VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
PŘÍPRAVA DNA V KVALITĚ VHODNÉ PRO POLYMERÁZOVOU ŘETĚZOVOU REAKCI
DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS
AUTOR PRÁCE AUTHOR
BRNO 2011
Bc. ROBERT ČUTA
VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
PŘÍPRAVA DNA V KVALITĚ VHODNÉ PRO POLYMERÁZOVOU ŘETĚZOVOU REAKCI PREPARATION OF PCR-READY DNA
DIPLOMOVÁ PRÁCE MASTER'S THESIS
AUTOR PRÁCE
Bc. ROBERT ČUTA
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR
BRNO 2011
doc. Ing. BOHUSLAV RITTICH, CSc.
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno 12
Zadání diplomové práce Číslo diplomové práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:
FCH-DIP0460/2010 Akademický rok: 2010/2011 Ústav chemie potravin a biotechnologií Bc. Robert Čuta Chemie a technologie potravin (N2901) Potravinářská chemie a biotechnologie (2901T010) doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc.
Název diplomové práce: Příprava DNA v kvalitě vhodné pro polymerázovou řetězovou reakci
Zadání diplomové práce: 1. Vypracujte literární přehled k dané problematice 2. Popište použité experimentální metody 3. Zpracujte získané experimentální výsledky 4. Vyhodnoťte získané výsledky formou diskuse
Termín odevzdání diplomové práce: 13.5.2011 Diplomová práce se odevzdává ve třech exemplářích na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu diplomové práce. Toto zadání je přílohou diplomové práce.
----------------------Bc. Robert Čuta Student(ka)
V Brně, dne 15.1.2011
----------------------doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. Vedoucí práce
----------------------doc. Ing. Jiřina Omelková, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Jaromír Havlica, DrSc. Děkan fakulty
ABSTRAKT Bakterie mléþného kvašení (BMK) jsou ve velké míĜe využívány v potravináĜském prĤmyslu napĜíklad pĜi výrobČ mléþných výrobkĤ, sýrĤ a fermentovaných salámĤ, dále se využívají ke konzervaci zeleniny. KromČ prĤmyslového využití jsou u BMK dĤležité i mikrobiologické parametry. PĜi identifikaci bakteriálních rodĤ se v poslední dobČ velmi þasto využívají metody založené na izolaci a amplifikaci DNA. Diplomová práce se zabývá optimalizací lyze bakteriálních bunČk rodu Lactobacillus. Jako první byla testována koncentrace lysozymu (3mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) v lyzaþním roztoku a doba jeho pĤsobení (3, 5 a 10 hodin). Následovalo testování lyzaþních roztokĤ pĜipravených z komerþních pracích práškĤ pĜi lyzi bakteriálních bunČk rodu Lactobacillus. K tomuto úþelu byl nejprve použit prací prášek Amway o rĤzné koncentraci (1%, 2%, 3% a 4%). Dále byly pĜi optimalizaci testovány další þtyĜi druhy komerþních pracích práškĤ. Optimalizace lyze byla provádČna s buĖkami þisté kultury rĤzných druhĤ Lactobacillus. Po provČĜení úþinnosti pracích práškĤ pro lyzi bunČk þisté kultury Lactobacillus byly provedeny lyze bunČk v potravinových matricích (Acidofilní mléko, Jogurt mango, Jogurt bílý) bČžnČ dostupných v obchodČ s potravinami. Všechny postupy byly vyhodnocovány amplifikaþní metodou PCR s primery specifickými pro rod Lactobacillus. Izolace DNA pro PCR byla provádČna pomocí paramagnetických nosiþĤ P(HEMA-co-GMA) a množství DNA bylo kvantifikováno spektrofotometricky. Detekce PCR produktĤ byla provedena pomocí agarosové gelové elektroforézy.
ABSTRACT In these days are probiotic lactic acid bacteria (LAB) very often used in food processing industry, such as milk products, cheese and fermented salami production. As well as the food conservation agent. Except of the industry usage of the LAB there are microbiological aspects. Identification of the bacterial species methods based on the isolation and amplification of DNA are very often used last few years. Diploma thesis deal with the bacterial cell of Lactobacillus species lysis and it´s optimalization. At first it was tested the optimal concentration of lysozyme (3mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) and the exposure times (3, 5 a 10 hours). Another testing was aimed to the use and suitability of washing powder to the bacterial cell of Lactobacillus species lysis. I tested the Amway washing powder optimal concentration (1%, 2%, 3% a 4%). Four of another comercial washing powders were tested too. All these tests were performed at the pure Lactobacillus bacterial culture. To ensure the results I tested the washing powders at the real food matrix (Acidified milk, yogurt mango, yogurt white). All the methods were evaluated at the amplification method PCR with specific primers for the Lactobacillus genus. The DNA isolation was performed with the paramagnetic microsperes P(HEMA-co-GMA) and the amount of the DNA was quantified spectrophotometrically. The PCR products detection was performed with the agarose gel electrophoresis.
3
KLÍýOVÁ SLOVA rod Lactobacillus, lysozym, prací prášek, DNA, P(HEMA-co-GMA), polymerázová ĜetČzová reakce (PCR)
paramagnetické
mikroþástice
KEYWORDS Lactobacillus species, lysozyme, washing powder, DNA, paramagnetic microsperes P(HEMA-co-GMA), polymerase chain reaction (PCR)
4
ýUTA, R. PĜíprava DNA v kvalitČ vhodné pro polymerázovou ĜetČzovou reakci . Brno: Vysoké uþení technické v BrnČ, Fakulta chemická, 2011. 82 s. Vedoucí diplomové práce doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc..
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem diplomovou práci vypracoval samostatnČ a že všechny použité literární zdroje jsem správnČ a úplnČ citoval. Diplomová práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v BrnČ a mĤže být využita ke komerþním úþelĤm jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a dČkana FCH VUT.
….………………………. podpis studenta
5
PODċKOVÁNÍ ChtČl bych podČkovat panu doc. Ing. Bohuslavu Rittichovi, CSc a paní doc. RNDr. AlenČ Španové, CSc. za odbornou radu a pomoc pĜi Ĝešení a pĜi zpracování této práce. Dále bych chtČl podČkovat Ing. Michaele Friþové za pomoc pĜi práci.
6
OSNOVA Abstrakt ...................................................................................................................................... 3 Abstract ...................................................................................................................................... 3 Klíþová slova.............................................................................................................................. 4 Keywords ................................................................................................................................... 4 Prohlášení ................................................................................................................................... 5 PodČkování ................................................................................................................................. 6 Osnova........................................................................................................................................ 7 Úvod ......................................................................................................................................... 10 1 Teoretická þást.................................................................................................................. 11 1.1 Bakterie rodu Lactobacillus ..................................................................................... 11 1.2 Struktura bakteriálních bunČk a funkce jednotlivých struktur ................................. 11 1.2.1 BunČþná stČna bakterií ..................................................................................... 11 1.2.1.1 Grampozitivní bakterie................................................................................. 13 1.2.1.2 Gramnegativní bakterie ................................................................................ 14 1.2.1.3 PĤsobení lysozymu na bunČþnou stČnu bakterií........................................... 16 1.2.2 Cytoplazmatická membrána bakterií................................................................ 17 1.2.3 Cytoplazma bakterií ......................................................................................... 18 1.2.4 Jaderný materiál bakterií a jeho funkce............................................................ 18 1.3 Magnetické nosiþe.................................................................................................... 21 1.4 Replikace DNA ........................................................................................................ 24 1.5 Polymerázová ĜetČzová reakce ................................................................................. 25 2 Cíl práce ........................................................................................................................... 29 3 Experimentální þást .......................................................................................................... 30 3.1 Materiál .................................................................................................................... 30 3.1.1 Použité bakteriální kmeny................................................................................ 30 3.1.2 Použité mléþné výrobky ................................................................................... 30 3.1.3 Prací prášky ...................................................................................................... 31 3.1.4 Chemikálie ....................................................................................................... 31 3.1.4.1 Chemikálie pro pĜípravu roztokĤ ................................................................. 31 3.1.4.2 Magnetické þástice ....................................................................................... 32 3.1.4.3 Roztoky ........................................................................................................ 32 3.1.5 PĜístroje a pomĤcky.......................................................................................... 35 3.2 Metody ..................................................................................................................... 36 3.2.1 Kultivace bakterií ............................................................................................. 36 3.2.1.1 Stanovení poþtu bunČk ................................................................................. 36 3.2.1.2 Stanovení poþtu bunČk kultivaþní metodou ................................................. 36 3.2.2 PĜíprava hrubých lyzátĤ (HL) bunČk................................................................ 36 3.2.3 Izolace bakteriální DNA................................................................................... 37 3.2.3.1 Fenolová extrakce ........................................................................................ 37 3.2.3.2 Izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ................................................. 37 3.2.4 Spektrofotometrické stanovení þistoty a koncentrace DNA na NanoPhotometru 38 3.2.5 Polymerázová ĜetČzová reakce (PCR).............................................................. 39 3.2.5.1 PĜíprava PCR smČsi pro rod Lactobacillus .................................................. 39 3.2.6 Elektroforéza hrubých lyzátĤ, bakteriální DNA a PCR produktĤ.................... 40 4 Výsledky........................................................................................................................... 41 4.1 Kultivace bakteriálních kmenĤ................................................................................. 41 4.1.1 Stanovení optické denzity kultury bakteriálních kmenĤ .................................. 41 7
4.1.2 Stanovení þistoty bakteriální kultury................................................................ 41 4.1.3 Stanovení poþtu bunČk kultivaþní metodou ..................................................... 42 4.2 Testování vlivu koncentrace lysozymu v lyzaþním roztoku B na lyzy bunČk a výtČžnost DNA..................................................................................................................... 44 4.2.1 Lyze bunČk pomocí roztoku B s rĤznými koncentracemi lysozymu .............. 45 4.2.2 Izolace DNA metodu fenolové extrakce a magnetickým nosiþem z hrubých lyzátĤ bunČk ..................................................................................................................... 47 4.2.2.1 Izolace DNA fenolovou extrakcí a spektrofotometrické mČĜení ................. 47 4.2.2.2 Izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ a spektrofotometrické mČĜení DNA 48 4.2.3 Srovnání množství DNA izolované metodou fenolové extrakce a pomocí magnetických nosiþĤ ........................................................................................................ 48 4.2.4 PCR – rod Lactobacillus .................................................................................. 52 4.2.4.1 PCR s DNA izolovanou metodou fenolové extrakce................................... 52 4.2.4.2 PCR s DNA izolované pomocí magnetických nosiþĤ.................................. 54 4.3 Testování úþinnosti lysozymu (3mg/ml), imobilizovaného lysozymu a lysozymu obsaženém v pracím prášku Amway pĜi pĜípravČ hrubých lyzátĤ bunČk ............................ 56 4.3.1 Lyze bunČk pomocí roztoku B s lysozymem v roztoku ................................... 56 4.3.2 Lyze bunČk pomocí enzymu obsaženého v pracím prášku .............................. 56 4.3.3 Lyze bunČk pomocí imobilizovaného lysozymu.............................................. 57 4.3.4 Izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ z HL bunČk získaných pomocí rĤzných lyzaþních þinidel................................................................................................. 59 4.3.5 PCR s DNA matricí izolovanou pomocí þástic z HL bunČk získaných pomocí rĤzných lyzaþních roztokĤ ............................................................................................... 59 4.3.5.1 Použití roztoku B s lysozymem v roztoku pro lyzi bunČk ........................... 61 4.3.5.2 Použití imobilizovaného lysozymu pro lyzi bunČk ...................................... 61 4.3.5.3 Použití pracího prášeku Amway pro lyzi bunČk .......................................... 61 4.4 Testování rĤzných koncentrací pracího prášku Amway pro lyzi bunČk .................. 61 4.4.1 Lyze bunČk pomocí enzymĤ obsažených v parcím prášku Amway ................ 61 4.4.2 Izolace DNA z HL pĜipravených pomocí rĤznČ koncentroveného pracího prášku Amway.................................................................................................................. 62 4.4.3 PCR s DNA izolovanou z HL bunČk pĜipravených práškem Amway ............. 62 4.5 Testování rĤzných pracích práškĤ pro lyzi bunČk.................................................... 64 4.5.1 Lyze bunČk pomocí enzymĤ rĤzných pracích práškĤ ...................................... 64 4.5.2 Izolace DNA izolované z HL bunČk pĜipravených pomocí pČti rĤzných pracích práškĤ pomocí magnetických nosiþĤ ............................................................................... 64 4.5.3 PCR s DNA matricí izolovanou z HL bunČk pĜipravených pomocí rĤzných pracích práškĤ .................................................................................................................. 65 4.6 Izolace DNA z potravináĜských matric .................................................................... 67 4.6.1 Lyze bunČk obsažených v tekutých mléþných výrobcích ................................ 67 4.6.2 Lyze bunČk obsažených v tekutých jogurtu ..................................................... 67 4.6.3 Izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ získané z hrubých lyzátĤ bunČk mléþných výrobkĤ ............................................................................................................ 67 4.6.4 PCR s DNA matricí mléþných výrobkĤ ........................................................... 68 4.7 PĜíprava HL bunČk z vČtšího množství potravináĜských matric s kratším pĤsobením 4% pracího prášku PER 100% ............................................................................................. 70 4.7.1 Lyze bunČk pracím práškem PER 100%.......................................................... 70 4.7.2 PCR s DNA získanou z mléþných výrobkĤ s 1 ȝl DNA matrice..................... 70 4.7.3 PCR s DNA získanou z mléþných výrobkĤ s 3 ȝl DNA matrice.................... 72 5 Diskuze............................................................................................................................. 73
8
5.1 Testování vlivu koncentrace lysozymu v lyzaþním roztoku B na výtČžnost DNA, srovnání metod izolace DNA ............................................................................................... 73 5.1.1 Srovnání množství DNA izolované metodou fenolové extrakce a pomocí magnetických nosiþĤ ........................................................................................................ 73 5.2 Vliv þasového pĤsobení lysozymu na výtČžnost DNA, srovnání úþinnosti lysozymu (3mg/ml), imobilizovaného lysozymu a lysozymu obsaženém v pracím prášku ................ 74 5.3 Testování rĤzných koncentrací pracího prášku pro lyzi bunČk................................ 75 5.4 Testování rĤzných pracích práškĤ pro lyzi bunČk.................................................... 75 5.5 Izolace DNA z hrubých lyzátĤ bunČk potravináĜských matric ................................ 75 6 ZávČr................................................................................................................................. 77 7 Seznam použitých zdrojĤ ................................................................................................. 78 8 Seznam použitých zkratek................................................................................................ 80 Seznam pĜíloh........................................................................................................................... 81 9 PĜílohy .............................................................................................................................. 82
9
ÚVOD Bakterie rodu Lactobacillus jsou ve velké míĜe využívány v potravináĜském prĤmyslu k výrobČ fermentovaných výrobkĤ (sýry, kysané mléko a jogurty), fermentované zeleniny (kysané zelí) a pĜi výrobČ kvalitních fermentovaných salámĤ a klobás. Rod Lactobacillus patĜí mezi probiotické bakterie, které významnČ ovlivĖují zdraví živoþichĤ a þlovČka jsou souþástí gastrointestinálního traktu, kde kladnČ ovlivĖují mikroflóru a znemožĖují osidlování traktu patogenními organismy. PĜi analýze mikroorganismĤ obsažených v potravinách se využívají metody založené na amplifikaci DNA, napĜ. polymerázová ĜetČzová reakce (PCR) a postupy na ní založené. Je ale zapotĜebí nejprve vzorek potraviny upravit, aby bylo možné DNA pomocí této metody analyzovat. PĜi identifikaci bakterií rodu Lactobacillus v potravináĜských matricích se používá Ĝada chemikálií a drahých enzymĤ, které jsou napĜ. používány k lyzi bunČk. ZvláštČ enzymy, které jsou nároþné na skladování a þistotu, jsou jedním z nejnákladnČjších komponent pĜi pĜípravČ vzorkĤ. To je také jedním z dĤvodĤ hledání nových cest jak ušetĜit a zjednodušit pracovní postupy. V této práci jsem se zamČĜil na využití enzymĤ a detergentĤ, obsažených v pracích prášcích, pĜi pĜípravČ hrubých lyzátĤ bakteriálních bunČk rodu Lactobacillus a následnou izolaci DNA pomocí magnetických nosiþĤ. Intaktnost takto izolované DNA byla ovČĜena pomocí PCR.
