´ al´ozatok kialakul´as´anak k´ıs´erleti Erh´ vizsg´alata
´ırta:
K´osa Edina Biol´ ogiai Fizika Tansz´ek, ELTE, Term´eszettudom´anyi Kar t´emavezet˝o:
Czir´ok Andr´as, PhD egyetemi adjunktus, Biol´ ogiai Fizika Tansz´ek, ELTE, Term´eszettudom´anyi Kar Budapest, 2009
Tartalomjegyz´ ek 1. Bevezet´ es
1
1.1. Biol´ogiai form´ak kialakul´asa . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1.2. Korai mad´arembri´ok fejl˝od´ese . . . . . . . . . . . . . . . . .
2
1.3. Az ´erh´al´ozat kialakul´asa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
1.4. A fibronektin szerepe az ´erh´al´ozat kialakul´as´aban . . . . . .
6
1.5. Az ´erh´al´ozat jelent˝os´ege tumorokban . . . . . . . . . . . . .
7
2. C´ elkit˝ uz´ esek
9
3. Anyagok ´ es M´ odszerek
11
3.1. Immunjel¨ol´es . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 3.2. Sejtteny´eszetek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3.3. 3D kollag´en g´el . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3.4. Videomikroszk´opia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13 3.5. K´epfeldolgoz´as . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 3.6. AFM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15 4. Eredm´ enyek 17 ´ al´ozat morfol´ogi´aja ´es immunjel¨ol´ese a vaszkulogenezis 4.1. Erh´ sor´an . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 4.2. Sejth´al´ozatok in vitro teny´eszetekben . . . . . . . . . . . . . 19 4.3. A t¨obbsejt˝ u h´al´ozatok kialakul´as´anak dinamik´aja . . . . . . 22 4.4. H´al´ozatot alkot´o sejtek mikromechanikai tulajdons´agai . . . 24 4.5. A fibronektin dinamik´aja ´es szerepe . . . . . . . . . . . . . . 28 5. Diszkusszi´ o: a h´ al´ ozatk´ epz´ es modellez´ ese
33
5.1. A r´eszecskemodell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 5.2. A Potts modell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35 ¨ 6. Osszefoglal´ as
37 I
´ TARTALOMJEGYZEK 7. K¨ osz¨ onetnyilv´ an´ıt´ as
II 39
Hivatkoz´asok . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
1. fejezet Bevezet´ es 1.1.
Biol´ ogiai form´ ak kialakul´ asa
R´egt˝ol fogva k´et, egym´ast kieg´esz´ıt˝o u ´tja l´etezik a minket k¨or¨ ulvev˝o vil´ag, az ´el˝o ´es ´elettelen term´eszet meg´ert´es´enek: az alkot´or´eszek ´es a forma fel˝oli vizsg´alat, azaz a redukcionizmus ´es a holizmus. A redukcionista megk¨ozel´ıt´es az alkot´oelemeket vizsg´alja, az elemi o¨sszetev˝ok mibenl´et´et igyekszik felder´ıteni, a ”mib˝ol a´ll?” k´erd´esre keresi a v´alaszt. A holizmus a forma szeml´elete, a min˝os´egre koncentr´al, az alkot´oelemek szervez˝od´es´enek mint´azat´at helyezi a k¨oz´eppontba. Ez a kett˝oss´eg m´ar az ´okori g¨or¨og term´eszetfiloz´ofusokn´al is megnyilv´anul. Plat´on ´es Arisztotel´esz a fizikai vil´ag dolgait szint´en e k´et o¨sszetev˝oj¨ ukre: az anyagi ´es a formai elemre k¨ ul¨onv´alasztva vizsg´alja. Igaz Plat´on m´eg nem haszn´alja az anyag kifejez´est, ink´abb csak k¨or¨ ul´ırja, mely szerint az a dolog, amely r´eszes¨ ul egy ide´aban, ´es ez´altal a megfelel˝o tulajdons´agokkal rendelkezik. Arisztotel´eszn´el kapja meg az anyagi ¨osszetev˝o az elnevez´es´et, form´anak pedig azt a bels˝o szellemi l´enyeget nevezi, amely meghat´arozza, hogy valamely anyag milyen konkr´et l´etez˝ot testes´ıt meg. Az anyag lehet˝os´eg, ´es a forma ´altal lesz az ami – minden dolog e k´et t´enyez˝o szerves egys´egek´ent l´etezik. Fizikai, ´elettelen rendszerek (krist´alyok, frakt´alok) eset´en m´ar sokat tudunk a mint´azatk´epz˝od´est, szervez˝od´est meghat´aroz´o szab´alyokr´ol (Vicsek, 1992). Sz´amos mint´azat egyszer˝ u modellekkel el´eg nagy pontoss´aggal le´ırhat´o. A sok hasonl´o egys´eg k¨olcs¨onhat´asa k¨ovetkezt´eben makroszk´opikus szinten olyan elrendez˝od´es form´al´odik, amelyet az alkot´oelemek k¨olcs¨onhat´as hi´any´aban nem tudn´anak l´etrehozni. Az o¨nszervez˝o rendszerek l´enyeges tulajdons´agai az eg´esz rendszer viselked´es´et ´ırj´ak le, ezek olyan tulajdons´agok, amikkel egyetlen r´esz sem rendelkezik, hanem az a r´eszek k¨oz¨otti kapcsolatokb´ol ´es ¨osszef¨ ugg´esekb˝ol j¨on l´etre. A biol´ogi´aban megjelen˝o, ´el˝o rendszerek tele vannak k¨ ul¨onf´ele mint´azatokkal, ´ıgy mint´azatot alkotnak p´eld´aul a gerincoszlop csigoly´ai vagy a t¨ ud˝o l´egj´aratai. Az ´el˝ol´enyek k¨ uls˝o megjelen´es´eben szint´en sz´amos mint´azat figyelhet˝o meg, gondoljunk csak a zebra cs´ıkjaira, a pillang´ok sz´arny´an kirajzol´od´o mot´ıvumokra. M´ar egysejt˝ u mikroorganizmusok is 1
´ FEJEZET 1. BEVEZETES
2
figyelemre m´elt´o alakzatokat tudnak kialak´ıtani (Vicsek, 2001). Az embrion´alis fejl˝od´es sor´an a k¨ ul¨onb¨oz˝o szervek, sz¨ovetek k´epz˝od´esekor ugyancsak jellegzetes mint´azatok alakulnak ki, morfol´ogia ´es funkci´o a sejtek o¨nszervez˝od´ese r´ev´en j¨on l´etre. A fizikai rendszerekkel o¨sszehasonl´ıtva az ´el˝o szervezet azonban rendk´ıv¨ ul bonyolult: m´ar az alapvet˝o o¨sszetev˝o, a sejt m˝ uk¨od´es´enek meg´ert´ese sem k¨onny˝ u feladat. B´ar a sejtek mibenl´et´er˝ol m´ara m´ar o´ri´asi tud´as halmoz´odott fel, egy¨ uttes viselked´es¨ uk megj´osl´asa t¨obbnyire tov´abbra is lehetetlen. Ez´ert a sejtekb˝ol fel´ep¨ ul˝o kollekt´ıv rendszerek felt´erk´epez´ese, ´ertelmez´ese napjaink egyik nagy kih´ıv´asainak egyike. Az o¨nszervez˝o mechanizmus r´ev´en r´eszletekben gazdag strukt´ ura j¨on l´etre, ´es ebben a fizikai k¨olcs¨onhat´asoknak (diff´ uzi´o, mechanika) is fontos szerep jut. Az egyik legegyszer˝ ubb biol´ogiai o¨nszervez˝o folyamat a melegv´er˝ u gerinces embri´okban kialakul´o els˝odleges ´erh´al´ozat. Ezt a strukt´ ur´at m´eg a sz´ıvm˝ uk¨od´es megindul´asa el˝ott t¨obb sz´az, nagyj´ab´ol azonos sejt kollekt´ıv viselked´ese alak´ıtja ki (Risau and Flamme, 1995). Az ´erh´al´ozat l´etrej¨otte j´ol nyomonk¨ovethet˝o mad´arembri´ok fejl˝od´es´enek f´enymikroszk´opos megfigyel´es´evel. Az embri´o a toj´as s´arg´aj´anak felsz´ın´en, egy k¨onnyen hozz´af´erhet˝o fel¨ uleten ter¨ ul el, valamint sz´amos madarakra jellemz˝o, j´ol ´eszlelhet˝o endot´el specifikus molekul´aris marker is ismert. A folyamat sor´an a mezoderm´ab´ol v´eletlenszer˝ u helyeken differenci´al´odott endot´el (a k´es˝obbi ´erfalat alkot´o) sejtek el˝obb aggreg´atumokba szervez˝odnek, majd ny´ ulv´anyaik seg´ıts´eg´evel h´al´ozatot k´epeznek. A mechanizmus ¨onszervez˝o jelleg´ere a k¨ovetkez˝o tapasztalatok utalnak: egyr´eszt, az egyes ´erszegmensek elhelyezked´ese nagyfok´ u egyedi v´altozatoss´agot mutat, ´es kialakul´asa sor´an a h´al´ozat topol´ogi´aja t¨obbsz¨or a´talakul (Rupp et al., 2004; Czirok et al., 2008). M´asr´eszt, izol´alt ´ersejtek hasonl´o h´al´ozatokat hoznak l´etre olyan mesters´eges k¨or¨ ulm´enyek k¨oz¨ott, ahol nincs jelen a felt´etelezhet˝oen poz´ıcion´alis ir´any´ıt´ast ad´o term´eszetes sz¨oveti k¨ornyezet (Davis et al., 2000). A folyamat meg´ert´es´ehez szeretn´enk megv´alaszolni, hogy milyen mechanizmusok j´atszanak szerepet a mint´azat kialakul´as´aban, hogyan oldj´ak meg az egyedi sejtek, hogy egy¨ uttm˝ uk¨od´es¨ uk eredm´enyek´epp egy jellegzetes szerkezet (poligon´alis h´al´ozat) j¨on l´etre. Amint azt az al´abbiakban bemutatjuk, ezen k´erd´esek meg´ert´ese a tumorn¨oveked´es megakad´alyoz´as´aban is hasznosnak bizonyul, ezen k´ıv¨ ul a megfelel˝oen ´es megbizhat´oan funkcion´al´o ´erh´al´ozat a mesters´eges sz¨ovetek el˝oa´ll´ıt´as´anak is egyik sz¨ uks´eges felt´etele.
1.2.
Korai mad´ arembri´ ok fejl˝ od´ ese
A megterm´ekeny´ıtett toj´asban az embri´o kezdetben a toj´as s´arg´aj´at bor´ıt´o szikh´artya bels˝o oldal´an elhelyezked˝o, n´eh´any ezer sejtb˝ol ´all´o, korong alak´ u sejtcsoportosul´as (blasztodiszk). A korong k´et koncentrikus ter¨ uletre tagol´odik, a bels˝o z´ona az area pellucida, m´ıg a k¨ uls˝o az area opaca. A sejtcsoport eleinte szorosan a szikhez tapad (morula a´llapot), majd r´eszben egy kiss´e elt´avolodik t˝ole (blastula ´allapot) kialak´ıtva ezzel egy
´ FEJEZET 1. BEVEZETES
3
1.1. ´abra. A mezoderma kialakul´as´anak sematikus ´abr´aja a gasztrul´al´o mad´ arembri´ oban. A k¨ uls˝ o ´es bels˝o cs´ıralemez k¨oz¨ott sejtv´andorl´assal l´etrej¨on a k¨oz´eps˝ o cs´ıralemez. A gasztrul´aci´o korai szakasz´aban l´ev˝o embri´o fel¨ uln´ezeti k´ep´en (A) a vizszintes vonal jel¨oli a keresztmetszeti k´ep (B) s´ıkj´at (Lough and Sugi, 2000).
u ¨reget (blastocoel, subgermin´alis u ¨reg). Az u ¨reg felett elhelyezked˝o r´esz az area pellucida, m´ıg a tov´abbra is a szikh´arty´ahoz kapcsol´od´o k¨ uls˝o korong az area opaca. A fejl˝od´es k¨ovetkez˝o l´ep´ese a gasztrul´aci´o, melynek sor´an l´etrej¨onnek a cs´ıralemezek, ´es az embri´o morfol´ogi´aja az akt´ıv sejtmigr´aci´o k¨ovetkezt´eben dr´amaian a´talakul. A kezdeti sejtt¨omeg egyes sejtek kiv´andorl´as´aval el˝obb fokozatosan k´et r´etegg´e (epiblaszt ´es hipoblaszt) k¨ ul¨on¨ ul, majd a k¨ uls˝o r´etegb˝ol (epiblaszt) egy epit´el-mezenkim´alis transzform´aci´oval sejtek v´alnak le, amelyek l´etrehozz´ak a k¨oz´eps˝o cs´ıralemezt (mezoderma). A folyamat sor´an az embri´o farki r´esz´en´el az epiblaszt egy r¨ovid, sz´eles tartom´anyban megvastagodik (primit´ıv lemez), majd a lemez elkezd ny´ ulni, keskenyedni m´ıgnem egy cs´ıkot form´az (primit´ıv cs´ık). A mezoderm´at alkot´o sejtek a primit´ıv cs´ıkon kereszt¨ ul l´epnek be az embri´o belsej´ebe (1.1. ´abra). Ezt k¨ovet˝oen megkezd˝odik a mezoderma differenci´al´od´asa (1.2. a´bra), megindul az o˝scsigoly´ak (szomit´ak) fejl˝od´ese.
1.3.
