VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

VZNIK AKRYLAMIDU V POTRAVINÁCH BĚHEM TEPELNÉHO ZPRACOVÁNÍ POTRAVIN

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS

AUTOR PRÁCE AUTHOR

BRNO 2015

VERONIKA ŠNAJDROVÁ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY

VZNIK AKRYLAMIDU V POTRAVINÁCH BĚHEM TEPELNÉHO ZPRACOVÁNÍ POTRAVIN ACRYLAMIDE FORMATION DURING HEAT TREATMENT OF FOODS

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS

AUTOR PRÁCE

VERONIKA ŠNAJDROVÁ

AUTHOR

VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR

BRNO 2015

prof. Ing. PETER ŠIMKO, DrSc.

Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12

Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:

FCH-BAK0906/2014 Akademický rok: 2014/2015 Ústav chemie potravin a biotechnologií Veronika Šnajdrová Chemie a technologie potravin (B2901) Potravinářská chemie (2901R021) prof. Ing. Peter Šimko, DrSc.

Název bakalářské práce: Vznik akrylamidu v potravinách během tepelného zpracování potravin

Zadání bakalářské práce: Studium podmínek vzniku akrylamidu v potravinách

Termín odevzdání bakalářské práce: 22.5.2015 Bakalářská práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.

----------------------Veronika Šnajdrová Student(ka)

V Brně, dne 30.1.2015

----------------------prof. Ing. Peter Šimko, DrSc. Vedoucí práce

----------------------prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Martin Weiter, Ph.D. Děkan fakulty

ABSTRAKT Tato bakalářská práce má rešeršní charakter a zabývá se vznikem akrylamidu během tepelného zpracování potravin. Shrnuje poznatky o mechanismu tvorby akrylamidu, jeho výskytu v potravinách a také o analytických metodách, kterými je moţné akrylamid stanovit. Dále jsou zde popsány vlivy různých látek a podmínek na sníţení obsahu akrylamidu v potravinách.

ABSTRACT The bachelor thesis has a research character and deals with acrylamide formation during the heat treatment of foods. It summarizes findings about the mechanism of acrylamide formation, its occurrence in food and the analytical methods for the assessment as well. Also the effects of different additives and conditions on acrylamide reduction in foodstuffs are described.

KLÍČOVÁ SLOVA Akrylamid, Maillardova reakce, redukující sacharidy, asparagin, sníţení obsahu akrylamidu, GC-MS/MS, HPLC-MS/MS, potraviny

KEYWORDS Acrylamide, Maillardova reaction, reducing sugars, asparagine, acrylamide reduction, GCMS/MS, HPLC-MS/MS, foodstuffs 3

ŠNAJDROVÁ, V. Vznik akrylamidu v potravinách během tepelného zpracování potravin. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2015. 30 s. Vedoucí bakalářské práce prof. Ing. Peter Šimko, DrSc.

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a ţe všechny pouţité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a můţe být vyuţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana FCH VUT.

……………………….. podpis studenta

PODĚKOVÁNÍ Děkuji vedoucímu mé bakalářské práce prof. Ing. Peteru Šimkovi, DrSc. za vstřícný přístup, rady a připomínky při psaní této bakalářské práce. 4

OBSAH 1

ÚVOD .................................................................................................................................. 6

2

SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY ......................................................... 7 2.1 Historie ........................................................................................................................... 7 2.2 Charakteristika akrylamidu ............................................................................................ 7 2.3 Pouţití............................................................................................................................. 8 2.4 Mikrobiální produkce a biodegradace akrylamidu ......................................................... 8 2.5 Mechanismus vzniku a syntéza ...................................................................................... 8 2.5.1 Vznik akrylamidu z asparaginu Maillardovou reakcí .............................................. 8 2.5.2 Hypotetický vznik akrylamidu z lipidů .................................................................. 11

3

METODY STANOVENÍ ................................................................................................. 12 3.1 Metody zaloţené na plynové chromatografii (GC) ...................................................... 12 3.1.1 Metody GC s derivatizací ....................................................................................... 12 3.1.2 Přímá analýza (bez derivatizace) ............................................................................ 13 3.2 Metody zaloţené na vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) ..................... 13 3.2.1 HPLC metody s derivatizací .................................................................................. 13 3.2.2 HPLC metody bez derivatizace .............................................................................. 14

4

VÝSKYT V POTRAVINÁCH ........................................................................................ 15

5

ELIMINACE AKRYLAMIDU ....................................................................................... 17 5.1 Asparagin a redukující sacharidy ................................................................................. 17 5.1.1 Produkty z brambor ................................................................................................ 17 5.1.2 Produkty z obilovin ................................................................................................ 17 5.1.3 Káva ....................................................................................................................... 18 5.2 Vliv antioxidantů .......................................................................................................... 18 5.2.1 Rozmarýn a třemdava ............................................................................................. 18 5.2.2 Flavonoidy .............................................................................................................. 19 5.3 Enzym asparagináza ..................................................................................................... 20 5.3.1 Produkty z brambor ................................................................................................ 20 5.3.2 Produkty z obilovin ................................................................................................ 21 5.3.3 Káva ....................................................................................................................... 21 5.4 Přídavek kationtů.......................................................................................................... 21 5.5 Praţení kávy ................................................................................................................. 21 5.6 Vliv pH ......................................................................................................................... 22 5.7 Fyzikální metody - teplota, obsah vody, doba zpracování ........................................... 22 5.8 Kypřící činidla .............................................................................................................. 22 5.9 Fermentace ................................................................................................................... 23 5.10 Přídavek aminokyselin a sacharidů .............................................................................. 23 5.11 Vliv NaCl a jeho aditiv................................................................................................. 23

6

ZÁVĚR .............................................................................................................................. 26

7

SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ ................................................................................ 27

8

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK............................................................................. 30

5

1

ÚVOD

V současné moderní době se zvýšilo pouţívání chemikálií, které znečišťují krajiny po celém světě. Ve srovnání s minulým stoletím se světová výroba zvýšila 400 krát. Vysoké riziko pochází z chemických výrobních závodů, kde dochází k expozici těkavých organických sloučenin. Ročně jsou ztraceny miliony hektarů zemědělské půdy v důsledku vzniku nebezpečných odpadů a toxických chemikálií [1]. Několik stovek chemických sloučenin se do poţivatin, pokrmů a také do krmiv pro hospodářská zvířata přidává záměrně jako přídatné neboli aditivní látky. Cílem je zvýšení některých aspektů kvality poţivatin [2]. V důsledku lidských aktivit v zemědělství, v průmyslu a při jiných činnostech vstupují neţádoucí chemické látky do potravního řetězce člověka. Dochází ke kontaminaci nejen ovzduší, půdy a vody, ale také potravin. Dále pak existují některé další neţádoucí sloučeniny vznikající ze sloţek potravin [2]. Podle toho se ve vztahu k poţivatinám někdy rozlišují kontaminanty primární (exogenní) a kontaminanty endogenní. Zvláštním případem je kontaminace toxiny mikroorganismů. Mezi exogenní kontaminanty, pocházející z vnějšího prostředí, můţeme zařadit například rezidua pesticidů. Naopak kontaminanty endogenní mohou vznikat za určitých okolností z přirozených sloţek během zpracování a skladování [2]. Příkladem je akrylamid, který vzniká v potravinách právě při jejich tepelném zpracování. Jedná se o úpravu potravin při teplotách vyšších neţ 120 °C [3]. Vyskytuje se v produktech potravin, jako je například káva, pečivo a brambory [4]. Sledováním potravin obsahujících akrylamid se věnují mnohé světové laboratoře [3]. Akrylamid byl na základě karcinogenních účinků zařazen mezi pravděpodobné lidské karcinogeny do skupiny 2A [5]. Následující kapitoly jsou zaměřeny na problematiku této toxické sloučeniny.

