MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE
VLIV KOLOIDNÍHO STŘÍBRA A DALŠÍCH CHEMICKÝCH LÁTEK NA VYBRANÉ ORGANISMY Diplomová práce
Zdeněk Pokorný
Vedoucí práce: doc. RNDr. Alena Žákovská, Ph.D.
1
Brno 2015
Bibliografický záznam Autor:
Název práce:
Bc. Zdeněk Pokorný Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Vliv koloidního stříbra a dalších chemických látek na vybrané organismy
Studijní program:
Experimentální biologie
Studijní obor:
Speciální biologie
Vedoucí práce:
doc. RNDr. Alena Žákovská, Ph.D.
Akademický rok:
2014/2015
Počet stran:
53
Klíčová slova:
stříbrné nanočástice, zlaté nanočástice, antibakteriální účinek, Escherichia coli K12, Bacillus cereus CCM 2010, bioluminiscence, turbidimetrie
2
Bibliographic Entry Author
Title of Thesis:
Bc. Zdeněk Pokorný Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Effect of colloidal silver and other chemicals on selected organisms
Degree programme:
Experimental Biology
Field of Study:
Special Biology
Supervisor:
doc. RNDr. Alena Žákovská, Ph.D.
Academic Year:
2014/2015
Number of Pages:
53
Keywords:
silver nanoparticles, gold nanoparticles, antibacterial effect, Escherichia coli K12, Bacillus cereus CCM 2010, bioluminescence, turbidimetry
3
Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá účinky stříbrných a zlatých nanočástic na zástupce gram-negativních a gram-pozitivních mikroorganismů. V první části práce se nachází literární přehled o přípravě, antibakteriálních účincích a mechanismech účinku zlatých a stříbrných nanočástic. Experimentální část práce se zabývá porovnáním účinku stříbrných a zlatých nanočástic na bakterie. Jako zástupce gram-negativních bakterií byla vybrána Escherichia coli K12 s plazmidem pEGFPluxABCDEAmp a zástupcem grampozitivních mikroorganismů byl Bacillus cereus CCM 2010. Koloidní stříbrné nanočástice byly připraveny pomocí elektrolýzy a největší zastoupení měly nanočástice s průměrnou velikostí 10 nanometrů. Byly použity dva druhy zlatých nanočástic, které byly připraveny chemickou redukcí: zlaté nanočástice NanoFlowers s průměrnou velikostí částic
88
nanometrů;
zlaté
polyhedrální
nanočástice
s průměrnou
velikostí
60 nanometrů. Diplomová práce předkládá výsledky z ověření antibakteriálních účinků, při kterých byly použity dvě metody bioluminiscenční a turbidimetrické stanovení viability bakterií. Stříbrné nanočástice dosahovaly očekávaných výsledků. Byla stanovena inhibiční koncentrace IC50, která potlačuje růst bakterií o 50%. Naprosto opačně působily zlaté nanočástice na mikroorganismy, jelikož nevykazovaly žádný antibakteriální účinek. Práce je zakončena diskuzí s autory věnujícími se studiu stejného tématu.
4
Abstract This diploma thesis deals with the effects of silver and gold nanoparticles on representative of gram-negative and gram-positive microorganisms. The first part is a literature review about the preparation, antibacterial effects and mechanisms of action of gold and silver nanoparticles. The experimental part of the work deals with comparing the effect of silver and gold nanoparticles on bacteria. Escherichia coli K12 with plasmid pEGFPluxABCDEAmp was chosen as a representative of Gram-negative bacteria and Bacillus cereus CCM 2010 was a representative of gram-positive microorganism. Colloidal silver nanoparticles were prepared by electrolysis, and the largest representation had nanoparticles with average size of 10 nanometres. It was used two kinds of gold nanoparticles, which have been prepared by chemical reduction: gold nanoparticles NanoFlowers with an average particle size of 88 nanometres; polyhedral gold nanoparticles with an average size of 60 nanometres. This thesis presents the results of the verification antibacterial effects, in which were used two methods: bioluminescent and turbidimetric determination of viability of bacteria. Silver nanoparticles reached the expected results. It was determined inhibitory concentration IC50 that inhibits bacterial growth by 50%. Gold nanoparticles caused on microorganisms absolutely oppositely, because they showed no antibacterial activity. This thesis is terminated by discussions with authors committed to the study of the same issue.
5
6
7
Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat své školitelce, paní doc. RNDr. Aleně Žákovské, Ph.D., za veškerou pomoc, kterou mně poskytla při provádění experimentů a následně při vypracovávání mé diplomové práce. Také bych chtěl poděkovat doktorům Liboru Vojtkovi a Pavlu Dobešovi za pomoc při řešení technických problémů s luminometrem a za poskytnutí rad ohledně zpracování výsledků. Dále bych chtěl poděkovat panu profesorovi Esa-Matti Liliusovi za poskytnutí bakterie E. coli K12 s plazmidem pro luciferázu a také panu profesoru Havlovi a jeho studentce Mgr. Lence Kolářové za poskytnutí obou druhů zlatých nanočástic. Velké díky také patří mé rodině, která za mnou neochvějně stála po dobu celého mého studia a bez které bych tuto práci nedokázal vypracovat.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.
Brno 11. 5. 2015
……………………………… Jméno Příjmení
8
Obsah 1.
Úvod ............................................................................................................................. 10 1.1. Co to jsou nanočástice? ............................................................................................ 11 1.2. Zlato .......................................................................................................................... 12 1.2.1. Příprava nanočástic zlata .................................................................................... 12 1.2.2. Antibakteriální účinek nanočástic zlata ................................................................ 13 1.2.3. Mechanismy účinku nanočástic zlata .................................................................. 18 1.2.4. Využití zlatých nanočástic ................................................................................... 19 1.3. Stříbro ....................................................................................................................... 20 1.3.1. Příprava nanočástic stříbra ................................................................................. 20 1.3.2. Antibakteriální účinek nanočástic stříbra ............................................................. 21 1.3.3. Mechanismus účinku nanočástic stříbra .............................................................. 24 1.3.4. Využití nanostříbra .............................................................................................. 25 1.4. Mikroorganismy ......................................................................................................... 27
2. Cíle práce ........................................................................................................................ 32 3. Materiály a metody........................................................................................................... 32 3.1. Mikroorganismy a jejich uchovávání .......................................................................... 32 3.2. Příprava nanočástic stříbra ....................................................................................... 32 3.3. Příprava nanočástic zlata .......................................................................................... 34 3.4. Analýza velikosti stříbrných nanočástic ..................................................................... 34 3.5. Analýza velikosti zlatých nanočástic .......................................................................... 34 3.6. Bioluminiscenční stanovení viability bakterií .............................................................. 34 3.7. Turbidimetrické stanovení viability bakterií ................................................................ 35 3.8. Statistická analýza ..................................................................................................... 36 4. Výsledky .......................................................................................................................... 37 4.1. Velikost stříbrných nanočástic ................................................................................... 37 4.2. Velikost zlatých nanočástic ........................................................................................ 37 4.3. Bioluminiscenční stanovení viability bakterií .............................................................. 39 4.4. Turbidimetrické stanovení viability bakterií ................................................................ 42 5. Diskuze ............................................................................................................................ 44 6. Závěr ............................................................................................................................... 46 7. Seznam zkratek ............................................................................................................... 47 8. Seznam literatury: ............................................................................................................ 48
9
1. Úvod V posledních letech registrujeme nárůst rezistence mikroorganismů proti dosud objeveným nebo uměle připraveným antibiotikům. To je způsobeno jejich nadměrným užíváním v medicíně, při chovu domácích zvířat a přidáváním do různých druhů potravin, jako prevence proti mikroorganismům. Z tohoto hlediska si za zvýšení rezistence mikroorganismů k antibiotikům může lidstvo samo. Vyvíjejí se další antibiotika, která by byla účinnější, než ta doposud používaná, a vyřešila by tento problém. Existuje však i jiná cesta, než vývoj nových antibiotik, který by mohl vést k dalšímu zvyšování rezistence mikroorganismů. Touto cestou by mohlo být používání nanočástic. Zájem je zaměřen především na nanočástice stříbra a zlata. Vždyť již ve starověkém Římě se stříbro využívalo pro své antibakteriální účinky. Byly vyráběny stříbrné poháry, ze kterých se pilo nebo se do nádob vkládaly stříbrné mince (Hájková s Šmejkal 2010, Kleilová a Bencko 2010). Stříbro je již dnes známé pro své antibakteriální účinky, a tudíž by se mohlo stát částečným řešením pro výše zmíněné problémy s rezistencí mikroorganismů. Nanočástice jsou využívány nejen v biologických oborech a medicíně, ale také v chemii, fyzice, elektronice, potravinářském průmyslu, textilním průmyslu, stavebnictví, sportu, kosmetice a v mnoha dalších oblastech (Hájková s Šmejkal 2010).
10
1.1. Co to jsou nanočástice?
Nanotechnologie je v posledních letech velmi rychle se vyvíjející interdisciplinární obor (Hošek 2010, Hájková s Šmejkal 2010). Jako zakladatel tohoto odvětví je obvykle uváděn fyzik Richard P. Feynman (1918-1988), který ve svém příspěvku nazvaném There’s Plenty of Room at the Bottom (Tam dole je spousta místa) nastínil možnosti nanotechnologie (Šrámek 2009). Odvětví nanotechnologie můžeme rozdělit do čtyř hlavních skupin: nanoelektronika, nanomateriály, molekulární nanotechnologie a mikroskopy s nanometrovou rozlišovací schopností (Hájková s Šmejkal 2010). Ve své práci se budu zabývat nanomateriály, a to konkrétně některými vybranými nanočásticemi. Slovo nanočástice je tvořeno dvěma slovy. Slovo částice má jasný význam, ale slovo nanos je odvozeno z řečtiny a znamená trpaslík. Jejich velikost se pohybuje v řádu nanometrů, což je 10-9 metru a to v rozmezí od 1 nm do 100 nm (Šrámek 2009, Hájková s Šmejkal 2010). Abychom částici mohli považovat za nanočástici, je třeba využívat chemických a fyzikálních vlastností na úrovni atomů a molekul. Tyto látky mají neobvyklé vlastnosti oproti látkám nebo systémům, které nejsou tvořeny nanočásticemi a musí být schopny tvořit větší struktury, které mají důsledky do makrosvěta. Tvorba shluků může být náhodná (Hošek 2010), ale také záměrná. Takto jsou tvořeny například nanodráty, nanotrubice, nanokompozity a mnohé další struktury (Prnka a Šperlink 2006). Neméně důležitou charakteristikou je velmi vysoký poměr mezi plochou nanočástic a jejich objemem (Ikhmayies 2014). Díky tomu jsou nanočástice mnohem více reaktivní a získávají nové vlastnosti oproti částicím z makrosvěta (Hájková s Šmejkal 2010). Díky dosažené technické úrovni lze zjistit nepřeberným množstvím technik vlastnosti nanočástic. Používá se elektronová mikroskopie, mikroskopie atomárních sil, rentgenová difrakce, neutronová difrakce, rentgenová fluorescenční spektrometrie, měření kontaktního úhlu (Ikhmayies 2014) nebo dynamického rozptylu světla (Hall a kol. 2007).
