsou umísťovány před vlastní kolonou. Vnitřní povrch kolony by měl být dokonale hladký. V současné době se využívá konvenčních kolon o vnitřním průměru 2,1 až 5 mm, délce 10 až 300 mm s náplněmi o velikosti částic 1 až 10 μm [13].

Obr. č. 8.: Schéma HPLC kolony [24]. 3.2.5 Detektory Detekční systémy jsou u HPLC systému umístěny za kolonou a jejich funkcí je zaznamenávání rozdílů v signálech mezi průchodem čisté mobilní fáze a fáze obsahující 20

analyt. Detektory lze rozdělit na koncentrační a hmotnostní. U koncentračních se zaznamenává změna hmotnostní koncentrace nezávisle na rychlosti toku analyzované složky do detektoru. Hmotnostní detektory reagují na změnu hmotnostního toku. Pokud se rychlost mobilní fáze změní, změní se i výška píku, ale jeho plocha se zachová. Dalším kriteriálním rozdělením je dělení detektorů na destruktivní a nedestruktivní. U destruktivních detektorů dochází k nevratné chemické přeměně detekovaného analytu, u nedestruktivních se detekovaný analyt chemicky nemění. Ideálně by měly detektory pro HPLC splňovat následující kritéria [13,30]: · · · · · · · · ·

Specifičnost Detekce všech přítomných složek Okamžitá odezva Vysoká citlivost a robustnost Omezení šumu Možnost gradientové eluce Nedestruktivnost Nerozšiřování chromatografických zón Spolehlivost a snadnost použití

3.2.5.1 Refraktometrický detektor (RI) Refraktometrický detektor (Refractive Index detector – RI) slouží k detekci rozdílů mezi indexem lomu eluentu a čisté mobilní fáze. Jedná se o univerzální detektor s nepříliš velkou citlivostí. Je vhodný pro detekci sacharidů, polymerů a lipidů [23, 30]. 3.2.5.2 UV –VIS detektor UV-VIS neboli spektrofotometrický detektor zaznamenává absorbanci eluátu v oblasti vlnových délek od 190 do 800 nm. Detektory s fixní vlnovou délkou využívají jako zdroj záření rtuťovou, zinkovou nebo kadmiovou výbojka. Dokonalejší detektory namísto výbojek využívají tzv. diodové pole a jsou označovány zkratkou DAD (Diode Array detector). Tyto detektory umožňují detekci analytu při jakékoliv vlnové délce a jsou schopny vypočítat čistotu píku. Míru odezvy u spektrofotometrických detektorů udává Lambert-Beerův zákon, vyjadřující vzájemný vztah mezi tloušťkou absorbující vrstvy, koncentrací složky a velikostí absorpce (absorbance) [23, 30]. A = e ×c×l ,

kde: A - absorbance e - molární absorpční koeficient [ l × mol -1 × cm -1 ] c - koncentrace [ mol × l -1 ] l - tloušťka kyvety [ cm ]

21

(9)

3.2.5.3 Elektrochemický detektor Tento typ detektoru se hodí zejména pro stanovování velmi nízkých koncentrací látek ovšem za předpokladu, že se jedná o látky s oxidační nebo redukční aktivitou. Měří se zde proud protékající mezi pracovní elektrodou, která je polarizovaná, a pracovní elektrodou. Většinou je součástí i třetí elektroda, referenční neboli srovnávací. Pracovní elektroda může být rtuťová (polarografický princip), uhlíková, platinová nebo z amalgámu. Výhodou těchto detektorů je rychlá odezva a zvýšená citlivost, nevýhodou pak pasivace elektrod a následné čištění [23, 30]. 3.2.5.4 ELS detektor ELS detektor (Evaporative Light Scattering Detector - ELSD) zaznamenává rozptyl světla na částicích analytu, které vznikly zmlžením eluentu a následným odpařením rozpouštědla. Je vhodný hlavně pro látky, které neobsahují chromofor nebo fluorofor jako např. sacharidy, fosfolipidy, mastné kyseliny aj. Eluent (1) vstupuje do zmlžovače (4), kde pomocí inetrního plynu (2) dochází ke zmlžení. Zkondenzovaný eluent je odváděn jako odpadní látka (3) ven ze zmlžovače. Zmlžený eluent spolu se solutem (5) je poté přiváděn do evaporační komůrky (6). V evaporační komůrce se začíná odpařovat mobilní fáze a vznikají zde částečky méně těkavého solutu. V optické komůrce (7) potom dochází k rozptylu světla ze zdroje (8) na částečkách solutu a odezva detektoru je úměrná množství solutu, které paprskem prochází. Jedná se o univerzální detektor s vysokou citlivostí na složení mobilní fáze, je však zcela nespecifický. Jako mobilní fázi je vhodné používat těkavé pufry, např. octany nebo amoniak, protože jak vyplývá z teorie pro ELSD, musí být mobilní fáze těkavější než soluty. ELSD je technikou destruktivní, proto se tento typ detektoru zařazuje až na úplný konec [13,30] .