6

2

SOUČASNÝ STAV ŘEŠENÉ PROBLEMATIKY

2.1 Historie Akrylamid jako důleţitý průmyslový monomer je komerčně vyuţíván od poloviny 50. let 20. století. Výroba monomeru akrylamidu začala v roce 1955 a průmyslová polymerizace v roce 1965 [6]. Tato sloučenina patří mezi substituované monomery olefinu, které byly na počátku roku 1970 testovány z důvodu karcinogenity u pokusných zvířat kvůli výskytu neobvyklého typu rakoviny (angiosarkom jater). Tento typ rakoviny se vyskytl u zaměstnanců v továrnách, kteří byli vystaveni jinému důleţitému monomeru vinyl chloridu [5]. V roce 1980 bylo publikováno několik studií potvrzujících karcinogenitu akrylamidu u myší a potkanů [5]. Roku 1986 byly zveřejněny studie o úmrtnosti 371 zaměstnanců, kteří byli potenciálně vystaveni expozici akrylamidu během výroby monomeru a průmyslové polymerizace akrylamidu v průmyslové továrně v Michiganu [6]. V roce 1991 Vědecký výbor pro potraviny (SCF) hodnotil akrylamid jako monomer při styku s potravinami a dospěl k závěru, ţe akrylamid je genotoxický karcinogen [7]. V roce 1994 byl akrylamid klasifikován Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny (IARC) jako pravděpodobný lidský karcinogen (skupina 2A) [5]. Dne 24. dubna 2002 publikovala Švédská národní potravinová správa (NFA) ve spolupráci se Stockholmskou univerzitou [8] výsledky výzkumu o vzniku akrylamidu, toxické a potenciálně rakovinotvorné sloučenině, v mnoha druzích potravin připravených při vysokých teplotách [9]. Přestoţe byl akrylamid komerčně vyráběn po mnoho let pro různé technické účely, zjištění, ţe můţe být neúmyslně vytvořen také při zpracování potravin, bylo novým poznatkem [10]. O svých poznatcích informovala NFA regionální a mezinárodní orgány a organizace, aby mohla být zahájena mezinárodní spolupráce. S ohledem na obavy vyjádřené členskými státy, bylo svoláno zasedání Organizace pro výţivu a zemědělství (FAO) a Světová zdravotnická organizace (WHO). Zasedání se konalo v Ţenevě 25. - 27. června 2002 [9]. Cílem bylo plně posoudit míru rizika akrylamidu v potravinách pro veřejné zdraví [7]. 28. března 2003 se konal v Bruselu seminář s názvem „Výzkum akrylamidu v potravinách“ [7, 11]. Přibliţně 70 odborníků z EU a Severní Ameriky diskutovali o současných poznatcích s cílem identifikovat mezery a tam, kde je to vhodné a moţné doporučit řešení. Tato řešení se soustředí na koordinaci výzkumu zaměřeného na minimalizaci akrylamidu v potravinách [11].

2.2 Charakteristika akrylamidu Akrylamid (CH2=CH–CONH2, známý také jako prop-2-enamid) je pevná krystalická látka bez barvy a zápachu s teplotou tání 84,5 °C [12]. Bod varu je 136 °C při tlaku 3,3 kPa a molekulová hmotnost 71,08 g∙mol-1. Je rozpustný ve vodě, acetonu, ethanolu, methanolu, diethyletheru, ethyl acetátu, chloroformu a velmi málo rozpustný v heptanu. Při pokojové teplotě je stabilní, ale polymerizuje táním nebo vystavením ultrafialovému záření [6]. Vzniká

7

hydratací akrylonitrilu. Má vysokou mobilitu v půdě a v podzemních vodách je biologicky odbouratelný [12].

2.3 Použití Komerčně vyráběný akrylamid je pouţíván jako chemický meziprodukt při výrobě a syntéze polyakrylamidu [10]. Pro schopnost selektivně modifikovat SH skupiny ve strukturních i funkčních proteinech má široké vyuţití ve vědeckých výzkumech. Polyakrylamidové polymery a kopolymery jsou pouţívány v papírenském a textilním průmyslu k výrobě papíru a barviv, v těţebním průmyslu při zpracování rud, ke stabilizaci půdy, v kosmetice, dále jako flokulanty při čištění odpadních vod, zahušťovadla, zemědělské postřiky. Polyakrylamidové gely jsou uplatňovány také ve výzkumných laboratořích k elektroforetické separaci proteinů a jiných sloučenin [6, 12]. Akrylamid je součástí také tabákového kouře, coţ naznačuje, ţe můţe být vytvořen zahříváním biologického materiálu [10].

2.4 Mikrobiální produkce a biodegradace akrylamidu Mikroorganismy produkují enzymy, které katalyzují jak syntézu, tak biodegradaci akrylamidu. Mezi mikrobiální enzymy Rhodococcus rhodochrous patří nitrilhydratázy, amidázy, glutaminsyntetázy a dehydrogenázy. Enzym nitrilhydratáza produkovaný rodem Nocardia katalyzuje hydrolýzu akrylonitrilu na akrylamid. Enzym amidáza, který byl také izolován z Klebsiella pneumoniae, akrylamid degraduje. Akrylamid je také dobrým substrátem pro amidázy produkované lidským ţaludečním patogenem Helicobacter pylori [12].

2.5 Mechanismus vzniku a syntéza Akrylamid je malá a jednoduchá molekula. Můţe být vytvořena v potravinách při jejich zahřívání několika různými mechanismy, které mohou vést k reakcím sacharidů, proteinů a aminokyselin, lipidů a případně dalších minoritních sloţek potravin. S největší pravděpodobností závisí variabilita reakčních mechanismů na sloţení potravin a podmínkách zpracování [9]. Mezi nejvýznamnější a zároveň nejrozšířenější chemické reakce probíhající během skladování a zpracování patří reakce redukujících sacharidů s aminosloučeninami. V průběhu těchto reakcí vzniká řada velmi reaktivních karbonylových sloučenin, které reagují vzájemně a také s přítomnými aminosloučeninami. Soubor reakcí se obecně označuje jako Maillardova reakce. Průvodním jevem těchto reakcí je vznik hnědých pigmentů melanoidinů, a proto se tyto reakce nazývají reakce neenzymového hnědnutí [13]. Zároveň dochází ke vzniku důleţitých ţádoucích senzoricky aktivních sloučenin, které dodávají produktům charakteristické zbarvení, chuť a vůni, ale i k tvorbě některých toxických sloučenin s mutagenními a karcinogenními vlastnostmi [3]. 2.5.1 Vznik akrylamidu z asparaginu Maillardovou reakcí První detailní pohled na tvorbu akrylamidu poskytli Zyzak a kol. [14] a Yaylayan a kol. [15], potvrzující hypotézu Stadlera a kol. [16] a Mottrama a kol. [17], ţe akrylamid je vytvořen v Maillardově reakci z asparaginu a karbonylových zdrojů (redukujících sacharidů) [18]. I kdyţ můţe být v zásadě asparagin převeden na akrylamid tepelně indukovanou 8

dekarboxylací a deaminací, v praxi jsou pro ovlivnění přeměny asparaginu na akrylamid sacharidy nezbytné [18, 15]. Stadler a kol. publikovali (viz Obr. 1) vznik asparagin-N-glykosidu nebo Schiffovy báze, původních produktů interakce mezi glukózou a asparaginem, jako přímých prekurzorů akrylamidu [14]. V podmínkách s niţším obsahem vody jsou obě sloučeniny relativně stabilní, nicméně ve vodném prostředí můţe Schiffova báze hydrolyzovat na prekurzory anebo podléhat přesmyku za vzniku Amadoriho produktu (Obr. 1, dráha I) [19]. Alternativně můţe Schiffova báze podléhat dekarboxylaci na azometin ylid, který po tautomerizaci vede ke vzniku dekarboxylovaného Amadoriho produktu (Obr. 1, dráha II) [20]. Yaylayan a kol. navrhli mechanismus zaloţený na schopnosti iminů (nebo Schiffových betainů) vznikajících mezi aminokyselinami a aldehydy podléhat intramolekulární cyklizaci iniciované karboxylátovým aniontem a tvorby oxazolidin-5-onu (Obr. 1, dráha IIb) [14]. Snadnou dekarboxylací oxazolidin-5-onu se získá stabilní meziprodukt azomethin ylid, který snadno podléhá nevratnému 1,2-prototropnímu posunu za vzniku dekarboxylované Schiffovy báze a dekarboxylovaného Amadoriho produktu. I kdyţ můţe být dekarboxylovaný meziprodukt vytvořen za mírných podmínek, k odštěpení kovalentní vazby C-N můţe vyţadovat vyšší teploty a následně pak produkovat akrylamid [14].

Obr. 1: Vznik akrylamidu z asparaginu a zdroje karbonylu [18, 20]

9

Zyzak a kol. navrhli dvojí způsob reakce dekarboxylované Schiffovy báze [14]. Buď můţe hydrolyzovat a uvolňovat meziprodukt 3-aminopropionamid, jehoţ tepelnou degradací, odstraněním amoniaku, vzniká akrylamid. Nebo podléhat 1,2-eliminaci za přímého vzniku akrylamidu (viz Obr. 2) [14, 18].

Obr. 2: Dvojí způsob reakce dekarboxylované Schiffovy báze [14]

Na tvorbě akrylamidu se mohou podílet jakékoliv karbonylové sloučeniny, ale asparagin raději podléhá intramolekulární cyklizaci za vzniku imidu (3-aminosukcinimidu a následně maleinimidu) neţ dekarboxylaci [3, 14, 15] (viz Obr. 3). NH2 NH2 O

N

- NH3

O

O

- H2O

NH2 O

O

N

O

H 3-aminosukcinimid

H maleinimid

akrylamid

- NH3

- H2O

COOH

NH2

- NH3

COOH

O

NH2

- CO2

NH2 O

asparagin

Obr. 3: Tepelná degradace asparaginu [15]

10

NH2

2.5.2 Hypotetický vznik akrylamidu z lipidů Jasuhara a kol. [21] z výsledků získaných ve své studii navrhli hypotetický vznik akrylamidu, jehoţ schéma je znázorněno na Obr. 4. Při vysokých teplotách vzniká z lipidů (triglyceridů) glycerol, jehoţ tepelnou degradací dochází k tvorbě akroleinu. Akrolein se oxiduje na kyselinu akrylovou, která následně reaguje s amoniakem, vznikajícím pyrolýzou sloučenin obsahující dusík a vede k tvorbě akrylamidu [21, 22]. Nebo pak při vysokých teplotách akrylový radikál, vytvořený homolytickým štěpením akroleinu, absorbuje aminový radikál (z aminokyselin) a tím poskytuje akrylamid. V obou případech můţe být akrolein tvořen také ze sloučeniny obsahující tří uhlíkovou jednotku (mastné kyseliny) [21]. Zjištění ukazují, ţe amoniak a akrolein by mohl hrát důleţitou úlohu při tvorbě akrylamidu v potravinách bohatých na lipidy. Nicméně tyto alternativní mechanismy vzniku musí být ještě prokázány v reálných systémech potravin [7]. CH2 OH O CH2 O CH

