Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici
Vliv malolaktické fermentace na analytické a senzorické parametry bílých vín Diplomová práce
Vedoucí diplomové práce:
Vypracoval:
Ing. Mojmír Baroň, Ph.D.
Bc. Tomáš Němec
Lednice 2014
Prohlášení: Prohlašuji, že jsem diplomovou práci na téma: Vliv malolaktické fermentace na analytické a senzorické parametry bílých vín vypracoval samostatně a veškeré použité prameny a informace uvádím v seznamu použité literatury. Souhlasím, aby moje práce byla zveřejněna v souladu s § 47b zákona č. 111/1998 Sb., o vysokých školách ve znění pozdějších předpisů a v souladu s platnou Směrnicí o zveřejňování vysokoškolských závěrečných prací. Jsem si vědom, že se na moji práci vztahuje zákon č. 121/2000 Sb., autorský zákon, a že Mendelova univerzita v Brně má právo na uzavření licenční smlouvy a užití této práce jako školního díla podle § 60 odst. 1 autorského zákona. Dále se zavazuji, že před sepsáním licenční smlouvy o využití díla jinou osobou (subjektem) si vyžádám písemné stanovisko univerzity, že předmětná licenční smlouva není v rozporu s oprávněnými zájmy univerzity, a zavazuji se uhradit případný příspěvek na úhradu nákladů spojených se vznikem díla, a to až do jejich skutečné výše.
V Lednici, dne: ……………………………
Podpis: ……………………………………
Děkuji všem, kteří mi pomohli cennými radami, připomínkami a odborným vedením, při vypracování této práce.
Zvláštní poděkování patří především Ing. Mojmíru Baroňovi, Ph.D. za odborné vedení, čas a spolupráci po celou dobu konzultací při zpracování diplomové práce. Dále děkuji panu Ing. Michalu Kumštovi za pomoc při analytickém vyhodnocování vzorků vín, které je součástí praktické části této práce.
Obsah 1.
ÚVOD ..................................................................................................................................... 8
2.
CÍL PRÁCE .............................................................................................................................. 9
3.
LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................................................ 10
3.1 RŮST POPULACE MLÉČNÝCH BAKTERIÍ VE VÍNĚ ................................................................ 10 3.2 FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ VÝVOJ MLÉČNÝCH BAKTERIÍ VE VÍNĚ .......................................... 11 3.2.1
HODNOTA pH .............................................................................................................. 11
3.2.2
SO2 ............................................................................................................................... 12
3.2.3
ETANOL........................................................................................................................ 14
3.2.4
TEPLOTA ...................................................................................................................... 15
3.2.5
NUTRIČNÍ POŽADAVKY ................................................................................................ 16
3.2.6
FENOLICKÉ SLOUČENINY ............................................................................................. 17
3.2.7
INTERAKCE MEZI KVASINKAMI A MLÉČNÝMI BAKTERIEMI......................................... 18
3.3 VLIV METABOLISMU MLÉČNÝCH BAKTERIÍ NA ANALYTICKÉ A SENZORICKÉ PARAMETRY BÍLÝCH VÍN .......................................................................................................................... 20 3.3.1
METABOLISMUS ORGANICKÝCH KYSELIN ................................................................... 20
3.3.2
METABOLISMUS CUKRŮ.............................................................................................. 23
3.3.3
ACETOINOVÉ SLOUČENINY ......................................................................................... 26
3.3.4
METABOLISMUS FENOLICKÝCH SLOUČENIN ............................................................... 28
3.3.5
METABOLISMUS POLYOLŮ .......................................................................................... 29
3.3.6
HYDROLÝZA GLYKOSIDŮ.............................................................................................. 30
3.3.7
VOLATILNÍ SLOUČENINY SÍRY ...................................................................................... 31
3.3.8
SLOUČENINY OBSAHUJÍCÍ DUSÍK................................................................................. 32
3.3.9
METABOLISMUS POLYSACHARIDŮ ............................................................................. 33
3.3.10
VYŠŠÍ ALKOHOLY ......................................................................................................... 34
3.3.11
LIPOLÝZA ..................................................................................................................... 34 4
3.3.12
KYSELINA OCTOVÁ ...................................................................................................... 36
3.3.13
ESTERY ......................................................................................................................... 36
3.3.14
METABOLISMUS ACETALDEHYDU ............................................................................... 37
4.
MATERIÁL A METODY ......................................................................................................... 40
4.1 OBECNÝ POPIS .................................................................................................................... 40 4.2 METODIKA TECHNOLOGIE .................................................................................................. 44 4.3 ANALYTICKÝ ROZBOR VÍNA ................................................................................................ 45 4.3.1
VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE – HPLC ....................................... 45
4.4 SENZORICKÉ HODNOCENÍ................................................................................................... 46 5.
VÝSLEDKY PRÁCE ................................................................................................................ 47
5.1 ANALYTICKÉ HODNOCENÍ VZORKŮ VÍN ............................................................................. 47 5.2 SENZORICKÉ HODNOCENÍ VZORKŮ VÍN ............................................................................. 58 6.
DISKUSE ............................................................................................................................... 62
7.
ZÁVĚR .................................................................................................................................. 67
8.
SOUHRN .............................................................................................................................. 68
9.
RESUME ............................................................................................................................... 69
10. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY .......................................................................................... 70
5
SEZNAM TABULEK Tab. 1 Inhibiční účinek kvasinkových metabolitů na MB…………………………….. 18 Tab. 2 Vliv různých faktorů výroby vína na obsah diacetylu…………………………. 27 Tab. 3 Čtyři hlavní volatilní sloučeniny síry produkované MB během MLF…………. 32 Tab. 4 Vliv některých aldehydů na vůni vína…………………………………………. 38 Tab. 5 Způsob realizace MLF ve vzorcích vín………………………………………… 41 Tab. 6 Charakteristika různých variant provedení MLF ve víně………………………. 43 Tab. 7 Analytické údaje jednotlivých vzorků vín………………………………………47 Tab. 8 Bodové hodnocení vzorků vín………………………………………………….. 58
SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1 Schéma růstu mléčných bakterií během vinifikace vína……………………….. 10 Obr. 2 Vztah mezi počátečním pH a rychlostí MLF…………………………………... 12 Obr. 3 Vliv SO2 na schopnost přežití Oenococcus oeni ve víně……………………….. 13 Obr. 4 Vliv etanolu na růst a malolaktickou aktivitu Oenococcus oeni…………………. 14 Obr. 5 Vliv teploty na množství kyseliny jablečné ve víně během vinifikace………… 15 Obr. 6 Vliv kvasinkových manoproteinů na růst Oenococcus oeni……………………… 19 Obr. 7 Výroba energie (ATP) v Oenococcus oeni prostřednictvím konverze kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou a CO2…………………………………………. 21 Obr. 8 Metabolická cesta degradace kyseliny citronové mléčnými bakteriemi……….. 22 Obr. 9 Dvě hlavní cesty fermentace glukózy bakteriemi mléčného kvašení…………...24 Obr. 10 Metabolismus pentóz mléčných bakterií……………………………………… 25 Obr. 11 Degradace kyseliny citronové a tvorba diacetylu, acetoinu a 2,3-butandiolu během MLF…………………………………………………………………... 27 Obr. 12 Tvorba volatilních fenolických sloučenin z hydroxyskořicových kyselin……. 29 Obr. 13 Degradace glycerolu mléčnými bakteriemi…………………………………… 30 Obr. 14 Schématické znázornění tvorby heterocyklických volatilních dusíkatých bází zapříčiňujících myšinu v buňce mléčné bakterie……………………………...33 Obr. 15 Struktura polysacharidu produkovaného Pediococcus damnosus……………….34 Obr. 16 Změna v aromatickém profilu volatilních mastných kyselin spojená s MLF… 35 Obr. 17 Změna v aromatickém profilu esterů spojená s MLF………………………….37 Obr. 18 Schématické znázornění biosyntetických drah senzoricky aktivních sloučenin v buňce mléčné bakterie……………………………………………………… 39
6
SEZNAM GRAFŮ Graf 1 Změny v koncentraci zbytkových aminokyselin ve víně………………………. 16 Graf 2 Analytický rozbor organických kyselin ve vzorku č. 1………………………… 48 Graf 3 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 2……………………...... 49 Graf 4 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 3……………………...... 50 Graf 5 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 4…….…………………. 51 Graf 6 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 5.………… …………… 52 Graf 7 Analytický rozbor organických kyselin ve vzorku č. 6………………................ 53 Graf 8 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 7….……………………. 54 Graf 9 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 8……………………...... 55 Graf 10 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 9……………………… 56 Graf 11 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 10…………………...... 57
POUŽITÉ ZKRATKY MB MLF AF MK Arg Glu Lys Ile Thr Ala Leu Val Cys Phe Trp OH ppb TPF ASVK ATP ADP ATPáza S. O. L. P. RR RV
mléčné bakterie malolaktická fermentace alkoholová fermentace mastná kyselina arginin kyselina glutamová lysin isoleucin treonin alanin leucin valin cystein fenylalanin tryptofan optická hustota počet částic na bilion thiaminpyrofosfát aktivní suché vinné kvasinky adenosintrifosfát adenosindifosfát adenosintrifosfatáza Saccharomyces Oenococcus Lactobacillus Pediococcus Ryzlink rýnský Ryzlink vlašský
7
1.
ÚVOD
Víno je velmi komplexní médium skládající se z nesčetných sloučenin, které mohou být buď prospěšné, nebo škodlivé pro růst a přežití mikroorganismů. Role mikrobů ve víně není omezena pouze na přeměnu hroznového moštu ve víno, ale svou roli také hrají mléčné bakterie (MB), které degradují kyselinu L-jablečnou na kyselinu L-mléčnou během malolaktické fermentace (MLF). MLF je biologický jev a jako taková podléhá fyzikálním, chemickým a environmentálním omezením, což má vliv na růst bakteriální populace. Víno má poměrně vysoký obsah kyselin a alkoholu, nízké pH a většinou obsahuje oxid siřičitý. Pokud se ve víně prosadí spontánní MLF, znamená to, že bakterie mléčného kvašení překonaly tyto nehostinné podmínky a namnožily se na potřebný počet k zahájení MLF. Nicméně to neznamená, že započatá MLF povede k pozitivnímu vnímání senzorického profilu vína, který je očekáván. Vinař nikdy nemá dokonalou kontrolu nad populací MB, která se ve víně rozvine. Z toho vyplývá, že spontánní MLF může vést k rozvoji nežádoucího kmene MB. To má za následek produkci negativních metabolitů a případné znehodnocení vína. Pochopení procesů odehrávajících se při MLF, dalo vinařství mocný nástroj k ovládání a dokonce i předvídání průběhu MLF. Klíčem k úspěchu je inokulace známých a spolehlivých kmenů MB a nespoléhat se na spontánní rozvoj bakteriální flóry. Komerční mléčné bakterie se selektují jak z hlediska schopnosti růstu ve víně, tak i pro pozitivní smyslové atributy jako je aroma a chuť konečného výrobku. Dále přispívají k zvýšení pocitu plnosti vína v ústech a minimalizaci produkce nežádoucích metabolitů. Izolované bakteriální kultury jsou otestované na složky vína, které by mohly inhibovat nebo znemožnit jejich růst. Rovněž byly zkoumány nutriční požadavky, jakož i kompatibilita bakteriálních kmenů s různými kmeny kvasinek použitých při výrobě vína. Příspěvek určitých kmenů MB na specifické vlastnosti vína je také známý. MLF je většinou zmiňována ve vztahu k červeným vínům. Existují ovšem případy, kdy je tento proces podporován i u bílých vín. Příspěvek MLF se projevuje v aromatické složitosti vín a vyvíjí a stabilizuje určité strukturální a aromatické nuance. Na druhé straně i povedená MLF v bílých vínech může vést k výraznému snížení ovocného charakteru. Stručně řečeno, rozsah našich znalostí o MLF ve spojení s praktickými zkušenostmi je na takové úrovni, že správně vedená MLF ruku v ruce s odpovídajícím stylem vína je předností a spoluvytváří produkt vysoké kvality.
8
2.
CÍL PRÁCE
Cílem diplomové práce je prozkoumat vliv malolaktické fermentace na analytické a senzorické parametry bílých vín. V této souvislosti otestovat komerčně dostupné druhy mléčných bakterií z hlediska jejich vlivu na víno a vhodnosti malolaktické fermentace pro snížení kyselosti bílých vín. Dále prověřit kvalitu biologického odbourávání kyselin v souvislosti s načasováním inokulace mléčných bakterií. V nepostední řadě je záměrem finální porovnání vín, která prodělala malolaktickou fermentaci a vín kontrolních, bez aplikovaných mléčných bakterií. Úkolem zadání je prostudovat problematiku malolaktické fermentace a informace zpracovat v literárním přehledu. Dále zajistit vzorky vín po MLF, které byly vyrobeny pomocí různých komerčních bakterií pro senzorické a analytické vyhodnocení.
9
3.
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1
RŮST POPULACE MLÉČNÝCH BAKTERIÍ VE VÍNĚ
Po ukončení AF a počáteční lag fáze, ve které se MB nemnoží a přizpůsobují se novému prostředí, se přežívající bakteriální buňky (nejčastěji Oenococcus oeni) začnou množit. Tato fáze je charakterizována intenzivním růstem bakterií, které pro tento účel využívají cukr. Start MLF je vyvolán, jakmile dosáhnou bakteriální populace velikosti 106/ml. (HENICK-KLING, 1993) Následuje brzká fáze stacionární, ve které MB využívají jako zdroj energie kyselinu jablečnou. Ve fázi, kdy je MLF skoro u konce, začnou MB degradovat kyselinu citronovou. Při odbourávání kyseliny citronové vzniká diacetyl, který ve vysokých koncentracích působí senzoricky nepříznivě. (DAVIS et al., 1986) Po dokončení MLF jsou zbývající MB stále schopny metabolizovat zbytkový cukr, což by mohlo mít za následek znehodnocení vína produkcí těkavých kyselin. Tento scénář obzvláště hrozí ve vínech s vysokým pH, kde se mohou objevit druhy Lactobacillus a Pediococcus. (WIBOWO et al., 1985) Pokud je médium inokulováno uměle, vyšší úroveň počáteční inokulace MB urychluje začátek a zkracuje MLF. Vede také k nižší tvorbě diacetylu. Nízká úroveň inokulace má prodlouženou lag fázi až na dobu 14 dnů a vytváří vyšší obsah diacetylu, který může negativně ovlivňovat senzorickou kvalitu vína. Inokulace bakterií v dávce dle návodu výrobce je proto velmi důležitá. (PAVLOUŠEK, 2010)
Obr. 1 Schéma růstu mléčných bakterií během vinifikace vína. Populační vývoj Oenococcus oeni pod ( ) a nad ( ) pH 3,5 před a během malolaktické fermentace; a růst jiných druhů v pozdějších fázích MLF nebo zrajícím víně: Oenococcus oeni ( ), jiné druhy ( ). (JACKSON, 2008) 10
3.2
FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ VÝVOJ MLÉČNÝCH BAKTERIÍ VE VÍNĚ
Jen málo druhů MB je schopných růstu v hroznovém moštu a víně, protože musí čelit množství nepříznivých podmínek, se kterými se setkávají: hlavně nízké pH, nedostatek živin, přítomnost etanolu a SO2, atd. Ze všech bakterií, které jsou schopny provést MLF je nejžádanější druh Oenococcus oeni. Má největší schopnost růst v nízkém pH a v přítomnosti etanolu. (CARRASCOSA et al., 2011)
3.2.1 HODNOTA pH
pH vína hraje důležitou roli při určování druhu MB, který ve víně přežije a rozvine se. Taktéž lze odhadovat tempo růstu bakterií. Pokud jde o zahájení a ukončení MLF, vína s pH 3,3 a více, obecně mohou vykazovat několik problémů, zatímco při pH nižším než 2,9 jsou Oenococcus oeni inhibovány. (KUNKEE, 1967) Oenococcus oeni obvykle představují dominantní druhy ve víně pod pH 3,5. Při vyšším pH je podporován růst více druhů, které dokáží přežít a růst, např. Lactobacillus a Pediococcus spp. pH silně ovlivňuje malolaktickou činnost buněk. I když použijí cukr k růstu, jsou při nízkém pH inhibovány. Malolaktická aktivita je nejvyšší při pH 3,5 až 4,0. (HENICK-KLING, 1995) Ve skutečnosti frakce kyselin, které volně pronikají v nedisociované formě, disociují uvnitř buněk, což vede ke snížení pH. V důsledku toho je intracelulární enzymová aktivita více či méně inhibována s ohledem na optimální pH jejich činnosti. Vysoké pH usnadňuje růst bakterií ve víně, stejně jako podporuje jejich přežití, a to nejen přímo, ale také tím, že sníží účinnost volného oxidu siřičitého. Kromě růstu ovlivňuje pH malolaktickou činnost celé buňky. Malolaktická činnost kmenů Oenococcus oeni je optimální při pH mezi 3,0 a 3,2 a asi 60 % své maximální aktivity mají při pH 3,8. Obvyklý rozsah pH vína proto dobře koresponduje s maximální malolaktickou aktivitou bakteriální buňky. Přesto je rychlost MLF závislá nejen na aktivitě, ale také na množství buněk. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006) RIBÉREAU-GAYON et al. (1975) definovali prahové hodnoty pH pro asimilaci kyseliny jablečné a cukru. Tyto hodnoty odpovídají nejnižším hodnotám pH, při kterých je substrát transformován a liší se v závislosti na kmenu. Prahová hodnota pH kyseliny jablečné je nižší, než je prahová hodnota pH cukrů. V oblasti mezi těmito dvěma pH bakterie rozkládají kyselinu jablečnou, aniž by zpracovávaly velké množství cukrů a tudíž produkovaly těkavé kyseliny. Čím větší je tato oblast, tím lépe je kmen bakterií 11
přizpůsoben pro použití ve vinařství. Dá se říci, že pro biologické odbourávání kyselin se osvědčuje hodnota pH mezi 3,3–3,5. Naopak při pH vyšším než 3,5 preferují MB metabolismus cukrů za vzniku kyseliny octové. pH je tedy velmi důležité z pohledu výběru nejvhodnějšího kmene, tempa růstu a produktivity, ale také charakteru produktů transformovaných během MLF. (EDER et al., 2006)
Obr. 2 Vztah mezi počátečním pH a rychlostí MLF (JACKSON, 2008) 3.2.2
SO2
Přídavek SO2 na podrcené hrozny nebo v pozdějších fázích výroby vína je prostředkem pro inhibici a kontrolu mikrobiální populace. Oxid siřičitý existuje v různých formách jako vázaný, molekulární nebo volný SO2, ale také ve formě hydrogensiřičitanových iontů (HSO3-) a siřičitanových iontů (SO32-). Při nízkém pH převládá volný SO2, který se skládá hlavně z iontů HSO3- a SO32- a malého zlomku molekulárního SO2. Právě molekulární forma SO2 je považována za nejvíce inhibiční vůči MB. Je nejúčinnější při nižších hodnotách pH a jako jediná forma SO2 dokáže difundovat skrz bakteriální buněčnou stěnu. Uvnitř buňky je molekulární SO2 převeden na hydrogensiřičitan a může reagovat s různými složkami buněk, jako jsou např. proteiny a ovlivnit tak růst MB. (CARRETÉ et al., 2002; BAUER & DICKS, 2004) Mechanismus, kterým SO2 inhibuje MB, funguje na základě rozrušení disulfidových můstků v proteinech, jakož i reakce s kofaktory NAD+ a FAD, což má vliv na růst MB. Nedávno bylo prokázáno, že SO2 je schopen inhibovat aktivitu ATPázy, která je nezbytná pro udržování intercelulárního pH a tedy růst MB. (KOEBMANN et al., 2000) 12
Bylo zjištěno, že i tak nízké koncentrace molekulárního SO2 jako 0,1 až 0,15 mg.l-1, mohou působit inhibičně na růst některých kmenů MB. MB se také liší ve schopnosti snášet SO2 (např. Oenococcus oeni jsou méně tolerantní k vyšším celkovým koncentracím SO2 než kmeny Pediococcus). Vzhledem k velkému vlivu pH vína a individuální toleranci určitého kmene bakterií k SO2, je účinek různých koncentrací SO2 na MB různorodý. (LARSEN et al., 2003) HENICK-KLING (1993) poukazuje na 13% snížení aktivity MLF při 20 mg.l-1 vázaného SO2, dále snížení o 50 % při 50 mg.l-1 a žádnou malolaktickou aktivitu při 100 mg.l-1 vázaného SO2. GUZZO et al. (1998) ve výsledcích uvádí úmrtí Oenococcus oeni během 3 hodin při 15 mg.l-1 volného SO2, zatímco CARRETÉ et al. (2002) zjistili, že koncentrace 20 mg.l-1 volného SO2 inhibuje aktivitu ATPázy MB o více než 50 % a MLF potřebuje 40 dnů na dokončení v přítomnosti 5 mg.l-1 volného SO2. Pro kontrolu a inhibici MB doporučuje HENICK-KLING (1993) zachovat úroveň volného SO2 nad 10 mg.l-1 a celkového SO2 nad 30 mg.l-1. Vzhledem k zásadnímu vlivu pH vína na formu SO2 navrhují GARCÍA-RUIZ et al. (2008) následující koncentrace volného SO2 k inhibici MB: 10–30 mg.l-1 při pH 3,2–3,6; 30–50 mg.l-1 při pH 3,5–3,7 a 100 mg.l-1 pro vína s pH nad 3,7.