Az ´ erh´ al´ ozat kialakul´ asa
Az ´erh´al´ozat egyike a melegv´er˝ u gerincesek fejl˝od´ese sor´an legkor´abban kialakul´o ´es funkcion´alisan m˝ uk¨od´esbe l´ep˝o szerveknek. F˝o szerepe a t´apanyag-ell´at´as ´es az anyagcsere biztos´ıt´asa, illetve a feln˝ott egyedben fontos kommunik´aci´os csatornak´ent m˝ uk¨odik a k¨ ul¨onb¨oz˝o szervek ´es sz¨ovetek k¨oz¨ott, n´elk¨ ul¨ozhetetlen az endokrin kommunik´aci´oban ´es a szervezet v´edelm´eben. Az embrion´alis ´erh´al´ozat morfogenezise a 20. sz´azad kezdet´et˝ol aktivan vizsg´alt ter¨ ulet. Az els˝odleges ´errendszer kialakul´asa t¨obb egym´ast k¨ovet˝o folyamat eredm´enye, els˝o l´ep´ese a k´es˝obbi ´erfalak bels˝o felsz´ın´et bor´ıt´o endot´el sejtek differenci´al´od´asa. Melegv´er˝ u gerincesekn´el ezek a sejtek hozz´ak l´etre a h´al´ozatos szerkezet˝ u primer plexust, mely ”poligon´alis” elrendez˝od´es˝ u, v´altoz´o sz´eless´eg˝ u finom ´agak, o¨sszekapcsolt sejtl´ancok j´arj´ak ´at az avaszkul´aris ter¨ uleteket. Ebb˝ol a tranziens strukt´ ur´ab´ol alakulnak ki a sz´ıv erei,
´ FEJEZET 1. BEVEZETES
4
1.2. ´abra. A mezoderma differenci´aci´oj´anak sematikus keresztmetszeti k´epe. A mezoderma ´ allom´ anya fokozatosan k´et lemezre v´alik sz´et, a k¨ uls˝o cs´ıralemezhez simul´ o r´esz a szomatikus mezoderma, m´ıg az endoderm´ahoz k¨ozeli lemez a splanchnikus mezoderma. Ekkor megjelennek m´ar az endot´el sejtek prekurzor sejtjei is, az angioblasztok (Fishman and Chien, 1997).
´ FEJEZET 1. BEVEZETES
5
1.3. ´abra. Els˝odleges ´erh´al´ozatot l´etrehoz´o endot´el sejtek szervez˝od´ese mad´ arembri´ oban. A kezdetben egyed¨ ul´all´o, illetve kisebb aggreg´atumokba csoportosul´ o sejtek (a) n´eh´ any ´ ora alatt line´aris szegmensekb˝ol fel´ep¨ ul˝o h´al´ozatot alkotnak (b). A felv´etelek f¨ urjembri´o endot´el sejtjeinek QH1 immunfluoreszcencia jel¨ol´es´evel k´esz¨ ultek, a jobb kontraszt miatt az intenzit´as´ert´ekeket invert´altuk.
az aorta, az art´eri´ak ´es v´en´ak, valamint a hajsz´al´erh´al´ozat. Nem melegv´er˝ u gerincesekn´el (klasszikusan tanulm´anyozott p´eld´aja a zebrahal) az embriogenezis rendk´ıv¨ ul gyorsan zajlik le, az ´erh´al´ozat l´etrej¨ott´et nem k´ıs´eri a primer plexushoz hasonl´o ´atmeneti strukt´ ura. A zebrahal ´errendszere a megterm´ekeny´ıt´est k¨ovet˝o 24 ´ora m´ ulva m´ar egy funkcion´alis szerv, mely a k´es˝obbiekben nem m´odosul sz´amottev˝oen (Weinstein, 1999). Mad´arembri´okban a mezoderm´ab´ol differenci´al´od´o kisebb sejtaggreg´atumok, az u ´n. v´erszigetek jelentik a kering´esi rendszer els˝o felismerhet˝o elemeit, melyek a t´enyleges embri´on k´ıv¨ uli, extraembrion´alis sz¨ovetben jelennek meg (Risau and Flamme, 1995). A v´erszigetek perif´eri´aj´an az endot´el sejtek, m´ıg k¨ozep´en a hemopoietikus sejtek prekurzor sejtjeit tal´aljuk. El˝obbiek (angioblasztok) hozz´ak l´etre az els˝odleges ´erh´al´ozatot, a primer plexust, ut´obbiakb´ol pedig az els˝odleges v´er funkci´oit ell´at´o sz¨ovet alakul ki. Az intraembrion´alis sz¨ovet ter¨ ulet´en v´erszigetek helyett csup´an egyed¨ ul´all´o angioblasztok figyelhet˝ok meg, melyek vagy helyben hoznak l´etre egy eret, vagy elv´andorolnak ´es hozz´akapcsol´odnak m´as angioblasztokhoz, illetve m´ar megl´ev˝o a´gakhoz. Az intaembrion´alis ´es extraembrion´alis ter¨ ulet hamar ¨osszek¨ottet´esbe ker¨ ul, ´es n´eh´any ´ora ut´an megindul a v´erkering´es. Az angioblasztok differenci´al´od´as´at, oszt´od´as´at, illetve a poligon´alis h´al´ozatot form´al´o, az aort´at ´es a f˝obb ereket tartalmaz´o els˝odleges plexus kialakul´as´anak folyamat´at vaszkulogenezisnek nevezz¨ uk. Ezt k¨ovet˝oen az angiogenezis sor´an a kialakult els˝odleges ´erh´al´ozat tov´abb form´al´odik, egyes ´agak visszafejl˝odnek, m´ıg m´as szegmensek egyes¨ ul´es´evel nagyobb erek j¨onnek l´etre, illetve u ´j erek is megjelenhetnek. Az ´erfalak stabiliz´aci´oj´aval l´etrej¨on a kifejlett szervezetre jellemz˝o mint´azat, ami a k´es˝obbiekben is k´epes a k¨ornyezeti hat´asokhoz alkalmazkodni (Yancopoulos et al., 2000).
´ FEJEZET 1. BEVEZETES
6
Az ´erh´al´ozat d¨ont˝o r´eszben embrion´alis korban v´egbemen˝o kialakul´asa k¨ ul¨on¨osen j´ol vizsg´alhat´o mad´arembri´ok fejl˝od´es´enek f´enymikroszk´opos nyomonk¨ovet´es´evel (Czirok et al. (2002), 1.3. ´abra). Az embri´o a toj´as s´arg´aj´anak felsz´ın´en, egy k´ıs´erleti vizsg´alatok sz´am´ara k¨onnyen hozz´af´erhet˝o fel¨ uleten ter¨ ul el. A f¨ urjekre (Coturnis coturnis japonica) jellemz˝o, j´ol ´eszlelhet˝o endot´el specifikus sejtfelsz´ıni molekul´aris marker (QH1) lehet˝ov´e teszi az endot´el sejtek ´es strukt´ ur´ak azonos´ıt´as´at ´es vizualiz´aci´oj´at az ´el˝o ´es fejl˝od˝o embri´okban (Pardanaud et al., 1987). Amint azt a vaszkulogenezis folyamat´ar´ol k´esz¨ ult hossz´ ut´av´ u optikai mikroszk´opos megfigyel´esek megmutatt´ak, az ´erh´al´ozat-k´epz´es folyam´an a mezoderm´alis eredet˝ u prekurzor sejtekb˝ol differenci´al´odott egy´eni, illetve kisebb aggreg´atumokba szervez˝od¨ott endot´el sejtek kezdetben k¨ ul¨on´all´o klasztereket alkotnak (Rupp et al., 2004). Az id˝o el˝orehaladt´aval ezek a csoportok ¨osszekapcsol´odnak, ´es line´aris sejtl´ancokat k´epeznek. A line´aris szegmensek jellemz˝oen egy u ´n. cs´ır´az´asi (sprouting) mechanizmussal j¨onnek l´etre. A csoport egy sejtje egy v´ekony ny´ ulv´anyt bocs´at a k¨ornyez˝o sejtk¨oz¨otti ´allom´anyba, melynek ment´en tov´abbi sejtek v´andorolnak ki, mik¨ozben egym´assal ´es az eredeti aggreg´atummal is kapcsolatban maradnak. Az ´ıgy l´etrehozott l´anchoz a szomsz´edos helyekr˝ol m´eg tov´abbi sejtek csatlakozhatnak, u ´jabb o¨sszek¨ottet´eseket ´es csom´opontokat teremtve a mint´azatban, m´ıgnem a line´aris szegmensek egym´assal is ¨osszekapcsol´odnak. A folyamat eredm´enye egy karakterisztikus poligon´alis szerkezet˝ u, sejtmentes ter¨ uleteket k¨or¨ ul¨olel˝o h´al´ozat lesz. A k¨ovetkez˝o l´ep´esben az egyes line´aris szegmenseket alkot´o n´eh´any sejt lumeneket form´az ´es cs¨oveket hoz l´etre, melyek azt´an nagyobb a´tm´er˝oj˝ u erekk´e olvadhatnak o¨ssze (Rupp et al., 2003).
1.4.
A fibronektin szerepe az ´ erh´ al´ ozat kialakul´ as´ aban
A sz¨oveti sejtek sz´am´ara dinamikusan v´altoz´o k¨ornyezetet jelent˝o extracellul´aris m´atrix (ECM) egyik gyakori komponense a fibronektin, mely szerepet j´atszik a sejtek kitapad´as´aban, ´es ´ıgy k¨ozvetve a sejtek migr´aci´oj´aban, differenci´aci´oj´aban ´es oszt´od´as´aban is (Hynes, 1992). A glikoproteinek csal´adj´aba tartoz´o fibronektint sz´amos k¨ ul¨onb¨oz˝o sejtt´ıpus (endot´el, fibroblaszt sejtek, bizonyos epit´el sejtek) diszulfid h´ıddal o¨sszekapcsolt dimer form´aj´aban k´epes szekret´alni. A sejtek a szekret´alt dimereket specifikus sejtfelsz´ıni receptorok (α5β1 integrin) seg´ıts´eg´evel megk¨otik, ´es sz´alas strukt´ ur´akba rendezik. A fibronektin az embrion´alis fejl˝od´es legkor´abbi szakasz´aban jelen van a sejtk¨oz¨otti a´llom´anyban, jelenl´ete legink´abb a Hensen-csom´o k¨orny´ek´en ´es a primit´ıv cs´ık ment´en szembet˝ un˝o. Szerkezet´et ´es lokaliz´aci´oj´at egyr´eszt az embri´o fejl˝od´ese sor´an fell´ep˝o deform´aci´ok ´es nagy sk´al´aj´ u sz¨ovetmozg´asok, m´asr´eszt az egyes sejtek ´altal kifejtett hat´asok (migr´aci´o, cs´ır´az´as) alak´ıtj´ak (Czirok et al., 2006). A fejl˝od˝o erek baz´alis oldal´at bebor´ıt´o alaph´artya
´ FEJEZET 1. BEVEZETES
7
1.4. a´bra. Az extracellul´aris m´atrix rostjainak felt´etelezett szerepe a vaszkulogenezis sor´ an. A sejtcsoportok egyenletes h´ uz´oer˝ot fejtenek ki az ˝oket k¨or¨ ulvev˝o ECM sz´ alaira, melynek k¨ ovetkezt´eben k´et csoport k¨oz¨ott az ˝oket ¨osszek¨ot˝o egyenes ment´en a m´ atrix rostjai megfesz¨ ulnek ´es k¨otegekk´e ´allnak ¨ossze (A). Az ´ıgy l´etrej¨ ott el˝ omint´ azatot k¨ ovetik azt´an a sejtek migr´aci´ojuk alatt, melynek sor´an h´al´ozatos szerkezetet alakitanak ki (C) (Vernon et al., 1995). BAEC (bovine aortic endothelial cells) sejtek csoportjaib´ol kin¨ov˝o cs´ır´ak a k¨ozt¨ uk fesz¨ ul˝o kollag´en roston haladnak (Korff and Augustin, 1999).
is fibronektinben gazdag (Ffrench-Constant and Hynes, 1988), ´es a fibronektin n´elk¨ ul¨ozhetetlen szerepet j´atszik a vaszkulogenezis folyamat´aban: azok a g´enki¨ ut¨ott eg´erembri´ok, amelyekb˝ol hi´anyzik vagy a fibronektin g´en, vagy a fibronektin f˝o receptor´anak, az α5β1 integrinnek az egyik o¨sszetev˝oje, ´eletk´eptelenek, ´erh´al´ozatuk fejl˝od´ese s´ ulyos rendelleness´egekkel t¨ort´enik (George et al., 1993). Az azonban nem ismert, hogy a fibronektin hi´anya milyen m´odon akad´alyozza meg a vaszkulogenezis folyamat´at. Egyes felt´etelez´esek szerint az endot´el sejtek migr´aci´ojuk sor´an bizonyos j´ol defini´alt, az ECM-ben ”el˝orejelzett” u ´tvonalat k¨ovetnek (Vernon et al. (1995), 1.4. a´bra) – a fibronektin-tartalm´ u ECM rostok k¨ ul¨on¨osen alkalmasak lehetnek erre a szerepre.
1.5.
