VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY
FAKULTA CHEMICKÁ FACULTY OF CHEMISTRY
ÚSTAV CHEMIE POTRAVIN A BIOTECHNOLOGIÍ INSTITUTE OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY
INTERAKCE PLASMIDOVÉ DNA SE SLOUČENINAMI LANTHANOIDŮ PLASMID DNA INTERACTIONS WITH LANTHANOIDE COMPOUNDS
BAKALÁŘSKÁ PRÁCE BACHELOR'S THESIS
AUTOR PRÁCE
Sabina Göghová
AUTHOR
VEDOUCÍ PRÁCE SUPERVISOR
BRNO 2016
doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc.
Vysoké učení technické v Brně Fakulta chemická Purkyňova 464/118, 61200 Brno
Zadání bakalářské práce Číslo bakalářské práce: Ústav: Student(ka): Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce Konzultanti:
FCH-BAK1011/2015 Akademický rok: 2015/2016 Ústav chemie potravin a biotechnologií Sabina Göghová Chemie a technologie potravin (B2901) Potravinářská chemie (2901R021) doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. doc. RNDr. Alena Španová, CSc.
Název bakalářské práce: Interakce plasmidové DNA se sloučeninami lanthanoidů
Zadání bakalářské práce: 1. Vyhledání a kritické zpracování dostupné literatury k dané problematice. 2. V praktické části izolovat plasmidovou DNA z bakteriální kultury a štěpit ji vybranými sloučeninami (ionty) lanthanoidů. 3. V teoretické části vyhodnotit získané poznatky formou diskuse.
Termín odevzdání bakalářské práce: 20.5.2016 Bakalářská práce se odevzdává v děkanem stanoveném počtu exemplářů na sekretariát ústavu a v elektronické formě vedoucímu bakalářské práce. Toto zadání je přílohou bakalářské práce.
----------------------Sabina Göghová Student(ka)
V Brně, dne 31.1.2016
----------------------doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc. Vedoucí práce
----------------------prof. RNDr. Ivana Márová, CSc. Ředitel ústavu ----------------------prof. Ing. Martin Weiter, Ph.D. Děkan fakulty
Abstrakt V teoretické části bakalářské práce byl vypracován přehled literatury o izolaci a purifikaci plasmidové DNA, využití lanthanoidů jako neenzymatických nukleas a praktický význam sloučenin lanthanoidů v medicíně. V praktické části práce byla izolována plasmidová DNA pUC19 metodou alkalické lýzy. Izolované plasmidová DNA byla štěpena při 70 °C v různých časových intervalech chloridem neodimitým. K vyhodnocování experimentů byla použita gelová elektroforéza.
Abstract In the theoretical part of bachelor thesis, literature was summarised on the isolation and purification of plasmid DNA, the application of lanthanides as non enzymatic nucleases and practical importance of lanthanide compounds in medicine. In the experimental part of the thesis, plasmid DNA pUC19 was isolated by the method of alkaline lysis. Isolated plasmid DNA was cleaved by neodymium trichloride at 70 °C in different intervals. Gel electrophoresis was used for evaluation of experiments.
Klíčová slova DNA pUC19, izolace, alkalická lyze, štěpení lanthanoidy, gelová elektroforéza
Key words DNA pUC19, isolation, alkaline lysis, cleavage by lanthanides, gel electrophoresis
3
GÖGHOVÁ, S. Interakce plasmidové DNA se sloučeninami lanthanoidů. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2016. 33 s. Vedoucí bakalářské práce doc. Ing. Bohuslav Rittich, CSc..
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana FCH VUT. .............................................. Sabina Göghová
PODĚKOVÁNÍ Ráda bych poděkovala vedoucímu bakalářské práce panu doc. Ing. Bohuslavu Rittichovi, CSc. za jeho odborné vedení, poskytnutí cenných informací, trpělivost a čas, který mi věnoval.
4
Obsah 1. ÚVOD ............................................................................................................................... 7 2. TEORETICKÁ ČÁST ...................................................................................................... 8 2.1 Nukleové kyseliny ..................................................................................................... 8 2.2 Základní charakteristiky plasmidů............................................................................. 8 2.3 Přenos genů .............................................................................................................. 11 2.4 Plasmid pUC19 ........................................................................................................ 11 2.5 Izolace a purifikace plasmidové DNA ..................................................................... 12 2.6 Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA .................................... 13 2.7 Lanthanoidy jako neenzymatické nukleasy ............................................................. 14 2.8 Využití lanthanoidů pro praktické aplikace ............................................................. 15 2.9 Gelová elektroforéza na agarose .............................................................................. 16 3. CÍL PRÁCE .................................................................................................................... 17 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .......................................................................................... 18 4.1 Chemikálie a mikroorganismy................................................................................. 18 4.1.1 Chemikálie ........................................................................................................ 18 4.1.2 Použité mikroorganismy ................................................................................... 18 4.2 Roztoky a média ...................................................................................................... 18 4.2.1 Kultivační půdy pro přípravu médií ................................................................. 18 4.2.2 Roztoky pro izolaci plasmidové DNA (alkalická lyze) .................................... 19 4.3 Přístroje a pomůcky ................................................................................................. 21 4.4 Metody ..................................................................................................................... 21 4.4.1 Kultivace bakteriálních buněk E. coli JM 109 a E. coli JM 109 (pUC19) na pevných médiích .............................................................................................................. 21 4.4.2 Izolace plasmidové DNA (alkalická lyze) ........................................................ 22 4.4.3 Odstranění RNA srážením chloridem lithným ................................................. 22 4.4.4 Stanovení koncentrace, čistoty a intaktnosti pDNA ........................................ 22 4.4.5 Štěpení plasmidu pUC19 roztokem chloridem neodimitým ............................ 23 4.4.6 Gelová elektroforéza plasmidové DNA po štěpení chloridem neodimitým ..... 23 5. VÝSLEDKY A DISKUSE ............................................................................................. 24 5.1 Kultivace buněk v médiích bez antibiotika a s antibiotikem ................................... 24 5
5.2 Izolace plasmidové DNA metodou alkalická lyze a srážení RNA roztokem chloridu lithného ................................................................................................................................. 25 6. ZÁVĚR ........................................................................................................................... 29 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ ..................................................................................... 30 SEZNAM ZKRATEK ......................................................................................................... 33
6
1. ÚVOD Plasmidové DNA hrají významnou roli v lékařském výzkumu při vývoji nových léčiv a vakcín. Představují novou generaci vakcín s velkým potenciálem při prevenci řady nemocí. Používají se jako klonovací vektory, pomocí kterých lze přenést genetický materiál do jiných organizmů. Molekulární biologie obsahuje dostatečné techniky pro genové manipulace, které umožňují přípravu rekombinantních plasmidových molekul DNA a tedy i přípravu plasmidových DNA vakcín. Vývoj syntetických látek, které štěpí (hydrolyzují) nukleové kyseliny (DNA, RNA) je nezbytný pro řadu aplikací v molekulární biologii, lékařství a souvisejících oborech. Pro některé aplikace však neexistují vhodné restriktasy, které bynukleové kyseliny štěpily ve zvolené sekvenci. K činidlům štěpícím nukleové kyseliny hydrolýzou fosfodiesterové vazby patří především ionty některých přechodných prvků a lanthanoidů.