10
1
TEORETICKÁ ýÁST
1.1 Bakterie rodu Lactobacillus Rod Lactobacillus náleží do domény Bacteria, kmene Firmicutes, tĜídy Bacilli, Ĝádu Lactobacillales a þeledi Lactobacillaceae. (Klein a kol., 1998). VČtšina druhĤ Lactobacillus fermentuje glukosu a laktosu na laktát a odtud pochází název tohoto rodu. (Votava a kol., 2003). Bakterie rodu Lactobacillus jsou katalasa negativní a nepohyblivé aerobní až fakultativnČ anaerobní tyþinkovité bakterie (Merk a kol., 2004). TvoĜí robustní nesporulující grampozitivní tyþky, þasto Ĝetízky. Na kultivaþní pĤdČ tvoĜí kolonie. (Votava a kol., 2003). Ideální pro jejich rĤst jsou mezofilní až mírnČ termofilní podmínky, mírnČ kyselé prostĜedí pH 5, jsou acidotolerantní až acidofilní. PĜi fermentaci sacharidĤ vytváĜejí kyselé prostĜedí tvorbou kyselin, pĜi poklesu pod pH 4 však utlumují až zastavují svĤj rĤst. Kyselina mléþná z dĤvodu snížení pH zastavuje rĤst hnilobných bakterií. Její vlastnosti jsou s výhodou využívány v potravináĜském prĤmyslu ke konzervaci potravin - kvašení zelí, okurek a v zemČdČlství k silážování píce. V mlékárenství se používá napĜ. druh Lactobacillus delbueckii ssp. bulgaricus pĜi výrobČ jogurtu, Lactobacillus acidophilus pĜi pĜípravČ acidofilního mléka nebo Lactobacillus casei pĜi pĜípravČ sýrĤ (Votava a kol., 2003). Druhy využívané v prĤmyslové výrobČ patĜí do skupiny bakterií tzv. obecnČ pokládaných za bezpeþné – GRAS (generaly regarded as safe) (Roginski a kol., 2003). V intestinálním traktu lidí a zvíĜat mají velice pozitivní vliv na stĜevní mikroflóru. NČkteré laktobacily se vyskytují také jako nežádoucí kontaminace ve vinaĜství a pivovarnictví, kde zpĤsobují chuĢové vady výrobkĤ, a v drožćárenství, což vede ke ztrátám výtČžnosti. (Šilhánková, 2002). V pĜírodČ se lactobacily vyskytují pĜevážnČ na rozkládajícím se rostlinném materiálu spolu s dalšími zástupci bakterií mléþného kvašení.
1.2 Struktura bakteriálních bunČk a funkce jednotlivých struktur
1.2.1
BunČþná stČna bakterií
Každá mikrobiální buĖka je od vnČjšího prostĜedí oddČlena silnou, vČtšinou neohebnou (rigidní) strukturou, jež se nazývá bunČþná stČna (Obr. 1).
11
Obr. 1: Srovnání bunČþné stČny G+ a G- bakterií upraveno dle http://water.me.vccs.edu/
Pevnost a neohebnost bunČþné stČny bakterií je výsledkem pĜítomnosti vrstvy peptidoglykanĤ, zvaných též mukopeptidy nebo mureiny (od lat. murus = stČna). Vrstva peptidoglykanĤ se vyskytuje v bunČþné stČnČ všech bakterií. Obsahují polysacharidová vlákna tvoĜená molekulami N-acetylglukosaminu a N-acetylmuramové kyseliny (tj. 3-O-D-laktylderivátu N-acetyl-D-glukosaminu). ParalelnČ položené ĜetČzce tČchto polysacharidĤ jsou vzájemnČ spojeny prostĜednictvím tetra- nebo pentapeptidĤ, a to peptidovou vazbou pĜes karboxylovou skupinu muramové kyseliny. V tČchto peptidech je pĜítomno nČkolik typĤ aminokyselin, z toho vždy alespoĖ jedna s dvČma aminoskupinami v molekule. Peptidoglykanová vrstva, jejíž tloušĢka se u rĤzných rodĤ bakterií liší, pĜedstavuje vlastnČ jednu obrovskou molekulu. Lysozym (glykosidasa) díky bakteriocidním úþinkĤm a schopnostem štČpit glykosidické vazby mezi N-acetylglukosaminovými jednotkami a zbytky N-acetylmuramové kyseliny, rozkládá peptidoglykany a v izotonickém prostĜedí, tak vzniká protoplast. (Šilhánková, 2002; Rau, 2005; Kaprálek, 1986; Rosypal a kol., 1981). Syntéza peptidoglykanĤ je inhibována penicilinem, který pĤsobí jako antagonista muramové kyseliny. V pĜítomnosti urþitých koncentrací tohoto antibiotika v rĤstovém prostĜedí o stejném osmotickém tlaku, jaký panuje uvnitĜ bakteriálních bunČk, exkretují bakterie do prostĜedí deriváty muramové kyseliny a tvoĜí buĖky neobvyklých tvarĤ, s defektní bunČþnou stČnou. Tyto neobvyklé útvary se nazývají L-formy bakterií a jsou velmi citlivé na snížení osmotického tlaku. Za vhodných rĤstových podmínek mohou regenerovat v normální bakteriální buĖky. Další složky bunČþné stČny jsou rozdílné u gramnegativních a grampozitivních bakterií. (Šilhánková, 2002)
12
1.2.1.1 Grampozitivní bakterie
Jako grampozitivní se oznaþují ty bakterie, u nichž bunČþné stČny po obarvení Gramovým barvícím roztokem a moĜení jodovým roztokem neztrácejí toto barvivo pĤsobením organických rozpouštČdel (acetonu nebo ethanolu). U gramnegativních bakterií je toto barvivo z obarvených bunČk uvedenými rozpouštČdly vyplavováno, takže se buĖky odbarví. Gramova barvení se používá pĜi diagnostice bakterií. Grampozitivní bakterie mají Ĝadu spoleþných fyziologických vlastností, odlišujících je od gramnegativních bakterií (napĜ. citlivost k nČkterým antibiotikĤm, aniontovým povrchovČ aktivním látkám a toxickým barvivĤm). Bylo zjištČno, že všechny tyto vlastnosti jsou odrazem rozdílĤ složení bunČþných stČn grampozitivních a gramnegativnívh bakterií. (Šilhánková, 2002) Hlavní složkou bunČþné stČny grampozitivních bakterií je silná peptidoglykanová vrstva, která je jako tmelem vyplnČna teichoovou kyselinou (Obr. 2). Základem teichoové kyselin je u nČkterých bakterií polyglycerolfosfát, u jiných polyribitolfosfát. Teichoová kyselina je vázána kovalentní vazbou na muramovou kyselinu a pĜedstavuje až 50% sušiny bunČþné stČny grampozitivních bakterií. KromČ teichoové kyseliny jsou na peptidoglykan grampozitivních bakterií vázány ještČ polysacharidy složené z glukosy, galaktosy, mannosy a nČkterých dalších monosacharidĤ. Složení tČchto polysacharidĤ je specifické pro jednotlivé skupiny bakterií a je zodpovČdné za imunochemické reakce, tj. za specifické antigenní vlastnosti jednotlivých skupin bakterií.
13
Obr.2: BunČþná stČna grampozitivních bakterií, zdroj internet: http://www.wikiskripta.eu/
1.2.1.2 Gramnegativní bakterie StČna gramnegativních bakterií se skládá z tenké vrstvy peptidoglykanĤ bez teichoové kyseliny a z tzv. vnČjší membrány, jež obsahuje fosfolipidy, strukturní i enzymové proteiny, lipoproteiny a lipopolysacharidy. StČny gramnegativních bakterií neobsahují teichoovou kyselinu (viz. Obr. 3), což je zĜejmČ, spolu s pomČrnČ tenkou vrstvou peptidoglykanu, pĜíþinou vyplavování komplexu Gramova barviva z buĖky pĤsobením acetonu nebo ethanolu. Mezi vnČjší membránou a peptidoglykanovou vrstvou je tzv. periplazmatický prostor. NČkteré lipoproteiny tvoĜí výbČžky smČrem k peptidoglykanové vrstvČ a jsou s ní spojeny kovalentní vazbou. Ve fosfolipidové vrstvČ jsou hydrofilní tunely (póry), tvoĜené triméry bílkoviny zvané porin. Tyto póry zasahují pĜes periplazmatický prostor až k peptidoglykanu, k nČmuž je porin pevnČ, ale nekovalentnČ vázán. (Šilhánková, 2002)
14
Obr. 3: BunČþná stČna gramnegativních bakterií, zdroj internet: http://www.wikiskripta.eu/
Obsah lipidĤ ve stČnČ gramnegativních bakterií je pĜíþinou jejich zvýšené odolnosti k aniontovým povrchovČ aktivním látkám, jako jsou mýdla, žluþové kyseliny, alkylsulfáty nebo alkylsulfonáty apod. Tato odolnost ke žluþovým kyselinám umožĖuje vysoký výskyt gramnegativních bakterií (hlavnČ enterobakterií) ve stĜevním traktu savcĤ. V praxi se této odolnosti využívá pĜi pĜípravČ selektivních živných pĤd pro stanovení stĜevních bakterií v potravinách nebo ve vodČ. Lipopolysacharidy bunČþné stČny patogenĤ (napĜ. pĜíslušníkĤ rodu Salmonella) fungují jako endotoxiny, neboĢ v tČle živoþichĤ vyvolávají charakteristické pĜíznaky onemocnČní; jsou zodpovČdné za somatickou (tČlovou) antigenní specifitu, oznaþovanou jako O antigen. Tato specifita spoþívá v tom, že lipopolysacharid urþitého chemického složení vyvolává v krvi savcĤ syntézu specifické protilátky, vedoucí k imunitČ tj. k odolnosti vĤþi tomuto lipopolysacharidu, a tedy i vĤþi celé bakteriální buĖce. Antigenní specifita je velmi vysoká pĜedevším u stĜevních bakterií, takže u nČkterých druhĤ je možno rozlišit velké množství sérotypĤ (nebo sérovarĤ), odrážející rozdíly ve složení stČnových lipopolysacharidĤ. NapĜ. u patogenního rodu Salmonella, který byl z tohoto hlediska nejlépe prostudován a který má pouze þtyĜi druhy, bylo rozlišeno pĜes 2000 sérovarĤ. Pro pĜípravu protoplastĤ je u gramnegativních bakterií zapotĜebí pĜidat k lysozymu v izotonickém prostĜedí nČjaké chelataþní þinidlo, napĜ. EDTA. Ani pak však nedochází k úplnému odstranČní všech složek bunČþné stČny, a proto vzniklý kulovitý útvar mnohem snáze regeneruje v normální buĖku, než je tomu u protoplastĤ grampozitivních bakterií. Z tČchto dĤvodĤ se þasto protoplast gramnegativních bakterií nazývá nepravý protoplast nebo sféroplast. (Šilhánková, 2002)
15
1.2.1.3 PĤsobení lysozymu na bunČþnou stČnu bakterií Lysozym hydrolyzuje glykosidickou vazbu, která spojuje N-acetylmuramovou kyselinu se þtvrtým atomem uhlíku N-acetylglukosaminu na disacharidové jednotky. BuĖky bakterií, zbavené peptidoglykanu, snadno praskají a lyzují díky osmotickému tlaku a jsou snadno fagocytovány. (Šilhánková, 2002; Kaprálek, 1986). Obr. 4: Struktura lysozymu , zdorj internet: http://upload.wikimedia.org/
16
1.2.2
Cytoplazmatická membrána bakterií
Cytoplazmatická membrána bakterií je velmi jemná a tenká membrána (silná asi 7 nm), která je zĜetelná pouze v elektronovém mikroskopu. Je složená z fosfolipidĤ a proteinĤ (viz. Obr. 5), pĜiþemž proteiny pĜedstavují 50 až 70 % její sušiny. Z cytoplazmatické membrány bakterií vybíhají do cytoplazmy vychlípeniny, jejichž poþet a velikost jsou závislé na druhu bakterií. U nČkterých druhĤ jsou tyto vychlípeniny zastoupeny v hojném poþtu, u jiných je jen jeden nebo dva. Zvláštním typem tČchto vychlípenin jsou mesosomy (viz. Obr. 6), které se vyskytují hlavnČ poblíž oblasti, kde se pĜi dČlení buĖky tvoĜí pĜepážka. Mesosomy jsou tvoĜeny jedinou membránou, která je však složena do mnoha záhybĤ a je vychlípeninou cytoplazmatické membrány. Cytoplazmatická membrána je sídlem dýchacích enzymĤ, systému oxidaþní fosforylace, enzymĤ syntézy a hydrolýzy fosfolipidĤ a koneþné fáze syntézy složek bunČþné stČny a pouzdrových obalĤ. V membránČ fototrofních bakterií je pĜítomen také bakteriochlorofyl, nezbytný pro pĜemČnu svČtelné energie v energii chemickou, a celý systém uskuteþĖující tuto pĜemČnu. PĜi rĤstu na svČtle je veškerá cytoplazma bakterií prostoupena nádobkovitými nebo lamelárními vychlípeninami membrány. V cytoplazmatické membránČ bakterií jsou dále pĜítomny bílkovinné pĜenašeþe, nutné pro transport látek do buĖky a z buĖky. (Šilhánková, 2002)
Obr. 5: Cytoplazmatická membrána bakterií, upraveno dle http://upload.wikimedia.org/
17
1.2.3
Cytoplazma bakterií
KromČ bČžných složek, pĜítomných ve všech mikrobiálních buĖkách, obsahuje cytoplazma nČkterých bakterií také barviva. NejþastČji jsou to karotenoidní barviva, která zbarvují buĖky a jejich kolonie žlutČ, oranžovČ, rĤžovČ, pĜípadnČ až þervenČ. Jako rezervní látky jsou v cytoplazmČ bakterií pĜítomny vedle zrníþek volutinu hlavnČ kapiþky poly-ȕ-hydromáselné kyseliny. Tato slouþenina se Ĝadí k lipidĤm, neboĢ se barví stejnými barvivy jako neutrální tuky, tj. sudanem, šarlachem apod. Neutrální tuky, tj. glyceridy vyšších mastných kyselin, se u bakterií jako rezervní látky nevyskytují. NČkteré bakterie obsahují jako rezervní látky polysacharid granulosu, jehož zrníþka se barví roztokem jodu modĜe, nebo polysacharid glykogen, barvící se jodem hnČdoþervenČ. Ribosomy bakterií jsou ponČkud menší než ribosomy eukaryotních mikroorganismĤ a tvoĜí až 40% sušiny cytoplazmy. Tento mimoĜádnČ vysoký obsah ribosomĤ, v nichž probíhá syntéza bílkovin, umožĖuje obrovskou rychlost syntézy buČþné hmoty bakterií: za optimální teploty, pH a pĜísunu živin se bunČþná hmoty bakterií zdvojnásobí za 15 až 25 minut. (Šilhánková, 2002)
1.2.4
Jaderný materiál bakterií a jeho funkce
Jaderný materiál bakterií tvoĜí deoxyribonukleová kyselina (DNA) umístČná pĜímo v cytoplazmČ a doprovázená malým množstvím polyaminĤ. DNA vČtšiny bakterií tvoĜí chromosom, který má uzavĜenou strukturu, takže si jej zjednodušenČ mĤžeme pĜedstavit jako kružnici. Molekula DNA je ovšem ve srovnání s bakterií nepomČrnČ delší: napĜ. chromosom Escherichia coli je dlouhý 1,1 až 1,4 mm, zatímco buĖka má délku 1 až 2 µm. Bakteriální chromosom je napojen na vnitĜní stranu cytoplazmatické membrány vČtšinou prostĜednictvím mesosomu (viz. Obr. 6).
