VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ

VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V BRNĚ BRNO UNIVERSITY OF TECHNOLOGY

FAKULTA CHEMICKÁ ÚSTAV CHEMIE A TECHNOLOGIE OCHRANY ŽIVOTNÍHO PROSTŘEDÍ FACULTY OF CHEMISTRY INSTITUTE OF CHEMISTRY AND TECHNOLOGY OF ENVIRONMENTAL PROTECTION

VYUŽITÍ KAPALINOVÉ CHROMATOGRAFIE PRO STANOVENÍ REZIDUÍ LÉČIV THE USE OF LIQUID CHROMATOGRAPHY FOR DETERMINATION OF DRUG RESIDUES

AUTOREFERÁT DOKTORSKÉ DIZERTAČNÍ PRÁCE SUBSTANTIAL RESULTS OF DOCTORAL THESIS

BRNO 2012

ING. PETRA DVOŘÁKOVÁ

Dizertační práce byla vypracována v rámci prezenčního studia doktorského studijního programu Chemie a technologie životního prostředí na Fakultě chemické Vysokého učení technického v Brně.

Autor práce

Ing. Petra Dvořáková

Author

Vedoucí práce Supervisor

2

Prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

ABSTRAKT Předkládaná dizertační práce se zabývá problematikou výskytu reziduí léčiv v životním prostředí. Studie se zaměřuje na vypracování optimální metody pro stanovení vybraných léčiv ze vzorků odebraných z vodního ekosystému a kalů z čistíren odpadních vod. Ze skupiny léčiv byla vybrána antibiotika, která patří mezi nejčastěji užívaná léčiva. Antibiotika přítomná ve složkách životního prostředí mají jako ostatní léčiva toxický vliv na organismy v něm žijící. V případě antibiotik však dochází navíc ke vzniku rezistence. Pro studii byla konkrétně zvolena sulfonamidová antibiotika, která se používají jak v humánní tak i ve veterinární medicíně. Byly vypracovány celkem tři optimalizované postupy pro stanovení vybraných analytů ve vzorcích povrchové vody, sedimentu a kalu. V rámci optimalizace byly zkoušeny čtyři typy extrakce, a to extrakce na tuhou fází, extrakce pomocí zvýšeného tlaku, mikrovlnná extrakce a ultrazvuková extrakce. Pro finální analýzu byla použita kapalinová chromatografie s dvěma detektory detektorem diodového pole a hmotnostním spektrometrem. Optimalizované metody byly aplikovány na reálné vzorky. Povrchová voda a sediment byly odebírány na dvou řekách (Svratka a Svitava), a to celkem na 31 odběrových místech. Kal byl odebírán na čistírně odpadních vod (ČOV) Brno-Modřice po dobu osmi dnů. Pro vypracování ucelené studie byla přítomnost analytů sledována rovněž ve vzorcích rybí svaloviny. Vzorky ryb pocházely z řeky Svratky (před a za ČOV). Výskyt sulfonamidových antibiotik byl potvrzen ve vzorcích povrchové vody z řeky Svratky (µg.l-1), v sedimentu z obou sledovaných řek (µg.kg-1) a v kalu z ČOV (µg.kg-1). Ve vzorcích povrchové vody z řeky Svitavy a ve vzorcích ryb nebyla léčiva detekována, případně se jejich koncentrace nacházela pod limitem detekce.

KLÍČOVÁ SLOVA Rezidua léčiv, antibiotika, extrakce tuhou fází, extrakce za zvýšeného tlaku, mikrovlnná extrakce, ultrazvuková extrakce, kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie, povrchová voda, sediment, kal.

3

ABSTRACT This work is based on the occurrence of drug residues in the environment. This study is focused on the development and optimization methods for determination of selected drugs in the surface water, aquatic sediment and sewage sludge from waste water treatment plant. From the group of drugs were chosen antibiotics. Antibiotics presented in the environment can cause adverse effects including toxic effects, immunity disorders and indirect bioalteration effects. Sulfonamide antibiotics, which are used in the treatment of urinary and respiratory tract infections as well as in the treatment of other infectious diseases, were chosen as a target compounds. Three optimized analytical methods for determination of sulfonamide antibiotics were developed. For the optimization of extraction were tested: solid phase extraction, pressurized solvent extraction, microwave extraction and ultrasonic extraction. For the final analysis was used liquid chromatography with two detectors - diode array detector and mass spectrometer. These optimized methods were applied for the analysis of real samples. The surface water and sediment samples were collected from two Moravian rivers (the Svratka river and the Svitava river). Samples of sewage sludge were collected from waste water treatment plant Brno-Modřice. Fish samples from the Svratka river were also collected. It was observed that all the selected sulfonamide antibiotics are present in real sediment samples (µg.kg-1). Simultaneously presence of some target analytes in real surface water (µg.l-1) and in sewage sludge (µg.kg-1) samples has been confirmed. In samples of surface water from the Svitava river and in fish samples sulfonamide antibiotics were not detected or their concentrations were below the limit of detection.

KEYWORDS Drug residues, antibiotics, solid phase extraction, pressurized solvent extraction, microwave extraction, ultrasonic extraction, liquid chromatography, mass spectrometry, surface water, sediment, sewage sludge.

4

OBSAH 1. Úvod 2. Teoretická část 2.1 Antibiotika 2.1.1 Rozdělení antibiotik 2.2 Osud léčiv v organismu 2.3 Léčiva v životním prostředí 2.4 Zdroje antibiotik v životním prostředí 2.5 Metody stanovení 3. Vybrané výsledky dizertační práce 3.1 Experimentální část 3.1.1 Sledované analyty 3.1.2 Sledované matrice 3.1.3 Pracovní postupy 3.1.3.1 Odběr vzorků a jejich příprava 3.1.3.2 Extrakce 3.1.3.3 Analýza vzorků 3.2 Výsledky a diskuze 3.2.1 Účinnost metody 3.2.2 Opakovatelnost metody 3.2.3 Limity detekce a kvantifikace 3.2.4 Reálné vzorky 3.2.4.1 Povrchová voda 3.2.4.2 Sediment 3.2.4.3 Kal 3.2.5 Výskyt sulfonamidových antibiotik v životním prostředí 4. Závěr 5. Seznam použité literatury 6. Profil autora 7. Publikační činnost

6 7 7 7 7 8 9 10 12 12 12 12 13 13 14 14 15 15 16 16 17 17 18 20 22 24 26 31 33

5

1

ÚVOD

Výskyt reziduí léčiv v životním prostředí je jedním z aktuálních environmentálních problémů. Nadměrné užívání léčiv, a to jak v humánní, tak také ve veterinární medicíně, je zásadním problémem moderní společnosti. Organismus totiž dokáže využít jen malou část účinných látek obsažených ve zkonzumovaných lécích. Po požití léčiv je organismem využita pouze jejich část. Zbytek odchází v nezměněné formě, případně v podobě metabolitů ven z těla, nejčastěji spolu s fekáliemi a močí. Riziko je spojeno především s jejich nedokonalým odstraněním na čistírnách odpadních vod. Spolu s vyčištěnou vodou potom léčiva pronikají do životního prostředí. Jelikož se často jedná o látky biologicky aktivní a s nízkou biodegradabilitou, působí v životním prostředí svými negativními dopady na organismy v něm žijící. Léčiva se mohou vyskytovat téměř ve všech složkách životního prostředí (voda, půda, sedimenty, kal). Mezi nejdůležitější skupinu léčiv a zároveň také hojně užívanou patří antibiotika. Používají se k prevenci a léčbě infekčních onemocnění u lidí i zvířat. Jejich spotřeba ve světě neustále narůstá. Na rozdíl od ostatních skupin léčiv (analgetika, hormony) není u antibiotik nejzávažnějším negativním efektem jejich toxicita, ale především vznik rezistence mikroorganismů. Mezi nejsledovanější antibiotika ve složkách životního prostředí patří zejména chinolony, nitroimidazoly, sulfonamidy a beta-laktamová antibiotika. Koncentrace v povrchových vodách se pohybují v řádech ng.l-1, v sedimentech pak v ng.kg-1 a v kalech dokonce až v mg.kg-1. Předložená práce se zabývá výskytem sulfonamidových antibiotik, tj. jednou z nejstarších skupin antibiotik, ve složkách životního prostředí. Je zaměřena zejména na jejich sledování v povrchové vodě, sedimentech a v kalech z čistíren odpadních vod. Antibiotika byla z matrice (povrchová voda) extrahována a následně zakoncentrována pomocí extrakce na tuhou fází. Pro extrakci léčiv z pevných matric byly použity a ověřovány tři typy extrakce, a to extrakce ultrazvukem, mikrovlnná extrakce a extrakce za zvýšeného tlaku. Léčiva se v těchto matricích vyskytují ve velmi nízkých koncentracích, a proto byla pro analýzu zvolena vysokoúčinná kapalinová chromatografie s hmotnostním spektrometrem jako detektorem (LC/MS), která je při zjišťování přítomnosti léčiv v biotických a environmentálních matricích v současnosti jednou z nejvíce používaných analytických metod. Optimalizované metody byly následně aplikovány pro stanovení analytů v reálných vzorcích povrchové vody, sedimentu, kalu a také rybí svaloviny.