Obr. 3 Vliv SO2 na schopnost přežití Oenococcus oeni ve víně. V nepřítomnosti SO2 (•) a v přítomnosti různých koncentrací SO2 : 15 mg.l-1 (▪), 30 mg.l-1 (▴), 60 mg.l-1 (♦). (GUZZO et al., 1998)
13
3.2.3
ETANOL
Etanol je hlavní metabolit tvořený kvasinkami při alkoholové fermentaci. V důsledku jeho nepříznivých účinků na růst MB, hraje zásadní roli ve schopnosti MB přežít ve vinném prostředí a provést MLF. Stejně jako u většiny inhibičních faktorů MB, také etanol prokazuje synergicky inhibiční účinky v součinnosti s teplotou. Optimální teplota růstu MB klesá při zvyšujících se koncentracích etanolu a zvýšená teplota znamená nižší schopnost MB odolávat zvýšené koncentraci etanolu. (HENICK-KLING, 1993; BAUER & DICKS, 2004) Teplota 25 °C a výše v kombinaci s úrovní etanolu 10 až 14 % obj., téměř zcela inhibuje růst MB. Naopak optimálního růstu v tomto rozmezí etanolu je dosaženo při teplotě mezi 18 a 20 °C. Kmeny Oenococcus oeni jsou schopny přežít a množit se v 10 % obj. etanolu v pH 4,7. Míra, do jaké jsou MB schopny tolerovat koncentraci etanolu, je závislá na kmenu, stejně jako je závislá na aktivačních krocích před inokulací do vína. (BRITZ & TRACEY, 1990) G-ALEGRÍA et al. (2004) uvádějí schopnost Oenococcus oeni a Lactobacillus plantarum růst v množství etanolu 13 % obj. HENICK-KLING (1993) konstatuje, že koncentrace etanolu vyšší než 14 % obj. inhibují růst Oenococcus oeni. V přítomnosti vysokých koncentrací etanolu bakterie reagují tím, že se pokouší udržet tekutost a integritu buněčné membrány. (COUTO et al., 1996)
Obr. 4 Vliv etanolu na růst a malolaktickou aktivitu Oenococcus oeni. Kyselina jablečná (g.l-1), , 5%;
, 8%;
; bakteriální růst (optická hustota: OH620 nm), , 11%;
, 13%. (JACKSON, 2008) 14
;
, 0%;
3.2.4
TEPLOTA
BRITZ & TRACEY (1990) zkoumali vliv některých faktorů na růst 54 kmenů MB a zjistili, že teplota má významný vliv na bakteriální růst. Bylo zjištěno, že etanol má větší inhibiční účinek, kdy jeho toxicita s teplotou vzrůstá. Existuje také synergický inhibiční účinek mezi teplotou, etanolem a SO2. Teplota je parametr, který lze snadno monitorovat a kontrolovat. Má zřetelný vliv na schopnost přežít ve víně u MB, ale také ovlivňuje zahájení, průběh a konec MLF. Teplota ovlivňuje růst, délku lag fáze a počet populace MB. Optimální teplota růstu pro Oenococcus oeni je stanovena na 27–30 °C, ale v důsledku přítomnosti etanolu ve víně, se optimální teplota pro růst snižuje na hodnotu mezi 20–23 °C. G-ALEGRÍA et al. (2004) zjistili, že jak Oenococcus oeni, tak Lactobacillus plantarum jsou schopny malolaktické aktivity při 18 °C, ale při teplotách pod tuto hodnotu je oddálen nástup MLF a prodlužuje se délka MLF. Teplota nižší než 16 °C blokuje růst Oenococcus oeni a vede k poklesu buněčné aktivity. CHU-KY et al. (2005) dodávají, že ačkoliv mají nízké teploty od 8 do 14 °C vliv na plazmatickou membránu, nemá to vliv na schopnost přežívání buněk. Aby bylo zajištěno rychlé zahájení a dokončení MLF, je nezbytné kontrolovat teplotu během MLF, která by měla být udržována na 18–22 °C, aby byla zajištěna optimální malolaktická aktivita MB.
Obr. 5 Vliv teploty na množství kyseliny jablečné ve víně během vinifikace. Během AF při 15 °C a MLF při 15 °C ( ), 22 °C ( ) a 27 °C ( ). (HERRERO et al., 1998)
15
3.2.5 NUTRIČNÍ POŽADAVKY
Kromě fyzikálních parametrů jako je etanol, pH, SO2 a teplota, je stav živin ve víně velmi důležitým ukazatelem v úspěšnosti MB provést MLF. Dostupnost některých živin je proto nezbytně nutná. MB jsou velmi náročné na nutriční požadavky v důsledku jejich
omezených
biosyntetických
schopností.
(THÉODORE
et
al.,
2005)
FUGELSANG & EDWARDS (1997) například poukazují na neschopnost MB využít hydrogenfosforečnanu diamonného jako zdroje dusíku. Jedním z hlavních prvků, které hrají roli v přežití MB v laboratorních podmínkách, je přítomnost aminokyselin. Je to s ohledem na omezenou schopnost biosyntézy aminokyselin MB. Oproti tomu systémy, které jsou zodpovědné za uvolnění aminokyselin pomocí hydrolýzy proteinu, jsou dobře vyvinuté. Bylo prokázáno, že MB jsou schopny uvolnit esenciální aminokyseliny, aby byly schopny přežít a uspokojily požadavky na růst. (MATTHEWS et al., 2004) Také bylo identifikováno několik zásadních aminokyselin pro MB: kyselina glutamová, valin, arginin, leucin, izoleucin, cystein a tyrosin. Jejich důležitost se může lišit v závislosti na bakteriálním kmenu. Dřívější studie také zjistila potřebu dalších nezbytných sloučenin pro růst bakterií: kyselina nikotinová, riboflavin, kyselina pantotenová, tiamin, pyridoxin. Mnoho druhů také vyžaduje purin a kyselinu listovou. (DU PLESSIS, 1963)
Graf 1 Změny v koncentraci zbytkových aminokyselin ve víně. Stanoveno z kalů na konci exponenciální růstové fáze L. plantarum. (FABIANA, 2007)
16
Vína s nízkým stavem živin mohou v průběhu MLF vykazovat zátěž pro růst bakterií. Tato situace může být umocněna kvasinkami, které během AF spotřebují většinu přítomných živin nebo produkují vyšší koncentrace SO2 do prostředí. Jeví se jako výhodné, inokulovat kvasinky a MB současně nebo potřebné živiny dodat ve formě preparátů z buněčných stěn kvasinek a vitaminových preparátů. Výběr kmenu kvasinek a bakterií je důležitým nástrojem k odvrácení budoucích problémů s nutričním stavem hroznového moštu či vína. (JUSSIER et al., 2006)
3.2.6 FENOLICKÉ SLOUČENINY
Množství fenolických sloučenin obsažených v hroznech a víně je kultivarově specifické, stejně jako je závislé na vinifikačních postupech. Interakce mezi MB a fenolickými sloučeninami je ovlivněna různými faktory včetně kmene MB, dále typem a koncentrací fenolické sloučeniny přítomné ve víně. Vzhledem k této interakci mohou mít fenolické sloučeniny vliv na iniciaci, jakož i na průběh MLF. Mezi hlavní sloučeniny, které mohou být transformovány různými MB, patří hydroxyskořicové kyseliny a jejich deriváty,
flavonoly
a
jejich
glykosidy,
flavanol
monomery
a
oligomery,
trans-resveratrol a jeho glukosid. (HERNÁNDEZ et al., 2006) Fenolické sloučeniny mohou mít vliv na bakteriální metabolismus, kde některé fenolické kyseliny inhibují růst MB, zatímco jiné růst stimulují. GARCÍA-RUIZ et al. (2008) tvrdí, že metabolismus MB není inhibován množstvím 100–250 mg.l-1 fenolických sloučenin, oproti inhibiční koncentraci vyšší než 500 mg.l-1. Mechanismy, kterými fenolické sloučeniny inhibují MB, nejsou zcela jasné. Jako možná se jeví interakce fenolických sloučenin s buněčnými enzymy a adsorpce fenolů do buněčných stěn. Fenolické sloučeniny by mohly být příčinnou ztráty draselných iontů, kyseliny glutamové nebo intracelulární RNA. Také mohou způsobovat změnu ve složení mastných kyselin. (ROZÈS & PEREZ, 1998) Fenolické sloučeniny mohou mít také stimulační účinek na MB. Volné antokyany a jiné fenolické sloučeniny (např. kyselina gallová) jsou schopny stimulovat růst buněk a degradaci kyseliny jablečné MB. Fenolkarboxylové kyseliny a katechin, zdá se, stimulují růst Oenococcus oeni tím, že podporují metabolismus kyseliny citronové a redukují tak počáteční lag fázi MB. (VIVAS et al., 1997) ROZÈS & PEREZ (1998) poznamenávají, že koncentrace 50 mg.l-1 fenolických sloučenin je stimulační pro růst Oenococcus oeni. Tento stimulační účinek je možné připsat ochranné roli bakteriálních buněk fenolickými sloučeninami vůči etanolu, ale také 17
skutečnosti, že fenolické sloučeniny snižují redoxní potenciál ve víně, a tím podporují růst MB. Fenolické sloučeniny mají vliv na metabolickou aktivitu a růst buněk v závislosti na typu sloučeniny, její koncentraci, stejně jako na kmenu MB.
3.2.7
INTERAKCE MEZI KVASINKAMI A MLÉČNÝMI BAKTERIEMI
Aby měl vinař maximální kontrolu nad AF a MLF, je důležité, vybrat vhodné kvasinky a bakterie mléčného kvašení. Interakce mezi bakteriemi a kvasinkami v průběhu AF nebo MLF bude mít přímý vliv na růst MB a malolaktickou aktivitu. (OSBORNE & EDWARDS, 2006) ALEXANDRE et al. (2004) navrhli rozložit tyto složité vztahy do tří kategorií.:
V první kategorii, dle NEHME et al. (2008) bylo zjištěno, že se míra inhibice mezi Saccharomyces cerevisiae a Oenococcus oeni odvíjí od vybraných kmenů kvasinek a bakterií a že inhibice koreluje se snížením bakteriálního růstu, spíše než s poklesem malolaktické aktivity MB. Druhým faktorem je příjem a uvolňování živin kvasinkami, které jsou opět k dispozici po autolýze kvasinek, tentokráte MB. Na začátku a během AF jsou Oenococcus oeni inhibovány kvasinkami v důsledku jejich rychlého nástupu a spotřebě živin jako jsou např. steroly, aminokyseliny a vitamíny. V této fázi je živin v prostředí tak málo, že růst bakterií je posunut až do autolýzy kvasinek. Během autolýzy se uvolňují aminokyseliny, peptidy, proteiny, glukany a manoproteiny. Manoproteiny, zdá se, mají velký význam, neboť jejich uvolnění může stimulovat růst bakterií. Děje se tak adsorpcí mastných kyselin se střední délkou řetězce uhlíku na manoproteiny a tím dochází k detoxikaci vína (Obr. 6). (GUILLOUX-BENATIER & CHASSAGNE, 2003) Tab. 1 Inhibiční účinek kvasinkových metabolitů na MB (LERM et al., 2010) kvasinkový metabolit
vliv na MB nebo MLF
etanol
vliv na růst MB než na malolaktickou aktivitu
SO2
inhibice MLF
mastné kyseliny se střední délkou řetězce
ovlivňují růst MB a snižují schopnost metabolizovat kyselinu jablečnou. Kombinace MK (hexanové, oktanové a dekanové) způsobují větší inhibici než jednotlivé sloučeniny peptid produkovaný S. cerevisie během AF inhibuje O. oeni narušením buněčné membrány, inhibice je závislá na SO2
metabolity bílkovinné povahy
18
Obr. 6 Vliv kvasinkových manoproteinů na růst Oenococcus oeni (JACKSON, 2008) U třetího faktoru je třeba zvážit, mají-li kvasinky schopnost produkovat metabolity, které mohou mít buď stimulační, nebo inhibiční (toxický) účinek na MB. Existuje celá řada inhibičních sloučenin produkovaných kvasinkami včetně etanolu, SO2, mastných kyselin se střední délkou řetězce a proteinů. První tři jsou sloučeniny nejčastěji studované s ohledem na inhibici růstu MB. (ALEXANDRE et al., 2004) OSBORNE & EDWARDS (2006) zjistili, že peptid produkovaný Sacharomycces cerevisiae inhibuje Oenococcus oeni. Dále uvádějí, že tato inhibice je závislá na SO2. Tab. 1 poskytuje přehled hlavních inhibičních sloučenin produkovaných kvasinkami.
19
3.3
VLIV METABOLISMU MLÉČNÝCH BAKTERIÍ NA ANALYTICKÉ A SENZORICKÉ PARAMETRY BÍLÝCH VÍN
Bakteriální buňka, stejně jako každý jiný živý organismus, je otevřený systém vyměňující s okolím hmotu, energii a informaci. Hmota je přijímána ve formě jednoduchých živin a přebudována ve složité biomolekuly a organizované struktury buňky, a v ještě jednodušší zplodiny metabolismu. Hmota, energie a informace jsou živým systémem na vstupech přijímány, uvnitř systému transformovány a na výstupech systému vyslány do prostředí. Tento tok hmoty, energie a informace živým systémem je možno nazvat metabolismem. Jeho celkovou výslednicí je výkon životních funkcí organismu včetně té nejvyšší, autoreprodukce systému. (BEDNÁŘ et al., 1996) Ze všech metabolických činností, které bakterie mléčného kvašení mohou ve víně uskutečňovat, je nejvíce důležitá či žádoucí degradace kyseliny jablečné cestou MLF. Značné důsledky má z vinařského pohledu tedy transformace kyseliny jablečné, ale je též zřejmé, že MB metabolizují i jiné substráty ve víně, aby bylo zajištěno jejich množení. Mezi tyto substráty patří kyselina citronová a vinná, cukry, glycerin, některé aminokyseliny atd. Následuje popis některých metabolických transformací, které získaly největší pozornost v literatuře, nebo které mají významný dopad na víno při jeho výrobě. (MORENO-ARRIBAS et al., 2005)
3.3.1 METABOLISMUS ORGANICKÝCH KYSELIN
Schopnost metabolizovat organické kyseliny je obecně rozšířená mezi MB, které se vyvíjejí po alkoholovém kvašení a může vést k velkému počtu a rozmanitosti organoleptických změn.
METABOLISMUS KYSELINY JABLEČNÉ
Přestože kyselina jablečná stimuluje růst Oenococcus oeni, byl biochemický přínos MLF pro mléčné bakterie dlouho záhadou. Nicméně se přišlo na to, že na základě chemiosmotické teorie MB vyrovnávají protonový gradient (rozdíl koncentrací vodíkových kationtů H+) skrz buněčnou membránu. Tento přechod protonů umožňuje vznik energie ATP. Za normálních podmínek je vyšší koncentrace H+ v okolí buňky,
20
než v jejím nitru. Jak proton (H+) putuje koncentračním spádem z vyšší do nižší koncentrace přes membránu do buňky, prochází přes ATPázu, která umožňuje bakteriím vytvářet molekulu ATP z ADP a anorganického fosfátu. Transformace kyseliny L-jablečné je hlavní reakce MLF. Doprava kyseliny L-jablečné do buňky je zprostředkována malát permeázou. Nahromaděná kyselina L-jablečná se enzymaticky dekarboxyluje na kyselinu L-mléčnou a CO2. V reakci je vyžadován jeden proton. Je prokázáno, že MLF přináší syntézu ATP díky schopnosti buňky vyloučit laktát a protony (prostřednictvím pasivní difúze). Spotřeba protonu v cytoplasmě vytváří pH gradient a změnu elektrického potenciálu, což vede k dalšímu membránovému transportu Přeměna
protonů kyseliny
a
tvorbě
jablečné
na
ATP.