11
1.2. Zlato Zlato je žlutý a drahý kov, který patří mezi d-prvky, konkrétně mezi prvky skupiny mědi. Za normálních podmínek se jedná o velice stálý kov. Rozpouští se jen v lučavce královské, což je směs koncentrované kyseliny dusičné a chlorovodíkové v poměru 1:3. Zlato je kujné a tažné a dobře vede teplo i elektrický proud (Vacík a kol. 1999).
1.2.1. Příprava nanočástic zlata V odborné literatuře lze najít obrovské množství možností, jak lze připravit nanočástice zlata. Pro představu si uvedeme pár příkladů. Nanočástice zlata se dají připravit rozpuštěním 4, 6-diamino-2-pyrimidinthiolu v roztoku metanolu, kyseliny octové, Tween 80 a trihydrátu kyseliny chlorozlatité v ledové lázni. Po kapkách se přidá tetrahydridoboritan sodný a míchá se po dobu jedné hodiny. Po uplynutí této doby se odstraní metanol ve vakuu při 40°C a do zbylé směsi se přidá deionizovaná voda. Roztok je dále dialyzován v neionizované vodě po dobu 48 hodin a následovně je sterilizován přes 22 µm filtr a skladován při teplotě 4°C (Zhao a kol. 2010). Příprava nanočástic zlata za použití chemických nebo fyzikálních metod je poměrně častá. Existují však i jiné, biologické metody. Jako příklad si můžeme uvést využití extraktu z jednobuněčných organismů, jako jsou bakterie (Ahmad a kol. 2003, Nair a Pradeep 2002) nebo mnohobuněčných jako houby (Mukherjee a kol. 2001), ale také za využití extraktů z rostlin například listy pelargónie (Shankar a kol. 2003), voňatka citronová (Shankar a kol. 2004) nebo aloe pravá (Chandran a kol. 2006). Jako příklad je uvedena příprava nanočástic zlato pomocí nebuněčného extraktu z kvasinky Candida albicans. Nebuněčný extrakt z výše uvedené kvasinky byl připraven přidáním buněk kvasinky do YPD (Yeast extract Peptone Dextrose) média, které bylo suspendováno v médiu na mletí (sacharóza, Tris HCl, polymetyl sulfonyl fluorid a skleněné kuličky). Směs byla narušena v homogenizátoru během 9 cyklů (10 sekund s vibracemi 4000 za minutu). Homogenizát se následně odstředil a oddělily se neporušené buňky a skleněné kuličky a následně se znovu centrifuguje. Takto připravený supernatant byl použit pro přípravu nanočástic zlata. Při přípravě nanočástic byl použit 0,01 molární vodný roztok kyseliny chlorozlatité. Ta byla přidána to kyvety a s ní výše uvedený nebuněčný extrakt. Směs byla zředěna a na 48 hodin inkubována při 35 °C na třepačce. Získaný produkt byl následně tři-krát promyt, z toho dva-krát deionizovanou vodou (Ahmad a kol. 2013).
12
1.2.2. Antibakteriální účinek nanočástic zlata Antibakteriální účinek nanočástic zlata je přímo úměrný velikosti částic a jejich tvaru. Čím jsou nanočástice menší, tím je zajištěn i větší antibakteriální účinek (Naraginti a Sivakumar 2014, Uma Suganya a kol. 2015). Na Obrázku 1 můžete vidět příklad zlatých nanočástic.
Obrázek 1: Zlaté nanočástice z transmisní elektronové mikroskopie (TEM).
Účinek nanočástic zlata se také liší s ohledem na druh mikroorganismu. Gramnegativní mikroorganismy jsou na účinky nanočástic zlata více citlivé než mikroorganismy gram-pozitivní (Ahmad a kol. 2013, Naraginti a Sivakumar 2014). To je způsobeno rozdílnou strukturou buněčné stěny. Gram-negativní mikroorganismy mají dvě fosfolipidové membrány. Jedna je vnitřní a druhá vnější. Mezi těmito dvěma membránami je periplazmatický prostor, který je vyplněn peptidoglykenem mureinem, který je tvořen N-acetylglukosaminem a kyselinou N-acetylmuramovou. Tyto dva řetězce jsou spojeny β-(1,4)-glykosidickou vazbou. Zesíťování těchto řetězců zajišťují boční řetězce tvořené L-alaninem, D-glutamátem a kyselinou meso-diaminopimelovou. Ve vnější membráně nalezneme poriny, které slouží pro neselektivní transport látek, lipopolysacharidy a také Braunův lipoprotein, který ukotvuje vnější membránu do peptidoglykanu mureinu. Schéma Gram-negativní buněčné stěny, Obrázek 2 (Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999; Votava 2005). Gram-pozitivní buněčná stěna (Obrázek 3) má pouze vnitřní membránu, na které je několik vrstev peptidoglykanu mureinu. Ten je složen ze stejných molekul jako u gramnegativních mikroorganismů, ale boční řetězce jsou tvořeny pentapeptidem D-alanyl-Dalanyl-D-lysin-D-glutanyl-L-lysin. Při tvorbě vazeb se vždy terminální D-alanin ztrácí
13
(Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999). Pevné spojení všech vrstev peptidoglykanu zajišťuje kyselina teichoová a lipoteichoová (Votava 2005).
Obrázek 2: Schéma gram-negativní buněčné stěny mikroorganismu.
14
Obrázek 3: Schéma gram-pozitivní buněčné stěny mikroorganismu.
Účinek nanočástic zlata na gram-pozitivní i gram-negativní mikroorganismy je vidět na Obrázku 4. Minimální inhibiční koncentrace (MIC) byla v tomto případě stanovena jako 80 % snížení absorbance oproti kontrole. Pro toto stanovení byla zvolena metoda turbidimetrie. MIC pro zlaté nanočástice byla 128 µg/ml pro gram-negativní mikroorganismy, respektive 512 µg/ml pro gram-pozitivní mikroorganismy. Průměrná velikost nanočástic byla 5 nanometrů s převážně kulovitým tvarem. Za zástupce gram-negativních mikroorganismů byla vybrána bakterie Escherichia coli a gram-pozitivních mikroorganismů Staphylococcus aureus. Pro porovnání je v grafu vyznačen i účinek nanočástic stříbra. Křivky v grafu vypadají podobně, ale použitá koncentrace nanočástic stříbra je výrazně nižší, než je tomu u nanočástic zlata. U gram-negativní bakterie Escherichia coli byla použita koncentrace nanočástic stříbra
8 µg/ml a pro gram-pozitivní bakterii Staphylococcus aureus
32 µg/ml, průměrná velikost nanočástic byla 30 nanometrů a měly kulovitý tvar. Další srovnání je na Obrázku 5, který znázorňuje zónu inhibice pro daný druh mikroorganismu (Ahmad a kol. 2013). Účinek různých koncentrací nanočástic zlata je vidět na Obrázku 6. Byly zde použity dva druhy mikroorganismů Bacillus subtilis a Staphylococcus aureus. I když obě bakterie patří mezi gram-pozitivní mikroorganismy, objevil se významný rozdíl v odpovědi na zvyšující se koncentraci nanočástic zlata. Použité koncentrace byly 10, 50, 100, 150 a 200 µg/ml a velikost částic se pohybovala v rozmezí od dvou do osmi nanometrů. V pokusu byl sledován i vliv proteinu z řasy Spirulina platensis. Účinek tohoto proteinu byl zkoumán
15
z důvodu jeho využití při přípravě zlatých nanočástic. Tyto nanočástice jsou tak obalené tímto proteinem. Pokus byl prováděn pomocí měření optické hustoty vzorku s následným přepočítáním na počet buněk (Uma Suganya a kol. 2015)
Obrázek 4: Ovlivnění růstu mikroorganismů Escherichia coli (a) a Staphylococcus aureus (b) nanočásticemi zlata a stříbra.
16
Obrázek 5: Pozorované zóny inhibice zlatých a stříbrných nanočástic proti mikroorganismům Escherichia coli a Staphylococcus aureus. ZOI – zóna inhibice.
Obrázek 6: Antibakteriální účinek nanočástic zlata proti mikroorganismům Bacillus subtilis (A) a Staphylococcus aureus (B).
17
1.2.3. Mechanismy účinku nanočástic zlata Ještě donedávna nebylo jasné, jak přesně účinkují nanočástice zlata na bakteriální buňku. Některé z těchto účinků jsou však již známé. Dochází ke snížení potenciálu buněčné stěny, což vede ke snížení množství ATP (Cui a kol. 2012). Na dalším snížení hladiny ATP se podílí i down-regulace proteinů AtpA a AtpD. Tyto proteiny patří mezi podjednotky F-typu ATP syntázy (Cui a kol. 2012). Zlaté
nanočástice mají také vliv na
chemotaxi mikroorganismů.
Zpočátku
se mikroorganismy ovlivněné nanozlatem pohybují rychleji, než ty neovlivněné, ale postupem času ztrácí svou pohyblivost. Snížení pohyblivosti je pravděpodobně důsledkem vyčerpání ATP z výše uvedených důvodů (Cui a kol. 2012). Zlaté nanočástice také přímo působí na bakteriální buněčnou stěnu (Obrázek 7). Způsobují její nepravidelný tvar a poškozují její funkci jakožto ochranou membránu před vnějším prostředím (Uma Suganya a kol. 2015).
Obrázek 7: Vliv zlatých nanočástic na membránu gram-pozitivních mikroorganismů Bacillus subtilis (A) a Staphylococcus aureus (B).