6

2

TEORETICKÁ ČÁST

2.1 ANTIBIOTIKA Antibiotika jsou jednou z nejdůležitějších a nejpoužívanějších skupin léčiv. Je známo, že antibiotika jsou buď produkována mikroorganismy, nebo uměle syntetizována. Jedná se látky, které mají schopnost inhibovat růst a množení jiných mikroorganismů [1–4]. Používají se po několik desetiletí ve velkém množství k léčbě nebo prevenci různých infekčních onemocnění [5]. Kromě svých příznivých účinků však antibiotika mají také účinky nežádoucí (toxicita, ovlivnění imunity, vznik rezistence, porucha ekologické rovnováhy bakteriální flóry) [6, 7].

2.1.1

Rozdělení antibiotik

Antibiotika jsou strukturně velmi rozmanité sloučeniny, které mohou být rozděleny do několika podskupin, jakými jsou např. sulfonamidy, makrolidy, beta-lactamová antibiotika, tetracykliny a mnoho dalších [8]. Lze je rozdělit na podkladě různých charakteristik, a to podle způsobu přípravy, dle místa účinku, podle léčebného použití, chemické struktury apod. [8, 9]. Antibiotika podle způsobu přípravy se dělí na: • Přirozená - produkovaná přímo mikroorganismy. • Semisyntetická - připravovaná ze základní molekuly přirozeného antibiotika jeho chemickou obměnou. • Syntetická - připravená chemickou syntézou [9]. Dalším důležitým rozdělením je rozlišení antibiotik dle jejich účinku: • Antibiotika bakteriostatická inhibují růst a množení mikroorganismů. Bakteriostaticky působí především ta antibiotika, která narušují proteosyntézu. • Antibiotika bakteriocidní usmrcují mikroorganismy. Mezi ně patří například látky, které ovlivňují buněčnou stěnu nebo buněčnou membránu [4, 10]. Dále můžeme antibiotika rozdělit podle místa účinku a to na celková (perorální, parenterální) a na místní (lokálně aplikovaná) [9].

2.2 OSUD LÉČIV V ORGANISMU Hlavní úlohou léčiva v organismu je doputovat z místa podání ke specifickému místu, tj. k místu, kde jsou umístěny struktury zprostředkovávající účinek dané látky. Podané látky se v organismu rozdělují do tělových oddílů (především pak do plazmy, extracelulárních a intracelulárních prostor), které jsou od sebe odděleny bariérami různě propustnými pro odlišné látky. Léčivo musí nejprve projít řadou biologických membrán, než pronikne do systémové cirkulace [1, 3, 10]. Absorpcí se léčivo dostává z místa aplikace do krevního řečiště [4, 10]. Poté, co je léčivo absorbováno, dochází k jeho distribuci, tj. k rozdělení nebo rozprostření léčiva uvnitř v organismu. Léčivo je v organismu transportováno krví, a to buď jako volné, případně navázané na plazmatické bílkoviny [6, 10, 11]. Na distribuci léčiva navazuje proces biotransformace. Během biotransformace se léčivo stává polárnější a v důsledku toho lépe vylučitelné z organismu. Rozeznáváme dva stupně biotransformace, které označujeme jako fázi I a II metabolismu látek (viz obrázek 1) [3, 10]. Posledním krokem souvisejícím s osudem léčiva v organismu je jeho exkrece. Dochází při něm k bioeliminaci léčiv a jeho metabolitů. Nejvýznamnější roli při

7

vylučování většiny léčiv mají ledviny. Dalšími významnými vylučovacími orgány jsou trávicí trakt, plíce, eventuálně se léčiva vylučují slinami, slzami, potem nebo mateřským mlékem [6, 9, 10].

Obrázek 1: Biotransformační fáze ve vztahu k možným farmakokinetickým účinkům vzniklých metabolitů [6]

2.3 LÉČIVA V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Léčiva v životním prostředí prochází cyklem, který je rozdílný pro humánní a veterinární léčiva. Do životního prostředí vstupují z nejrůznějších zdrojů. Z těchto zdrojů pak mohou pronikat do jednotlivých složek životního prostředí. Zde může, nebo také nemusí docházet k jejich eliminaci. Léčiva tak mohou přetrvávat v životním prostředí a mohou mít nejrůznější efekty na organizmy, které v něm žijí [8]. Do životního prostředí pronikají nejrůznější skupiny léčiv, mezi nejvíce sledované a stanovované skupiny léčiv patří především antibiotika, cytostatika a imunosupresivní léky, hormony, analgetika, anestetika a chlorofenoly [8, 12]. Ze skupiny antibiotik se zejména sledují, a to z důvodu nízké biodegradability, následující skupiny antibiotik: chinolony, nitroimidazoly, sulfonamidy, beta-laktamová antibiotika, a další [13, 14]. V humánní medicíně jsou nejvíce používaná beta-laktamová antibiotika; dále, makrolidová, sulfonamidová, chinolonová antibiotika tetracykliny (graf 1) [11, 15, 16]. Antibiotika se mohou vyskytovat v odpadní, povrchové, podzemní i pitné vodě, dále pak v kalu, sedimentech a půdě [8]. Výskytem antibiotik ve vodních ekosystémech se zabývá mnoho studií. Sleduje se zde především výskyt těchto antibiotik: sulfonamidy a trimethoprim [17, 18, 19, 20], makrolidy [17, 18, 20], tetracykliny [19, 20], chinoliny a fluoro-chinolony [18, 20] a betalaktamová antibiotika [20]. Koncentrace antibiotik v odpadní vodě se pohybuje v µg.l-1, v povrchové vodě jsou pak hodnoty koncentrací nižší, tj. v ng.l-1 [22, 23]. Podle výsledků publikované studie [19] nebyla antibiotika detekována v pitné vodě. Humánní i veterinární antibiotika jsou přítomna i v sedimentech, identifikována byla tato antibiotika: tetracykliny, sulfonamidy a makrolidy [24]. Koncentrace ve vodních sedimentech se pohybuje v jednotkách ng.kg-1 [11]. Mezi další složky životního prostředí, ve kterých se zjišťují antibiotika, patří kal z čistíren odpadních vod a půdy. V kalu byla například detekována sulfonamidová [25] a fluoro-chinolonová [26] antibiotika. Jak již bylo řečeno, koncentrace antibiotik v kalu se pohybuje v jednotkách µg.kg-1 [13], přičemž některá léčiva byla kvantifikována dokonce v koncentracích v mg.kg-1 [27]. V půdách se jejich koncentrace pohybuje v jednotkách µg.kg-1 [28].

8

Graf 1: Spotřeba antibiotik v počtu balení vyjádřená jako procento z celkové spotřeby v ČR za rok 2008 [16]

2.4 ZDROJE ANTIBIOTIK V ŽIVOTNÍM PROSTŘEDÍ Antibiotika vstupují do životního prostředí v důsledku jejich používání v humánní, případně ve veterinární medicíně, z akvakultury a rostlinného zemědělství; dalšími zdroji mohou být jejich výroba a vzniklé odpady [13, 17, 29]. Léčiva v humánní medicíně jsou používána jak v nemocnicích, tak i v domácnostech. Je známo, že množství antibiotik, která se každoročně spotřebují, je značné [8]. Graf 2 zobrazuje spotřebu jednotlivých skupin antibiotik v České republice v letech 2004 až 2008. Z grafu je patrné, že spotřeba antibiotik je opravdu značná (cca 350 tis. balení za rok 2008) [16]. Podle dat dodaných Evropskou federací pro zdraví zvířat v roce 1999, bylo v Evropské unii a ve Švýcarsku použito celkem 13 216 tun antibiotik; 65 % z nich bylo aplikováno v humánní medicíně [8]. Po podání léku je léčivo absorbováno organismem a prochází metabolickými reakcemi (např. hydroxylace, hydrolýza), při kterých dochází ke vzniku metabolitů léčiva. Značná část antibiotik je však z organismu vyloučena v jeho původní formě, tzn. ve formě biologicky aktivní a prostřednictvím fekálií proniká na čistírnu odpadních vod. Při procesu čištění odpadní vody nejsou léčiva zcela odstraněna a spolu s vyčištěnou vodou vstupují do povrchové vody a do sedimentů. ČOV se tak stává hlavním bodovým zdrojem vstupu antibiotik do životního prostředí [22, 28, 30–32]. Za další důležitý zdroj je považováno používání antibiotik k léčení a k prevenci nemocí ve veterinární medicíně. Jedná se především o aplikování kontaminovaného hnoje na pole. Antibiotika a jejich metabolity se následně mohou vyskytovat v půdě, v sedimentech, v povrchové, podzemní nebo dokonce i v pitné vodě [8, 13, 28, 33, 34]. Léčiva mohou být také využita jako anti-mikrobně aktivní látky pro zlepšení příjmu živin absorbovaných trávicím traktem (růstové promotory). V Evropské unii a několika dalších státech, jako je např. Švýcarsko a Švédsko, bylo toto použití zakázáno [8, 13, 14].

9

Graf 2: Spotřeba antibiotik v ČR vyjádřená počtem balení v letech 2004 – 2008 [16]

Neméně významným zdrojem, ze kterého mohou antibiotika pronikat do životního prostředí, je akvakultura. Akvakulturou se označuje hospodaření s vodními organismy, včetně ryb, měkkýšů, korýšů a vodních rostlin. Antibiotika oprávněná k používání v akvakultuře jsou oxytetracyklin, florfenicol, premix, sarafloxacin, erythromycin, nebo sulfonamidy s trimethoprimem [35]. Antibiotika se rovněž používají k ošetření ovoce, zeleniny a okrasných rostlin proti bakteriálním onemocněním. Dnes se nejvíce používá streptomycin s oxytetracyklinem. Jedná se však pouze o malý rozsah [8].