7
2. TEORETICKÁ ČÁST 2.1
Nukleové kyseliny
Nosičem genetické informace jsou nukleové kyseliny DNA nebo RNA. Nukleové kyseliny jsou z chemického hlediska polynukleotidy, monomerem je nukleotid. Monomer se skládá z dusíkatého heterocyklu, pentosy a z fosfátové skupiny. Dusíkaté báze ovlivňují strukturu nukleových kyselin. Z chemického hlediska purinové a pyrimidinové báze jsou konjugovaná jádra se střídavými jednoduchými a dvojnými vazbami. Z důvodu rezonance vznikají delokalizované elektrony. Důsledkem je planární struktura pyrimidinu a ne celkem planární struktura purinu. Dále v závislosti na pH dusíkaté báze existují v tautomerních formách [1]. Podle komponentu monomerů se rozlišuje RNA s monomerem ribonukleotidů, a DNA s monomerem deoxyribonukleotidů. DNA se slouží pro dlouhodobé skladování informace a v buňkách se vyskytuje v dvouřetězcové formě [1]. RNA je nosičem genetické informace jenom u RNA virů [2]. Funkčním jednotkou genetické informace je gen, který kóduje tvorbu bílkovin. Bakteriální buňka obsahuje více genů, zhruba 90% DNA se skládá z genů, naopak eukaryotní DNA obsahuje veliké množství intronů, které jsou nekódující části [3]. Jedna dlouhá molekula DNA vytváří chromosom, v eukaryotních buňkách chromosom je komplexem DNA s bílkovinami, v prokaryotních buňkách chromosomem rozumíme kružnicovou dvouřetězcovou DNA v relaxovaném a nadšroubovicovém uspořádání [4] (Obrázek1 a Obrázek2). Genomem se rozumí veškerá genetická informace organizmů. Bakteriálním genomem je chromosom a plasmidy [3].
2.2
Základní charakteristiky plasmidů
Plasmidy je malé, většinou kruhové molekuly DNA, která se přirozeně vyskytují v cytoplazmě některých bakterií, archebakterií, méně obvykle i u eukaryot. Výraz plazmid byl prvně použit v roce 1952 Lederbergem [6]. Genetická informace u bakterie je uložená nejenom v chromosomální DNA, ale buňka může obsahovat i extrachromosomální molekuly dsDNA, které jsou schopné samostatné replikace jako chromosomální DNA. Plasmidy obsahují genetické informace, které nejsou nezbytné pro růst buněk [7] obsahují např. geny zajišťující resistenci proti antibiotikům. Plasmidová DNA je nejčastěji kružnicová a může se vyskytovat v buňce ve více kopiích; v porovnání s chromosomální DNA, která se vyskytuje v buňce jedenkrát. Jeden plasmid může mít velikost v rozmezí cca 1 000– 200 000 párů bází. Plasmidy tvoří 1- 5 % prokaryotní DNA.
8
Obrázek 1: Struktura eukaryotického chromosomu [5]
Obrázek 2: Krátký úsek dvoušroubovice DNA [5]
Plasmidová DNA se vyskytuje v několika formách: 1. nadšroubovicová, kovalentně uzavřená kružnice (ccc – covalently closed circular). DNA, která nemá volné konce ani zlom, 9
2. otevřená kružnice (oc – open circular), která obsahuje zlom v jednom z řetězců, 3. lineární. K replikaci plasmidu jsou potřebné enzymy, které jsou kódovány buď geny nesenými na plasmidu nebo na chromosomu [4]. Rozlišujeme dva základní typy replikace: • stringentní kontrola replikace - plasmidy jsou schopné replikace během buněčného dělení; plasmid je udržován v buňce jen v 1 kopii, • relaxovaná kontrola replikace, která je nezávislá na replikaci buněčného chromosomu; v bakteriální buňce je plasmid udržován v 1 až 20 kopiích. Podle vlastností lze plasmidy rozdělit do následujících druhů: 1. R-plasmidy způsobují v hostitelských buňkách rezistenci na těžké kovy či antibiotika. Plasmid, který kóduje rezistenci na antibiotika (R-plasmid) slouží jako selekční marker. To znamená, že na médiu, které obsahuje antibiotikum, můžeme kultivovat jenom bakterie, které obsahují daný plasmid. Col plasmidy - v buňce podmiňují tvorbu polypeptidových toxinů.
2. 3.
F-plasmidy - neobsahují jiné geny kromě replikačních a ferilitních genů. Pro jejich přenos je nutný bezprostřední kontakt mezi samčí a samičí buňkou. Některé bakterie obsahují F faktor (fertilitní faktor), což umožňuje konjugaci buněk pomocí speciálních pilů pro přenos část genetické informace. Po spojení buněk F+ bakterie předává svůj plasmid do buňky F- [8].
4.
Virulentní plasmidy - jsou zodpovědné za patogenitu a virulenci v hostitelské buňce.
5.
Degradační plasmidy - nesou geny kódující informace o enzymech, které zabezpečují rozklad cizorodých molekul.
6.
2 µm plasmid – malý kruhový plasmid vyskytující se u kvasinek Saccharomyces cerevisiae
7.
pGKL plasmidy – lineární plasmidy kvasinky Kluyveromyces lactis kódující tzv. killer fenotyp. Rhizobiální plasmidy – plasmidy umožňující fixaci vzdušného dusíku (N2)
8. 9.
Ti-plasmid – na těchto plasmidech se nachází geny, jejichž produkty vyvolávají tvorbu nádorů na kořenech dvouděložných rostlin.
2.3 Přenos genů Upravené plasmidy, nebo viry jsou vhodnými klonovacími vektory, na kterých jsou klonovací místa (buď jedinečná nebo mnohočetná restrikční místa - polylinker). 10
Do restrikčních míst se vkládá část cizorodé DNA a vzniká rekombinantní DNA. Plasmidové vektory lze přenášet různými metodami, např. chemickou transformací nebo elektroporací. Chemická transformace je metoda, při které za použití chloridu vápenatého a tepelného šoku se získají kompetentní buňky, do kterých se transformuje cizorodá DNA. Elektroporace je obousměrná metoda, kterou lze přenést do buněk nebo z buněk kromě DNA i jiné molekuly, (např. proteiny). K transportu molekul do buněk dochází po aplikaci krátkého elektrického pulzu o vysokém napětí. [9]. Účinnost transformace lze kontrolovat kultivací buněk na půdě obsahující selekční markéry [9, 10]. Jiným typem transformace je postup při kterém je využíván tzv. Yoshida efekt. Principem metody je přenos DNA do nekompetentních buněk pomoci nanojehel v koloidním roztoku. Jemný roztěr směsi buněk a nanojehel způsobuje průnik nanojehel s obsahem DNA do buněk. K tomuto účelu byl používán asbest, který byl nahrazen minerálem sepiol [11]. Klasickými klonovacími vektory jsou plasmidy pUC18, pUC19 a pBR322. Velmi častým hostitelem plasmidových vektorů jsou buňky Escherichia coli [12].
2.4 Plasmid pUC19 Plasmidy typu pUC neobsahují rop gen, který kóduje protein kontrolující replikaci - proto se v buňkách nachází ve více kopiích. Molekula plasmidu pUC19 (Obrázek 3) obsahuje gen kódující rezistenci k ampicilinu, který slouží jako selekční marker.