18
1.2.4. Využití zlatých nanočástic Zlaté nanočástice se spíše využívají jako nosiče pro různá léčiva (Giljohann a kol. 2010). Je možno je využít i jako stabilizační činidlo liposomů, které také ve svém středu nesou léčivou látku (Pornpattananangkul a kol 2011). Zlaté nanočástice jsou často využívány jako povrchy pro biosenzory. Tato metoda je založena na více postupech. V prvním se využívá hydrofilních vlastností zlata a druhý je založen na chemisorpci, která se dělí podle použitých molekul na thiolovou a nethiolovou. Thiolové molekuly obsahují síru, která reaguje se zlatými molekulami. Nethiolové molekuly se většinou využívají na stabilizaci koloidních nanočástic (Měch 2014). Zlaté nanočástice se dají využívat i v radiodiagnostice. Mají totiž vyšší absorpci rentgenového záření a vyšší biologický poločas než jodové kontrastní látky (Šrámek 2009). Další možností využití je při detekci antigenu, nukleových kyselin, enzymatických reakcí a spoustě dalších reakcí (Wilson 2008). Dalším využitím je značení protilátek zlatými nanočásticemi nebo jako elektromagnetické zesílení signálu v Ramanově spektroskopii (Svobodová a kol. 2009).
19
1.3. Stříbro
Stříbro je bílý kov a stejně jako zlato patří mezi d-prvky a do prvků skupiny mědi. Na vzduchu černá účinkem sulfanu a mezi jeho nejdůležitější sloučeniny patří jeho sloučeniny s halogeny, kterých se využívá při fotografování. Je kujné a tažné a dobře vede teplo i elektrický proud (Vacík a kol. 1999).
1.3.1. Příprava nanočástic stříbra Příprava nanočástic stříbra se v průběhu let výrazně změnila. Zprvu používanou elektrolýzu nahradily chemicko-fyzikální děje, které zahrnují redukční činidla, dodávání tepla nebo mikrovlnné procesy. Tyto reakce však vyžadují použití toxických a nebezpečných látek pro životní prostředí (Devi a Joshi 2014). Tato změna byla provedena z důvodu stabilizace nanočástic stříbra již při jejich přípravě. Pro snížení toxicity při přípravě nanočástic stříbra se začalo využívat přírodních činidel a stabilizátorů. Existují již ověřené přípravy nanočástic stříbra a výsledkem je zjištění antibakteriálních vlastností takto připravených nanočástic. Jedná se o přípravy z rostlin (Seralathan a kol. 2014, Naraginti a Sivakumat 2014), mikroskopických hub (Gade a kol. 2014, Ahmad a kol. 2013, Devi a Joshi 2014) nebo i přímo z mikroorganismů (Tamboli a Lee 2013). Konkrétně příprava nanočástic stříbra z (MTCC 2210).
Mikroorganismus
byl
kultivován
mikroorganismu Phoma glomerata v bramborově-dextrózovém
médiu
na třepačce při 25 °C a 120 otáčkách za minutu po 96 hodin. Poté byl přefiltrován přes filtrační papír. Biomasa byla třikrát až čtyřikrát promyta destilovanou vodou a následně míchána v Erlenmayerově baňce se 100 mililitry destilované vody po dobu 24 hodin, teplotě 25 °C a 120 otáčkách za minutu. Po kultivaci byla biomasa opět přefiltrována a filtrát byl smísen s roztokem dusičnanu stříbrného (1 milimolární koncentrace) v poměru 1:1 a i biomasa byla smíchána s tímto roztokem. Tyto roztoky byly dále inkubovány za výše zmíněných podmínek a za přítomnosti slunečního světla (Gade a kol. 2014). Další zajímavá příprava je pomocí extraktu z rostliny Salicornia brachiata. Nadzemní část rostliny byla vysušena a rozmělněna na prášek, který byl vyluhován v pročištěné vodě. Po 24 hodinách byl extrakt přefiltrován přes filtrační papír. Tento postup byl třikrát opakován a následně byla odpařena voda za sníženého tlaku a poté byl vzorek lyofilizován (odpařování vody ze zmraženého vzorku ve vakuu [URL 2]). Takto připravený vzorek byl smíchán s destilovanou vodou a přefiltrován přes filtrační papír. Filtrát byl smíchán s roztokem dusičnanu stříbrného a změna barvy z čiré na žlutou naznačovala tvorbu stříbrných nanočástic (Seralathan a kol. 2014).
20
1.3.2. Antibakteriální účinek nanočástic stříbra Podle mnoha studií mají nanočástice stříbra (Obrázek 8) silnější antibakteriální účinky, než je tomu u nanočástic zlata, avšak princip jejich účinku je shodný. Menší částice mají silnější antibakteriální účinky (Naraginti a Sivakumar 2014, Souza e Silva a kol. 2013). V literatuře se popisuje, že gram-negativní mikroorganismy jsou více citlivé na nanostříbro než grampozitivní mikroorganismy (Tamboli a Lee 2013, Ahmad a kol. 2013).
Obrázek 8: Snímek nanočástic stříbra z TEM.
Tabulka 1 ukazuje zónu inhibice, minimální inhibiční koncentraci (MIC) a minimální baktericidní koncentraci (MBC) stříbrných nanočástic o průměrné velikosti 52 nanometrů. MIC byla v tomto případě definována jako nejnižší koncentrace stříbrných nanočástic, která inhibuje viditelný růst mikroorganismu po 18 hodinové inkubaci při 37 °C. MBC byla definována jako nejnižší koncentrace nanočástic, která zabije 99,9 % bakterií. Zástupcem gram-negativních mikroorganismů byla Escherichia coli a gram-pozitivních Staphylococcus aureus. Suspenze buněk, použitá pro zjištění zóny inhibice, měla koncentraci 104 – 105 CFU/ml. 100 µl této suspenze bylo rovnoměrně aplikováno na agar a po 24 hodinové kultivaci při 35 °C byly vysekány jamky a do nich napipetováno 100 µl nanočástic stříbra (Valodkar a kol. 2011).
21
Tabulka 1: Zóna inhibice, MIC a MBC koncentrace nanočástic stříbra proti Staphylococcus aureus a Escherichia coli (převzato z Valodkar a kol 2011).
Bakterie
Zóna inhibice [cm]
MIC [mg/l]
MBC [mg/l]
Staphylococcus aureus
1,7
0,34
1,62
Escherichia coli
2,1
0,26
0,78
Vliv různých koncentrací nanočástic stříbra na čtyři druhy mikroorganismů je vidět na Obrázku 9. Použité koncentrace byly 1, 5, 10 a 15 mikromolární s průměrnou velikostí částic 5,5 ± 3,1 nanometrů. Růst bakterií byl zaznamenáván pomocí absorbance při 600 nanometrech po dobu 30 hodin. Na grafech je vidět, že nanočástice způsobily zpožděný růst mikroorganismů, ale i tak mikroorganismy, které byly ovlivněny nanostříbrem, nedosahovaly hodnot absorbance jako mikroorganismy neovlivněné nanočásticemi stříbra. Experiment byl proveden na čtyřech druzích bakterií: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica a Enterococcus faecalis. Tyto grafy ukazují vyšší citlivost gramnegativních mikroorganismů na stříbrné nanočástice. Při 10 mikromolární koncentraci začaly růst gram-negativní mikroorganismy po 24 hodinách po aplikaci nanočástic. Naproti tomu gram-pozitivní bakterie začali růst při stejné koncentraci nanostříbra po 14 respektive 16 hodinách po aplikaci stříbrných nanočástic (Devi a Joshi 2014).
Obrázek 9: Vliv různých koncentrací nanočástic stříbra na mikroorganismy Escherichia coli (A), Salmonella enterica (B), Staphylococcus aureus (C) a Enterococcus faecalis (D).
22
Vliv vyšší koncentrace stříbrných nanočástic, konkrétně 100 µg/ml, je vidět na Obrázku 10. Průměrná velikost nanočástic byla 30 nanometrů. Byly použity čtyři mikroorganismy: Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli a Staphylococcus aureus (Tamboli a Lee 2013). Na rozdíl od výše uvedených grafů není zde vidět opožděný růst mikroorganismů, které jsou ovlivněny nanostříbrem.
Obrázek 10: Vliv stříbrných nanočástic o koncentraci 100 µg/ml na mikroorganismy Salmonella typhimurium (a), Pseudomonas aeruginosa (b), Escherichia coli (c) a Staphylococcus aureus (d). - Kontrola bez ovlivnění stříbrnými nanočásticemi; - Bakterie ovlivněné stříbrnými nanočásticemi.
23
1.3.3. Mechanismus účinku nanočástic stříbra Stejně jako u nanočástic zlata nebyl donedávna znám přesný mechanismus účinku nanočástic stříbra.
Avšak dnes již je známo několik mechanismů. Jedním z účinků je
zvyšující se hladina reaktivních kyslíkových radikálů (ROS) (Lee a kol. 2014, MoronesRamirez a kol. 2013). ROSy poškozují v buňce proteiny, což se může projevit na snížení schopnosti nebo neschopnosti transportní funkce. Další buněčnou strukturou, kterou ROSy poškozují, je DNA a RNA struktury, především hydroxylový radikál způsobující deformace, jež vedou k záměně nukleotidů anebo ke zlomům v DNA (Obrázek 11) a RNA. Také mitochondrie mohou být cílem poškození (Richterová 2008). Stříbrné nanočástice také zvyšují hladinu intracelulárního vápníku, který se podílí na signalizaci buněčné smrti. Dalším účinkem je překlopení fosfolipidu fosfatidylserinu z vnitřní na vnější stranu plazmatické membrány, což je jeden z časných znaků buněčné smrti. Způsobuje i zvýšení exprese kaspázám podobným proteinům, což je také jeden ze znaků bakteriální apoptózy (Lee a kol. 2014, Dwyer a kol. 2012). Nanočástice stříbra působí také přímo na buněčnou stěnu mikroorganismů (Obrázek 12). Narušuje ji a významně mění její propustnost. Bakteriální buňky nejsou schopny správné regulace transportu přes membránu. Stříbrné nanočástice pronikají do bakterie a způsobují výše zmíněné zlomy v DNA a RNA (Tamboli a Lee 2013).
Obrázek 11: DNA zlomy u mikroorganismu Escherichia coli (single cell electrophoresis). A ukazuje neovlivněnou bakteriální buňku a B je po ovlivnění nanočásticemi stříbra.
24
Obrázek 12: Snímky ze skenovacího elektronového mikroskopu (SEM) ukazující poškození buněčné membrány nanočásticemi stříbra. Velké písmeno znamená mikroorganismus před použitím nanostříbra a malá písmena po použití nanočástic stříbra. A – Salmonella typhimurium; B – Pseudomonas aeruginosa; C – Escherichia coli; D – Staphylococcus aureus.