2.5 METODY STANOVENÍ LÉČIV Pro vlastní analýzu léčiv z environmentální matrice je nezbytné nejprve analyty izolovat, tzn. léčiva získat z jednotlivých složek životního prostředí (povrchová voda, sedimenty, půda, odpadní voda, kal apod.). Ze vzorkované lokality se odebere reprezentativní vzorek do vhodných vzorkovnic. Zajistí se příslušné podmínky pro přepravu vzorku do laboratoře, kde následně probíhá preanalytická úprava vzorku [36]. V případě pevných vzorků (kal, sediment, půda) po usušení, homogenizaci a přesítování následují extrakční kroky jako je Soxhletova extrakce, ultrazvuková extrakce (USE), mikrovlnná extrakce (MAE) a extrakce za zvýšeného tlaku (PSE). Získaný extrakt je následně přečištěn pomocí extrakce na tuhou fázi (SPE). Nejčastěji používané postupy pro stanovení léčiv z pevných matric jsou uvedeny na obrázku 2 [36]. V případě stanovování léčiv ve vzorcích povrchové, odpadní vody následuje po přefiltrování krok SPE a dále už jen analytická koncovka [37, 38].

10

Obrázek 2: Postup nejčastěji používaných analytických metod pro stanovení léčiv z pevných matric podle [36]

Léčiva jsou nejčastěji stanovována metodou kapalinové chromatografie (LC) [20, 21, 37-43], po derivatizaci pomocí plynové chromatografie (GC) [44-48] nebo pomocí elektromigračních metod [49-51]. Nejčastěji se používá kapalinová chromatografie v kombinaci s hmotnostní spektrometrií [20, 21, 38, 40-42], která nahradila v minulosti velmi často používanou UV detekci [37]. Začíná se také velmi rozšiřovat nová LC technologie nazývaná UPLC (nebo UHPLC, ultra performance liquid chromatography), která využívá novou generaci kolon. Tyto kolony jsou tvořené malými částicemi z hybridních materiálů (průměr 1,7 µm). Umožňují pracovat v mnohem vyšších tlacích a to až 15 000 psi. Dochází tedy ke zkrácení doby analýzy a ke zmenšení potřebných objemů mobilních fází [52]. Po úpravě vzorků derivatizací je možné použít i plynovou chromatografii, často ve spojení s hmotnostní spektrometrií (GC/MS nebo GC/MS/MS); v tomto případě se

11

sulfonamidy převádí N1-methylací na N1-methyl deriváty. Derivatizace se provádí reakcí s diazomethanem [44, 45]. Pro stanovení antibiotik se nejčastěji používá HP5-MS kolona [46-48]; dále se v literatuře jako vhodné kolony uvádí kolony HP Ultra 2 [44, 46] a HP-1 [53]. Pro stanovení sulfonamidů se používají nejen MS detektory, ale lze využít i detektor elektronového záchytu, nebo také atomový emisní detektor [44]. Pro některá léčiva je vhodné stanovení pomocí kapilární zónové elektroforézy (CZE), nejčastěji pak ve spojení s MS, MS/MS a dokonce s MS/MS/MS. I pro stanovení sulfonamidů lze využít elektromigračních metod, především kapilární zónovou elektroforézu. Při stanovení léčiv metodou CZE je výhodou snížení objemu použitých kapalin a menší počet použitých vzorků, než je tomu u LC [49-51].

3

VYBRANÉ VÝSLEDKY DIZERTAČNÍ PRÁCE

3.1

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

3.1.1

Sledované analyty

Sulfonamidy patří mezi nejdéle známá protiinfekční chemoterapeutika. Významně se uplatňují při terapii infekcí močových cest, dýchacích cest a dalších infekčních onemocněních. Používání sulfonamidů v posledních letech klesalo. Pokles byl pravděpodobně způsoben vznikem rezistence mikroorganismů vůči těmto látkám a objevem novějších antibiotik. Spektrum uplatnění sulfonamidů znovu rozšířila možnost jejich kombinace s diaminopyrimidinovými deriváty (trimethoprim). Objev zesíleného terapeutického účinku uvedené kombinace léčiv měl za následek obnovení používání sulfonamidů při léčbě vážných infekčních onemocnění. Dnes sulfonamidy patří mezi široce aplikovaná humánní a veterinární antibiotika, a to pro prevenci i pro léčbu. Výhodou sulfonamidů je jejich nízká cena a široké spektrum aktivity. V některých zemích jsou dokonce přidávány do krmiv, protože působí jako promotory růstu. Česká republika využívání léčiv jako promotorů růstu nepovoluje [7, 8, 10, 40, 54]. Ze skupiny antibiotik byla vybrána následující sulfonamidová antibiotika: sulfathiazol, sulfapyridin, sulfadiazin, sulfacetamid, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamethoxazol (obrázek 3).

Obrázek 3: Sledované analyty

3.1.2

Sledované matrice

Výskyt sulfonamidových antibiotik byl sledován v následujících matricích: povrchová voda, sediment, kal a rybí svalovina.

12

3.1.3 3.1.3.1

Pracovní postupy Odběr vzorků a jejich příprava

Vzorky povrchové vody byly odebrány celkem na dvou řekách, a to na řece Svitavě a řece Svratce. Odběr byl proveden na přelomu března a dubna roku 2011. Spolu s odběrem byl zpracován protokol o odběru, který obsahoval přesné GPS souřadnice odběrových míst (viz obrázek 4), vlastnosti vody (teplotu, pH, pach) a informace o počasí. Vzorky byly odebírány pomocí hloubkového vzorkovače. Všechny odebrané vzorky byly dopraveny v tmavých skleněných vzorkovnicích do laboratoře a zpracovány do 24 hodin. Před samotnou extrakcí byly vzorky přefiltrovány pomocí filtru ze skleněných vláken. Vzorky sedimentu byly odebrány obdobně jako vzorky povrchové vody v říjnu 2011. Celkem bylo odebráno 31 vzorků sedimentů, které byly v plastových vzorkovnicích dopraveny do laboratoře. Při laboratorní teplotě byly vysušeny a byla u nich gravimetricky stanovena sušina. Před extrakcí byly vzorky sedimentu rozdrceny v třecí misce s tloučkem a přesítovány pomocí sít o velkosti ok 0,6 cm. Vzorky kalu pocházely z ČOV Brno-Modřice a byly odebrány příslušným pracovníkem ČOV v období od 5. 3. do 14. 3. 2012, vždy v 7:00 hodin ráno. Jednalo se o vysušený kal bez úpravy vápnem. V případě potřeby byl kal tloučkem rozdrcen v třecí misce. Po přesítování přes síto o velikosti ok 0,6 mm, byly vzorky připraveny pro extrakci. Pracovalo se i se vzorky ryb. Ryby (Jelec tloušť) byly odloveny odbornými pracovníky Povodí Moravy, kteří jsou na tuto činnost akreditováni; pocházely z řeky Svratky před a za ČOV BrnoModřice.

Obrázek 4: Místa odběru povrchové vody a sedimentu z řek Svitavy a Svratky

13

3.1.3.2

Extrakce

Vzorky povrchové vody byly zkoncentrovány a přečištěny pomocí SPE metody. Kolony ENVI– 18 SPE Tubes s obsahem sorbentu 1 g byly určeny jako nejvhodnější. Optimální množství vzorku bylo stanoveno na 300 ml, nebylo upravováno pH vzorku. Metoda SPE byla použita i pro přečištění extraktu získaného z pevných matric; zde byla aplikována stejná metoda, avšak jiná kolona s menším objemem sorbentu. Jednotlivé kroky SPE jsou uvedeny v tabulce 1. Tabulka 1: Optimální podmínky SPE metody pro vzorky povrchové vody, extrakty sedimentu a kalu

Optimální podmínky SPE metody Kondicionace kolonky: 2 ml 0,1 M kyseliny mravenčí v methanolu 2 ml 5% methanolu Aplikace vzorku: 300 ml povrchová voda, 5 ml extrakt Sušení proudem vzduchu: 5 minut Promytí sorbentu: 2 ml 5% methanolu Eluce analytu: 4 ml 0,1 M kyseliny mravenčí v methanolu Zahuštění pod dusíkem na 0,5 ml. Pro pevné matrice (sediment, kal, rybí svalovina) byly ověřovány celkem tři extrakční metody, a to zrychlená extrakce rozpouštědlem, mikrovlnná extrakce a extrakce ultrazvukem. Jako první byly pro všechny tři matrice stanoveny optimální podmínky metody PSE, následně byla ověřena MAE pro sediment a kal a na závěr byl sediment extrahován pomocí USE. Účinnosti metod byly prověřeny na základě výpočtu výtěžnosti léčiv. Nejvyšších výtěžností u všech sledovaných matric bylo dosaženo pomocí PSE metody. Podmínky, které byly stanoveny jako optimální, jsou uvedeny v tabulce 2. Tabulka 2: Optimální podmínky pro extrakci sulfonamidů ze vzorků sedimentu, kalu a rybí svaloviny

Optimální podmínky PSE metody Tlak Teplota Extrakční činidlo Množství vzorku Počet cyklů Doba statické fáze Proplach rozpouštědlem

3.1.3.3

sediment 6 MPa 40 °C

kal 14 MPa 40 °C Methanol 15 g 2 7 min 2 min

ryby 12 MPa 40 °C

Analýza vzorků

Analýza reálných vzorků a standardů léčiv byla provedena pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Celkem byly použity dva typy detektorů: detektor diodového pole a hmotnostní spektrometr. Vlnová délka detekce pro DAD detektor byla 270 nm. Pro hmotnostní detektor (iontová past, elektrosprej) byly nastaveny následující podmínky: tlak zmlžovače 20 psi; průtok sušícího plynu 10 L/min; teplota sušícího plynu 350 °C; napětí na kapiláře 3500 V; pozitivní ionizační mód; rozsah skenovaných hmot 100 – 500 m/z; cílová hmota 250 m/z.