(FUGELSANG
mléčnou
je
&
biochemický
EDWARDS, výsledek
1997) aktivity
malolaktického enzymu, který je charakteristický pro MB. Tato transformace má dvojí účinek. Na jedné straně je snížena kyselost vína, na druhé se zvýší pH. Tento účinek je větší při vyšším počátečním množství kyseliny jablečné. MLF dává vínu jemnější chuť. Nahradí kyselou a svíravou chuť kyseliny jablečné sametovým, kulatým a harmonickým tónem kyseliny mléčné. MLF takto mění organoleptický charakter vína, proto je obzvláště doporučována pro většinu červených a mnoho bílých vín. Malolaktický enzym je dimerní protein a skládá se ze dvou identických podjednotek. Funguje pouze v přítomnosti kofaktoru NAD+ a dvojmocných iontů. Mn2+ je nejúčinnější. Jeho aktivita je indukována reakcí, jejímž substrátem je kyselina jablečná. (MORENO-ARRIBAS et al., 2009)
Obr. 7 Výroba energie (ATP) v Oenococcus oeni prostřednictvím konverze kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou a CO2. (FUGELSANG & EDWARDS, 1997)
21
METABOLISMUS KYSELINY CITRONOVÉ
Některé MB (heterofermentativní koky i homofermentativní bacily) degradují kyselinu citronovou. Mezi tyto druhy vyskytující se ve víně patří L. plantarum, L. casei, O. oeni a L. mesenteroides. Existují kmeny a druhy MB, které neodbourávají kyselinu citronovou, protože jsou deficitní na první enzym metabolické cesty: citrát lyázu. Největší množství tohoto enzymu je syntetizováno při nízké koncentraci cukru ve víně obsahujícího kyselinu citronovou. Glukóza v tomto případě působí jako represor. Rozcestníkem metabolismu kyseliny citronové je pyruvát, který je prekurzorem: •
Acetoinových sloučenin (diacetyl, acetoin a 2,3-butandiol)
•
Laktátu (pokud je k dispozici koenzym NADH)
•
Etanolu (dekarboxylací pyruvátu a následnou redukcí etanalu)
•
Mastných kyselin a lipidů (činností acetylkoenzymu A)
•
Acetátu (činností acetylkoenzymu A)
Obr. 8 Metabolická cesta degradace kyseliny citronové mléčnými bakteriemi (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006)
22
Z uvedeného plyne, že metabolismus kyseliny citronové produkuje různorodé sloučeniny. Dá se ovšem říci, že v omezené koncentraci glukózy, nízkém pH a přítomnosti růstových inhibitorů, je kyselina citronová přednostně využívána k tvorbě acetoinových sloučenin. Acetoinové sloučeniny jsou produkovány při stíženém růstu bakterií, které se tak snaží o detoxikaci. Aby udržely své intracelulární pH, musí odstranit pyruvát.
Produkci ostatních sloučenin do značné míry určují faktory
ovlivňující růstové podmínky. Pokud je růst bakterií snadný, pyruvát se využije na syntézu mastných kyselin a kyselina octová je vyráběna ve velkém množství. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006)
METABOLISMUS KYSELINY VINNÉ
MB mohou ve víně degradovat také kyselinu vinnou. Tento metabolismus se liší od jablečného i citronového tím, že jde vždy o skutečné bakteriální znehodnocení vína, které je doprovázeno zvýšením obsahu těkavých kyselin. Mezi tyto bakterie nejčastěji patří laktobacily, resp. L. plantarum a L. brevis. Degradace může být celková nebo částečná, v závislosti na úrovni bakteriálního rozvoje. Vždy ovšem snižuje kvalitu vína. Toto znehodnocení je vzácné, protože kmeny bakterií, které jsou schopny degradovat kyselinu vinnou, se zdají být relativně málo početné. Pokud má víno vyšší pH, může to být příznivé pro navyšování populace bakterií. Kromě toho, jsou tyto bakterie citlivé na SO2. Proto by mělo být dostatečné, respektovat pravidla hygieny ve sklepě a víně, aby se tomuto problému dalo vyhnout. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006)
3.3.2
METABOLISMUS CUKRŮ
Mléčné bakterie jsou obligátně fermentativní a nemohou získat energii oxidačními nebo respiračními procesy. Hlavní způsob, jakým bakterie získávají ATP je fosforylace substrátů nacházejících se ve víně.
HOMOFERMENTATIVNÍ METABOLISMUS HEXÓZ
Homofermentativní bakterie k zisku energie využívají hexózy, nejčastěji glukózy. Metabolická dráha (glykolýza či Embden-Meyerhofova dráha) probíhá v buňkách MB a
23
téměř výhradně produkuje kyselinu mléčnou jako konečný produkt za standardních podmínek. Glykolýza je charakterizována vytvořením fruktózo-1,6-difostátu, který je rozdělen prostřednictvím fruktóza-1,6-difostát aldolázy na dihydroxyacetonfosfát a glyceraldehyd-3-fostát. Posledně zmíněný je dále převeden až na pyruvát. Za normálních podmínek (tj. dostatek cukru a omezené množství kyslíku) je pyruvát redukován na výsledné 2 molekuly kyseliny mléčné (Obr. 9 A.). (HORNSEY, 2007)
Obr. 9 Dvě hlavní cesty fermentace glukózy bakteriemi mléčného kvašení: (A) homofermentativní cesta (glykolýza), (B) heterofermentativní cesta (6-fosfoglukonátová cesta). Vybrané enzymy určují čísla: 1. Glukokináza, 2. Fruktózo-1,6-difosfát aldoláza, 3. Glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenáza, 4. Pyruvátkináza, 5. Laktátdehydrogenáza, 6. Glukózo-6-fosfátdehydrogenáza, 7. 6-fosfoglukonátdehydrogenáza, 8. Fosfoketoláza, 9. Acetaldehyddehydrogenáza, 10. Alkoholgehydrogenáza (HORNSEY, 2007)
24
HETEROFERMENTATIVNÍ METABOLISMUS HEXÓZ Heterofermentativní zpracování
hexóz.
mléčné
bakterie
Klíčovým
využívají
bodem
této
6-fosfoglukonátovou metabolické
dráhy
cestu je
ke
tvorba
xylulózo-5-fosfátu, který je dále rozdělen na dva meziprodukty: glyceraldehyd-3-fostát (tento je následně metabolizován cestou glykolýzy jako je tomu u homofermentativních bakterií až na kyselinu mléčnou) a acetylfostát (redukuje se na etanol pomocí acetylkoenzymu A a aldehydu). Tato metabolická cesta vede k produkci i jiných produktů, než jenom kyseliny mléčné. Tvoří se například etanol, kyselina octová, CO2, glycerol, případně manitol apod. (Obr. 9 B). (HORNSEY, 2007)
METABOLISMUS PENTÓZ
Některé kmeny Lactobacillus, Pediococcus nebo Leuconostoc zkvašují pentózy, jako je ribóza, arabinóza a xylóza, ať jsou homofermentativní nebo heterofermentativní (Obr. 10). Pentózy jsou fosforylovány za přítomnosti kinázy a využitím ATP. Specifické isomerásy pak vedou metabolickou dráhu ke vzniku xylulózo-5-fosfátu. Následující reakce jsou totožné s metabolismem hexóz heterofermentativních bakterií. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006)
Obr. 10 Metabolismus pentóz mléčných bakterií (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006) 25
3.3.3
ACETOINOVÉ SLOUČENINY
Mléčné bakterie jsou dobře známé pro svou schopnost produkovat diacetyl, acetoin a 2,3-butandiol. Jak již bylo řečeno, tyto sloučeniny pocházejí z metabolismu kyseliny citronové a mají značný význam pro aromatický profil vína. Diacetyl (2,3-butandion) je považován za jednu z nejvýznamnějších aromatických sloučenin, produkovaných během MLF. Je to diketon, který je charakterizován máselným, ořechovým, karamelovým nebo toustovým aroma. I když malé množství diacetylu (0,2–0,3 mg.l-1) může být vyrobeno kvasinkami při alkoholovém kvašení, další navýšení obsahu diacetylu je obvykle spojeno s růstem MB a MLF. Senzorický práh detekce diacetylu je nízký (0,2–2,3 mg.l-1) a závisí na stylu vína. V závislosti na stylu a typu vína přispívá diacetyl v malých množstvích (1–4 mg.l-1) svým máselným charakterem k složitosti aroma a ve víně je považován za žádoucí. Nicméně koncentrace nad 5–7 mg.l-1 mohou působit škodlivě na kvalitu vína, které má pak máselné aroma až po zkaženém zelí. Diacetyl může být tvořen jako meziprodukt metabolismu kyseliny citronové při redukční dekarboxylací kyseliny pyrouhličité na diacetyl prostřednictvím acetolaktátu. (BOU et al., 2005) Vzhledem k tomu, je diacetyl chemicky nestabilní a může být dále redukován aktivními buňkami Oenococcus oeni nebo kvasinkami prostřednictvím diacetylreduktázy na méně aromatický acetoin a 2,3-butandiol. Acetoin a 2,3-butandiol mají vyšší práh detekce, přibližně 150 mg.l-1 a 600 mg.l-1 v daném pořadí a přispívají tak k máselnému aroma v nižším rozsahu. Mikrobiální tvorba diacetylu je dynamický proces a jeho koncentrace ve víně, je závislá na několika faktorech: bakteriálním kmenu, pH, stupni provzdušnění, SO2, kontaktu s kvasnicemi, koncentraci kyseliny citronové a cukrů, teplotě a velikosti populace (viz Tab. 2). (MORENO-ARRIBAS et. al., 2009) Metabolismus kyseliny citronové začíná na konci MLF, kdy je většina kyseliny jablečné metabolizována na kyselinu mléčnou. To znamená, že maximální koncentrace diacetylu je tvořena ve fázy, kdy je kyselina jablečná téměř vyčerpána. (LERM et al., 2010)
26
Obr. 11 Degradace kyseliny citronové a tvorba diacetylu, acetoinu a 2,3-butandiolu během MLF (SAUVAGEOT et al., 1997)
Tab. 2 Vliv různých faktorů výroby vína na obsah diacetylu (BARTOWSKY, HENSCHKE, 2004) Účinek na obsah diacetylu a senzorický Faktory výroby vína vjem Kmen MB při MLF
O. oeni se liší v produkci diacetylu
Typ vína
Červená vína jsou méně citlivá než bílá
Množství inokula MB
Nižší inokulum než 104 /ml zvyšuje tvorbu diacetylu
Kontakt vína s kvasnicemi
Snižuje obsah diacetylu ve víně
Hladina SO2 v průběhu MLF
SO2 váže diacetyl, sníží senzorický vjem (reakce je reverzibilní)
Hladina kyseliny citronové
Podporuje vznik diacetylu
Teplota během MLF
18–25 °C může podpořit vznik diacetylu
pH vína během MLF
Nižší pH podporuje vznik diacetylu
Hladina sacharidů
Zbytkový obsah sacharidů může snížit obsah diacetylu
Kontakt vína s kyslíkem během MLF
Podporuje vznik diacetylu
27
3.3.4 METABOLISMUS FENOLICKÝCH SLOUČENIN
Aromatický charakter vína může negativně ovlivňovat tvorba těkavých fenolů. Tento účinek se projevuje zejména u bílých odrůd, u nichž často hnědne slupka. Následně se objevuje hořká a tříslovitá chuť a bývá ovlivněna i barva. Hnědnutí slupky u bílých odrůd poukazuje na vyšší obsah fenolických látek, zejména hydroxyskořicových kyselin. Kyselina ferulová, kumarová, fertarová a koutarová jsou hlavními prekurzory těkavých fenolů. (PAVLOUŠEK, 2011) Tyto prekurzory obsažené v hroznech se během zpracování hroznů dostávají i do vína, kde mohou být použity jako substrát MB k tvorbě těkavých fenolů. MB jsou schopny využít aktivního transportního mechanismu pro přenos fenolických kyselin do buňky, kde hydroxycinamát dekarboxyláza přeměňuje hydroxyskořicové kyseliny do formy vinylfenolů (4-vinylguajakol a 4-vinylfenol), které jsou poté ve druhé enzymatické reakci redukovány na etylfenoly (4-etylguajakol a 4-etylfenol), viz Obr. 12. (CAVIN et. al., 1993; SWIEGERS et. al., 2005) Vinylfenoly se zpravidla vytvářejí v bílém víně a projevují se jako lékárenská, plastová či připálená vůně. Na jejich tvorbě se podílejí i kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Enzymy podílející se na tvorbě etylfenolů, jsou přítomny ve velkém množství bakterií, hub a kvasinek. Etylfenoly se nacházejí spíše v červených vínech, která zrála v dřevěných sudech. Jejich aromatický projev lze popsat jako koňský pot, pach kůže, venkovský dvorek. Tyto typy aroma jsou obecně spojovány především s přítomností kvasinek Brettanomyces. (PAVLOUŠEK, 2011) NELSON (2008) uvádí, že MB jsou schopny produkce značného množství těkavých fenolů. Bylo též zjištěno, že spontánní MLF má za následek vyšší hladiny těkavých fenolů. Navzdory tomu, že byla zjištěna produkce těkavých fenolů u MB, není stále zřejmé, zda kmen Oenococcus oeni je schopen tvorby takového množství těkavých fenolů, které by mohly být senzoricky významné.
Studie týkající se metabolismu fenolických kyselin, naznačují schopnost produkce těkavých fenolů několika druhy MB. Jsou to především laktobacily a pediokoky. Ne vždycky jsou těkavé fenoly zodpovědné za znehodnocení vína. Záleží na jejich koncentraci. K pozitivnímu vnímání těkavých fenolů, které obohacují víno, přispívá např. kouřové, dřevité či kořenité aroma. (CAMPOS et. al., 2003)
28
Obr. 12 Tvorba těkavých fenolických sloučenin z hydroxyskořicových kyselin. (FUGELSANG & EDWARDS, 1997) 3.3.5
METABOLISMUS POLYOLŮ
Je známo, že některé laktobacily, jsou schopné degradovat glycerol a mannitol, dva hlavní polyoly ve víně. Ukázalo se, že L. brevis a L. buchneri izolované ze zkaženého vína, mohou metabolizovat glycerol v přítomnosti glukózy a fruktózy, což vede ke vzniku 3-hydroxypropanalu (3-hydroxypropionaldehyd, 3-HPA). (LIU, 2002) Tato sloučenina se spontánně rozpadá na akrolein. Sloučením fenolů s akroleinem pak vznikají látky, které chutnají hořce. Mluví se o zhořknutí vína (Obr. 13). V pozdější fázi nastávají makroskopické změny, jako jsou sraženiny barvy, usazeniny na dně a zákaly. (EDER et al., 2006)
Metabolismus fruktóz heterofermentativních MB, kam patří i Oenococcus oeni, může vést k tvorbě mannitolu, alkoholickému cukru s šesti uhlíky. Ve víně znehodnoceném mannitolem se obvykle nacházejí další doprovodné metabolity MB: kyselina octová, kyselina D-mléčná, n-propanol a 2-butanol. Takto zkažené víno může být vnímáno jako slizké s jemně nasládlou chutí. Mannitol je obvykle produkován ve vínech s vyšší úrovní zbytkového cukru, která podstoupí MLF. (LIU, 2002)
29
Obr. 13 Degradace glycerolu mléčnými bakteriemi (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006) 3.3.6
HYDROLÝZA GLYKOSIDŮ
Mnohé volatilní aromatické látky jsou přítomny ve vazbě na cukry. Tyto sloučeniny jsou nevolatilní v této glykosidické formě a představují rezervoár potenciálních aromatických látek, které mohou přispět k aroma vína, jsou-li uvolněny z této vazby. Tyto potenciální volatilní látky a důležité smyslové sloučeniny zahrnují monoterpeny, C13-norisoprenoidy, deriváty benzenu a alifatické sloučeniny. MB a především Oenococcus oeni prokazují glykosidickou aktivitu a uvolňují tak tyto volatilní sloučeniny z glykosidické vazby. Uvolněné volatilní sloučeniny, se poté stávají senzoricky aktivními. (SEFTON et al., 1993) GRIMALDI et al. (2000) zjistili pokles koncentrace všech glykosidů a navýšení volných volatilních sloučenin ve víně po MLF provedené bakteriemi Oenococcus oeni. Oproti tomu McMahon et al. (1999) nenalezli glykosidickou aktivitu u komerční kultury Oenococcus oeni. To by mohlo znamenat, že kultivar ovlinňuje aktivitu enzymu zodpovědného za uvolňování aromatických látek. Míra, do jaké se uskuteční enzymatická hydrolýza, je nejspíše závislá také na bakteriálním kmenu, chemické struktuře substrátu a fázi růstu MB. Glykosidická činnost je také ovlivněna hodnotou pH, teplotou, cukry a etanolem. Kyselé podmínky panující ve víně mohou denaturovat nebo inhibovat enzymatickou aktivitu. Nicméně Oenococcus oeni si zachovávají svou β-glukosidickou aktivitu až do 80 % při pH 3,5. (GRIMALDI et al., 2000) 30
3.3.7
VOLATILNÍ SLOUČENINY SÍRY
Volatilní sloučeniny síry významně přispívají k senzorickým vlastnostem vína svým charakteristickým aroma. Některé ovlivňují negativně kvalitu vína (např. sirovodík, metantiol či etantiol), zatímco ostatní sloučeniny mají pozitivní vliv na vinné aroma (např. dimetyldisulfid, metional) nebo přispívají k odrůdovému aroma vína (např. některé volatilní tioly). (MALHERBE, 2010) Přesný mechanismus a biochemické cesty zodpovědné za metabolismus síry MB, není doposud zcela objasněn. VALLET et al. (2008) popsali možnou metabolickou dráhu metioninu, který stojí za tvorbou volatilních sloučenin síry během MLF. Z výsledků vyplývá, že všechny kmeny Oenococcus oeni a některé laktobacily testované v syntetickém médiu, byly schopny metabolizovat aminokyselinu metionin na metantiol, dimetyldisulfid, metionol a 3-(metylsulfanyl) propionovou kyselinu. Stejně jako většina volatilních sloučenin síry mohou také tyto látky přispívat k příjemnému či nepříjemnému aroma vína v závislosti na jejich povaze a koncentraci. PRIPIS-NICOLAU et al. (2004) stanovili koncentrace 3-(metylsulfanyl) propionové kyseliny na základě senzorických vlastností. Zatímco koncentrace 50 µg.l-1 byla ve víně vnímána jako čokoládová a pražená vůně, koncentrace 244 µg.l-1 se projevovala zemitými tóny a vůní červeného ovoce.