Az ´ erh´ al´ ozat jelent˝ os´ ege tumorokban
M´ar jelenleg is sz´amos ter´api´as k´ıs´erlet pr´ob´alja az ´erh´al´ozat n¨oveked´es´et stimul´alni, illetve g´atolni (Rumpold et al., 2004; Murphy et al., 2008). B´armely sz¨ovet ´eletben marad´as´anak elengedhetetlen felt´etele az
´ FEJEZET 1. BEVEZETES
8
oxig´enell´at´as, mely a sz¨ovetet a´tj´ar´o hajsz´al´erh´al´ozaton kereszt¨ ul val´osul ´ meg. Igy van ez r´akos sz¨ovetek eset´en is, kapill´aris rendszer hi´any´aban a sejtburj´anz´as fejl˝od´ese hamarosan le´all. Ha azonban a rosszindulat´ uan elv´altozott sejtek megoldj´ak az oxig´en p´otl´as´at, vagyis k´epess´e v´alnak ´erh´al´ozat-k´epz˝od´est beind´ıt´o faktorokat kiv´alasztani, ´es ezzel beind´ıtani az ´erk´epz˝od´est, biztos´ıtani tudj´ak korl´atlan n¨oveked´es¨ uk egyik alapvet˝o k¨ovetelm´eny´et. Vagyis a daganatos sz¨ovetek n¨oveked´ese a legt¨obb esetben az azt beh´al´oz´o hajsz´alerek kialakul´as´anak megakad´alyoz´as´aval sikeresen g´atolhat´o. Az ´erk´epz˝od´es dinamik´aj´anak, szab´alyoz´as´anak ismerete hat´ekony elj´ar´asokhoz vezethet daganatos betegs´egek gy´ogy´ıt´as´aban (R´ez, 2002). Az egyik legintenz´ıvebben kutatott tumorellenes strat´egia a VEGF (vascular endothelial growth factor) n¨oveked´esi faktor hat´as´an alapul. A VEGF az endot´el sejtek mozg´as´at ´es oszt´od´as´at el˝oseg´ıt˝o szekret´alt feh´erje, melynek gradiense az endot´el sejtek ir´any´ıtott v´andorl´as´at (kemotaxis) is el˝oid´ezi (Bauer et al., 2009). A VEGF sz´amos v´altoz´ast induk´al a daganatok k¨or¨ ul kialakul´o ´erh´al´ozatban is, bele´ertve az endot´el sejtek oszt´od´as´at, migr´aci´oj´at, inv´az´os k´epess´eg´et, t´ ul´el´es´et, csontvel˝ob˝ol sz´armaz´o progenitor sejtek kemotaxis´at, v´ererek permeabilit´as´at ´es t´agul´as´at (vasodilation). A szolid tumorok a VEGF mellett m´as angiog´en faktort is termelnek, melyek egy komplex folyamatsort elind´ıtva u ´j erek l´etrej¨ott´et eredm´enyezik a daganatos sz¨ovetekben. Ahogy egy friss ´attekint´es (Ellis and Hicklin, 2008) ismerteti, t¨obb lehet˝os´eg is k´ın´alkozik a n¨oveked´esi faktorok hat´as´anak megakad´alyoz´as´ara. A ligandum (VEGF), illetve a receptorai (VEGFR) inaktiv´alhat´oak ellenanyagok felhaszn´al´as´aval, a VEGFR kin´az aktivit´asa ´es a bel˝ole kiindul´o sejten bel¨ uli jel´atvitel g´atolhat´o tirozin kin´az inhibitorokkal. Jelenleg a bevacizumab, mely egy a VEGF elleni rekombin´ans monoklon´alis antitest, m´ar a klinikai fejleszt´esek el˝orehaladott st´adium´aban j´ar. Kemoter´api´aval kombin´alva jav´ıtotta a t´ ul´el´est metasztatikus colorectalis szarkin´oma ´es t¨ ud˝or´ak eset´en. A VEGF-et c´elz´o ter´apia o¨nmag´aban alkalmazva is eredm´enyesnek bizonyult vese ´es m´aj szarkin´oma (epit´eli´as eredet˝ u rosszindulat´ u tumor) megbeteged´esek eset´en, m´ıg m´as esetekben kemoter´api´as kezel´es mellett alkalmazt´ak nem kissejtes t¨ ud˝or´akban ´es metaszt´azisos mellr´akban szenved˝o betegekn´el. A ter´apia sz´amos sejtt´ıpust (endot´el sejtek, hemopoietikus prekurzor sejtek, dendritikus ´es daganatsejtek) ´erint a daganat mikrok¨ornyezet´eben, ´es hat´asa sz´amos mechanizmuson kereszt¨ ul nyilv´anul meg, melyek tumor t´ıpusonk´ent elt´er˝ok lehetnek. A kezel´es amellett hogy m´odos´ıtja az ´errendszeri funkci´okat (´araml´as ´es permeabilit´as), akad´alyozza tov´abbi u ´j erek l´etrej¨ott´et. Az ´erh´al´ozat n¨oveked´es´enek serkent´ese szint´en sz´amos ter´api´as c´el´ u hasznos´ıt´asi lehet˝os´eget k´ın´al. S´er¨ ult, beteg sz¨ovetek, illetve szervek regener´al´od´asa csak a folyamatot k´ıs´er˝o, folyamatosan fejl˝od˝o ´errendszer mellett lehets´eges, mely megker¨ ulhetetlen r´esze a sz¨ovetek mesters´eges el˝o´all´ıt´as´ara tett er˝ofesz´ıt´eseknek is (Wu et al., 2004). Az ´erfalakat fel´ep´ıt˝o sejtek o¨nszervez˝o viselked´es´enek meg´ert´ese sz´amottev˝oen seg´ıtheti ezeket a pr´ob´alkoz´asokat.
2. fejezet C´ elkit˝ uz´ esek A bemutatott munk´am c´elja kett˝os. Egyr´eszt, in vitro modellek seg´ıts´eg´evel tanulm´anyozzuk a t¨obbsejt˝ u ”cs´ır´az´ast”, azaz azt a folyamatot, amikor t¨obb sejt egy¨ uttes mozg´asa egy line´aris strukt´ ur´at eredm´enyez. M´asr´eszt, r´eszben az in vitro modellek, r´eszben fejl˝od˝o mad´arembri´ok hossz´ ut´av´ u (time-lapse) mikroszk´opos felv´eteleinek ki´ert´ekel´es´evel behat´aroljuk a fibronektin vaszkulogenezis sor´an bet¨olt¨ott lehets´eges szerep´et. A nemr´eg l´etrehozott BCE endot´el sejtvonal (Veitonmaki et al., 2003) egy sokkal egyszer˝ ubb in vitro endot´el modell lehet˝os´eg´et ´ıg´eri, mint a hagyom´anyos primer (HUVEC, BAEC) sejtek. Megvizsg´aljuk, hogy kialak´ıthat´oak-e olyan teny´eszt´esi k¨or¨ ulm´enyek, amelyekben a kollag´enI g´elbe ´agyazott BCE sejtek is h´al´ozatokba kapcsol´odnak o¨ssze. A h´aromdimenzi´os teny´eszetek hossz´ ut´av´ u mikroszk´opos megfigyel´es´evel meghat´arozzuk, hogy hogyan j¨onnek l´etre a sejth´al´ozatok. A VEGF (vascular endothelial growth factor) mind a vaszkulo-, mind az angiogenezis folyamat´aban egy fontos jelmolekula, mely a sejtfelsz´ıni tirozin-kin´az receptorhoz k¨otve stimul´alja a sejtek oszt´od´as´at ´es migr´aci´oj´at. A bFGF (basic fibroblast growth factor) szint´en szerepet j´atszik a prolifer´aci´oban ´es a sejtek differenci´aci´oj´aban. BCE sejtek h´aromdimenzi´os teny´eszeteiben meghat´arozzuk, ezek a faktorok hogyan befoly´asolj´ak a sejtek h´al´ozatk´epz´es´et. J´ol ismert, hogy bizonyos nem-endot´el sejtek k´etdimenzi´os teny´eszeteiben is line´aris strukt´ ur´ak k´epz˝odnek. Mivel a k´etdimenzi´os teny´eszt˝ofel¨ ulet lehet˝ov´e teszi az egyes sejtek ´es sejtalakok egyszer˝ u megk¨ ul¨onb¨oztet´es´et, az egyes sejtek trajekt´ori´ainak elemz´es´evel meghat´arozzuk a sejtmozg´asok ´es a kialakul´o mint´azat kapcsolat´at, valamint a h´al´ozatk´epz˝o sejtek mikromechanikai a´llapot´at. Fix´alt embri´ok immunjel¨ol´es´evel, r´eszletes id˝ofelbont´assal felt´erk´epezz¨ uk a fibronektin eloszl´as´at a vaszkulogenezis k¨ ul¨onb¨oz˝o f´azisaiban, k¨ ul¨on¨os tekintettel az ´erh´al´ozat lehets´eges ECM el˝omint´azat´ara. Egy, a fibronektin polimeriz´aci´oj´at g´atl´o fibronektin fragmenst felhaszn´alva megvizsg´aljuk a fibronektin szerep´et a h´aromdimenzi´os in vitro modellrendszerekben. Mikroinjekt´alt ellenanyagokkal pulzus-immunjel¨olt embri´ok fejl˝od´es´er˝ol k´esz¨ ult k´epsorozatokat elemezve megvizsg´aljuk az ereket be9
´ ˝ ESEK ´ FEJEZET 2. CELKIT UZ
10
burkol´o alaph´artya fibronektin komponens´enek az o¨ssze´all´as´at, illetve az endot´el sejtek mozg´as´anak ´es a fibronektin rostoknak a kapcsolat´at.
3. fejezet Anyagok ´ es M´ odszerek 3.1.
Immunjel¨ ol´ es
A k¨ ul¨onb¨oz˝o inkub´al´asi id˝oknek megfelel˝oen elt´er˝o fejl˝od´esi st´adiumban l´ev˝o f¨ urj embri´okat (Coturnix coturnix japonica, Ozark Egg Co., Stover, MO U.S.A.) egy foglalatk´ent szolg´al´o pap´ırgy˝ ur˝ u seg´ıts´eg´evel tett¨ uk hozz´af´erhet˝ov´e a manipul´aci´ok elv´egz´es´ehez. A megterm´ekeny´ıtett, felnyitott toj´as tartalm´at egy petri-cs´esz´ebe o¨nt¨ott¨ uk, a toj´asfeh´erj´et pedig transzferpipett´aval elt´avol´ıtottuk, hogy felfedj¨ uk a szikh´arty´at ´es a rajta elhelyezked˝o embri´ot. Ezt k¨ovet˝oen egy pap´ırgy˝ ur˝ ut helyezt¨ unk az embri´o f¨ol´e, ami a szikh´arty´ahoz tapadt. A gy˝ ur˝ ut k¨ uls˝o ´atm´er˝oje k¨or¨ ul k¨orbev´agtuk, majd elv´alasztottuk a toj´ass´arg´aj´at´ol a hozz´atapadt szikmembr´annal ´es embri´oval. Az embri´okat EPBS-be (embryonic phosphate buffered saline) mer´ıtett¨ uk elt´avol´ıtva a m´eg hozz´atapadt toj´as darabk´akat. A fix´al´ast 3%-os paraformaldehidben v´egezt¨ uk szobah˝om´ers´ekleten 45 percig. A szikmembr´an elt´avol´ıt´asa ut´an az embri´okat abszol´ ut metanolban o permeabiliz´altuk (4 C, 1 o´ra), ´es egyre cs¨okken˝o koncentr´aci´oj´ u etanol-v´ız oldatban rehidr´altuk, majd 0,01 % azidot tartalmaz´o PBS-ben t¨obbsz¨or megmostuk. A fix´alt embri´okat el˝osz¨or 3%-os BSA-ban (bovine serum albumin) inkub´altuk (4o C, 12-18 ´ora), majd ny´ ul anti-TAL1 (Dr. C.Drake, Medical University of South Carolina) ´es eg´er monoklon´alis B3D6 (Developmental Studies Hybridoma Bank) els˝odleges ellenanyagokkal v´egezt¨ unk immo unjel¨ol´est (4 C, 12-18 ´ora). Hig´ıt´asok: TAL1 1:500, B3D6 1:8000 a sejtmagok, illetve a fibronektin jel¨ol´es´ere. T¨obbsz¨ori PBS-ben t¨ort´en˝o mos´as ut´an ism´et 3%-os BSA-ban blokkoltuk az embri´okat, v´eg¨ ul alkalmas fluorokr´ommal ell´atott m´asodlagos antitestekkel (TAL1: poliklon´alis szam´ar anti-ny´ ul + Alexa-555, 1:1000; B3D6 poliklon´alis kecske anti-eg´er + Alexa488, 1:1000), illetve az endot´el sejtek kimutat´as´ara szolg´al´o direkt konjug´alt (Alexa-488) monoklon´alis QH1 (Developmental Studies Hybridoma Bank) ellenanyaggal inkub´altuk ˝oket (4o C, 12-18 o´ra, 1:1000 hig´ıt´as). A mikroinjekt´al´asra sz´ant embri´okat a toj´asb´ol t¨ort´en˝o elt´avol´ıt´as ´es megtiszt´ıt´as ut´an 5% agar g´elre helyezt¨ uk ventr´alis oldalukkal felfel´e. A Cy3 fluorofl´orral konjug´alt QH1 ´es B3D6+Alexa-488 ellenanyagokat 1 ng/nl 11
´ MODSZEREK ´ FEJEZET 3. ANYAGOK ES
12
koncentr´aci´oban, 25 nl adagokban a szomit´akt´ol later´alisan mindk´et oldalon injekt´altuk, oldalank´ent 2-4 poz´ıci´oban. A m˝ uvelethez haszn´alt 18 µm bels˝o a´tm´er˝oj˝ u injekt´al´o t˝ ut az endoderma ´es a splanchnikus mezoderma k¨oz´e, az ´erh´al´ozat-k´epz˝od´es akt´ıvan zajl´o ter¨ ulet´ere vezett¨ uk be. A t˝ u poz´ıcion´al´asa egy mechanikus mikromanipul´atorral (Narishige) t¨ort´ent. Az aktinv´az fluoreszcens jel¨ol´es´et 10% FCS-t tartalmaz´o DMEM-ben teny´esztett C6 gli´oma ´es 3T3 fibroblaszt sejtek kult´ ur´ain v´egezt¨ uk. A sejteket 20 µg/ml koncentr´aci´oj´ u fibronektin aljzaton n¨ovesztett¨ uk, melyet egy napig inkub´altunk szobah˝om´ers´ekleten u ¨veglemezekre. A fix´al´ast 3%-os paraformaldehidben v´egezt¨ uk (20 perc, szobah˝om´ers´eklet), majd h´aromszori PBS-ben t¨ort´en˝o mos´ast k¨ovet˝oen 0.1 %-os Triton X-100 oldatban permeabiliz´altuk a sejteket ¨ot percig. T¨obbsz¨ori mos´as ut´an a teny´eszeteket 20 µg/ml koncentr´aci´oj´ u phalloidin-FITC-cel festett¨ uk meg (1.5 ´ora, szobah˝om´ers´eklet), majd u ´jabb mos´asokkal elt´avol´ıtottuk a marad´ek ellenanyagot.