Obrázek 3: Mapa plasmidu pUC19 [14]
11
Dále obsahuje gen kódující regulační sekvenci a část genu kódujícího βgalaktosidasu.Expresí vzniká neaktivní N-koncový fragment enzymu, který v buňkách kódujících C-koncový úsek β-galaktosidasy vznik aktivního enzymu. Tento jev se nazývá αkomplementace. Bakterie s aktivní β-galaktosidasou jsou schopny rozkládat 5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-galaktosid (X-gal) za vzniku modrého zbarvení kolonií [10, 12]. Enzym β-galaktosidasa hydrolyzuje glykosidickou vazbu laktosy za vzniku glukosy a galaktosy [13]. Pokud buňka není schopná rozkládat X-gal tak kolonie budou mít bílé zbarvení. Syntézu Nterminálního fragmentu β-galaktosidasy lze inaktivovat vložením fragmentu DNA do plasmidu [10].
2.5 Izolace a purifikace plasmidové DNA Existuje řada postupů pro izolaci a purifikaci DNA; metoda se volí s ohledem na účel pro který bude nukleová kyselina používána. Izolace DNA začíná lyzí buněk, při kterém je stěna bakteriálních buněk rozpuštěna lysozymem. Suspenze obsahuje RNA, proteiny a zbytky buněčných stěn, které mohou ovlivnit kvalitu izolované DNA. Plasmidovou DNA lze izolovat metodou alkalická lyze. V alkalickém prostředí se chromosomální DNA sráží, naopak plasmidová DNA v ccc formě zůstává v roztoku i když podléhá denaturaci. Do původního stavu se plasmidová DNA převede po okyselení roztoku. Pro další použití je nutné plasmidovou DNA zbavit proteinů, RNA, toxinů a dalších látek. K tomuto účelu je vhodné použít dvoufázové vodné systémy [15] nebo některý typ chromatografie [16]: afinitní chromatografie (AC) chromatografie na měničích aniontů (AEC) chromatografie s obrácenými fázemi (RP-HPLC) gelová chromatografie (molekulová vylučovací chromatografie) (SEC) hydrofobní interakční chromatografie (HIC)
2.6 Spektrofotometrické stanovení koncentrace a čistoty DNA Úspěšnost purifikace plasmidové DNA lze kontrolovat změřením absorbance v UV části spektra v rozsahu vlnových délek 220-320 nm [9]. Delokalizované elektrony mají maximum absorbance při 260 nm (Obrázek 4). Při této absorbanci lze rovněž stanovit koncentraci DNA; přítomnost RNA však obsah DNA nadhodnocuje. Při denaturaci DNA dochází k růstu absorbance (hyperchromický efekt). Hodnota absorbance je ovlivněna poměrem bází v nukleových kyselinách a kvalitou vzorku. Při izolaci DNA se používá řada rozpouštědel, která při nedostatečném odstranění by mohla ovlivnit čistotu izolované DNA. Vzorek může dále obsahovat zbytky bílkovin a další kontaminanty. Fenol, který se používá při extrakci DNA má maximum absorbance při 230 nm. Rovněž některé kontaminující látky (např. huminové kyseliny, rostlinné fenolické látky) koextrahované při izolaci DNA absorbují v oblasti 230 nm. Bílkoviny obsahující aminokyseliny s aromatickým jádrem mají maximum 12
absorbance při 280 nm; z poměru 260nm/280nm lze zjistit, zda vzorek je dostatečně čistý a vhodný pro následnou identifikaci DNA s použitím molekulárně biologických metod [17]. RNA má maximum absorbance při 260 nm a její přítomnost zvyšuje hodnotu koncentrace DNA. Proto je doporučováno odstranění RNA srážením LiCl. Úspěšnost srážení RNA je vhodné kontrolovat pomocí gelové elektroforézy [12]. Při použití enzymu RNasa A dochází sice ke štěpení RNA na kratší fragmenty (které nejsou detegovatelné na gelu), ale hodnota absorbance se prakticky nemění. Při velmi nízkých koncentracích DNA se používá citlivější metoda s použitím vhodných fluorescenčních barviv, které se vážou na nukleové kyseliny [17].
Obrázek 4: Spektrum absorbance nativní a denaturované DNA bakterie E.coli [18]
2.7 Lanthanoidy jako neenzymatické nukleasy Nekatalyzované štěpení fosfoesterové vazby P–O probíhá velmi pomalu a tato vazba je za fyziologických podmínek prakticky inertní. Restrikční endonukleasy (restriktasy) jsou velká skupina původně bakteriálních enzymů, které štěpí esterové vazby v řetězcich dsDNA. Bakteriím pravděpodobně slouží jako ochrana před narušením jejich genomu cizí (např. virovou) DNA. Každý bakteriální druh chrání vlastní DNA v restrikčním místě methylací několika bází. DNA, která nemá tyto methylové skupiny je štěpena a destruována. Existují stovky restrikčních enzymů, které jsou vytvářeny různými bakteriemi a štěpí DNA v různých sekvencích. Restriktasy se klasifikují podle složení molekuly a specificity štěpení DNA na 4 typy (typ I, II, III a IV).
13
Největší uplatnění v genovém inženýrství mají nukleasy typu II, které specificky štěpí molekulu nemethylované DNA v místě (nebo v blízkosti) rozpoznávací sekvence, která je obvykle symetrická. Pro některé aplikace však neexistují vhodné restriktasy, které by nukleové kyseliny štěpily ve zvolené sekvenci. Vývoj syntetických látek, které štěpí (hydrolyzují) nukleové kyseliny (DNA, RNA) je nezbytný pro řadu aplikací v molekulární biologii, lékařství a souvisejících oborech [17]. Ke štěpení nukleových kyselin pomocí syntetických látek jsou využívány následující mechanismy: 1. tvorba volných radikálů, 2. eliminace, 3. hydrolýza fosfodiesterových vazeb. ad. 1. Specifita štěpení volnými radikály je nízká. Molekuly radikálů jsou malé a mohou snadno difundovat podél molekuly nukleové kyseliny a štěpit substrát na více místech. Koncové struktury fragmentů jsou jiné než vytvořené přirozeně se vyskytujícími nukleasami, a proto nemohou být opětovně spojeny ligasou. Další problém je v tom, že volné radikály jsou škodlivé pro biologické systémy, proto nejsou vhodné pro aplikace in vivo. Pro činidla tvořící volné radikály jsou nutné oxidačně-redukční kofaktory. ad. 2. Nukleové kyseliny eliminačním mechanismem štěpí např. tripeptid lysyn-tryptofanlysin, který rozpoznává DNA v nebázických místech. Koncové struktury fragmentů jsou rovněž jiné než vytvořené přirozeně se vyskytujícími nukleasami, proto nemohou být opětovně spojeny ligasou. ad. 3. K činidlům štěpícím nukleové kyseliny hydrolýzou fosfodiesterové vazby patří především ionty kovů: ionty některých přechodných prvků - Co3+, Zn2+, Cu2+, Mg2+, Pb2+, Mn2+, ionty lanthanoidů a jejich komplexy. Hydrolytické štěpení má oproti štěpení pomocí volných radikálů následující výhody: fragmenty mohou být po štěpení opětovně spojeny ligasou, protože nedochází ke tvorbě radikálů nenastává poškození biologického systému (jsou bezpečné při použití in vivo). Nevýhodou je skutečnost, výše uvedené prvky neštěpí nukleové kyseliny specificky ale náhodně. Tento nedostatek lze odstranit použitím oligonukleotidových sond, které obsahují funkční skupiny (např. cheláty lanthanoidů) indukující štěpení nukleových kyselin v požadovaném místě (sekvenci). Lanthanoidové ionty jsou připojeny k 5'-konci syntetického oligomeru, který je komplementární ke specifické sekvenci cílové DNA, pomocí iminodiacetátového ligandu. Za fyziologických podmínek tyto hybridní molekuly selektivně hydrolyzují DNA nebo RNA od 3'-konce sekvence, která je komplementární k DNA oligomeru [19 – 21]. Nejvíce aktivní při hydrolýze byly ionty Ce4+ ; ionty Eu3+ , Tm3+ a Lu3+ byly nejvíce aktivní při hydrolýze RNA [19]. Autoři [22] připravili sekvenčně selektivní ribonucleasu připojením ethylenediaminu k 5'-konci DNA oligomeru.