Tvorba sirných sloučenin hraje důležitou roli ve složitosti vinného aroma. Jejich charakteristika a senzorické vlastnosti jsou uvedeny v Tab. 3. Vyšší koncentrace těchto sloučenin negativně ovlivňují vůni vína, zato koncentrace pod nebo blízké prahové detekci přispívají k aromatické složitosti vína. Koncentrace metantiolu a metionolu nad jejich práh vnímání, jsou obvykle spojeny s redukční pachutí. Produkce těchto volatilních sloučenin síry je závislá na kmenu, stejně jako rodu MB. Dle poznatků vytváří Oenococcus oeni více těchto sloučenin v porovnání s druhy laktobacilů. (PRIPIS-NICOLAU et al., 2004)
Existují různé faktory, které ovlivňují produkci těchto sloučenin síry, včetně přítomnosti metioninu jako prekurzoru a fáze růstu MB. VALLET et al. (2008) konstatují, že produkce metionolu nastala během exponenciální fáze růstu MB, zatímco tvorba 3-(metylsulfanyl) propionové kyseliny nastává v exponenciální i stacionární fázi růstu.
31
Tab. 3 Čtyři hlavní volatilní sloučeniny síry produkované MB během MLF a jejich potenciální přínos pro vinné aroma. (LERM et al., 2010) Sloučenina
Aroma
Prekurzory
metantiol
vařené zelí, cibule vařené zelí, cibule květák, zelí čokoláda, pražený tón
metionin
2,1–5,1
Práh vnímání (ppb) 0,3
metantiol
2
15–29
metionin
140–5000
500
metionin
0–1811
244
dimetyldisulfid 3-(metylsulfanyl) propan-1-ol 3-(metylsulfanyl) propionová kyselina
3.3.8
Koncentrace ve víně (ppb)
SLOUČENINY OBSAHUJÍCÍ DUSÍK
Mléčné bakterie jsou schopné produkovat heterocyklické těkavé dusíkaté báze, které jsou zodpovědné za zkažení vína. Je-li víno znehodnoceno těmito látkami, mluví se o tzv. myšině. Myšina se ve víně projevuje narušením aroma a zápachem po myších výkalech. Víno má mdlou chuť a myšina je cítit na jazyce a na patře. Častým doprovodným jevem myšiny je vyšší obsah těkavých kyselin. Náchylná jsou hlavně mladá vína s nižším obsahem kyselin a etanolu, která leží delší dobu na kalech při vyšší teplotě. Nemoc způsobují především bakterie Lactobacillus brevis a Lactobacillus cellobiosis, ale i kvasinky Brettanomyces. (EDER et al., 2006) Některé heterocyklické sloučeniny dusíku mohou být tvořeny MB prostřednictvím metabolismu některých aminokyselin. Jedná se zejména o lysin a ornitin. Mezi významné senzorické heterocyklické
dusíkaté
báze
patří:
2-acetyltetrahydropyridin
(ACTPY),
2-acetyl-1-pyrrolin (ACPY) a 2-etyltetrahydropyridin (ETPY). Práh vnímání těchto senzoricky účinných sloučenin je 1,6 µg.l-1 pro ACTPY (stanoveno ve vodě) a 0,1 µg.l-1 pro ACPY (stanoveno ve víně). ETPY byl senzoricky detekovatelný od koncentrace 150 µg.l-1 ve víně. Vína postižená tímto defektem mohou obsahovat jednu skupinu sloučenin nebo se jedná o kombinaci všech. (MALHERBE, 2010) SWIEGERS et al. (2005) pozorovali rozdíly v tvorbě různých heterocyklických sloučenin dusíku produkovaných MB. Heterofermentativní laktobacily produkovaly přednostně ACTPY. Oproti tomu O.oeni upřednostňovaly nejvíce syntézu ETPY, senzoricky nejméně aktivní sloučeniny. COSTELLO & HENSCHKE (2002) rovněž poukazují na významný vliv prekurzorů lysinu a ornitinu, ale také na stimulační účinek etanolu a acetaldehydu mající vliv na schopnost MB produkovat heterocyklické sloučeniny dusíku. 32
Mléčné bakterie jsou též schopny produkovat biogenní aminy a etylkarbamát. Rozklad argininu MB vede k produkci citrulinu a karbamoylfosfátu. Pokud tyto sloučeniny reagují s močovinou, která je produkována určitými kvasinkami během AF, může dojít k tvorbě karcinogenního etylkarbamátu. Dekarboxylace některých aminokyselin vede k tvorbě biogenních aminů jako je histamin, putrescin a kadaverin. Poslední dva jmenovaní pak mohou předat hnilobnou příchuť do nakaženého vína. (BOU et al., 2005)
Obr. 14 Schématické znázornění tvorby heterocyklických volatilních dusíkatých bází zapříčiňujících myšinu v buňce mléčné bakterie. (2-acetyltetrahydropyridin (ACTPY), 2-acetyl-1-pyrrolin (ACPY)) (SWIEGERS et al., 2005) 3.3.9
METABOLISMUS POLYSACHARIDŮ
Je známo, že některé druhy MB produkují deriváty glukózy odvozené z exocelulárních polysacharidů glukanu nebo dextranu, což vede ke zvýšení viskozity vína. Tomuto jevu se říká vláčkovatění. Sliz je vytvářen především bakteriemi kmenů Pediococcus a Lactobacillus. Jejich rozvoj nastává zvláště při vysokých hodnotách pH (nad 3,5) a při ležení vína na kvasnicích. (STEIDL et al., 2002)
Bylo zjištěno, že bakterie Pediococcus damnosus izolované z takového vína, vytvářejí β-D-glukany, které se skládají z opakujících se trisacharidů jednotek D-glukozy. MB jsou
také
schopny
degradace
polysacharidů
33
kromě
jejich
biosyntézy.
Bylo prokázáno, že Oenococcus oeni mají extracelulární β-1,3-glukanázovou aktivitu a mohou tak rozkládat polysacharidy jako je glukan. Nadměrné hladiny polysacharidů ve víně jsou nežádoucí z pohledu vysoké viskozity. Nicméně střední úrovně mohou být prospěšné, vzhledem k vlivu na senzorické vlastnosti vína, jako například pocit plnosti v ústech či zvýšení těla vína. (LIU, 2002)
Obr. 15 Struktura polysacharidu produkovaného Pediococcus damnosus (LONVAUD-FUNEL et al., 1991) 3.3.10 VYŠŠÍ ALKOHOLY Vliv MLF na koncentraci vyšších alkoholů se jeví jako neprůkazný. Řada studií neohlašuje žádné změny v koncentraci nebo nevýznamné navýšení koncentrací 1-propanolu, isobutanolu, isoamylalkoholu či 2-fenyletanolu v závislosti na použitém kmenu MB. Skutečnost, že MB mají omezenou schopnost produkovat vyšší alkoholy, může být výhodná, protože koncentrace vyšších alkoholů (nad 400 mg.l-1) dodává vínu agresivní vůni rozpouštědla. Naopak koncentrace nižší než 300 mg.l-1 přispívají ke složitosti a ovocnému aroma. (SWIEGERS et al., 2005)
3.3.11 LIPOLÝZA
Kvasinkami i MB mohou být produkovány volatilní mastné kyseliny s krátkým řetězcem v důsledku metabolismu mastných kyselin. Volatilní mastné kyseliny jsou tvořeny hydrolýzou tri-, di- a monoacylglycerolů (lipidů). I přes nízkou koncentraci ve víně mohou tyto látky negativně ovlivnit jeho kvalitu. Víno je pak cítit potem, zatuchle, žlukle či po sýru. Pozitivně přispívají k aromatickému profilu vína nižší koncentrace volatilních mastných kyselin a také estery, ketony a aldehydy od nich odvozené. (MATTHEWS et al., 2004)
34
MAICAS et al. (1999) poukazují na nevýznamný nárůst kyseliny isovalerové, isomáselné a hexanové po MLF, i když hladina kyseliny kaprinové a kaprylové byla vyšší. Tento fakt může být pozitivní vzhledem k tomu, že kyseliny isovalerová, isomáselná a hexanová jsou spojeny s nežádoucími pachy vína. Naopak LEE et al. (2009) zjistili, že Oenococcus oeni vyprodukovaly během MLF zvýšené množství kyselin isomáselné, isovalerové, hexanové a oktanové, což vedlo k znehodnocení vína. Ukazuje se, že vliv na produkci volatilních mastných kyselin má kmen MB. Lipolytické systémy MB ve víně zatím nejsou dobře popsány a je proto potřeba dalšího zkoumání. (LIU, 2002)
Obr. 16 Změna v aromatickém profilu volatilních mastných kyselin spojená s MLF. Barevně jsou odlišené různé bakteriální startovací kultury v odrůdě Pinotage. (před MLF, Enoferm alpha, Lalvin VP 41, Viniflora oenos, Viniflora CH 16) (MALHERBE, 2010)
35
3.3.12 KYSELINA OCTOVÁ
Kyselina octová je nejvýznamnější těkavou kyselinou vznikající při alkoholové i malolaktické fermentaci, a to jak kvantitativně, tak senzoricky. Práh detekce kyseliny octové ve víně je závislý na typu a stylu vína. Kyselina octová působí ve víně kysele, štiplavě a má octové aroma. To vše v koncentraci vyšší než 0,7 g.l-1. Nižší koncentrace v rozmezí 0,2–0,6 g.l-1 mohou přispět ke komplexnosti aroma. Nárůst kyseliny octové během MLF je obvykle od 0,1–0,2 g.l-1. Je tvořena hlavně v případech, kdy je MLF zahájena ještě před dokončením AF. MB jsou schopny kvasit hexózy, které ještě kvasinky nestačily prokvasit. Další významný nárůst kyseliny octové je spojován s metabolismem kyseliny citronové. Významnou měrou přispívá k obsahu kyseliny octové i rychlost MLF. Vyšší koncentrace této kyseliny jsou ve spojení s rychlejším průběhem MLF. (LERM et al., 2010)
3.3.13 ESTERY
Estery jsou tvořeny esterifikací alkoholu a karboxylové kyseliny za vyloučení molekuly vody. Děje se tak enzymaticky nebo v důsledku chemické esterifikace při stárnutí vína. Tato skupina sloučenin je kvalitativně jednou z nejdůležitějších volatilních látek ve víně.
Enzymatická
syntéza
esterů
je
katalyzována
esterázami,
lipázami
a
alkoholacetyltransferázami, které jsou produkovány mikrobiálním metabolismem (především kvasinkami). (MAICAS et al. 1999) Také MB přispívají k tvorbě esterů díky své enzymatické aktivitě, která může syntetizovat nebo hydrolyzovat estery v závislosti na bakteriálním kmenu, kultivaru hroznů a fermentačních podmínkách. MLF je obecně spojená se zvýšenou koncentrací především dietylsukcinátu a etyllaktátu. Další významné etylestery vytvářené MB jsou etylacetát, etylhexanoát a etyloktanoát a další (Obr. 17). (SWIEGERS et. al., 2005) Etyllaktát je esterifikační produkt etanolu a laktátu, tvořeného MB během MLF. Tato sloučenina má pozitivní vliv na aromatický profil vína díky své ovocné, máslové či smetanové vůni. Stejně tak přispívá k pocitu plnosti v ústech. LLORET et al. (2002) určili práh vnímání aroma etyllaktátu ve víně na 110 mg.l-1. Vína, ve kterých neproběhla MLF měla hladinu etyllaktátu 5–8 mg.l-1, oproti vínům s 90–150 mg.l-1 etyllaktátu, kde byla MLF úspěšně provedena.
36
Dietylsukcinát vzniká pro změnu neenzymatickou esterifikací etanolu a kyseliny jantarové,
která
je
tvořena
jako
vedlejší
produkt
metabolismu
kvasinek.
Tento ester přispívá k ovocnému a melounovému aroma vína. Jeho práh detekce je 1,2 mg.l-1. Z uvedeného je zřejmé, že MB stojí za přítomností široké škály esterů ve víně. MB proto mají velký potenciál přispívat k vinnému aroma. (LIU, 2002)
Obr. 17 Změna v aromatickém profilu esterů spojená s MLF. Barevně jsou odlišené různé bakteriální startovací kultury v odrůdě Shiraz. (před MLF, Enoferm alpha, Lalvin VP41, Viniflora oenos, Viniflora CH16) (MALHERBE, 2010) 3.3.14 METABOLISMUS ACETALDEHYDU
Hlavní produkt metabolismu kvasinek je acetaldehyd, což je kvantitativně nejhojnější aldehyd přítomný ve víně a představuje 90 % z celkové koncentrace aldehydů. Má důležitou roli ve vztahu ke stárnutí vína, stálosti barvy a senzorickým vlastnostem vína. Koncentrace acetaldehydu ve víně se pohybuje v rozmezí 10 až 200 mg.l-1. Práh jeho senzorického vnímání je 500 µg.l-1. V těchto koncentracích přispívá k aroma vína příjemnou ovocností a ořechovou vůní. Při vyšším obsahu se ale podílí na zeleném, travnatém a oxidačním aroma nebo vůni po zeleném jablku. (MALHERBE, 2010) Během MLF lze obecně snížit koncentraci acetaldehydu, ale i jiných karbonylových sloučenin. Ukazuje se, že některé kmeny MB, zejména Oenococcus oeni a laktobacily,
37
mají schopnost metabolizovat jak volný, tak i acetaldehyd vázaný na SO2. Výsledkem metabolismu acetaldehydu je především etanol a kyselina octová. Dále bakteriální degradace acetaldehydu vázaného na SO2 zvyšuje hladinu volného SO2. Takto uvolňovaný SO2 se ovšem může dostat až na koncentraci, která by mohla inhibovat MB, což může vést až ke stagnaci MLF. I ostatní karbonylové sloučeniny mohou být potenciálně metabolizovány MB. (BOU et al., 2005) Kromě acetaldehydu se ve víně vyskytuje i velké množství dalších aldehydů, většinou přítomných ve stopovém množství (Tab. 4). Studie týkající se senzorických vlastností aldehydů, poukazují na to, že aldehydy s 8–10 atomy uhlíku (např. E-2-nonenal, octanal, nonanal, dekanal nebo E,Z-2,6-nonadienal), jsou silně senzoricky aktivní. Kupříkladu přítomnost E-2-nonenalu ve víně, může být zodpovědná za příchuť či vůni po pilinách, zatímco bylinná vůně je často spojená s alifatickými aldehydy jako je hexanal, E-2-hexenal, E-2-heptenal, octanal a E-2-octenal. (MALHERBE, 2010) V současnosti není úplně přesně stanovena role aldehydů ve vinném aroma, kvůli nedostatku analytických dat. Schopnost degradace acetaldehydu ukazuje na potenciál MB uplatnit tuto vlastnost i v souvislosti s dalšími aldehydy. To by mohlo vést ke snížení zelených či vegetativních tónů ve vůni vína. (OSBORNE & EDWARDS, 2006) Tab. 4 Vliv některých aldehydů na vůni vína (MALHERBE, 2010) sloučenina
charakteristika vůně
2-metylpropanal 2-metylbutanal 3-metylbutanal E-2-hexenal E-2-heptenal E-2-octenal E-2-Nonenal fenylacetaldehyd
čokoládová, sladová čokoládová, sladová čokoládová, sladová bylinná, zelená bylinná bylinná, citronová vůně pilin a dřeva vůně hlohu (květinová), medová, sladká
38
koncentrace (µg.l-1) 0,9–132 3,3–105 1,0–49 0,02–1,6 <0,16 0,04–4,1 0,1–3,7 2,4–130
práh vnímání (µg.l-1) 6 16 4,6 4 4,6 3 0,6 1
Obr. 18 Schématické znázornění biosyntetických drah senzoricky aktivních sloučenin v buňce mléčné bakterie (KÖNIG et al., 2009)
39
4.
MATERIÁL A METODY
4.1
OBECNÝ POPIS
Cílem diplomové práce bylo provést malolaktickou fermentaci v bílých vínech a sledovat její vliv na analytické a senzorické parametry. Pro větší objektivitu byly v experimentu použity 2 odrůdy révy vinné: Ryzlink rýnský a Ryzlink vlašský. Úkony související s experimentální částí této práce probíhaly u obou odrůd paralelně (např. sběr, lisování, inokulace kvasinkami nebo bakteriemi, atd.). Dále byly testovány dva druhy mléčných bakterií Oenococcus oeni od dvou různých výrobců, kteří je předurčují k biologickému odbourávání kyseliny jablečné v bílých vínech. V prvním případě se jedná o MB vyrábějící se pod komerčním názvem CH 35, ve druhém jde o bakteriální kulturu nesoucí název MaloStar Fruit. Mléčné bakterie MaloStar Fruit jsou specifické v tom, že postrádají schopnost rozkládat kyselinu citronovou na diacetyl, tudíž by měly zachovávat ovocný charakter vína. Hovoříme zde o citrát negativních mléčných bakteriích. Kultura CH 35 je odolnější vůči nižšímu pH, které panuje v bílých vínech a není tak senzitivní vůči SO2 jako CiNe bakterie.