Obr. 6: Mesosom upraveno dle http://home.earthlink.net/
18
Molekula DNA má u bakterií, podobnČ jako u ostatních organismĤ, tvar dvojité šroubovice, tj. šroubovice tvoĜené dvČma paralelními ĜetČzci, jež jsou vzájemnČ spojeny vodíkovými mĤstky. Je to polynukleotid obsahující dvČ purinové báze (adenin a guanin) a dvČ pyrimidinové báze (thymin a cytosin). Cukr deoxyribosa (tj. 2-deoxy-D-erythropentosa) je vázán svým prvním uhlíkem na purinovou bázi, þímž se vytváĜí nukleosid (viz. Obr. 7). Kyselina fosforeþná spojuje pátý uhlík nukleosidu s tĜetím uhlíkem dalšího nukleosidu.
Obr. 7: Fosfodiesterová vazba v DNA, zdroj internet : http://www.aldebaran.cz/
19
PoĜadí bází v ĜetČzci je velmi dĤležité, neboĢ udává složení bílkovin a ribonukleových kyselin v buĖce. Protilehlé báze dvou paralelních ĜetČzcĤ jsou spolu spojeny vodíkovými mĤstky, a to tak, že adenin (A) je vždy spojen dvČma vodíkovými mĤstky s tyminem (T) a guanin (G) tĜemi mĤstky s cytosinem (C), takže nastává párování A-T a G-C (viz. Obr. 8).
Obr. 8: Struktura DNA, zdroj internet: http://www.sci.muni.cz/
Urþitý úsek DNA pĜedstavuje informaci o složení urþité molekuly bílkoviny nebo ribonukleové kyseliny anebo má urþitou regulaþní funkci a je oznaþován jako gen. NapĜ. molekula DNA Escherichia coli obsahuje zhruba 4,6 . 106 párĤ bází, což pĜedstavuje materiál pro asi 3000 genĤ. Molekula DNA bakterií rodu Lactobacillus obsahuje pĜibližnČ 2 . 106 párĤ bází. Jak již bylo Ĝeþeno, byl v klidové buĖce dosud studovaných bakterií zjištČn vždy jeden chromosom. PĜi rozmnožování bakterií, tj. pĜi dČlení bunČk, dochází nejdĜíve ke zdvojení molekuly DNA neboli replikaci DNA, takže v buĖce jsou dva chromosomy; pak se teprve buĖka rozdČlí ve dvČ. Je-li dČlení bunČk poškozeno nebo zpomaleno, avšak replikace DNA není zmČnČna, vznikají vláknité vícejaderné buĖky. Je-li poškozena nebo inhibována replikace DNA, avšak ostatní syntetické procesy probíhají normálnČ, vzniká také vláknitý útvar, který však obsahuje jen jeden chromosom. (Šilhánková, 2002)
20
1.3 Magnetické nosiþe V oblasti biotechnologie byly magnetické þástice poprvé použity v roce 1973 P. J. Robinsonem (Bruce, 2004). P. J. Robinson použil oxid železitý pokrytý oxidem kĜemiþitým a oxid železitý pokrytý celulózou. Na tyto magnetické nosiþe imobilizoval enzymy Į-chymotrypsin a ȕ-galaktosidasu. NáslednČ je používal pro aplikace v bioreaktorech. Separaþní techniky využívající mikroþástice a nanoþástice jako magnetické nosiþe se stále více prosazují pĜi separaci biologických molekul a bunČk. ZmínČné techniky jsou uplatĖovány v mnoha vČdních oborech biochemie, biologie, biotechnologie a lékaĜství. Rychlost a jednoduchost separace látek z homogenních i heterogenních materiálĤ jsou hlavními výhodami pĜi použití magnetických nosiþĤ. Další pĜedností, napĜíklad pĜi izolaci bakteriální DNA, je možnost vyhnout se používání organických toxických látek (fenol). Separaci je možno provádČt ve standardnČ vybavené laboratoĜi, není tĜeba žádného nákladného instrumentálního vybavení. Techniky separace na magnetických nosiþích je možno pokládat za jednoduché, levné a úþinné (Bruce, 2004; Sakar a kol., 2008). Magnetické materiály se vyznaþují širokým rozsahem magnetických vlastností. VČtšina magnetických nosiþĤ používaných k separaci má superparamagnetické vlastnosti. Bez pĤsobení magnetického pole se þástice navzájem nijak nepĜitahují a tvoĜí stejnorodou smČs, v pĜítomnosti vnČjšího magnetického pole jsou však pĜitahovány ke zdroji (magnetu) a mohou tak být ze smČsi izolovány magnetickým separátorem (ŠafaĜíka kol., 1999). Magnetické þástice se skládají z magnetického jadérka, které zajišĢuje þástici její magnetické vlastnosti, ochranného obalu - chránící jadérko pĜed vnČjšími vlivy a z aktivní molekuly podle afinity k vybraným látkám (Obr. 9).
Obr. 9: Magnetická þástice pro biotechnologické aplikace, upraveno dle (McBain a kol., 2008)
21
Magnetické jadérko se vČtšinou skládá z materiálu na bázi magnetických oxidĤ železa (magnetit - Fe3O4, maghemit - Ȗ-Fe2O3). PĜipravené magnetické jadérko by mČlo mít požadovanou velikost a magnetické vlastnosti. Pro biologické aplikace je tĜeba minimalizace nežádoucích nespecifických interakcí kovu s vnČjším prostĜedím a složkami v nČm. Toho je dosaženo pokrytím þástic vysoko- nebo nízko-molekulárními polymery. Mezi nejþastČji používané polymery patĜí poly(glycidyl methakrylát) (PGMA), poly(2-hydroxyethyl methakrylát) (P(HEMA)), a jejich kopolymery a polystyren. Polymery P(HEMA) a PGMA se Ĝadí mezi hydrofilní nosiþe, jejichž výhodou jsou: vysoká mechanická stabilita, biokompatibilita, nízká nespecifická adsorpce biologicky aktivních látek a široké využití pro biomedicínské aplikace. PGMA má navíc výhodu pĜítomnosti oxiranové skupiny, která sice není pĜíliš reaktivní, ale lze ji snadno upravit hydrolýzou, aminací, oxidací atd. Polymery založené na polystyrenu mají hlavní nedostatek v tom, že vyvolávají hydrofobní interakce s biomolekulami i pĜesto jsou v souþasnosti nejvíce používané. Pomocí specifické vazby jsou cílové molekuly ze vzorku navázány na aktivní molekuly tvoĜící vnČjší vrstvu magnetických þástic. Magnetické þástice lze rozdČlit podle typu funkcionalizovaného povrchu a užití (Obr. 10). (Rittich a kol., 2006; Life Technologies Corporation, 2011; Horák a kol., 2004; Kubicz, 2010).
22
Obr. 10: Typy a užití magnetických mikroþástic, upraveno dle http://www.invitrogen.com/ a http://www.biclone.us/
23
1.4 Replikace DNA Replikace DNA se uskuteþĖuje tak, že v urþitém místČ se oba paralelní ĜetČzce vzdálí a ke každému z nich se zaþíná syntetizovat doprovodný ĜetČzec na principu párování bází. PĤvodní ĜetČzec tedy slouží jako pĜedloha pro novČ vznikající ĜetČzec. Tím je zaruþeno, že z jedné molekuly DNA vzniknou dvČ molekuly, jež jsou po chemické stránce totožné. Každá z tČchto molekul obsahuje jeden ĜetČzec pĤvodní a jeden novČ syntetizovaný. Klíþovým enzymem pĜi replikaci DNA je DNA polymerasa (viz. Obr. 10). Jedná se o amplifikaci DNA in vivo.
Obr. 11: DNA replikace, zdroj internet:http://upload.wikimedia.org/
Tato tzv. semikonzervativní replikace DNA je spoleþná všem živým organismĤm a vyskytuje se i pĜi replikaci virové DNA. Tento zpĤsob syntézy DNA, jenž zaruþuje pĜesný pĜenos genetické informace z mateĜské buĖky do buĖky dceĜiné, je tedy základem dČdiþnosti. Jen velmi vzácnČ dochází pĜi replikaci DNA k chybČ a pak hovoĜíme o samovolné neboli spontánní mutaci. Syntéza bakteriální DNA probíhá od tzv. iniciaþního bodu, který se nachází v místČ napojení chromosomu na cytoplazmatickou membránu, a postupuje obČma smČry. Proces replikace, její prĤbČh a regulaci, zajišĢuje nČkolik bílkovin enzymové povahy. Celý tento proces je ovládán více než dvaceti geny.
24
1.5 Polymerázová ĜetČzová reakce Polymerázová ĜetČzová reakce (PCR) a postupy na ní založené jsou ve výzkumných laboratoĜích nejvíce využívanou molekulárnČ diagnostickou metodou. Podstatou PCR je cyklicky se opakující syntéza urþitého úseku DNA. Jedná se o amplifikaci DNA in vitro. K vybraným úsekĤm komplementárních vláken denaturované DNA se hybridizují (pĜipojují) krátké syntetické oligonukleotidy (primery), od nichž probíhá syntéza nového ĜetČzce DNA. Syntéza je katalyzována termostabilní DNA dependentní DNA-polymerasou. PCR je proces, pĜi nČmž se v závislosti na teplotČ reakþní smČsi pravidelnČ stĜídají tĜi kroky, bČhem nichž probíhají tĜi odlišné dČje (viz. Obr. 12): - denaturace dvouĜetČzcových molekul DNA (94 °C), - pĜipojení primerĤ k oddČleným ĜetČzcĤm DNA (50 - 65 °C), - syntéza nových ĜetČzcĤ DNA katalyzovaná DNA-polymerasou (65 - 75 °C)
25
Obr. 12: Polymerázová ĜetČzová reakce – schema, zdroj internet: http://www.wikiskripta.eu/
26
Postupným opakováním tohoto procesu se exponenciálnČ (2n; n = poþet cyklĤ) syntetizuje až 109 kopií vybraného úseku DNA. Optimální poþet cyklĤ je závislý na výchozí koncentraci templátové DNA a zpravidla se pohybuje v rozmezí od 25 - 35 cyklĤ. Reakce se provádí v termocykleru, v nČmž se teplota mČní automaticky v naprogramovaných þasových intervalech. PĜi pĜíliš vysokém poþtu cyklĤ se úþinnost DNA-polymerasy snižuje. Výsledným produktem PCR jsou amplikony, což jsou úseky DNA definované délky o velikosti obvykle desítky až tisíce párĤ bází (bp). Jejich pĜítomnost se v reakþní smČsi prokazuje elektroforézou na agarosovém polyakrylamidovém gelu nebo kvantitativním mČĜením množství produktu v reálném þase (PCR v reálném þase). Reakþní smČs (obvykle v rozmezí objemĤ 25 - 100 µl) se skládá z následujících složek: Matrice DNA (DNA templát) - makromolekula DNA, podle které se komplementárnČ syntetizují nové ĜetČzce DNA. Obsahuje cílová místa pro primery. Typická množství bakteriální a plasmidové DNA, pĜidávané do reakce, jsou 10 a 1 ng a 10 pg. Oligonukleotidové primery - bývají synteticky pĜipravené a jsou komplementární k templátové DNA, která má být amplifikována. Primery jsou sekvenþnČ specifické a nesmí obsahovat falešná vazebná místa templátu. Typické primery mají 18 - 30 nukleotidĤ a obsahují 40 - 60 % GC bází. Teplota tání primerĤ bývá v rozmezí 55 - 80 °C. Primery by nemČly být mezi sebou komplementární, zejména ne na 3´-konci, kde párování dvou nebo tĜí bází mĤže vést ke vzniku dimerĤ primerĤ, zejména pĜi nadbytku primerĤ. PotĜebná koncentrace primeru pro jednu reakci je 0,1 - 0,5 µM. DNA-polymerasa - syntetizuje novou DNA ve smČru 5´ ĺ 3´ podle sekvence nukleotidĤ v komplementárním ĜetČzci DNA od 5´ konce primeru. Ke katalýze se používají termostabilní polymerasy, napĜ. Taq DNA-polymerasa izolovaná z mikroorganismu Thermus aquaticus. 2´ -deoxynukleosid-5´-trifosfáty (dNTP) - (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) - stavební kameny pro syntézou nové DNA. Optimalní koncentrace je 200 µM, toleranþní rozpČtí je 20 - 400 µM. Vysoké koncentrace dNTP (od 4 mM a výše) pĤsobí inhibiþnČ, protože vyvazují hoĜeþnaté ionty (Mg2+). Mg2+ ionty - jsou nezbytné pro aktivitu DNA-polymerasy. Koncentrace Mg2+ musí být optimalizována pro každou kombinaci primerĤ a DNA templátu. Obvykle se používá koncentrace 1,5 mM Mg2+. Toleranþní rozpČtí je 0,5 - 8 mM. Vyšší koncentrace iontĤ snižuje specifitu PCR. U primerĤ bohatých na G a C báze je ale použití vyšší koncentrace Mg2+ vhodnČjší. Pufr pro PCR - vytváĜí optimální prostĜedí pro DNA-polymerasu. Standardní reakþní pufr obsahuje 10 mM Tris-HCl (pH 8,3 - 8,8), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2. PĜípadnČ mĤže ještČ obsahovat acetamid, albumin, želatinu nebo Tween 20. Voda pro PCR - používá se na doplnČní smČsi pro PCR na požadovaný objem. NejvhodnČjší je voda o odporu 18 mȍ nebo voda pro injekce ýSL 4.
27
DNA-polymerasa, smČs dNTP, PCR pufr (bez nebo s Mg2+ ionty) jsou dodávány výrobci (prodejci) DNA-polymerasy. Podmínky amplifikace uvádČné v následujícím textu závisí na použitých chemikáliích, pĜístrojové technice a spotĜebním materiálu. Proto je nutné podmínky amplifikace validovat a v ĜadČ pĜípadĤ optimalizovat. Doporuþuje se používat všechny pufry od stejného výrobce. PĜi separaci DNA se jako nosiþe použivají agarosa (pro separaci molekul o velikosti 200 - 50 000 bp) a polyakrylamid (pro separaci molekul o velikosti 10 - 1 000 bp). Vysoká citlivost a specifita PCR zpĤsobuje, že kontaminace i jedinou molekulou exogenní nebo neznámé DNA postaþuje pro získání falešnČ pozitivního výsledku. (Španová a Rittich , 2010)
28
2
CÍL PRÁCE
Cílem práce byla pĜíprava DNA v kvalitČ vhodné pro polymerázovou ĜetČzovou reakci Pozornost byla zamČĜena na lyzy bunČk pomocí rĤzných látek: lysozymu v roztoku, imobilizovaného lysozymu a enzymĤ obsaženým v pracích prášcích. DNA byla poté izolována s využitím magnetických nosiþĤ. Jako kontrola byla pro izolaci DNA použita fenolová extrakce. Pro pĜípravu hrubých lyzátu bunČk a izolaci DNA byly použity sbírkové kmeny rodu Lactobacillus a mléþné výrobky.