1.3.4. Využití nanostříbra Nanočástice stříbra se využívají v obrovském měřítku a to nejen pro své antibakteriální účinky, i když v této oblasti mají nejspíše největší využití. Tyto nanočástice se využívají jako přídatná ochrana do krémů na popáleniny, kde zastávají právě antibakteriální funkci (Duran a kol. 2007). Dokonce by stříbrné nanočástice měly podporovat hojení popálenin (Tian a kol. 2006). Ze stejných důvodů se nanostříbro přidává do obvazových materiálů (Obrázek 13) (Castellano a kol. 2007). V nemocničních zařízeních lze nanočástice stříbra využívat jako součást omítek zdí proti plísním (Prnka a Šperlink 2006) ale také jako součást nemocničních textilií. Ale nejen v těch se nachází stříbro. Stříbro se v textilním průmyslu již běžně využívá například u sportovních oděvů (Duran a kol. 2007). Nanostříbro se dá také využít jako impregnační ochrana chirurgických přístrojů, nástrojů (Furno a kol. 2004) nebo i roušek (Li a kol. 2006). Stříbrné nanočástice se také využívají jako elektromagnetické zesílení signálu v Ramanově spektroskopii (Svobodová a kol. 2009).
25
Obrázek 13: Obvaz s nanočásticemi stříbra.
26
1.4. Mikroorganismy Účinek různých druhů nanočástic se zkoumá na prokaryotických organismech. Prokaryota se dělí na dvě velké domény, doména Archea a doména Bacteria, které se dále dělí do mnoha kmenů, tříd, řádů, čeledí, rodů, druhů a poddruhů. U prokaryot se nevyužívá označení říše a ani oddělení, jako je tomu v taxonomii eukaryotních organismů. Pro určení jednotlivých druhů se využívá sekvenční analýzy konzervativních genů, jako je třeba 16S rRNA. Nejnižší procentuální shoda, aby byly druhy považovány za příbuzné a mohly být zařazeny do stejného rodu, je 97% (Sedláček 2007). Další odlišností mezi prokaryotickými a eukaryotickými je buněčná stěna. Prokaryotické organismy mají ve své buněčné stěně peptidoglykan murein nebo mukopeptid. tyto peptidoglykany se v buněčné stěně eukaryotických organismů vůbec nevyskytují. Prokaryota také postrádají jadernou membránu, která by oddělovala jádro od cytoplazmy. Postrádají i jakékoli vnitřní membrány, které by vyčlenily buněčné útvary pro metabolické pochody, jako je tomu u eukaryot (Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999). Více využívanou doménou v antibakteriálních testech nanočástic je doména Bacteria. Tu dále můžeme rozdělit do tří skupin, grampozitivní typ, gramnegativní typ a buňky postrádající jakoukoli buněčnou stěnu. Toto rozdělení se používá z praktických důvodů a nemá základy v molekulárně-genetických metodách, ale v morfologických a fyziologických vlastnostech (Sedláček 2007). Mezi nejvíce využívané druhy pro analýzu účinku nanočástic se řadí Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus a Staphylococcus aureus. Druh Escherichia coli patří do rodu Escherichia, čeledi Enterobacteriaceae, řádu Enterobacteriales, třídy Gammaproteobacteria, kmenu Proteobacteria a do domény Bacteria s gram-negativní buněčnou stěnou (Obrázek 14). Bakterie rodu Escherichia jsou bakterie tyčkovitého tvaru vyskytující se jednotlivě nebo ve skupenství po dvou. Jejími vlastnostmi jsou nepohyblivost nebo naopak pohyblivost pomoci peritrichálních bičíků. Jsou fakultativně anaerobní a chemoorganotrofní, jsou schopny využívat dva druhy metabolismu, respiratorní a fermentatorní. Rostou na běžných půdách a jejich optimální teplota pro růst je 37°C (Sedláček 2007). Přirozeně se vyskytují v koncové části střeva u teplokrevných živočichů (Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999). Druhy produkující enterotoxin a jiné druhy virulence způsobují průjmová a další onemocnění, jako jsou infekce močových cest, septikémie (Stav, při kterém dochází k množení bakterií přímo v krevním řečišti [Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999]) nebo meningitidy. E. coli se vyskytuje ve střevě obratlovců a kmeny, které produkují shiga toxiny (bílkoviny, které produkují některé rody z čeledi Enterobacteriaceae) mohou vyvolávat onemocnění jako je hemoragická kolitida nebo hemolyticko-uremický syndrom (Sedláček 2007; Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999; Bednář a kol. 1996).
27
Obrázek 14: Snímek mikroorganismu Escherichia coli ze SEM (URL 3).
Druh
Pseudomonas
Pseudomonadaceae,
řádu
aeruginosa
patří
Pseudomonadales,
do třídy
rodu
Pseudomonas,
čeledi
Gammaproteobacteria,
kmenu
Proteobacteria a do domény Bacteria s gram-negativní buněčnou stěnou (Obrázek 15). Bakterie rodu Pseudomonas tvarem rovné nebo mírně zakřivené tyčky (Sedláček 2007), jsou saprofytické mikroorganismy, přítomné v půdě, vodě a ve vlhkém prostředí (Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999). K pohybu využívají jeden nebo několik polárních bičíků, nepohyblivé jsou jen zřídka. Jsou to aerobní mikroorganismy se striktně respiratorním typem metabolismu. Koncovým akceptorem elektronů je kyslík, ale vyjímečně to může být i nitrát a díky tomu je bakterie schopna růstu i za anaerobních podmínek. Jsou široce rozšířené a některé druhy mohou být i multirezistentní (Sedláček 2007). Kvůli přirozené rezistenci a adaptabilitě způsobuje u člověka infekční onemocnění (Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999). Příležitostně je patogenní pro rostliny a produkuje různé pigmenty (Bednář a kol. 1996, Sedláček 2007).
28
Obrázek 15: Snímek mikroorganismu Pseudomonas aeruginosa pomocí SEM (URL 4).
Druh Bacillus cereus patří do rodu Bacillus, čeledi Bacillaceae, řádu Bacillales, třídy Bacilli, kmenu Firmicutes a do domény Bacteria s gram-pozitivní buněčnou stěnou (Obrázek 16) (Sedláček 2007). Bakterie rodu Bacillus mají tyčkovitý tvar různé délky. Vyskytují se ve dvojicích nebo mohou tvořit řetízky (Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999) se zakulaceným nebo čtvercovým koncem. Jsou pohyblivé díky peritrichálním bičíkům a schopny tvořit endospory. Endospory jsou kulaté nebo oválné útvary zajišťující přežití při nepříznivých podmínkách. Jedna bakterie může mít maximálně jednu endosporu, která může být uložená centrálně, paracentrálně, subterminálně, terminálně nebo laterálně. Klíčení spor se odehrává bez jakýchkoli aktivačních faktorů. Jsou to aerobní nebo fakultativně anaerobní mikroorganismy s širokou diverzitou fyziologických schopností. Optimální růstová teplota se pohybuje v rozmezí od 15 do 55°C a jako chemoorganotrofové disponují fermentatorním nebo respiratorním metabolismem. Bacillus cereus je široce rozšířená bakterie a způsobuje gastroenteritidy a enterotoxigenní (toxiny vylučované v tenkém střevě [Podobová 2014]) kmeny vyvolávají alimentární intoxikace (Sedláček 2007; Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999; Bednář a kol. 1996).
29
Obrázek 16: Snímek mikroorganismu Bacillus cereus ze světelného mikroskopu (URL 5).
Druh
Staphylococcus
aureus
patří
do
rodu
Staphylococcus,
čeledi
Staphylococcaceae, řádu Bacillales, třídy Bacilli, kmenu Firmicutes a do domény Bacteria s gram-pozitivní buněčnou stěnou (Obrázek 17) (Sedláček 2007). Mikroorganismy rodu Staphylococcus mají sférický tvar buněk a vyskytují se jednotlivě, ve dvojicích, v nepravidelných shlucích (Bednář a kol. 1996), ale občas i v tetrádách (Sedláček 2007). Buňky
jsou
nepohyblivé,
netvoří
spóry
a
jsou
fakultativně
anaerobní.
Jde
o chemoorganotrofní bakterie s metabolismem fermentatorním i respiratorním. Jsou citlivé k lyzi lysostafinem, ale ne lysozymem. Rostou v přítomnosti 10% roztoku chloridu sodného. Jejich optimální teplota pro růst je 30 až 37°C. Jsou to všudypřítomné bakterie, primárně je však jejich výskyt vázán s kůží, kožními žlázami a sliznicemi u velkého množství teplokrevných obratlovců. Mohou být také izolovány z potravin živočišného původu, jako je mléko, maso nebo sýr a také z prostředí (půda, prach, voda, písek). Některé druhy jsou oportunními patogeny člověka a zvířat nebo mohou produkovat extracelulární toxiny nebo jsou patogenní pouze pro zvířata (Sedláček 2007; Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999; Bednář a kol. 1996). Staphylococcus aureus se dále rozděluje na dva poddruhy, Staphylococcus aureus aureus a Staphylococcus aureus anaerobius. S. aureus aureus je nejspíše nejúspěšnější lidský patogen. Způsobuje široké spektrum onemocnění od hnisavých onemocnění kůže až po sepse a alimentární intoxikace. S. aureus anaerobius je patogen ovcí a je to jeden ze dvou striktně anaerobních stafylokoků (Sedláček 2007; Greenwood, Slack, Peutherer a kol. 1999).
30
Obrázek 17: Snímek mikroorganismu Staphylococcus aureus pomocí SEM (URL 6).
31
2. Cíle práce Cílem naší práce bylo prozkoumat antibakteriální účinky některých vybraných stříbrných a zlatých nanočástic. Dalším úkolem bylo zjistit, jaké budou rozdíly mezi připravenými druhy nanočástic a jaké budou antibakteriální účinky na některé zástupce gram-negativních a gram-pozitivních bakterií.
3. Materiály a metody 3.1. Mikroorganismy a jejich uchovávání Pro náš experiment byly vybrány dva druhy mikroorganismů, jeden gram-pozitivní a jeden gram-negativní. Jako zástupce gram-pozitivních mikroorganismů byl vybrán Bacillus cereus (CCM 2010), který byl objednán z České sbírky mikroorganismů a zástupcem gramnegativních mikroorganismů Escherichia coli K12 s plazmidem pEGFPluxABCDEAmp (prof. Esa-Matti Lilius, Univerzita v Turku, Finsko). E. coli byla skladována v mrazáku (Ultra-Low temperature Freezer MDF-192, Sanyo, Japonsko) při - 80 °C v PBS pufru s glycerolem. B. cereus byl skladován v chladničce Ardo (místnost 1S25, pavilon A36, Univerzitní Kampus Bohunice) na šikmém agaru (Nutrient agar, ApplyChem, Německo) a na Petriho miskách. Na šikmém agaru byla kultura přeočkovávána po dvou měsících a na Petriho miskách po 3 týdnech. Agar byl připravován v koncentraci 4 gramy prášku a 1 gram glukózy na 100 mililitrů deionizované vody. Tento roztok byl následně sterilizován a rozlit na Petriho misky nebo do zkumavky na šikmý agar. Při experimentech byly mikroorganismy kultivovány v Luria Broth médiu (Mo Bio Laboratories, San Diego, USA).