3.2.
Sejtteny´ eszetek
A h´aromdimenzi´os kollag´en g´elbe kevert in vitro kult´ ur´akhoz kapill´aris (BCE, bovine capillary endothelial cell line, (Veitonmaki et al., 2003)) ´es k¨old¨okzsin´or (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells, Invitrogen) endot´el sejteket haszn´altunk. A primer HUVEC sejteket 2% f¨ot´alis borj´ usav´ot (FCS, Gibco) tartalmaz´o ECGM-ben (endothelial cell growth medium, Promocell), a BCE sejteket 10% FCS-sel ´es 3 ng/ml bFGF n¨oveked´esi faktorral kieg´esz´ıtett DMEM-ben (Dulbeccos modified essential medium, Sigma) tartottuk fenn. A k´etdimenzi´os kult´ ur´akhoz k¨onnyen kezelhet˝o patk´anyb´ol sz´armaz´o C6 gli´oma, illetve 3T3 eg´er fibroblaszt sejtvonalakat alkalmaztunk. A sejtek 10% FCS-t tartalmaz´o DMEM-ben n¨ovesztett¨ uk, ahol jel¨olt¨ uk blebbisztatin inhibitorral (Sigma) kezelt¨ uk ˝oket 1, 3, 10 µM koncentr´aci´oban. A sejteket 35 mm-es cs´esz´ekben, 37 fokos, 5%-os sz´endioxiddal d´ us´ıtott leveg˝oj˝ u inkub´atorban teny´esztett¨ uk.
3.3.
3D kollag´ en g´ el
A mesters´eges h´aromdimenzi´os k¨ornyezetet patk´anyfarok kollag´en-I g´elben (Becton-Dickinson) hoztuk l´etre, melynek pH-j´at 10X PBS-sel ´es 1 M NaOH-dal ´all´ıtottuk be, majd belekevert¨ uk a sejteket 105 − 106 sejt/ml s˝ ur˝ us´egben. Tapasztalataink szerint enn´el alacsonyabb sejts˝ ur˝ us´eg eset´en nem alakul ki mint´azat a sz´etsz´ort sejtekb˝ol, nagyobb s˝ ur˝ us´egn´el pedig a sejtek o¨sszeh´ uzz´ak a g´elt, mely ´ıgy lev´alik a teny´eszt˝oed´eny fal´ar´ol. Az elk´esz¨ ult sejt-g´el kever´eket 24, ill. 96 lyuk´ u sejtteny´eszt˝o t´alc´akba helyezt¨ uk, el˝obbibe 80 µl, ut´obbiba 250/500 µl t´erfogatot t´eve, majd f´el o´r´aig inkub´altuk 37o C fokon. A kult´ ur´akhoz (v´egs˝o koncentr´aci´ot tekintve) 40 ng/ml bFGF (basic fibroblast growth factor, Invitrogen), 40
´ MODSZEREK ´ FEJEZET 3. ANYAGOK ES
13
3.1. a´bra. Az ELTE Biol´ogiai Fizika Tansz´ek´en m˝uk¨od˝o, Leica DMIRB inverz mikroszk´ opra ´ep´ıtett automatiz´alt mikroszk´oprendszer 2007 ˝osz´en.
ng/ml VEGF (vascular endothelial growth factor, Sigma-Aldrich), 50 ng/ml PMA (phorbol myristate acetate, Sigma-Aldrich) ´es 50 µg/ml aszkorbinsav adal´ekokat tartalmaz´o t´apoldatot adtunk, melyet h´aromnaponta cser´elt¨ unk. Ahol jel¨olt¨ uk, 75 µg/ml 70 kDa fibronektin fragmenst is tartalmazott a t´apoldat. A prepar´atumokat 3-5%-os paraformaldehiddel fix´altuk 30 percig szobah˝om´ers´ekleten, ´es toluidink´ekkel festett¨ uk meg.
3.4.
Videomikroszk´ opia
Sejtkult´ ur´ak hossz´ u t´av´ u mikroszk´opos megfigyel´es´ehez az ELTE Biol´ogiai Fizika Tansz´ek´en m˝ uk¨od˝o, Leica DMIRB inverz mikroszk´opra ´es Olympus Dp70 kamer´ara ´ep´ıtett automatiz´alt rendszert haszn´altuk (3.1. a´bra). A rendszerben egy mini-inkub´ator biztos´ıtja a sejtek fenntart´as´ahoz sz¨ uks´eges h˝om´ers´ekletet ´es l´egk¨ort. A t´argyasztal mozgat´as´aval egyszerre t¨obb l´at´ot´er nyomonk¨ovet´ese is lehets´eges t¨obb f´okuszs´ıkban (3.2. a´bra). A k´epsorozatokat 10X nagy´ıt´as´ u objekt´ıvvel k´esz´ıtett¨ uk minden t´ız percben. Az embrion´alis ´erh´al´ozat id˝obeli fejl˝od´es´et a University of Kansas Medical Center Anat´omiai ´es Sejtbiol´ogiai Tansz´ek´en m˝ uk¨od˝o, Leica DMR mikroszk´opra ´es Retiga kamer´ara ´ep´ıtett videomikroszk´opos rendszerrel vizsg´altuk. A felv´eteleket DIC ´es epifluoreszcens optik´akkal, 10X objekt´ıvvel k´esz´ıtett¨ uk.
´ MODSZEREK ´ FEJEZET 3. ANYAGOK ES
14
3.2. a´bra. A sejtteny´eszetek megfigyel´es´ehez haszn´alt automatiz´alt mikroszk´oprendszer sematikus rajza (Heged˝ us et al., 2000).
´ MODSZEREK ´ FEJEZET 3. ANYAGOK ES
15
3.3. ´abra. Az AFM m´er´esek sor´an felhaszn´alt piramis alak´u cs´ucs elektronmikroszk´ opos k´epe (A), valamint geometriai param´eterei (B). Forr´as: http://www.veecoprobes.com/p-3419-msct.aspx
3.5.
K´ epfeldolgoz´ as
A wide-field fluoreszcens k´epek dekonvolv´al´as´at az Autoquant X programmal (Media Cybernetics) v´egezt¨ uk. A k´epek elemz´es´ehez felhaszn´altuk az ImageJ open-source program Wright Imaging Facility v´altozat´at, valamint a Debian 4.0 oper´aci´os rendszer k´epmanipul´al´o seg´edprogramjait.
3.6.
AFM
Az atomer˝o mikroszk´opos vizsg´alatokat a SOTE Biofizika Int´ezet´eben, Dr Kellermayer Mikl´os laborat´orium´aban v´egezte Dr M´ehes El˝od. Az adatok ki´ert´ekel´es´et az IGOR szoftvercsomaggal (WaveMetrics, Portland, OR) valamint UNIX scriptekkel v´egeztem. Az AFM m´er´esek sor´an felhaszn´alt piramis alak´ u cs´ ucs (3419-msct, Veeco Instruments) geometriai param´eterei a 3.3. a´bra jel¨ol´eseivel: Front Angle (FA): 15 ± 2.5o ; Back Angle (BA): 25 ± 2.5o ; Side Angle (SA): 22.5 ± 2.5o . Az indent´aci´os (benyom´od´as-er˝o) g¨orb´ek ki´ert´ekel´es´ere a Sneddon modellt haszn´altuk. Sneddon (Sneddon, 1965) eredm´enye alapj´an a k´ uppal benyomott v´egtelen f´elt´er eset´en a d benyom´od´asi m´elys´eghez tartoz´o F er˝o nagys´aga d2 2tgθ 2 F = d, (3.1) 1 − ν2 π ahol E a benyomott anyag rugalmass´agi modulusa, θ a k´ up f´elny´ıl´assz¨oge,
´ MODSZEREK ´ FEJEZET 3. ANYAGOK ES
16
ν pedig a Poisson sz´am, melynek ´ert´eke izotr´op, o¨sszenyomhatatlan k¨ozeg eset´en ν = 0.5. Ha a k´ up ny´ıl´assz¨og´et a piramis geometriai adatai alapj´an θ ≈ 20o -kal k¨ozel´ıtj¨ uk, valamint irodalmi adatok alapj´an felt´etelezz¨ uk, hogy 1 − ν 2 ≈ 0.75, a Young modulusra 3 E ≈ 3(F/d2 ) = F 00 2
(3.2)
ad´odik, ahol F 00 jel¨oli az F (d) g¨orbe m´asodik deriv´altj´at a t˝ u ´es a sejtfelsz´ın ´erintkez´esi pontj´aban. Ezt az ´ert´eket az F (d) g¨orb´ek els˝o deriv´altjaira illesztett egyenes meredeks´eg´eb˝ol hat´arozzuk meg.
4. fejezet Eredm´ enyek 4.1.
´ al´ Erh´ ozat morfol´ ogi´ aja ´ es immunjel¨ ol´ ese a vaszkulogenezis sor´ an
Fix´alt f¨ urjembri´ok immunfluoreszcens jel¨ol´es´evel nyomonk¨ovethet˝o az els˝odleges ´erh´al´ozat morfol´ogi´aj´anak kialakul´asa. A 4.1. a´bra mutatja h´arom, az embrion´alis fejl˝od´es k¨ ul¨onb¨oz˝o st´adiumaiban l´ev˝o egyed immunjel¨ol´es´et h´aromf´ele ellenanyaggal: (i) a QH1 egy f¨ urj-specifikus antitest, a felismert epit´op az endot´el sejtek felsz´ın´en tal´alhat´o (Pardanaud et al., 1987); (ii) a TAL1 transzkripci´os faktort az irodalom az endot´el sejtek differenci´aci´ojakor a sejtmagban hamar kimutathat´o markerk´ent tartja sz´amon (Drake et al., 1997); (iii) a B3D6 antifibronektin az endot´el sejtek ECM k¨ornyezet´et vizualiz´alja. Vizsg´alat´at az indokolja, hogy az endot´el cs¨ovek baz´alis fel¨ ulet´et nagyon hamar egy fibronektinben gazdag alaph´artya burkolja be, tov´abb´a a fibronektin – csak´ ugy mint receptora, az α5β1 integrin – sz¨ uks´eges a vaszkulogenezis norm´alis lefoly´as´ahoz (George et al., 1993). Az ´erh´al´ozat kialakul´as´anak kezdeti szakasz´aban az embri´o egy-k´et szomit´as, azaz a Hamburger-Hamilton-f´ele (HH, (Hamburger and Hamilton, 1951)) 6-os ´allapotban van. Ekkor az els˝ok´ent megjelen˝o mezoderm´alis eredet˝ u, endot´el prekurzor sejtek (angioblasztok) strukt´ ur´alatlan fibronektin k¨ornyezetben helyezkednek el, azaz nem l´athat´o fibronektin el˝omint´azat (4.1A ´es D ´abr´ak). Ekkor v´eletlenszer˝ uen elsz´ort TAL1+/QH1, TAL1+/QH1+ ´es esetenk´ent TAL1-/QH1+ sejteket figyelhet¨ unk meg, melyek k¨oz¨ ul a TAL1+/QH1- a leggyakoribb. A vaszkulogenezis k¨ovetkez˝o f´azis´aban (HH 7-8) a k¨ ul¨on´all´o, illetve kisebb csoportokban l´ev˝o sejtek line´aris szegmenseket k´epeznek. Az ´ıgy megjelen˝o strukt´ ur´ak egy r´esz´et m´ar fibronektin burkolja be (4.1B ´es E ´abr´ak). A vaszkulogenezis utols´o f´azis´aban, a kering´es megindul´asa el˝ott (HH9) az ´erh´al´ozat anterior r´esz´en az endot´el sejtek m´ar cs¨oveket alkotnak, a fibronektin pedig j´or´eszt az ´erfalakban tal´alhat´o – az avaszkul´aris ter¨ uleteken alig kimutathat´o (4.1C, F ´es G a´br´ak). A fibronektin teh´at nagyon hamar, sokszor m´eg a QH1 marker megjelen´ese el˝ott feld´ usul az endot´el sejtek felsz´ın´en, el˝omint´azatot azonban nem alkot. 17
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
18
. 4.1. a´bra. A korai ´erh´al´ozat szervez˝od´ese f¨urj embri´okban. Az immunjel¨ol´est az endot´el sejtfelsz´ıni QH1 markerrel (piros), a sejtmagban lokaliz´al´od´o TAL1 transzkripci´ os faktort jel¨ ol˝ o ellenanyaggal (k´ek), valamint B3D6 antifibronektinnel v´egezt¨ uk (z¨ old). A megjelen˝o angioblasztok popul´aci´oja kezdetben gazdag, ´ am rendezetlen fibronektin k¨ornyezetben helyezkedik el (A, D). A k´epz˝od˝o QH1+ vagy TAL1+ line´ aris strukt´ ur´ak fel¨ ulet´en feld´ usul a fibronektin (B, E). A kering´est megel˝ oz˝ o f´ azisban a fibronektin alig detekt´alhat´o az endot´el szegmenseken k´ıv¨ uli, avaszkul´ aris ter¨ uleteken (C, F, G). Ebben a f´azisban gyakran megfigyelhet¨ unk QH1+/TAL1- sejteket is (t´eglalap). A nyilak az endot´el sejtfelsz´ınn´el feld´ usult fibronektint mutatj´ ak. A differenci´al´od´o QH1-/TAL1+ angioblasztokat k¨or¨ok jelzik.