14
2.8 Využití lanthanoidů pro praktické aplikace V posledních letech je věnována velká pozornost aplikacím lanthanoidů v průmyslových a medicínských oblastech, zejména je studován jejich vliv na živé organismy. Často se studuje cytotoxicita lanthanoidů, za fyziologických podmínek. Lanthanoidy jsou schopny se navázat na specifické biomolekuly a jsou transportovány hlavně do jater a ledvin. Byla studována in vitro toxicita iontů Eu3+ v organizmech savců a byla pozorována tvorba komplexů s organickými ligandy v moči [23]. Ln3+ ionty jsou toxické, ale při tvorbě stabilních komplexů (Obrázek 5) lze toxicitu významně snížit. Pro značení buněk je využívána luminiscence lanthanoidů [24], které mají specifické spektrální vlastnosti. Ligandy nejenom výrazně snižují toxicitu, ale jsou nezbytné pro luminiscenci, protože absorbují energii pro excitaci a předávají ji dál lanthanoidům. Luminiscence těchto sloučenin je využíván v imunoanalýze, v tkáňově specifickém zobrazování a molekulární diagnostice. Lanthanoidy jsou také využívány v nádorové terapii, protože některé molekuly s antitumorovou aktivitou jsou schopné vytvářet komplexy a cíleně interagovat s DNA [25]. Zvýšení permeability komplexu do buněk se dá ovlivňovat použitím ligandů, které obsahují halogen [26].
Obrázek 5: Příprava lanthanoidových komplexů [26]
Žádoucí vlastností při vizualizaci buněk (biomolekul) pomocí lanthanoidů je ostrý a intenzivní emisní pás, relativně delší životnost a velký Stokesův posun [25, 27]. V závislosti na druhu lanthanoidu je možné zobrazení v oblastech UV-VIS-NIR. Některé lanthanoidy jsou vhodné jako kontrastní látky pro magnetickou rezonanci. Nejčastěji se využívají komplexy Gd3+ [25, 28]. Pro aplikace komplexů lanthanoidů je potřebné, aby byly odolné vůči enzymům, byly udržovány v buňce do potřebnou dobu a hlavně aby neovlivnily homeostázu, růst a rozmnožování buněk [25]. Bylo rovnež studováno štěpení pBR322 s použitím chloridů Eu3+, La3+, Pr3+, Gd3+ v pufru HEPES. Výsledky byly vyhodnoceny po štěpení plasmidu při různých teplotách (v rozmezí 24-76 °C), a v časových intervalech 0-3 hodin. Byla pozorována přeměna plasmidové DNA z ccc do oc a následně do lineární formy. Štěpení bylo nejúčinnější při teplotách 63 a 76 °C. Výsledky byly vyhodnoceny pomocí agarosové gelové elektroforézy [29]. Tento postup byl 15
využit při analýze plasmidů kmenů Staphylococcus aureus pocházejících z potravin a nemocničních izolátů [30].
2.9 Gelová elektroforéza na agarose Elektroforéza je hojně využívána metoda v oblasti molekulární biologie. Vzhledem k tomu, že fosfátové skupiny v nukleových kyselinách jsou negativně nabité, molekuly DNA a RNA se pohybují v elektrickém poli k anodě. Molekuly, které mají velký náboj se pohybují rychleji. Při separaci molekul se rovněž uplatňuje sítová struktura gelu. Pro separaci plasmidových DNA se obvykle používá agarosová gelová elektroforéza. Různé strukturní formy plasmidů se pohybují různou rychlostí. (Obrázek 6). Pro vizualizaci separovaných molekul se používají interkalační činidla, např. ethidiumbromid, akridinová oranž, nebo profalvin, která se váží na DNA a působením UV-světla fluoreskují [31].
Obrázek 6: Separace různých konforrmací plasmidové DNA gelovou elektroforézou [32]
16
3. CÍL PRÁCE Cílem teoretické části bakalářské práce bylo vypracovat přehled literatury o izolaci a purifikaci plasmidové DNA, využití lanthanoidů jako neenzymatické nukleasy a praktický význam sloučenin lanthanoidů v medicíně. Cílem praktické části práce byla izolace plasmidové DNA metodou alkalické lýzy a stěpení izolované pDNA chloridem neodimitým. K vyhodnocování experimentů byla použita gelová elektroforéza. Součástí práce bylo: izolace plasmidové DNA metodou alkalické lýzy, stěpení pDNA chloridem neodymitým (NdCl3) (modelová sloučenina, pozitivní kontrola).
17
4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Chemikálie a mikroorganismy 4.1.1 Chemikálie Agarosa pro gelovou elektroforézu (Top – Bio, ČR) Standard DNA (žebříček 100 bp) (Malamité, Moravské Prusy, ČR) Ethanol (Lachema, Neratovice, ČR) Ethidium bromid (Sigma, St. Louis, USA) EDTA (kyselina ethylendiaminotetraoctová) (Serva, Heidelberg, SRN) Fenol (Lachema, Brno, ČR) Glukosa (Penta, Praha, ČR) HEPES: N-(2-hydroxyethyl)-piperazin-N´-2-ethansulfonová kyselina (Serva, Heidelberg, Německo) Chlorid niobitý (Sigma, St. Louis, USA) Kyselina boritá (Lachema, Neratovice, ČR) Kyselina octová (Lachema, Neratovice, ČR) Lysozym (Serva, Heidelberg, SRN) Nanášecí pufr 10x Blue Load (Top Bio, Praha, ČR) Octan draselný (Lachema, Brno, ČR) Dodecylsulfát sodný (SDS) (Sigma, St. Louis, USA) Tris-báze (Tris-hydroxymethyl-aminomethan) (Amresco, Solon, USA) Tris-HCl (Tris-hydroxymethyl-aminomethan hydrochlorid) (Amresco, Solon, USA) Další chemikálie použité v práci byly v čistotě p. a.
4.1.2 Použité mikroorganismy V experimentech byly použity kmeny Escherichia coli JM 109 a Escherichia coli JM 109 (pUC19), které byly získány od doc. RNDr. Aleny Španové, CSc.