3.2. Příprava nanočástic stříbra V našich experimentech bylo použito koloidní stříbro, které bylo připraveno elektrolyticky (Obrázek 18). Do čisté skleněné nádoby se nalije známý objem destilované vody a zahřeje se na co nejvyšší teplotu, ale nesmí vařit. Do vody se vloží stříbrné elektrody tak, aby tyto elektrody byly přibližně rovnoběžně, a zdroj se zapojí do elektrické zásuvky (230 V). V průběhu přípravy se koloid promíchává nekovovým nástrojem. Po uplynutí příslušné doby (Tabulka 2) se zdroj vytáhne z elektrické sítě. Následně bylo takto připravené koloidní stříbro přefiltrováno přes filtrační papír, aby se odstranily vzniklé nečistoty během přípravy. Po filtraci bylo koloidní stříbro sterilizováno v autoklávu (Tuttnauer Autoclave-Steam Sterilizer 3150 ELC, Merci, Česká republika).
32
Obrázek 18: Přístroj na přípravu koloidního stříbra.
Tabulka 2: Čas pro přípravu určité koncentrace koloidního stříbra v určitém objemu. Čas je uváděn takto: minuty, vteřiny. Například pro přípravu 0,15 l koloidního roztoku o koncentraci 10 µg/ml je potřebný čas reakce 21 minut a 33 sekund.
Objem Koncentrace [µg/ml] [l]
1
2
3
5
7
10
15
20
30
50
0,10
1,24
2,48
4,12
7,01
9,49
14,01
21,02
28,02
42,03
70,06
0,12
1,44
3,29
5,13
8,41
12,10
17,23
26,04
34,46
52,09
86,55
0,15
2,09
4,19
6,28
10,47
15,05
21,33
32,20
43,07
64,40
107,47
0,19
2,40
5,21
8,01
13,22
18,43
26,44
40,06
53,27
80,11
133,39
0,24
3,19
6,38
9,57
16,34
23,12
33,09
49,43
66,17
99,26
165,43
0,29
4,07
8,13
12,20
20,33
28,46
41,06
61,39
82,12
123,18 205,29
0,36
5,06
10,12
15,17
25,29
35,40
50,58
76,26
101,55 152,53 254,48
0,45
6,19
12,38
18,57
31,36
44,14
63,11
94,47
126,23 189,34 315,57
0,56
7,50
15,40
23,30
39,11
54,51
78,21
117,32 156,43 235,04 391,47
0,69
9,43
19,26
29,09
48,35
68,01
97,10
145,45 194,20 291,29 485,49
0,86
12,03
24,06
36,09
60,14
84,20
120,29 180,43 240,58 361,27 602,25
1,0
14,01
28,02
42,03
70,06
98,08
140,11 210,17 280,22 420,34 700,56
33
3.3. Příprava nanočástic zlata V našem experimentu byly použity dva druhy nanočástic zlata. Tyto nanočástice nám byly připraveny na Ústavu chemie, po konzultaci s panem prof. RNDr. Josefem Havlem, DrSc., slečnou Mgr. Lenkou Kolářovou.: 1) polyhedrální nanočástice zlata. Nanočástice byly připraveny redukcí kyseliny tetrachlorozlatité kyselinou gallovou při laboratorní teplotě. 2) NanoFlowers (NF). Tyto nanočástice byly připraveny redukcí kyseliny tetrachlorozlatité triethanolaminem v ethylenglykolu při teplotě 40 °C. Nanočástice byly promyty a převedeny do vody. .
3.4. Analýza velikosti stříbrných nanočástic Tato
analýza
na Výzkumném
byla
provedena
panem
ústavu Veterinárního Lékařství.
RNDr.
Jaroslavem
Analýza byla
Turánkem,
CSc.
provedena metodou
dynamického rozptylu světla (Zetesizer Nano ZS, Malvern, Velká Británie). Koncentrace zkoumaného vzorku byla 20 µg/ml a byl testován třikrát. Nejprve byl testován nefiltrovaný vzorek, následně vzorek přefiltrovaný přes filtrační papír s póry o velikosti 100 nanometrů a poslední vzorek byl přefiltrován přes filtrační papír s póry 20 nanometrů velkými.
3.5. Analýza velikosti zlatých nanočástic Tato analýza byla provedena slečnou Mgr. Lenkou Kolářovou na transmisním elektronovém mikroskopu FEI Morgagni 268D (FEI, Eindhoven, Nizozemsko). Nanočástice byly naneseny na měděné síťky pokryté uhlíkovou vrstvou.
3.6. Bioluminiscenční stanovení viability bakterií Den před provedením experimentu byla bakterie E. coli vytažena z - 80 °C a bylo dáno kultivovat 10 mikrolitrů bakterií o koncentraci 560000 buněk ve 120 mikrolitrech ve 20 mililitrech LB média s přídavkem 20 mikrolitrů ampicilinu. Byla dána kultivovat mezi druhou a třetí hodinou odpoledne ve vodní lázni (Memmert WNB 22, Merci) s frekvencí třepání 120 za minutu. Druhý den ráno byly bakterie naředěny v 5 – 6 mililitrech LB média s ampicilinem na optickou hustotu 0,2 (kolorimetr Spekol 210, Německo) při vlnové délce 620 nanometrů. Opět byly bakterie kultivovány ve výše zmíněných podmínkách, aby byla dosažena optická hustota 0,5 (ale ne více) při vlnové délce 620 nanometrů. Následně byly bakterie centrifugovány (laboratorní centrifuga Janetzki K23) 10 minut při 2000 otáčkách za minutu. Poté byl pelet promyt PBS (použité chemikálie ze skladu chemikálií PřF,
34
Univerzitní Kampus Bohunice) s pH 7,5 (pH bylo měřeno na přístroji pH meter 320, Corning, Spojené Království) a naředěn v PBS na optickou hustotu 0,25 při vlnové délce 620 nanometrů. Takto připravené bakterie byly napipetovány v objemu 150 mikrolitrů do 96 jamkové neprůhledné destičky. Do těchto jamek bylo přidáno 100 mikrolitrů nanočástic stříbra o koncentracích 50; 20; 15; 10; 7,5; 5; 3,75; 2,5; 1,25 a 0,625 µg/ml nebo zlaté polyhedrální nanočástice o 0,24; 0,12; 0,06; 0,03 a 0,015 milimorání koncentraci nebo zlaté NF o 1,6; 0,8; 0,4; 0,2 a 0,1 milimolární koncentraci. Nanočástice zlata byly před pipetováním rozbity pomocí sonikátoru (Sonifier 150, Branson, USA), protože při skladování docházelo k jejich shlukování. Nižší koncentrace byly naředěny z maximální koncentrace do sterilní deionizované vody. Byla napipetována i negativní kontrola v podobě 250 mikrolitrů PBS a pozitivní kontrola v podobě 150 mikrolitrů bakterií a 100 mikrolitrů PBS. Takto připravená destička byla vložena do předehřátého luminometru (Luminometr LM-01T, Meopta, Česká republika) a byla měřena hodnota luminiscence po dobu 4 hodin v desetiminutových intervalech. Experiment byl zhotoven v deseti provedeních pro stříbrné nanočástice a v pěti pro oba typy zlatých nanočástic. Každý experiment byl proveden v duplikátech.
3.7. Turbidimetrické stanovení viability bakterií Den
před
samotným
experimentem
byla
bakterie
B.
cereus
kultivována
v 10 mililitrech LB média ve vodní lázni s teplotou 37 °C a frekvencí třepání 120 za minutu. Do tohoto média bylo přidáno asi jedno oko kličky. Bakterie byly dány kultivovat mezi druhou a třetí hodinou odpoledne. Druhý den ráno byly bakterie naředěny v LB médiu na 2,7 * 107 CFU/ml. Takto naředěné bakterie byly napipetovány 96 jamkové ELISA destičky v objemu 150 mikrolitrů. K těmto bakteriím byly přidány nanočástice stříbra potažmo zlata o objemu 100 mikrolitrů ve stejných koncentracích, které byly uvedeny výše a stejně tak byly zlaté nanočástice rozbity pomocí sonikátoru. Jako negativní kontrola bylo použito 250 mikrolitů LB média a jako pozitivní kontrola 150 mikrolitrů bakterií se 100 mikrolitry PBS. Takto připravená destičky byla měřena na ELISA Readeru (SLT Lab Instruments A-5082, Spectra Rainbow, Rakousko) při vlnové délce 340 nanometrů po dobu 4 hodin s 15 minutovými intervaly mezi měřeními. Mezi měřeními byla destička inkubována při 37 °C v termostatu (Inkubat 85, Melag, Německo). Pro všechny druhy nanočástic bylo provedeno deset opakování a každé opakování bylo prováděno v duplikátech.
35
3.8. Statistická analýza Statistická analýza byla provedena v programu STATISTIKA 12. Bylo ověřeno normální rozložení dat a následně byl proveden t-test, nezávislý dle proměnných na hladině p = 0,05.
36
4. Výsledky 4.1. Velikost stříbrných nanočástic Výsledky analýzy velikosti stříbrných nanočástic lze vidět na Obrázku 19. Filtrace přes různé filtrační papíry byla provedena, aby byla lépe zjištěna distribuce velikosti, z důvodu, že větší částice překryjí ty menší, pak není analýza tak přesná. Po filtraci přes 100 nanometrový filtrační papír se distribuce velikosti nanočástic příliš nezměnila. Rozdíl byl 13 nanometrů. Průměrná velikost nefiltrovaného koloidního stříbra byla ± 65 nanometrů a po filtraci přes 100 nanometrový filtr se průměrná velikost snížila na ± 52 nanometrů. Po Filtraci přes 20 nanometrový filtrační papír se průměrná velikost nanočástic snížila na 10 nanometrů. Na grafu je také vidět, že největší procentuální zastoupení mají nanočástice s průměrnou velikostí 10 nanometrů.