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
19
4.2. ´abra. H´al´ozatk´epz´es h´aromdimeni´os sejtteny´eszetekben. Kollag´en-I g´elbe a´gyazott BCE (A) ´es HUVEC (B) endot´el sejtek szuszpenzi´oj´ab´ol kapill´arisszer˝ u strukt´ ura fejl˝ odik. Toluidink´ek fest´es, 10X objekt´ıvvel.
K¨ozvetlen¨ ul a cs˝osz´ıv kialakul´asa el˝ott (HH 9) j´ol kivehet˝o a vel˝ocs˝o mellett o¨ssze´all´o dorz´alis aorta p´ar. Ett˝ol later´alisan egy avaszkul´aris ter¨ ulet j¨on l´etre, ahol a m´eg megl´ev˝o QH1+ ´erszegmenseket gyakran a TAL1 transzkripci´os faktor hi´anya jellemzi. Az irodalom szerint a line´aris sejtl´ancok h´al´ozatt´a szervez˝od´ese egyr´eszt a fej-farok tengely ment´en halad posterior ir´anyba, m´asr´eszt later´alisan az extraembrion´alis sz¨ovett˝ol az intraembrion´alis sz¨ovet ir´anyba (Drake et al., 1997). Ennek megfelel˝oen a h´al´ozat anterior r´esz´en a TAL1 mint´azat korrel´al a QH1 jel¨ol´essel, m´ıg a posterior r´egi´oban, ahol az ´erh´al´ozatk´epz˝od´es k´es˝obb t¨ort´enik meg, jellemz˝oen TAL1+/QH1- sejteket azonos´ıthatunk. Meglep˝o m´odon azonban TAL1-/QH1+ sejtcsoportokat is azonos´ıtottunk HH 7-8 embri´okban – a TAL1 transzkripci´os faktor teh´at bizonyos endot´el sejtmagokban nem, vagy csak nagyon r¨ovid ideig (legfeljebb 1 ´or´aig) tal´alhat´o meg. Ezek a sejtek jellemz˝oen a dorz´alis aort´akt´ol later´alisan tal´alhat´oak, egy olyan ter¨ uleten, ahonnan az els˝odleges ´erh´al´ozat visszah´ uz´odik. Ebben a r´egi´oban a fibronektin felhalmoz´od´asa a TAL1+ szegmensek k¨or¨ ul m´eg a QH1 epit´op megjelen´ese el˝ott megt¨ort´enik.
4.2.
Sejth´ al´ ozatok in vitro teny´ eszetekben
A vaszkulogenezis sor´an kialakul´o sejth´al´ozat egyes magyar´azatai felt´etelezik, hogy az endot´el sejtek migr´aci´ojuk sor´an bizonyos j´ol defini´alt, a k¨or¨ ulvev˝o ECM-ben ”el˝orejelzett” u ´tvonalat k¨ovetnek (Poole and Coffin, 1989; Vernon et al., 1995; Ambler et al., 2001). A korai embrion´alis ´erh´al´ozatot jellemz˝o mint´azat´ahoz nagy m´ert´ekben hasonl´o, line´aris szegmensekb˝ol a´ll´o strukt´ ur´ak l´etrehoz´as´ara azonban term´eszetes sz¨oveti k¨ornyezet¨ ukb˝ol kiragadott endot´el sejtek is k´epesek. Egy, a k¨old¨okzsin´or (HUVEC) endot´el sejtekre kidolgozott teny´eszt´esi m´odszert (Davis et al., 2000) m´odos´ıtva megmutattuk, hogy a nemr´eg l´etrehozott kapill´aris BCE vonal (Veitonmaki et al., 2003) sejtjei is ¨osszekapcsol´od´o, line´aris sejtl´ancokat ´es kapill´aris-szer˝ u strukt´ ur´akat alak´ıtanak
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
20
4.3. ´abra. Kollag´en-I g´elbe helyezett sejtek morfol´ogi´aja k¨ul¨onb¨oz˝o teny´eszt´esi id˝okn´el. Reprezentat´ıv p´eldak´ent egy 3 (A), 6 (B) ´es 9 (C) napos BCE teny´eszetet, valamint egy 1 (D) ´es 3 (E) napos HUVEC teny´eszetet mutatunk. A sz´etsz´ ortan elhelyezked˝o, k¨ ul¨on´all´o sejtek m´as sejtekkel kontaktusba ker¨ ulve t¨ obbsejt˝ u cs´ır´ at hoznak l´etre, mely a migr´aci´o ´es oszt´od´as ´altal egyre n˝o. K´es˝obb az ´ agak kapcsol´ od´ as´ aval h´al´ozatok alakulhatnak ki. Megfelel˝o sejts˝ ur˝ us´eg eset´en n´eh´ any nap (HUVEC) illetve egy h´et (BCE) eltelt´evel megjelennek a t¨obb sejtb˝ ol ´ all´ o line´ aris strukt´ ur´ ak. HUVEC sejtek eset´en er˝oteljes lumen k´epz˝od´es figyelhet˝ o meg: nagy vaku´ olumok j¨onnek l´etre, melyek k´es˝obb ¨osszeolvadnak. F´aziskontraszt felv´etelek, 10X objekt´ıvvel.
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
21
¨ nap 4.4. a´bra. N¨oveked´esi faktorok hat´asa BCE sejtek h´al´ozatk´epz´es´ere. Ot teny´eszt´est k¨ ovet˝ oen n¨ oveked´esi faktorok hi´any´aban sok elpusztult ´es k¨ ul¨on´all´o sejt tal´ alhat´ o (A). VEGF ´es bFGF jelenl´et´eben ennyi id˝o el´eg h´al´ozatok kialalk´ıt´ as´ ahoz (B). Ugyanakkor, ha a helyi sejts˝ ur˝ us´eg el´eg magas, n¨oveked´esi faktorok hozz´ aad´ asa n´elk¨ ul is kialakulhatnak ¨osszekapcsol´od´o sejtl´ancok (kinagy´ıtott r´eszletek).
ki homog´en, h´aromdimenzi´os kollag´en-I g´el k¨ornyezetben (4.2. a´bra). B´ar a mint´azat morfol´ogi´aja ´es kialakul´as´anak id˝osk´al´aja elt´er˝o a k´et sejtt´ıpus eset´eben (4.3), a kollag´en g´elbe kevert sejtek strukt´ ur´aja ECMel˝omint´azat n´elk¨ ul - megfelel˝o sejts˝ ur˝ us´eg ´es n¨oveked´esi faktor kever´ek jelenl´ete eset´en - a sok hasonl´o r´esztvev˝o kollekt´ıv ¨onszervez˝od´es´evel alakul ki. A BCE sejtek in vitro teny´eszetei j´o lehet˝os´eget biztos´ıtottak arra, hogy a k´et alapvet˝o fontoss´ag´ u endot´el n¨oveked´esi faktor, a VEGF ´es a bFGF szerep´et megvizsg´aljuk (4.4. a´bra). A n¨oveked´esi faktorokt´ol mentes BCE teny´eszet sok halott ´es k¨ ul¨on´all´o, mag´anyos sejtet tartalmazott. A sejtek a´ltal´aban nem vettek fel megny´ ult form´at, kevesebb ny´ ulv´anyt bocs´atottak ki. Ugyanakkor a lok´alisan nagy s˝ ur˝ us´eg˝ u r´eszeken tov´abbra is ny´ ulv´anyok ´es sejtl´ancok alakultak ki. A VEGF-fel ´es bFGF-fel kezelt kult´ ur´aban az o¨t¨odik napra jelent˝osen megn˝ott a sejtek sz´ama. Hasonl´oan az erek fejl˝od´es´ehez, ezek a sejtek kiter¨ ultek ´es ny´ ulv´anyaik r´ev´en egym´assal kapcsolatot teremtve t¨obb sejtb˝ol a´ll´o strukt´ ur´akat form´altak. Morfol´ogiai vizsg´alataink alapj´an a n¨oveked´esi faktorok hat´asa els˝osorban a sejts˝ ur˝ us´eg gyors megn¨ovel´es´eben nyilv´anult meg. T¨obbsejt˝ u, line´aris szegmensekb˝ol a´ll´o h´al´ozatot r´aad´asul nem csak az endot´el sejtek hoznak l´etre in vitro. Amint a 4.5A ´es B ´abr´ak mutatj´ak, erre t¨obb m´as sejtvonal is k´epes: a C6 gli´oma vagy a 3T3 fibroblaszt vonalak sejtjei is h´al´ozatos szerkezetbe rendez˝odnek a szok´asos k´et dimenzi´os, merev teny´eszt´esi fel¨ uleten. B´ar a morfol´ogia kev´esb´e eml´ekeztet az els˝odleges ´erh´al´ozatra, statisztikai vizsg´alataink alapj´an a sejtek eloszl´asa nem v´eletlenszer˝ u, ´es szubkonfluens sejts˝ ur˝ us´egek eset´en a line´aris alakzatokat prefer´alj´ak (Szabo et al., 2008).
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
22
4.5. a´bra. Line´aris strukt´ur´ak 3T3 fibroblaszt (C) ´es C6 glioma (D) sejtek k´etdimenzi´ os teny´eszeteiben is megjelennek (Szabo et al., 2008). A C6 sejtek z¨olddel jelzett trajekt´ ori´ ai mutatj´ak, hogy az elny´ ult sejtekb˝ol fel´ep¨ ul˝o l´ancokban a sejtek motilit´ asa sokkal nagyobb, mint az izotr´op sejtcsoportokban. A hosszanti strukt´ ur´ ak egyben migr´ aci´ os c´elpontot jelentenek a sejtek sz´am´ara: a bev´agott grafikon mutatja, hogy az ´ ag vastagod´asa (r) ´es az ´ag anizotr´opi´aja (A) k¨oz¨ott pozit´ıv korrel´ aci´ o van.
4.3.
A t¨ obbsejt˝ u h´ al´ ozatok kialakul´ as´ anak dinamik´ aja
Mint azt kor´abbi hossz´ ut´av´ u automatiz´alt mikroszk´opos vizsg´alatok megmutatt´ak, az els˝odleges ´erh´al´ozat kialakul´asa jellemz˝oen t¨obbsejt˝ u ”cs´ır´az´assal” (sprouting) t¨ort´enik (Rupp et al., 2004). A folyamat sor´an egy aggreg´atumb´ol t¨obb sejt egyidej˝ uleg ki´aramlik ugyanazt az u ´tvonalat k¨ovetve, mik¨ozben egym´assal sejt-sejt kontaktust tartanak. Esetenk´ent megfigyelhet˝o a m´ar l´etrej¨ott strukt´ ur´ak sz´etes´ese is, de j´oval kisebb gyakoris´aggal. A 4.6. a´br´an megmutatjuk, hogy a h´aromdimenzi´os kollag´en-I g´elben kialakul´o endot´el h´al´ozatok is hasonl´o m´odon, cs´ır´az´assal j¨onnek l´etre. A cs´ır´az´as sor´an egy k¨ ul¨on´all´o, illetve kisebb aggreg´atumban jelenl´ev˝o sejt megny´ ult form´at vesz fel, ´es kibocs´at egy vagy t¨obb v´ekony ny´ ulv´anyt, mellyel kapcsolatot teremthet a k¨ornyez˝o aggreg´atumok sejtjeivel. Ez a ny´ ulv´any egyfajta migr´aci´os ¨osv´enyt biztos´ıt az aggreg´atum t¨obbi sejtje sz´am´ara, amely ment´en mozogva hamarosan t¨obbsejt˝ u a´gat hoznak l´etre. Felv´eteleink szerint a k´epz˝od˝o cs´ıra a kezdeti csoportosul´asb´ol kiv´andorl´o, illetve a szomsz´edos ter¨ uletekr˝ol csatlakoz´o sejtek, valamint oszt´od´asok a´ltal is n¨ovekszik. A mint´azatk´epz˝od´esi folyamat k¨ ul¨on¨osen j´ol k¨ovethet˝o a k´et dimenzi´os teny´eszt˝ofel¨ uleten line´aris szegmenseket k´epz˝o sejtvonalak eset´en, ahol az egyes sejtek alakja ´es mozg´asa k¨onnyen azonos´ıthat´o (4.5B a´bra). Sejttrajekt´ori´ak statisztikai elemz´es´evel megmutathat´o (Szabo et al., 2008), a sejtek morfol´ogi´aja jelent˝osen befoly´asolja a sejtek migr´aci´oj´at. Elny´ ujtott sejtek, valamint a bel˝ol¨ uk o¨ssze´all´o line´aris strukt´ ur´ak ment´en a sejtek mozg´ekonyabbak, mint a j´ol kiter¨ ult sejtek szomsz´eds´ag´aban. A cs´ır´ak egyben migr´aci´os c´elpontok is: a v´andorl´asb´ol ad´od´oan a cs´ır´ak ter¨ ulet´enek ´es
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
23
4.6. ´abra. T¨obbsejt˝u cs´ıra k´epz˝od´es´enek folyamata 3D kollag´en-I g´elben, BCE (A) ´es HUVEC (B) sejtek eset´en. Mindk´et esetben a sejtek el˝osz¨or egy v´ekony ny´ ulv´ anyt bocs´ atanak ki, aminek ment´en azt´an tov´abbi sejtek v´andorolnak ki az aggreg´ atumb´ ol. A ny´ ulv´any v´eg´et z¨old, a sejttesteket s´arga nyilak jel¨olik. A BCE sejtek eset´en az egyes sejttestek csak akkor megk¨ ul¨onb¨oztethet˝ok, amikor elhagyj´ ak a t¨obbsejt˝ u cs´ır´at. A k´epsorozatok el´erhet˝oek a http://pearl.elte.hu/meas/net/G29/TIFF/G29X01a+07.mpeg , illetve http://pearl.elte.hu/meas/net/G10/TIFF/G10X02a+04.mpeg c´ımeken.