O

CH OH

C O

R1

C

R2

O C



CH2 OH glycerol

CHO CH CH2

(O)

R3

COOH NH3

CH



CH CH2

kyselina akrylová

akrolein



R2COOH

akrylamid NH2

R3COOH

lipid (triglycerid)

CONH 2

CH2

R1COOH

O CH2

- 2H2O

O tří uhlíkovájednotka

mastné kyseliny

H2C CH C

Obr. 4: Hypotetický vznik akrylamidu z lipidů [21]

Yaylayan a kol. uvedli vznik akrylamidu z dipeptidu karnosin při zahřívání masa [18]. Hydrolýzou karnosinu v masných výrobcích se uvolňuje β-alanin [14]. Pyrolýzou β-alaninu vzniká kyselina akrylová, která reaguje s amoniakem (vznikajícího v důsledku Streckerovy degradace aminokyselin) a poskytuje akrylamid [15, 18] (viz Obr. 5). Důvodem, proč akrylamid v masných výrobcích nelze nalézt nebo lze, ale velmi málo, je, ţe akrylamid ochotně tvoří methylové deriváty s ještě neznámými toxikologickými účinky [18]. OH O

NH2 -alanin

NH2

OH

- NH3

- NH3 O akrylová kyselina

O akrylamid

Obr. 5: Hydrolýza β-alaninu [15]

11

3

METODY STANOVENÍ

S rozšířením průmyslového vyuţití akrylamidu byly vyvinuty metody pro jeho analýzu. Ty však nebyly dostatečně citlivé pro stanovení relativně malého obsahu (μg∙kg-1 a ppb) v potravinách [4]. Pro stanovení akrylamidu jsou pouţívány analytické metody jako plynová chromatografie (GC), vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC), hmotnostní spektrometrie (MS) a jejich kombinace [12]. Nejčastěji vyuţívanými technikami jsou plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) a kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS) [4, 9]. Bylo zjištěno, ţe příprava vzorků a extrakce má velký vliv na výtěţnost akrylamidu naměřeného ve vzorcích potravin. Rutinní postup přípravy vzorků před instrumentální analýzou zahrnuje homogenizaci vzorku, přídavek vnitřního standardu (IS), odmaštění, extrakci, zahuštění a vyčištění [23]. Přídavek vnitřního standardu ke vzorku potravin je ţádoucí, protoţe poskytuje obnovu případných ztrát a pomáhá zajistit spolehlivost výsledků [17]. Obvykle pouţívanými vnitřními standardy pro stanovení akrylamidu jsou izotopově značené vnitřní standardy, jako je deuteriem značené (2H3-AA nebo d3-AA) nebo uhlíkem značené (13C3-AA) a neizotopově značené vnitřní standardy jako methakrylamid, N,N-dimethylakrylamid a acetamid [23]. Při přípravě vzorku pro detekci akrylamidu se v řadě potravin jeví jako nejkritičtější parametry podmínky extrakce. Extrakce můţe být provedena vodou, která je vysoce účinným extrakčním rozpouštědlem, protoţe akrylamid je velmi hydrofilní a vysoce rozpustný ve vodě. Voda je často pouţívána k extrakci akrylamidu při pokojové teplotě, neboť minimalizuje rozpouštění hydrofobních sloučenin v potravinářských produktech a také společnou extrakci dalších neţádoucích látek v matrici (např. solí, proteinů, sacharidů), které by mohly zasahovat do detekce a degenerovat chromatografický systém. Pro dosaţení lepší penetrace extrakčního rozpouštědla do potravinové matrice je někdy pouţívána zvýšená teplota. Kromě vody jako extrakčního činidla mohou být také pouţity rozpouštědla organická, jako jsou n-propanol, methanol, aceton a acetonitril [23].

3.1 Metody založené na plynové chromatografii (GC) Techniky plynové chromatografie pro stanovení akrylamidu v potravinových matricích jsou zaloţeny na derivatizaci analytu nebo na přímé analýze bez derivatizace [23]. Vzhledem k nízké těkavosti a polaritě akrylamidu je většina metod GC zaloţena na derivatizaci [4, 23]. 3.1.1 Metody GC s derivatizací Nejpouţívanější metodou derivatizace akrylamidu před GC analýzou je jeho bromace [23]. Bromace probíhá při nízkém pH a analýza bromovaných vzorků při vysokých teplotách [25]. Akrylamid je derivatizován bromací na dvojnou vazbu ethylenu za vzniku derivátu 2,3dibrompropionamidu [25], který má zlepšené GC vlastnosti [9]. Derivát akrylamidu je identifikován svým retenčním časem a poměrem charakteristických hmotností (MS) iontů [9]. Bromace do vodného extraktu akrylamidu se provádí přidáním připraveného bromačního činidla sestávajícího z nasyceného roztoku bromu (Br2), bromidu draselného (KBr) a kyseliny bromovodíkové (HBr). Nebo také ve směsi KBr + KBrO3 v kyselém prostředí, která je bezpečnější [4, 23]. Bromace se provádí v chladničce nebo na ledě v temnu [23]. Po deri12

vatizaci se přebytek bromu neutralizuje přidáním roztoku thiosíranu sodného a nepolární derivát se extrahuje extrakcí kapalina-kapalina v organickém rozpouštědle, např. ethylacetátu. Tento organický extrakt můţe být podroben dalšímu vyčištění [4]. Produkt bromace 2,3-dibromopropionamid je poměrně nestabilní a můţe se rozkládat v GC injektoru na 2-brompropenamid. Přidáním triethylaminu se získá 2-bromopropenamid, který pak představuje cílový analyt. GC kolony pouţívané pro analýzu brom-derivátu jsou středně polární aţ polární (DB-17 a ZB-WAX) [4, 23]. Kvantitativní metoda GC-MS byla vyvinuta pro stanovení stopových koncentrací (< 50 μg∙kg-1) v potravinách z obilovin [23]. 3.1.2 Přímá analýza (bez derivatizace) Navzdory tomu, ţe přímá analýza nederivatizovaného akrylamidu pomocí GC-MS je méně pracná, pouţívá se jen zřídka. Přímá analýza GC-MS volného akrylamidu, izolovaného z komplexní potravinové matrice, je vţdy spojena s různými problémy [23]. Příčinou je nedostatek charakteristických iontů v hmotnostním spektru nederivatizovaného akrylamidu (vzhledem k nízké molekulové hmotnosti) a interference způsobené matricí, coţ zvyšuje na pozadí šum, a proto není moţné získat nízký limit detekce [33]. Dalším problémem je riziko tvorby akrylamidu v zahřátém GC injektoru, zejména jsou-li přítomny ve výsledném extraktu prekurzory akrylamidu (asparagin a redukující sacharidy) [4, 33]. Také vysoká rozpustnost akrylamidu ve vodě ve srovnání s organickými rozpouštědly komplikuje přípravu vzorku pro GC analýzu [23]. Řešením můţe být aplikace GC-MS/MS umoţňující sníţení interference; extrakce n-propanolem následovaná výměnou rozpouštědla acetonitrilu zabraňující společně izolaci prekurzorů akrylamidu, které by mohly vést k další tvorbě v GC injektoru; nebo derivatizace akrylamidu s následnou extrakcí z vodné fáze do ethylacetátu [23].

3.2 Metody založené na vysokoúčinné kapalinové chromatografii (HPLC) Analýzu vyčištěných extraktů akrylamidu lze provést přímo pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC). Pro detekci se pouţívá UV i MS. Vzhledem k tomu, ţe akrylamid postrádá chromogenní skupinu, při měření UV musí být pouţita nízká vlnová délka (195 – 205 nm), která je zcela univerzální pro celou řadu nenasycených molekul. Nedávné studie věnovaly větší pozornost pouţití techniky LC-MS/MS pro rutinní analýzu akrylamidu, protoţe tato chromatografická metoda má vysokou citlivost, selektivitu, jednoduchost a zbavuje kroku derivatizace [23]. 3.2.1 HPLC metody s derivatizací Vzhledem k tomu, ţe je akrylamid velmi polární molekulou vysoce rozpustnou ve vodě, jeho zadrţení na konvenční reverzní fázi sorbentu je špatné a následkem je nevyhovující separace mezi akrylamidem a společnými extrakty z matrice. Derivatizace akrylamidu řeší problém špatného zadrţení na RP-HPLC koloně (chromatografie s reverzní fází) a zabraňuje interferenci společně extrahovaných látek. Proces derivatizace také zvyšuje selektivitu a citlivost v instrumentální analýze [23]. Jedna z metod derivatizace akrylamidu spočívá v pouţití kyseliny 2-merkaptobenzoové v zásaditém prostředí. Přebytek činidla je odstraněn působením octanu olovnatého následo-

13

vaný extrakcí kapalina-kapalina ethylacetátem. Pro analýzu LC/MS byla pouţita kolona Luna fenyl-Hexyl a pro HPLC-UV/VIS pak kolona C18 [23]. Další způsob je zaloţen na derivatizaci akrylamidu bromičnanem draselným (KBrO3) a bromidem draselným (KBr) v kyselém prostředí. Konečný analyt 2-brompropanamid je analyzován pomocí HPLC-DAD na koloně ODS-3 C18. Limit detekce byl odhadnut na 15 μg∙kg-1 [23, 24]. 3.2.2 HPLC metody bez derivatizace Většina metod pro stanovení akrylamidu je zaloţena na spojení kapalinové chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií (HPLC-MS/MS nebo LC-MS/MS) a analyzována pouţitím ionizace elektrosprejem (ESI) v pozitivním modu. Příkladem kolon vyuţívaných k chromatografické separaci jsou například Atlantis dC18, AQASIL C18, Hypercarb nebo Alltima HP C18 amide [23].