Obr. č. 9.: ELS detektor [24].

3.3 HILIC metoda Hydrofilní interakční kapalinová chromatografie je chromatografická technika určená pro separaci silně polárních a hydrofilních sloučenin, které mají nízkou nebo vůbec žádnou retenci na reverzní fázi kolony, ale v systémech s normální fází jsou zadržovány až příliš dlouho. Takovými sloučeninami jsou například sacharidy, aminokyseliny či peptidy. HILIC metoda je definována jako chromatografie na normálních fázích ovšem s mobilní fází, která je typická pro systémy s fázemi reverzními. Je založena na principu, kdy analyty interagují s hydrofilní stacionární fází a eluce je prováděna hydrofóbní mobilní fází obsahující větší podíl organické složky a menší podíl složky vodné. Na polárních centrech stacionární fáze dochází k adsorpci vody, což má za následek vznik difúzní vrstvy s gradientem koncentrace vody směrem do mobilní fáze. Stacionární fáze tak funguje jako přenašeč vody [13,20]. 22

Obr. č. 10.: Povrch stacionární fáze modifikované diolovými skupinami [32]. K separaci sloučenin dochází na základě tvorby rovnováhy mezi vodně-organickou mobilní fází a hydrofilní stacionární fází, přičemž platí, že čím větší podíl vody ve stacionární fázi, tím větší je eluce. Zvýšený obsah organické látky naopak snižuje tlak působící na kolonu [27, 33]. Stacionární fáze využívané pro HILIC metodu lze rozdělit do tří skupin: · neutrální – bez elektrostatických interakcí (diol) · nabité – silné elektrostatické interakce (silikagel) · zwitterionty – slabé elektrostatické interakce (sulfobetain) Od roku svého objevení obliba HILIC metody stále roste díky vzrůstajícím požadavkům analýzy polárních látek v komplexních sloučeninách [13, 34].

23

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Využité materiály a zařízení 4.1.1 Chemikálie · Acetonitril (Sigma Aldrich) · Ethanol (Sigma Aldrich) · Methanol (Sigma Aldrich) · Deionizovaná voda 4.1.2 Vzorky · Sacharosa (Sigma Aldrich) · Palatinosa (Sigma Aldrich) · Fruktosa (Sigma Aldrich) · Glukosa (Sigma Aldrich) · Compress B.I.G (Nutrend) (EAN: 8594073174488) o Deklar. složení: maltodextrin, isomaltulosa, dextrosa; 15,7 g/100 g balení · CarboJET TM Gain (Amix) o Deklar. složení: maltodextrin, fruktosa, dextrosa, isomaltulosa; 20,6 g/100 g balení · ISO drink (Nutrend) (EAN: 8594073170224) o Deklar. složení: sacharosa, glukosa, maltodextrin; 85,7 g/100 g balení · Actions WheyGainer (Aminostar) (EAN: 8594046794556) o Deklar. složení: fruktosa, dextrosa, maltodextrin; 71,6 g/100 g balení 4.1.3 Přístroje · Chromatograf (YL9100 HPLC System) · Diolová kolona LiChroCART® 125-4 LiChrospher® 100 DIOL (5 µm) · ELS detektor (1200 Series ELSD, Agilent Technologies) · Automatické pipety 1000 µl a 20 µl (Biohit) · Analytické váhy · Laboratorní sklo · Ultrazvuková lázeň · Odstředivka 4.1.4 Software · Microsoft Excel 2007 · Clarity CDS (Chromatography Data Station) · ChemSketch

4.2 HPLC analýza – podmínky · · · · · · ·

Poměr mobilní fáze acetonitril:H2O - 90:10, izokratická eluce Rychlost průtoku: 2 ml/min Velikost nástřiku: 5 μl Teplota kolony: 10 °C Teplota detektoru: 40 °C Zesílení detektoru (gain): 6 Délka měření: 15 – 20 minut 24

4.3 Příprava standardů Pro tuto práci byly využity celkem čtyři standardy sacharidů o koncentraci 100 mg · ml-1, konkrétně pak standardy fruktosy, glukosy, sacharosy a palatinosy.