14

Pro separaci antibiotik byla použita kolona ZORBAX Eclipse XDB-C18 (2,1 x 150 mm; 3,5 µm velikost částic). Později byla nahrazena kolonou ZORBAX Eclipse XDB-C8 (2,1 x 150 mm; 3,5 µm velikost částic). Jako mobilní fáze byla vybrána 0,01 M kyselina mravenčí (A) a methanol (B). Průtok mobilní fáze byl 0,15 ml/min pro kolonu C18, 0,2 ml/min pro kolonu C8. Gradient mobilní fáze v čase byl na začátku zvolen 70 % A a 30 % B; v čase 3 minuty se snížil průtok A na 60 % a zvýšil se průtok B na 40 %; v čase 6 minut se průtok A snížil až na 20 % a zvýšil se průtok B na 80 %. Teplota kolony byla 20 °C. Celková doba analýzy byla za těchto zvolených podmínek 20 (kolona C8) - 25 (kolona C18) minut. V tabulce 3 jsou uvedeny retenční časy a charakteristické m/z jednotlivých léčiv. Tato data sloužila pro identifikaci a kvantifikaci jednotlivých analytů. Tabulka 3: Analytická data pro LC/MS

Léčivo

Retenční čas (min) Kolona C18

Kolona C8

Charakteristické m/z

3,6 4,4 4,6 5,1 5,9 8,4 11,5 4,4 11,4 13,1

3,3 3,6 4,2 4,6 4,9 6,6 9,3 3,9 9,2 11,2

215 251 256 250 265 279 254 258 256 298

Sulfacetamid Sulfadiazin Sulfathiazol Sulfapyridin Sulfamerazin Sulfamethazin Sulfamethoxazol Sulfathiazol-d4 Sulfamethoxazol-d4 N-Acetyl sulfamethoxazol-d4

3.2 VÝSLEDKY A DISKUZE Celkem byly navrženy tři metody pro stanovení sulfonamidů z povrchové vody, sedimentu a kalu. Metody se lišily především krokem extrakce, který byl u každé matrice odlišný. Vlastní stanovení pomocí kapalinové chromatografie probíhalo za stejných podmínek. Pouze pro vzorky povrchové vody byla použita kolona ZORBAX Eclipse XDB-C18 a pro ostatní vzorky (sediment, kal, rybí svalovina) kolona ZORBAX Eclipse XDB-C8.

3.2.1

Účinnost metody

Účinnosti jednotlivých navržených metod jsou uvedeny v tabulce 4. Byly stanoveny pomocí výpočtu výtěžností antibiotik v jednotlivých matricích. V případě povrchové vody bylo do destilované vody o objemu 300 ml přidáno 200 ng od každého léčiva; vzorek byl podroben SPE za optimálních podmínek. U vzorků sedimentů bylo přidáno vždy 200 ng každého léčiva do přečištěného vzorku sedimentu, který byl následně extrahován PSE za optimálních podmínek. Se vzorky kalu se postupovalo obdobně jako se vzorky sedimentu. Pouze po odpaření extraktu a přečištění na SPE koloně byl do vzorku přidán přídavek standardu o koncentraci 300 ng.ml-1. Přídavek standardu byl použit proto, jelikož kal je svým obsahem velice složitá matrice a nebylo možné identifikovat léčiva přímo.

15

Pro povrchovou vodu měla metoda účinnost od 35 – 94 % v závislosti na léčivu. Získané hodnoty jsou obdobné jako údaje uváděné v jiných studií (55 – 100 % [55], 34 – 90 % [41]), kde se používaly C18 SPE kolony. Účinnost metody se pro vzorky sedimentu pohybovala mezi 53 – 73 % a pro vzorky kalu mezi 52 – 80 %, což je srovnatelné s výsledky prezentovanými v literatuře. Studie, ve kterých jako krok extrakce byla také použita extrakce za zvýšeného tlaku, uvádí účinnost metody 55 – 100 % [56], 74 – 87 % [27] a 39 – 67 % [57] v závislosti na léčivu. Tabulka 4: Účinnost metody pro jednotlivé analyty

léčiva

Účinnost metody (n=10) (%) Povrchová Sediment Kal voda sulfacetamid 68,0 52,9 52,3 sulfadiazin 35,4 65,2 56,5 sulfathiazol 44,0 60,2 79,8 sulfapyridin 92,6 63,6 63,7 sulfamerazin 89,6 61,5 57,3 sulfamethazin 93,8 73,1 64,8 sulfamethoxazol 81,5 70,0 72,6

3.2.2

Opakovatelnost metody

Byla stanovena opakovatelnost metody, která byla vyjádřena pomocí relativní směrodatné odchylky dle rovnice (1): S (1) S r = ⋅ 100 % x S je směrodatná odchylka; x je průměrná hodnota. Získané hodnoty jsou uvedeny v tabulce 5. Pro povrchovou vodu se pohybovaly od 1,3 do 7,3 %; pro vzorky sedimentu mezi 4,5 – 7,4 a pro vzorky kalu od 5,2 do 14,3 %. Tabulka 5: Opakovatelnost metody pro jednotlivé analyty

léčiva

RSD (n=10) (%)

Povrchová Sediment voda sulfacetamid 1,6 5,4 sulfadiazin 4,9 6,6 sulfathiazol 7,3 6,7 sulfapyridin 3,7 4,5 sulfamerazin 1,5 5,9 sulfamethazin 1,6 6,3 sulfamethoxazol 1,3 7,4

16

Kal 14,3 12,1 5,2 12,0 8,9 10,8 9,4

3.2.3

Limity detekce a kvantifikace

Byly určeny meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ) pro jednotlivá léčiva dle vzorců (2) a (3); c je nejnižší koncentrace analytu, která byla stanovena; A je plocha píku analytu při nejnižší koncentraci a AS je průměrná plocha píku šumu odečteného po celé délce chromatogramu. LOD = 3.

c ( A / As )

(2)

c ( A / As ) Limity a koeficienty determinace pro jednotlivé analyty jsou uvedeny v tabulce 6. LOQ = 10.

(3)

Tabulka 6: Koeficient determinace, LOD, LOQ

Povrchová voda LOQ LOD léčiva R2 -1 (µg.l ) (µg.l-1) sulfacetamid 0,9961 2,55 8,50 sulfadiazin 0,9999 1,09 3,64 sulfathiazol 0,9994 1,79 5,98 sulfapyridin 0,9964 0,72 2,41 sulfamerazin 0,9986 0,92 3,06 sulfamethazin 0,9997 0,76 2,52 sulfamethoxazol 0,9998 0,24 0,81

3.2.4

R2 0,9989 0,9988 0,9991 0,9990 0,9998 0,9994 0,9995

Sediment LOD LOQ (ng.kg-1) (ng.kg-1) 390 1300 70,8 236 97,9 326 54,4 181 47,9 160 29,9 100 50,9 170

Kal LOD (ng.kg-1) 627,3 114,0 157,7 87,53 77,06 48,07 82,02

LOQ (ng.kg-1) 2090 379,8 525,6 291,8 256,9 160,2 273,4

Reálné vzorky

Reálnými vzorky byly zvoleny následující matrice: povrchová voda a sediment z řek Svitavy, Svratky a vysušený kal z ČOV Brno-Modřice. Reálné vzorky byly stanoveny pomocí výše uvedených optimalizovaných metod. Odběr povrchové vody byl proveden na jaře roku 2011. Vzorky sedimentu byly odebrány na podzim roku 2011. Reálné vzorky kalu byly odebírány v březnu roku 2012. Kromě již jmenovaných matric byla také sledována přítomnost sulfonamidů také v rybí svalovině. Jednalo se o vzorky ryb (Jelec tloušť) z řeky Svratky, odlovené na podzim roku 2011, před a za ČOV Brno-Modřice. V reálných vzorcích ryb však nebyla žádná ze sledovaných antibiotik identifikována. Reálné vzorky byly vyhodnoceny na základě externí kalibrace. Kalibrace byla provedena zvlášť pro vzorky povrchových vod na chromatografické koloně C18 a zvlášť pro vzorky sedimentu, kalu a ryb na chromatografické koloně C8.