29
3
EXPERIMENTÁLNÍ ýÁST
3.1 Materiál 3.1.1
Použité bakteriální kmeny
Použití bakteriální kmeny pocházely z ýeské sbírky mikroorganismĤ (CCM, Brno. ýR) a Sbírky mlékaĜských kultur Laktoflora (CCDM, Tábor, ýR). Byly použity následující kmeny: Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088 Lactobacillus plantarum CCM 7039 Lactobacillus fermentum CCM 7192. 3.1.2
Použité mléþné výrobky
Použité mléþné výrobky byly zakoupeny v bČžném obchodČ s potravinami. à
Acidofilní mléko (mlékárna Valašské MeziĜíþí)
Acidofilní mléko plnotuþné. Složení: mléko, mléþné kultury, ABT kultura, (Lactobacillus acidophillus, Bifidobacteria sp., Streptococcus thermophillus). 100g výrobku prĤmČrnČ obsahuje: energie 280 kJ/ 67 kcal, tuk min. 3,6g hmotnosti. Obsahuje živou mikroflóru. à
Jogurt ochucený mango (Zott)
Složení: mléko, mango, koncentrát manga, glukozo-fruktozový sirup, cukr, sušené mléko, E100 Kurkumin (Cl pĜírodní žluĢ 3), aroma, jogurtová kultura
à
Bílý jogurt (Madeta)
Složení: plnotuþné mléko,sušené mléko, jogurtová kultura
30
3.1.3
Prací prášky
Amway - SA8 TM – Premium + BIOQUEST prací prášek (Amway TM) Persil prášek – PERSIL color pulver: Gold (Henkel) Persil modrý tekutý - PERSIL Color prací gel pro barevné prádlo (Henkel) Persil zelený tekutý - PERSIL universal: Gold tekutý prací gel (Henkel) PER 100% - univerzální prací gel (Complete) 3.1.4
Chemikálie
3.1.4.1 Chemikálie pro pĜípravu roztokĤ à à à à à à à à à à à à à à à à à à à à à à
Agarosa pro elektroforézu DNA (Serva, Heidelberg, SRN) DNA standard (100 bp) (Malamité, Moravské Prusy, ýR). Obsahuje fragmenty o délce: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500 bp Ethanol (Lachema, Brno, ýR) Ethidium bromid (5 mg/ml) (EtBr) (Sigma, St. Lois, USA) Ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) (Serva, Heidelberg, SRN) Fenol pH 7,8 (Sigma, St. Louis, USA) Hydroxid sodný (Lachema, Brno, ýR) Chlorid sodný (Lachema, Brno, ýR) Chlorid draselný (Lachema, Brno, ýR) Chloroform (Lachema, Brno, ýR) Isoamylalkohol (Lachema, Brno, ýR) Kyselina boritá (HBO2) (Lachema, Brno, ýR) Lysozym (Renal, BudapešĢ, Maćarsko) Nanášecí pufr (2,5 % Ficoll 400) (Top-Bio, Praha, ýR) Octan sodný (Lachema, Brno, ýR) PCR komponenty: 10x reakþní pufr, Taq DNA polymeráza dNTP smČs (Top. Bio, Praha, ýR) Primer LbLMA 1-rev, primer R 16-1 (Generi Biotech s.r.o, ýR) PEG 6000 (Sigma, St. Louis, USA) Proteinasa K (100 ȝg/ml) (Sigma, St. Louis, USA) RNasa A (Reanal, BudapešĢ, Maćarsko) dodecylsulfát sodný (SDS) (Sigma, St. Louis, USA) Tris-hydroxymethyl-aminomethan (Tris base) (Amresco, Solon, USA)
Ostatní chemikálie byly þistoty p.a. a pocházely z bČžných komerþních zdrojĤ.
31
3.1.4.2 Magnetické þástice à
Magnetické neporézní mikroþástice
Poly(2-hydroxyethyl methakrylat-co-glycidyl methakrylát) (P(HEMA-co-GMA)) (1:1) o prĤmČru þástic 2,2 ȝm, s obsahem železa 6,5 %. ýástice byly pokryty karboxylovými skupinami a obsahem -COOH skupin 2,67 mM. ýástice byly pĜipraveny na Makromolekulárním ústavu Akademie vČd ýR v Praze (ing. D. Horák, CSc.). à
Imobilizovaný lysozym
Poly-(2-hydroxyethyl methakrylat-co-glycidyl methakrylát) (P(HEMA-co-GMA)) (1:1) o prĤmČru þástic 2,2 um, s obsahem železa 6,5 % a navázaným lysozymem. ýástice byly pĜipraveny na Makromolekulárním ústavu Akademie vČd ýR v Praze (ing. D. Horák, CSc.)
3.1.4.3 Roztoky 3.1.4.3.1 Roztoky pracích práškĤ Do 10 ml sterilní vody byl rozpuštČno 0,4 g (400 ȝl) pracího prášku. Poté byl roztok pĜefiltrován pĜes bakterilogický filtr (póry 0,4 ȝl). 3.1.4.3.2 Kultivaþní média à M R.S. médium MRS médium bylo pĜipraveno dle návodu výrobce. V 1 000 ml destilované vody bylo rozpuštČnoí 52 g MRS média, pH média bylo upraveno na hodnotu 6,2. Médium bylo sterilizováno v autoklávu (121 °C/15 minut). à M.R.S. agar. MRS médium bylo pĜipraveno podle návodu výrobce. Byla pĜidána agarosa (15 g/l). Médium bylo sterilizováno v autoklávu (121 °C/15 minut). Poté bylo médium rozplnČno do Petriho misek a uchováváno v ledniþce.
32
3.1.4.3.3 Roztoky pro pĜípravu hrubých lyzátĤ à 0,5 M EDTA (pH 8,0) Navážka 202,2 g EDTA byla pĜevedena do 800 ml destilované vody, poté byla nádoba s roztokem umístČna na magnetickou míchaþku, pH bylo upraveno pĜidáním asi 20 g NaOH v peletkách. Nejprve bylo pĜidáno 15 g a potom byl pĜidán zbytek za kontroly pH. Objem byl doplnČn destilovanou vodou do 1 l. Roztok je možné pĜefiltrovat. Sterilizovat v autoklávu (121 °C/15 min). Rozplnit do alikvotĤ. à 1 M Tris-HCl (pH 7,8) V 80 ml destilované vody bylo rozpustČno v 12,1 g Tris-base. Bylo upraveno pH pomocí koncentrované HCl. Objem byl doplnČn destilovanou vodou do 100 ml. Roztok byl sterilován v autoklávu (121 °C, 15 minut). à Lyzaþní roztok A (10 mM Tris pH 7,8, 5 mM EDTA pH 8,0) SterilnČ bylo smícháno 1 ml 1M Tris HCl (pH 7,8), 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) a 98 ml destilované vody. à Lyzaþní roztok B (10 mM Tris pH 7,8, 5 mM EDTA pH 8,0, lysozym 3 mg/ml) SterilnČ bylo smícháno 1 ml 1M Tris HCl (pH 7,8) , 1 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) a 98 ml destilované vody. PĜed použitím byl do roztoku pĜidán lysozym. à SDS (10 %, 20 %) 10 (20) g SDS bylo rozpuštČno v 90 (80) ml sterilní destilované vodČ. Bylo upraveno pH na 7,0 nČkolika kapkami koncentrované HCl. Objem byl doplnČn destilovanou vodou do 100 ml. PĜi vážení práškového SDS je nutné používat ústenku. Proteinasa K (100 ȝg/ml) 100 µg proteinasy K bylo rozpuštČno v 1 ml sterilní destilované vody. Roztok Proteinasy K byl rozplnČn do alikvotĤ a uchovánán v - 20 °C. à
à CIZ SmČs chloroformu a isoamylalkoholu v pomČru 24:1 à 1 M NaOH 40 g NaOH bylo rozpuštČno v 800 ml destilované vody a doplnČno do 1 l. Poté byl roztok NaOH rozplnČn do alikvotĤ. Roztoky pro izolaci DNA pomocí magnetických nosiþĤ à 1 x TE pufr SterilnČ bylo smícháno 1 ml 1 M Tris (pH 7,8) a 100 µl 0,5 M EDTA (pH 8,0) s 98,9 ml destilované vody (na výslednou koncentraci 0,01 M Tris a 0,001 M EDTA).
33
à 5 M NaCl 58,4 g NaCl bylo rozpuštČno ve 150 ml destilované vody a doplnČno destilovanou vodou do 200 ml. Poté byl roztok sterilizován v autoklávu (121 °C/15 minut). à 40 % PEG 6000 40 g PEG 6000 bylo rozpuštČno v 60 ml sterilní destilované vody a doplnČno sterilní destilovanou vodou do 100 ml. Roztok byl uchováván pĜi 4 °C. à 70 % ethanol Bylo smícháno 70 ml 96 % ethanolu s 26 ml destilované vody. 3.1.4.3.4 Roztoky pro agarózovou gelovou elektroforézu à DNA standard (100 bp) Obsahuje fragmenty o délce: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500 bp à 5 × TBE pufr 54 g Tris-base a 27,5 g kyseliny borité bylo rozpuštČno v 600 ml destilované vody. Poté bylo pĜidáno 20 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) a doplnČno destilovanou vodou do 1 l. Lze pĜefiltrovat a sterilizovat v autoklávu. PĜed použitím byl roztok 10 x naĜedČn na výslednou koncentraci 45 mM Tris, 45 mM kyselina boritá a 1 mM EDTA. à Agarosový gel 1,8% 1,8 g agarosy byl rozvaĜen ve 100 ml 0,5 × koncentrovaného TBE pufru. à Ethidium bromid (0,5 ȝg/ml) 100 ȝl roztoku EtBr o koncentraci 2,5 mg/ml bylo zĜedČno 500 ml sterilní vody.
34
3.1.5 à à à à à à à à à à à à à à à à à
PĜístroje a pomĤcky Centrifuga (Eppendorf AG, Hamburg, NČmecko) Centrifuga MINI Spin 13 400 min-1 (Eppendorf, Hamburg, NČmecko) Laboratorní váhy (Kern & Sohn, NČmecko) Magnetický separátor Invitrogen Dynal AS (Dynal Biotech, Oslo, Norsko) Mikropipety Discovery HTL o objemu 10 ȝl, 20 ȝl, 200 ȝl, 1000 ȝl (Discovery HTL, Varšava, Polsko) Mikrovlná trouba SMW 5020 (Sencor, ýR) Minicentrifuga C1301 (Labnet international, Inc., USA) Minicycler PTC 150 (MJ Research, Watertown, USA) NanoPhotometr (Implen, NČmecko) Termocycler PTC-200 (BIO-RAD Lab., USA) Termostat – Mini incubator (Labnet, USA) Transluminátor TVR 3121 (Spectroline, Paramount, USA) ZaĜízení pro elektroforézu Easy-Cast, model B1 (Owl Scientific, USA) Zdroj elektrického napČtí Lighting volt Power Supply, model OSP-300 (Owl Scientific, USA) Laboratorní sklo a pomĤcky
35
3.2 Metody 3.2.1
Kultivace bakterií
Bakteriální druhy rodu Lactobacillus byly inokulovány do tekutého média MRS (0,3 ml/10 ml) a následnČ kultivovány po dobu 48 hodin pĜi 37°C. Pracovalo se sterilnČ.
3.2.1.1 Stanovení poþtu bunČk Bakteriální kultury byly 10x naĜedČny MRS médiem a byla zmČĜena absorbance A600nm tekutého média s narostlou kulturou. Pracovalo se sterilnČ. 3.2.1.2 Stanovení poþtu bunČk kultivaþní metodou Kultura bakteriálního kmene Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 byla narostlá A600nm = 5,7. Vzorek o pĜíslušné absorbanci byl zĜedČn na 1Â10-6, 1Â10-7 a 1Â10-8. 100 ȝl naĜedČného vzorku bylo rozetĜeno na agarovou plotnu. Vzorky byly uloženy do inkubátoru (37°C) a ponechány rĤst po dobu 48 hod. Po 48 hod byly spoþítány kolonie vyrostlé na plotnách a stanoven poþet bunČk (cfu/ml). Pracovalo se sterilnČ. 3.2.2
PĜíprava hrubých lyzátĤ (HL) bunČk
Jeden ml bunČþné suspenze o A600nm = 3,0 byl centrifugován 3 min pĜi 15000 ot/min. NáslednČ byl supernatant slit a sediment byl resuspendován v 1 ml roztoku A (10 mM Tris-HCl pH 7,8; 5 mM EDTA pH 8,0). Suspenze byla opČt centrifugována za stejných podmínek. Po odstĜedČní bunČk byl supenratant opČt slit a sediment byl resuspendován v 500 ȝl roztoku B s obsahem lysozymu 3 mg/ml. K buĖkám s bunČþnou stČnou narušenou lysozymem bylo pĜidáno 25 ȝl 10 % SDS a 5 ȝl proteinasy K (100 mg/ml). SmČs byla ponechána inkubovat pĜi 55°C do druhého dne. Takto pĜipravené hrubé lyzáty byly použity pro izolaci DNA fenolovou extrakcí a magnetickými nosiþi.
36
3.2.3
Izolace bakteriální DNA
3.2.3.1 Fenolová extrakce K 500 µl lyzátu bunČk byl pĜidán stejný objem fenolu (pĜedestilovaného, pH upraveno na hodnotu 7,8). Poté byla smČs kývavým pohybem opatrnČ promíchávána 4 minuty. NáslednČ byla smČs odstĜedČna pĜi 15 000 ot/min po dobu 5 minut. Pomocí špiþky s ustĜiženým hrotem byla odebrána vodní fáze s DNA do þisté Eppendorfovy zkumavky. Vodní fáze s DNA byla doplnČna TE pufrem na objem 500 µl a poté bylo pĜidáno 700 µl smČsi chloroform–isoamylalkohol (24:1). SmČs byla opatrnČ promíchávána kývavým pohybem 4 minuty. Poté byla smČs opČt odstĜedČna pĜi 15 000 ot/min po dobu 5 minut. Vodní fáze s DNA byla odebrána do þisté Eppendorfovy zkumavky. DNA byla následnČ vysrážena 96% ethanolem. 3.2.3.1.1 Srážení DNA ethanolem Pomocí automatické pipety byl zmČĜen objem vzorku DNA (400 ȝl). Ke vzorku DNA byla pĜidána 1/20 objemu 3 M octanu sodného (20 µl). Vše bylo dobĜe promícháno. NáslednČ byl pĜidán 1 ml (2,5 násobek objemu) ethanolu (96 %) a smČs byla promíchána. DNA byla srážena pĜi - 20 °C po dobu 15-60 min. SmČs byla odstĜedČna pĜi 15 000 ot/min po dobu 15 minut (pĜi 4 °C). Supernatant byl opatrnČ odlit. Sediment byl opláchnut 70 % ethanolem a opČt centrifugován pĜi 15 000 ot/min po dobu 10 minut (pĜi 4 °C). Sediment DNA byl vysušen v exikátoru (asi 15 min) a DNA byla rozpuštČna v 50 µl (100 ul) TE pufru. Takto pĜipravená DNA byla použita pro agarosovou gelovou elektroforézu a pro spektrofotometrické stanovení koncentrace DNA. ýást DNA byla zmrazena (- 20 °C) a pozdČji použita jako DNA matrice pro ĜetČzovou polymerázovou reakci.
3.2.3.2 Izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ Další metodou izolace bakteriální DNA je izolace pomocí magnetického nosiþe P(HEMA-co-GMA). Tato izolace byla provedena ze suspenze hrubých lyzátĤ bunČk pĜipravených v kapitoly 2.3.2. Separaþní smČs s magnetickými nanoþásticemi byla pĜipravena podle Tabulky 1.
37
Tabulka 1 : Separaþní smČs pro izolaci DNA pomocí magnetických þástic 1 2 3 4
Komponenta NaCl (5 M) hrubý lyzát (HL) PEG 40 % magnetické þástice (2 mg/ml) Výsledný objem
Objem (µl) 400 100 400 100 1000
Jednotlivé komponenty byly smíchány v daném poĜadí podle Tabulky 1 a smČs byla inkubována 15 min pĜi laboratorní teplotČ. Zkumavky se smČsí þástic s navázanou DNA byly vloženy do magnetického separátoru a ponechány v separátoru s magnetem po dobu 15 minut. Supernatant byl opatrnČ odpipetován a þástice s DNA byly promyty 70 % ethanolem. Promytí bylo zopakováno ještČ jednou. Poté byl odpipetován supernatant a zkumavky s þásticemi s navázanou DNA byly sušeny v sušárnČ (55 °C) do odpaĜení zbytku ethanolu. Poté byly magnetické þástice s navázanou DNA resuspendovány ve 100 ȝl TE pufru a DNA ponechána eluovat po dobu 30 min, nebo do dalšího dne pĜi laboratorní teplotČ. ýástice byly odseparovány magnetem a DNA se odebrala do þisté Eppendorfovy zkumavky. Takto izolovaná DNA byla použita jako DNA matrice do PCR. (Španová a Rittich, 2010) 3.2.4
Spektrofotometrické stanovení þistoty a koncentrace DNA na NanoPhotometru
Pomocí pĜístroje NanoPhotometru a speciálních kyvet Label Gard byla zmČĜena koncentrace a stanovena þistota DNA. ýistota DNA byla vypoþítána z pomČru absorbancí A260nm/A280nm. ( Sambrook ., 2001). Do pĜístroje byla vložena speciální kyveta ve smČru procházejícího svČtelného paprsku. Byl zvolen program Label Gard Application, analýza Nucleic acid pro ds DNA. Dále bylo vybráno lid víþko podle pĜedpokládané koncetrace DNA (viz. Tabulka 2) Tabulka 2: VýbČr lid víþka Víþko optická dráha (nm) rozsah koncentrace DNA (ng/µl) objem vzorku (µl)
38
lid 5 2 7 - 350 6 - 10
lid 10 1 14 - 700 3-5
lid 50 0,2 250 - 4000 0,7 - 4
3.2.5
Polymerázová ĜetČzová reakce (PCR)
Bakterie rodu Lactobacillus byly detegovány pomocí amplifikace fragmentu DNA dlouhého 250 pb, který byl vymezen následujícími primery (Dubenet a kol., 2002): 1. LbLMA 1-rev 5´ - CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC – 3´ RodovČ specifický primer, který byl navržen z mezerníkové oblasti mezi 16S a 23S rRNA. 2. R16-1 5´- CTT GTA CAC ACC GCC CGT CA – 3´ Univerzální primer, který odpovídá koncové sekvenci genu pro 16S rRNA.