Tvorba diacetylu je u nich
předpokládána. Svou roli při výrobě bílého vína, ve kterém má proběhnout MLF, sehrává i doba inokulace MB do vína či moštu. V tomto experimentu byly testovány dva způsoby: inokulace MB před alkoholovou fermentací (tzn. simultánně s kvasinkami) a inokulace po alkoholové fermentaci. V experimentu bylo sledováno celkem 10 vzorků vín dvou odrůd, dva druhy MB a doba inokulace ve dvou variantách (před či po AF). Byly odzkoušeny 4 varianty kombinací: bakterie x doba inokulace, a to v obou odrůdových vínech. Od každé odrůdy byl zachován kontrolní vzorek vína, ve kterém MLF neproběhla. Tímto způsobem bylo možné porovnat odbouraná vína s neodbouranými po všech stránkách. V rámci odbouraných vín pak bylo možné pozorovat vliv určité kombinace druhu bakterie a doby inokulace na analytické a senzorické parametry obou druhů bílých vín. Během MLF bylo ze vzorků vín odebíráno malé množství vína v pravidelných intervalech. Odběr byl následně zamražen, aby se MLF zastavila. Každý odebraný vzorek byl označen odpovídajícím číslem a datumem odběru. Odebrané a zamražené vzorky vín byly po MLF vyhodnoceny metodou HPLC. Z těchto analytických údajů je možné odečíst vliv MLF na víno a v neposlední řadě z nich vyplývá, kolik času bylo zapotřebí k odbourání kyseliny jablečné na kyselinu mléčnou u každého vzorku vína. Vína také prošla senzorickou analýzou při degustaci. 40
Všechna vyrobená vína pocházejí z ročníku 2013. Dále následuje přehled způsobu provedení experimentu a stručný popis použitého materiálu a bakterií. Tab. 5 Způsob realizace MLF ve vzorcích vín vzorek č. odrůda
1 2 3 4 5 6 7
RR RR RR RR RR RV RV
8 9 10
RV RV RV
bakterie
doba inokulace
kontrolní vzorek kontrolní vzorek CiNe po AF CiNe před AF CH 35 po AF CH 35 před AF kontrolní vzorek kontrolní vzorek CiNe po AF CiNe CH 35 CH 35
před AF po AF před AF
Ryzlink rýnský
Je pozdní bílá moštová odrůda s původem v Německu. Vznikla pravděpodobně křížením mezi odrůdou Heunisch x Tramín. Předpokládá se, že odrůda vznikla v okolí horního toku Rýna. Typickým odrůdovým znakem je černá tečka po blizně na vrcholu bobule. Proti napadení houbovými chorobami je odrůda méně až středně odolná. Na půdu nemá vysoké nároky, ale nesnáší vyšší obsah vápna. Ryzlink rýnský je považován za nejkvalitnější odrůdu severních vinohradnických oblastí. Ve vůni můžeme hledat ovocná aroma jako broskev, meruňku, ananas, jablko, exotické plody, ale také lipový květ. (PAVLOUŠEK, 2007)
Ryzlink vlašský
Je pozdní bílá moštová odrůda s nejednoznačným původem. Většinou se uvádí Francie. Odrůda nemá s RR kromě názvu nic společného. Hrozen je středně hustý s dlouhou stopkou a často s přívěskem. Odolnost proti napadení houbovými chorobami je nižší. Proti poškození mrazy je odrůda odolná. Vyžaduje nejlepší polohy vzhledem k pozdnímu zrání. Sklizňová zralost začíná v polovině října. Na půdu je odrůda nenáročná. Víno bývá velmi dobré jakosti, v příznivých letech dává výjimečná vína. Voní nejdříve po jablku, angreštu, po vyzrání jako louka či med. (PAVLOUŠEK, 2007)
41
Viniflora CH 35
Je lyofilizovaná kultura Oenococcus oeni. Jedná se o heterofermentativní mléčné bakterie, které byly vybrány a upraveny speciálně pro přímou inokulaci do růžových a bílých vín. Zajišťují rychlou a bezpečnou MLF. Jsou vhodné pro inokulaci do suchého vína hned po alkoholové fermentaci, ale není problém je použít i pro simultánní očkování spolu s kvasinkami. Mezi vlastnosti kultury Viniflora CH 35 patří: •
Vynikající tolerance k nízkému pH: > 3,0
•
Vysoká tolerance k SO2: volná SO2 do 35 mg.l-1 a celková SO2 do 60 mg.l-1
•
Vysoká malolaktická aktivita i v drsných podmínkách bílého vína
•
Čistý a ovocný organoleptický profil výsledného produktu
•
Nízká produkce těkavých kyselin a žádná produkce biogenních aminů
•
Tolerance k etanolu až do 13,5 % obj. a minimální teplotě do 15 °C
(materiály firmy CHR. HANSEN) MaloStar Fruit
Je citrát negativní bakteriální kultura druhé generace, která je určena pro výrobu výrazně ovocných vín, díky schopnosti bakterií nerozkládat kyselinu citronovou na diacetyl. Víno si tak zachová přirozený obsah kyseliny citronové a netvoří se diacetyl, který je známý svým máselným aroma. Tím není poškozen svěží a ovocný charakter vína. Po skončení MLF proto není nutné řízení diacetylu, tzn., že není potřeba uchovávat víno na jemných kalech ve snaze o jeho redukci kvasinkami. Naopak se víno může stočit z kalů a ihned sířit. Takto se dá víno v brzké době ochránit před nežádoucím bakteriálním rozvojem. Tento kmen Oenococcus oeni vykazuje zlepšený příjem živin, což vede k rychlému růstu a tím i vyšší rychlosti množení a celkově rychlejší degradaci kyseliny jablečné. Aktivační proces se provádí takovým způsobem, aby se zabránilo nedostatku kyseliny pantotenové. To podporuje rychlý start MLF a zabraňuje možnému vzniku těkavých kyselin z glukózy během MLF, způsobené nedostatkem této kyseliny.
42
Enologické vlastnosti: •
Bezpečná a rychlá MLF pro bílá i červená vína
•
Podpora aroma díky zachování obsahu kyseliny citronové
•
Ovocné vůně nejsou překryty máselným aroma diacetylu
•
Nižší riziko vzniku těkavých kyselin
•
Vhodné i pro simultánní očkování do vína
•
Tolerance k SO2: volná SO2 do 10 mg.l-1 a celková SO2 do 25 mg.l-1
•
Teplota inokulace alespoň 18 °C (pozdější pokles teploty ve sklepě již nemá vliv na započatou MLF)
•
Tolerance k pH: > 3,2
•
Tolerance k etanolu až do 13,5 % obj. (materiály firmy LA LITTORALE)
1
2
3
4
kombinace
Varianta č.
Tab. 6 Charakteristika různých variant provedení MLF ve víně
CiNe x po AF
CiNe x před AF
CH 35 x po AF
CH 35 x před AF
charakteristika varianty výhody
nevýhody
zbytkové teplo po AF, autolýza kvasinek, omezený metabolismus hexóz nízký obsah etanolu a SO2, živiny, rychlejší namnožení, příznivá teplota během AF zbytkové teplo po AF, autolýza kvasinek, omezený metabolismus hexóz nízký obsah etanolu a SO2, živiny, rychlejší namnožení, příznivá teplota během AF
vyčerpané živiny, teplota, přítomnost toxických metabolitů, např. SO2, etanol interakce s kvasinkami (souboj o živiny, toxické metabolity)
příležitosti
čisté a ovocné aroma bez vyššího množství acetátu a diacetylu, okamžité stočení z kvasnic po MLF rychlejší MLF, možnost okamžitého stočení z kvasnic po MLF díky nepřítomnosti diacetylu vyčerpané komplexnější živiny, teplota, aroma vzniklé přítomnost začleněním diatoxických cetylu do aroma metabolitů, např. vína, redukce SO2, etanol diacetylu interakce s rychlejší MLF, kvasinkami rychlejší degra(souboj o živiny, dace diacetylu toxické aktivními kvametabolity) sinkami na 2,3-butandiol
43
hrozby pomalý růst populace, zdlouhavá MLF, nedokončená MLF upřednostnění metabolismus hexóz (produkce kyseliny octové)
pomalý růst populace, zdlouhavá MLF, nedokončená MLF upřednostnění metabolismus hexóz (produkce kyseliny octové)
4.2
METODIKA TECHNOLOGIE
Sběr Ryzlinku rýnského i Ryzlinku vlašského proběhl ve stejný den 14. 10. 2013. Hrozny byly dopraveny na místo zpracování a bezprostředně poté odstopkovány a podrceny na mlýnkoodzrňovači. Obě odrůdy dosáhly shodné cukernatosti 20 °NM. Bylo stanoveno pH moštu obou odrůd ručním pH metrem: RR–3,10; RV–3,16. Sklizené hrozny byly v perfektním zdravotním stavu. Nebylo tudíž zapotřebí síření rmutů, jak proti vlivu oxidačního enzymu laccáze produkovaného plísní šedou, tak vzhledem k předpokládané MLF. S ohledem na větší vyluhování látek ze slupek bobulí do moštu, byly ponechány rmuty obou odrůd k naležení během noci. Extrakcí látek ze slupek se do moštu dostávají odrůdově typické aromatické látky, polysacharidy, minerální látky a rostlinné steroly. Soubor těchto látek se podílí na senzorickém profilu vína a zároveň obohacuje rmut o živiny, které podporují alkoholové kvašení i malolaktickou aktivitu. Další den ráno byly rmuty vylisovány na hydrolisu. Již do moštu bylo poté přidáno menší množství bentonitu, aby nebyly ovlivněny aromatické látky vznikající při kvašení, v dávce 40 g.hl-1. Tímto postupem došlo k odstranění nestabilních proteinů, redukci oxidačního enzymu tyrozinázy přírodně se vyskytujícího se v hroznech a rychlejší sedimentaci kalových částic. Po 12 hodinách sedimentace byly mošty stočeny z kalů a doslazeny shodně na 21 °NM. Následným rozdělením moštů do deseti skleněných demižonů (RR–5 nádob, RV–5 nádob) o objemu 25 litrů, byl zajištěn samostatný vývoj jednotlivých vzorků vín a také dosaženo předpokladu nezkreslených výsledků pro analytické a senzorické vyhodnocení. Dalším krokem vinifikace bylo zaočkování všech vzorků vín universálními ASVK určenými pro všechny bílé odrůdy. Od každé odrůdy byl ponechán 1 vzorek vína jako kontrolní varianta, ve které MLF neproběhla. Bezprostředně po kvasinkách přišlo i na inokulaci (simultánní) mléčných bakterií do těch moštů, které pro tento účel byly vybrány. U Ryzlinku rýnského se před alkoholovou fermentací očkovaly 2 vzorky, každý jiným druhem bakterií (CH 35 a CiNe). Stejný postup inokulace bakteriemi před alkoholovou fermentací následoval i u 2 vzorků Ryzlinku vlašského. Kvůli podpoře MLF bylo přistoupeno k přídavku speciální výživy pro malolaktické bakterie v dávce 20 g.hl-1. Tímto způsobem se do moštu dostaly inaktivované kvasinky bohaté na polysacharidy, aminokyseliny, vitamíny a polypeptidy z buněčných stěn, které stimulují růst bakterií, zlepšují jejich množení a zároveň mohou výrazně redukovat délku MLF. V této chvíli zbývalo naočkovat mléčnými bakteriemi ještě 4 vzorky vín (2 od každé odrůdy). Stalo se tak v návaznosti 44
na konec alkoholové fermentace ve snaze využít její zbytkové teplo, tzn., že MB byly do vín inokulovány 12. den od zakvašení ASVK. Opět se očkovaly 2 vzorky Ryzlinku rýnského, stejně tak 2 vzorky Ryzlinku vlašského mléčnými bakteriemi CH 35 a CiNe. Každý vzorek jedné odrůdy jiným druhem bakterií. Malolaktická aktivita byla i zde podpořena speciální výživou pro bakterie v dávce 20 g.hl-1. Pro optimální průběh alkoholové i malolaktické fermentace byla všem vzorkům vín zajištěna teplota cca 21 °C. Dle individuální délky MLF bylo každé víno po jejím konci ponecháno ještě asi 14 dní na kalech. Účelem byla redukce eventuálního diacetylu kvasinkami na 2,3-butandiol. Po tomto období bylo přikročeno namísto komplikované filtrace k vyčiření vína, za použití preparátů k tomuto účelu určených. Po vyčiření a tvorbě kompaktní usazeniny, bylo víno stočeno opět do skleněného demižonu a poprvé zasířeno dávkou 30 mg.l-1 SO2. V tomto stavu byla vína uložena ke zrání až do 25. 3. 2014, kdy na MZLU v Lednici proběhla jejich degustace.
4.3
ANALYTICKÝ ROZBOR VÍNA
4.3.1 VYSOKOÚČINNÁ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE – HPLC
Kapalinová chromatografie patří mezi nejdokonalejší analytické metody pro stanovování obsahů organických kyselin v moštu a víně. Řadí se mezi nejčastěji používané separační metody a vyniká vysokou účinností, dobrou opakovatelností a robustností. Tato metoda je vhodná pro dělení organických méně těkavých kapalných a tuhých látek, které jsou rozpustné ve vodě, v organických rozpouštědlech nebo zředěných kyselinách. HPLC je založena na separaci analytů na základě jejich distribuce mezi stacionární a mobilní fází, která je vždy kapalná. Stacionární fáze je zakotvená v chromatografické koloně. Během separace dochází k mnoha typům interakcí. Uplatňují se interakce analytů s mobilní fází, interakce mobilní fáze se stacionární fází a sorpce analytů na stacionární fázi. Vysokoúčinný kapalinový chromatograf pracuje tak, že jsou vzorky dávkovány dávkovacím ventilem do mobilní fáze. Ta unáší jednotlivé složky vzorku na kolonu, kde dochází k opakovanému ustanovení rovnováhy mezi mobilní a stacionární fázi a k separaci analytů dle fyzikálně-chemických vlastností. Po průchodu separační kolonou jsou analyty v mobilní fázi detekovány v průtokové cele detektoru. Měřenou veličinou je fluorescence, absorbance, index lomu, elektrická vodivost. Výstupem z detektoru je grafický záznam 45
závislosti odezvy detektoru na retenčním čase, tj. chromatogram, na němž se hodnotí plocha nebo výška píku. Kvantitativní analýza se provádí na principu odečtení výsledku z kalibrační křivky. Použití této separační metody ke stanovení titrovatelných a organických kyselin v tomto experimentu, je důležitým ukazatelem výsledku této práce.
4.4
SENZORICKÉ HODNOCENÍ
Senzorické hodnocení vín proběhlo na MZLU v Lednici 25. 3. 2014. Bylo předloženo 10 vzorků bílých vín. Z toho polovina vína byla vyrobena z odrůdy Ryzlink rýnský a druhá polovina z odrůdy Ryzlink vlašský. Od každé odrůdy byl zachován 1 kontrolní vzorek vína, ve kterém MLF neproběhla. Kontrolní vzorky byly též součástí degustace a posloužily k senzorickému porovnání odbouraných a neodbouraných vín. Ve zbylých 8 vzorcích vín byl hodnocen vliv čtyř variant provedení MLF (druh bakterie x doba inokulace) na senzorický profil bílého vína. Degustace se zúčastnilo celkem 6 degustátorů s platným osvědčením o degustátorské zkoušce. Vína se hodnotila 100 bodovým systémem. Výsledky degustace byly zpracovány formou tabulky a slovně okomentovány.
46
5.
VÝSLEDKY PRÁCE
Cílem práce bylo prostudovat vliv malolaktické fermentace na analytické a senzorické parametry bílých vín. V experimentu bylo sledováno10 vzorků bílých vín dvou odrůd révy vinné (Ryzlink rýnský a Ryzlink vlašský). Z toho v 8 vínech byl sledován průběh MLF s dobou inokulace mléčných bakterií před či po alkoholové fermentaci. Taktéž byl pozorován vliv dvou druhů mléčných bakterií na víno, z nichž jedny během MLF metabolizují kyselinu citronovou a druhé tuto schopnost postrádají. V neposlední řadě byl vyhodnocen vliv MLF na vína z jednotlivých odrůd.
Od každé odrůdy byl
zachován 1 kontrolní vzorek vína, v němž MLF neproběhla. Experiment byl proveden na přelomu let 2013/2014. Z každého vína byl odebírán vzorek v pravidelných intervalech před, během a po MLF, který byl posléze zamražen, aby se probíhající MLF zastavila. Tímto způsobem bylo možné, při konečném vyhodnocení odebraných vzorků, sledovat změny v analytických parametrech v určitých fázích MLF jednotlivých vín.
5.1
ANALYTICKÉ HODNOCENÍ VZORKŮ VÍN
Výsledky analytického rozboru jsou rozděleny dle jednotlivých vzorků vín, slovně okomentovány a vyhodnoceny formou grafů. Tyto grafy se zaměřují na organické kyseliny, které jsou důležité pro analýzu průběhu MLF. Úvodní tabulka slouží k ucelenému přehledu analytických údajů všech vzorků vín.
Tab. 7 Analytické údaje jednotlivých vzorků vín odrůda
bakterie
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
RR RR RR RR RR RV RV RV RV RV
kontrolní CiNe CiNe CH 35 CH 35 kontrolní CiNe CiNe CH 35 CH 35
k. mléčná k. citronová k. octová (g.l-1) (g.l-1) (g.l-1) před po před po před po MLF MLF MLF MLF MLF MLF MLF MLF
kontrolní po AF před AF po AF před AF kontrolní po AF před AF po AF před AF
Délka MLF
vzorek číslo:
k. jablečná
doba (g.l-1) před po inokulace 4,75 4,73 4,42 4,87
0,00 1,63 0,00 0,00
0,03 0,07 0,24 0,00
3,21 2,23 3,14 3,41
0,26 0,25 0,23 0,32
0,03 0,18 0,03 0,09
0,14 0,07 0,16 0,01
0,33 52 0,11 115 0,70 50 0,39 26
4,06 3,98 3,58 4,04
0,00 0,00 0,00 0,00
0,13 0,05 0,38 0,09
3,03 2,71 3,11 2,98
0,33 0,33 0,27 0,28
0,02 0,28 0,01 0,17
0,17 0,08 0,19 0,17
0,34 0,11 0,34 0,25
47
28 21 23 28
Vzorek č. 1 (RR) Jedná se o víno vyrobené z odrůdy RR. Vzorek vína byl ponechán jako kontrolní, tzn., že v něm MLF neproběhla. Většinu kyselin ve víně tvoří kyselina vinná a jablečná. Jak z grafu 2 vyplývá, víno má vyšší obsah celkových kyselin, což může mít negativní dopad na harmonii chuti. Kyselina vinná není během AF kvasinkami napadána. Avšak určité množství kyseliny vinné se vysráží jako vinný kámen v důsledku obsahu etanolu ve víně, který pozměňuje její rozpustnost. Vyšší obsah kyseliny jablečné v tomto víně poukazuje na nevyzrálý ročník, který se následně odráží i v kvalitě. Minimální množství kyseliny mléčné a zachování obsahu kyseliny jablečné je výsledkem potlačené MLF. Také kvasinky mohou, i když jen v omezeném rozsahu, produkovat kyselinu mléčnou. Vzniklé množství je ale malé. Přirozený obsah kyseliny citronové se ve víně pohybuje mezi 50 až 300 mg.l-1. Zachování přibližně stejného obsahu této kyseliny je důkazem, že nebyla kvantitativně využívána MB k tvorbě diacetylu. Kvasinky mohou za nepřístupu vzduchu vytvářet 0,3 až 0,6 g.l-1 kyseliny octové. Obsah 0,6 g.l-1 se považuje za znamení aktivní bakteriální činnosti, což není případ tohoto vzorku vína.