3.2.4.1

Povrchová voda

Vzorky povrchové vody byly odebírány po celé délce řeky Svratky a Svitavy, vždy před a za městem.Vzorky byly dopraveny do laboratoře ve tmavých vzorkovnicích a byly ihned zpracovány. Z celkového počtu devatenácti vzorků povrchové vody z řeky Svratky byl na pěti odběrových místech zaznamenán výskyt sulfonamidových antibiotik, a to v jednotkách µg.l-1. Konkrétně se jednalo o vzorky odebrané před městem Štěpánov, Veverská Bítýška, v městské části BrnoJundrov a před ČOV v Brno-Modřice. Přítomnost sulfonamidů byla zjištěna i na některých dalších

17

lokalitách, avšak jejich koncentrace se pohybovaly pod mezí kvantifikace. V žádné z dvanácti odebraných lokalit na řece Svitavě nebyla stanovena žádná sulfonamidová antibiotika. Pouze ve třech lokalitách se některá ze sledovaných léčiv objevila v koncentracích pod limitem kvantifikace. Jednalo se o odběrové místo před městem Svitavy, před a za obcí Březová nad Svitavou. V zahraniční literatuře se ze skupiny sulfonamidových antibiotik nejčastěji zjišťuje sulfamethoxazol, v některých studiích také sulfamethazin a sulfathiazol (tabulka 7). Ve studii pocházející z Austrálie bylo uvedeno, že koncentrace sulfamethoxazolu v povrchové vodě dosahovaly hodnot až 2000 ng.l-1. Ve studiích z USA byly koncentrace sulfamethoxazolu až na úrovni 1900 ng.l-1. Evropské studie z Lucemburska, Německa a Švýcarska publikovaly hodnoty v rozmezí 50 – 80 ng.l-1. Hodnoty naměřené v rámci této studie jsou v porovnání s jinými evropskými studiemi vyšší. Spíše se přibližují hodnotám zjištěným v USA a Austrálii. Tabulka 7: Sulfonamidová antibiotika v reálných vzorcích povrchové vody

Antibiotikum Sulfonamidy Sulfamethoxazol Sulfamethoxazol Sulfonamidy Sulfamethazin Sulfamethoxazol Sulfamethoxazol Sulfamethoxazol Sulfamethoxazol Sulfathiazol

3.2.4.2

Koncentrace (ng.l-1) 820 – 3780 až 480 až 52 až 80 54 8 – 2000 až 1900 až 450 až 1000 až 80

Země

Lit. zdroj

ČR Německo Německo Lucembursko Švýcarsko Austrálie USA USA

Dizertace [17] [18] [58] [59] [19] [60] [61]

USA

[62]

Sediment

Celkem bylo odebráno 31 vzorků sedimentu z řek Svratky a Svitavy. Vzorky byly po převezení do laboratoře vysušeny při laboratorní teplotě. Byla u nich gravimetricky stanovena sušina. Následně byly vzorky sedimentů přesítovány pomocí sít o velikosti ok 0,6 cm. Ihned po jejich vysušení a přípravě byly vzorky extrahovány pomocí optimalizované metody. Výskyt léčiv v sedimentech v obou řekách Svratce i Svitavě byl častý. Hodnoty koncentrací se pohybovaly v závislosti na místu odběru a léčivu v desetinách až jednotkách µg.kg-1 sušiny. V sedimentu se nejčastěji vyskytoval sulfapyridin a sulfamerazin, které byly stanoveny celkem ve 22 vzorcích z celkového počtu 31 odebraných vzorků. Naopak nejméně často byla ve vzorcích sedimentu přítomna léčiva sulfacetamid (10 vzorků), sulfamethazin (11 vzorků). V grafech 3 a 4 jsou zobrazeny hladiny sulfonamidových antibiotik. Lze z nich vyčíst celkovou kontaminaci vzorku sulfonamidovými antibiotiky. Z grafů je patrné, která léčiva se v jednotlivých odběrových lokalitách vyskytovala. Vzorek odebraný před vodní nádrží Vír byl nejvíce kontaminovaným vzorkem z řeky Svratky. U vzorků z řeky Svitavy byla nejvyšší koncentrace sulfonamidů stanovena ve vzorku za městem Blansko.

18

Graf 3: Hladiny sulfonamidových antibiotik ve vzorcích sedimentu z řeky Svratky vyjádřené jako celková kontaminace

19

Graf 4: Hladiny sulfonamidů ve vzorcích sedimentu z řeky Svitavy vyjádřené jako celková kontaminace

3.2.4.3

Kal

Reálné vzorky kalu byly odebírány v období 5. 3. – 14. 3. 2012. Jednalo se o vzorky vysušeného kalu bez úpravy vápnem. Vzorky byly vždy odebrány v 7:00 hodin příslušnými pracovníky ČOV. Následně byly přepraveny do laboratoře a ihned zpracovány podle optimalizované metody. V grafu 5 jsou znázorněny hladiny koncentrací jednotlivých sulfonamidových antibiotik ve vzorcích kalu vyjádřené celkovou kontaminací. Z grafu je také patrné, že ve vzorcích kalu byla stanovena pouze tři ze sedmi sledovaných sulfonamidových antibiotik, a to sulfacetamid, sulfadiazin a sulfathiazol. Koncentrace sulfacetamidu se pohybovaly v rozmezí 5,3 – 16,5 µg.kg-1; koncentrace sulfadiazinu byly v rozmezí 2,6 – 6,8 µg.kg-1 a koncentrace sulfathiazolu dosahovala hodnoty až 8,8 µg.kg-1. V zahraniční literatuře (tabulka 8) byla ve vzorcích kalu detekována především léčiva sulfamethoxazol a sulfapyridin [23, 25]. Koncentrace se pohybovaly od desetin [57] přes desítky [23] až po stovky [25] µg.kg-1 sušiny. Toto široké rozpětí může být způsobeno různorodostí kalu, protože kal je velmi složitá a komplikovaná matrice. Koncentrace získané v rámci této studie se nejvíce přibližují hodnotám publikovaným ze Španělska [23]; Radjenović aj. používali k izolaci analytů extrakci za zvýšeného tlaku; jako extrakční činidlo použili methanol.

20

Graf 5: Hladiny sulfonamidových antibiotik ve vzorcích kalu z ČOV Brno-Modřice vyjádřené jako celková kontaminace Tabulka 8: Sulfonamidová antibiotika v kalech

Antibiotikum Sulfonamidy Sulfadiazin Sulfapyridin Sulfathiazol Sulfamethoxazol Sulfonamidy Sulfamethoxazol Sulfamethoxazol Sulfapyridin

Koncentrace (µg.kg-1)(d.w.) 0,89 – 16,5

Země

Lit. zdroj

ČR

Dizertace

< LOQ

Španělsko

[27]

0,1 – 0,23 0,6 – 21 34 – 113 24 – 197

Španělsko Španělsko Švýcarsko Německo

[57] [23] [25]

21

3.2.5

Výskyt sulfonamidových antibiotik v životním prostředí

Ve vzorcích povrchové vody byla zjištěna přítomnost čtyř ze sedmi sledovaných léčiv, a to sulfapyridinu, sulfamerazinu, sulfamethazinu a sulfamethoxazolu. Ostatní léčiva nebyla detekována, případně se jejich koncentrace vyskytovaly pod limitem kvantifikace. U vzorků kalu byla situace odlišná. Ve vzorcích byla detekována jen tři léčiva, a to sulfacetamid, sulfadiazin a sulfathiazol. Na základě výsledků získaných při zpracování této studie by se mohly sledované analyty rozdělit do dvou skupin, a to na skupinu léčiv, která se pravděpodobně budou vázat na kal, a proto budou efektivněji zachycována v průběhu čistírenského procesu (sulfacetamid, sulfadiazin a sulfathiazol) a na skupinu léčiv, která budou z větší části setrvávat ve vyčištěné odpadní vodě a budou dále přecházet do vodního ekosystému (sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin a sulfamethoxazol). Protože ve vzorcích sedimentu byla detekována všechna sledovaná léčiva, lze se domnívat, že v sedimentech dochází pravděpodobně k zakoncentrování analytů. Situace je názorně zobrazena na grafu 6, kde jsou uvedeny maximální hodnoty koncentrací jednotlivých sulfonamidů v reálných vzorcích povrchové vody, sedimentu a kalu.

Graf 6: Maximální hodnoty koncentrací sulfonamidových antibiotik stanovené v reálných vzorcích

Tabulka 9 přehledně shrnuje výsledky získané v rámci této dizertační práce. Hodnoty jsou doplněny o nejnovější data (2010) získaná v dizertační práci (Lisá, 2011), kde se autorka mimo jiné zabývala také výskytem vybraných sulfonamidových antibiotik v odpadní vodě odebrané z ČOV Brno-Modřice. Výsledky získané v rámci jedné studie prokázaly [160], že se na přítoku na ČOV běžně sulfonamidová antibiotika vyskytují, a to v koncentracích 3,56 - 26,09 µg.l-1. Přesto nebyla na odtoku z ČOV již většina sledovaných léčiv přítomna; byl detekován pouze sulfapyridin v koncentracích 4,95 - 5,25 µg.l-1. Na podkladě ve studii prezentovaných výsledků lze konstatovat, že výše zmíněná ČOV je sice zdrojem kontaminace, avšak koncentrace sulfonamidů v odtokové vodě jsou velmi nízké a pohybují se vesměs pod limitem detekce.