14

4

VÝSKYT V POTRAVINÁCH

Akrylamid není přítomen v nativních (syrových) ingrediencích, jako jsou například syrové brambory. Vzniká v průběhu tepelného zpracování potravin bohatých na sacharidy při zvýšených teplotách, obvykle 120 °C nebo výše, během smaţení, opékání, pečení, praţení nebo grilování. Potraviny získané z rostlinných sloţek, jako jsou brambory a obiloviny, mají nejvyšší obsah akrylamidu. To je dáno především přítomností přirozených reakčních sloţek (glukóza/fruktóza a asparagin), podílejících se na tvorbě akrylamidu. Masné výrobky obsahují málo nebo neobsahují ţádný akrylamid kvůli nedostatku těchto potřebných reakčních sloţek [4]. Akrylamid byl nalezen téměř ve všech dosud analyzovaných potravinách, coţ zvyšuje pravděpodobnost, ţe by mohl být přítomen i v jiných poloţkách potravin, které dosud ještě analyzovány nebyly [9]. Vypočtený průměrný příjem akrylamidu se pohybuje od 0,3 aţ 0,6 mg∙kg-1 tělesné hmotnosti za den pro dospělé, zatímco děti a dospívající mají tendenci přijímat v potravě více akrylamidu (0,4 aţ 0,6 mg∙kg-1). Lze to přičíst kombinaci vyššího kalorického příjmu a jejich vyšší spotřebě potravin bohatých na akrylamid, jako jsou hranolky a bramborové lupínky. Potraviny s největším příspěvkem příjmu akrylamidu se liší země od země, v souladu s vnitrostátními stravovacími zvyklostmi a způsoby přípravy potravin. Obecně platí, ţe výrobky z brambor, kávy a pečiva jsou nejdůleţitějšími zdroji. Například v Německu představuje chléb a pečivo asi 25 % příjmu akrylamidu vzhledem k vysoké spotřebě téměř 240 g na den [18]. I kdyţ má potravinářský produkt nízký obsah akrylamidu, ale je spotřebováván často nebo ve velkých mnoţstvích, můţe se stát i hlavním přispěvatelem (např. káva). Ve Spojených státech bylo odhadnuto, ţe k potravinám, které obsahují akrylamid přispívá 38 % denních kalorií, 36 % vlákniny, 33 % sacharidů a více neţ 25 % stopových prvků [4]. Krátce po oznámení výskytu akrylamidu v potravinách byla uznána nutnost sledovat a shromaţďovat údaje o výskytu a rozsahu akrylamidu v potravinách. To vedlo k zaloţení monitorovacích databází akrylamidu, a to zejména v Evropě a ve Spojených státech [4]. Akrylamid se v ţádné formě do potravin nepřidává. Z vnějšího prostředí se do potravin můţe dostat kontaminací z obalového materiálu nebo pitné vody. Avšak koncentrace akrylamidu z těchto zdrojů je velmi nízká, pohybuje se v rozsahu 15 – 350 μg∙kg-1 [3]. Dalším zdrojem je kouření, které významně zvyšuje příjem akrylamidu 1 – 2 mg na cigaretu [18]. Příklady různých potravin a potravinových skupin s jejich obsahem akrylamidu (μg∙kg-1) uvádí Tabulka I. Tabulka I: Přehled obsah akrylamidu v různých skupinách potravin [4]

potraviny/potravinové skupiny brambory (syrové) bramborové chipsy/lupínky hranolky/chipsy pečivo a sušenky chléb chléb (opékaný) snídaňové cereálie

obsah akrylamidu [μg∙kg-1] < 10 – < 50 117 – 4 215 59 – 5 200 18 – 3 324 < 10 – 3 200 25 – 1 430 < 10 – 1 649

15

ostatní ovocné a zeleninové produkty čokoládové produkty praţená káva kávová náhraţka kávový extrakt/prášek maso mléčné výrobky dětská a kojenecká výţiva

16

< 10 – 70 < 2 – 826 45 – 935 80 – 5 399 87 – 1 188 < 10 – 116 < 10 – 100 < 10 – 130

5

ELIMINACE AKRYLAMIDU

Obsah akrylamidu je ovlivněn mnoha faktory, jako je počáteční koncentrace reaktantů a prekurzorů, jejich poměru, podmínek zpracování (doba ohřevu, teplota, obsah vody v surovině, pH, přítomnost aditiv). Obsah vytvořeného akrylamidu závisí také nejen na druhu potravin, ale také na podmínkách skladování surovin a kultivačních podmínkách [26]. Hlavním problémem redukce akrylamidu je sníţit jeho obsah v potravinách a zároveň zachovat zvláštnosti kvality daných potravin [27].

5.1 Asparagin a redukující sacharidy Přítomnost prekurzorů v potravinách je nezbytná pro tvorbu akrylamidu. Tyto prekurzory zahrnují aminokyseliny (jako je volný asparagin, alanin, arginin, kyselina asparagová, cystein, glutamin, methionin, threonin, valin) a mono- nebo disacharidy (jako jsou redukující sacharidy glukóza a fruktóza a neredukující sacharid sacharóza), hladiny, které do značné míry závisí na genetických a environmentálních faktorech. Proto druhy a kultivary potravinářských surovin, zemědělské systémy, doba sklizně, doba uchovávání a teplota, vše můţe mít do určité míry vliv na konečné hladiny prekurzorů akrylamidu [27]. 5.1.1 Produkty z brambor Kontrola sacharidu v hlízách brambor a konečná teplota smaţení a pečení je dnes v hotových bramborových produktech povaţována za nejúčinnější opatření vedoucí ke sníţení akrylamidu. V případě kontroly sacharidu je třeba dávat pozor na výběr odrůdy brambor, dodrţování agronomie osvědčenými postupy, zralost hlíz při sklizni, výběr šarţe na bázi sacharidů, posouzení barvy a na skladovacích podmínkách pro hlízy (> 6 °C). V hlízách brambor je asparagin dominantní volnou aminokyselinou přispívající 33 % – 59 % z celkového obsahu volné aminokyseliny. Hlízy obsahují vysoké koncentrace asparaginu při vystavení vysokého obsahu dusíku v půdě, ale zvýšení pozitivně koreluje se všemi aminokyselinami, kromě asparaginu [4]. 5.1.2 Produkty z obilovin Asparagin, spíše neţ redukující sacharidy, je hlavní determinant tvorby akrylamidu u výrobků z obilných zrn a jeho koncentrace v zrnech se velmi liší. Rozsahy asparaginu u pšenice jsou obvykle 69 – 443 mg∙kg-1, s mírně vyššími hodnotami vykazovanými v ţitě (319 – 791 mg∙kg-1). Studie modelových systémů a různých produktů z obilovin/pečiva ukázaly, ţe koncentrace asparaginu v zrnech nebo těstě je v přímé korelaci s obsahem akrylamidu v konečných produktech. V pšeničných produktech však tvorba akrylamidu není určena obsahem sacharidů. Z tohoto důvodu můţe být kontrola nebo specifikace asparaginu v zrnech schůdnou cestou vedoucí ke sníţení obsahu akrylamidu v obilovinách, coţ ale dnes není moţné z důvodu velké variability odrůd (v rámci i mezi odrůdami), významného vlivu růstových podmínek a faktorů ţivotního prostředí [4]. Proto jsou agronomická opatření ke zmírnění obsahu akrylamidu omezená a doposud jediným adekvátním řešením, které lze doporučit, aby se předešlo přebytečnému skladování asparaginu, je hnojení pšenice a ţita sírou [4].

17

Nepříznivé povětrnostní podmínky mohou vést k pučení, coţ je váţný problém ve výrobě obilovin. V důsledku toho mohou být aktivity proteázy téměř dvojnásobné, a tím dochází k podstatně vyššímu obsahu asparaginu v mouce z klíčících zrn pšenice. Vzhledem k tomu, ţe asparagin je limitující prekurzor v produktech z obilí, hladiny akrylamidu v chlebech vyrobených z této mouky jsou také výrazně vyšší. Z tohoto důvodu by mouky z naklíčené pšenice nebo ţita neměly být pouţity pro pekařské výrobky, a to i kdyţ jsou smíchány s jinými moukami [18]. 5.1.3 Káva Produkty z kávy jsou bohaté jak na asparagin, tak sacharózu, během praţení kávy je sacharóza rozdělena na redukující sacharidy glukózu a fruktózu. Nicméně praţením různých kávových zrn za stejných podmínek jsou získány různé úrovně akrylamidu [27].