14
12,75
12 10,4
g.l-1
10 8 5,99
6 4
mošt
4,8 4,78
víno
3,61
2 0,040,18
0,290,25
0
Graf 2 Analytický rozbor organických kyselin ve vzorku č. 1
48
0,040,36
Vzorek č. 2 (RR) Je víno, které bylo inokulováno CiNe bakteriemi po AF. Kyselina jablečná zde byla zcela odbourána až na hodnotu 0 g.l-1 za 52 dnů. Stojí za povšimnutí, že největší intenzita degradace kyseliny jablečné nastala až v poslední třetině MLF. Tento jev by mohl souviset s pomalejším růstem populace MB v počátcích MLF. Příčinou může být zdlouhavá lag fáze, spojená s přítomností etanolu a SO2 tvořených během AF, tak i nižší dostupnost živin. Pozitivním zjištěním plynoucím z tohoto vývoje je fakt, že MB jsou schopné úplné degradace kyseliny jablečné i po měsíci problematického množení. Co se týče ostatních kyselin, kyselina citronová byla metabolizována v průběhu celé MLF za tvorby diacetylu až na hodnotu blízkou nule. Nevelký nárůst kyseliny octové během MLF je nejspíše také spojen s metabolismem kyseliny citronové. Toto množství ovšem neohrožuje kvalitu výsledného produktu.
5,00
0,35 4,75
0,33
4,50 0,30 4,00 0,26
0,25
3,50 3,21
0,20
g.l-1
g.l-1
3,00 2,50 2,00
0,15 0,14
1,50
0,10
1,00 0,03
0,50 0,00
0,00
0,03 1.
17.
35.
0,05
0,00
52.
dny k. jablečná
k. mléčná
k. citronová
Graf 3 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 2
49
k. octová
Vzorek č. 3 (RR) Do tohoto vzorku byly inokulovány CiNe bakterie před AF. Ve víně neproběhla úplná MLF. I když se MB velmi rychle namnožili na odpovídající počet a kyselina jablečná byla plynule odbourávána, zdá se, že malolaktická aktivita byla inhibována metabolity produkovanými během AF. Ačkoliv bylo víno bez přídavku SO2 a obohacené výživou pro bakterie, nestačilo ani 115 dnů na kompletní MLF. Po tomto dlouhém období čekání na celkovou degradaci kyseliny jablečné, byla MLF před dokončením přerušena. Víno se stočilo z jemných kalů a zasířilo, aby nedošlo k znehodnocení. Útlum MB je patrně příčinou zvyšujícího se obsahu etanolu, či produkce vyššího množství SO2 do vína během AF. Kyselina citronová nebyla významně metabolizována, ovšem senzorické hodnocení tohoto vzorku odhalilo nevýraznou přítomnost diacetylu. Za tímto faktem může stát realizace MLF CiNe bakteriemi, které dle výrobce postrádají schopnost degradace kyseliny citronové. Při inokulaci MB před AF existuje hrozba uplatnění metabolismu sacharidů. Tato varianta ovšem nenastala, což je pro kvalitu vína důležité. Rozhodující vliv přitom mělo nejspíše nízké pH vína, díky kterému nebyly sacharidy kvantitativně zpracovávány. 5,00
0,30 4,73
4,50 0,25
0,25
3,50
0,20 0,18
g.l-1
3,00 2,50
0,15 2,23
2,00
0,11 1,63
1,50
0,10
0,07 1,00
0,05
0,50 0,00
0,07
0,00 1.
29.
56.
87.
115.
dny k. jablečná
k. mléčná
k. citronová
Graf 4 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 3
50
k. octová
g.l-1
4,00
Vzorek č. 4 (RR) Víno bylo zaočkováno bakteriální kulturou CH 35 po AF. Na kompletní MLF bakterie potřebovali 50 dnů. Jak se ukazuje, inokulace MB po AF byla v RR poměrně zdlouhavá, i když kompletní. Inhibiční roli pravděpodobně hrají již zmiňované faktory jako etanol, SO2, živiny, ale také pravděpodobně velmi nízké pH, které umocňuje zmiňované činitele. Z vývoje kyseliny citronové, je dobře znatelný předpoklad jejího odbourání v pozdní fázi MLF, kdy růst a množení bakterií již ustává. Jak je vidět i na průběhu množství kyseliny octové, je degradace kyseliny citronové v pozdní stacionární fázi MLF zodpovědná i za navýšení obsahu acetátu. V neposlední řadě s tímto momentem souvisí i vysoký obsah diacetylu zpozorovaný při senzorickém hodnocení. I když bylo víno ponecháno po MLF na jemných kalech za účelem redukce diacetylu na 2,3-butandiol, zřejmě již víno nevládlo po dlouhé MLF dostatečným počtem života schopných kvasinek, které by tento proces zajistily.
0,80
5,00 4,50
4,42
0,70
0,70
4,00 0,60 3,50
g.l-1
2,50
0,40
2,00 1,50 1,00
0,50
0,30 0,23
0,20
0,16 0,10
0,50 0,03 0,00
0,24 0,00 1.
17.
32.
0,00
50.
dny k. jablečná
k. mléčná
k. citronová
Graf 5 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 4
51
k. octová
g.l-1
3,14
3,00
Vzorek č. 5 (RR) V tomto vzorku byly testovány bakterie CH 35 očkované před AF. Časové období, po které MB odbourávaly kyselinu jablečnou, se zastavilo na čísle 26 dnů. MLF zde proběhla poměrně rychle. Dá se říci, že úbytek kyseliny jablečné a s tím spojený nárůst obsahu kyseliny mléčné, byl víceméně lineární. Pozitivně se projevila inokulace MB před AF, kdy panují příhodnější podmínky pro množení a růst bakterií díky nepřítomnosti etanolu a SO2. Téměř veškerá kyselina citronová byla MB metabolizována. Dle senzorického hodnocení byl vzniklý diacetyl nejspíše dostatečně redukován kvasinkami přes acetoin na 2,3-butandiol, který se ve víně chová neutrálně. Rozhodující úlohu zde sehrává časná inokulace MB, které MLF dokončují nedlouho po AF. Diacetyl je pak snižován už během AF, popřípadě v období ponechání vína na jemných kalech. Také toto víno neobsahuje nepřiměřené množství kyseliny octové, i když MB byly do moštu očkovány s rizikem preference sacharidů před kyselinou jablečnou. I zde se projevil pozitivní vliv nízkého pH, které je vhodné pro inokulaci MB do moštu.
0,45
6,00 0,39 5,00
4,87
0,40 0,35
0,32
g.l-1
3,41
0,25
3,00 0,20 0,15
2,00
0,09
1,00
0,10 0,05
0,01 0,00
0,00
0,00 1.
8.
17.
0,00
26.
dny k. jablečná
k. mléčná
k. citronová
Graf 6 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 5
52
k. octová
g.l-1
0,30
4,00
Vzorek č. 6 (RV) Je kontrolní vzorek odrůdy Ryzlink vlašský, ve kterém bylo zajištěno, aby se MLF neuskutečnila. Víno z RV disponovalo o něco menší aciditou než víno z RR. Konkrétně mělo v moštu méně celkových organických kyselin o 1,7 g.l-1. Ve výsledném neodbouraném víně se nacházel nižší obsah celkových kyselin o 0,5 g.l-1 oproti RR. Taktéž v tomto víně lze očekávat velmi nízké pH. Od této skutečnosti se odráží fakt, že víno disponuje vyšším podílem kyselin, než by bylo vhodné. Graf 7 naznačuje, že množství kyseliny vinné ve víně je nižší, než tomu bylo v moštu. I když kyselinu vinou mohou rozkládat některé laktobacily, není tento rozdíl obsahů zapříčiněn mikrobiální degradací. Důvodem inhibice nežádoucího bakteriálního rozvoje je nízké pH. Rozklad kyseliny vinné je navíc doprovázen produkcí metabolitů, zodpovědných za zkažení vína, což není tento případ. Důvodem snížení obsahu kyseliny vinné je vysrážení vinného kamene díky přítomnosti etanolu a nízké teplotě. Vyšší podíl kyseliny jablečné v tomto víně může vyvolávat pocit tvrdosti, což může mít negativní dopad na chuťový profil vína. Množství kyseliny mléčné poukazuje na nečinnost MB, jejichž potlačená aktivita se dá odečíst i ze zachovalého množství kyseliny jablečné. Diacetyl nebyl ve víně pozorován, čemuž nasvědčuje množství neodbourané kyseliny citronové. Kyselina octová se nachází v množství, které je přirozené pro vína po AF.
12
11,05 9,9
10
g.l-1
8 6
5,54
mošt
4,164,10
4
3,52
víno
2 0,070,12
0,310,21
0
Graf 7 Analytický rozbor organických kyselin ve vzorku č. 6
53
0,46 0,13
Vzorek č. 7 (RV) MLF v tomto víně zajistily CiNe bakterie inokulované po AF. Degradace kyseliny jablečné byla kompletní. MB k tomu potřebovaly 28 dnů. Podle rychlosti úbytku kyseliny jablečné se dá předpokládat, že se MB po inokulaci musely nejdříve vypořádat s nehostinnými podmínkami převládajícími v prokvašeném víně. Toto období množení a růstu populace trvalo asi třetinu délky MLF, kdy se MB vyrovnávaly s výskytem etanolu, nejspíše i SO2 a nízkým pH. Optimální teplota po fermentaci a přísun výživy byly naopak faktory stimulující růst. V dalším průběhu MLF bylo cca 3,5 g.l-1 kyseliny jablečné transformováno na kyselinu mléčnou za 18 dní, kdy již byla namnožena početná populace. Téměř veškerá kyselina citronová byla metabolizována, což je proces doprovázený zvýšenou tvorbou diacetylu i nárůstem obsahu kyseliny octové. Vyhovující délka celkové MLF byla pravděpodobně příhodná k náslené redukci diacetylu kvasinkami ve víně. Tento vývoj byl podpořen ponecháním vína na jemných kalech po dobu 14 dní od konce MLF.
4,50 4,00
0,40 4,06 0,34
0,33 3,50
0,35 0,30
3,03
3,00
0,25 0,20 2,00
0,17 0,15
1,50 0,10
1,00
0,05
0,50 0,00
0,02 0,00
0,13 1.
10.
19.
0,00
28.
dny k. jablečná
k. mléčná
k. citronová
Graf 8 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 7
54
k. octová
g.l-1
g.l-1
2,50
Vzorek č. 8 (RV) Součástí výroby tohoto vína byla MLF provedená CiNe bakteriemi, které se očkovali simultánně s kvasinkami, tedy před AF. MLF zde proběhla za nejkratší dobu ze všech sledovaných vín. V tomto případě za 21 dnů. Opět se ukázalo, že simultánní očkování MB a kvasinek má na vývoj populace bakterií pozitivní vliv. Bude to patrně ze známých důvodů, tedy nepřítomnosti etanolu a SO2. Růst byl navíc podpořen přídavkem výživy pro bakterie a vhodnou teplotou média. Vypadá to, že MB se intenzivně množily od prvních chvil inokulace do moštu. Zpočátku využívají jako zdroj energie přítomné cukry pro tvorbu biomasy. Následně v brzké stacionární fázi, je zpracovávána kyselina jablečná. V pozdní fázi stacionární je nakonec metabolizována i kyselina citronová. Tento předpoklad degradace kyseliny citronové nebyl naplněn ani u tohoto vzorku vína, které bylo inokulováno před AF a to CiNe bakteriemi. Minimální úbytek kyseliny citronové se dá označit za nepodstatný. CiNe bakterie zde projevily svůj potenciál. Další pozitivní vlastnost těchto bakterií se prokázala v neuplatnění metabolismu sacharidů, i když byly očkovány před AF. Tento moment vystihuje vývoj kyseliny octové. 0,35
4,50 0,33 4,00
3,98
0,30 0,28
3,50
0,25 3,00 2,71
2,00
0,15
g.l-1
0,20
g.l-1
2,50
1,50 1,00
0,11
0,05
0,50 0,00
0,10
0,08
0,00
0,05 1.
8.
14.
0,00
21.
dny k. jablečná
k. mléčná
k. citronová
Graf 9 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 8
55
k. octová
Vzorek č. 9 (RV) Tento vzorek vína posloužil pro sledování bakterií CH 35 inokulovaných až po AF, což nebylo překážkou pro rychlou MLF za 23 dnů. Na vývoji obsahu kyseliny jablečné je zajímavé, jak snadno a rychle se MB dokázaly namnožit na potřebný počet potřebný k zahájení MLF. Kvantitativně začaly kyselinu jablečnou degradovat od prvních momentů inokulace i přes inhibiční faktory spojenými s AF jakou jsou etanol, SO2 či nižší dostupnost živin. Za 7 dní bylo odbouráno již 3,07 g.l-1 kyseliny jablečné. Je otázkou, proč se dobře rozjetá MLF přibrzdila a zbylých 0,51 g.l-1 kyseliny jablečné se neodbouralo v nastoleném tempu. Příčiny mohou spočívat ve vyčerpání živin bakteriemi, jež byly uvolněny po AF během autolýzy. Také synergie etanolu, SO2 a teploty média v kombinaci s nízkým pH zde mohla sehrát negativní úlohu. Za vyšší obsah diacetylu ve víně je zodpovědný metabolismus kyseliny citronové, jejíž degradace byla úplná. Také množství kyseliny octové vzrůstalo přiměřemě k úbytku kyseliny citronové. Tato hladina ovšem nenarušovala vůni či chuť výsledného vína.
4,00 3,50
0,40 3,58 0,34
0,35
3,11 3,00
0,30 0,27 0,25
2,00
0,20 0,19
1,50
0,15
1,00
0,10
0,50
0,05 0,38 0,01 0,00
0,00 1.
7.
15.
0,00
23.
dny k. jablečná
k. mléčná
k. citronová
Graf 10 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 9
56
k. octová
g.l-1
g.l-1
2,50
Vzorek č. 10 (RV) V posledním ze vzorků vín bylo pozorováno, jak si počínají bakterie CH 35 očkované již před AF. Analýzou bylo prokázáno, že odbourávání kyseliny jablečné trvalo 28 dnů. Tato délka MLF se dá označit za optimální a podle rovnoměrného úbytku kyseliny jablečné také za zdařilou. Vzorek č. 10 je jediným vínem s naočkovanou bakteriální kulturou CH 35, ve kterém nebyla odbourána kyselina citronová na nulu či hodnotu blízkou nule. Znova se tato situace odehrála ve víně, které bylo očkované MB před AF. Je možné, že za touto pozitivní vlastností stojí optimální podmínky panující před AF. Prostředí média je tak vhodné pro růst, namnožení a tvorbu dobré konstituce MB. Nízké množství kyseliny octové ukazuje na preferenci kyseliny jablečné před metabolismem cukrů. Tomuto faktu nahrává nízké pH vína. Případný diacetyl tvořený MB z kyseliny citronové, mohl být díky časné inokulaci MB do moštu dále degradován kvasinkami na neutrální 2,3-butandiol. Tato součinnost se příznivě projevila i v hodnocení výsledného vína.
4,50 4,00
0,30 0,28 4,04 0,25
0,25
2,98
0,20
3,50 3,00
0,17
0,17
0,15 2,00 1,50
0,10
1,00 0,05 0,50 0,00
0,00
0,09 1.
9.
19.
0,00
28.
dny k. jablečná
k. mléčná
k. citronová
Graf 11 Vývoj organických kyselin během MLF ve vzorku č. 10
57
k. octová
g.l-1
g.l-1
2,50
5.2
SENZORICKÉ HODNOCENÍ VZORKŮ VÍN
K pozitivnímu vnímání senzorického profilu bílého vína obecně přispívá jeho ovocnost a svěžest. MLF je všeobecně považována za element, který tlumí tyto vlastnosti bílého vína. Navzdory tomu se při výrobě mnohých bílých vín MLF často využívá právě jako prostředek, který vede k obohacení chuťového a aromatického profilu. Zajímavou možností jak provést MLF a zároveň zachovat typické vlastnosti bílého vína, je použití citrát negativních mléčných bakterií, které neprodukují diacetyl. Víno se tak zakulatí díky navýšení obsahu kyseliny mléčné a ve víně se neprojeví negativní vlastnosti spojené s diacetylem. Pokud je cílem produkovat plná vína s komplexnějším aroma, může být vhodnou volbou využití již zaběhlých kultur Oenococcus oeni. Produkovaný diacetyl může být po MLF dále redukován kvasinkami až na 2,3-butandiol, který se chová ve víně neutrálně. Tímto způsobem se dá dospět k požadovanému stylu vína, ve kterém je MLF přínosem. Důležitá je také doba inokulace mléčných bakterií do média, která může mít zásadní vliv na budoucí kvalitu vína. Výhody nebo hrozby tohoto rozhodnutí spočívají především v namnožení a růstu bakterií či možnosti upřednostnění metabolismu hexóz. V neposlední řadě rozhoduje o pozitivním vnímání MLF vhodně zvolený styl vína a odrůda. Bodové hodnocení všech vzorků vín, při kterém byl použit 100 bodový systém, je sjednoceno v Tab. 8. Následuje slovní komentář k degustovaným vínům.
Tab. 8 Bodové hodnocení vzorků vín Vzorek číslo: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Degustátor 1
2
3
4
5
6
83 75 86 74 82 85 86 87 83 83
82 81 83 81 85 82 83 84 79 84
82 80 80 78 75 81 76 73 78 84
77 71 75 82 71 81 82 75 82 81
72 81 76 72 80 81 75 80 72 81
75 78 86 76 86 80 75 78 75 82
58
Průměr
Směrodatná odchylka
79 78 81 77 80 82 80 80 78 83
4,1 3,6 4,4 3,6 5,3 1,6 4,3 4,9 3,8 1,3
Vzorek č. 1 (RR) Ve vzorku č. 1 MLF neproběhla. Víno si zachovalo svěží a jemný ovocný charakter typický pro tuto odrůdu, i když se v něm daly nalézt i stopy travnatých tónů. Výraznější kyselina narušovala harmonický dojem. Kladně byla hodnocena čistota alkoholové fermentace bez negativních vedlejších produktů. Vzorek č. 2 (RR) Při senzorickém hodnocení víno působilo lehce máselným dojmem, který byl ovšem vnímán pozitivně, jako součást komplexního aroma. Nebylo ovšem bez povšimnutí, že i tak bylo zčásti zastřeno odrůdové aroma. Nic nezměnil ani fakt, že MLF provedly CiNe bakterie, které dle výrobce neprodukují během MLF diacetyl. Plnost vína tvořil vyšší obsah kyseliny mléčné. Na čistotě aroma se nepříliš pozitivně projevila nejspíše delší MLF a s tím spojené ležení vína na kalech bez možnosti použití SO2. Vzorek č. 3 (RR) Vzorek byl hodnocen jako hladký, hutný či strukturní s velmi jemným nádechem máselného tónu, který se svou měrou doplňoval s ovocností vína. Na druhé straně byla podpořena bohatost aroma o zajímavý prvek. Víno se jevilo jako čistě odbourané bez negativních vedlejších produktů MLF. Další klad byl shledán v nepřítomnosti travnatých tónů oproti kontrolní variantě, s čímž může souviset biologické odbourávání kyselin, respektive metabolismus aldehydů. Vzorek č. 4 (RR) Víno se prezentovalo jako vysloveně laktózní, jogurtové. Diacetyl byl patrný, na čemž se shodli všichni degustující. Dle preferencí jednotlivých degustátorů, co se máselných tónů týče, dostávalo toto víno různé bodové ohodnocení. Kulatost a intenzivní chuťový i aromatický projev máselných tónů byl dominantním znakem vína. Svou roli ve vyšším obsahu diacetylu ve víně, může hrát fakt, že MB byly inokulovány až po AF, kdy je množství aktivních kvasinek schopných redukce diacetylu již omezené. Zvláště to může být patrné při delší MLF jako v této variantě.