22

Výsledky získané analýzou reálných vzorků povrchové vody a sedimentu, které byly odebrány před a za ČOV Brno-Modřice mohou potvrdit, že tato ČOV není hlavním zdrojem kontaminace vodního ekosystému sulfonamidovými antibiotiky. Zdroji, které mohou být zodpovědné za přítomnost sulfonamidů ve vodním ekosystému, mohou být např. nemocnice, zemědělská hospodářství, odpady, domácnosti. Proto je nezbytné k antibiotikům jako takovým přistupovat zodpovědně a zbytečně je do životního prostředí nevnášet. Tabulka 9: Sulfonamidová antibiotika v životním prostředí ČR

Matrice

Povrch. voda -1

Sediment

Odpadní voda [160]

Kal -1

(µg.l-1)

-1

Léčivo

(µg.l )

(µg.(d.w.)kg )

(µg.(d.w.)kg )

Sulfacetamid Sulfadiazin Sulfathiazol Sulfapyridin Sulfamerazin Sulfamethazin Sulfamethoxazol


1,35 - 4,14 0,34 - 1,28 0,39 - 5,50 0,20 - 7,30 0,30 - 2,81 0,15 - 1,65 0,17 - 2,93

5,30 - 16,49 2,62 - 6,77 0,89 - 8,77 ND ND ND ND

Přítok -

Odtok -

3,56 - 6,98

< LOD

4,93 - 7,63 < LOD 5,45 - 7,29 8,37 - 26,09

4,95 - 5,25 < LOD < LOD < LOD

23

4

ZÁVĚR

Cílem předložené dizertační práce bylo vypracovat optimalizovanou metodu pro stanovení vybraných antibiotik z kapalných a pevných matric. Jako klíčové analyty byla vybrána sulfonamidová antibiotika, která se používají v humánní i ve veterinární medicíně. Hlavní analyzovanou matricí byla povrchová voda, sediment a kal. Na základě provedených optimalizací byly zpracovány celkem tři metody pro stanovení sulfonamidových antibiotik v různých matricích. Navržené metody se převážně liší metodou extrakce, vlastní analýza vždy probíhala pomocí LC/MS. Analytická metoda pro stanovení sulfonamidů v povrchových vodách je založena na SPE metodě, vhodné pro izolaci analytů z matrice. Vybrány byly SPE kolony ENVI C18 s obsahem sorbentu 1 g, u kterých byly prokázány nejvyšší výtěžnosti pro hodnocená léčiva. Optimální objem povrchové vody byl 300 ml, pracovní postup nepředpokládal úpravu pH vzorku. Účinnost metody se při těchto podmínkách pohybovala v rozmezí 68 – 94 %. Nižší účinnost byla prokázána u sulfadiazinu (35 %) a sulfathiazolu (44 %). Opakovatelnost metody se pohybovala, a to v závislosti na analyzovaném léčivu, od 1 do 7 %. Koeficient determinace byl vždy vyšší než 0,996. Limity detekce se pohybovaly v rozmezí 0,2 – 2,6 µg.l-1 a limity kvantifikace v rozmezí 0,8 – 8,5 µg.l-1. Pro vzorky sedimentu byla metoda izolace analytů složena z extrakce pomocí PSE a přečištění extraktu pomocí SPE. Při PSE metodě byl použit jako extrakční rozpouštědlo methanol, optimální teplota byla 40 °C a optimální tlak 6 MPa. Přečištění extraktu probíhalo na SPE kolonách ENVI C18 s obsahem sorbentu 0,5 g. Účinnost zvolené metody se pohybovala v závislosti na typu léčiva mezi 53 – 73 %. Opakovatelnost metody byla v rozmezí 5 – 7 %, podle druhu analytu. Koeficient determinace byl vždy vyšší než 0,998. Limity detekce se pohybovaly od 30 do 390 ng.kg-1 a limity kvantifikace od 100 do 1300 ng.kg-1. Pro vzorky kalu byla extrakce založena na PSE metodě a přečištění probíhalo rovněž pomocí SPE. Optimální teplota při PSE byla 40 °C a optimální tlak 14 MPa. Jako extrakční činidlo byl použit methanol. Účinnost metody se pohybovala v závislosti na léčivu mezi 52 – 80 %, opakovatelnost metody byla 5 – 14 % a koeficient determinace byl vždy vyšší než 0,998. Limity detekce byly v rozmezí 48 – 627 ng.kg-1 a limity kvantifikace v rozmezí 160 – 2090 ng.kg-1 Vypracované a optimalizované metody byly následně použity pro stanovení sulfonamidových antibiotik detekovaných v reálných vzorcích povrchové vody, sedimentu a čistírenského kalu. Aby byla studie komplexní, byla studie rozšířena o další matrici, kterou byla rybí svalovina. V případě vzorků povrchové vody a sedimentu bylo odebráno celkem 31 vzorků, a to po celé délce řek Svitavy a Svratky, a proto lze předkládanou studii posuzovat jako monitoring vodního ekosystému těchto řek. Kal byl odebírán z ČOV Brno-Modřice, po dobu osmi dní. Vzorky ryb byly odloveny pracovníky Povodí Moravy, kteří jsou pro tuto činnost akreditováni, přičemž pro odlov byla vybrána místa před a za ČOV Brno-Modřice. Ve vzorcích povrchové vody z řeky Svratky byla na některých ze sledovaných lokalit detekována některá sulfonamidová antibiotika (sulfapyridin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamethoxazol), v koncentracích 0,82 – 3,78 µg.l-1. Nejčastěji se sledované analyty vyskytovaly v okolí Brna, konkrétně v lokalitě Brno-Jundrov. Na toku řeky Svitavy nebyla žádna ze sledovaných léčiv detekována a identifikována. Byla prokázána přítomnost všech sledovaných léčiv ve vzorcích sedimentu v koncentracích

24

v řádech desetin až jednotek µg.kg-1, v závislosti na konkrétním léčivu a místu odběru. Nejčastěji se ve vzorcích vyskytoval sulfapyridin a sulfamerazin. Naopak nejméně byl identifikován sulfacetamid a sulfamethazin. Ve vzorcích kalu byla prokázána přítomnost celkem tří léčiv z této skupiny antibiotik, a to sulfacetamidu, sulfadiazinu a sulfathiazolu. Koncentrace se pohybovaly v rozmezí 0,89 – 16,5 µg.kg-1. Ve vzorcích rybí tkáně nebyla sulfonamidová antibiotika detekována. Výsledky ucelené komplexní studie zaměřené na vodní ekosystém prokázaly nezbytnost sledování úrovně kontaminace také u jiných léčiv, například makrolidových antibiotik a cytostatik.

25

5

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

[1] Hampl, F., Paleček, J.: Farmakochemie. 1. vyd. Praha: VŠCHT Praha, 2002. 413 s. ISBN 807080-495-5. [2] Hejzlar, M.: Antibiotika v praxi. 2. přepracované vyd. Praha: Markopulos, 1995. 499 s. ISBN 80-901776-4-6. [3] Hynie, S.: Farmakologie v kostce. 2. přepracované vyd. Praha: Triton, 2001. 520 s. ISBN 807254-181-1. [4] Lüllmann, H., Mohr, K., Wehling, M.: Farmakologie a toxikologie. 2. vyd. Praha: Grada Publishing, 2004. 725 s. ISBN 80-247-0836-1. [5] Kümmerer, K.: Antibiotics in the aquatic environment – A review – Part II. Chemosphere. 2009, vol. 75, pp. 435 – 441. [6] Květina, J., Herink, J., Vopršalová, M.: Základy farmakologie 1.díl: Obecná farmako-logie. 1. vyd. Brno: Veterinární a farmaceutická universita Brno, 1999. 135 s. ISBN 80-85114-44-5. [7] Lochmann, O.: Nežádoucí účinky antiinfekčních léčiv. 1. vyd Praha: Triton, 2008. 243 s. ISBN 978-80-7387-073-7. [8] Kümmerer, K.: Antibiotics in the aquatic environment – A review – Part I. Chemosphere. 2009, vol. 75, p. 417 – 434. [9] Lochmann, O.: Antimikrobní terapie v praxi. 1. vyd. Praha: Triton, 2006. 204 s. ISBN 807254-826-3. [10] Tisoňová, J., Kriška, M., a kol.: Základy farmakologie: pre nelekárské študijné odbory. 1. vyd. Bratislava: Vydavateĺstvo UK, 2007. 292 s. ISBN 978-80-223-2279-9. [11] Zuccato, E., Calamari, D., Natangelo, M., Fanelli, R.: Presence of therapeutic drugs in the environment. The Lancet. 11A001, vol. 355, pp. 1789 – 1790. [12] Le-Minh, N., Khan, S. J., Drewes, J. E., Stuetz, R. M.: Fate of antibiotics during municipal water recycling treatment processes. Water Research. 2010, pp. 1 – 29. [13] Jørgensen, S. E., Halling-Sørensen, B.: Drugs in the environment. Chemosphere. 2000, vol. 40, is. 7, pp. 691 – 699. [14] Kummerer K.: Drugs in the environment: emission of drugs, diagnostic aids and disinfectants into wastewater by hospitals in relation to other sources – a review. Chemosphere. 2001, vol. 45, pp. 957 – 969. [15] Cars, O., Mölstadt, S., Melander, A.: Variation in antibiotic use in the European Union. The Lancet. 2001, vol. 357, pp. 1851 – 1853. [16] Hofmanová, G.: Trendy ve spotřebě antibiotik v ČR. Vysoká škola ekonomická v Praze, 2010. diplomová práce.

