vliv 3,4-methylendioxymetamFetaminu (extáze)

P s y c h i a t r ie § roèník 12 § 2008 § èíslo 2

Mozek – funkènì morfologické nálezy v psychiatrii

Rubrika zobrazení mozku se v tomto čísle vìnuje imunohistochemii, konkrétnì hodnocení vzniku a pøež­ívání nových neuronů. Průkaz neurogeneze v d­ospì­losti pøed­stavuje jed­en z nejvì­tších objevů posledních desetiletí. Článek prezentuje výsledky pilotní studie, ve které byl hodnocen vliv MDMA a citalopramu na pøež­ívání nových neuronů. Pøináší průkaz negativního vlivu subchronického pod­ávání MDMA na pøež­ívání nových neuronů v gyrus d­entatus. Navíc nás text seznání s imunohistochemickými metod­ami, které se využ­ívají pøi hod­nocení neurogeneze. doc. MUDr. Jiří Horáček, Ph.D.

vliv 3,4-methylendioxymetamFetaminu (extáze) a citaloPramu na Přežívání nově vzniklých buněk v hiPokamPu dosPělých Potkanů – pilotní studie the eFFect oF 3,4-methylenedioxymethamPhetamine (ecstasy) and citaloPram on survival oF neW generated cells in adult rat hiPPocamPus – pilot study Věra BuBENíkoVá-ValEŠoVá1, ToMአPálENíÈEk1, JIří HORáÈEk1,2 Psychiatrické centrum Praha 3. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze 1

2

Souhrn V dospělém savčím mozku se nacházejí dvě primární zóny neurogeneze: gyrus dentatus a subventrikulární zóna. Nově vznikající buňky se dají identifikovat pomocí imunohistochemie označením mitotického markeru Ki-67 nebo za pomoci bromdeoxiuridinu (BrdU). BrdU je tymidový analog, který se váže na DNA v průběhu dělení buňky. V naší pilotní studii jsme sledovali účinek týdenní aplikace MDMA a citalopramu na přežívání nově vzniklých neuronů v gyrus dentatus u potkana. Semikvantifikace BrdU pozitivních buněk v gyrus dentatus ukazuje, že týdenní aplikace MDMA (5 mg/kg, 2× denně) snižuje počet BrdU pozitivních buněk ve srovnání s kontrolou. Aplikace citalopramu (30 mg/kg) nemá žádný vliv na přežívání nových buněk v hipokampu potkana. Doposud není známo, proč MDMA, která působí stejně jako citalopram na serotoninový transportér, snižuje neurogenezi. Klíčová slova: MDMA, citalopram, BrdU, neurogeneze, kvantifikace

Summary Two primary zone of neurogenesis were identified in the adult mammal brain. These zones are localized in the dentate gyrus and the subventricular zone. New generated cells can be imunohistochemically stained against the mitotic marker Ki-67 or by bromdeoxyridine (BrdU). BrdU is a tymide analog, which is incorporated into the DNA during cell division. In our pilot study, we monitor the effect of MDMA and citalopram on survival of newly generated neurons in the dentate gyrus of rats. Semi-quantification of BrdU positive cells in the dentate gyrus determined that the application of MDMA (5 mg/kg, 2× day) decreased the number of BrdU-positive cells compared to the control group. The application of citalopram (30 mg/kg, 2× day) did not influence the survival of new cells in rat hippocampus. It si not yet clear why MDMA, which similar to citalopram inhibits transporter for serotonin, decreases the neurogenesis. Key words: MDMA, citalopram, BrdU, neurogenesis, quantification Bubeníková-Valešová V, Páleníček T, Horáček J. Vliv 3,4-methylendioxymetamfetaminu (extáze) a citalopramu na přežívání nově vzniklých buněk v hipokampu dospělých potkanů – pilotní studie. Psychiatrie 2008; 12(2): 107–111.