3.2.5.1 PĜíprava PCR smČsi pro rod Lactobacillus PĜíprava PCR smČsi o objemu 25 ȝl je uvedena va Tabulce 3. Pro pĜípravu vČtšího objemu PCR smČsi byl podle množství vzorkĤ pĜipraven tzv. master-mix do eppendorfovy zkumavky. Dále byla pĜipravena pozitivní kontrola s DNA Lactobacillus (10 ng/ml) a negativní kontrola, kde DNA matrice byla nahrazena PCR vodou. PĜi míchání bylo nutno dodržet poĜadí komponent a po pĜidání každé komponenty byla smČs dĤkladnČ promíchána. Poté co byla smČs krátce stoþena na centrifuze, byla zkumavka se smČsí umístČna do termocycleru. Po zapnutí pĜístroje byl zvolen program s následujícími reakþními podmínkami. Reakþní podmínky: 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
95°C/ 5 min. 95°C/ 0,5 min. denaturace DNA 55°C/ 0,5 min. hybridizace primerĤ 72°C/ 0,5 min. syntéza DNA ĜetČzce 29x opakováné kroku 2. - 4. 72°C/ 10 min. syntéza DNA ĜetČzce 10°C/ neomezenČ dlouhá doba
PĜed prvním cyklem se PCR smČs zahĜívá na teplotu 95°C po dobu 5 min. Jeden cyklus se skládá ze tĜí krokĤ. V prvním kroku dochází pĜi 95 °C po dobu 0,5 min k denaturaci DNA, v následujícím k hybridizaci primerĤ (0,5 min, 55°C) a v posledním k syntéze ĜetČzce DNA (0,5 min, 72°C). První cyklus se opakuje 29x. V posledním cyklu je doba syntézy ĜetČzce DNA prodloužena na 10 min. A nakonec byla smČs ochlazena na 10°C.
39
Tabulka 3 : Sožení amplifikaþní smČsi o objemu 25 ȝl pro PCR Komponenta PCR smČsi PCR voda 10x reakþní pufr kompletní dNTP smČs (10 mM) Primer LbLMA 1-rev (10 pmol/ȝl) Primer R16-1 (10 pmol/ȝl) Taq DNA polymerasa 1.1 (1 U/ȝl) DNA matrice (10 ng ȝl)
3.2.6
Množství (ȝl) 19 2,5 0,5 0,5 0,5 1 1
Elektroforéza hrubých lyzátĤ, bakteriální DNA a PCR produktĤ
Byl pĜipraven 0,8 % agarosový gel (0,8 g agarosy/ 100 ml 0,5x TBE pufru) pro hrubé lyzáty a bakteriální DNA nebo 1,8% agarosový gel (1,8 g agarosy/100 ml 0,5x TBE pufru) pro produkty PCR. Suspenze byla peþlivČ rozvaĜena v mikrovlnné troubČ, byla zchlazena na teplotu asi 60°C, poté byla nalita do elektroforetické vaniþky s hĜebínkem a ponechána 0,5 – 1 hodinu tuhnout. PĜed nanášením vzorkĤ na gel byl opatrnČ vyjmut hĜebínek. Ve zkumavce bylo smícháno 15 ȝl roztoku hrubého lyzátu þi bakteriální DNA se 3 ȝl nanášecího pufru. U PCR produktĤ bylo smícháno 25 ul PCR produktu s 5 ul nanášecího pufru. Poté byla smČs nanesena do komĤrky gelu. Na gel byl nanesen také hmotnostní standard DNA (napĜ. 500, 100 a 50 ng). Gel byl vložen do elektroforetické vaniþky v takové orientaci, aby zápornČ nabitá DNA migrovala k anodČ. Vaniþka s gelem byla opatrnČ pĜevrstvena 0,5x TBE pufrem do výšky 2-3 mm nad gel a byl zapnut zdroj gelové elektroforézy (75V – 2 hod). Separace byla ukonþena v okamžiku, kdy bromfenolová modĜ obsažená v nanášecím pufru doputovala do 2/3 délky agarózového gelu. Po skonþení elektroforézy byl gel obarven ethidium bromidem (0,5 ȝg/ml) po dobu 0,5 – 1 hod. Gel byl opláchnut v destilované vodČ, umístČn na transluminátor a vyhodnocen v UV svČtle pĜi vlnové délce Ȝ = 305 nm. Byla provedena fotografická dokumentace pomocí digitálního fotoaparátu. (Španová a Rittich, 2010)
40
4
VÝSLEDKY
4.1 Kultivace bakteriálních kmenĤ Bakteriální kmeny pČti rĤzných druhĤ rodu Lactobacillus byly inokulovány do tekutého média MRS a následnČ kultivovány po dobu 48 hodin pĜi 37°C. Po kultivaci byla stanovená absorbance A600nm kultury a poþet bunČk. 4.1.1
Stanovení optické denzity kultury bakteriálních kmenĤ
Byly zmČĜena absorbance A600nm narostlých kultur kultury podle kap. 3.2.1.1. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4. Byl sledován i rĤst bunČk a tvorba sedimentu. Tabulka 4: Absorbance a tvorba sedimentu u kultur bakteriálních kmenĤ. A600nm A600nm Tvorba sedimentu Bakteriální kmen (10x ĜedČné) Lactobacillus fermentum 0,35 3,5 + CCM 7192 Lactobacillus casei subsp. 0,37 3,7 + casei CCM 7088 Lactobacillus plantarum 0,41 4,1 + CCM 7039 Lactobacillus rhamnosus 0,52 5,2 + CCM 1825 Lactobacillus paracasei 0,53 5,3 + subsp. paracasei CCDM 212/106 Po 48 hodinách byly na dnČ kultivaþních zkumavek pozorovány narostlé buĖky pĜíslušné kultury, které rostly v sedimentu. BuĖky byly zbarveny béžovČ. Optická denzita bunČþné suspenze se pohybovala v rozmezí 3,5 – 5,3 4.1.2
Stanovení þistoty bakteriální kultury
Na agarózových plotnách byl proveden kĜížový roztČr kultur pĜíslušných bakteriálních druhĤ a misky byly ponechány kultivovat v termostatu pĜi 37°C po dobu 48 hod. RĤst kolonií Lactobacillus plantarum CCM 7039 ja uveden na Obr. 13.
41
Obr. 13 :KĜížový roztČr kultury Lactobacillus plantarum CCM 7039
Narostly kolinie, které byly bílé a lesklé, malé v místech hustého nárĤstu a vČtší v místech, kde rostly samostatnČ.
4.1.3
Stanovení poþtu bunČk kultivaþní metodou
Kultura bakteriálního kmene Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 byla narostlá do optické denzity 5,7. Kultura byla naĜedČna a vysévána na misky. Byl spoþítán poþet narostlých bakteriálních kolonií. (Tabulka 5) Misky s narostlými koloniemi jsou uvedeny na Obr. 14 -16. Tabulka 5: Poþty kolonií odpovídající ĜedČní vzorku ěedČní -6
1Â10 1Â10-7 1Â10-8
Poþet koliníí 94 23 3
Poþáteþní hodnota A600nm = 5,7.
42
cfu/ml 8 9,4Â10 9 2,3Â10 9 3Â10
Obr. 14: Stanovení poþtu bunČk: kultura Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 – ĜedČní 1Â10-6
Obr. 15: Stanovení poþtu bunČk: kultura Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 – ĜedČní 1Â10-7
43
Obr. 16: Stanovení poþtu bunČk: kultura Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 – ĜedČní 1Â10-8
HodnotČ A600nm = 5,7 pĜibližnČ odpovídal poþet kolonií 2,1Â109 v 1 ml. HodnotČ A600nm = 3,0 tedy pĜibližnČ odpovídalo 1,1Â109 kolonií v 1 ml.
4.2 Testování vlivu koncentrace lysozymu v lyzaþním roztoku B na lyzy bunČk a výtČžnost DNA Cílem experimentu bylo zjistit, jaká koncentrace lysozymu v lyzaþním roztoku (roztok B), použitého pro lyzy bunČk, umožĖuje izolovat DNA s nejvyššími výtČžky. Dalším cílem bylo srovnat dvČ metody izolace DNA: fenolová extrakce a izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ. KromČ 3 mg lysozymu/ml bylo testovány i koncentrace 5 a 10 mg/ml PĜi tomto experimentu byly použity bakteriální kultury: Lactobacillus rhamnosus CCM 1825 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088 Lactobacillus plantarum CCM 7039 Lactobacillus fermentum CCM 7192
44
4.2.1
Lyze bunČk pomocí roztoku B s rĤznými koncentracemi lysozymu
Jeden ml bunČþné suspenze o A600nm = 3,0 (2,1Â109 cfu/ml) byl centrifugován 3 min pĜi 15000 ot/min. NáslednČ byl supernatant slit a sediment byl resuspendován v 1 ml roztoku A (10 mM Tris-HCl pH 7,8; 5 mM EDTA pH 8,0). Suspenze byla opČt centrifugována za stejných podmínek. Po odstĜedČní bunČk byl supenratant opČt slit a sediment byl resuspendován v 500 ȝl roztoku B. K lyzy byl použit roztoku B o rĤzné koncentraci lysozymu (viz. Tabulka 6). Doba pĤsobení byla 1 hod pĜi laboratorní teplotČ. Tabulka 6 : Koncentrace lysozymu v roztoku B Roztok B Koncentrace lysozymu (mg/ml) 1 2 3
3 5 10
K buĖkám s bunČþnou stČnou narušenou lysozymem bylo pĜidáno 25 ȝl 10 % SDS a 5 ȝl proteinasy K (100 mg/ml). SmČs byla inkubována pĜi 55°C do druhého dne. Agarosová gelová elektroforéza s hrubými lyzáty pĜíslušných bunČk je uvedena na Obr. 17. Takto pĜipravené hrubé lyzáty byly použity pro izolaci DNA fenolovou extrakcí a izolaci pomocí magnetických mikroþástic.
45
Obr. 17: Agarosová gelová elektroforéza DNA v hrubých lyzátech bunČk Lactobacillus. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Na gel bylo naneseno 15 µl hrubého lyzátu. +, ++, +++ množství detegované DNA
BČh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
46
Koncentrace lysozymu Bakteriální kmen (mg/ml) Lactobacillus casei 3 subsp. casei 5 CCM 7088 10 Lactobacillus fermentum 3 CCM 7192 5 10 Lactobacillus plantarum 3 CCM 7039 5 10 Lactobacillus paracasei 3 subsp. paracasei 5 CCDM 212/106 10 Lactobacillus rhamnosus 3 CCM 1825 5 10
DNA v HL bunČk + + + ++ ++ ++ + ++ +++ + ++ ++ + + +
15
V hrubých lyzátech bunČk všech kmenĤ bylo identifikováno prĤkazné množství DNA. NejvČtší množství DNA je pĜítomné v hrubých lyzátech bunČk u druhĤ Lactobacillus fermentum a Lactobacillus plantarum. Naopak nejménČ u druhĤ Lactobacillus casei a Lactobacillus rhamnosus.
4.2.2
Izolace DNA metodu fenolové extrakce a magnetickým nosiþem z hrubých lyzátĤ bunČk
Z hrubých lyzátu bunČk pĜipravených dle postupu uvedeného v kap. 2.3.2 byla izolována DNA metodou fenolové extrakce a pomocí magnetických nosiþĤ. Množství DNA bylo stanoveno spektrofotometricky.
4.2.2.1 Izolace DNA fenolovou extrakcí a spektrofotometrické mČĜení DNA byla izolována metodou fenolové extrakce z 500 ȝl hrubých lyzátĤ bunČk. Poté byla zmČĜena na NanoPhotometru absorbance DNA a stanovena þistota a koncentrace DNA. PĜi mČĜení byl použit Lid (Factor 5). NamČĜené hodnoty jsou uvedené v Tabulce 7.
Tabulka 7: Spektrofotometrické mČĜení DNA izolované fenolovou extrakcí z hrubých lyzátĤ bunČk pĜipravených pmocí roztoku B s rĤzným množstvím lysozymu v roztoku
Jako optimální koncentrace lysozymu B v roztoku byla zvolena koncentrace 3 mg/ml.
47
4.2.2.2 Izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ a spektrofotometrické mČĜení DNA DNA byla vyizolována pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA) ze 100 ȝl hrubých lyzátĤ bunČk. Poté byla zmČĜena na NanoPhotometru absorbance DNA a stanovena koncentrace a þistota DNA. PĜi mČĜení byl použit Lid (Factor 5). NamČĜené hodnoty jsou uvedeny v Tabulce 8.
Tabulka 8: Spektrofotometrické mČĜení DNA izolované pomocí magnetických nanoþástic z hrubých lyzátĤ bunČk. K lyzi bunČk byly požity rĤzné koncentrace lysozymu.
Jako optimální koncentrace lysozymu v roztoku se jevila u Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum a Lactobacillus rhamnosus koncentrace lysozymu 5 mg/ml a u Lactobacillus paracasei a Lactobacillus casei 3 mg/ml. 4.2.3
Srovnání množství DNA izolované metodou fenolové extrakce a pomocí magnetických nosiþĤ
Byly srovnány množství DNA izolované metodou fenolové extrakce a metodou izolace pomocí magnetických nosiþĤ. Množství byly pĜepoþítány na 100 µl hrubého lyzátu. Výsledky jsou uvedeny na Obr. 18 - 20.