26

[17] Hirsh, R., Ternem, T., Haberer, K., Kratz, K.: Occurrence of antibiotics in the aquatic environment. The Science of the Total Environment. 1999, vol. 225, is. 1-2, pp. 109 – 118. [18] Christian, T., Schneider, R. J., Färber, et al.: Determination of antibiotic residues in manure, soil, and surface waters. Acta Hydroch. Hydrob. 2003, vol. 407, pp. 36 – 44. [19] Watkinson, A. J., Murby, E. J., Kolpin, D. W., Costanzo, S. D.: The occurrence of antibiotics in an urban watershed. From wastewater to drinking water. Science of the Total Environment. 2009, vol. 36, pp. 2711 – 2723. [20] Li, B., Zhang, T., Xu, Z. Y., Fang, H. H. P.: Rapid analysis of 21 antibiotics of multiple classes in municipal wastewater using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 2009. vol. 645, pp. 64 – 72. [21] Xiao, Y., Chang, H., Jia, A., Hu, J. Y.: Trace analysis of quinolone and fluoroquinolone antibiotics from wastewaters by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2008, vol 1214, pp. 100 – 108. [22] Hernando, M. D., Mezcua, M., Fernández-Alba, A. R:, Barceló, D.: Environmental risk assessment of pharmaceutical residues in wastewater effluents, surface waters and sediments. Talanta. 2005, vol. 69, pp. 334 – 342. [23] Radjenović, J., Petrović, M., Barceló, D.: Fate and distribution of pharmaceuticals in wastewater and sewage sludge of the conventional activated sludge (CAS) and advanced membrane bioreactor (MBR) treatment. Water Research. 2009, vol. 43, pp. 831 – 841. [24] Kim, S. C., Carlson, K.: Temporal and spatial trends in the occurrence of human and veterinary antibiotics in aqueous and river sediment matrices. Environmental Science Technology. 2007, vol. 41, pp. 50 – 57. [25] Göbel, A., Thomsen, A., McArdell, Ch. S., Alder, A. C., Giger, W., Theiss, N., Löffler, D., Ternem, T. A..: Extraction and determination of sulfonamides, macrolides, and trimethoprim in sewage sludge. Journal of Chromatography A. 2005, vol. 1085, pp. 179 – 189. [26] Golet, E. M., Strehler, A., Alder, A.C., Giger, W.: Determination of fluoroquinolone antibacterial agents in sewage sludge and sludge-treated soil using accelerated solvent extraction followed by solid-phase extraction. Analytical Chemistry. 2002. vol. 74, pp. 5455 – 5462. [27] Nieto, A., Borrull, F., Marcé, R. M., Pocurull, E.: Selective extraction of sulfonamides, macrolides and other pharmaceuticals from sewage sludge by pressurized liquid extraction. Journal of Chromatography A. 2007, vol. 1174, pp. 125 – 131. [28] Stoob, K., Winter, H. P., Stettler, S., Hartmann, N., Mueller, S. R., Stamm, Ch. H..: Exhaustive extraction of sulfonamide antibiotics from aged agricultural soils using pressurized liquid extraction, Journal of Chromatography A. 2006, vol. 1128, pp. 1 – 9. [29] Petrović, M., Hernando, M. D., Díaz-Cruz, M. S., Barceló, D.: Liquid chromatography– tandem mass spectrometry for the analysis of pharmaceutical residues in environmental samples: a review. Journal of Chromatography A. 2005, vol. 1067, pp. 1 – 14.

27

[30] Yang, S., Carlson, K.: Evolution of antibiotic occurrence in a river through pristine, urban and agricultural landscapes. Water Research. 2003, vol. 37, is. 19, pp. 4645 – 4656. [31] Nicholls, H.: Bacteria learn antibiotic resistence in the sludge. BMP News. 2003, vol 8, is. 22, pp. 1011. [32] Göbel, A., McArdell, Ch. S., Joss, A., Siegrist, H., Giger, W.: Fate of sulfonamides, macrolides, and trimethoprim in different wastewater treatment technologies. Scince of the Total Environment. 2007, vol. 372, pp. 361 – 371. [33] Heberer, T.: Occurrence, fate, and removal of pharmaceutical residues in the aquatic environment: a review of recent research data. Toxicology Letters, 2002, vol. 131, pp. 5 – 17. [34] Chang, H., Hu, J., Wang, L., Sbal, B.: Occurrence of sulfonamide antibiotics in sewage treatment plants. Chinese Science Bulletin. 2008, vol. 53, is. 4, pp. 514 – 520. [35] Serrano, P. H.: Responsible use of antibiotics in aquaculture. Rome: Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2005. p. 97. ISBN: 92-5-105436-3. [36] Nieto, A., Borrull, F., Pocurull, E., Marcé, M. R.: Pressurized liquid extraction: A useful technique to extract pharmaceuticals and personal-care products from sewage sludge. Trends in Analytical Chemistry. 2010, vol. 29, pp. 752 – 764. [37] Benito-Peňa, E., Partal-Rodera, A. I., León-González, M. E., Moreno-Bondi, M. C.: Evaluation of mixed mode solid phase extraction cartridges for the preconcentration of beta-lactam antibiotics in wastewater using liquid chromatography with UV-DAD detection. Analytica Chimica Acta. 2006, vol. 556, pp. 415 – 422. [38] Yang, S., Cha, J., Carlson, K.: Simultaneous extraction and analysis of 11 tetracycline and sulfonamide antibiotics in influent and effluent domestic wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2005, vol. 1013, pp. 40 – 53. [39] Kay, P., Blackwell, P. A., Boxall, A. B. A.: Transport of veterinary antibiotics in overland flow following the application of slurry to arable land. Chemosphere. 2005, vol. 59, is. 7, pp. 951 – 959. [40] Karthikeyan, K. G., Meyer, M. T.: Occurrence of antibiotics in wastewater treatment facilities in Wisconsin, USA. Science of the Total Environment. 2006, vol. 361, is. 1-3, pp. 196 – 207. [41] Hartig, C., Storm, T. a Jekel, M.: Detection and identification of sulphonamide drugs in municipal waste water by liquid chromatography coupled with electrospray ionisation tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1999, vol. 854, pp. 163 – 173. [42] Ben, W., Qiang, Z., Adams, C., Zhang, H., Chen, L.: Simultaneous determination of sulfonamides, tetracyclines and tiamulin in swine wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2008, vol. 1202, pp. 173 – 180. [43] Botitsi, E., Frosyni, Ch., Tsipi, D.: Determination of pharmaceuticals from different

28

therapeutic classes in wastewaters by liquid chromatography–electrospray ionization–tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 2007, vol. 387, pp. 1317 – 1327. [44] Chiavarino, B.: Determination of sulfonamide antibiotics by gas chromatography coupled with atomic emission detection. Journal of Chromatography B. 1998, vol. 706, pp. 269 – 277. [45] Preu, M., Guyot, D., Petz, M.:Development of a gas chromatography–mass spectrometry method for the analysis of aminoglycoside antibiotics using experimental design for the optimisation of the derivatisation reactions. Journal of Chromatography A. 1998, vol. 818, pp. 95 – 108. [46] Assassi, N., Tazerouti, A., Canselier, J. P.: Analysis of chlorinated, sulfochlorinated and sulfonamide derivatives of n-tetradecane by gas chromatography/mass spectrometry. Journal of Chromatography A, 2005, vol. 1071, pp. 71 – 80. [47] Togola, A., Budzinski, H.: Multi-residue analysis of pharmaceutical compounds in aqueous samples. Journal of Chromatography A, 2008, vol. 1177, pp. 150 – 158. [48] Moeder, M., Schrader, S., Winkler, M., Popp, P.: Solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry of biologically active substances in water samples. Journal of Chromatography A, 2000, vol. 873, pp. 95 – 106. [49] Mamani, M. C. V., Farfán, J. A., Reyes F. G. R., Rath, S.: Use of experimental design and effective mobility calculations to develop a method for the determination of antimicrobials by capillary electrophoresis. Talanta. 2008, vol. 76, pp. 1006 – 1014. [50] Mamani, M. C. V., Farfán, J. A., Reyes F. G. R., Fracassi da Silva, J. A., Rath, S.: Simultaneous determination of tetracyclines in pharmaceuticals by CZE using experimental design. Talanta. 2006, vol. 70, pp. 236 – 243. [51] Hows, M. E. O., Perrett, D., Kay, J.: Optimisation of a simultaneous separation of sulphonamides, dihydrofolate reductase inhibitors and β-1actam antibiotics by capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1997, vol. 768, pp. 97 – 104. [52] Li, B., Zhang, T., Zhaoyi, X., Fang, H.H.P.: Rapid analysis of 21 antibiotics of multiple classes in municipal wastewater using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 2009, vol. 645, pp. 64 – 72. [53] Soliman, M. A., Pedersen, J. A., Suffet, I. H. M.: Rapid gas chromatography-mass spectrometry screening method for human pharmaceuticals, hormones, antioxidants and plasticizers in water. Journal of Chromatography A, 2004, vol. 1029, pp. 223 – 237. [54] Díaz-Cruz, M. S., García-Galán, M. J., Barcelo, D.: Highly sensitive simultaneous determination of sulfonamide antibiotics and one metabolite in environmental waters by liquid chromatography–quadrupole linear ion trap–mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2008, vol. 1193, pp. 50 – 59. [55] Raich-Montiu, J., Folch, J., Compañó, R., Granados, M., Prat, M. D.: Analysis of trace levels of sulfonamides in surface water and soil samples by liquid chromatography-fluorescence. Journal