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
24
sz´eless´eg´enek n¨oveked´ese l´enyegesen meghaladja a j´ol kiter¨ ult sejtek csoportj´anak n¨oveked´es´et. A sejtek be´araml´asa ´ıgy addig n¨oveli a cs´ıra hossz´at, m´ıg az o¨ssze nem kapcsol´odik m´as hasonl´o strukt´ ur´aval. Megfelel˝oen alacsony sejts˝ ur˝ us´eg eset´en a kialakul´o szegmensek sejtmentes ter¨ uleteket vesznek k¨or¨ ul.
4.4.
H´ al´ ozatot alkot´ o sejtek mikromechanikai tulajdons´ agai
A k´ıs´erleti megfigyel´eseink teh´at mind az in vivo mind az in vitro rendszerekben arra engednek k¨ovetkeztetni, hogy a line´aris l´ancokb´ol fel´ep¨ ul˝o h´al´ozatos mint´azat egy hasonl´o, t¨obbsejt˝ u cs´ır´az´asi mechanizmus eredm´enye. A cs´ır´akat k´epz˝o sejtek alakja szembet˝ un˝oen megny´ ult az in vivo ´es in vitro k´ıs´erletekben egy´arant. A j´ol analiz´alhat´o k´etdimenzi´os teny´eszetekben a sejtek nagyobb val´osz´ın˝ us´eggel migr´alnak elny´ ujtott szomsz´edaik, mint j´ol kiter¨ ult, szimmetrikus t´arsaik ir´any´aba. Ez az anizotr´opia kutat´ocsoportunk hipot´ezise szerint egy meghat´aroz´o, alapvet˝o tulajdons´ag a line´aris szegmensekb˝ol fel´ep¨ ul˝o mint´azatok k´epz˝od´es´eben: a hosszan elny´ ujtott sejtek ind´ıtj´ak be ´es ir´any´ıtj´ak a folyamatot (Szabo et al., 2007). A sejtalak ´erz´ekel´es´et esetleg az elny´ ult alak´ u sejtek sejtv´az´anak megv´altozott mikromechanikai tulajdons´agai teszik lehet˝ov´e. Sz´amos megfigyel´es utal arra, hogy a sejtek ´erz´ekelik a k¨ornyezet (extracellul´aris m´atrix) mechanikai param´etereit, ´es az befoly´asolja mozg´asukat (Lo et al., 2000; Gray et al., 2003; Jiang et al., 2006). Felt´etelezhet˝o, hogy hasonl´o mechanizmus m˝ uk¨odhet sejt-sejt kapcsolatok eset´en is. A fenti k´ep alapj´an k¨ ul¨onbs´egeket v´arunk a hossz´ uk´as, line´aris szegmensekben elhelyezked˝o sejtek valamint a j´ol kiter¨ ult, izotr´op sejttestek sejtv´az´anak kem´enys´eg´eben. Mivel a k¨ornyezet mikromechanikai a´llapot´anak meghat´aroz´asa elk´epzelhetetlen valamilyen er˝o kifejt´ese n´elk¨ ul, v´arhat´o, hogy a sejten bel¨ uli kontrakci´os er˝ok´ert felel˝os molekul´aris motor, a miozin-II is szerepet j´atszik a folyamatban. Ezeket a vizsg´alatokat C6 ´es 3T3 sejtek k´etdimenzi´os teny´eszetein v´egezt¨ uk. A sejtv´az ´allapot´at fix´alt sejtekben az aktinsz´alak fluoreszcens megjel¨ol´es´evel, illetve ´el˝o ´es fix´alt teny´eszetek AFM vizsg´alat´aval hat´aroztuk meg. Phalloidin-jel¨olt teny´eszetek j´ol mutatj´ak, hogy a sejtv´azrendszer rendk´ıv¨ ul inhomog´en: az aktinfilamentumok eloszl´as´anak v´altozatoss´aga val´osz´ın˝ us´ıti a helyr˝ol helyre v´altoz´o mikromechanikai tulajdons´agokat. A mikromechanikai tulajdons´agok meghat´aroz´as´ara AFM-el felvett benyom´od´as-er˝o g¨orb´eket ´ert´ekelt¨ unk ki. A 4.8. ´abr´an l´athat´o, hogy a p´aszt´az´o (scanning) m´odban felvett strukt´ ur´ak megfeleltethet˝oek a phalloidin-jel¨olt stressz-rostoknak. Ugyanakkor, az inhomog´en sejtv´azon k¨ ul¨onb¨oz˝o jelleg˝ u benyom´od´as (d) - er˝o (F ) g¨orb´ek ad´odnak: a legt¨obb helyen F ∼ d2 , (4.1)
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
25
4.7. a´bra. C6 gli´oma (A, B) ´es 3T3 fibroblaszt (C, D) sejtek fibronektin aljzaton n¨ ovesztett, fix´ alt teny´eszeteinek phalloidin fest´essel vizualiz´alt aktinv´aza. A felv´etelek 30X objekt´ıvnagy´ıt´as´ u epifluoreszcens (A, C), illetve 66X objekt´ıvnagy´ıt´ as´ u konfok´ alis mikroszk´oppal (B, D) k´esz¨ ultek. Az aktinsz´alak szervez˝od´ese rendk´ıv¨ ul v´ altozatos, felfedezhet¨ unk vastag filamentumokb´ol ´all´o k¨otegeket, illetve h´ al´ ozatos elrendez˝od´est is. A p´arhuzamos elrendez˝od´es˝ u stresszrostok k¨ ul¨ on¨ osen a j´ ol kiter¨ ult, izotr´op sejtekre jellemz˝ok.
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
26
4.8. ´abra. Egy C6 gli´oma sejt mikromechanikai ´allapot´anak felt´erk´epez´ese atomer˝ o mikroszk´ opi´ aval. A: P´aszt´azott hibajel (deflection image). A sz´ınekkel jel¨olt helyekhez indent´ aci´ os (benyom´od´as-er˝o) g¨orb´ek tartoznak. A jel¨ol´es alakja az indent´ aci´ os g¨ orbe t´ıpus´ ara utal. A k¨or¨ok a Sneddon-modell szerint viselked˝o, parabolikus indent´ aci´ os g¨ orb´eket jeleznek. A k´ek, s´arga, piros sz´ınek ebben a sorrendben egyre n¨ ovekv˝ o kem´enys´egre utalnak, a vonatkoz´o rugalmass´agi modulusok tartom´ anyai: 75-130 kPa, 210-330 kPa, illetve 550-1025 kPa. A z¨old n´egysz¨ ogek – ´ altal´ aban j´ ol kivehet˝o stressz-rostok k¨ornyezet´eben – egy megfesz´ıtett h´ ur mer˝ oleges benyom´asakor v´art, line´arisan indul´o g¨orb´eket jel¨olnek. A lila h´ aromsz¨ ogek hely´en felvett g¨orb´ek pedig teljesen szab´alytalan alak´ uak. B: Ugyanezen sejt phalloidin-jel¨olt aktinv´az´anak epifluoreszcens mikroszk´opi´aval felvett k´epe. Az A panelen l´ athat´o r´esz a B panel bal fels˝o sark´aban tal´alhat´o. A ny´ıl a sejt fix´ al´ as el˝ otti halad´ asi ir´any´at mutatja. C: A sejt AFM p´aszt´azott topografikus k´epe. D-F: Indent´ aci´os g¨orb´ek F 0(d) deriv´altjai. A h´arom, k¨ ul¨onb¨oz˝o pontban felvett g¨ orbesereg egy-egy t´ıpust reprezent´al. D: Sneddon t´ıpus´ u viselked´es, az indent´ aci´ os g¨ orbe deriv´altja line´aris. E: A line´aris indent´aci´os g¨orbe deriv´ altj´ an egy plat´ o jelenik meg. F: Az indent´aci´os g¨orb´ek bizonyos pontokban nem ´ertelmezhet˝ oek egyszer˝ u modellekkel.
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
27
4.9. a´bra. Izotr´op (A) ´es hosszan elny´ult (B) C6 gli´oma sejttestek atomer˝o mikroszk´ opi´ as vizsg´ alata ´el˝ o kult´ ur´aban. A sejtek mikromechanikai ´allapot´at jellemz˝ o rugalmass´ agi modulus a felvett benyom´od´as-er˝o g¨orb´ek deriv´altjaib´ol (C, D) sz´ armaztathat´ o. J´ ol l´ atszik, hogy a line´aris szegmens elny´ ult alak´ u sejtj´enek eset´eben a deriv´ alt g¨ orb´ek meredeks´ege (D) j´oval kisebb mint egy sejtcsoportban tal´alhat´ o kiter¨ ult t´ arsa eset´en (C), ami puh´abb sejtv´azra utal.
ami egy rugalmas izotr´op k¨ozeg k´ uppal vagy piramissal t¨ort´en˝o benyom´od´as´aval (Sneddon modell) konzisztens. Ezeket a g¨orb´eket a Sneddon modell seg´ıts´eg´evel ki´ert´ekelve, a sejt belsej´eben ´altal´aban magasabb Young modulus ´ert´ekek ad´odnak mint a vezet˝o´eln´el. Stresszrostok k¨ornyezet´eben azonban a g¨orb´ek line´arisan indulnak F ∼ d,
(4.2)
ami megfeleltethet˝o egy fesz´ıtett h´ ur oldalir´any´ u benyom´asakor m´erhet˝o er˝onek. Bizonyos helyeken a F (d) g¨orb´ek enn´el o¨sszetettebben viselkednek. ´ o sejtek eset´en elv´egzett AFM m´er´esek F (d) g¨orb´eit a Sneddon modell El˝ szerint kielemezve megmutathat´o, hogy l´enyeges k¨ ul¨onbs´eg van a line´aris, t¨obbsejt˝ u cs´ır´akban elhelyezked˝o elny´ ult sejtek ´es a j´ol kiter¨ ult sejtek Young modulusaiban. Az indent´aci´os g¨orb´ek m´asodik deriv´altjaira hosszan elny´ ult 2 2 sejtek eset´en 0.35 nN/µm , m´ıg kiter¨ ult alak eset´eben 1.8 nN/µm k¨or¨ uli ´ert´eket kaptunk, melyek 50 kPa, illetve 10 kPa rugalmass´agi modulusnak felelnek meg. Ezek a m´er´esek teh´at igazolni l´atszanak azt a felt´etelez´est, mely szerint az elt´er˝o morfol´ogi´aj´ u sejtek elt´er˝o mikromechanikai tulajdons´agokkal is rendelkeznek. A blebbisztatin egy nemr´egiben felfedezett kis molekul´aris inhibitor, mely
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
28
4.10. a´bra. C6 gli´oma sejtek blebbisztatin inhibitorral kezelt teny´eszetei. A kontrollk´ent szolg´ al´ o, DMSO old´oszer hozz´aad´as´aval k´esz¨ ult minta mellett (A) egyre n¨ ovekv˝ o koncentr´aci´oban 1 (B), 3 (C) ´es 10 (D) µM volt jelen az inhibitor. A miozin-II egyre teljesebb g´atl´asa k¨ovetkezt´eben megv´ altozik a sejtek morfol´ ogi´aja: a sejtek alakja a blebbisztatin hat´as´ara egyre megny´ ultabb. Az utols´o felv´etelen szembet˝ un˝o a line´aris sejtl´ancok hi´anya is. A bemutatott felv´etelekhez tartoz´o k´epsorozat el´erhet˝o a http://pearl.elte.hu/meas/force-nucl/N4/TIFF/N4a.mpeg c´ımen.
nagy affinit´ast ´es szelektivit´ast mutat a miozin-II feh´erje fel´e (Kov´acs et al., 2004). Felt´etelezhet˝oen m´as feh´erj´ek m˝ uk¨od´es´et nem befoly´asolva, a blebbisztatin specifikusan megg´atolja a miozin-II ATP hidrol´ızis´et. Ez´altal az aktin-miozin rendszer k´eptelenn´e v´alik h´ uz´oer˝o kifejt´es´ere, ´es a sejt val´osz´ın˝ uleg elvesz´ıti k´epess´eg´et mikrok¨ornyezet´enek merevs´eg´enek ´erz´ekel´es´ere. Blebbisztatinnal kezelt C6 gli´oma (4.10. a´bra) ´es 3T3 fibroblaszt sejtek teny´eszeteit vizsg´alva meg´allap´ıthat´o, hogy a miozin-II egyre nagyobb m´ert´ek˝ u g´atl´as´aval a sejtek ´eletk´epesek ´es mozg´ekonyak maradnak, de egyre kisebb a sejtl´ancokat tartalmaz´o ter¨ uletek ar´anya.
4.5.