4.2 Roztoky a média Roztoky a metody byly převzaty z práce [12]. 4.2.1 Kultivační půdy pro přípravu médií Tekuté LB medium: Trypton ............................................... 10 g 18
kvasnicový extrakt .............................. 5 g Doplní se do 1 l destilovanou vodou, pH se upraví 1 M NaOH na hodnotu 7,0. Médium se sterilizuje 20 min při 121 °C. Tuhé LB médium (LB agar): K 1 l LB média se přidá 12 g agaru a sterilizuje se 20 min. při 121 °C, zásobní roztok ampicilinu (100 mg/ml) Tekuté LB medium: Trypton ............................................... 10 g Yeast extract ....................................... 5 g NaCl .................................................... 10 g 4.2.2 Roztoky pro izolaci plasmidové DNA (alkalická lyze) Roztok GLC s lysozymem: 50 mM glukosa ................................... 25 μl 10 mM EDTA (pH 8,0) ...................... 10 μl 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)................... 12,5 μl Destilovaná voda ................................ 425,5 μl Lysozym se do roztoku GLC přidá těsně před použitím v takovém množství, aby jeho výsledná koncentrace byla 2 mg/ml Roztok LYZ: 2 M NaOH .......................................... 100 μl 10 % SDS ........................................... 25 μl Destilovaná voda ................................ 375 μl Roztok SDS (20 %): 20 g SDS se rozpustí v 80 ml destilované vody při současném zahřívání na 68 °C; pH roztoku se upraví na hodnotu 7,0 koncentrovanou HCl. Roztok se doplní destilovanou vodou na objem 100 ml. Roztok HS: 5 M octan draselný ............................. 60 ml Kyselina octová (p.a.) ......................... 40 ml Výsledné pH je 4,8. TE pufr: 1 M Tris-HCl ...................................... 1 ml (pH 8,0) 0,5 M EDTA ....................................... 0,2 ml (pH 8,0) 19
Roztok se doplní destilovanou vodou na objem 100 ml. 1 M Tris-HCl: 121,1 g Tris-báze se rozpustí v 800 ml destilované vody, pH roztoku se upraví pomocí koncentrované HCl na hodnotu 8,0. Roztok se doplní destilovanou vodou na objem 1 litr. 0,5 M EDTA (pH 8,0): 186,1 g EDTA se rozpustí v 800 ml destilované vody, pH se upraví přidáním asi 20 g NaOH, za stálé kontroly pH roztoku. EDTA se rozpustí při hodnotě pH 8,0. Roztok se doplní destilovanou vodou na 1 litr. HEPES pufr (0,05 M; pH 8,0): HEPES ................................................ 1,92 g 1 M NaOH .......................................... 36,9 ml 1 M NaCl ............................................ 63,1 ml Roztoky pro odstranění RNA Odstranění RNA srážením LiCl: TE pufr................................................ 120 μl + 40μl LiCl 10 M ........................................... 40 μl Ethanol 96 % Štěpení plasmidové DNA chloridem neodimitým Připraví se štěpící směs smícháním následujících komponent (Tabulka 1): Tabulka 1: Složení směsi pro štěpení plasmidové DNA
Vzorek
1.
2.
Sterilní voda
13,5
13
Pufr HEPES (0,05 M; pH 8,0)
4
4
Plasmidová DNA pUC19
0,5
1
NdCl3 0,01 M
2
2
Roztoky pro gelovou elektroforézu Agarosový gel 1 % (1 g agarosy + 99 ml TBE pufru 0,5× koncentrovaný) TBE pufr 5× koncentrovaný: Tris-báze ............................................. 54 g Kyselina boritá.................................... 27,5 g 20
0,5 M EDTA (pH 8,0) ........................ 20 ml Navážka se rozpustí v 600 ml destilované vody. Roztok se doplní destilovanou vodou na objem menší než 1 litr, pH se upraví pomocí 1 M NaOH na hodnotu 8,0, a konečný objem se doplní na 1 litr. DNA standard λ/HindIII TE pufr................................................ 14 μl Standard DNA λ/HindIII (500 μg/ml) 1 μl Nanášecí pufr ...................................... 3 μl Směs se zahřívá 5 minut při 60°C.
4.3 Přístroje a pomůcky Analyticke váhy Pioneer TM PA 114 (Ohaus, New Jersey, USA) Centrifuga Mini spin (Eppendorf, Hamburg, SRN) Laboratorni váhy CS 200 (Ohaus, New Jersey, USA) Mikropipety Discovery HTL o objemu 10, 20, 200 a 1000 µl (PZ HTL, Polsko) Mikrovlnná trouba SMW 5020 (SENCOR, ČR) NanoPhotometer (Implen, Mnichov, SRN) Transluminátor TVR 312A (Spectroline, Albany, USA) Termostat – Mini Incubator 230V (Labnet, New Jersey, USA) Zařízení pro elektroforézu Easy-Cast, model B1 (Owl Scientific, Rochester, USA) Zařízení pro elektroforézu Mini gel unit 7x10 cm (Hoefer, Holliston, USA) Zdroj elektrického napětí pro elektroforézu Endurion (Labnet, Korea) Vortex (BioSan, Lotyšsko) Běžné laboratorní sklo a umělohmotné laboratorní pomůcky.
4.4 Metody 4.4.1 Kultivace bakteriálních buněk E. coli JM 109 a E. coli JM 109 (pUC19) na pevných médiích Kultivace buněk na médiích s antibiotikem: Do 150 ml LB agaru rozvařeného byl přidáno 75 μl ampicilinu. Roztok byl promíchán a rozlit do Petriho misek. Na misky s LB agarem a antibiotikem byly křížovým roztěrem naočkovány buňky E. coli JM 109 (pUC19); na další misky byly křížovým roztěrem naočkovány buňky E. coli JM 109. 21
Kultivace buněk na médiích bez antibiotika: Stejným postupem byly naočkovány buňky E. coli JM 109 (pUC19) a buňky E. coli JM 109 na misky bez ampicilinu. Buňky byly kultivovány při 37 °C do druhého dne.