29

of Chromatography A. 2007. vol. 1172, pp. 186 – 193. [56] Lillenberg, M., Yurchenkob, S., Kipper, K., Herodes, K.: Simultaneous determination of fluoroquinolones, sulfonamides and tetracyclines in sewage sludge by pressurized liquid extraction and liquid chromatography electrspray ionization-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2009, vol. 1216, pp. 5949 – 5954. [57] Díaz-Cruz M. S., López de Alda M. J., Barceló D.: Determination of antimicrobials in sludge from infiltration basins at two artificial recharge plants by pressurized liquid extraction-liquid chromatography-tandem mass spectrometry Journal of Chromatography A. 2006. vol. 1130, pp. 72 – 82. [58] Pailler, J. Y., Krein, A., Pfister, L., Hoffmann, L., Guidnard, C.: Solid phase extraction coupled to liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis of sulfonamides, tetracyclines, analgesics and hormones in surface water and wastewater in Luxembourg. Science of the Total Environment. 2009, vol. 407, pp. 4736 – 4743. [59] Alder, A. C., McArdell, C. S., Golet E. M., Ibric, S., Molnar, E., Nipales, N. S. et al.: Occurrence and fate of fluoroquinolone, macrolide and sulfonamide antibiotic during wastewater treatment and in ambient waters in Switzerland. American Chemical Society. 2001, pp. 39 – 54. [60] Kolpin, D. W., Skopec, M., Meyer, M. T., Furlong, E. T., Zaugg S. D.: Urban contribution of pharmaceuticals and other organic wastewater contaminants to stress during differing flow conditions. Sci. Total. Environ. 2004, vol. 328, pp. 119 – 130. [61] Batt, A. L., Snow, D. D., Aga, D. S.: Occurrence of sulfonamide antimicrobials in private water wells in Washington County, Idaho, USA. Chemosphere. 2006, vol. 64, pp. 1963 –1971. [62] Lindsey, M. E., Meyer, T. M, Thurman, E. M.: Analysis of trace levels of sulfonamide and tetracykline antimicrobials in groundwater and surface water using solid-phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry. Anal. Chem. 2001, vol. 73, pp. 4640 – 4646. [63] Lisá, H.: Problematika stanovení reziduí léčiv v odpadních vodách. ( disertační práce). Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2011. 145 s. Vedoucí dizertační práce prof. RNDr. Milada Vávrová, CSc.

30

6

PROFIL AUTORA

Osobní údaje Jméno a příjmení, titul: Rozená: Datum narození: E-mail:

Petra Dvořáková, Ing. Ženatová 28. 12. 1984 [email protected] [email protected]

VZDĚLÁNÍ Od roku 2009

2007-2009

2004-2007

1996-2004

Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická Typ studia: doktorský Obor: Chemie životního prostředí. Téma dizertační práce: Využití kapalinové chromatografie pro stanovení reziduí léčiv. Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická Typ studia: navazující magisterský Obor: Chemie a technologie ochrany životního prostředí. Téma diplomové práce: Posouzení kontaminace kalů z čistíren odpadních vod rezidui léčiv. Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická Typ studia: bakalářský Obor: Chemie a technologie ochrany životního prostředí. Téma bakalářské práce: Použití membránové mikrofiltrace v různých úpravnách pitné vody ve světě. Gymnázium Moravská Třebová. Osmileté gymnázium, zakončeno maturitou s vyznamenáním, maturitní předměty: ČJ, AJ, Biologie, Chemie.

KURZY, SEMINÁŘE, WORKSHOPY Kurz: Analýza organických látek, od firmy UPA – THETA (Valtice, 12. - 15. 10. 2009) Seminář: Vize 2009, pořádaný firmou WATERS (Brno, 10. 11. 2009) Seminář: Nová generace přístrojů Agilent technologies, pořádaný firmou HPST, s.r.o. (Brno, 13. 11. 2009) Seminář: Trendy v analýze potravin a životního prostředí, pořádaný firmou SIGMA-ALDRICH (Praha, 11. 2. 2010) Seminář: SPE method development, pořádaný firmou CHROMSERVIS (Brno, 17. 3. 2010) Kurz: International school – Monitoring, fate and toxicity of toxic compounds in the terrestrial

31

environment, University of Nova Gorica (Slovinsko 29.11. – 8.12. 2010); prezentace Workshop: Atmosferické částice, součást konference Ovzduší (Brno, 4. 4. 2011) Seminář: Příprava vzorků, od firmy HPST, s.r.o. (Brno, 19. 4. 2011) Workshop: Albertov Comprehensive days: Teorie a praxe komprehensivních separačních metod, Přírodovědná fakulta UK (Praha, 7. – 8. 2. 2012)

KONFERENCE Na následujících konferencích byly prezentovány výsledky dizertační práce: 11th European Meeting on Environmental Chemistry – EMEC 11 (Portorož, Slovinsko, 2010); posterová prezentace 5th Meeting on Chemistry and Life (FCH VUT Brno, 14. – 16. 9. 2011); posterová prezentace 16th International Symposium on Environmental Pollution and its Impact on Life in the Maditerranean Region – MESAEP (Ioannina, Řecko, 24. – 27. 9. 2011); posterová prezentace 12th European Meeting on Environmental Chemistry – EMEC 12 (Clermont-Ferrand, Francie, 7. – 10. 12. 2011); posterová prezentace 30th Informal Meeting on Mass Spectrometry 2012 (Olomouc, 29. 4. – 3.5. 2012); posterová prezentace

PROJEKTY FCH-S-11-2 Využití chemických, biochemických a toxikologických metod k hodnocení zátěže ekosystému (řešeno v roce 2010; specifický výzkum) FRVŠ projekt č. 2013/2011/G4 Stanovení léčiv v biotických a abiotických složkách životního prostředí (řešeno v roce 2011) FCH-S-11-3 Hodnocení zátěže ekosystému prioritními polutanty (řešeno v roce 2011; specifický výzkum) FRVŠ projekt č. 1497/2012/G4 Studium průniku vybraných léčiv do biotické složky ekosystému (řešeno v roce 2012) FCH-S-11-4 Posouzení úrovně kontaminace vodního a terestrického ekosystému (řeší se v roce 2012; specifický výzkum)

32

7

PUBLIKAČNÍ ČINNOST

DVOŘÁKOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M. Occurrence of sulfonamide antibiotics in sediment from Moravian rivers in the Czech Republic. Environmental Chemistry Letters, 2012. (v recenzním řízení) DVOŘÁKOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M.; MRAVCOVÁ, L. Využití extrakčních metod pro stanovení antibiotik ve vzorcích povrchové vody a sedimentu. Chemické listy, 2012. (v recenzním řízení) VÁVROVÁ, M.; LACINA, P.; DVOŘÁKOVÁ, P. Využití SPE a SPME při analýze léčiv ve vodách. In Pitná voda 2012. České Budějovice: 2012. s. 221-226. ISBN: 978-80-905238-0-7. ŽENATOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M.; MRAVCOVÁ, L.; LISÁ, H. Determination of sulphonamide antibiotics and trimethoprim in wastewater and sludge using liquid chromatography with diodearray detection. Journal of Environmental Science and Engineering, 2012, roč. 1, č. 2, s. 175-180. ISSN: 1934- 8932. LACINA, P.; ŽENATOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M. The assessment of contamination of selected river streams in Czech Republic by human and veterinary drug residues with using liquid and gas chromatography. Fresenius Environmental Bulletin, 2012, vol. 21. ISSN: 1018-4619. (Přijato 1.2.2012). JÁROVÁ, K.; VÁVROVÁ, M.; STOUPALOVÁ, M.; ŽENATOVÁ, P.; LACINA, P.; KRÁLOVÁ, Z.: Možnosti izolace vybraných léčiv z environmentálních matric. In Zborník proceedings. Ed. S. Hredzák. Hrádok pri Jelšave: Ústav geotechniky SAV Košice, 2011, s. 68-72. ISBN 978-80-970034-3-2. ŽENATOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M. Utilisation of solid phase extraction method for determination of drug residues in the river water. Ioannina: 16th International Symposium on Environmental Pollution and its Impact in the Mediterranean Region, 2011. LACINA, P.; ŽENATOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M. The assessment of contamination of selected river streams in Czech Republic by human and veterinary drug residues with using liquid and gas chromatography. 16th International Symposium on Environmental Pollution and its Impact on Life in the Mediterranean Region: Book of Abstracts. Ioannina: 2011. ŽENATOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M. Monitoring of drug residues contamination in two czech rivers by liquid chromatography. Clermont-Ferrand: 12th European Meeting on Environmental Chemistry, 2011. VÁVROVÁ, M.; STOUPALOVÁ, M.; ŽENATOVÁ, P.; LACINA, P. Možnost izolace vybraných léčiv z environmentálních matric. In Zbroník - Proceedings, Hrádok 2011. 2011. s. 6872. ISBN: 978-80-970034-3- 2.

33

ŽENATOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M.; DADÁKOVÁ, P. Suitability of extraction methods for determination of drug residues in the river sediment. 5th Meeting on Chemistry and Life. Chemické listy. Brno: Fakulta chemická VUT Brno, 2011. s. (s974 s.) ISSN: 0009- 2770. ŽENATOVÁ, P.; VÁVROVÁ, M.; MRAVCOVÁ, L.; LISÁ, H. Assessment of contamination of sewage sludge and wastewater from wastewater treatment plant by drug residuals. The 11th European Meeting on Environmental Chemistry. Nova Gorica, Slovenia: University of Nova Gorica, 2010. s. 227-227. ISBN: 978-961-6311-66- 3.

34