107

Mozek – funkènì morfologické nálezy v psychiatrii Úvod V současné době není pochyb, že nové nervové buňky vznikají v savčím mozku i v průběhu dospělosti (Gage, 2000). V dospělém savčím mozku se nacházejí dvě primární oblasti, ve kterých probíhá neurogeneze; jedná se o gyrus dentatus a subventrikulární zóny (obr. 1). Nově vznikající buňky (glie i neurony) jsou však pozorovány i v jiných oblastech mozku (Gould, 2007). V naší práci jsme se zaměřili na oblast v gyrus dentatus, kde progenitorové buňky jsou umístěny v subgranulární vrstvě a tyto buňky migrují do vrstvy granulární (Gage et al., 1998). Změny v neurogenezi můžeme sledovat v několika stadiích: proliferace, přežívání, vyzrávání a diferenciace neuronů. Ke sledování neurogeneze se nejčastěji používá značení pomocí bromdeoxyuridinu (BrdU), což je tymidinový analog, který se váže na DNA dělících se buněk v průběhu S-fáze cyklu. Vazba BrdU na DNA je stálá a lze sledovat migraci takto označených buněk (Taupin, 2006). Dalším ukazatelem proliferace, který se často používá je Ki-67 (obr. 2). Tento jaderný protein zvyšuje svoji expresi během mitózy (Kee et al., 2002). Ke zvýšení proliferace neuronálních prekurzorů dochází po poškození hipokampu lézí nebo ischemií (Gould a Tanapat, 1997; Koketsu et al., 2006). Naopak snížení proliferace a přežívání nově vzniklých buněk v gyrus dentatus bylo nalezeno po podání psychoaktivních látek, jako je morfin nebo kokain (Yamaguchi et al., 2004; Kahn et al., 2005). Dlouhodobé podávání alkoholu pak snižuje přežívání nově vzniklých buněk v gyrus dentatus (Herrera et al., 2003), ale v nízkých dávkách zvyšuje proliferaci buněk ve stejné oblasti (Aberg et al., 2005). 3,4-methylenedioxymetamfetamin (MDMA; extáze) je syntetický derivát fenyletylaminu. Tato látka se váže na transportéry pro serotonin, dopamin a noradrenalin, zvyšuje výdej monoaminů a také se váže na α2-adrenergní receptory,

Psychiatrie § roèník 12 § 2008 § èíslo 2 serotoninové 5-HT2 receptory, muskarinové M1 receptory a histaminové H1 receptory (Páleníček et al., 2005). Citalopram je antidepresivum, které blokuje serotoninový transportér a extracelulární hladinu serotoninu. Chronické podávání antidepresiv zvyšuje proliferaci, přežívání i diferenciaci buněk v hipokampu v modelech deprese, jako je olfaktoriární bulbektomie, nebo chronický stres (Jaako-Movits et al., 2006; Bansr a Duman, 2007). V naší nadále probíhající studii jsme chtěli zjistit, zda-li chronické podávání MDMA a citalopramu (v obou případech podobně serotonergně působících látek) bude mít stejný nebo odlišný vliv na přežívání nově vzniklých buněk v gyrus dentatus. metodika Samcům potkana (Wistar Hann, Konárovice BioTest s.r.o, Česká Republika) byly 2× denně v 7 h ráno a v 15 h odpoledne aplikovány MDMA (5 mg/kg, i.p.; Farmaceutická fakulta UK, Hradec Králové), citalopram (30 mg/kg, i.p.; Lundbeck) nebo fyziologický roztok. K označení nově vzniklých buněk jsme použili bromdeoxyuridin (BrdU, 50 mg/kg i.p. 1x denně; Sigma). Všechna zvířata byla po dobu 7 dní před zahájením experimentů ustájena ve světelném režimu 12 hod. světlo/12 hod. tma s přístupem k vodě a potravě ad libitum. Veškeré experimenty byly prováděny během světelné fáze cyklu. Experimenty byly schváleny odbornou komisí pro práci s laboratorními zvířaty při 3. LF UK a PCP a byly provedeny v souladu se zákonem 246/1992 Sb. na ochranu zvířat proti týrání a ve smyslu znění vyhlášky 311/1997 Sb. Přežívání buněk jsme sledovali po 5denní aplikaci MDMA nebo citalopramu za současného podávání BrdU; dalších 9 dnů byla zvířata ponechána bez aplikace jakékoliv látky (obr. 3).

Obrázek 1: Proliferační zóny v dospělém savčím mozku v průběhu 15 let. Před rokem 1990 nebyla neurogeneze v dospělém mozku akceptována. V průběhu 90. let byla prokázána neurogeneze v subventrikulární zóně a v gyrus dentatus. V současnosti byla nízká proliferace také v neokortexu, piriformní kůře, amygdale, hypotalamu, substantia nigra, tuberculum olfactorium a nucleus nervi vagi. Obrázek je upraven dle Gould, 2007.