Obr. č. 11.: Chromatogram cukerných standardů.

4.4 Příprava kalibračního roztoku palatinosy Kalibrační roztok pro palatinosu byl připraven ze zásobního roztoku (100 mg · ml-1) dle následujícího schématu. Protože použitý ELS detektor nemá lineární odezvu, je v práci použit graf kalibrační křivky po linearizaci. Tabulka č. 2: Koncentrační řada kalibračních roztoků Koncentrace [mg · ml-1] 0,2 0,3

Zásobní roztok [μl]

Voda [μl]

100 60

900 940

0,4 0,8

80 160

920 840

1

200

800

2

400

600

25

Obr. č. 12.: Kalibrační křivka.

4.5 Příprava vzorků Pro izolaci sacharidů z reálného vzorku, který představuje směs látek, byly experimentálně vyzkoušeny dva postupy. První z nich je následující: 1. Bylo naváženo 0,2 g vzorku, navážka byla zředěna 8 ml vody 2. Vzniklá směs byla pomocí ultrazvuku homogenizována 15 minut 3. Z homogenizované směsi bylo odebráno 0,5 ml do Eppendorf zkumavek, do kterých byl dále přidán 1 ml acetonitrilu, případně i roztok čisté palatinosy o koncentraci 100 mg · ml-1 (20, 30 a 40 μl) 4. Směs se nechala znovu homogenizovat po dobu 5 minut, dále byly Eppendorf zkumavky umístěny do odstředivky na 25 minut při maximálních otáčkách 5. Pro analýzu bylo odebráno 0,5 ml supernatantu 6. Vlastní měření probíhalo 15 minut pro vzorky Compress B.IG. (Nutrend), ISO drink (Nutrend), Actions WheyGainer (Aminostar) a 20 minut pro CarboJET GAIN TM (AMIX) , měření bylo prováděno 3x Druhý využitý postup je shodný s výše uvedeným, v bodě 3. je však jako extrakční činidlo využita směs metanolu s vodou. Z experimentálních výsledků se metoda s metanolem ukázala jako účinnější a proto byla využita pro další měření [21].

26

5. VÝSLEDKY A DISKUZE 5.1 Identifikace sacharidů 5.1.1 Compress B.I.G. (Nutrend) Z přiloženého chromatogramu (Obr. č. 13) je patrné, že kromě glukosy je přítomna i palatinosa. Vyšší pík představuje standard tohoto disacharidu [35].

Obr. č. 13.: Chromatogram pro standard palatinosy a reálný vzorek Compress B.I.G.. 5.1.2 CarboJET TM Gain (Amix) Ve vzorku byla stanovena fruktosa, glukosa a další cukry s retenčním časem 14 - 17 minut, které se nám nepodařilo identifikovat. Přestože je u tohoto výrobku palatinosa zmiňována na etiketě i ve složení, její konkrétní obsah uveden není. Dále pak dle Obr. č. 14 lze rozpoznat, že u daného výrobku nebyla přítomnost palatinosy prokázána. Zřejmě proto, že se obsah palatinosy pohyboval pod mezí detekce (LOD), která dle dostupné literatury činí pro cukry 9 mg · l-1 při 10 °C [36, 39].

27

Obr. č. 14: Standard palatinosy a nástřik vzorku CarboJET TM Gain. 5.1.3. ISO drink (Nutrend) U vzorku byl prokázán obsah glukosy a sacharosy. Palatinosa není výrobcem deklarována, což se ověřilo i při experimentálním měření [37].