A fibronektin dinamik´ aja ´ es szerepe
Ahogy azt a 4.1. a´br´an l´athattuk, a differenci´al´od´o angioblasztokat fibronektinben gazdag k¨ornyezet veszi k¨or¨ ul. Kezdetben a fibronektin strukt´ ur´atlan eloszl´asban figyelhet˝o meg a fejl˝od˝o embri´oban. Az endot´el sejtekb˝ol szervez˝od˝o els˝o line´aris szegmensek egy r´esz´et azonban m´ar fibronektin sz´alak burkolj´ak. A fibronektint ´es az endot´el sejteket mikroinjekt´alt QH1-Alexa647 valamint B3D6-Alexa488 ellenanyagokkal vizualiz´alva az ´el˝o embri´ok optikai mikroszk´opos megfigyel´es´evel nyomon k¨ovethet˝o az a folyamat, ami a kezdeti struktur´alatlan fibronektin ´es endot´el eloszl´asb´ol l´etrehozza az els˝odleges ´erh´al´ozatot a fibronektinben gazdag alaph´arty´aval. Amint az 4.11A a´bra mutatja, a differenci´al´od´o angioblasztokat kezdetben fibronektinben gazdag k¨ornyezet veszi k¨or¨ ul. A fibronektin rendezetlen eloszl´as´ u
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
29
4.11. ´abra. Pulzus-jel¨olt fibronektin ´es endot´el sejtek ´atrendez˝od´ese az embrion´alis ´erh´ al´ ozat fejl˝ od´ese sor´ an. (A): Strukt´ ur´alatlan fibronektin (z¨old) k¨ornyezetben sz´etsz´ ort sejtcsoportokb´ol (piros) k´et ´ora alatt a sejtek kiv´andorolnak, ´es line´ aris alakzatokba rendez˝odnek. Az a-d bet˝ uk az egyes csoportokb´ol kiv´andorolt sejteket jelzik. Ezalatt az id˝o alatt a fibronektin gombolyagok rostokk´ a szervez˝ odnek, ´es az ´erszegmensek k¨or´e h´ uz´odnak. (B): A fibronektin mozg´ as´ at az A ´ abr´ an s´ arga nyillal jel¨olt, az egyik szegmensre mer˝oleges egyenes ment´en felvett fluoreszcencia intenzit´asprofilok id˝obeli alakul´asa mutatja. Szaggatott egyenesik jel¨ olik a fibronektin r´ah´ uz´od´as´at az ´abra k¨ozep´en elhelyezked˝o ´erszegmensre. (C): A line´aris strukt´ ur´ak kialakul´as´an´al az endot´el sejtek (ny´ılhegy) elmozdul´ asa nem a fibronektin sz´alak ment´en t¨ot´enik. (D): A mikroinjekt´ alt B3D6-Alexa488 (z¨ old) ´es a n´egy ´or´aval k´es˝obb fix´alt embri´on v´egzett m´asodik B3D6-Alexa455 fibronektin jel¨ol´es (piros) teljes egyez´est mutat – az els˝odleges ´erh´ al´ ozat l´ ancai k¨ or¨ ul (k´ek) nem j¨onnek l´etre u ´j fibronektin rostok.
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
30
gombolyagok form´aj´aban figyelhet˝o meg. K´et ´ora eltelte alatt a pulzusjel¨olt endot´el sejtcsoportok sz´etv´andorolnak, a fibronektin gombolyagok pedig kisebb aggreg´atumok ¨ossze´all´as´aval fokozatosan egyre struktur´altabb, line´aris rostokk´a form´al´odnak. Amint azt egy ´erszegmensre mer˝oleges egyenes ment´en felvett fluoreszcencia intenzit´asprofil id˝obeli v´altoz´asa (4.11B a´bra) mutatja, a fibronektin rostok az erek mell´e h´ uz´odnak, a ”poligon´alis” els˝odleges ´erh´al´ozat avaszkul´aris ter¨ uleteir˝ol pedig elt˝ unnek. A sz´alas szerkezet˝ u fibronektin sem vezeti az endot´el sejtek mozg´as´at (4.11C a´bra), a sejtek elmozdul´asa ´es a sz´alak ir´anya korrel´alatlan. Az els˝o pulzusjel¨ol´est n´egy o´ra eltelt´evel a fix´alt mint´an egy m´asodik, B3D6-Alexa555 fibronektin immunjel¨ol´est elv´egezve meg´allap´ıthat´o, hogy a k´et jel¨ol´es teljesen kolokaliz´alt (4.11D a´bra). Ez figyelemrem´elt´o, hiszen (i) bizony´ıtja, hogy a mikroinjekt´alt immunjel¨ol´es ´es a hagyom´anyos fix´alt prepar´atumon t¨ort´en˝o immunjel¨ol´es ugyanazokat az epit´opokat ismeri fel, valamint (ii) arra utal, hogy a vizsg´alt id˝oszakban nem keletkeztek olyan fibronektin sz´alak, amelyek p´otoln´ak az avaszkul´aris ter¨ uletekr˝ol begy˝ ujt¨ott fibronektint. Ezen vizsg´alatok alapj´an az els˝odleges ´erh´al´ozatot beburkol´o, fibronektinben gazdag ECM teh´at jelent˝os r´eszben a mezoderm´at k¨or¨ ulvev˝o, a gasztrul´aci´o sor´an kialakul´o m´atrixfeh´erj´ek a´trendez´es´eb˝ol sz´armazik. A fibronektin szerep´et sejtteny´eszetekkel v´egzett k´ıs´erletekben vizsg´altuk. Ahogy az a 4.12. ´abr´an l´athat´o, HUVEC sejtek monolayer teny´eszetben is ¨ossze´all´ıtanak egy fibronektin strukt´ ur´at. H´aromdimenzi´os kollag´enI g´elbe ´agyazott HUVEC teny´eszeteket a fibronektin dimerek polimeriz´aci´oj´at akad´alyoz´o 70 kDa fibronektin fragmenssel kezelt¨ unk. A fragmenst vagy ki¨ ultet´eskor, vagy 48 o´ra eltelt´evel adtuk a teny´eszetekhez. A fix´alt mint´azatokat a teny´eszt´es 5. napj´an ki´ert´ekelve jelent˝os hat´as l´athat´o ha a fragmens a ki¨ ultet´est˝ol kezdve jelen volt a kultur´akban (4.13A ´es B a´br´ak). A fibronektin o¨ssze´all´ıt´as´aban g´atolt sejtek sokszor megtartott´ak a ki¨ ultet´esre jellemz˝o g¨omb¨oly˝ u alakjukat, ´es csak n´eh´any esetben figyelt¨ unk meg lumen/vaku´olum k´epz˝od´est vagy line´aris szegmensek kialakul´as´at. Ezzel szemben nem tapasztaltunk hat´ast sem a sejtek alakj´aban, sz´am´aban, sem pedig a k´epz˝od˝o strukt´ ur´ak jelleg´eben ha a kezel´es 48 ´ora ut´an t¨ort´ent (4.13C ´es D a´br´ak), amikorra az elny´ ult strukt´ ur´ak jelent˝os r´esze m´ar kialakult. A fibronektin polimeriz´aci´oj´anak teh´at az in vitro modell rendszerben is fontos szerepe van az endot´el h´al´ozatok kialakul´as´an´al. A rendszer ´ıgy alkalmas lesz annak vizsg´alat´ara, hogy a fibronektin g´atolt polimeriz´aci´oja milyen hat´assal van az egyedi endot´el sejtek mozg´as´ara.
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
31
4.12. a´bra. HUVEC sejtek ´altal sejtteny´eszetben termelt fibronektin. F´aziskontraszt (sejttestek) ´es epifluoreszcens (anti-Fibronektin ellenanyag) felv´etelek szuperpoz´ıci´ oja.
´ FEJEZET 4. EREDMENYEK
32
4.13. a´bra. Fibronektin polimeriz´aci´o g´atl´as´anak hat´asa HUVEC sejtek in vitro h´al´ozatk´epz´es´ere. A 70 kDa fragmens hat´as´ara, ha az ki¨ ultet´est˝ol jelen van (B), a sejtek jellemz˝ oen nem tapadnak ki (k¨or¨ok), ´es ritk´an figyelhet˝o meg line´aris strukt´ ur´ ak kialakul´ asa. A fragmens hozz´aad´asa a m´asodik napon (D) nem okoz ´eszrevehet˝ o v´ altoz´ ast. Toluidin-k´ek fest´es az 5-ik napon.
5. fejezet Diszkusszi´ o: a h´ al´ ozatk´ epz´ es modellez´ ese A k´ıs´erleti megfigyel´eseink alapj´an a h´al´ozatot l´etrehoz´o sejtek jobban prefer´alj´ak a megny´ ult sejtek szomsz´eds´ag´at mint az ugyanolyan t´ıpus´ u, de szimmetrikus sejtek´et. Ennek a preferenci´anak a molekul´aris mechanizmus´at m´eg nem ismerj¨ uk. Sz´amos k´ıs´erlet utal azonban arra, hogy a k¨ornyezet merevs´ege sok sejtt´ıpus mozg´as´at befoly´asolja. Ez´ert felt´etelezz¨ uk, hogy az elny´ ujtott sejtek megv´altozott mikromechanikai ´allapot´at ´erz´ekelik a t¨obbsejt˝ u cs´ırak´epz´esben r´esztvev˝o sejtek. A konkr´et mechizmust´ol f¨ uggetlen¨ ul sz´am´ıt´og´epes modellszimul´aci´ok seg´ıts´eg´evel megvizsg´alhat´o, hogy milyen ¨onszervez˝o mint´azatokat hozhat l´etre egy olyan sejt-sejt k¨olcs¨onhat´as, ami el˝oseg´ıti a sejtek mozg´as´at elny´ ujtott szomsz´edaik ir´any´aba. Sejtcsoportok viselked´es´enek elm´eleti modellez´ese eset´en sajnos ´altal´aban nem ´ep´ıtkezhet¨ unk a molekul´aris alapokt´ol, vagyis olyan alkot´oelemekb˝ol, amelyek viselked´ese fizikai ismereteink alapj´an egy´ertelm˝ uen meghat´arozhat´o. A fizik´an k´ıv¨ uli komplex rendszerek (pl. k¨ozleked´es, szinkroniz´aci´o) modellez´es´en´el elterjedt m´odon ez´ert a sejteket olyan objektumokkal reprezent´aljuk, amelyek bizonyos r´eszletekben j´ol k¨ozel´ıtik az empirikusan megfigyelhet˝o viselked´est. Ezek a modellek ´ıgy sz¨ uks´egszer˝ uen sz´amos felt´etelez´est tartalmaznak, r´aad´asul ezek egy jelent˝os r´esze a modell ”szerkezet´eb˝ol” ad´odik. P´eld´aul, ha a modell k¨olcs¨onhat´o pontr´eszecsk´ekb˝ol a´ll, akkor gyakori felt´etelez´es a p´ark¨olcs¨onhat´asokra bont´as, ´es ezek addit´ıv kezel´ese. Az is k¨ozismert, hogy egyes modellek p´arhuzamos vagy soros v´eletlenszer˝ u friss´ıt´ese is k¨ ul¨onbs´egekhez vezet. Hogy a modellez´es sokszor rejtett felt´etelez´eseinek jelent˝os´eg´et cs¨okkenthess¨ uk, c´elszer˝ u a vizsg´aland´o k¨olcs¨onhat´ast jelent˝osen k¨ ul¨onb¨oz˝o szerkezet˝ u modellekben tanulm´anyozni. Az al´abbiakban a kutat´ocsoportunk a´ltal r´eszletesebben tanulm´anyozott k´etf´ele modellt v´azoljuk fel. Az els˝oben a sejteket k¨olcs¨onhat´o pontr´eszecsk´ekkel modellezz¨ uk, a m´asodikban pedig egy Potts spinmodell dom´enjeivel. Mindk´et modellben figyelembe vessz¨ uk, hogy a sejtek nem hatolhatnak a´t egym´ason, szeretnek ¨osszetapadni, mozg´asuk v´eletlenszer˝ u, de hipot´ezis¨ unk ´ertelm´eben nagyobb gyakoris´aggal mozognak elny´ ujtott szomsz´edaik ir´any´aba. 33
´ A HAL ´ OZATK ´ ´ ES ´ MODELLEZESE34 ´ FEJEZET 5. DISZKUSSZIO: EPZ
5.1. a´bra. K¨olcs¨onhat´o r´eszecsk´ek h´al´ozatk´epz´ese k¨ul¨onb¨oz˝o r´eszecskes˝ur˝us´eg eset´en. A k´epz˝ od˝ o mint´ azat er˝ osen f¨ ugg a r´eszecsk´ek s˝ ur˝ us´eg´et˝ol: a perkol´aci´os s˝ ur˝ us´egk¨ usz¨ ob alatt a l´etrej¨ ott line´aris strukt´ ur´ak nem kapcsol´odnak ¨ossze, m´ıg nagy r´eszecskes˝ ur˝ us´eg eset´en v´ekony ny´ ulv´anyokkal ¨osszek¨ot¨ott struktur´alatlan aggreg´ atumok j¨ onnek l´etre. (Szabo et al. (2007) alapj´an.)
5.1.
A r´ eszecskemodell
A r´eszecskemodell el˝onye a nagyfok´ u egyszer˝ us´eg: itt a sejteket csak geometriai k¨oz´eppontjuk poz´ıci´oja, illetve aktu´alis elmozdul´asuk (sebess´eg¨ uk) jellemzi (Szabo et al., 2007). Az id˝o diszkretiz´alt, ´es a sejtek egy id˝ol´ep´es sor´an megtett elmozdul´asair´ol feltessz¨ uk, hogy azokat egy determinisztikus ”drift” ´es egy korrel´alatlan zaj ¨osszege ´all´ıtja el˝o: dxi (t + 1) = αdxi (t) + Mi (t) + ξi (t)
(5.1)
ahol t jel¨oli az id˝ol´ep´eseket, dxi az i-ik sejt elmozdul´asvektora egy id˝ol´ep´es alatt, valamint Mi tartalmazza a sejt-sejt kapcsolatok sejtmozg´asra gyakorolt hat´as´at. A ξi (t) sorozat azonos eloszl´as´ u, nulla v´arhat´o ´ert´ek˝ u, f¨ uggetlen val´osz´ın˝ us´egi v´altoz´okb´ol ´all. A k¨olcs¨onhat´asi tag hi´any´aban a modell r´eszecsk´ei perzisztens bolyong´o mozg´ast v´egeznek, ami j´ol k¨ozel´ıti az empirikus tapasztalatot. A szomsz´edos sejteknek egym´as mozg´as´at m´odos´ıt´o hat´asait t´avols´agf¨ ugg˝o p´ark¨olcs¨onhat´asok szuperpoz´ıci´oj´aval k¨ozel´ıtj¨ uk. A p´ark¨olcs¨onhat´asok egy r¨ovid hat´ot´avols´ag´ u tasz´ıt´o, ´es egy valamennyivel hosszabb hat´ot´avols´ag´ u vonz´o tagb´ol ´ep¨ ulnek f¨ol. A tasz´ıt´as biztos´ıtja, hogy k´et k¨ozeli sejt elt´avolodjon egym´ast´ol ´es ´ıgy nem tudj´ak egym´ast tetsz˝oleges m´ert´ekben megk¨ozel´ıteni. A p´ark¨olcs¨onhat´asok vonz´o komponense fejezi ki azt, hogy a sejtek gyakran a szomsz´edaik ir´any´aba mozdulnak el. Mivel ebben a modellben a sejtek alakja nem jelenik meg, a hipot´ezis¨ unket k¨ozel´ıt˝oleg u ´gy fogalmazzuk a´t, hogy a sejtek prefer´alj´ak az anizotr´op (elny´ ujtott) k¨ornyezeteket – azaz olyan ter¨ uleteket, ahol a szomsz´edos sejtek line´aris alakzatot alkotnak. A hat´as er˝oss´ege ez´ert a modellben f¨ ugg a szomsz´edos sejt k¨ornyezet´et˝ol, an´ nak anizotr´opi´aj´aval ar´anyos. Igy a p´ark¨olcs¨onhat´as aszimmetrikus, azaz a k´et szomsz´edos sejt egym´as mozg´as´ara gyakorolt befoly´asa k¨ ul¨onb¨oz˝o m´ert´ek˝ u lehet. Ez az´ert lehets´eges, mert a form´alis anal´ogia ellen´ere Mi nem mechanikai er˝oket reprezent´al, hanem v´eletlenszer˝ u akt´ıv mozg´ast v´egz˝o r´eszecsk´ek (sejtek) mozg´asir´any preferenci´ait.