108

P s y c h i a t r ie § roèník 12 § 2008 § èíslo 2

Mozek – funkènì morfologické nálezy v psychiatrii Po ukončení experimentu byli potkani usmrceni a transkardiálně perfundováni Ringerovým roztokem a poté 4% paraformaldehydem v Ringerově roztoku s HEPES, pH 7,4. Mozky byly ponechány ve fixativu další dva dny. Následně byly mozky uloženy do 30% sacharózy ve fosfátovém pufru pH 7,4 a sériově krájeny na kryostatu (Microm-Heidleberg). Každý 4. koronární řez o síle 40 mm byl umístěn na sklíčko a barven proti BrdU (potkaní monoklonální protilátka, SantaCruz, 1:100). Před imunohistochemickým stanovením BrdU pozitivních buněk byly řezy inkubovány 60 min v 2N HCl při 37 0C, neutralizovány v 0,1% borátu sodném pH 8,5 po dobu 30 min. Poté byly promyty ve fosfátovém pufru pH 7,4 60 min a inkubovány v 5% kozím séru. V primární protilátce se řezy inkubovaly 24h při 4 0C . Po několika promytích ve fosfátovém pufru se řezy inkubovaly v sekundární protilátce anti-goat IgG Alexa Fluor 594 (Invitrogen) 2 hod. při pokojové teplotě. Po dalším důkladném promytí byly řezy montovány pomocí ProLong media s DAPI (barvení jader), Invitrogen. Semikvantifikace BrdU pozitivních buněk (obr. 4) byla provedena ručně v celém gyrus dentatus pomocí mikroskopu Zeiss AxioVision Imaginer Z1, za použití 40 objektivu. Vzhledem k malému počtu řezů byly zavzaty k vyhodnocení řezy z různých potkanů dohromady. K analýze dat byl použit Kruskal-Wallis test s následným Dunn post hoc testem. Za statisticky významné byly považovány hodnoty p < 0,05. výsledky Semikvantifikace BrdU pozitivních buněk v gyrus dentatus ukazuje na snížení přežívání nově vzniklých buněk (p < 0,01) u zvířat po aplikaci MDMA ve srovnání s kontrolou. Citalopram neměnil počet BrdU pozitivních buněk ve srovnání s kontrolou (obr. 5). Diskuze

Obrázek 2: Ukázka dvojitého barvení na mitotický faktor Ki-67 (zelená barva) a jádra buněk DAPI (modrá barva) u kontrolních zvířat. Obrázek je zvětšen 400×.

Týdenní podávání MDMA snižovalo přežívání nově vzniklých buněk v gyrus dentatus. Přestože jsme nedělali dvojí barvení na neuronální faktor, podle velikosti buněk a jejich umístění se pravděpodobně jedná o nově vzniklé neurony. Podávání citalopramu neměnilo počet nově vzniklých buněk ve srovnání s kontrolou. Předpokládali jsme, že podávání citalopramu bude naopak zvyšovat počet BrdU pozitivních buněk. Avšak studie Jaako-Movits et al. ukázala, že ke zvýšení počtu nových neuronů po podání citalopramu dochází pouze u zvířat po olfaktorické bulbektomii

Obrázek 3: Schéma experimentu. Aplikace MDMA, citalopramu a BrdU probíhala po dobu 5 dnů. Zvířata byla usmrcena za dalších 9 dní.

109

Mozek – funkènì morfologické nálezy v psychiatrii A

Psychiatrie § roèník 12 § 2008 § èíslo 2 B MDMA

kontrola

Obrázek 4: Fotografie typické buňky pozitivní na BrdU v subgranulární vrstvě gyrus dentatus (Část A). Fotografie pozitivních buněk na BrdU v gyrus dentatus u potkanů po aplikaci MDMA a u kontrol. Šipky označují pozitivní buňky (B).

Obrázek 5: Semikvantitativní vyhodnocení BrdU pozitivních buněk v gyrus dentatus potkana po aplikaci MDMA a citalopramu po dobu 5 dní. Data byla vyhodnocena Kruskal-Wallis testem (9.29; p < 0,01) a následně Dunn post hoc testem (* * p < 0,01 ve srovnání s kontro-

110

(model deprese) ne u intaktních zvířat (Jaako-Movits et al., 2006). V jiné studii s fluoxetinem byla dokumentována zvýšená proliferace u myší pouze po aplikaci delší než 11 dní. V případě 5denní aplikace fluoxetinu, stejně jako v naší studii, nebyl nalezen žádný účinek (Santerelli et al., 2003). Antidepresivní látky jako fluoxetin a citalopram (SSRI) jsou inhibitory transportéru pro serotonin stejně jako MDMA. Také bylo zjištěno, že pozitivní účinek těchto látek na neurogenezi je závislý na 5-HT1A receptorech (Santerelli et al., 2003). Naše studie potvrdila předchozí nálezy, že MDMA snižuje přežívání nově vzniklých neuronů v gyrus dentatus (Hernández-Rabaza et al., 2006; Cho et al., 2007). Ve studii Hernández-Rabaza je ukázáno, že proliferace nových buněk se po MDMA nemění, pouze se snižuje přežívání nově vzniklých buněk (Hernández-Rabaze et al., 2006). V současné době není přesně známo, jakým mechanizmem MDMA snižuje