Obr. č. 15.: Standard palatinosy a nástřik vzorku ISO drink. 28

5.1.4. Actions WheyGainer (Aminostar) Kromě glukosy a fruktosy výrobek obsahuje i cukry, pro které jsme již neměli k dispozici standardy. Stejně jako předchozí vzorek, ani Actions WheyGainer nemá palatinosu deklarovánu. Vzorek obsahuje neznámý sacharid s podobným retenčním časem jako palatinosa. [38].

Obr. č. 16.: Standard palatinosy a nástřik vzorku Actions WheyGainer.

5.2 Stanovení palatinosy Dle výrobců by palatinosu měly obsahovat vzorky Compress B.I.G. (Nutrend) a CarboJET GAIN TM (AMIX). Analýzou bylo zjištěno, že palatinosa se nachází pouze ve vzorku Compress B.I.G. od společnosti Nutrend. 5.2.1 Určení opakovatelnosti Pro metodu stanovení za využití acetonitrilu jako extrakčního činidla byly provedeny čtyři nezávislé extrakce, z nichž byly změřeny plochy píku a následně vyhodnocena odchylka měření. Opakovatelnost je zobrazena na Obr. č. 17.

29

Obr. č. 17.: Měření opakovatelnosti. Tabulka č. 3: Určení odchylky měření. Extrakce: 1 2 3 4 Průměr Směrodatná odchylka Odchylka

Plocha píku 165,259 216,880 207,211 215,642 201,25 24,38 12%

Při samotném měření je tedy nutno počítat s 12 % odchylkou, která bude mít vliv na konečný výsledek. 5.2.2 Vzorky obsahujicí palatinosu Jako jediný ze čtyř vzorků obsahoval palatinosu produkt Compress B.I.G. od společnosti Nutrend.

30

Obr. č. 18.: Chromatogram pro reálný vzorek Nutrend Compress B.I.G. a přídavek palatinosy. Deklarovaný obsah cukrů byl 15,7 g/100 g balení, množství palatinosy ve vzorku bylo experimentálně stanoveno na 12,5 g/100 g balení, což představuje 80 % deklarovaného množství. Nutno však do celkového obsahu zahrnout i ostatní přítomné cukry i námi stanovenou odchylku měření. Přestože je u výrobku CarboJET GAIN TM (AMIX) ve složení jasně vyznačen obsah palatinosy, nebyla její přítomnost prokázána, což lze dokázat přiloženým chromatogramem na obrázku č. Z. Palatinosa zde byla zaznamenána až po přídavku jejího standardu (spiking).

Obr. č. 19.: Chromatogram pro reálný vzorek AMIX CarboJET GAIN palatinosy. 31

TM

s přídavkem

6. ZÁVĚR Ve čtyřech reálných vzorcích se nám podařilo identifikovat základní sacharidy. Ve vzorku Compress B.I.G. (Nutrend) to byla glukosa, palatinosa a neidentifikované cukry, v CarboJET TM Gain (Amix) fruktosa a glukosa, v ISO drink (Nutrend) glukosa a sacharosa a ve vzorku Actions WheyGainer (Aminostar) opět fruktosa a glukosa. Následně jsme stanovili palatinosu ve vzorku Compress B.I.G. (Nutrend) v množství 12,5 g/100 g. Palatinosa zde představuje 80 % vzorku, zbylých 20 % připadá na glukosu a maltodextrin, které jsou udány ve složení výrobcem. Vzhledem k 12 % odchylce měření je výsledek s přesností +/- 1,5 g. U vzorku s deklarovanou palatinosou CarboJET TM Gain (Amix) nebyl disacharid prokázán. Na závěr lze říci, že byla vyvinuta metoda pro detekci základních sacharidů, která umožňuje rychlé ověření složení reálných vzorků za využití nízkých finančních nákladů.