5.2 Vliv antioxidantů Je dobře známo, ţe melanoidiny jako reprezentativní skupiny konečných produktů Maillardovy reakce mají silné antioxidační účinky. V poslední době mnozí badatelé prokázali úzký vztah mezi antioxidačními účinky produktů Maillardovy reakce a tvorbou akrylamidu v různých potravinových matricích. V mechanistickému pohledu mohou antioxidanty inhibovat vznik akrylamidu tím, ţe brání oxidaci lipidů, coţ omezuje hromadění karbonylů [28]. 5.2.1 Rozmarýn a třemdava Byl zkoumán vliv antioxidantů na tvorbu akrylamidu při tepelném zpracování potravin v pšeničném pečivu přídavkem koření rozmarýnu a třemdavy do těsta před pečením. Jak je známo, rozmarýn a třemdava mají antioxidační vlastnosti a jsou pouţívány v mnoha typech potravin. Obsah akrylamidu byl sníţen v pšeničném pečivu přidáním rozmarýnu buď ve formě vodného výluhu jako rozmarýnový olej nebo sušených listů [29]. Bylo zjištěno, ţe i malé mnoţství rozmarýnu významně sniţuje obsah akrylamidu v pšeničném pečivu. Pokud byl přidán 1% extrakt z rozmarýnu odpovídající mnoţství rozmarýnového oleje nebo listů rozmarýnu, ve srovnání s pšeničným pečivem připraveným bez rozmarýnu se sníţil obsah akrylamidu o 62, 67 a 57 %. Zvýšení přídavku vodného extraktu rozmarýnu aţ o 10 % nezpůsobil další sníţení obsahu akrylamidu, ani podobné zvýšení přídavku pro rozmarýnový olej a listy [29]. Vodný extrakt z třemdavy ukázal menší účinek vlivu na tvorbu akrylamidu v pšeničném pečivu neţ rozmarýn, a dokonce mírně zvýšil tvorbu akrylamidu. Třemdava patří do čeledi Labiatae jako rozmarýn a jeho vodný extrakt má celkový obsah fenolu srovnatelný s rozmarýnem, ale neobsahuje fenolické kyseliny se strukturou katecholu, která je typická pro rozmarýn a můţe být za určitých podmínek jako většina koření prooxidační [29]. Různé koření s prokázanými antioxidačními účinky ve zpracovaných potravinách a specifické antioxidanty mohou mít různý vliv na tvorbu akrylamidu. Pro účinek antioxidantů na obsah akrylamidu se zdá důleţitý také způsob pouţití antioxidantu v produktu. Slibné je, ţe ochrana můţe být dosaţena nízkými koncentracemi, které nemají negativní vliv na senzorickou kvalitu chleba [29].

18

5.2.2 Flavonoidy Flavonoidy jsou velká skupina rostlinných polyfenolů, které obsahují strukturu na bázi benzopyranu s připojenou 2- nebo 3-fenylovou skupinou, které mají vzhledem k jejich uznávaným antioxidačním atributům mnoho farmakologických a fyziologických funkcí. Počáteční studie uvádí, ţe přídavek směsi koření bohatá na flavonoidy by mohla účinně sníţit obsah akrylamidu aţ o 50 % v bramborových lupíncích. Mechanismus, kterým flavonoidy zmírňují tvorbu akrylamidu, lze přičíst jejich antioxidačním vlastnostem, které jim umoţňují reagovat s akrylamidem, prekurzory akrylamidu nebo klíčovými meziprodukty během tvorby akrylamidu [28]. Za účelem zjištění vlivu flavonoidů na tvorbu akrylamidu byly vybrány některé reprezentativní flavony (apigenin, luteolin a tricin) a isoflavony (daidzein, daidzin, genistein a genistin). Tyto flavonoidy obsahují různý počet a poloh fenolických hydroxylových skupin a to můţe souviset s jejich sniţujícím účinkem. Byl zkoumán vztah mezi počtem fenolických hydroxylových skupin flavonoidů a jejich inhibičními účinky a bylo zjištěno, ţe síla inhibice tvorby akrylamidu korelovala se zvýšeným počtem fenolických hydroxylových skupin flavonoidů [28]. Na Obr. 6 je znázorněn vztah mezi mírou inhibice tvorby akrylamidu a koncentracemi reprezentativních flavonoidů v průběhu tepelného mikrovlnného zpracování. Celkově lze říci, ţe inhibiční účinky tří flavonů (tricin, apigenin a luteolin) na tvorbu akrylamidu byly lepší neţ isoflavonů (daidzin, genistin, daidzein a genistein). Ve srovnání s ostatními flavonoidy o stejné koncentraci, pak působil na tvorbu akrylamidu nejsilnějším účinkem luteolin. Nicméně modelový systém asparagin/glukóza zaloţený na bramborové matrici ukázal, ţe inhibice tvorby akrylamidu byla zvýšena přidáním větší koncentrace flavonoidů v rozmezí 10-11 – 10-9 mol∙l-1, pak se ale dramaticky sníţila, pokud se hladiny přidaných flavonoidů zvýšily na 10-9 – 10-4 mol∙l-1. Koncentrace 10-9 mol∙l-1 by mohla být povaţována za nejúčinnější, protoţe působí maximálním inhibičním účinkem (viz Obr. 6) [28]. Kromě toho vedou různé druhy rostlinných antioxidačních extraktů a fenolických látek buď k podpoře, nebo sníţení koncentrace akrylamidu. Flavonoidy mohou reagovat s klíčovými meziprodukty Maillardovy reakce (např. s 3-aminopropionamidem) za inhibice tvorby akrylamidu, ale také mohou vyvolat rozklad sacharidů na podporu tvorby akrylamidu. Nedávná studie ukázala, ţe antioxidanty vlastnící karbonylovou sloučeninu přímo reagují s asparaginem vedoucím ke vzniku akrylamidu. Coţ znamená, ţe flavonoidy napomohly ke sníţení koncentrace akrylamidu jen v případě, kdyţ bylo zvoleno mírné, ale ne vysoké mnoţství [28].

19

Obr. 6: Míra inhibice tvorby akrylamidu v závislosti na koncentraci flavonů (A) a isoflavonů (B) [28]

5.3 Enzym asparagináza Další moţností sníţení obsahu akrylamidu můţe být asparagináza, která hydrolyzuje asparagin na kyselinu asparagovou a amoniak. Hydrolýzou dochází k inhibici tvorby akrylamidu v Maillardově reakci [12, 18]. 5.3.1 Produkty z brambor Byly provedeny laboratorní studie o vlivu blanšírování bramborových plátků a asparaginázy na tvorbu akrylamidu. Při kombinaci těchto dvou úprav došlo aţ k 90% sníţení. Blanšírování činí tkáně propustnější a v důsledku toho je enzym k substrátu dostupnější. Nicméně blanšírování není běţné v průmyslu bramborových lupínků, protoţe má velmi negativní vliv na kvalitu (texturu a chuť), stejně tak jako na nutriční vlastnosti smaţeného produktu (obsah oleje a vitamín C). Nejdříve proto musí být výsledky potvrzeny výrobou v průmyslovém měřítku a poskytnout finální produkt srovnatelné kvality a stability trvanlivosti [4].

20

5.3.2 Produkty z obilovin Přídavek asparaginázy poskytuje sníţení akrylamidu o 50 % aţ 90 %. Implementace asparaginázy do perníku umoţňuje znovuzavedení amonných solí, a tím má malý aţ ţádný vliv na senzorické a kvalitativní vlastnosti výrobků. Asparagináza nefunguje dobře ve všech případech, protoţe její účinnost je závislá na obsahu vody, dávkování enzymu, kontaktním času a teplotě. V celozrnných produktech má její pouţití omezený úspěch v důsledku omezené dostupnosti enzymu na substrát, tj. obtíţnost pronikání do obilného zrna [4]. 5.3.3 Káva Předběţné výsledky z laboratorních studií ukazují významné sníţení obsahu asparaginu u zelené kávy po aplikaci enzymu. To vedlo k 10 aţ 45% sníţení úrovně akrylamidu přímo po praţení [30]. I kdyţ jsou tyto předběţné závěry slibné, musí být úplně posouzeny dopady následujících zjištění: Existuje řada potenciálních sníţení akrylamidu, která byla měřena pouze přímo po upraţení. Rozdíl se objevil (aţ 5 – 35 %) v časovém období, kdy je káva typicky spotřebována. Významně a negativně byla ovlivněna chuť kávy. Zejména kávová zrna Arabica, která jsou známá a ceněná podle chuti a aroma v konečném spařování kávy [30].