P s y c h i a t r ie § roèník 12 § 2008 § èíslo 2 neurogenezi. Jednou možností je dopaminergní působení MDMA zprostředkované D1 nebo D2 receptory. Aktivace D1 receptorů snižuje neurogenezi blokováním přechodu z G1 fáze do S fáze buněčného cyklu (Ohtani et al., 2003). D2 receptory zase snižují proliferaci neuronálních kmenových buněk (Kippin et al., 2005). Alternativním vysvětlením je aktivace volných radikálů, serotonergní dysregulace nebo ovlivnění endokrinních faktorů (Canales, 2007). Při provádění těchto experimentů navíc velmi záleží na délce podávání a protokolu studie. Prozatím nebyla zhotovena

Mozek – funkènì morfologické nálezy v psychiatrii studie srovnávající SSRI a MDMA ve stejném experimentálním uspořádání. Tato studie byla podpořena projekty NR 8785-3 a MZOPCP2005 z Ministerstva zdravotnictví ČR. RNDr.Vì­ra Valešová, PhD Psychiatrické centrum Praha Ústavní 91 181 03 Praha 8-Bohnice E-mail: [email protected] Do red­akce d­ošlo: 12. 5. 2008 K publikaci přijato: 12. 5. 2008

LITERATuRA Aberg E, Hofstetter CP, Olson L, Brené S. Moderate ethanol consumption increases hippocampal cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse. Int J Neuropsychopharmacol. 2005;8:557-67. Banasr M, Duman RS. Regulation of neurogenesis and gliogenesis by stress and antidepressant treatment. CNS Neurol Disord Drug Targets 2007; 6:311-20. Canales JJ. Adult neurogenesis and the memories of drug addiction. J Eur Arch Psychiatry and Clin Neurosc. 2007; 5: 0940-1334. Gage FH. Neurogenesis in the adult brain. J Neurosci. 2002; 22:612-613. Gage FH, Kempermann G, Palmer TD, Peterson DA, Ray J. Multipotent progenitor cells in the adult dentate gyrus 1998 J Neurobiol 36; 249-266.

Jaako-Movits K, Zharkovsky T, Pedersen M, Zharkovsky A Decreased hippocampal neurogenesis following olfactory bulbectomy is reversed by repeated citalopram administration. Cell Mol Neurobiol. 2006; 26:1559-70. Kahn L, Alonso G, Normand E, Manzoni OJ Repeated morphine treatment alters polysialylated neural cell adhesion molecule, glutamate decarboxylase-67 expression and cell proliferation in the adult rat hippocampus. Eur J Neurosci. 2005; 21:493-500. Kippin TE, Kapur S, van der KD. Dopamine specifically inhibits forebrain neural stem cell proliferation, suggesting a novel effect of antipsychotic drugs. J Neurosci. 2005; 25:5815–5823.

Gould E. How widespread is adult neurogenesis in mammals? Nat Rev Neurosci 2007; 8:481-488.

Koketsu D, Furuichi Y, Maeda M, Matsuoka N, Miyamoto Y, Hisatsune T Increased number of new neurons in the olfactory bulb and hippocampus of adult non-human primates after focal ischemia. Exp Neurol. 2006; 199:92-102.

Gould E, Tanapat P Lesion-induced proliferation of neuronal progenitors in the dentate gyrus of the adult rat. Neuroscience 1997; 80:427-36.

Ohtani N, Goto T, Waeber C, Bhide PG. Dopamine modulates cell cycle in the lateral ganglionic eminence. J Neurosci. 2003; 23:2840–2850.

Herrera DG, Yague AG, Johnsen-Soriano S, Bosch-Morell F, Collado-Morente L, Muriach M, Romero FJ, Garcia-Verdugo JM. Selective impairment of hippocampal neurogenesis by chronic alcoholism: protective effects of an antioxidant. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Jun 24; 100(13):7919-24.

Santarelli L, Saxe M, Gross C, Surget A, Battaglia F, Dulawa S, Weisstaub N, Lee J, Duman R, Arancio O, Belzung C, Hen R. Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants. Science. 2003; 301:805-9.

Cho KO, Kim SK, Rhee GS, Kwack SJ, Cho DH, Sung KW, Kim SY. Chronic 3,4-methylenedioxymethamphetamine treatment suppresses cell proliferation in the adult mouse dentate gyrus. Eur J Pharmacol. 2007; 566:120-3.

Yamaguchi M, Suzuki T, Seki T, Namba T, Juan R, Arai H, Hori T, Asada T. Repetitive cocaine administration decreases neurogenesis in adult rat hippocampus. Ann N Y Acad Sci. 2004; 1025:351-62.

111