59
Vzorek č. 5 (RR) V tomto případě bylo víno kladně hodnoceno za jeho zachovalou odrůdovost i po celkové MLF. Ve víně sice byl znatelný diacetyl, ovšem jeho koncentrace byla nejspíše snížena na příhodnou míru v důsledku reduktivních schopností kvasinek. Toto množství pak nezastíralo ovocnost vína a bylo přínosem pro jeho aroma. Zaujala tak vyváženost vína ve vůni i v harmonii chuti. Celkově bylo víno pozitivně hodnoceno jako příjemné a čistě odbourané. Vzorek č. 6 (RV) Ve vzorku č. 6 MLF neproběhla. Víno si zachovalo nevtíravou svěží chuť a ovocné aroma typické pro tuto odrůdu. Budilo dojem vyšší acidity, která lehce narušovala vyváženost a harmonii. Alkoholová fermentace se ve víně jevila jako čistá, bez negativních vedlejších produktů. V perzistenci bylo víno hodnoceno jako trpké, což může poukazovat na vyšší zastoupení hrubých tříslovin ve spojitosti s vyšší kyselostí. Celkový ohlas na víno byl ale velmi dobrý. Vzorek č. 7 (RV) Svěží a strukturní víno, které ovšem nezapře vliv MLF na jeho aromatický profil. V tomto případě se odbourání kyseliny jablečné jeví jako vhodný doplněk pro snížení acidity vína, navíc diacetyl během MLF tvořený, je vhodně zakomponován do aroma. Na této variantě inokulace po AF se ukazuje, že výrazná redukce diacetylu je realizovatelná i po AF. Vůně proto byla pozitivně hodnocena jako harmonická a komplexní. Vzorek č. 8 (RV) Je víno, ve kterém proběhla krátká a rychlá MLF. Při senzorickém hodnocení se ukázalo, že tento moment byl pro víno přínosný jak z hlediska aromatického, tak chuťového. Máselné aroma během degustace nebylo veskrze vnímáno, a pokud, tak jako minimálně invazivní a nepřehlušovalo odrůdový charakter vína. Pozitivní roli zde nejspíše sehrála vhodná kombinace CiNe bakterií a inokulace před AF. Aktivní kvasinky tak mohou redukovat případný diacetyl na přijatelnou úroveň.
60
Vzorek č. 9 (RV) Ve víně byla kladně hodnocena jeho struktura a plnost. Ve vůni i chuti bylo citelné vyšší množství diacetylu. Víno tak naprosto postrádalo ovocnost, což bylo mnohými degustátory ohodnoceno nižším počtem bodů za čistotu vůně. Lepší ohodnocení nebylo vínu dopřáno díky jeho reduktivnímu charakteru, který byl nejspíše důsledkem ležení vína na kalech ve snaze odbourat diacetyl kvasinkami. Vzorek č. 10 (RV) Toto víno dosáhlo během degustace nejvyššího průměrného bodového ohodnocení. Dalo by se charakterizovat jako svěží s ovocným nádechem, čisté ve vůni i chuti. MLF se i v tomto víně přece jenom projevila v aroma, ovšem jen v pozitivním slova smyslu. Ve vůni nevtíravé máselné aroma, sotva znatelné, chuť plná, harmonická. Důvodem vyššího ohodnocení byla opět nízká hladina diacetylu a harmonická plná chuť, která je výsledkem vyšší hladiny kyseliny mléčné. Znova se v dobrém světle projevila časná inokulace MB s kvasinkami, které mohou redukovat diacetyl až na 2,3-butandiol.
61
6.
DISKUSE
MLF bývá většinou spojována s výrobou červených vín, ovšem i mnohé bílé odrůdy jsou vhodné pro tento technologický krok. Pokud je ve víně požadováno biologické odbourání kyselin, doporučuje se inokulace selektovaného kmene MB. Spontánní MLF může být provedena na základě namnožení nečisté mikrobiální flóry, což vede k tvorbě negativních senzorických projevů. V současné době existuje na trhu dostatečná škála komerčně vyráběných preparátů MB. Základní výhodou inokulace čisté bakteriální kultury je možnost kontroly průběhu MLF, od čehož se odvíjí pozitivní vliv na senzorické vlastnosti vína. Další výhodou umělého očkování je lepší schopnost realizace MLF v obtížných podmínkách bílého vína. O tomto, zdali je MLF zdařilá, rozhoduje z pohledu mnohých konzumentů míra máselného aroma vyskytujícího se ve víně. DAVIS et al. (1986) uvádí, že při odbourávání kyseliny citronové MB vzniká diacetyl, který ve vysokých koncentracích působí senzoricky nepříznivě. Víno má pak máselné aroma až po zkaženém zelí. Na základě výsledků analýzy kyseliny citronové a míře vnímaného diacetylu ve víně, se dá s tímto výrokem souhlasit. Kyselina citronová byla u většiny vín nejvíce metabolizována na konci MLF. Nabízí se tedy srovnání obou testovaných druhů bakterií z pohledu tvorby diacetylu. CiNe bakterie dle výrobne postrádají schopnost rozkladu kyseliny citronové. Analytické a senzorické vyhodnocení experimentálních vzorků vín tento předpoklad do určité míry vyvrátilo. Zajímavým výsledkem této práce je zjištění, že CiNe bakterie očkované po AF do vzorku č. 2 a 7 odbouraly kyselinu citronovou až na hodnoty blízké nule. Při senzorickém hodnocení se tudíž ve víně objevovaly máselné tóny, které ovšem nezastíraly ovocnost vína a vhodně doplňovaly komplexnost aroma. Oproti tomu CiNe bakterie inokulované před AF byly varianty, které ve vzorcích č. 3 a 8 téměr zachovaly obsah kyseliny citronové. Degustátoři tato vína označili za ovocná a nejméně zasažená MLF. Máselné tóny se zde vyskytovaly jenom v jemných náznacích. Aby byl výsledek tohoto hodnocení korektní, je nutno dodat, že ve vzorku č. 3 nestačily MB odbourat zbývajících 1,63 g.l-1 kyseliny jablečné. Jak konstatuje LERM et al. (2010), metabolismus kyseliny citronové začíná na konci MLF, kdy je většina kyseliny jablečné metabolizována na kyselinu mléčnou. To znamená, že maximální koncentrace diacetylu je tvořena ve fázy, kdy je kyselina jablečná téměř vyčerpána. Z tohoto důvodu je škoda, že CiNe bakterie MLF nedokončily. Bylo by pak možné se přiklonit či odvrátit od zajímané hypotézy, že CiNe
62
bakterie očkované před AF kvantitativně neodbourávají kyselinu citronovou a netvoří tak diacetyl. Bakterie CH 35 se osvědčily jako vhodné kultury do bílých vín, které jsou schopné kompletní MLF v relativně krátké době. S produkcí diacetylu je u této kultury počítáno. Zajímavé bylo sledovat rozdíly ve vnímání diacetylu variant před a po AF. Varianta CH 35 x po AF měla u vín obou odrůd podobný charakter. Vzorek č. 4 byl shledán nejvíce laktózním ze všech degustovaných vín. V nadměrném množství diacetylu ho následoval vzorek č. 9. Kyselina citronová byla v obou vínech téměř zcela metabolizována bakteriemi CH 35. Jak předpokládá RIBÉREAU-GAYON et al. (2006), v omezené koncentraci glukózy, nízkém pH a přítomnosti růstových inhibitorů, je kyselina citronová přednostně využívána k tvorbě acetoinových sloučenin. Dá se říci, že v této variantě inokulace po AF, bylo zmiňovaných faktorů dosaženo, což se odráží v nadměrném množství diacetylu ve vínech. Varianta CH 35 x před AF byla ve vztahu k produkci diacetylu daleko vhodnější. Kyselina citronová sice byla degradována metabolismem MB, ale ne zcela. Ve vzorku č. 10 dokonce zůstalo více než poloviční množství (0,17 g.l-1). Toto víno dopadlo v průměrném vyhodnocení senzorické analýzy nejlépe. Projevovalo se zejména vhodnou mírou diacetylu ve víně, který byl přínosem ve složitosti aroma. Zásadní úlohu v tvorbě diacetylu sehrává počet inokula MB do vína. Jak uvádí HENICK-KLING (1993), start MLF je vyvolán, jakmile dosáhnou bateriální polulace velikosti 106/ml. PAVLOUŠEK (2010) předpokládá, že vyšší úroveň počáteční inokulace MB urychluje začátek a zkracuje MLF. Vede také k nižší tvorbě diacetylu. Nízká úroveň inokulace má prodlouženou lag fázi až na dobu 14 dnů a vytváří vyšší obsah diacetylu, který může negativně ovlivňovat senzorickou kvalitu vína. Dle tohoto popisu se dá předpokládat, že u vzorků č. 2 a 7 se lag fáze protáhla na cca 17 resp. 10 dní (nejdéle ze sledovaných vzorků). Množství kyseliny jablečné v tomto období klesalo jen velmi pozvolna. Shodou okolností se jednalo vždy o stejnou variantu: CiNe x po AF. Příčina prodloužené lag fáze bude pravděpodobně vězet ve vyšší senzitivitě CiNe bakterií na nehostinné podmínky panující ve víně po AF, kterými jsou etanol, SO2, nízké pH, obsah živin a teplota. Dále se z výsledků experimentu nedá s určitostí tvrdit, že délka MLF má vliv na množství diacetylu ve víně. Je pravdou, že MLF ve vyloženě laktózním vzorku č. 4 se dá označit za delší (trvala 50 dní). Oproti tomu vzorek č. 9 prodělal MLF za 23 dní a při senzorickém hodnocení se ukázalo, že množství diacetylu je zde nadměrné a vyšší než ve většině zbylých vín. 63
Z pohledu výskytu potenciálních negativních produktů (především kyseliny octové) se osvědčily oba druhy MB. Nejvyšší obsah kyseliny octové byl stanoven ve vzorku č. 4 (0,7 g.l-1), která byla produkována během MLF díky uplatnění metabolismu kyseliny citronové. Významná část tohoto množství (0,54 g.l-1) vznikla až po AF činností bakterií CH 35. Dle LERM et al. (2010) není toto množství ohrožením pro kvalitu vína. Uvádí, že kyselina octová působí ve víně kysele, štiplavě nebo po octu až v koncentracích, které jsou vyšší než 0,7 g.l-1. Tato slova potvrzuje i senzorická analýza, při níž nebyla tato vada shledána. Důležitým momentem při adaptaci MB na nové prostředí je jejich inokulace do moštu či do vína, tzn. před nebo po AF. Stimulovat, nebo naopak tlumit jejich růst či malolaktickou aktivitu mohou různé faktory (zejména pH, SO2, etanol, teplota, živiny a interakce s kvasinkami, také synergie více faktorů). Doba inokulace může mít vliv na vývoj populace a tedy i na zdárné dokončení a délku MLF. Na základě rozboru vín a jejich senzorického hodnocení se dájí srovnat obě varianty inokulace. Varianta s bakteriemi očkovanými po AF vykazovala rychlejší MLF u vín z odrůdy RV (v obou případech do 1 měsíce). Tato příčina se bude patrně odvíjet od vyššího pH, naměřeného v této odrůdě. KUNKEE (1967) tvrdí, že MB Oenococcus oeni jsou inhibovány, pokud je pH média nižší než 2,9. RIBÉREAU-GAYON et al. (1975) dodává, že pro biologické odbourávání kyselin se osvědčuje hodnota pH mezi 3,3–3,5. MLF po AF v RR trvala oběma testovaným druhům bakterií cca 50 dní. I přes nehostinné podmínky jako je nízké pH, přítomnost etanolu a SO2 se MB nakonec namnožily na potřebný počet a provedly celkovou degradaci kyseliny jablečné. Pozitivní vliv inokulace MB po AF se zřejmě projevil u vzorku č. 4, kdy se v průběhu MLF výrazně zpomalilo tempo odbourávání kyseliny jablečné. Je možné, že v této situaci přišly MB vhod uvolněné živiny a manoproteiny během autolýzy kvasinek, protože upadající malolaktická aktivita byla opět obnovena. GUILLOUX-BENATIER & CHASSAGNE (2003) poukazují na schopnost manoproteinů stimulovat růst bakterií díky adsorpci mastných kyselin a tak detoxikovat víno. Varianta s bakteriemi očkovanými před AF se jeví z pohledu délky MLF jako velmi výhodná. U 3 vzorků vín nastalo biologické odbourávání kyseliny jablečné krátce po inokulaci. Celý průběh MLF byl velmi plynulý a rychlý. Dá se říci, že MB k degradaci kyseliny jablečné stačil nanejvýš 1 měsíc. Výjimkou byl pouze vzorek č. 3 očkovaný před AF CiNe bakteriemi. Dobře nastartovaná MLF se v průběhu procesu přibrzdila a MB již dále nebyly schopny MLF dokončit ani za 115 dní. Důvodem útlumu bude nejspíše vyšší senzitivita CiNe bakterií 64
na přítomnost inhibičních faktorů, produkovaných kvasinkami během AF, tedy etanolu a SO2. V synergickém inhibičním vztahu se jmenovanými bude také nízké pH. Podstatným faktorem vzhledem k aktivitě MB je množství přítomného etanolu. Mošty s vyšší cukernatostí dosahují po alkoholové fermentaci vysoké hladiny etanolu ve víně. V takovém víně se MB vlivem jeho toxicity nemusí vůbec namnožit na počet potřebný k MLF. Etanol má nepříznivé účinky na růst MB a hraje zásadní roli ve schopnosti MB přežít ve vinném prostředí a provést MLF. Ve vyšších koncentracích působí negativně na tekutost a integritu buněčné membrány. Z tohoto pohledu měly MB inokulované před AF optimální podmínky na množení, růst populace a celkově rychlejší MLF. Tento předpoklad se naplnil u 3 vzorků inokulovaných před AF. MLF zde byla rychlá a kompletní. Zastavila jenom u vzorku č. 3. Kromě jiných zde mohl sehrát negativní úlohu právě etanol. Toxicita etanolu je vůči MB ve specifické synergii s teplotou. BAUER & DICKS (2004) tvrdí, že optimální teplota růstu MB klesá při zvyšujících se koncentracích etanolu a zvýšená teplota znamená nižší schopnost MB odolávat zvýšené koncentraci etanolu. Podobnou synergií vládne i dvojice SO2 a pH. Nejvíce inhibiční vůči MB je forma molekulárního SO2, která je nejúčinnější při nižších hodnotách pH a jako jediná dokáže difundovat skrz bakteriální buněčnou stěnu. KOEBMANN et al. (2000) popisuje mechanismus inhibice MB oxidem siřičitým na základě rozrušení disulfidových můstků v proteinech, reakce s kofaktory NAD+ a FAD a inhibice aktivity ATPázy, což ovlivňuje růst MB. K síření vína bylo přistoupeno teprve až po MLF a stočení vína z jemných kalů. Pokud byly MB během MLF oxidem siřičitým inhibovány, jednalo se o SO2 produkovaný kvasinkami během AF. Inhibiční množství SO2 nebylo pravděpodobně během AF kvasinkami produkováno, protože k zákvasu byly použity ASVK, které nejsou v produkci SO2 tak činné jako kvasinky při spontánní AF. Z tohoto důvodu nejspíše nedocházelo k inhibici MB oxidem siřičitým před ani po AF. Pokud ano, šlo zřejmě o synergii faktorů jako pH, SO2, etanol, živiny a teplota. I sama teplota v určitém rozmezí podporuje či tlumí malolaktickou činnost. CHU-KY et al. (2005), argumentuje tím, že ačkoliv mají nízké teploty od 8 do 14 °C vliv na plazmatickou membránu a tlumí malolaktickou aktivitu, nemá to vliv na schopnost přežívání buněk. Aby bylo zajištěno rychlé zahájení a dokončení MLF, je nezbytné kontrolovat teplotu během MLF, která by měla být udržována mezi 18–22 °C. Tím je zajištěna optimální malolaktická aktivita MB. Vínů byla během MLF zajištěna teplota cca 21 °C. Proto nebyl z hlediska teploty významný rozdíl mezi inokulací MB před nebo po AF.
65
Jinak ale platí, že bakterie očkované do moštu využívají teplo produkované kvasinkami během AF a bakterie očkované po AF využívají její zbytkové teplo. Kromě fyzikálních parametrů je pro množení MB nezbytný stav živin v médiu. MB jsou na nutriční požadavky velmi náročné v důsledku jejich omezených biosyntetických schopností. Jak praví MATTHEWS et al. (2004), nejdůležitější jsou z tohoto pohledu aminokyseliny. Všem pokusným vzorkům byla dodána výživa dle doporučení výrobce, ať už před či po AF. Stav výživy by se tedy neměl promítnout do případných problémů s MLF. Dále ale platí, že před AF jsou živiny dostupné jak bakteriím, tak i kvasinkám. Je
ovšem
realitou,
že
pokud
nejsou
živiny
dodány
uměle,
jsou
dle
GUILLOUX-BENATIER & CHASSAGNE (2003) Oenococcus oeni inhibovány kvasinkami v důsledku jejich rychlého nástupu a spotřebě živin. Na kvalitu vína vzhledem k produkci těkavých kyselin má výrazný vliv inokulace MB před nebo po AF. Těkavé kyseliny jsou tvořeny za upřednostnění metabolismu sacharidů v důsledku vyššího pH než 3,5, což zdůrazňuje RIBÉREAU-GAYON et al., (1975). Dle analýzy kyseliny octové nebyl metabolismus sacharidů uplatněn v žádném ze vzorků vín. O to lépe tento fakt vyznívá, protože polovina MB byla inokulována před AF, kdy je výskyt sacharidů nejvyšší. Příznivě se v tomto ohledu osvědčily oba druhy testovaných bakterií. Důvodem bylo nejspíše příznivé pH moštu (RR–3,10; RV–3,16). Jak vysvětluje RIBÉREAU-GAYON et al., (1975), prahová hodnota pH pro asimilaci kyseliny jablečné je nižší, než je prahová hodnota pH cukrů. V oblasti mezi těmito dvěma pH, bakterie rozkládají kyselinu jablečnou, aniž by zpracovávaly velké množství cukrů a tudíž produkovaly těkavé kyseliny. Vhodnost realizace MLF ve sledovaných odrůdách vína nebyla při senzorickém hodnocení definitivně stanovena. Dle degustujících platí, že pro harmonii chuti je příznivé odkyselení vysoce acidního vína. Jednou z možností je využití procesu MLF. Takto upravené víno do jisté míry ztrácí svoji ovocitost. Jak se potvrdilo v tomto experimentu, cenou za nižší aciditu vína je částečně snížená ovocná či květinová intenzita aroma, která je doplněna sloučeninami vznikajícími při MLF. Tato újma na vůni ovšem nemusí znamenat snížení kvality vína. Dobře se v tomto světle uvedla inokulace před AF bakteriemi CiNe i CH 35, která zachovala ovocnost v aroma vína. Zajímavé by bylo porovnat tento experiment s víny, ke kterým se dopad biologického odbourávání kyselin hodí nejvíce, tzn. s některými z burgundských odrůd. Toto by mohl být námět pro další studium vlivu MLF na bílá vína.