4.4.2 Izolace plasmidové DNA (alkalická lyze) Plasmidová DNA byla izolovaná z kultury E. coli JM 109 (pUC19) narostlé přes noc z 1 ml tekutého LB média s ampicilinem. Narostlé kolonie byly odebrány pomocí kličky, a buňky byly resuspendovány v Eppendorfově zkumavce ve 200 μl vody. Suspenze byla centrifugována při 15 000 ot/min. Jedním převrácením zkumavky byl odlit supernatant. K sedimentu bylo přidáno 100 μl roztoku GLC s lysozymem (lysozym byl přidán do roztoku GLC těsně před použitím, jeho výsledná koncentrace byla 0,2 mg/ml). Směs byla roztřepána a inkubována 5 minut při laboratorní teplotě. Byla připravena lázeň o teplotě 0 °C. Ke směsi bylo přidáno 150 μl roztoku LYZ a promíchána. Směs byla inkubována 5 minut při 0 °C, čas byl měřen stopkami. Bylo přidáno 150 μl roztoku HS, a promícháno převrácením (5×). Směs byla inkubována 15 minut při 0 °C. Směs byla centrifugována při laboratorní teplotě a 15 000 ot/5 min. Dále se pracovalo se supernatantem ve kterém byla pDNA. Sediment obsahoval chromosomální DNA a zbytky lyzovaných buněk. Supernatant byl odebrán do Eppendorfovy zkumavky a bylo přidáno 900 μl ethanolu, směs byla promíchána a inkubována 15 minut při -20 °C. Směs byla centrifugována při 15 000 ot/5min. Supernatant byl vylit jedním převrácením a stěna zkumavky byla vysušena filtračním papírem. Sediment byl vysušen v exsikátoru a po 10 min rozpuštěn v 40 μl TE pufru. 4.4.3 Odstranění RNA srážením chloridem lithným K plasmidové DNA rozpuštěné v 40 μl TE pufru byl přidán 40 μl vychlazenho 10 M LiCl a směs byla promíchána a inkubovala se 15 min při 0 °C. Směs se centrifugovala 5 min při 15 000 ot/min. Dále se pracovalo se supernatantem, z kterého byla vysrážena plasmidová DNA 96 % etanolem přidáním 2,5 násobek objemu. Směs se inkubovala 15 min při -20 °C a centrifugovala 5 min při 15 000ot/min. Supernatant bylo odstraněno otočením zkumavky a sediment byl vysušen v exsikátoru a po 10 min rozpuštěn v 40 μl TE pufru. 4.4.4 Stanovení koncentrace, čistoty a intaktnosti pDNA Roztok plasmidové DNA v TE pufru byl napipetován do kyvety a byla změřena absorbance v rozmezí vlnových délek 220-320 nm proti TE pufru. Byly odečteny hodnoty absorbanci při 235, 260, 280 a 320 nm a hodnoty byly vyhodnoceny. Po změření absorbancí byla provedena agarosová gelová elektroforéza. Vzorky byly připraveny podle Tabulky 2:
22
Tabulka 2: Složení jednotlivých směsí DNA
Číslo směsi
Plasmidová DNA [μl]
H2O [μl]
Nanášecí pufr [μl]
1
Vzorek 1 s RNA
1
14
3
2
Vzorek 1 s RNA
3
12
3
3
Vzorek 2 s RNA
1
14
3
4
Vzorek 2 s RNA
3
12
3
5
Vzorek 1 bez RNA
1
14
3
6
Vzorek 1 bez RNA
3
12
3
7
Vzorek 2 bez RNA
1
14
3
8
Vzorek 2 bez RNA
3
12
3
4.4.5 Štěpení plasmidu pUC19 roztokem chloridem neodimitým Štěpící směs byla připravena podle Tabulky 1 a byl pozorován časový průběh štěpení v časových intervalech 0; 30; 60; a 120 min. Směs se inkubovala při teplotě 70 °C, a štěpení byla ukončena přidáním 5 μl 0,5 M EDTA. 4.4.6 Gelová elektroforéza plasmidové DNA po štěpení chloridem neodimitým Po ukončení štěpení byla provedena agarosová gelová elektroforéza. Byl připraven 1 % agarosový gel smícháním 1 g agarosy a 0,5× 99 ml TBE pufru. Suspenze bylo rozvařeno v mikrovlnné troubě do rozpuštění agarosy. Směs byla promíchána a nalita do elektroforetické vaničky s hřebínkem. Po 30 minut tuhnutí hřebínek byl odstraněn. V Eppendorfově zkumavce byla smíchána 25 μl směs plasmidové DNA a 4 μl nanášecího pufru. Směs byla nanesena do komůrky gelu a gel byl zalit TBE pufrem (0,5× koncentrovaným). Byla provedena elektroforéza při 60 V/2 hodin. Po skončení elektroforézy gel byl obarven ethidium bromidem po dobu 1 hodin. Gel byl opláchnut destilovanou vodou vyhodnocen pod UV světlem při vlnové délce λ = 305 nm.
23
5. VÝSLEDKY A DISKUSE 5.1 Kultivace buněk v médiích bez antibiotika a s antibiotikem Na Petriho miskách bez ampicilinu a s ampicilinem byly kultivovány buňky E.coli JM 109 a E.coli JM 109 (pUC19). Na základě růstu kolonií na agarových plotnách s obsahem ampicilinu byla po 24 hodinách ověřena přítomnost plasmidu v buňkách (Obrázek 7).
Obrázek 7: Kultivace E.coli JM109 pUC19 (vlevo) a E.coli JM109 (vpravo) na agarových plotnách s ampicilinem
Naočkované kultury E.coli JM 109 (pUC19) na Petriho misku vlevo obsahovaly plasmid pUC19 protože byly rezistentní na ampicilin. Naopak kultury E.coli JM 109 naočkované na Petriho misku vpravo nerostly neboť, bez plasmidu pUC19 neměly rezistenci na ampicilin. Plasmid pUC19 zabezpečí další vlastnosti kromě rezistence na antibiotikum. Obsahuje gen kódujícího β-galaktosidasu. Pokud buňka obsahuje plasmid pUC19, a jsou schopny produkovat aktivní β-galaktosidasu, rozkládají X-gal. Na půdě se zmíněným substrátem narůstají kolonie s modrým zbarvením. Buňky, které nejsou schopny rozkládat X-gal, narůstají bílé kolonie. Schopnost rozkladu X-galu byla pozorována na Petriho miskách. Kolonie vlevo měly béžově–bílou barvu, kolonie vpravo měly fialově–modré zbarvení. Kultury na pravé misce produkovaly aktivní β-galaktosidasu, která je schopna hydrolyzovat glykosidickou vazbu, a rozkládat laktosu na glukosu a galaktosu (Obrázek 8).
24
Obrázek 8: Kultivace E. coli JM109 pUC19 na půdě s obsahem X-gal
5.2 Izolace plasmidové DNA metodou alkalická lyze a srážení RNA roztokem chloridu lithného Z bakteriální kultury E.coli JM 109 (pUC19) byl izolován plasmid pUC19 pomocí alkalické lyzy, byly připraveny 2 vzorky. Pomocí gelové elektroforézy byla vizualizovaná úspěšnost izolace plasmidu (viz. Obrázek 9), a lze vidět, že kromě plasmidu ve vzorku je přítomná veliké množství RNA. Obsah RNA byla ověřena i pomocí spektrofotometrické měření koncentrace a čistoty vzorku. Výsledky měření jsou uvedeny v Tabulce 3. Z poměru A260nm/A280nm lze zísaktat informaci zda vzorek obsahuje RNA nebo proteiny. Pokud poměr je větší než 2, vzorek obsahuje RNA. Pří měření bylo zjištěno, že vzorek 1. obsahoval RNA, která byla odstraněna pomocí LiCl. Po tomto kroku byla změřena absorbance, která dosáhla poloviční hodnoty původní absorbance. Pro určení dalších znečištění byla změřena absorbance při dalších vlnových délkách. Hodnota absorbance při 230 nm dosáhla minimální hodnyty v rozmezí vlnových délek 220 – 280 nm, což znamená, že vzorek neobsahoval fenol. Proteiny mají maximum absorbance při A280nm a z poměru A260nm/A280nm lzen zjistit, zda vzorek obsahuje proteiny. Poměr musí být větší než 1,8. Z výsledků uvedených v Tabulce 3 lze usuzovat, že vzorek 1 po přečištění s LiCl nebyl pravděpodobně kontaminován proteiny. Gelová elektroforéza izolovaných vzorků (v uspořádání podle Tabulky 2) je uvedena na Obrázku 9. Intenzita zbarvení jednotlivých pásů odpovídala obsahu izolovaných nukleových kyselin (viz Tabulka 2). Pásy 1–4 jsou vzorky směsí nukleových kyselin před srážením LiCl, pásy 5–8 jsou vzorky bez RNA po jejím odstranění LiCl. V bězích 5 - 8 byla detegována pouze ccc konformace plasmidové DNA pUC19.