Size Distribution by Volume
Volume (%)
40 30 20 10 0 0.1
1
10
100
1000
10000
Size (d.nm)
Record 3: colloidal Ag+ 26.3.2010 1 Record 7: colloidal Ag+ 26.3.2010 filtrace 20nm 1
Record 4: colloidal Ag+ 26.3.2010 filtrace 100nm 1
Obrázek 19: Distribuce velikosti nanočástic stříbra pomocí dynamického rozptylu světla.
4.2. Velikost zlatých nanočástic Pomocí TEM byla zjištěna velikost polyhedrálních a NF zlatých nanočástic. První jmenované nanočástice měly průměrnou velikost okolo 60 nanometrů (Obrázek 20) a výsledná koncentrace byla 0,24 milimolární. Velikost NF byla okolo 88 nanometrů (Obrázek 21) s 1,6 milimolární koncentrací.
37
Obrázek 20: Snímek polyhedrálních zlatých nanočástic z TEM.
Obrázek 21: Snímek zlatých NF nanočástic z TEM.
38
4.3. Bioluminiscenční stanovení viability bakterií Pro lepší hodnotitelnost výsledků byly hodnoty bioluminiscence převedeny na počet buněk. Tento krok byl proveden z důvodu nestejné intenzity bioluminiscenčního záření, což je zapříčiněno nestejnoměrnou replikací plazmidu pro luciferin a luciferázu. Z toho důvodu některé vzorky svítili více a některé méně. Po provedení tohoto výpočtu byl získán graf, který znázorňuje účinek nanočástic zlata nebo stříbra na bakterii E. coli. V případě stříbrných nanočástic (Obrázek 22) byl pozorován rychle se snižující počet buněk u poloviny použitých koncentrací, a to konkrétně od nejvyšší koncentrace 50 µg/ml do koncentrace 7,5 µg/ml. U těchto koncentrací došlo k usmrcení všech bakterií po 20 minutách od aplikování stříbrných nanočástic. Statisticky významný rozdíl byl pozorován u devíti z deseti použitých koncentrací. Pouze nejnižší koncentrace, 0,625 µg/ml, nevykazovala statisticky významný rozdíl. Je zajímavé, že koncentrace 1,25 µg/ml vykazovala pomalejší umírání bakterií, než tomu bylo u kontroly. Ze získaných výsledků byla vypočítána koncentrace IC50, což je inhibiční koncentrace, která sníží růst bakterií o 50%. Hodnota koncentrace IC50 pro účinek stříbrných nanočástic na gram-negativní mikroorganismy byla 2,08 µg/ml.
Vliv deseti koncentrací stříbrných nanočástic na bakterii E. coli K12 pEGFPluxABCDEAmp 60000000,00
Počet buněk
50000000,00 40000000,00 30000000,00 20000000,00 10000000,00
2 602 1202 1802 2402 3002 3602 4202 4802 5402 6002 6602 7202 7802 8402 9002 9602 10202 10802 11402 12002 12602 13202 13802 14402
0,00
Čas [s] Kontrola bez bakterií
Kontrola s bakteriemi
50 µg/ml *
20 µg/ml *
15 µg/ml *
10 µg/ml *
7,5 µg/ml *
5 µg/ml *
3,75 µg/ml *
2,5 µg/ml *
1,25 µg/ml *
0,625 µg/ml
Obrázek 22: Účinek stříbrných nanočástic na bakterii E. coli. * - Statisticky významný rozdíl.
39
Zlaté nanočástice, konkrétně NF, nevykazovaly stejné účinky, jako tomu bylo u stříbrných nanočástic (Obrázek 23). Dvě koncentrace neměly žádný statisticky významný rozdíl a to 1,6 milimolární a 0,1 milimolární koncentrace. Jedná se o nejvyšší a nejnižší použité koncentrace zlatých NF. Zbylé tři koncentrace vykazovaly statisticky významný rozdíl proti kontrole, ale bylo u nich pozorováno větší množství bakterií, než u kontrolního vzorku. Podobných výsledků bylo dosaženo s polyhedrálními zlatými nanočásticemi (Obrázek 24). Pouze nejvyšší koncentrace, 0,24 milimolární, nevykazovala žádné statisticky významné rozdíly a zbylé 4 koncentrace měly statisticky významný rozdíl oproti kontrole s bakteriemi. Stejně jako tomu bylo u zlatých NF, i u těchto koncentrací byl pozorován větší počet bakterií, než tomu bylo u kontrolního vzorku. Pro porovnání stříbrných a zlatých nanočástic byly koncentrace zlatých nanočástic přepočítány na stejnou jednotku koncentrace, která byla použita u stříbrných nanočástic. Nejvyšší koncentrace zlatých NF měla hodnotu 315,152 µg/ml, druhá 157,576 µg/ml, třetí 78,788 µg/ml, čtvrtá 39,394 µg/ml a pátá a zároveň nejnižší koncentrace byla 19,697 µg/ml. Koncentrace zlatých polyhedrálních nanočástic byla nižší než u zlatých NF. Nejvyšší koncentrací byla koncentrace 47,2728 µg/ml. Druhá koncentrace byla 23,6364 µg/ml, třetí 11,8182 µg/ml, čtvrtá 5,9091 µg/ml a pátá 2,9546 µg/ml.
Vliv pěti koncentrací zlatých nanočástic NF na bakterii E. coli K12 pEGFPluxABCDEAmp 90000000,00 80000000,00
Počet buněk
70000000,00 60000000,00 50000000,00 40000000,00 30000000,00 20000000,00 10000000,00 2 602 1202 1802 2402 3002 3602 4202 4802 5402 6002 6602 7202 7802 8402 9002 9602 10202 10802 11402 12002 12602 13202 13802 14402
0,00
Čas [s] Kontrola bez bakterií
Kontrola s bakteriemi
1,6 mM
0,8 mM *
0,4 mM *
0,2 mM *
0,1 mM Obrázek 23: Vliv zlatých nanočástic NF na bakterii E. coli. * - Statisticky významný rozdíl.
40
100000000,00 90000000,00 80000000,00 70000000,00 60000000,00 50000000,00 40000000,00 30000000,00 20000000,00 10000000,00 0,00 2 602 1202 1802 2402 3002 3602 4202 4802 5402 6002 6602 7202 7802 8402 9002 9602 10202 10802 11402 12002 12602 13202 13802 14402
Počet buněk
Vliv pěti koncentrací polyhedrálních zlatých nanočástic na bakterii E. coli K12 pEGFPluxABCDEAmp
Čas [s] Kontrola bez bakterií
Kontrola s bakteriemi
0,24 mM
0,12 mM *
0,06 mM *
0,03 mM *
0,015 mM * Obrázek 24: Vliv zlatých polyhedrálních nanočástic na bakterii E. coli. * - Statisticky významný rozdíl.
41
4.4. Turbidimetrické stanovení viability bakterií Výsledný graf vlivu stříbrných nanočástic na růst bakterie B. cereus je vidět na Obrázku 25. Statisticky významný rozdíl byl pozorován u koncentrace 50 µg/ml až po koncentraci 3,75 µg/ml, včetně. U zbylých tří koncentrací nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl. Pouze nejvyšší koncentrace neukázala žádný růst bakterií po celou dobu experimentu. Tento roztok byl následně ředěn a vyset na Petriho misku s agarem a kultivován při 37 °C po dobu přibližně 18 hodin. Po uplynutí této doby nebyly pozorovány žádné kolonie na Petriho miskách, ani při nejmenším ředění (10 krát). Z výsledků byla vypočtena koncentrace IC50 a její hodnota je 5,56 µg/ml.
Vliv koncentrací stříbrných nanočástic na bakterii Bacillus cereus CCM 2010 1,6000
Absorbance [340 nm]
1,5000 1,4000 1,3000 1,2000 1,1000 1,0000 0,9000 0,8000 0,7000 0
15
30
45
60
75
90
105 120 135 150 165 180 195 210 225 240
Čas [min] Kontrola bez bakterií
Kontorola s bakteriemi
50 µg/ml *
20 µg/ml *
15 µg/ml *
10 µg/ml *
7,5 µg/ml *
5 µg/ml *
3,75 µg/ml *
2,5 µg/ml
1,25 µg/ml
0,625 µg/ml
Obrázek 25: Graf vlivu stříbrných nanočástic na růst bakterie B. cereus. * - Statisticky významný rozdíl.
Naprosto jiný výsledek byl pozorován u zlatých nanočástic a to jak u polyhedrálních, tak u NF (Obrázek 26, 27). U žádné z koncentrací nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl. Byly
použity
stejné
koncentrace
zlatých
nanočástic,
jako
v případě
bioluminiscenčního stanovení viability bakterií. Pro porovnání koncentrací stříbrných
42
a zlatých nanočástic byly koncentrace zlatých nanočástic přepočítány na stejnou jednotku koncentrace. Zlaté NF měly koncentrace 315,152; 157,576; 78,788; 39,394 a 19,697 µg/ml. Polyhedrální zlaté nanočástice měly nižší koncentrace, konkrétně 47,2728; 23,6364; 11,8182; 5,9091 a 2,9546 µg/ml.
Absorbance [340 nm]
Vliv použitých koncentrací zlatých nanočástic NF na bakterii Bacillus cereus CCM 2010 1,6000 1,4000 1,2000 1,0000 0,8000 0
15
30
45
60
75
90
105 120 135 150 165 180 195 210 225 240
Čas [min] Kontrola bez bakterií
Kontrola s bakteriemi
1,6 mM
0,8 mM
0,4 mM
0,2 mM
0,1 mM Obrázek 26: Graf vlivu zlatých nanočástic NF na bakterii B. cereus.
Absorbance [340 nm]
Vliv koncentrací zlatých polyhedrálních nanočástic na bakterii Bacillus cereus CCM 2010 1,6000 1,5000 1,4000 1,3000 1,2000 1,1000 1,0000 0,9000 0,8000 0
15
30
45
60
75
90
105 120 135 150 165 180 195 210 225 240
Čas [min] Kontrola bez bakterií
Kontrola s bakteriemi
0,24 mM
0,12 mM
0,06 mM
0,03 mM
0,015 mM Obrázek 27: Graf vlivu zlatých polyhedrálních nanočástic na bakterii B. cereus.