5.4 Přídavek kationtů Přídavek dvojmocných kationtů, jako jsou Ca2+ a Mg2+ do těsta před pečením, ukázal pozoruhodný účinek na obsah akrylamidu v produktu. Při pouţití těchto iontů byl pokles akrylamidu téměř 20 % a v mírně kyselých podmínkách (pH = 5,5), které jsou běţné v mnoha potravinách, došlo ke sníţení aţ o 50 % [18]. Sniţující účinek akrylamidu vlivem dvojmocných kationtů byl připisován inhibici tvorby Schiffovy báze, tedy reakci sacharidů s α-aminoskupinou asparaginu a tím vzniku akrylamidu. Výsledné produkty s nízkým obsahem akrylamidu byly dostatečně hnědé, coţ znamená, ţe tvorba barvy během Maillardovy reakce nebyla ovlivněna [18].

5.5 Pražení kávy Ve srovnání s mnoha jinými smaţenými, praţenými a pečenými potravinářskými výrobky bylo hlášeno, ţe praţená a mletá káva obsahují relativně nízké koncentrace (170 – 351 mg∙kg-1 práškového základu) akrylamidu. Praţená a mletá káva se nekonzumuje jako taková, ale připravená jako nápoj. Káva se obvykle praţí při teplotách v rozmezí 220 – 250 °C a doba praţení a rychlost mají významný vliv na senzorické vlastnosti (aroma, chuť) [19]. Experimenty ukázaly, ţe akrylamid je degradován/eliminován během praţení. V kávě je akrylamid vytvořen na začátku praţení a ke konci praţení převládá ztráta akrylamidu. Proto světle praţené kávy mohou obsahovat relativně vyšší obsah akrylamidu neţ tmavá praţená zrna. Nicméně vyšší praţení, jako potenciální moţnost sníţení obsahu akrylamidu, můţe vytvářet jiné neţádoucí sloučeniny a mít negativní vliv na chuť/aroma produktu. V důsledku toho dnes nejsou po ruce ţádná praktická řešení, která by vedla ke sníţení obsahu akrylamidu a současně zachovala vlastnosti kvalitní kávy, protoţe praţení nemůţe být zásadně změněno [19].

21

5.6 Vliv pH Jakékoli působení kyseliny sniţuje pH potravinové matrice a tím i tvorbu Maillardových sloučenin [4]. Zvýšením kyselosti pod pH 6 ponořením bramborových hranolků do kyselých pufrů, jako jsou fosfátové a citrátové pufry, můţe vést ke sníţení tvorby akrylamidu v potravinách. Namáčením bramborových lupínků v roztoku kyseliny octové (po dobu 60 minut při teplotě 20 °C před smaţením) je dosaţeno aţ 90% sníţení obsahu akrylamidu [27]. Bakterie mléčného kvašení rychle metabolizují jednoduché sacharidy produkující kyselinu mléčnou, která sniţuje hodnotu pH a tím sniţuje Maillardovy reakce [4]. Fermentace brambor za tvorby kyseliny mléčné před fritováním sniţuje obsah akrylamidu o 48 – 71 %, zatímco blanšírování brambor, následná fermentace kyseliny mléčné a fritování sniţuje obsah akrylamidu o 79 – 94 % [27]. U bramborových produktů (lupínky, hranolky) se průmyslově pouţívá přídavek kyseliny citronové nebo kyseliny askorbové. Nicméně přídavek kyselin v pilotním a laboratorním měřítku v některých případech produkoval silný off flavour. Je tedy třeba dbát na to, aby se předešlo kyselé pachuti [30].

5.7 Fyzikální metody - teplota, obsah vody, doba zpracování Fyzikální metody jsou zaloţeny na způsobu zpracování potravin především prostřednictvím změny parametrů, jako je teplota, doba zpracování potravin a obsah vody. Tvorba akrylamidu je ovlivněna rostoucí teplotou, kdy se obsah akrylamidu zvyšuje. Schopnost sniţovat obsah akrylamidu prostřednictvím kontroly teploty a doby zpracování potravin do značné míry závisí na druhu potravin [27]. Mezi moţné způsoby sniţování obsahu akrylamidu u bramborových výrobků, zejména hranolků, je kontrola teploty skladování syrových brambor, výběr některých odrůd a změna podmínek zpracování (smaţení). Nicméně všechny úpravy provedené na surovinových sloţkách budou mít nevyhnutelně vliv na Maillardovy reakce a jejich produkty a současně na organoleptické vlastnosti (chuť a barvu) vařeného jídla [19]. V křupavém chlebě můţe být obsah akrylamidu sníţen sníţením průměrné teploty pečení a prodlouţením doby pečení. Akrylamid není přítomen v syrovém těstě, ale hladina akrylamidu rychle stoupá s časem. Teplota a doba vaření jsou úzce spojeny v procesu pečení, stejně tak jako konečný obsah vody. [19]. Bylo zjištěno, ţe v potravinách bohatých na tuky je počáteční obsah vody rozhodujícím faktorem pro určení konečné hodnoty obsahu akrylamidu, protoţe profil čas-teplota se můţe při zahřívání výrazně změnit, pokud je k dispozici různé mnoţství vody. Řízením obsahu vody je moţné rozpojit souběţné reakce tvorby akrylamidu a produktů Maillardovy reakce. Sníţení počátečního obsahu vody můţe přispět ke sníţení tvorby akrylamidu v potravinách bohatých na tuky, zatímco zachování určitého obsahu vody je dobré pro sníţení akrylamidu v sušených potravinách [27].

5.8 Kypřící činidla Nahrazení NH4HCO3 alternativními kypřícími látkami je prokázaný způsob, jak relativně sníţit akrylamid v některých produktech. I přes změny v chuti, barvě a textuře několika produktů (sladké sušenky a perníčky) byly přeformulovány a zkomercializovány. Ve většině případů byly nahrazeny sodné soli. Nicméně pro dosaţení správné rovnováhy uvolňování 22

plynu v průběhu pečení a optimální textury, chuti a barvy, je často zapotřebí kombinace NH4HCO3, NaHCO3 a okyselujících činidel. Experimenty ukázaly, ţe NH4HCO3 můţe podporovat produkci akrylamidu v perníku. NH4HCO3 zvyšuje tvorbu fragmentů sacharidu (glyoxal a methylglyoxal), které rychle reagují s asparaginem a poskytují akrylamid ve vyšším výtěţku, neţ nativní redukující sacharidy v rámci „mírných“ podmínek [30]. Sníţení nebo výměna NH4HCO3 v receptech, které se nyní pouţívají v některých komerčních aplikacích, je moţností, jak sníţit akrylamid, ale musí být posouzen dopad na organoleptické vlastnosti [30].

5.9 Fermentace Některé pečivo, jako je křupavý chléb a sušenky, mohou být vyrobeny z fermentovaného těsta tak, aby se dosáhlo konkrétní textury a chuti. Ve srovnání s podobnými, ale nefermentovanými výrobky, byla hladina akrylamidu ve fermentovaných variantách obecně niţší. Kvasinky rychle vstřebávají asparagin a kyselinu asparagovou, stejně jako sacharidy [30]. Kvašený pšeničný chléb dosahuje sníţení akrylamidu > 80 %, ale u kynutého kvašeného ţitného chleba pouze 17 %. Je to zřejmě z důvodu, ţe kynuté těsto sniţuje asparagin v menší míře neţ fermentované a ţitná mouka má typicky vyšší mnoţství asparaginu neţ pšeničná mouka [4].

5.10 Přídavek aminokyselin a sacharidů Jedna z nejúspěšnějších chemických metod pro redukci obsahu akrylamidu je přidání aminokyselin jiných neţ asparagin, jako je alanin, glutamin, lysin, glycin, cystein. Ke sníţení dochází pravděpodobně v důsledku konkurenční spotřeby prekurzorů, zvýšené eliminace nebo degradace. Namáčením těsta z pšeničné mouky a plátků brambor před zpracováním v glycinu nebo lysinu je řešení, které výrazně sniţuje hladinu akrylamidu ve zpracovaných potravinách [27]. Velmi efektivní při sniţování tvorby akrylamidu je také výměna fruktózy za glukózu, zejména v receptech obsahujících hydrogenuhličitan amonný. Redukující sacharidy jsou zodpovědné za mnoho charakteristických chutí a barev v sladkých sušenkách. Proto nahrazení glukózy fruktózou zachová původní kvalitu a strukturu [30].

5.11 Vliv NaCl a jeho aditiv Vliv této přídatné látky na tvorbu akrylamidu ve směsi byl sledován při pouţití přídavku 1, 5 a 10% NaCl k ekvimolární směsi asparagin/D-glukóza. Vzorky byly zahřívány na 171,17 °C po dobu 10 minut a obsah akrylamidu byl následně stanoven pomocí GC-MS za pouţití postupu negativní chemické ionizace. Pro srovnání byla studována také tvorba akrylamidu ve směsi bez přidání chloridu sodného za stejných podmínek [31]. Výsledky prokázaly značné inhibující účinky NaCl na tvorbu akrylamidu ve všech směsích s přídavkem NaCl, ve srovnání se směsí bez NaCl byl obsah akrylamidu sníţen přibliţně o 32, 36 a 40 %. Vysoký úbytek obsahu akrylamidu (o 32 %) je jiţ pozorován po přidání 1% NaCl, coţ je důleţité pro praktickou aplikaci v reálných technologických postupech při tepelném zpracování potravin, protoţe jen obsah zhruba 1% NaCl představuje jeho běţný obsah v mnoha potravinářských výrobcích. Na druhé straně rozdíl mezi přidáním 1 a 10% NaCl činí pouze 8 % [31].