48
Obr. 18: Množství DNA izolované metodou fenolové extrakce ze 100 ȝl HL Celkové množství DNA izolovaného fenolovou extrakcí ze 100 µl HL bunČk 5 rĤzných druhĤ Lactobacillus s rĤzným množstvím lysozymu
1600,0
Množství DNA (ng)
1400,0 1200,0 1000,0 800,0 600,0 400,0 200,0 0,0 1
ýíslo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
2
3
4
5
Bakteriální kmen Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088 Lactobacillus fermentum CCM 7192 Lactobacillus plantarum CCM 7039 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 Lactobacillus rhamnosus CCM 1825
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Koncentrace lysozymu (mg/ml) 3 5 10 3 5 10 3 5 10 3 5 10 3 5 10
49
Obr. 19: Množství DNA izolované þásticemi(P(HEMA-co-GMA). Celkové množství DNA izolované magnetickými þásticemi ze 100 µl HL bunČk 5 rĤzných druhĤ Lactobacillus s rĤzným množstvím lysozym
1600,0
Množství DNA (ng)
1400,0 1200,0 1000,0 800,0 600,0 400,0 200,0 0,0 1
ýíslo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 50
2
3
4
5
Bakteriální kmen Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088 Lactobacillus fermentum CCM 7192 Lactobacillus plantarum CCM 7039 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 Lactobacillus rhamnosus CCM 1825
6
7
8
9
10
Koncentrace lysozymu (mg/ml) 3 5 10 3 5 10 3 5 10 3 5 10 3 5 10
11
12
13
14
15
Obr. 20: Srovnání množství DNA izolovaných ze 100 ȝl hrubého lyzátu bunČk metodou fenolové extrakce a pomocí magnetických nosiþĤ. Porovnání celkového množství DNA získaného ze 100 µl hrubého lyzátu bunČk - fenolovou extrakcí x magnetickými nosiþi 1600,0 1400,0
množství DNA (ng)
1200,0 1000,0 DNA - fenolová extrakce
800,0
DNA - mikroþástice
600,0 400,0 200,0 0,0 1
ýíslo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
2
3
4
5
6
7
Bakteriální kmen Lactobacillus casei subsp. casei CCM 7088 Lactobacillus fermentum CCM 7192 Lactobacillus plantarum CCM 7039 Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 Lactobacillus rhamnosus CCM 1825
8
9
10
11
12
13
14
15
Koncentrace lysozymu (mg/ml) 3 5 10 3 5 10 3 5 10 3 5 10 3 5 10
51
NejvČtší množství DNA izolované metodou fenolové extrakce bylo zmČĜeno u vzorkĤ Lactobacillus plantarum a nejmenší množství u Lactobacillus paracasei. NejvČtší množství DNA izolované pomocí magnetických nosiþĤ P(HEMA-co-GMA) bylo namČĜeno u druhĤ Lactobacillus casei a Lactobacillus rhamnosus a nejmenší množství u Lactobacillus paracasei. Množství DNA izolované pomocí magnetických nanoþástic bylo vČtší než množsví DNA získané metdou fenolové extrakce. Nevýhodou fenolové exrakce je práce toxickými organickými látkami (fenol, chloroform). V dalších pokusech byla DNA izolována pomocí magnetických nosiþĤ. 4.2.4
PCR – rod Lactobacillus
S DNA izolovanou z bakterialních kmenĤ byla provedena PCR s rodovČ specifickými primery. 4.2.4.1 PCR s DNA izolovanou metodou fenolové extrakce Bakteriální DNA vyizolována metodou fenolové extrakce byla použita jako DNA matrice. Byla pĜipravena PCR smČs a provedena PCR dle kap. 2.3.5. Poté byla povedena agarosová gelová elektroforéza produktĤ PCR (Obr. 21).
52
Obr. 21: Agarosová gelová elektrofotéza produktĤ PCR specifických pro rod Lactobacillus (250 pb).: 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12 13 14 15
16 17
18
19
20
Byla amplifikována DNA izolovaná fenolovou extrakcí. +, ++, +++ intenzita produktu PCR.
ýíslo bČhu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Koncentrace Bakteriální kmen lysozymu (mg/ml) Lactobacillus casei 3 subsp.casei 5 CCM 7088 10 Lactobacillus 3 fermentum 5 CCM 7192 10 Lactobacillus plantarum 3 CCM 7039 5 10 Lactobacillus paracasei 3 subsp. Paracasei 5 CCDM 212/106 10 Lactobacillus 3 rhamnosus 5 CCM 1825 10 DNA standard 100 pb pozitivní kontrola prázdný bČh prázdný bČh negativní kontrola
DNA/PCR smČs (ng/25 ȝl)
PĜítomnost PCR produktĤ
34,00
+
34,30
++
13,30
+
65,30
+++
41,00
+++
34,00
+++
74,80
+++
71,80
+++
146,00
+++
22,00
++
11,20
++
31,50
++
20,50
+++
47,30
+++
38,30
+++ +++
-
-
-
-
53
U všech vzorkĤ DNA bylo prokázáno, že se matrice DNA amplifikovala za vzniku specifických produktĤ PCR. RĤznČ intenzivní produkty PCR korespondují s rĤzným množstvím DNA v PCR smČsích.
4.2.4.2 PCR s DNA izolované pomocí magnetických nosiþĤ DNA (1 ȝl) izolovaná z HL bunČk pomocí magnetických nanoþástic P(HEMA-co-GMA) byla použita do smČsi pro PCR a byla provedena PCR. Byla povedena agarosová gelová elektroforéza a produkty PCR byly detegovány pomocí agarosové gelové elektroforézy (Obr. 22).
54
Obr. 22: Agarosová gelová elektroforéza produktĤ PCR (250 pb). 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15 16
17 18
19
Amplifikována byla DNA izolovaná pomocí magnetických mikroþástic. +, ++, +++ intenzita produktu PCR, - produkt PCR nebyl detegován Koncentrace BČh Kmen lysozymu (mg/ml) 1 Lactobacillus casei 3 2 subsp.casei 5 3 CCM 7088 10 4 Lactobacillus 3 5 fermentum 5 6 CCM 7192 10 7 Lactobacillus plantarum 3 8 CCM 7039 5 9 10 10 Lactobacillus paracasei 3 11 subsp. Paracasei 5 12 CCDM 212/106 10 13 Lactobacillus 3 14 rhamnosus 5 15 CCM 1825 10 16 DNA standard 100 pb 17 pozitivní kontrola 18 prázdný bČh 19 negativní kontrola * po opakované amplifikaci byl produkt detegován
DNA/PCR smČs (ng/25 ȝl)
Produkt PCR
13,8
++
5
+++
4,5
-*
2,75
++
10,5
+
3,5
++
2,75
+++
11,2
+++
2,75
+
5,75
+
5,25
+
4
+
6
+++
11,2
+++
4,5
+++ +++
-
-
55
U všech vzorkĤ DNA bylo prokázáno, že se DNA matrice amplifikovala (s vyjímkou bČhu þ. 3). RĤznČ intenzivní produkty PCR odráží rĤzná množství DNA použité ve smČsi pro PCR.
4.3 Testování úþinnosti lysozymu (3mg/ml), imobilizovaného lysozymu a lysozymu obsaženém v pracím prášku Amway pĜi pĜípravČ hrubých lyzátĤ bunČk Cílem experimentu bylo optimalizovat dobu pĤsobení lysozymu na buĖky. V tomto pokusu byl testováno 1, 3 a 5 hodinové pĤsobení na bunČþnou stČnu. Pokus byl provádČn na bakteriálním kmeni Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106, protože v pĜedchozím pokusu bylo u tohoto druhu namČĜeno nejnižší množství izolované DNA. Byl použit 1 ml bunČþné suspenze o A600nm = 3,0. Další úkolem bylo srovnat pĤsobení imobilizovaného lysozymu s ostatními lyzaþními þinidly. Souþástí pokusu bylo i ovČĜit, zda jsou v pracím prášku pĜítomné enzymy, které by se daly použít pro lyzi bunČk. Hrubé lyzáty bunČk byly pĜipraveny dle postupu v kap. 2.3.2. Byly testovány tĜi rĤzné varianty lyze bunČk. Lyze pomocí roztoku B s obsahem lysozymu 3 mg/ml, což bylo vyhodnoceno v pĜedchozím pokusu jako optimální koncentrace lysozymu, dále pak lyze pomocí imobilizovaného lysozymu (10 ȝl) a lyze pomocí 4% roztoku pracího prášku Amway. Jako kontrolní vzorek byly použity buĖky, k nimž byl pĜidáván pouze roztok A (10 mM Tris-HCl, pH 7,8; 5 mM EDTA, pH 8,0), který neobsahoval lysozym. SouþasnČ byla testována doba pĤsobení lysozymu: 1 , 3 a 5 hod. Poté bylo ke smČsi pĜidáno 25 ȝl 10 % SDS a 5 ȝl proteinsy K (100 mg/ml). SmČs byla inkubována pĜi 55°C do druhého dne (18 hod). Z takto pĜipravených hrubých lyzátu byla izolována DNA. Po lyzy byla provedena elektroforéza hrubých lyzátĤ bunČk. (Obr. 23) 4.3.1
Lyze bunČk pomocí roztoku B s lysozymem v roztoku
Jeden ml bunČþné suspenze byl centrifugován 3 min pĜi 15000 ot/min. Poté byl pelet resuspendován ve 1000 ȝl roztoku A. Suspenze bunČk byla centrifugována 3 minuty pĜi 10000 ot/min. Pelet byl resuspendován v 500 ȝl roztoku B s lysozymem v roztoku. SmČs s lysozymem byla inkubována 1, 3 a 5 hod pĜi laboratorní teplotČ. Dále se pokraþovalo dle kap. 2.3.2. Výsledky jou uvedené na Obr. 23 bČh þ. 2, 6 a 10. 4.3.2
Lyze bunČk pomocí enzymu obsaženého v pracím prášku
Jeden ml bunČþné suspenze byl centrifugován 3 min pĜi 15000 ot/min. Poté byl pelet resuspendován ve 1000 ȝl roztoku A. Suspenze bunČk byla centrifugována 3 minuty pĜi 10000 otáþkách. Pelet byl resuspendován v 500 ȝl roztoku pracího prášku. Dále se pokraþovalo dle kapitoly 2.3.2. Výsledky jsou uvedené na Obr. 23 bČh þ. 4, 8 a 12. 56
. 4.3.3
Lyze bunČk pomocí imobilizovaného lysozymu
Jeden ml bunČþné suspenze o A600nm =3,0 byl centrifugován 3 min. pĜi 15000 ot/min. Poté byl pelet resuspendován ve 1000 ȝl roztoku A (10 mM Tris-HCl pH 7,8; 5 mM EDTA pH 8,0). Suspenze byla centrifugována 3 minuty pĜi 10000 ot/min. Pelet byl resuspendován v 490 ȝl roztoku A a 10 ȝl imobilizovaného lysozymu. SmČs s lysozymem byla inkubována 1, 3 a 5 hod pĜi laboratorní teplotČ. Dále se pokraþovalo dle kapitoly 2.3.2. Výsledky jou uvedené na Obr. 23 bČh þ. 3, 7 a 11.
57
Obr. 23: Agarosová gelová elektroforéza DNA v hrubých lyzátech bunČk Lactobacillus paracasei. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Na gel bylo naneseno 15 ȝl hrubého lyzátu. +, ++, +++ množství detekované DNA, - DNA nebyla detegována BČh
Lyze bunČk
1 2 3
kontrolní roztok A roztok B imobilizovaný lysozym V roztoku A prací prášek Amway kontrolní roztok A roztok B imobilizovaný lysozym V roztoku A prací prášek Amway kontrolní roztok A roztok B imobilizovaný lysozym V roztoku A prací prášek Amway
4 5 6 7 8 9 10 11 12
58
ýas (hod) Koncentrace/objem pĤsobení lysozymu lysozymu 0 3 mg/ml 10 ȝl 4% roztok 0 3 mg/ml 10 ȝl 4% roztok 0 3 mg/ml 10 ȝl 4% roztok
PĜítomnost DNA
1
+/+++ ++
3
+ + +++ ++
5
+ + ++ + -
12
DNA byla detegována v hrubých lyzátech bunČk všech vzorkĤ v rĤzné intenzitČ. Nejvyšší množství amplikonu bylo u vzorkĤ, kde byl použit roztok B (3 mg lysozymu/ml). U bČhu þíslo 10 se vzorkem, kde pĤsobil roztok B na buĖky 5 hod, je již koncentrace DNA nižší než u bČhu 2 a 6, kde roztok B pĤsobil 1 a 3 hod. Nižší koncentrace DNA byly detegovány u vzorkĤ, kde byl použit imobilizovaný lysozym a prací prášek Amway. 4.3.4
Izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ z HL bunČk získaných pomocí rĤzných lyzaþních þinidel
Z HL pĜipravených pomocí: roztoku A, roztoku B s lysozymem v roztoku, imobilizovaného lysozymu a 4% roztoku pracího prášku Amway byla izolována DNA pomocí þástic P(HEMA-co-GMA). NáslednČ byla zmČĜena koncentrace a þistota DNA. (Tabulka 9) Tabulka 9: Hodnoty koncentrace izolované DNA izolované z HL pĜipravených pĤsobením rĤzných lyzaþních roztokĤ
*
zabarvení vzorku, nesluþitelné se spektrofotometrickým mČĜením
NejvČtší množství DNA bylo získáno u vzorku, kde byl pro pĜípravu HL bunČk použit roztok B s lysozymem v roztoku. 4.3.5
PCR s DNA matricí izolovanou pomocí þástic z HL bunČk získaných pomocí rĤzných lyzaþních roztokĤ
DNA (1 ȝl) izolovaná z hrubých lyzátĤ bunČk Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA) byla použita pro provedení PCR. Produkty PCR byly detegovány pomocí agarosové gelové elektroforézy. (Obr. 24)
59
Obr. 24: Agarosová gelová elektroforéza PCR produktĤ Lactobacillus paracasei – þasové pĤsobení lyzaþních roztokĤ. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
+, ++, +++ množství detegovaného produktu PCR, - produkt PCR nebyl nedetegován
BČh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Doba (hod) Koncentrace/objem pĤsobení lysozymu lysozymu Lyze bunČk kontrolní roztok A 0 roztok B 3 mg/ml imobilizovaný lysozym 10 ȝl 1 V roztoku A prací prášek Amway 4% roztok kontrolní roztok A 0 roztok B 3 mg/ml imobilizovaný lysozym 10 ȝl 3 V roztoku A prací prášek Amway 4% roztok kontrolní roztok A 0 roztok B 3 mg/ml imobilizovaný lysozym 10 ȝl 5 V roztoku A prací prášek Amway 4% roztok DNA standard 100 bp pozitivní kontrola negativní kontrola
DNA/ smČs pro PCR (ng/25 ȝl) 24,2 5,5 5,1
Produkt PCR ++ +
-* 7,5 3,8 3
+++ ++ -
-* 26,6 25,7 48,5
+++ ++ -
-*
++ +++ -
* pĜístroj Nanodrop nenamČĜil kladné hodnoty koncentrace, pravdČpodobnČ z dĤvodu zpĤsobených interferencí pĜímČsí v pracím prášku. Z Obr. 24 je patrné, že optimální doba pĤsobení lyzaþního roztoku B s lysozymem a roztoku pracího prášku jsou 1 až 3 hod. Pro imobilizovaný lysozym to je 1 hod pĤsobení na buĖky. 60
4.3.5.1 Použití roztoku B s lysozymem v roztoku pro lyzi bunČk Pro pĜípravu HL bunČk byl použit roztok B s pĜídavkem lysozymu 3 mg/ml. Doba pĤsobení lysozymu na buĖky byla 1, 3 a 5 hod. Z takto pĜipravených HL bunČk byla izolována DNA pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA). DNA byla amplifikována pomocí PCR a detegována agarosovou gelovou elektroforézou. (Obr. 24) Optimální doba pĤsobení lysozymu v roztoku B na buĖky byla 1 až 3 hod.
4.3.5.2 Použití imobilizovaného lysozymu pro lyzi bunČk PĜi pĜípravČ hrubých lyzátĤ bunČk byl použit imobilizovaný lysozym na magnetických þásticích. Z hrubých lyzátu bunČk byla izolována DNA pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA) a následnČ amplifikována v PCR. Produkt PCR (Obr. 24) byl detegován pouze u vzorku 3 (bČh þ. 3). Tento vzorek byl pĜipraven z hrubých lyzátu, kde na buĖky pĤsobil imobilizovaná lysozym 1 hod. Poté byla izolována DNA pomocí magnetických þástic a amplifikována v PCR. Optimální doba pĤsobení u imobilizovaného lysozymu byla 1 hod.
4.3.5.3 Použití pracího prášeku Amway pro lyzi bunČk PĜi pĜípravČ hrubých lyzátĤ bunČk byl použit 4% roztok pracího prášku Amway. Z hrubých lyzátu bunČk byla izolována DNA pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA) a následnČ amplifikována v PCR. Výsledky jsou uvedeny na Obr. 24 bČh þ. 4, 8 a 12. NejintenzivnČjší PCR produkt je vzorek 8 (bČh þ. 8). Tento vzorek byl pĜipraven amplifikací DNA získané z hrubých lyzátu, ve kterých na buĖky pĤsobil roztok pracího prášku Amway 3 hod.
4.4 Testování rĤzných koncentrací pracího prášku Amway pro lyzi bunČk Cílem pokusu bylo najít optimální koncentraci lyzaþního roztoku obsahujícího prací prášek Amway. Tento pokus byl provádČn na bakteriálním kmeni Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106. 4.4.1
Lyze bunČk pomocí enzymĤ obsažených v parcím prášku Amway
Pro lyzy bunČk byl použit 1, 2, 3 a 4% roztok pracího prášku Amway. Jako kontrola byl pro lyzi bunČk použit roztok B s obsahem 3 mg/ml lysozymu. Lyzaþní roztok pĤsobil na buĖky 1 hod. a 3 hod. Dále bylo postupováno dle kap. 2.3.2.