43
5. Diskuze V naší práci jsme se zabývali účinky stříbrných a dvou zlatých nanočástic na gramnegativní a gram-pozitivní mikroorganismy. Co se týče stříbrných nanočástic, jejich distribuce velikosti se rovná těm nejmenším rozměrům, což naznačují i antibakteriální vlastnosti, které jsou srovnatelné s vlastnostmi stříbrných nanočástic popsaných v literatuře (Ahmad a kol. 2013, Devi a Joshi 2014). Stejně tak se nám potvrdilo, že gram-negativní mikroorganismy jsou méně odolné proti stříbrným nanočásticím než gram-pozitivní mikroorganismy. Hodnota koncentrace IC50 pro gram-negativní bakterie je 2,08 µg/ml a pro gram-pozitivní 5,56 µg/ml. Tyto hodnoty by se daly srovnat s hodnotami v literatuře reprezentované publikací od Ahmad a kol. 2013. Zde jsou sice vyšší uvedené koncentrace, ale to je z důvodu rozdílných hodnot koncentrací, kdy my jsme se rozhodli pro koncentraci IC50 a v literatuře je koncentrace MIC80, čili koncentrace, která sníží růst bakterií minimálně o 80% oproti kontrole. Z našich pokusů naše stříbrné nanočástice vykazovaly větší antibakteriální účinky. To si vysvětlujeme menšími nanočásticemi. V námi připraveném koloidním roztoku nanočástic stříbra převažují nanočástice s průměrnou velikostí 10 nanometrů a v literatuře jde o nanočástice s průměrnou velikostí 30 nanometrů. Důležitost velikosti nanočástic lze také porovnat s literaturou od Devi a Joshi 2014. Zde nejnižší koncentrace, která zabránila jakémukoliv růstu bakterií jak gram-negativních tak gram-pozitivních má hodnotu 15 mikromolární, což je přibližně koncentrace 1,62 µg/ml. Průměrná velikost těchto nanočástic byla 5,5 nanometrů. V našem experimentu nejnižší koncentrace pro gram-negativní mikroorganismy, která usmrtila všechny bakterie, měla hodnotu 3,75 µg/ml a v případě gram-pozitivních mikroorganismů to byla koncentrace 50 µg/ml. Také jsme pozorovali rozdíl v účinku stříbrných nanočástic v závislosti na stáří bakterie B. cereus. Tuto bakterii jsme získali od České sbírky mikroorganismů celkem dvakrát. I když jsme bakterii svědomitě přeočkovávali a skladovali, tak po přechodu na nově dodaný mikroorganismus B. cereus byly tyto bakterie odolnější proti účinku stříbrných nanočástic. Naproti tomu zlaté nanočástice nevykazovaly žádný antibakteriální účinek proti oběma druhům mikroorganismů, i když jsme měli k dispozici poměrně vysoké koncentrace těchto nanočástic. V případě zlatých NF byla nejvyšší použitá koncentrace 1,6 milimolární, což je 315,152 µg/ml a zlaté polyhedrální nanočástice měly nejvyšší koncentraci 0,24 milimolární = 47,27 µg/ml. Zvláště koncentrace zlatých NF byla přibližně 6krát vyšší, než nejvyšší koncentrace stříbrných nanočástic. Po porovnání koncentrací s literaturou, by alespoň zlaté NF měli mít antibakteriální účinky (Ahmad a kol. 2013, Uma Suganya a kol. 2015). Neúčinnost obou druhů zlatých nanočástic může být z části způsobeno jejich velikostí. Průměrná velikost zlatých NF byla 88 nanometru a polyhedrální zlaté nanočástice
44
měly průměrnou velikost 60 nanometrů. V literatuře se průměrná velikost zlatých nanočástic pohybuje okolo pěti nanometrů. Dalším vysvětlením, proč námi používané zlaté nanočástice neměly předpokládaný antibakteriální účinek je, že tyto nanočástice se ještě nepodařilo stabilizovat. Z tohoto důvodu se zlaté nanočástice začaly brzy shlukovat a ztratily své antibakteriální vlastnosti, které by v opačném případě pravděpodobně měly. Za zmínku také stojí, že koncentrace zlatých nanočástic, které měly statisticky významný rozdíl oproti kontrolnímu vzorku, vykazovaly přežití většího množství bakterií. V tomto případě se jedná o experiment bioluminiscenčního stanovení viability bakterií. To znamenalo, že by tyto nanočástice naopak podporovaly růst bakterií? To však můžeme vyloučit, protože v případě zlatých NF statisticky významný rozdíl nebyl u nejvyšší a nejnižší použité koncentrace a v případě polyhedrálních zlatých nanočástic byla statisticky významná jen nejvyšší koncentrace. Spíše si myslíme, že se jedná o chybu při provádění experimentu. I když jsme pipetovali vždy stejná množství naředěných bakterií v PBS, tak není možné zaručit, že vždy bude v jamce stejný počet bakterií. A také, jak bylo napsáno výše, nemůžeme ovlivnit intenzitu záření jednotlivých bakterií, jelikož nemůžeme zajistit, aby každá bakterie měla replikovaný stejný počet plazmidů pro luciferázu. Dalším naším cílem bylo porovnání dvou používaných druhů zlatých nanočástic. Jelikož jsou v tomto případě použité různé koncentrace, tak jsme se rozhodli porovnat ředění, která mají k sobě nejblíže. Proto jsme se rozhodli porovnat antibakteriální účinky u koncentrací 0,1 milimolární pro zlaté NF a 0,12 milimolární pro polyhedrální zlaté nanočástice. Z dosažených výsledků je patrné, že není rozdíl mezi oběma druhy zlatých nanočástic. Z dosažených výsledků můžeme konstatovat, že stříbrné nanočástice mají větší antibakteriální účinky než zlaté nanočástice a také, že gram-negativní mikroorganismy jsou více citlivé na přítomnost nanočástic, než mikroorganismy gram-pozitivní.
45
6. Závěr Cílem této diplomové práce bylo ověření antibakteriálních účinků vybraných zlatých a stříbrných nanočástic na zástupce gram-pozitivních a gram-negativních mikroorganismů a srovnání vybraných nanočástic mezi sebou. Potvrdili jsme vysoké antibakteriální vlastnosti stříbrných nanočástic. Z výsledků jsme vypočítali koncentraci IC50, která byla v případě gram-negativních mikroorganismů 2,08 µg/ml a 5,56 µg/ml pro bakterie gram-pozitivní. Tyto hodnoty obstály i v porovnání s literaturou. Naprosto opačným účinkem se prezentovaly oba druhy zlatých nanočástic, které neměly žádný antibakteriální účinek, což se výrazně liší od literárních zdrojů, ze kterých je zřejmé, že při využití zlata se většinou nepočítá s antibakteriálním účinkem, který, pokud existuje, je velice nízký nebo je nutné použít vysoké koncentrace stabilizovaných zlatých nanočástic. To dokladují i naše výsledky. Antibakteriální účinek u nanostříbra je již dnes hojně využíván, i když ne specificky vůči konkrétním patogenům. Při srovnání vybraných druhů stříbrných a zlatých nanočástic je zřejmé, že stříbrné nanočástice mají silnější antibakteriální účinky proti gram-negativním i gram-pozitivním bakteriím a nebyl zaznamenán významný rozdíl mezi působením dvou druhů zlatých nanočástic na oba typy bakterií.
46
7. Seznam zkratek a kol.
a kolektiv
CCM
Czech Collection of Microorganisms
IC50
koncentrace, která sníží růst mikroorganismu o 50% oproti kontrole
LB médium
Luria Broth médium
MIC
minimální inhibiční koncentrace
MTCC
The Microbial Type Culture Collection
NF
zlaté nanočástice NanoFlowers
nm
nanometr
ROS
Reactive Oxygen Species – Reaktivní kyslíkové radikály
SEM
Skenovací elektronový mikroskop
TEM
Transmisní elektronový mikroskop
47
8. Seznam literatury: Primární citace: Ahmad A., Senapati S., Khan M.I., Kumar R., Sastry M. 2003. Extracellular Biosynthesis of Monodisperse
Gold
Nanoparticles
by
a
Novel
Extremophilic
Actinomycete,
Thermomonospora sp. Langmuir, 19(8), str. 3550-3553. Ahmad T., Wani I.A., Manzoor N., Ahmed J., Asiri A.M. 2013. Biosynthesis, structural characterization and antimicrobial activity of gold and silver nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 107, str. 227-234. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2013.02.004. Bednář M., Fraňková V., Hájek V., Horák P., Chaloupecký J., Chalupský J., John C., Kalvodová D., Kaprálek F., Kolářová L., Kozák K., Kubín M., Manych J., Menčíková E., Nohýnková E., Pavlík E., Russo-Marie F., Scharfen J., Schindler J., Souček A., Součková A., Vávra J., Volf P., Závadová M., 1996. Lékařská mikrobiologie: Bakteriologie, virologie, parazitologie. 1. vydání. Praha: Marvil. str. 558. ISBN 80-2380-297-6.
Castellano J.J., Shafii S.M., Ko F., Donate G., Wright T.E., Mannari R.J., Payne W.G., Smith D.J., Robson M.C., 2007, Comparative evaluation of silver-containing antimicrobial dressings and drugs; International Wound Journal, 4, 114–122 str. DOI: 10.1111/j.1742481X.2007.00316.x. Cui Y., Zhao Y., Tian Y., Zhang W., Lü X., Jiang X. 2012. The molecular mechanism of action of bactericidal gold nanoparticles on Escherichia coli. Biomaterials, 33(7), str. 23272333. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2011.11.057.
Devi L.S., Joshi S.R. 2014. Evaluation of the Antimicrobial Potency of Silver Nanoparticles Biosynthesized by Using an Endophytic Fungus, Cryptosporiopsis ericae PS4. Journal of Microbiology. 52(8) str. 667-674. DOI: 10.1007/s12275-014-4113-1. Duran N., Marcarto P.D., De Souza G.I.H., Alves O.L., Esposito E. 2007. Antibacterial Effect of Silver Nanoparticles Produced by Fungal Process on Textile Fabrics and Their Effluent Treatment.
Journal
of
Biomedical
Nanotechnology.
3(2).
str.
203-208.
DOI:
http://dx.doi.org/10.1166/jbn.2007.022.
Dwyer D.J., Camacho D.M., Kohanski M.A., Callura J.M., Collins J.J. 2012. AntibioticInduced Bacterial Cell Death Exhibits Physiological and Biochemical Hallmarks of Apoptosis. Molecular Cell. 46. str. 561-572. DOI: 10.1016/j.molcel.2012.04.027.