32

7. SEZNAM LITERÁRNÍCH ZDROJŮ [1] VELÍŠEK, Jan. Chemie potravin. Rozš. a přeprac. 3. vyd. Tábor: OSSIS, 2009, xxii, 580 s. ISBN 978-80-86659-17-6. [2] FRASER-REID, Bertram O, Kuniaki TATSUTA a J THIEM. Glycoscience: chemistry and chemical biology I-III. New York: Springer, c2001, s. 53-61. ISBN 354067764x-. [3] VODRÁŽKA, Zdeněk. Biochemie. 2. oprav. vyd. Praha: Academia, 1999, Přer. str. ISBN 80-200-0600-1. [4] KODÍČEK, Milan. Biochemické pojmy: výkladový slovník : elektronická interaktivní verze. Verze 2.0, 2007. Praha: Vydavatelství VŠCHT, 2007, 1 CD-ROM. ISBN 978-80-7080669-2. Dostupné z: http://vydavatelstvi.vscht.cz/knihy/uid_es-002_v1/ [5] POTÁČEK, Milan. Organická chemie: pro biology. 3. opr. vyd. Brno: Masarykova univerzita, 2002, 208 s. ISBN 80-210-2850-5. [6] JANDERA, Pavel. Stationary phases for hydrophilic interaction chromatography, their characterization and implementation into multidimensional chromatography concepts. Journal of Separation Science. 2008, vol. 31, issue 9, s. 1421-1437. DOI: 10.1002/jssc.200800051. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jssc.200800051 [7] KUBÁŇ, Vlastimil a Petr KUBÁŇ. Analýza potravin. Vyd. 1. V Brně: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2007. ISBN 978-80-7375-036-7. [8] HÁLKOVÁ, Jana. Kvantitativní chemická analýza. 2. vyd. Újezd u Brna, 2001, 60 s. ISBN 80-864-9401-2. [9] OPEKAR, František. Základní analytická chemie: pro studenty, pro něž analytická chemie není hlavním studijním oborem. 1. vyd. Praha: Karolinum, 2003, 201 s. ISBN 80-246-0553-8. [10] KAWAGUTI, Haroldo Yukio, Eiric MANRICH, Luciana Francisco FLEURI a Hélia Harumi SATO. Production of glucosyltransferase by Erwinia sp. using experimental design and response surface methodology. Brazilian Journal of Microbiology. 2005, vol. 36, issue 3, s. -. DOI: 10.1590/S1517-83822005000300005. Dostupné z: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext [11] VOLKA, Karel. Analytická chemie II. 1. vyd. Praha: VŠCHT, 1995, 236 s. ISBN 80708-0227-8. [12] http://ciselniky.dasta.mzcr.cz/hypertext/200630/hypertext/AJAOF.htm [online]. [cit. 2014-02-03] [13] NOVÁKOVÁ, Lucie. Moderní HPLC separace v teorii a praxi. 1. vyd. Praha: Lucie Nováková, 2013, 299 s. . ISBN 978-80-260-4243-3. 33

[14] NOVÁKOVÁ, Lucie. Moderní HPLC separace v teorii a praxi II. 1. vyd. Praha: Lucie Nováková, 2013, 235 s. ISBN 978-80-260-4244-0. [15] http://www.4fitness.cz [online]. [cit. 2014-02-03] [16] http://www.vscht.cz/ktk/www_324/lab/texty/ana/TLC2.pdf [online]. [cit. 2014-02-03] [17] Davídek, J. Laboratorní příručka analýzy potravin, Praha: SNTL, 1977 [18] http://www.beneopalatinit.com/en/Food_Ingredients/Isomaltulose/What_is_Isomaltulose/ [online]. [cit. 2014-02-03] [19] http://www.wikiskripta.eu/index.php/Chromatografie [online]. [cit. 2014-02-03] [20] Merck Milipore Czech republic. Merck Milipore [online]. 2013 [cit. 2013-11-25]. Dostupné z: http://www.merckmillipore.cz/chemicals/sequant-zic-hilic-hplccolumns/c_TcGb.s1OJfQAAAEaFMlf.ck9?back=true [21] FLORES, Alarcon. Fast determination of myo-inositol in milk powder by ultra high performance liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. Food Chemistry, (2011), 129(3), 1281-1286. [22] http://web.natur.cuni.cz/~pcoufal/hplc.html [online]. [cit. 2014-02-03] [23] KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. 2., upr. a dopl. vyd. Ostrava: Pavel Klouda, 2003, 132 s. ISBN 80-863-6907-2. [24] http://www.hplc.cz/ [online]. [cit. 2014-02-04] [25] WANG, Xiande, Weiyong LI a Henrik T. RASMUSSEN. Orthogonal method development using hydrophilic interaction chromatography and reversed-phase highperformance liquid chromatography for the determination of pharmaceuticals and impurities. Journal of Chromatography A. 2005, vol. 1083, 1-2, s. 58-62. DOI: 10.1016/j.chroma.2005.05.082. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967305011520 [26] LIU, Xiaodong a Christopher POHL. New hydrophilic interaction/reversed-phase mixedmode stationary phase and its application for analysis of nonionic ethoxylated surfactants. Journal of Chromatography A. 2008, vol. 1191, 1-2, s. 83-89. DOI: 10.1016/j.chroma.2007.12.012. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967307021590 [27] C WEST, C. a E. LESELLIER. Characterisation of stationary phases in subcritical fluid chromatography with the solvation parameter model. Journal of Chromatography A. 2006, vol. 1110, 1-2, s. 200-213. DOI: 10.1016/j.chroma.2006.01.109. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0021967306002652 34