61
4.4.2
Izolace DNA z HL pĜipravených pomocí rĤznČ koncentroveného pracího prášku Amway
Z HL pĜipravených pomocí rĤznČ kontrovaného roztoku pracího prášku Amway byla izolována DNA pomocí magnetických nosiþĤ P(HEMA-co-GMA). NáslednČ byla zmČĜena koncentrace a þistota na Nanodropu. (Tabulka 10) Tabulka 10: Hodnoty koncentrace DNA izolované z HL pĜipravených pĤsobením roztokĤ pracích prášku
Koncentrace DNA získaných z HL bunČk pomocí roztokĤ pracích práškĤ byly nižší než pĜi použití lysozymu v roztoku B. 4.4.3
PCR s DNA izolovanou z HL bunČk pĜipravených práškem Amway
Z hrubých lyzátĤ (HL) bunČk Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106 pĜipravených práškem Amway byla vyizolována bakteriální DNA pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA). Takto izolovaná DNA byla použita pro amplifikaci v PCR. Produkty PCR byly detegovány na gelu z agarosové gelové elektroforézy. (Obr. 25)
62
Obr. 25: Agarosová gelová elektroforéza PCR produktĤ Lactobacillus paracasei. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 14
Amplifikována byla DNA z HL bunČk, které byly lyzovány pomocí prášku Amway za pomocí SDS a proteinasy K. ++, +++ množství detegované DNA
BČh 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Lyze bunČk Roztok B Amway Amway Amway Amway Roztok B Amway Amway Amway Amway DNA standard 100 pb pozitivní kontrola negativní kontrola
Koncentrace lysozymu 3 mg/ml 1% roztok 2% roztok 3% roztok 4% roztok 3 mg/ml 1% roztok 2% roztok 3% roztok 4% roztok -
ýas (hod) pĤsobení lysozymu 1
3
-
DNA/ smČs pro PCR
(ng/25 ȝl) 77,7 58,1 22,5 8,6 3,7 46,9 61,7 28,7 30,2 27,8
Produkt PCR +++ ++ + + +++ +++ + + ++ +++ +++ -
NejvČtší množství PCR produktĤ bylo detegováno u vzorku, kde k lyzi bunČk byl použit 4% roztoku Amway po dobu 3 hod (bČh þ. 10).
63
4.5 Testování rĤzných pracích práškĤ pro lyzi bunČk Cílem pokusu bylo zjistit, který prací prášek je nejvhodnČjší pro lyzi bunČk. Tento pokus byl provádČn na bakteriálním druhu Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106. Byly použity prací prášky: sypký Amway, tekutý zelený Persil, tekutý modrý Persil, sypký Persil a tekutý PER 100%.
4.5.1
Lyze bunČk pomocí enzymĤ rĤzných pracích práškĤ
Pro lyzi bunČk bylo použito pČt rĤzných druhĤ pracích práškĤ (4% roztoky). Roztok pĤsobil na buĖky 1 a 3 hod, a poté byl k bunČþné suspenzi pĜidán SDS a proteinasa K. 4.5.2
Izolace DNA izolované z HL bunČk pĜipravených pomocí pČti rĤzných pracích práškĤ pomocí magnetických nosiþĤ
Vzniklé HL bunČk byly použity pro izolaci DNA magnetickými nosiþi P(HEMA-coGMA). U DNA byla zmČĜena koncentrace a þistota DNA na Nanodropu. (Tabulka 11) Tabulka 11: Hodnoty koncentrace a DNA získáné z HL bunČk pĤsobením rĤzných roztokĤ pracích práškĤ
*
pĜíliš nízká koncentrace DNA
Byla izolována DNA v koncentraci 7,9 až 52,5 ng/ml. NejvČtší množství DNA bylo získáno ze vzorkĤ, kde bylo pro pĜípravu HL bunČk použit prací prášek Persil modrý tekutý a PER 100%.
64
4.5.3
PCR s DNA matricí izolovanou z HL bunČk pĜipravených pomocí rĤzných pracích práškĤ
Hrubé lyzáty byly pĜipraveny pomocí rĤzných pracích práškĤ. Z hrubých lyzátĤ bakteriálního kmene Lactobacillus paracasei byla vyizolována bakteriální DNA pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA). Takto izolovaná DNA byla použita pro provedení PCR. Produkty PCR byly detegovány pomocí agarosové gelové elektroforézy (Obr. 26).
65
Obr. 26: Agarosová gelová elektroforéza PCR produktĤ Lactobacillus paracasei 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
+, ++, +++ množství detegovaných produktĤ PCR ýas (hod) pĤsobení lyzaþního roztoku
DNA/PCR
smČs (ng/25 ȝl)
PĜítomnost DNA +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++
BČh Lyzaþní þinidlo(4% roztok) 1 Amway -* 2 Persil zelený tekutý 25,2 3 Persil modrý tekutý 1 27,2 4 Persil prášek 18,1 5 PER 100% 51 6 Amway 7,3 7 Persil zelený tekutý 25,2 8 Persil modrý tekutý 3 52,5 9 Persil prášek 29,8 10 PER 100% 33,6 11 DNA standard100 pb 12 pozitivní kontrola +++ 13 14 negativní kontrola * pĜístroj Nanodrop nenamČĜil kladné hodnoty koncentrace, pravdČpodobnČ z dĤvodu zpĤsobených interferencí pĜímČsí v pracím prášku
PCR produkty byly detegovány po amplifikaci DNA izolované ze všech vzorkĤ hrubých lyzátĤ bunČk. NejménČ intenzivní PCR produkt byl detekován u vzorku, kde byl pro lyzi 66
bunČk použit Persil tekutý modrý, nejvíce intenzivní PCR produkty u vzorkĤ, kde byl použit pro pĜípravu HL bunČk lyzaþní roztok prášku Amway, Persil zelený tekutý, Persil prášek a PER 100%.
4.6 Izolace DNA z potravináĜských matric Cílem pokusu bylo vyizolovat DNA z potravináĜských matric za použití magnetických nosiþĤ P(HEMA-co-GMA). Hrubé lyzáty bunČk byly pĜipraveny pĤsobením 4% roztoku pracího prášku PER 100%. Tekutý prací prášek PER 100% byl zvolen pro jednodušší pĜípravu lyzaþního roztoku. Pro pokus bylo použito Acidofilní mléko plnotuþné (Mlékárny Valašské MeziĜíþí), dále jogurt – pĜíchuĢ mango (Zott) a bílý jogurt (Madeta). 4.6.1
Lyze bunČk obsažených v tekutých mléþných výrobcích
Z tekutého mléþného výrobku byl odebrán 1 ml vzorku do 1,5 ml zkumavky. Vzorek byl centrifugován pĜi 14 000 ot/min po dobu 5 min. NáslednČ byl slit supernatant a sediment byl promyt a resuspendován v 1 ml sterilní vody. Toto promývání bylo 5x opakováno. K sedimentu byl pĜidán 1 ml lyzaþního roztoku (4% roztoku pracího prášku), ve kterém byl resuspendován. Vzorek byl inkubován 1 hod (3 hod) pĜi laboratorní teplotČ a následnČ bylo ke smČsi pĜidáno 50 µl 20 % SDS a 5 µl proteinasy K (100 ȝg/ml).
4.6.2
Lyze bunČk obsažených v tekutých jogurtu
Homogenizovaný vzorek jogurtu byl resuspendován ve sterilní vodČ v pomČru 1 g jogurtu na 1 ml sterilní vody. Vzorek byl centrifugován pĜi 14 000 ot/min po dobu 5 min. NáslednČ byl slit supernatant a sediment byl promyt a resuspendován v 1 ml sterilní vody. Toto promývání bylo 5x opakováno. K sedimentu byl pĜidán 1 ml lyzaþního roztoku (4% roztoku pracího prášku), ve kterém byl resuspendován. Vzorek byl inkubován 1 hod (3 hod) pĜi laboratorní teplotČ a následnČ bylo ke smČsi pĜidáno 50 ȝl 20 % SDS a 5 ȝl proteinasy K (100 ȝg/ml). 4.6.3
Izolace DNA pomocí magnetických nosiþĤ získané z hrubých lyzátĤ bunČk mléþných výrobkĤ
Z HL bunČk získaných pĤsobením 4% roztoku pracího prášku PER 100% byla izolována DNA magnetickými nanoþásticemi P(HEMA-co-GMA). U takto vyizolované DNA byla zmČĜena koncentrace a þistota DNA na Nanoddropu. (Taulka. 12).
67
Tabulka 12: Hodnoty koncentrace DNA izolované z HL bunČk mléþných výrobkĤ
NejvČtší množství DNA bylo získáno ze vzorku ochuceného jogurtu – mango (Zott), kde HL bunČk byl pĜipraven 3 hod pĤsobením pracího prášku PER 100%. Koncentrace DNA získaných z HL bunČk mléþných výrobkĤ pomocí roztokĤ pracích práškĤ byly dostaþující pro PCR.
4.6.4
PCR s DNA matricí mléþných výrobkĤ
Pomocí pracího prášku PER 100% byly pĜipraveny HL bunČk, z nichž byla následnČ izolována DNA pomocí magnetických nosiþĤ P(HEMA-co-GMA) (viz. kap. 2.3.3.2). Takto izolovaná DNA byla použita pro provedení PCR reakce. PCR produkty byly detegovány na gelu z agarosové gelové elektroforézy pod UV svČtlem. (Obr. 27)
68
Obr. 27: Agarosová gelová elektroforéza PCR produktĤ. 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Amplifikována byla DNA izolována z HL bunČk potravináĜských matric lyzovaných pomocí pracího prášku PER 100%. +, ++, +++ množství detegovaného produktu PCR, - produkt PCR nebyl detegován. Lyze bunČk BČh 1 2 3 4 5 6 9 10 11 12
Mléþný výrobek Acidofilní mléko (Valašské MeziĜíþí) Jogurt mango (Zott) Jogurt bílý (Madeta) Acidofilní mléko (Valašské MeziĜíþí) Jogurt mango (Zott) Jogurt bílý (Madeta) DNA standard 100 pb pozitivní kontrola negativní kontrola
4% PER 100%
ýas (hod) DNA/ PCR pĤsobení smČsi lyzaþního (ng/25 ȝl ) roztoku
1 hod
4% PER 100%
3 hod
-
-
Produkt PCR
64,1
-
64,9 84,7
++
47,6
-
107,6 42,8
+++ -
PCR produkt byl detegován po amplifikaci DNA pouze u vzorku (bČh þ.3) bílého jogurt (Madeta), kde byl hrubý lyzát bunČk pĜipraven pomocí lyzaþní roztoku (roztok prášku PER 100%), který pĤsobil na buĖky 1 hod.
69
4.7 PĜíprava HL bunČk z vČtšího množství potravináĜských matric s kratším pĤsobením 4% pracího prášku PER 100% Byl opakován pĜedchozí pokus (viz. kapitola 2.4.6) s potravináĜskými matricemi: acidofilní mléko (Valašské MeziĜíþí), jogurt mango (Zott) a bílý jogurt (Madeta). Pro pĜípravu HL bunČk byl použit 4% prací prášek PER 100%, který pĤsobil po dobu pĤl hodiny a 1 hod. 4.7.1
Lyze bunČk pracím práškem PER 100%
Pro lyzi bunČk bylo použito dvojnásobné množství mléþných výrobkĤ (2 ml). Vzroky byly promyty sterilní vodou pouze jedenkrát. Lyzaþní roztok PER 100% pĤsobil na buĖky 0,5 a 1 hod. NáslednČ byla z hrubých lyzátĤ bunČk izolována DNA pomocí magnetických mikroþástic P(HEMA-co-GMA). DNA byla použita do PCR. 4.7.2
PCR s DNA získanou z mléþných výrobkĤ s 1 ȝl DNA matrice
Pro PCR byla použita DNA získaná z HL bunČk mléþných výrobkĤ magnetickými þásticemi P(HEMA-co-GMA). (Obr. 28) Byla pĜipravena PCR smČs s obsahem DNA matrice 1 ȝl.
70
Obr. 28: Agarosová gelová elektroforéza PCR produktĤ. 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
Byla amplifikována DNA izolovaná z mléþných výrobkĤ. . +, ++, +++ množství detegovaného produktu PCR, - produkt PCR nebyl detegován Lyze bunČk BČh 1
Mléþný výrobek Acidofilní mléko (Valašské MeziĜíþí)
2 3 4
Jogurt mango (Zott) Jogurt bílý (Madeta) Acidofilní mléko (Valašské MeziĜíþí)
5 6 7
Jogurt mango (Zott) Jogurt bílý (Madeta) Acidofilní mléko (Valašské MeziĜíþí)
8 9 10
Jogurt mango (Zott) Jogurt bílý (Madeta) Acidofilní mléko (Valašské MeziĜíþí)
11 12 13 14 15 16
Jogurt mango (Zott) Jogurt bílý (Madeta) žebĜíþek 100 pb pozitivní kontrola negativní kontrola
ýas (hod) pĤsobení lyzaþního roztoku
Objem DNA v PCR PĜítomnost smČsi (ȝl) DNA -
4% PER 100 %
0,5
1
+ +++ +
4% PER 100 %
1
1
+ +++ ++
4% PER 100 %
0,5
3
+ +++ +
4% PER 100 %
1
3
+ +++
-
-
+++ -
Byly detegovány PCR produkty rĤzné intenzity. NejintenzivnČjší PCR produkt byl detegován po amplifikaci DNA izolované ze vzorku bílého jogurtu (Madeta). Nižší množství PCR produktĤ bylo detegováno u vzorkĤ jogurt mango (Zott) a acidofilního mléka (Valašské MeziĜíþí).
71
4.7.3
PCR s DNA získanou z mléþných výrobkĤ s 3 ȝl DNA matrice
PCR reakce byla provedena s DNA získanou z HL bunČk mléþných výrobkĤ magnetickými þásticemi P(HEMA-co-GMA) (Obr. 28). PCR smČs obsahovala 3 ȝl DNA matrice. Na Obr. 28 byly detegovány intenzivnČjší PCR produkty u vzorkĤ, u kterých bylo do smČsi pro PCR pĜidáno 3 ȝl DNA matrice. NejintenzivnČjší PCR produkt byl detegován u vzorku bílého jogurtu (bČh þ. 9 a 12, Obr. 28).
72
5
DISKUZE
5.1 Testování vlivu koncentrace lysozymu v lyzaþním roztoku B na výtČžnost DNA, srovnání metod izolace DNA Cílem pokusu bylo zjistit, která koncentrace lysozymu použitého pro lyzi bunČk, odpovídá nejvyšším výtČžkĤm DNA. Byly použity tĜi rĤzné koncentrace: 3, 5 a 10 mg lysozymu na 1 ml roztoku A. Pro každý druh byla výtČžnost DNA nejoptimálnČjší pĜi rĤzné koncentraci lysozymu. Na základČ vyhodnocení úþinnosti koncentrace enzymu byla pro další pokusy s buĖkami Lactobacillus zvolena koncentrace lysozymu 3 mg/ml, protože se jevila pro rod Lactobacillus jako nejoptimálnČjší. Metodou fenolové extrakce byla izolována DNA, která byla následnČ amplifikována pomocí PCR. U druhu Lactobacillus plantarum byl produkt PCR nejintenzivnČjší. Nejnižší intenzita PCR produktu byla u druhu Lactobacillus paracasei a Lactobacillus casei. Pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA) byla izolována DNA a následnČ amplifikována pomocí PCR. NejvČtší intenzita produktu PCR byla detegována po amplifikaci DNA izolované z bunČk Lactobacillus rhamnosus, naopak nejmenší množství u Lactobacillus paracasei. Intenzita PCR produktĤ odráží množství DNA ve smČsích pro PCR. Pro každý bakteriální druh je optimální jiná koncentrace lysozymu v lyzaþním roztoku použitém pro lyzi bunČk, což mĤže být zpĤsobeno rozdílným složením bunČþné stČny. V obou pĜípadech izolace DNA, která byla použita v PCR, byl produkt PCR nejménČ intenzivní po amplifikaci DNA u Lactobacillus paracasei, proto se v následujících experimentech pracovala právČ s tímto bakteriálním druhem. Pro izolaci fenolovou extrakcí bylo použito 500 µl hrubého lyzátu bunČk; na rozdíl od izolace pomocí magnetických nosiþĤ, kde bylo použito 100 µl hrubých lyzátĤ bunČk. Tento rozdíl byl brán v úvahu pĜi srovnání množství DNA získané rĤznými metodami izolace DNA. Z testovaných izolaþních postupĤ byly vhodnČjší magnetické þástice (Rittich a kol., 2006) než metoda izolace fenolovou extrakcí. 5.1.1
Srovnání množství DNA izolované metodou fenolové extrakce a pomocí magnetických nosiþĤ
Magnetické separaþní techniky využívají velmi malé magnetické þástice (Petrová, 2004) k navázání DNA. Tyto þástice se však snadno odseparují magnetem s adsorbovanou DNA. U fenolové extrakce se pracuje s toxickými organickými látkami jako je fenol a chloroform, což je znaþnou nevýhodou. Byly srovnány výtČžky DNA získaných za použití tČchto dvou metod izolace DNA. Po pĜepoþtu, kdy bylo bráno v úvahu, že se vycházelo ze 100 ȝl HL bunČk, bylo dosaženo vyšších výtČžkĤ DNA za použití metody izolace DNA pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA).