48
Furno F., Morley K.S., Wong B., Sharp B.L., Arnold P.L., Howdle S.M. 2004. Silver nanoparticles and polymeric medical devices: a new approach to prevention of infection?. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 54(6). str. 1019-1024. DOI: 10.1093/jac/dkh478. Gade A., Gaikwad S., Duran N., Rai M. 2014. Green synthesis of silver nanoparticles by Phoma glomerata. Micron. 59. str. 52-59. DOI: 10.1016/j.micron.2013.12.005. Giljohann D.A., Seferos D.S., Daniel W.L., Massich M.D., Patel P.C., Mirkin Ch.A., 2010, Gold Nanoparticles for Biology and Medicine, Angewandte Chemie International Edition., 49(19), str. 3280 – 3294. DOI: 10.1002/anie.200904359. Greenwood D., Slack R.C.B., Peutherer J.F. 1999. Lékařská mikrobiologie: Přehled infekčních onemocnění: patogeneze, imunita, laboratorní diagnostika a epidemiologie. 1. české vydání. Praha: Grada publishing. str. 686. ISBN 80-7169-365-0. Hájková Z., Šmejkal P. 2010. Nanotechnologie pro život (projekt 5P – program pro pedagogy přírodovědných předmětů). Praha. 52 str.
Hall J.B., Dobrovolskaia M.A., Patri A.K., McNeil S.E. 2007. Characterization of nanoparticles
for
therapeutics.
Nanomedicine,
2(6),
str.
789-803.
DOI:
10.2217/17435889.2.6.789. Hošek, J. 2010. Úvod do nanotechnologie. 1. vydání. Praha: Česká technika – nakladatelství ČVUT. 170 str. ISBN 978-80-01-04555-8. Ikhmayies J.S. 2014. Characterization of Nanomaterials. The Minerals, Metals & Materials Society, 66(1), str. 28-29. DOI: 10.1007/s11837-013-0826-6. Keilová V., Bencko V. 2010. Stříbro není jen krásný kov, z něhož se vyrábí šperky, ale také je o něm známo, že ničí nebezpečné choroboplodné zárodky. Moje zdraví, 6, s. 31-33. Lee W., Kim K.-J., Lee D.G. 2014. A novel mechanism for the antibacterial effect of silver nanoparticles on Escherichia coli. Biometals. 27. str. 1191-1201. DOI: 10.1007/s10534-0149782-z. Li Y., Leung P., Song Q.W., Newton E. 2006. Antimicrobial effects of surgical masks coated with
nanoparticles.
Journal
of
Hospital
10.1016/j.jhin.2005.04.015.
49
Infection.
62(1).
str.
58-63.
DOI:
Měch, Rostislav. 2014. Aplikace nanotechnologií pro detekci biolomekul: Diplomová práce. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta strojního inženýrství, str. 61. Morones-Ramirez J.R., Winkler J.A., Spina C.S., Collins J.J. 2013. Silver Enhances Antibiotic Activity Against Gram-Negative Bacteria. Science Translational Medicine. 5 (190). str. 190ra81. DOI: 10.1126/scitranslmed.3006276. Mukherjee P., Ahmad A., Mandal D., Senapati S., Sainkar S.R., Khan M.I., Ramani R., Parischa R., Ajayakumar P.V., Alam M., Sastry M., Kumar R. 2001. Bioreduction of AuCl4Ions by the Fungus, Verticillium sp. and Surface Trapping of the Gold Nanoparticles Formed. Angewandte Chemie International Edition, 40(19), str. 3585-3588. Nair B., Pradeep T., 2002. Coalescence of Nanoclusters and Formation of Submicron Crystallites Assisted by Lactobacillus Strains, Crystal Growth & Design, 2(4), str. 293-298. Naraginti S., Sivakumar A. 2014. Eco-friendly synthesis of silver and gold nanoparticles with enhanced bactericidal activity and study of silver catalyzed reduction of 4-nitrophenol. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 128, str. 357-362. doi: 10.1016/j.saa.2014.02.083. Podobová, Lenka. 2014. Výskyt Bacillus cereus v potravinách: Bakalářská práce. Brno: Masarykova univerzita, Fakulta přírodovědecká, str. 50. Pornpattananangkul D., Zhang L., Olson S., Aryal S, Obonyo M., Vecchio K., Huang Ch-M., Zhang L., 2011, Bacterial Toxin-Triggered Drug Release from Gold Nanoparticle- Stabilized Liposomes for the Treatment of Bacterial Infection, Journal of the American Chemical Society, 133(11), str. 4132–4139. DOI: 10.1021/ja111110e. Prnka T., Šperlink K. 2006. Bionanotechnologie, Nanobiotechnologie, Nanomedicína. 1. vydání, Ostrava: Repronis, 177 str., ISBN: 80-7329-134-7. Richterová, Lenka. 2008. Reaktivní sloučeniny kyslíku: Bakalářská práce. Brno: Masarykova univerzita, Fakulta přírodovědecká, str. 41. Sedláček I. 2007. Taxonomie prokaryot. 1. vydání. Brno: TYPO ART PRES. 270 str. ISBN 80-210-4207-9.
50
Seralathan J., Stevenson P., Subramanian S., Ragvahan R., Pemaiah B., Sivasubramanian A., Veerappan A. 2014. Spectroscopy investigation on chemo-catalytic, free radical scavenging and bactericidal properties of biogenic silver nanoparticles synthesized using Salicornia
brachiata
aqueous
extract.
Spectrochimica
Acta
Part
A:
Molecular
and Biomolecular Spectroscopy. 118. str. 349-355. DOI: 10.1016/j.saa.2013.08.114. Shankar S.S., Ahmad A., Pasricha R., Sastry M. 2003. Bioreduction of chloroaurate ions by geranium leaves and its endophytic fungus yields gold nanoparticles of different shapes. Journal of Materials Chemistry, 13, str. 1822-1826. doi: 10.1039/b303808b.
Shankar S.S., Rai A., Ahmad A., Sastry M., 2004. Rapid synthesis of Au, Ag, and bimetallic Au core–Ag shell nanoparticles using Neem (Azadirachta indica) leaf broth. Journal of Colloid and Interface Science, 275, str. 496-502. doi: 10.1016/j.jcis.2004.03.003. Sousa e Silva J.M., Pastorello M., Kobarg J., Cardoso M.B., Mazali I.O. 2013. Selective Synthesis of Silver Nanoparticles onto Potassium Hexaniobate: Structural Organisation with Bactericidal Properties. ChemPhysChem of Chemical Physics and Physical Chemistry. 14(18). str. 4075-4083. DOI: 10.1002/cphc.201300855. Svobodová I., Hezinová V., Lišková M., Přikryl J., Maděránková D., Klepárník K., Foret F., 2009. PŘÍPRAVA, FYZIKÁLNĚ-CHEMICKÉ VLASTNOSTI A VYUŽITÍ NANOČÁSTIC V BIOANALÝZE. Nanocon. str. 8. Šrámek, J. 2009. Nanotechnologie v medicíně. Brno: Masarykova univerzita, Lékařská fakulta – Biofyzikální ústav. str. 15. Tamboli D.P. a Lee D.S. 2013. Mechanistic antimicrobial approach of extracellularly synthesized silver nanoparticles against gram positive and gram negative bakteria. Journal of Hazardous Materials. 260. str. 878-884. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2013.06.003. Tian J.,Wong K.K.Y., Ho C.M., Lok C.N., Yu W.Y., Che C.M., Chiu J.F., Tam P.K.H. 2006. Topical Delivery of Silver Nanoparticles Promotes Wound Healing. ChemMedChem: Chemistry Enabling Drug Discorery. 2(1). str. 129-136. DOI: 10.1002/cmdc.200600171. Uma Suganya K.S., Govindaraju K., Kumar V.G., Dhas T.S., Karthick V., Singaravelu G., Elanchezhiyan M. 2015. Blue green alga mediated synthesis of gold nanoparticles and its antibacterial efficacy against Gram positive organisms. Materials Science and Engineering C, 47, str. 351-356. doi: 10.1016/j.msec.2014.11.043.
51
Vacík J., Barthová J., Pacák J., Strauch B., Svobodová M., Zemánek F. 1999. Přehled středoškolské chemie. 4. vydání. Praha: SPN Pedagogické nakladatelství a. s.. str. 386. ISBN 80-7235-108-7. Valodkar M., Modi S., Pal A., Thakore S., 2011. Synthesis and anti-bacterial activity of Cu, Ag and Cu–Ag alloy nanoparticles: A green approach. Materials Research Bulletin. 46(3). str. 384-389. DOI: 10.1016/j.materresbull.2010.12.001. Votava M. 2005. Lékařská mikrobiologie obecná. 2. přepracované vydání. Brno: Neptun. str. 351. ISBN 80-86850-00-5. Wilson R., 2008. The use of gold nanoparticles in diagnostics and detection. Chemical Society Reviews. 37. str. 2028-2045. DOI: 10.1039/b712179m. Zhao Y., Tian Y., Cui Y., Liu W., Ma W., Jiang X. 2010. Small Molecule-Capped Gold Nanoparticles as Potent Antibacterial Agents That Target Gram-Negative Bacteria. Journal of the American Chemical Society, 132(35), str. 12349–12356. Sekundární citace: Chandran S.P., Chaudhary M., Pasricha R., Ahmad A., Sastry M. 2006 cit. podle Ahmad T., Wani I.A., Manzoor N., Ahmed J., Asiri A.M. 2013. Biosynthesis, structural characterization and antimicrobial activity of gold and silver nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 107, str. 227-234. doi: 10.1016/j.colsurfb.2013.02.004.
52
URL zdroje: URL 1: http://mikrobiologie.xf.cz/files/atb-bunecna-stena.doc.html URL 2: http://slovnik-cizich-slov.abz.cz/web.php/slovo/lyofilizace URL 3: http://microvisionlabs.com/gallery/sem-images/ URL 4: http://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/12/xampu-da-avon-contaminadocom.html URL 5: http://cit.vfu.cz/alimentarni-onemocneni/xbc/xbc01.jpg URL 6: http://hardinmd.lib.uiowa.edu/cdc/staph/sem4.html URL 7: https://www.google.cz/search?q=obvazy+se+st%C5%99%C3%ADbrem&tbm=isch&t bo=u&source=univ&sa=X&ei=pWNHVbW0NoOY7gbCpIDgBQ&ved=0CFEQsAQ&biw=1366 &bih=657#tbs=isz:m&tbm=isch&q=Acticoat+7&spell=1&imgrc=VH0FGJODUtmRPM%253A %3BpZX4FWd4y6nwUM%3Bhttp%253A%252F%252Fstatic.medlatest.com%252Fwpcontent%252Fuploads%252F2013%252F04%252FActicoat-7-antimicrobial-dressings-smithnephew.jpg%3Bhttp%253A%252F%252Fwww.healthmultiplier.com%252Facticoat-7day%252F%3B576%3B566
53