23

V další studii byl akrylamid aplikován na kuchyňskou sůl a zahříván ve skleněné reakční nádobě v rozmezí teplot 50 – 210 °C s rychlostí ohřevu 2 °C∙min-1 a pozorován vliv teploty a kuchyňské soli na eliminaci akrylamidu. Pro srovnání byl zahříván také čistý akrylamid na teplotu 190 °C za stejných podmínek. Oba systémy byly analyzovány na obsah akrylamidu podle GC-MS. Během zahřívání se obsah akrylamidu, který byl v kontaktu s kuchyňskou solí sníţil z 99,9 na 67,7 μg, zatímco obsah akrylamidu bez kuchyňské soli se sníţil z 99,9 na 81,3 μg, a to zřejmě v důsledku polymerační reakce probíhající v obou studovaných systémech [32]. Akrylamid je vysoce reaktivní sloučenina, zejména při zvýšené teplotě. Molekuly akrylamidu mohou reagovat nejen s dalšími chemickými sloučeninami, ale také mezi sebou za vzniku biologicky inaktivního polymeru - polyakrylamidu. Ve studovaném systému nemohl akrylamid reagovat ani s kuchyňskou solí, ani se sklem. Proto jedinou myslitelnou reakcí vedoucí ke sníţení obsahu akrylamidu je jeho polymerace. Po přidání vody do obsahu zahřívané nádoby byl tento předpoklad prokázán tvorbou gelového produktu typického pro polyakrylamid. Polymerace můţe představovat jeden z moţných způsobů eliminace akrylamidu v reálné potravinové matrici [32]. Jak je prokázáno diferenční skenovací kalorimetrií (DSC), NaCl katalyzuje proces polymerace akrylamidu a tvorbu odpovídajícího polymeru, kterým je polyakrylamid. Na Obr. 7 jsou znázorněny DSC záznamy akrylamidu, NaCl a směsi akrylamidu a NaCl. Lze vidět, ţe ve vybraném teplotním intervalu je NaCl inertní. DSC záznam čistého akrylamidu je však tvořen dvěma různými píky. První endotermický pík s teplotou 83°C odpovídá bodu tání akrylamidu. Druhý exotermický pík s teplotou 156 °C odpovídá polymerační reakci. DSC záznam směsi akrylamidu a NaCl ukazuje pík představující bod tání akrylamidu. Avšak začátek druhého exotermního píku je výrazně posunut na teplotu 144 °C. Ve srovnání s čistým akrylamidem sniţuje NaCl počáteční teplotu polymerace akrylamidu o 12°C [32].

Obr. 7: DSC záznamy akrylamidu, NaCl a směsi akrylamidu a NaCl (1:1) [32]

Kuchyňská sůl je schopna iniciovat polymerační reakci a tím urychlit eliminaci akrylamidu. Polymerace akrylamidu je urychlována i jinými anorganickými sloučeninami přidanými do kuchyňské soli, například hexakyanoţeleznatanem draselným K4[Fe(CN)6] 24

a jodičnanem draselným KIO3 [32]. Nicméně různé soli vykazují různé katalytické účinky na rozsah polymerace akrylamidu [33]. Byl zkoumán vliv těchto dvou aditiv kuchyňské soli na eliminaci akrylamidu. Akrylamid aplikovaný na hexakyanoţeleznatan draselný a jodičnan draselný byl zahříván ve skleněné reakční nádobě v rozsahu teplot 102 – 180 °C s rychlostí ohřevu 2 °C∙min-1 [33]. Pro srovnání byl stejný pokus proveden také s chemicky čistým chloridem sodným. Jak bylo zjištěno, účinek této soli na eliminaci akrylamidu nebyl příliš silný a obsah akrylamidu byl sníţen pouze o 13 %. Avšak mnohem intenzivnější účinek na eliminaci akrylamidu měly K4[Fe(CN)6] a KIO3. Za stejných experimentálních podmínek sníţil hexakyanoţeleznatan draselný obsah akrylamidu o 61 % a jodičnan draselný pak o více neţ 88 % [33]. Podstata tohoto způsobu sniţování obsahu akrylamidu v bramborových potravinářských výrobcích připravovaných tepelnou úpravou spočívá v tom, ţe surovina na výrobu bramborových potravinářských výrobků se před tepelnou úpravou uvede do styku s hexakyanoţeleznatanem draselným nebo jodičnanem draselným. Bylo zjištěno, ţe na sníţení obsahu akrylamidu aţ o 94 % v bramborových výrobcích je potřebné ponořit syrové hranolky anebo lupínky do roztoku zmíněných sloučenin na dobu, která závisí od průměru tělesa, např. v případě lupínků cca 5 min, v případě hranolků 30 min. Po oddělení kapalného podílu mechanickým způsobem se surovina tepelně opracuje běţným způsobem, tj. smaţí se v tuku při teplotě 160 – 180 °C po dobu 10 – 15 min [34].

25

6

ZÁVĚR Získané poznatky o akrylamidu jsou shrnuty v následujících bodech: - Akrylamid vzniká tepelným zpracováním potravin bohatých především na škrob při teplotách 120 °C a vyšších. Při vzniku se uplatňuje Maillardova reakce, která je zodpovědná za charakteristické hnědé zbarvení, chuť a vůni produktu, ale také produkci karcinogenního akrylamidu. Největší obsah akrylamidu je přítomen v bramborových lupíncích a hranolkách, dále v pečivu, kávě a snídaňových cereáliích. - Existuje mnoho způsobů, jak sníţit obsah akrylamidu v potravinách, ale je třeba nalézt takové, které nemají vliv na konečnou kvalitu produktu. Moţnosti minimalizace obsahu akrylamidu jsou spojeny s pochopením mechanismu tvorby akrylamidu.  Výběr odrůdy a podmínky skladování ovlivňují obsah sacharidů v hlízách brambor a tím přispívají ke konečné tvorbě akrylamidu. Účinný způsob sníţení obsahu akrylamidu, ovlivněním prekurzorů, spočívá v působení jiných aminokyselin neţ asparaginu, a to glycinu a lysinu, a také je efektivní výměna sacharózy za fruktózu.  Další moţností jsou antioxidanty, které mohou za určitých podmínek sniţovat obsah akrylamidu, ale také se podílet na jeho tvorbě. Koření rozmarýn a třemdava přidané do těsta před pečením inhibují obsah akrylamidu jiţ při nízkých koncentracích bez vlivu na senzorické vlastnosti chleba. U bramborových výrobků působí ze skupiny flavonoidů nejúčinněji luteolin při koncentraci 10-9 mol∙l-1.  Kombinace vlivu blanšírování a enzymu asparaginázy poskytuje aţ 90% sníţení obsahu akrylamidu, avšak má negativní vliv na výslednou kvalitu produktu.  Obsah akrylamidu v potravinách je ovlivňován také regulací fyzikálních parametrů, jako je teplota, obsah vody i doba zpracování. Také změnou pH (působením kyselin) dochází ke sníţení obsahu akrylamidu, ale kvalita produktu je negativně ovlivněna.  Velmi účinnou inhibici poskytuje NaCl, hexakyanoţeleznatan draselný a jodičnan draselný. Jejich účinek spočívá v iniciaci polymerační reakce za vzniku polyakrylamidu, který jiţ karcinogenní není.

26

7 [1]

[2] [3] [4]

[5] [6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11] [12]

[13] [14]

SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ LAKSHMIKANDAN, M., K. SIVARAMAN, S. ELAIYA RAJA, P. VASANTHAK UMAR, R. P. RAJESH, K. SOWPARTHANI a S. Emmanuel Joshua JEBASINGH. Biodegradation of acrylamide by acrylamidase from Stenotrophomonas acidaminiphila MSU12 and analysis of degradation products by MALDI-TOF and HPLC. International Biodeterioration & Biodegradation. 2014, roč. 94, s. 214-221. DOI: 10.1016/j.ibiod.2014.07.014. VELÍŠEK, Jan. Chemie potravin 1. 1. vyd. Tábor: OSSIS, 1999, s. 2. ISBN 80-9023912-9. CIESAROVÁ, Zuzana. Minimalizácia obsahu akrylamidu v potravinách. Chemické listy, 2005, roč. 99, č. 7, s. 483 – 491. LINEBACK, David R., James R. COUGHLIN a Richard H. STADLER. Acrylamide in Foods: A Review of the Science and Future Considerations. Annual Review of Food Science and Technology. 2012-04-10, roč. 3, č. 1, s. 15-35. DOI: 10.1146/annurevfood-022811-101114. RICE, M. J. The carcinogenity of acrylamide. Mutation Research, 2005, č. 580, s. 3– 20. DOI: 10.1016/j.mrgentox.2004.09.008. International Agency for Research on Cancer (IARC), Acrylamide, IARC Monographs on Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, Some Industrial Chemicals, roč. 60, International Agency for Research on Cancer. Lyon 1994, s. 389– 433. European Food Safety Authority. Workshop on Acrylamide Formation in Food, 17 November 2003, Brussels, s. 1-22. Dostupné z: http://www.efsa.europa.eu/en/ events/event/stakeholder031117-m.pdf AHN, J. S., L. CASTLE, D. B. CLARKE, A. S. LLOYD, M. R. PHILO a D. R. SPECK. Verification of the findings of acrylamide in heated foods. Food Additives and Contaminants. 2002, roč. 19, č. 12, s. 1116-1124. DOI: 10.1080/0265203021000048214. Health Implications of Acrylamide in Food: Report of a Joint FAO/WHO Consultation. WHO Headquarters. Geneva, Switzerland, 25-27 June 2002, s. 1-35. Dostupné z: http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/42563/1/9241562188.pdf?ua=1 European Commission: Opinion of the Scientific Committee on Food on new findings regarding the presence of acrylamide in food. SCF/CS/CNTM/CONT/4, 3 July 2002. Dostupné z: http://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out131_en.pdf White Paper on Acrylamide, 3-4 July 2003 EFSA Advisory Forum Meetings. Dostupné z: http://www.efsa.europa.eu/en/af030703/docs/af030703-ax8.pdf FRIEDMAN, Mendel. Chemistry, Biochemistry, and Safety of Acrylamide. A Review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003, roč. 51, č. 16, s. 45044526. DOI: 10.1021/jf030204. VELÍŠEK, Jan. Chemie potravin 1. 1. vyd. Tábor: OSSIS, 1999, s. 277-278. ISBN 80902-3912-9. ZYZAK, David V., Robert A. SANDERS, Marko STOJANOVIC, Daniel H. TALLMADGE, B. Loye EBERHART, Deborah K. EWALD, David C. GRUBER, Thomas R. MORSCH, Melissa A. STROTHERS, George P. RIZZI a Maria D. VILLAGRAN. Acrylamide Formation Mechanism in Heated Foods. Journal of