66
7.
ZÁVĚR
Tato práce se zaobírá vlivem MLF na analytické a senzorické parametry bílých vín. Téma bylo podrobeno praktické zkoušce, ke které posloužily dvě bílé moštové odrůdy (Ryzlink rýnský a Ryzlink vlašský). Testované MB Oenococcus oeni nesly komerční názvy Viniflora CH 35 a MaloStar Fruit. Kultura MaloStar Fruit se dle výrobce od CH 35 odlišuje tím, že postrádá schopnost degradace kyseliny citronové (tzv. citrát negativní MB). Produkce diacetylu by v tomto případě měla být velmi omezená. Výsledek experimentu tento předpoklad potvrdil jen částečně. Dále byl zkoumán vliv MB s různou dobou inokulace na výsledné víno. Byly stanoveny 2 základní termíny očkování: před AF (simultánně s kvasinkami) a po AF (12. den od zaočkování vína ASVK). Na základě senzorického a analytického hodnocení vín se dal posoudit vliv obou typů bakterií, doba inokulace a různé varianty kombinací těchto kritérií, které se nabízely. Výsledkem experimentu realizace MLF v bílých vínech je doporučení inokulace MB před AF. Tento způsob je vhodný při nízkém pH vína, které je určujícím faktorem, zdali MB upřednostní metabolismus sacharidů či nikoliv. Další výhoda je, že kvasinky mohou během AF redukovat vznikající diacetyl až na neutrální 2,3-butandiol. Jedná se tedy o varianty CiNe x před AF a CH 35 x před AF. Tyto kombinace obstály jak v kvalitě, rychlosti a spolehlivosti procesu MLF, tak ve vlivu na senzorickou kvalitu. CiNe bakterie ukázaly svůj potenciál. Kyselina citronová nebyla jejich metabolismem ve variantě před AF téměř zasažena. Tento fakt byl také pozorován při senzorické analýze v téměr nezjištném máselné tónu. Mile překvapily i bakterie CH 35 inokulované před AF, které v RV nedegradovaly kyselinu citronovou ani z poloviny. Tato varianta se ve finále projevila jako černý kůň pokusu, protože získala při degustaci v průměrném bodovém hodnocení 1. místo. Všechny varianty inokulace MB po AF se prezentovaly celkovou MLF. Obecně však MB musí překonávat obtíže způsobené nízkým pH v kombinaci s přítomným etanolem a SO2, ale také nízkou teplotou a stavem živin. Pokus poodhalil, že MLF provedená po AF, může mít na víno ve smylu obsahu diacetylu, neblahý dopad. V tomto ohledu se negativně projevily bakterie CH 35. Bylo také přijato tvrzení, že plošné biologické odbourávání kyselin v bílých vínech není cestou k vyšší kvalitě. Výjimkou nebyla odrůda RR ani RV. Opakem jsou vína vysoce acidní, ve kterých jsou negativa způsobená kyselostí převážena pozitivy MLF. Přínosem této práce je reálné otestování CiNe bakterií v podmínkách bílého vína, jelikož tato kultura není komerčně dostupná pro malovinaře a jejich malé objemy vína. 67
8.
SOUHRN
Vliv malolaktické fermentace na analytické a senzorické parametry bílých vín
Tato diplomová práce se zabývá vlivem malolaktické fermentace na analytické a senzorické parametry bílých vín. Literární část se věnuje růstu populace MB a faktorům ovlivňujících jejich vývoj ve víně, dále metabolismu mléčných bakterií a jeho produktům a vlivu těchto produktů na organoleptické vlastnosti bílých vín. Praktická část se opírá o experiment s inokulací dvou odlišných druhů mléčných bakterií do vína v různých fázích vinifikace a analytické a senzorické vyhodnocení vyrobeného vína. Pro větší šíři dat posloužily dvě odrůdy révy vinné: Ryzlink rýnský a Ryzlink vlašský. Celkem bylo pozorováno a analyzováno deset vzorků vín. Z tohoto množství zůstal zachován vždy jeden kontrolní vzorek od každé odrůdy, ve kterém biologické odbourávání kyselin neproběhlo. Ve zbylých vzorcích vín, které podstoupily malolaktickou fermentaci, se při senzorické analýze hodnotil vliv obou typů bakterií i doba jejich inokulace na výsledné víno. Pokusem bylo potvrzeno, že mají-li mléčné bakterie vhodné podmínky v moštu či víně, mohou transformovat veškerou kyselinu jablečnou na kyselinu mléčnou a zmírnit tak kyselost výsledného vína.
Klíčová slova:
mléčná bakterie, malolaktická fermentace, metabolismus mléčných bakterií
68
9.
RESUME
The influence of malolactic fermentation on analytical and sensory parametrs of white wines This thesis deals with the influence of malolactic fermentation on analytical and sensory characteristics of white wines. Literary section addicts oneself to population growth lactic acid bacteria and factors affecting their development in wine, the metabolism of lactic acid bacteria and their products and how these products influence organoleptic properties of white wines. The practical part deals on the experiment of the inoculation of two different species of lactic acid bacteria in wines at different stages of vinification and on the analytical and sensory evaluation of produced wine. Two wine varieties were used in order to have more data: Rhine Riesling and Welschriesling . Totally, ten samples of wine were observed and analyzed . Always remained one control sample from each variety, which was not the biological degradation of acids. In the remaining samples of wines, that have undergone malolactic fermentation, when sensory analysis evaluated the impact of both types of bacteria and time of inoculation on the resulting wine. Experiment confirmed, that the lactic acid bacteria in a suitable environment in the must or wine, can transform all of malic acid to lactic acid and reduce the acidity of the resulting wine.
Keywords:
lactic acid bacteria, malolactic fermentation, metabolism of lactic acid bacteria
69
10.
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
1. ALEXANDRE, H. et al., 2004. Saccharomyces cerevisiae-Oenococcus oeni interactions in wine: current knowledge and perspectives. Int. J. Food Microbiol. 93, 141-154. 2. ANONYM: Firemní materiály CHR. HANSEN 3. ANONYM: Firemní materiály LA LITTORALE 4. BARTOWSKY, E. J. & HENSCHKE, P. A., 2004. Wine quality and malolactic fermentation, In: MINÁRIK, E., Diacetyl-původce máselné pachuti po malolaktické fermentaci, Vinařský obzor (5/2007), s. 236 5. BAUER, R. & DICKS, L. M. T., 2004. Control of malolactic fermentation in wine. A review. S. Afr. J. Enol. Vitic. 25, 74-88. 6. BEDNÁŘ, M. et al., Lékařská mikrobiologie, Mavril 1996 7. BOU, M., et al., Malolactic fermentation in wine, Montreal 2005, ISBN: 0-9739147-0-X 8. BRITZ, T. J. & TRACEY, R. P., 1990. The combination effect of pH, SO2, ethanol and temperature on the growth of Leuconostoc oenos. J. Appl. Bacteriol. 68, 23-31. 9. CAMPOS, F. M. et al., 2003. Influence of phenolic acids on growth and inactivation of Oenococcus oeni and Lactobacillus hilgardii. J. Appl. Microbiol. 94, 167-174. 10. CARRASCOSA, A. V. et al., Molecular wine mikrobiology, Academic Press, San Diego 2011, ISBN: 978-0-12-375021-1 11. CARRETÉ, R. et al., 2002. Inhibitory effect of sulphur dioxide and other stress compounds in wine on the ATPase activity of Oenococcus oeni. FEMS Microbiol. Lett. 211, 155-159. 12. CAVIN, J. F. et al., 1993. Ability of wine lactic acid bacteria to metabolize phenol carboxylic acids. Am. J. Enol. Vitic. 44, 76-80. 13. COSTELLO, P. J. & HENSCHKE, P. A., 2002. Mousy off-flavour of wine: Precursors and biosynthesis of the causative N-heterocycles, 2-ethyltetrahydropyridine, 2-acetyltetrahydropyridine and 2-acetyl-1-pyrroline by Lactobacillus hilgardii DSM 20176. J. Agric. Food Chem. 50, 7079-7087. 14. COUTO, J. A. et al., 1996. Ethanol induced changes in the fatty acid composition of Lactobacillus hilgardii, its effects on plasma membrane fluidity and relationships with ethanol tolerance. J. Appl. Bacteriol. 81, 126-132. 15. DAVIS, C. R. et al., 1986b. Growth and metabolismof lactic acid bacteria during fermentation and conservation of some Australian wines. Food Technol. Aust. 38, 35-40. 16. DU PLESSIS, L. D. W., 1963. The microbiology of South African winemaking. Part V. Vitamin and amino acid requirements of lactic acid bacteria from dry wines. S. Afr. J. Enol. Sci. 6, 485-494. 17. EDER, R., et al., Vady vína, Národní vinařské centrum 2006, ISBN: 80-903201-6-3 18. FABIANA M. et al., 2007. Improvement of a Chemically Defined Medium for the Sustained Growth of Lactobacillus plantarum: Nutritional Requirements. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia, Universidad Nacional de Tucumán, Ayacucho, 491 4000, Tucumán, Argentina, 414–418.
70
19. FUGELSANG, K. C. & EDWARDS, C. G., 1997 (2nd ed). Wine Microbiology: Practical Applications and Procedures. Springer, New York. 20. G-ALEGRÍA, E. et al., 2004. High tolerance of wild Lactobacillus plantarum and Oenococcus oeni strains to lyophilisation and stress environmental conditions of acid pH and ethanol. FEMS Microbiol. Lett. 230, 53-61. 21. GARCÍA-RUIZ, A. et al., 2008. Potential of phenolic compounds for controlling lactic acid bacteria growth in wine. Food Control 19, 835-841. 22. GRIMALDI, A. et al., 2000. Identification and partial characterization of glycosidic activities of commercial strains of the lactic acid bacterium, Oenococcus oeni. Am. J. Enol. Vitic. 51, 362-369. 23. GUILLOUX-BENATIER, M. & CHASSAGNE, D., 2003. Comparison of components released by fermented or active dried yeasts after aging on lees in a model wine. J. Agric. Food Chem. 51, 746-751. 24. GUZZO, J. et al., 1998, Increase of sulfite tolerance in Oenococcus oeni by means of acidic adaptation. FEMS Microbiology Letters, 160: 43–47. 25. HENICK-KLING, T., 1993. Malolactic fermentation. In: FLEET, G. H. (ed.). Wine Microbiology and Biotechnology, Harwood Academic Publishers, Chur, Switzerland, pp. 289-326. 26. HENICK-KLING, T., 1995. Control of malolactic fermentations in wine: energetics,flavour modification and methods of starter culture preparation. J. Appl. Bacteriol.79, 29-37. 27. HERNÁNDEZ, T. et al., 2006. Phenolic compounds in red wine subjected to industrial malolactic fermentation and ageing on lees. Analytica Chimica Acta, 563, 116-125. 28. HERRERO et al., 1998. Changes in Organic Acids During Malolactic Fermentation at Different Temperatures in Yeast-Fermented Apple Juice. Department of chemical engineering and environmental technology, University of Oviedo, Spain, 191-195 29. HORNSEY, I., The Chemistry and Biology of Winemaking, The Royal Society of Chemistry 2007, ISBN-13: 978-0-85404-266-1 30. CHU-KY, S. et al., 2005. Combined cold, acid, ethanol shocks in Oenococcus oeni: Effects on membrane fluidity and cell viability. Biochim. et Biophys. Acta 1717, 118-124. 31. JACKSON, R. S., Wine science – principles and Applications, Academic Press, San Diego 2008, ISBN: 978-0-12-373646-8 32. JUSSIER, D. et al., 2006. Effect of simultaneous inoculation with yeast and bacteria on fermentation kinetics and key wine parameters of cool-climate Chardonnay. Appl. Environ. Microbiol. 72, 221-227. 33. KOEBMANN, B. J. et al., 2000. The membranebound H+ -ATPase complex is essential for growth of Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 182, 4738-4743. 34. KÖNIG, H. et al., Biology of Microorganisms on Grapes, in Must and in Wine, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 2009, ISBN: 978-3-540-85462-3 35. KUNKEE, R. E., 1967. Malolactic fermentation. Adv. Appl. Microbiol. 9, 235-279. 36. LARSEN, J. T. et al., 2003. Impact of different strains of Saccharomyces cerevisce on malolactic fermentation by Oenococcus oeni. Am. J. Enol. Vitic. 54, 246-251. 71
37. LEE, J. E. et al., 2009. Characterisation of fermentative behaviours of lactic acid bacteria in grape wines through 1H-NMR- and GC-based metabolic profiling. J. Agric. Food Chem. 57, 4810-4817. 38. LERM, E. et al., 2010. Malolactic fermentation: The ABC´s of MLF. In: S. Afr. J. Enol. Vitic. Stellenbosh univerzity Library and informatik service [online]. [cit. 2013-02-03]. Dostupné z http://www.sasev.org/ 39. LIU, S. Q., 2002, Malolactic fermentation in wine – beyond deacidification. Journal of Applied Microbiology, 92: 589–601. 40. LLORET, A. et al., 2002. Aroma variation in Tannat wines: Effect of malolactic fermentation on ethyl lactate level and its enantiomeric distribution. Ital. J. Food. Sci. 14, 175-180. 41. LONVAUD-FUNEL, A. et al., 1991. Specific enumeration of lactic acid bacteria in fermenting grape must and wine by colony hybridisation with nonisotopic DNA probes. J. Appl. Bacteriol. 71, 501-508. 42. MAICAS, S. et al., 1999. Improvement of volatile composition of wines by controlled addition of malolactic bacteria. Food Res. Int. 32, 491. 43. MALHERBE, S. Investigation of the impact of commercial malolactic fermentation starter cultures on red wine aroma compounds, sensory properties and consumer preference. Disertační práce. Stellenbosch: Stellenbosch University, 2010. 44. MATTHEWS, A. et al., 2004. Lactic acid bacteria as a potential source of enzymes for use in vinification. Appl. Environ. Microbiol. 70, 5715-5731. 45. McMAHON, H. et al., 1999. Quantification of glycosidase activities in selected yeasts and lactic acid bacteria. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 23, 198-203. 46. MORENO-ARRIBAS et al., 2005. Winemaking microbiology and biochemistry: current knowledge and future trends. Crit. Rev. Food Sci Nutr., 45, 265–286. 47. MORENO-ARRIBAS et al., 2009. Wine chemismy and biochemistry, Springer Science+Business Media, New York, ISBN: 978-0-38774116-1 48. NEHME, N. et al., 2008. Quantitative study of interactions between Saccharomyces cerevisiae and Oenococcus oeni strains. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 35, 685-693. 49. NELSON, L., 2008. The production of volatile phenols by wine microorganisms. Thesis, Stellenbosch University, Private Bag X1, 7602 Matieland (Stellenbosch), South Africa. 50. OSBORNE, J. P. & EDWARDS, C. G., 2006. Inhibition of malolactic fermentation by Saccharomyces during alcoholic fermentation under low- and high nitrogen conditions: A study in synthetic media. Aust. J. Grape Wine Res. 12, 69-78. 51. PAVLOUŠEK, P., Encyklopedie révy vinné, Computer Press, a.s., Brno 2007, IBSN: 978-80-251-1704-0 52. PAVLOUŠEK, P., Pěstování révy vinné, Grada publishing, a. s., Praha 2011, ISBN: 978-80-2473314-2 53. PAVLOUŠEK, P., Výroba vína u malovinařů, 2. Aktualizované a rozšířené vydání, Grada publishing, a. s., Praha 2010, ISBN: 978-80-247-3487-3 54. PRIPIS-NICOLAU, L. et al., 2004. Methionine catabolism and production of volatile sulphur compounds by Oenococcus oeni. J. Appl. Microbiol. 96, 1176-1184. 72
55. RIBÉREAU-GAYON P. et al., 1975. In Trait´e d’OEnologie. Sciences et Techniques du Vin, vol. 2. Dunod, Paris. 56. RIBÉREAU-GAYON, P. et al., Handbook of Enology: The Microbiology of Wine and Vinifications, Volume 1, John Wiley & Sons 2006, ISBN: 0-470-01034-7 57. ROZÈS, N. & PEREZ, C., 1998. Effects of phenolic compounds on the growth and the fatty acid composition of Lactobacillus plantarum. Appl. Microbiol. Biotech. 49, 108-111. 58. SAUVAGEOT, F. et al., Effects of malolactic fermentation on sensory properties of four Burgundy wines. Am. J. Enol. Vitic. 1997, 48, 187-192. 59. SEFTON, M. A. et al., 1993. The volatile composition of Chardonnay juices: a study by flavor precursor analysis. Am. J. Enol. Vitic. 44, 359-370. 60. STEIDL, R. et al., Sklepní hospodářství, Národní salon vín, 2002. ISBN: 80-903201-0-4 61. SWIEGERS, J. H. et al., 2005. Yeast and bacterial modulation of wine aroma and flavour. Aust. J. Grape Wine Res. 11, 139-173. 62. THÉODORE, D. et al., 2005. Bacterial nutritionthe key to successful malolactic fermentation. Aust. N. Z. Grapegrow. Winemak. April, 65-68. 63. VALLET, A. et al., 2008. Pathways that produce volatile sulphur compounds from methionine in Oenococcus oeni. J. Appl. Microbiol. 104, 1833-1840. 64. VIVAS, N. et al., 1997. Effect of phenolic acids and anthocyanins on growth, viability and malolactic activity of a lactic acid bacterium. Food Microbiol. 14, 291-300. 65. WIBOWO, D. et al., 1985. Occurrence and growth of lactic acid bacteria in wine: A review. Am. J. Enol. Vitic. 36, 302-313.
73