73
Nejvyšší množství DNA bylo získáno u bunČk druhu Lactobacillus fermentum, kde pro pĜípravu HL bunČk bylo použito 10 mg lysozymu na 1 ml roztoku A a u druhu Lactobacillus casei, kdy pro pĜípravu HL bunČk byl použit roztok s obsahem lysozymu 3 mg/ml. Rozdíly ve výtČžnosti DNA mnohdy korespondují s obsahem DNA matrice v PCR smČsi a intenzitou PCR produktu. Mohou být zpĤsobeny též odlišným složením bunČþné stČny. Ve vČtšinČ pĜípadĤ použití nižší koncentrace lysozymu (3 mg/ml), byla detekce specifického PCR produktu pro rod Lactobacillus (250 bp) intenzivnČjší. (Doubernet a kol., 2002)
5.2 Vliv þasového pĤsobení lysozymu na výtČžnost DNA, srovnání úþinnosti lysozymu (3mg/ml), imobilizovaného lysozymu a lysozymu obsaženém v pracím prášku Cílem pokusu bylo optimalizovat dobu pĤsobení lysozymu na buĖky. V tomto pokusu bylo testováno 1, 3 a 5 hodinové pĤsobení lysozymu na bunČþnou stČnu. Byl použit roztok B s lysozymem v roztoku o nejnižší koncentraci lysozymu 3 mg/ml, což bylo v pĜedchozím pokusu vyhodnoceno jako optimální koncentrace lysozymu v roztoku, a bakteriální kmen Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 212/106, u nČhož bylo izolováno nejménČ DNA. Po vyhodnocení na základČ Obr. 24 byla jako nejoptimálnČjší doba pĤsobení lysozymu na bunČþnou stČnu doba 3 hod. Na Obr. 24 lze vidČt, že PCR produkty po 1 hod pĤsobení lysozymu jsou slabé a po 5 hod pĤsobení jsou PCR produkty rozostĜené. PravdČpodobnČ došlo k degradaci DNA. Další úkol byl srovnat pĤsobení imobilizovaného lysozymu s ostatními lyzaþními þinidly. PĜi použití imobilizovaného lysozymu bylo získáno ménČ PCR produktu než pĜi použití jiných lyzaþních þinidel. Na Obr. 24 je detegován pouze slabý PCR produkt po 1 hodinovém pĤsobení lysozymu. Bylo to zĜejmČ proto, že toto množství imobilizovaného lysozymu nebylo dostateþné pro lyzi bunČk, nebo imobilizací lysozymu byly porušeny vlastnosti enzymu. PĜi spektrofotometrickém mČĜení koncentrace DNA, kde byl na pĜípravu HL bunČk použit prášek Amway, byly hodntoty koncentrace DNA záporné, což mĤže být zpĤsobené tím, že prací prášek obsahuje pĜímČsy, které ovlivĖují spektrofotometrické mČĜení. Takto pĜipravenou DNA nelze spektrofotometricky analyzovat. Souþástí pokusu bylo i ovČĜit, zda jsou v pracím prášku pĜítomné enzymy, které by se daly použít k lyzy bunČk, což se podaĜilo. V tomto pokusu bylo ovČĜeno, že prací prášek Amway obsahuje enzymy, pomocí kterých lze lyzovat buĖky. VýtČžnost DNA byla srovnatelná s výtČžností DNA získané z lyzovaných bunČk roztokem B s lysozymem v roztoku o koncentraci 3 mg/ml. Imobilizovaný lysozym a lysozym obsažený v roztoku B jsou finanþnČ nákladné, oproti použití pracího prášku. Bylo prokázáno, že za použití pracího prášku dochází k lyzi bunČk a ze vzniklých hrubých lyzátu bunČk lze pomocí magnetických þástic izolovat DNA v kvalitČ vhodné pro PCR. PĜímo magnetické þástice jsou vhodné pro izolaci DNA ve výše uvedené kvalitČ, což bylo prokázáno Ĝadou autorĤ. (Rittich a kol., 2006)
74
5.3 Testování rĤzných koncentrací pracího prášku pro lyzi bunČk Cílem pokusu bylo najít optimální koncentraci lyzaþního roztoku obsahujícího prací prášek Amway. Spektrofotometrické mČĜení bylo provedeno na pĜístroji Nanodrop. Byla zmČĜena koncentrace DNA a hodnota þistoty DNA byla vypoþítána z pomČru absorbancí A260nm/A280nm. (Sambrook a Russel, 2001) PĜi hodinovém pĤsobení lyzaþního roztoku byly hodnoty koncentrace nejvyšší u vzorku, kde byl pro lyzi bunČk použit roztok B s 3 mg/ml lysozymu v roztoku. PĜi 3 hod pĤsobení lyzaþního roztoku byla však nejvyšší koncentrace DNA u vzorku, kde byl pro pĜípravu HL bunČk použit 1% roztok pracího prášku Amway. Z hrubých lyzátĤ byla DNA izolována pomocí magnetických þástic P(HEMA-co-GMA) a použita jako matrice do PCR. NejintenzivnČjší PCR produkty byly detegovány u vzorku, kde pro pĜípravu HL bunČk byl použit roztok B s lysozymem v roztoku a 4% roztok pracího prášku Amway. Jako optimální koncentrace roztoku pracího prášku Amway byla zvolena koncentrace 4 %. PĜi použití roztoku pracího prášku o nižších koncentracchí byly detegované PCR produkty ménČ intenzivní (Obr. 25). To znamená, že ve PCR smČsi bylo menší množství DNA. V dalších pokusech byla pro lyzi bunČk používána koncentrace roztoku pracího prášku 4 %. Používání roztoku B s obsahem lysozymu v roztoku pro pĜípravu HL bunČk je nákladné oproti používání pracích práškĤ.
5.4 Testování rĤzných pracích práškĤ pro lyzi bunČk Cílem pokusu bylo zjistit, který prací prášek je vhodnČjší pro lyzi bunČk. BuĖky byly lyzováný pomocí roztokĤ pracích práškĤ: sypký Amway, tekutý zelený Persil, tekutý modrý Persil, sypký Persil a tekutý PER 100%, u kterých výrobci uvádČjí pĜítomnost enzymĤ v pracím prášku. Z HL bunČk byla izolována DNA pomocí magnetických mikroþástic(P(HEMA-co-GMA), která byla následnČ použita do PCR, tak jako v pĜípadČ použití prášku Amway. Intenzita PCR produktĤ získaných z DNA matrice, izolované z hrubých lyzátĤ bunČk pĜipravených pomocí rĤzných pracích práškĤ, byla témČĜ srovnatelná. PĜi provádČní experimentĤ podle uspoĜádání uvedeném v této práci bylo zjištČno, že pĜi pĜípravČ lyzaþních roztokĤ je jednodušší používat tekuté prací prášky. Lépe se rozpouštČjí a filtrují. Proto byly v dalších pokusech používány pĜedevším tekuté prací prášky.
5.5 Izolace DNA z hrubých lyzátĤ bunČk potravináĜských matric V tomto pokusu byly použity k izolaci DNA lyzáty bakteriálních bunČk, obsažených v mléþných výrobcích. DNA byla izolována pomocí mikroþástic (P(HEMA-co-GMA) pokrytých karboxylovými skupinami. S takto izolovanou DNA byla provedena PCR. PCR produkt byl nejprve detegován pouze ze vzorku bílého jogurtu (Madeta), kde lyzaþní roztok pracího prášku PER 100% pĤsobil 1 hod. 75
Lze pĜedpokládat, že u ostatních vzorkĤ byly výsledky negativní z dĤvodĤ nízké koncentrace cílových bunČk ve vzorku. Proto byl proveden další pokus, kde se vycházelo z vČtšího objemu vzorku mléþného výrobku. BČhem procesu pĜípravy hrubých lyzátĤ bunČk byl vzorek promyt sterilní vodou pouze jednou, protože u pĜedchozího pokusu došlo ke ztrátám bunČk z dĤvodu složité manipulace pĜi promývání vzorku. OsvČdþilo se i vČtší množství DNA matrice v PCR smČsi (3 ȝl). Specifické PCR produkty pro rod Lactobacillus byly detegovány po amplifikaci DNA izolované ze všech vzorkĤ mléþných produktĤ.
76
6
ZÁVċR
V diplomové práci byla opimalizována lyze bakteriálních bunČk rodu Lactobacillus. PĜíprava hrubých lyzátĤ bunČk byla provedena pomocí lyzaþních roztokĤ obsahující enzym lysozym, imobolizovaný lysozym a pomocí pracích práškĤ. Byly opimamalizovány následující podmínky pĤsobení lyzaþních roztokĤ na bunČþnou stČnu bakteriálních bunČk: þas, koncentrace lysozymu, resp. koncentrace pracích práškĤ. Jako nejvhodnČjší se jevil lyzaþní roztok s koncentrací lysozymu 3 mg/ml s tĜí hodinovým pĤsobením na buĖky. Tento lyzaþní roztok byl nadále používán jako kontrola pĜi další optimalizaci. Bylo zjištČno, že prací prášky obsahují enzymy vhodné k narušení bunČþné stČny. Bylo testováno pČt druhĤ komerþních pracích práškĤ. Všechny tyto prášky se projevily jako velmi vhodné k pĜípravČ lyzaþních roztokĤ. Je vhodnČjší použít tekuté prací prášky z dĤvodĤ lepší rozpustnosti a snadnČjší pĜípravy lyzaþního roztoku. Lyzaþní roztoky pĜipravené z pracích práškĤ byly testovány na potravináĜských matricích (mléþné výrobky) s velmi uspokojivým výsledkem. DNA byla z hrubých lyzátĤ bunČk izolována pomocí magnetických nosiþĤ P(HEMA-co-GMA) pokrytých karboxylovými skupinami, amplifikována metodou PCR a detegována gelovou agarosovou elektroforézou. Po zhodnocení výsledkĤ byl jako optimální lyzaþní roztok zvolen prací prášek PER100% pro snadnou pĜípravu lyzaþního roztoku, úþinku pĜi lyzi bakteriálních bunČk a krátkému þasovému pĤsobení. V této diplomové práci byla vypracována metoda pĜípravy hrubých lyzátĤ bunČk, která je stejnČ úþinná jako pĜi použití komerþního lysozymu, ale mnohem levnČjší.
77
7
SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJģ
Balogová P. Identifikace bakterií mléþného kvašení v probiotických preparátech (tabletách) s využitím amplifikaþních metod.. BakaláĜská práce. Brno: VUT v BrnČ, Fakulta chemická, 2008. Balogová P., Izolace a identifikace DNA probiotických bakterií v komplexních matricích. Diplomová práce. Brno: VUT v BrnČ, Fakulta chemická, 2008. Bruce, I. J., Taylor, J., Todd, M., Davies, M. J., Borioni, E., Sangregorio, C., Sen, T.: Synthesis, characterisation and application of silica-magnetite nanocomposites, Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 284: 145-160. 2004. Dubernet S., Desmasures N., Guégue M.: A PCR-based method for identification of lactobacilli at the genus level. FEMS Microbiol. Lett., 214: 271-275. 2002 Horák, D., Rittich, B., Španová, A., Beneš M.J.: Magnetic microparticulate carriers with immobilized selective ligands in DNA diagnostics. Polymer, 46: 1245-1255. 2004. Kaprálek, F. Fyziologie bakterií, 1. vydání, Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1986. ISBN 14-600-86 ,604 str. Klein G., Pack A., Bonaparte C., Reuter G.: Taxonomy and physiology of probiotic lactic acid bacteria, International Journal of Food Microbiology, 42: 103–125. 1998 Kubicz P., Reverzibilní imobilizace DNA na novČ syntetizovaných magnetických nosiþích, Diplomová práce. Brno : Vysoké uþení technické Brno. 2010. Life Technologies Corporation – oficiální webové stránky dostupné z: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Dynal/Dynabeads-Types-and-Uses.html, staženo dne 27. 4. 2010. McBain, C. S., Yiu, HP. H., Dobson, J.: Magnetic nanoparticles for gene and drug delivery. International Journal of Nanomedicine, 3: 169–180. 2008 Merk K., Borelli C., Korting H. CH.: Lactobacilli - bacteria- host interactions with special regard to the urogenital trakt, International Journal of Food Microbiology, 24: 9-18. 2004.
78
Petrová K. Identifikace bakterií mléþného kvašení (BMK) v mléþných výrobcích s využitím metod amplifikace DNA. Diplomová práce. Brno: Masarykova univerzita v BrnČ. 2004. Rau A., The crystal structure of a bacterial lysozyme at atomic resolution, Dissertation thesis. Jena: Fridrich–Schiller–Universität Jena, Chemisch–Geowissenschaftlichen Fakultät, 2005. Rittich, B., Španová, A., Horák, D., Beneš, M.J., Klesnilová, L., Petrová, K., RybníkáĜ, A.: Isolation of microbial DNA by newly designed magnetic particles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 52: 143-148. 2006. Roginski H., Fuquay J. W., Fox P. F., Encyklopedia of dairy sciences, Londýn: Acadademic Press, 2003. ISBN 0-12-227235-8, 2799 str. Rosypal, S. a kol. Obecná bakteriologie, 1. vydání Praha: Státní pedagogické nakladatelství, 1981 ,749 str. Sambrook J., Russel D. W. Molecular cloning: A laboratory manual (II), 3. vydání. New York : Cold Spring Labor. Harb. Press. 2001. Sakar, T. R., Irudayaraj J.: Carboxyl-coated magnetic nanoparticles for mRNA isolation and extraction of supercoiled plasmid DNA, Analytical Biochemistry, 379: 130-132. 2008. Šilhánková L., Mikrobiologiepro potravináĜe a biotechnology, 3. vydání, Praha: Nakladatelství Akademie vČd ýeské republiky, 2002. ISBN 80-200-1024-6, 363 str. Španová A., Rittich B., Analýza vybraných bakterií mléþného kvašení pomocí metod molekulární biologie, Brno: Vysoké uþení technické v BrnČ, 2010, ISBN 978-80-214-4004-3, 86 str. Votava M., LékaĜská mikrobiologie speciální, 1. vydání, Brno : Neptun, 2003. ISBN 80-902896-6-5, 495 str.
79
8
SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK
DNA A G C T PCR PGMA P(HEMA) HL
80
deoxyribonukleova kyselina adenin guanin cytosin tymin polymerázová ĜetČzová reakce poly(glycid methakrylát) poly(2-hydroxy methakrylát) hrubý lyzát
SEZNAM PěÍLOH Poster - The use of enzymes contained in the washing powders to the preparation of the crude lysates of Lactobacillus cells for magnetic DNA isolation
81
9
82
PěÍLOHY