25
Tabulka 3: Spektrofotometrické měření koncentrace DNA a čistoty vzorku
Vzorek
Koncentrace LID FAKTOR [ng/μl]
A230nm
A260nm
A280nm
A320nm
A260nm/A280nm
1. 10
657
0,58
1,32
0,63
0,007
2,10
50
305
0,01
0,12
0,07
0,001
1,79
50
1220
0,18
0,49
0,25
0,001
1,93
50
648
0,08
0,26
0,13
0,001
1,92
s RNA 1.bez RNA 2. s RNA 2.bez RNA
Běh
Objem DNA [μl]
1
1
2
3
3
1
4
3
5
1
6
3
7
1
8
3
Obrázek 9: Gelová elektroforéza izolované plasmidové DNA pUC19
26
Běh
DNA
Obsah DNA [μl]
1
Standard λ/HindIII
1
2
kontrola (štěpení 0 min)
5
3
štěpení 30 min
5
4
štěpení 60 min
5
5
štěpení 120 min
5
6
prázdný
0
7
původní vzorek
1
8
původní vzorek
3
Obrázek 10: Gelová elektroforéza po štěpení
Izolovaná plasmidová DNA byla štěpena roztokem NdCl3 při 70 °C za dobu 0, 30, 60 a 120 minut. Jednotlivé pruhy jsou popsány na Obrázku 10 Vzorek obsahoval veliké množství RNA. Po působení štěpící směsi bylo zjištěno, že pokud vzorek nebyl přečištěn sráženám LiCl, štěpící směs snadněji štěpila RNA než DNA. I po 120 minutách štěpení nebyl pozorován pokles intenzity zbarvení ccc formy DNA pUC19. V porovnání s Obrázkem 9 (na kterém byla detegována pouze ccc forma), byly na Obrázku 10 detegovány různé konformace plasmidové DNA, které vznikly štěpením ccc formy. Nejmenší mobilitu měla oc forma, střední mobilitu měla lineární forma a nejrychleji migrovala ccc forma. Na Obrázku 10 byly dále detegovány další konformace (zřejmě Sumery) plasmidové DNA pUC19.
27
Obrázek 11: Štěpení plasmidu pUC19 roztokem NdCl3
Běh
DNA
1
Standard λHind/III
Objem DNA [μl] Běh
(štěpení 0 min)
Objem DNA [μl]
kontrola 1
6
0,5
7
štěpení 30 min
1
kontrola 2
DNA
(štěpení 0 min)
1
3
štěpení 30 min
0,5
8
štěpení 60 min
1
4
štěpení 60 min
0,5
9
štěpení 120 min
1
5
štěpení 120 min
0,5
Po přečištění vzorku roztokem LiCl byla znova připravena štěpící směs podle Tabulky 1. Vzorek plasmidové DNA byl štěpena roztokem NdCl3 při 70 °C za dobu 0, 30, 60 a 120 minut. Výsledky jsou uvedeny na Obrázku 11. Forma ccc, byla detegována pouze v kontrolních běžích 2 a 6 (čas 0 min). Již po 30 minutách působení NdCl3 byla veškerá ccc forma naštěpená, tomu odpovídal vznik intenzivně zbarvených lin a oc forem (běhy 3-5; 7-9).
28
6. ZÁVĚR V první části bakalářské práce byly zpracovány poznatky týkající se syntetických látek, které štěpí (hydrolyzují) nukleové kyseliny (DNA, RNA). Dále bylo pojednáno o experimentálních metodách používaných při sledování hydrolýzy modelové sloučeniny – plasmidové DNA. Druhá část bakalářská práce se zabývala izolací DNA pUC19 alkalickou lyzí z bakterie Escherichia coli JM109 (pU19) po kultivaci na půdě se selekčním markerem. Izolovaný vzorek byl purifikován srážením roztokem LiCl a čistota plasmidové DNA byla stanovena spektrofotometricky z poměru absorbancí A260nm/A280nm. Přečištěný vzorek DNA pUC19 byl štěpebroztokem NdCl3. Pmocí agarosové gelové elektroforézy byla při různých časech sledována účinnost štěpení plasmidové DNA.
29
SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ [1]
COX, M.M., J.A. DOUDNA a M. O'DONNELL. Molecular biology: principles and practice. New York, NY: W.H. Freeman and Co., c2012. ISBN 07-167-7998-6.
[2]
WEAVER, R.F. a P.W. HEDRICK. Genetics. 3rd ed. Dubuque, IA: Wm. C. Brown Publishers, c1997. ISBN 06-971-6000-9.
[3]
HARTWELL, L. a P.W. HEDRICK. Genetics: from genes to genomes. 5th ed. New York: McGraw-Hill, c2015. ISBN 978-1-259-09554-2.
[4]
ROSYPAL, S. Úvod do molekulární biologie. 4., (inovované) vyd. Brno: Stanislav Rosypal, 2005. ISBN 8090256252.
[5]
ALBERTS, B. Molecular biology of the cell. 4th ed. New York: Garland Science, c2002. ISBN 0815332181.
[6]
G.W. FUHS. The Nuclear Structures of Protocaryotic Organisms (Bacteria and Cyanophyceae). Vienna: Springer Vienna, 1969. ISBN 3709155894.
[7]
BLACK, J.G. a L. BLACK. Microbiology: principles and explorations. 9th edition /. Hoboken, NJ: Wiley, 2015. ISBN 1118743164.
[8]
SPICER, W.J. Clinical bacteriology, mycology and parasitology: an illustrated colour text. Ilustrace Peter Lamb. Edinburgh: Churchill Livingstone, c2000. ISBN 0443043655.
[9]
SINDEN, R.R. DNA structure and function. San Diego: Academic Press, c1994. ISBN 0126457506.