[28] ZEHNÁLEK, Josef. Biochemie 2. Vyd. 1. V Brně: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita, 2003, 200 s. ISBN 978-80-7157-716-4 [29] MCKEOWN, A. P. a M. R. EUERBY. The use of silica for liquid chromatographic/mass spectrometric analysis of basic analytes. Journal of Separation Science. 2001, roč. 24, 10-11. Dostupné z: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/16159314(20011101)24:10/11%3C835::AID-JSSC835%3E3.0.CO;2-5/abstract [30] http://web.natur.cuni.cz/~analchem/bosakova/hplc3.pdf [online] [cit. 2014-02-04] [31] http://www.glsciences.com/ [online] [cit. 2014-02-04] [32] VACEK, Jan, Lucija ONOFREJOVÁ a Vlastimil KUBÁŇ. Využití kapalinové chromatografie založené na hydrofilních interakcích pro separace polárních látek. Chemické listy. Praha: Česká společnost chemická, 2009, č. 103, s. 381-385. Dostupné z: http://www.chemicke-listy.cz/docs/full/2009_05_381-385.pdf [33] HSIEH, Yunsheng. Potential of HILIC-MS in quantitative bioanalysis of drugs and drug metabolites. Journal of Separation Science. 2008, vol. 31, issue 9, s. 1481-1491. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/jssc.200700451 [34] STREGE. Hydrophilic interaction chromatography-electrospray mass spectrometry analysis of polar compounds for natural product drug discovery. Analytical Chemistry Washington. 1998, č. 13, s. 2439-2445. [35] NUTREND D.S. Nutrend [online]. 2006 [cit. 2014-02-21]. Dostupné z: http://shop.nutrend.cz/cz/produkt/compress-big/ [36] Fitness: Pro aktivní život [online]. 2008 [cit. 2014-02-21]. Dostupné http://www.fitness.cz/gainery-nad-2500g/amix-carbojet-gain-4000g-s36951391

z:

Dostupné

z:

[37] NUTREND D.S. Nutrend [online]. /http://shop.nutrend.cz/cz/produkt/isodrinx/

2006

[cit.

2014-02-21].

[38] http://www.fitness007.cz/e-shop/chci-mit-svaly/sacharidy-gainery/aminostar-actionswhey-gainer-4500g [online] [cit. 2014-02-20] [39] PAZOUREK, J., Fast Separation and Determination of free myo-Inositol by Hydrophilic Liquid Chromatography, Carbohydrate Research (2014), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.carres.2014.03.010

35

8. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK DAD

Diode array detector (detektor s diodovým polem)

ELSD

Evaporative Light Scattering Detector (odpařovací detektor rozptylu světla)

HILIC

Hydrophilic interaction liquid chromatography (hydrofilní interakční kapalinová chromatografie)

HPLC

High performance chromatografie)

HPLC-NR

Normal phase HPLC (HPLC se systémem normálních fází)

HPLC-RP

Reverse phase HPLC (HPLC se systémem obrácených fází)

HPTLC

High performance thin layer chromatogramy (vysokoúčinná tenkostěnná kapalinová chromatografie)

LOD

Limit of detection (mez detekce)

PEEK

Polyether ether ketone (polyetherketonová vlánka)

RI

Refractive Index detector (refraktometrický detektor)

TLC

Thin layer chromatography (kapalinová chromatografie na tenké vrstvě)

liquid

chromatography

(vysokoúčinná

kapalinová

36