27

[15]

[16]

[17]

[18]

[19]

[20]

[21]

[22]

[23]

[24]

[25]

[26]

28

Agricultural and Food Chemistry. 2003, roč. 51, č. 16, s. 4782-4787. DOI: 10.1021/jf034180i. YAYLAYAN, Varoujan A., Andrzej WNOROWSKI a Carolina PEREZ LOCAS. Why Asparagine Needs Carbohydrates To Generate Acrylamide. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003, roč. 51, č. 6, s. 1753-1757. DOI: 10.1021/jf0261506. STADLER, Richard H., Imre BLANK, Natalia VARGA, Fabien ROBERT, Jörg HAU, Philippe A. GUY, Marie-Claude ROBERT a Sonja RIEDIKER. Food chemistry: Acrylamide from Maillard reaction products. Nature. 2002-10-3, roč. 419, č. 6906, s. 449-450. DOI: 10.1038/419449a. MOTTRAM, Donald S., Bronislaw L. WEDZICHA a Andrew T. DODSON. Food chemistry: Acrylamide is formed in the Maillard reaction. Nature. 2002-10-3, roč. 419, č. 6906, s. 448-449. DOI: 10.1038/419448a. CLAUS, Achim, Reinhold CARLE a Andreas SCHIEBER. Acrylamide in cereal products: A review. Journal of Cereal Science. 2008, roč. 47, č. 2, s. 118-133. DOI: 10.1016/j.jcs.2007.06.016. STUDER, A., I. BLANK a R. H. STADLER. Thermal processing contaminants in foodstuffs and potencial strategies of control. Czech J. Food Sci. 2004. roč. 22, s. 110. STADLER, Richard H., Fabien ROBERT, Sonja RIEDIKER, Natalia VARGA, Tomas DAVIDEK, Stéphanie DEVAUD, Till GOLDMANN, Jörg HAU a Imre BLANK. In-Depth Mechanistic Study on the Formation of Acrylamide and Other Vinylogous Compounds by the Maillard Reaction. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004, roč. 52, č. 17, s. 5550-5558. DOI: 10.1021/jf0495486. YASUHARA, Akio, Yuuka TANAKA, Matt HENGEL a Takayuki SHIBAMOTO. Gas Chromatographic Investigation of Acrylamide Formation in Browning Model Systems. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003, roč. 51, č. 14, s. 39994003. DOI: 10.1021/jf0300947. BECALSKI, Adam, Benjamin P.-Y. LAU, David LEWIS a Stephen W. SEAMAN. Acrylamide in Foods: Occurrence, Sources, and Modeling. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2003, roč. 51, č. 3, s. 802-808. DOI: 10.1021/jf020889y. ELBASHIR, Abdalla A., Mei M Ali OMAR, Wan Aini Wan IBRAHIM, Oliver J. SCHMITZ a Hassan Y. ABOUL-ENEIN. Acrylamide Analysis in Food by Liquid Chromatographic and Gas Chromatographic Methods. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 2014, roč. 44, č. 2, s. 107-141. DOI: 10.1080/10408347.2013.829388. GENG, Z., P. WANG a A. LIU. Determination of Acrylamide in Starch-Based Foods by HPLC with Pre-Column Ultraviolet Derivatization. Journal of Chromatographic Science. 2011-11-01, roč. 49, č. 10, s. 818-824. DOI: 10.1093/chrsci/49.10.818. TAREKE, Eden, Per RYDBERG, Patrik KARLSSON, Sune ERIKSSON a Margareta TÖRNQVIST. Analysis of Acrylamide, a Carcinogen Formed in Heated Foodstuffs. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2002, roč. 50, č. 17, s. 4998-5006. DOI: 10.1021/jf020302f. MIZUKAMI, Yuzo, Yusuke SAWAI a Yuichi YAMAGUCHI. Changes in the Concentrations of Acrylamide, Selected Odorants, and Catechins Caused by Roasting of Green Tea. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2008, roč. 56, č. 6, s. 2154-2159. DOI: 10.1021/jf0731806.

[27]

[28]

[29]

[30]

[31]

[32]

[33]

[34]

XU, Yi, Bo CUI, Ran RAN, Ying LIU, Huaping CHEN, Guoyin KAI a Jianxin SHI. Risk assessment, formation, and mitigation of dietary acrylamide: Current status and future prospects. Food and Chemical Toxicology. 2014, roč. 69, s. 1-12. DOI: 10.1016/j.fct.2014.03.037. CHENG, Jun, Xinyu CHEN, Sheng ZHAO a Yu ZHANG. Antioxidant-capacity-based models for the prediction of acrylamide reduction by flavonoids. Food Chemistry. 2015, roč. 168, s. 90-99. DOI: 10.1016/j.foodchem.2014.07.008. HEDEGAARD, Rikke Vingborg, Kit GRANBY, Henrik FRANDSEN, Jonas THYGESEN a Leif H. SKIBSTED. Acrylamide in bread. Effect of prooxidants and antioxidants. European Food Research and Technology. 2008, roč. 227, č. 2, s. 519-525. DOI: 10.1007/s00217-007-0750-5. FDE. Food Drink Europe Acrylamide Toolbox. 2011. 30 September 2011, s. 1-47. Dostupné z: http://www.fooddrinkeurope.eu/uploads/publications_documents/ Toolboxfinal260911.pdf KOLEK, Emil, Peter ŠIMKO a Peter ŠIMON. Inhibition of acrylamide formation in asparagine/d-glucose model system by NaCl addition. European Food Research and Technology. 2006-11-22, roč. 224, č. 2, s. 283-284. DOI: 10.1007/s00217-006-0319-8. KOLEK, Emil, Peter ŠIMON a Peter ŠIMKO. Nonisothermal Kinetics of Acrylamide Elimination and Its Acceleration by Table Salt – A Model Study. Journal of Food Science. 2007, roč. 72, č. 6, s. 341-344. DOI: 10.1111/j.1750-3841.2007.00403.x. KOLEK, Emil, Peter ŠIMKO, Peter ŠIMON a Anton GATIAL. Confirmation of polymerisation effects of sodium chloride and its additives on acrylamide by infrared spectrometry. Journal of Food and Nutrition Research. 2007, roč. 46, č. 1, s. 39-44. ŠIMKO, Peter, Emil KOLEK a Peter ŠIMON. Spôsob znižovania obsahu akrylamidu v zemiakových potravinárskych výrobkoch pripravovaných tepelnou úpravou. Slovenská republika. Patentový spis, SK 287569 B6. 2011-3-4.

29

8

SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK

DSC ESI FAO GC GC-MS GC-MS/MS HPLC HPLC-UV/VIS HPLC-DAD IARC LC-MS/MS MS NFA RP-HPLC SCF UV WHO

30

Diferenční skenovací kalorimetrie Ionizace elektrosprejem Světová organizace pro výţivu a zemědělství (The Food of Agriculture Organization of the United Nations) Plynová chromatografie Plynová chromatografie s hmotnostní spektrometrií Plynová chromatografie s hmotnostní tandemovou spektrometrií Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s UV/VIS detekcí Vysokoúčinná kapalinová chromatografie ve spojení s detekcí diodového pole Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny (International Agency for Research on Cancer) Kapalinová chromatografie s tandemovou hmotnostní spektrometrií Hmotnostní spektrometrie Švédská národní potravinová správa (Swedish National Food Administration) Chromatografie s obrácenými (reverzními) fázemi Vědecký výbor pro potraviny (Scientific Committee on Food) Ultrafialové záření Světová zdravotnická organizace (World Health Organisation)