[10] RUML, T., M. RUMLOVÁ a V. PAČES. Genové inženýrství. Praha: Vysoká škola chemicko-technologická, 2002. ISBN 8070804998. [11] MENDES, G.P., P.S. VIEIRA, S. LANCEROS-MÉNDEZ, L.D. KLUSKENS a M. MOTA. Transformation of Escherichia coli JM109 using pUC19 by the Yoshida effect. Journal of Microbiological Methods [online]. 2015, 115, 1-5 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1016/j.mimet.2015.05.012. ISSN 01677012. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0167701215001517 [12] ŠPANOVÁ, A. a B. RITTICH. Analýza vybraných druhů bakterií mléčného kvašení pomocí metod molekulární biologie. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2010. ISBN 9788021440043. [13] SIKYTA, B. a J. DUŠEK. Biotechnologie pro farmaceuty: určeno pro posl. farmaceutické fak. Univ. Karlovy. Praha: Karolinum, 1992. ISBN 8070666420. [14] Obrázek: [online]. [cit. 2016-05-12]. Dostupné z: https://www.neb.com/products/n3041puc19-vector [15] LUECHAU, F., T.C. LING a A. LYDDIATT. Selective partition of plasmid DNA and RNA from crude Escherichia coli cell lysate by aqueous two-phase systems. Biochemical Engineering Journal [online]. 2011, 55(3), 230-232 [cit. 2016-0530
11]. DOI: 10.1016/j.bej.2011.04.014. ISSN 1369703x. http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1369703X11001288
Dostupné
z:
[16] GHANEM, A., R. HEALEY a F.G. ADLY. Current trends in separation of plasmid DNA vaccines: A review.Analytica Chimica Acta [online]. 2013, 760, 1-15 [cit. 201605-11]. DOI: 10.1016/j.aca.2012.11.006. ISSN 00032670. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0003267012016467 [17] ZVÁROVÁ, J. a I. MAZURA. Metody molekulární biologie a bioinformatiky. Praha: Karolinum, 2012. Biomedicínská informatika. ISBN 9788024621500. [18] Obrázek: [online]. [cit. 2016-05-12]. Dostupné z: https://www3.nd.edu/~aseriann/CHAP5B.html/sld036.htm [19] KOMIYAMA, M. SEQUENCE-SPECIFIC AND HYDROLYTIC SCISSION OF DNA AND RNA BY LANTHANIDE COMPLEX-OLIGODNA HYBRIDS. JOURNAL OF BIOCHEMISTRY. 1995, 118(4), 665-670. ISSN 0021-924X. [20] KITAMURA, Y., J. SUMAOKA a M. KOMIYAMA. Hydrolysis of DNA by cerium(IV)/EDTA complex. Tetrahedron[online]. 2003, 59(52), 10403-10408 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1016/j.tet.2003.06.005. ISSN 00404020. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0040402003016089 [21] MATSUMURA, K., M. ENDO a M. KOMIYAMA. Lanthanide complex–oligo-DNA hybrid for sequence-selective hydrolysis of RNA. J. Chem. Soc., Chem. Commun [online]. 1994, (17), 2019-2020 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1039/C39940002019. ISSN 00224936. Dostupné z: http://xlink.rsc.org/?DOI=C39940002019 [22] KOMIYAMA, M, T. INOKAWA a K. YOSHINARI. Ethylenediamine–oligo DNA hybrid as sequence-selective artificial ribonuclease. J. Chem. Soc., Chem. Commun [online]. 1995, (1), 77-78 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1039/C39950000077. ISSN 00224936. Dostupné z: http://xlink.rsc.org/?DOI=C39950000077 [23] SACHS, S., A. HELLER, S. WEISS, F. BOK a G. BERNHARD. Interaction of Eu(III) with mammalian cells: Cytotoxicity, uptake, and speciation as a function of Eu(III) concentration and nutrient composition. Toxicology in Vitro[online]. 2015, 29(7), 15551568 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1016/j.tiv.2015.06.006. ISSN 08872333. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0887233315001423 [24] ZINNA, F. a L. DI BARI. Lanthanide Circularly Polarized Luminescence: Bases and Applications. Chirality[online]. 2015, 27(1), 1-13 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1002/chir.22382. ISSN 08990042. Dostupné z: http://doi.wiley.com/10.1002/chir.22382 [25] INDAPURKAR, A., B. HENRIKSEN, J. TOLMAN a J. FLETCHER. Evaluation of Triazole-Chelated Lanthanides as Chemically Stabile Bioimaging Agents. Journal of 31
Pharmaceutical Sciences [online]. 2013, 102(8), 2589-2598 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1002/jps.23616. ISSN 00223549. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0022354915309734 [26] LIU, Y.C., Z.F. CHEN, X.Y. SONG, Y. PENG, Q.P. QIN a H. LIANG. Synthesis, crystal structure, cytotoxicity and DNA interaction of 5,7-dibromo-8-quinolinolatolanthanides. European Journal of Medicinal Chemistry[online]. 2013, 59, 168-175 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1016/j.ejmech.2012.11.001. ISSN 02235234. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0223523412006599 [27] LE, T., P. YAN, J. LIU a S. WEI. Simultaneous detection of sulfamethazine and sulfaquinoxaline using a dual-label time-resolved fluorescence immunoassay. Food Additives & Contaminants: Part A [online]. 2013, 30(7), 1264-1269 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1080/19440049.2013.801084. ISSN 19440049. Dostupné z: http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/19440049.2013.801084 [28] GUANCI, C., R. PINALLI, S. AIME, E. GIANOLIO, L. LATTUADA a G.B. GIOVENZANA. Synthesis of phosphonic analogues of AAZTA†AAZTA=6-Amino-6methylperhydro-1,4-diazepine-N,N′,N″,N″-tetraacetic acid.† and relaxometric evaluation of the corresponding Gd(III) complexes as potential MRI contrast agents. Tetrahedron Letters [online]. 2015, 56(15), 1994-1997 [cit. 2016-05-11]. DOI: 10.1016/j.tetlet.2015.02.118. ISSN 00404039. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S0040403915004116 [29] RITTICH, B., A. ŠPANOVÁ, M. FALK, M.J. BENEŠ, M. HRUBÝ. Cleavage of double stranded plasmid DNA by lanthanide complexes. Journal of Chromatography B. 2004, 800(1-2), 169-173. DOI: 10.1016/j.jchromb.2003.09.011. ISSN 15700232. Dostupné také z: http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/S1570023203007281 [30] ZOVČÁKOVÁ, M. A. ŠPANOVÁ, R. PANTŮČEK, J. DOŠKAŘ, B. RITTICH. Efficient non-enzymatic cleavage of Staphylococcus aureus plasmid DNAs mediated by neodymium ions. Analytical Biochemistry. 2016. (přijato k publikaci). [31] KRÁLOVÁ, B. Bioanalytické metody. Vyd. 3., přeprac. Praha: Vysoká škola chemickotechnologická, 2001. ISBN 9788070804490. [32] Obrázek: [online]. [cit. 2016-05-12]. Dostupné z: http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/IntroductionToPracticalBiochemistr y/ch10s06.html
32
SEZNAM ZKRATEK DNA ................................ deoxyribonukleová kyselina pUC18, pUC19, pBR322 druhy plasmidů RNA ................................. ribonukleová kyselina dsDNA ............................. dvouvláknová deoxyribonukleová kyselina ccc pDNA ........................ kovalentně uzavřená kružnicová forma plasmidové DNA oc pDNA .......................... otevřená kružnicová forma plasmidové DNA X-gal ................................ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktosid bp ..................................... páry bází AC.................................... afinitní chromatografie AEC ................................. chromatografie na měničích aniontů RP-HPLC ......................... chromatografie s obrácenými fázemi SEC .................................. gelová chromatografie (molekulová vylučovací chromatografie) HIC .................................. hydrofobní interakční chromatografie RNasa A........................... ribonukleasa A UV-VIS ............................ ultrafialová-viditelná oblast HEPES ............................. N-(2-hydroxyethyl)-piperazin-N´-2-ethansulfonová kyselina EDTA .............................. kyselina ethylendiaminotetraoctová SDS .................................. dodecylsulfát sodný Tris-báze .......................... tris(hydroxymethyl)aminomethan TE-pufr ............................ pufr s obsahem Tris-báze a EDTA TBE-pufr.......................... pufr s obsahem Tris-báze, kyseliny borité a EDTA LB médium/agar .............. Luria Bertani médium/agar GLC ................................. roztok glukosy LYZ ................................. lyzační roztok λ/HindIII .......................... deoxyribonukleová kyselina fága lambda štěpená restrikční endonukleasou HindIII
33