´ A HAL ´ OZATK ´ ´ ES ´ MODELLEZESE35 ´ FEJEZET 5. DISZKUSSZIO: EPZ
5.2. ´abra. Mint´azatk´epz˝od´es a sejteket egy ´altal´anos´ıtott Potts-modell dom´enjeivel reprezent´ al´ o modellben. A modell nemegyens´ ulyi dinamik´aja f¨ ugg a szomsz´edos sejtek alakj´ at´ ol. Ha az elny´ ult sejtek preferenci´aja kicsi (γ < 1), a rendszer egyedi sejtekre esik sz´et. Er˝os preferencia (γ > 1) eset´en t¨obb sejtb˝ol ´all´o ´ agak k´epz˝ od´es´et figyelhetj¨ uk meg. A modell v´eletlen kezd˝o´allapotb´ol ind´ıtva egy t´ag param´etertartom´anyban spont´an h´al´ozatokba rendez˝odik (5.1. a´bra). Ebben az a´llapotban a mint´azat kv´azistacion´arius: b´ar egyes ´agak keletkeznek ´es felszakadnak, a mint´azat karakterisztikus m´erete ´alland´o marad. Az is figyelemre m´elt´o, hogy a mint´azat nem a lyukak m´eret´enek fokozatos n¨oveked´es´evel, hanem az empirikus tapasztalatoknak megfelel˝oen ”sarjadz´assal”, azaz u ´j a´gak megjelen´es´evel t¨ort´enik.
5.2.
A Potts modell
Sejtek k¨olcs¨onhat´asainak modellez´es´ere gyakran alkalmazott m´asik m´odszer a sejteket egy Potts modell dom´enjeivel a´br´azolni (Izaguirre et al., 2004). A modell ´ıgy egy r´acson defini´alt, ´es k´epes k¨ ul¨onf´ele sejtalakokat felbontani. Minden r´acspontban egy diszkr´et ´ert´ek, a Pottsspin tal´alhat´o. Ezek ´ert´eke megadja, hogy az adott r´acspont melyik sejthez tartozik. A hagyom´anyos Potts modellt˝ol elt´er˝oen itt megk¨ovetelj¨ uk, hogy az egyes spin´allapotok a r´acs egyszeresen o¨sszef¨ ugg˝o tartom´any´at alkoss´ak. A modellt motiv´al´o k´ıs´erletekben a mesters´eges sejtaggreg´atumok folyad´ekcseppekhez hasonl´o viselked´est mutattak, ´es makroszk´opikus dinamik´ajukat egy fel¨ uleti fesz¨ ults´eghez hasonl´o param´eterrel lehetett jellemezni (Forgacs et al., 1998). A folyad´ekokhoz val´o hasonl´os´agot tov´abb er˝os´ıti, hogy a sejtaggreg´atumok effekt´ıv fel¨ uleti fesz¨ ults´eg´enek a nagys´aga ar´anyos a sejtek felsz´ın´en tal´alhat´o sejtadh´ezi´os receptorok sz´am´aval (Foty and Steinberg, 2005; Heged¨ us et al., 2006). A modell Hamilton-f¨ uggv´eny´eben (H) energi´akat rendel¨ unk a spinkonfigur´aci´okban megjelen˝o sejt- (dom´en-) hat´arokhoz att´ol f¨ ugg˝oen, hogy a vizsg´alt hat´arszegmens szomsz´edos-e m´as sejttel, ´es ha igen, akkor milyen t´ıpus´ uval. Ha egy dom´en ter¨ ulete elt´er az el˝ore be´all´ıtott ´ert´ekt˝ol, az szint´en megn¨oveli a konfigur´aci´ohoz tartoz´o energi´at. A modell szok´asos dinamik´aj´at egy Metropolis Monte-Carlo szimul´aci´o adja v´eletlen soros friss´ıt´essel. Azaz, egy kiv´alasztott r´acspont a´llapot´at megk´ıs´erelj¨ uk a´tm´asolni egy szomsz´edos r´acspontra. Ha az o¨sszef¨ ugg˝os´egi k´enyszerek ezt lehet˝ov´e teszik, akkor a l´ep´es megt´etel´enek a p val´osz´ın˝ us´ege
´ A HAL ´ OZATK ´ ´ ES ´ MODELLEZESE36 ´ FEJEZET 5. DISZKUSSZIO: EPZ a Hamilton-f¨ uggv´eny megv´altoz´as´anak exponenci´alis f¨ uggv´enye: ln p = min(0, −δH)
(5.2)
A Potts modell fenti, szok´asos form´aja sz¨ uks´egszer˝ uen egy egyens´ ulyi helyzethez t¨ort´en˝o relax´aci´os folyamatot eredm´enyez. Hogy a hipot´ezis¨ unknek megfelel˝o nemegyens´ ulyi viselked´est a Potts modell keretein bel¨ ul is megvizsg´alhassuk, egy elemi l´ep´es val´osz´ın˝ us´eg´enek meghat´aroz´asakor figyelembe vessz¨ uk, hogy a megv´altozott sejt-sejt ´erintkez´esi fel¨ uletekn´el mennyire elny´ ult a szomsz´edos sejt alakja: ln p = min(0, −δH + w)
(5.3)
ahol a w tag ann´al nagyobb, min´el elny´ ultabb a l´ep´es sor´an esetlegesen ”meg´erintett” sejt. Megmutathat´o, hogy ezzel a v´altoztat´assal a modellben s´er¨ ul a r´eszletes egyens´ uly, ami egy alapvet˝oen nemegyens´ ulyi viselked´eshez vezet (Szabo et al., 2008). A szimul´aci´ok eredm´enyei alapj´an a rendszer itt is kv´azisztacion´arius a´llapothoz tart. Ha az elny´ ult alak´ u sejtek preferenci´aja nagy, akkor ebben a modellben is t¨obbsejt˝ u a´gak n¨ovekednek (5.2. ´abra). Az empirikus tapasztalatokkal egyez˝oen a modell sejtek felbontj´ak kapcsolataikat a kiter¨ ult szomsz´edos sejtekkel, ´es a n¨ovekv˝o ´agakba a´ramlanak. Mindk´et – a sejteket k¨olcs¨onhat´o pontrendszerrel, illetve Potts dom´enekkel reprezent´al´o – modell teh´at nagyon hasonl´o, ´es az empirikus tapasztalatok sz´amos r´eszlet´et j´ol visszaad´o kollekt´ıv viselked´est eredm´enyez, ha implement´aljuk benn¨ uk a sejtek prefer´alt adh´ezi´oj´at elny´ ult szomsz´edaikhoz. Term´eszetesen az ismertetett modelleknek vannak hi´anyoss´agai: nem reproduk´alj´ak el´egg´e pontosan a sejtmozg´asok empirikusan megfigyelhet˝o statisztikus tulajdons´agait (sebess´egeloszl´as, perzisztencia), illetve a szimul´aci´ok sor´an az a´gk´epz˝od´es (cs´ır´az´as) folyamat´at biol´ogiai visszacsatol´asok helyett csak fluktu´aci´ok hajtj´ak. Azt v´arjuk azonban, hogy a szimul´aci´os eredm´enyek ´es az empirikus adatok tov´abbi ¨osszevet´es´eb˝ol jobban meg´erthetj¨ uk a mint´azatk´epz˝od´esi folyamatot l´etrehoz´o akt´ıv sejtmozg´as k¨ornyezetf¨ ugg˝o szab´alyoz´o-mechanizmusait.
6. fejezet ¨ Osszefoglal´ as Dolgozatomban az ´erh´al´ozat kialakul´as´anak dinamik´aj´at, a sejt-sejt kapcsolatok szerep´et, illetve a sejt-extracellul´aris m´atrix kapcsolat hat´as´at vizsg´altuk. K´et ´es h´aromdimenzi´os in vitro modellekben tanulm´anyoztuk a sejtek line´aris strukt´ ur´akba t¨ort´en˝o o¨nszervez˝od´es´et. A nemr´eg l´etrehozott BCE endot´el sejtvonalra meghat´aroztuk azokat a k´ıs´erleti k¨or¨ ulm´enyeket, amikor kollag´en g´elbe keverve h´al´ozatokat alkotnak. Morfol´ogiai vizsg´alataink alapj´an ebben a rendszerben a VEGF ´es bFGF n¨oveked´esi faktorok hat´asa els˝osorban a sejts˝ ur˝ us´eg gyors megn¨ovel´es´eben nyilv´anult meg. Megmutattuk, hogy a sejtteny´eszetekben kialakul´o sejth´al´ozatok is cs´ır´az´assal j¨onnek l´etre. A cs´ır´az´as sor´an egy k¨ ul¨on´all´o, illetve kisebb aggreg´atumban jelenl´ev˝o sejt megny´ ult form´at vesz fel, ´es kibocs´at egy vagy t¨obb v´ekony ny´ ulv´anyt, mellyel kapcsolatot teremthet a k¨ornyez˝o aggreg´atumok sejtjeivel. Ez a ny´ ulv´any migr´aci´os o¨sv´enyt biztos´ıt az aggreg´atum t¨obbi sejtje sz´am´ara, amely ment´en mozogva hamarosan t¨obbsejt˝ u a´gat hoznak l´etre. Mivel a k´etdimenzi´os teny´eszt˝ofel¨ ulet lehet˝ov´e teszi az egyes sejtek ´es sejtalakok egyszer˝ u megk¨ ul¨onb¨oztet´es´et, az egyes sejtek trajekt´ori´ainak elemz´es´evel megmutattuk, hogy a szomsz´edos sejtek morfol´ogi´aja jelent˝osen befoly´asolja a sejtek migr´aci´oj´at. Elny´ ujtott sejtek, valamint a bel˝ol¨ uk o¨ssze´all´o line´aris strukt´ ur´ak ment´en a sejtek mozg´ekonyabbak, mint a j´ol kiter¨ ult sejtek szomsz´eds´ag´aban. Ezek a cs´ır´ak egyben migr´aci´os c´elpontok ´ is. El˝o sejtteny´eszetek AFM vizsg´alat´aval megmutattuk, hogy l´enyeges k¨ ul¨onbs´eg van a line´aris, t¨obbsejt˝ u cs´ır´akban elhelyezked˝o elny´ ult sejtek ´es a j´ol kiter¨ ult sejtek Young modulusaiban: a j´ol kiter¨ ult sejtek felsz´ıne o¨tsz¨or kem´enyebbnek bizonyult. A t¨obbsejt˝ u cs´ır´az´as sor´an a sejtek mozg´as´anak mikromechanikai vez´erl´es´et t´amasztja al´a az a megfigyel´es¨ unk is, mely szerint a folyamathoz miozin-II aktivit´as sz¨ uks´eges. Fix´alt embri´ok immunjel¨ol´es´evel, r´eszletes id˝ofelbont´assal felt´erk´epezt¨ uk a fibronektin eloszl´as´at a vaszkulogenezis k¨ ul¨onb¨oz˝o f´azisaiban. Megmutattuk, hogy a fibronektin sz´alak nem alkotnak olyan el˝omint´azatot amely meghat´arozn´a az endot´el sejtek k´es˝obbi mozg´as´at. Egy, a fibronektin polimeriz´aci´oj´at g´atl´o fibronektin fragmenst felhaszn´alva h´aromdimenzi´os in 37
¨ ´ FEJEZET 6. OSSZEFOGLAL AS
38
vitro modellrendszerekben megmutattuk, hogy a fibronektin ¨ossze´all´as´anak blokkol´asa a h´al´ozatk´epz´es kezdeti l´ep´es´ehez, val´osz´ın˝ uleg a sejtmozg´as beind´ıt´as´ahoz sz¨ uks´eges. Mikroinjekt´alt ellenanyagokkal pulzus-immunjel¨olt embri´ok fejl˝od´es´er˝ol k´esz¨ ult k´epsorozatokat elemezve megmutattuk, hogy az els˝odleges ´erh´al´ozatot beburkol´o, fibronektinben gazdag ECM jelent˝os r´eszben a mezoderm´at k¨or¨ ulvev˝o, a gasztrul´aci´o sor´an kialakul´o m´atrixfeh´erj´ek ´atrendez´es´eb˝ol sz´armazik.
7. fejezet K¨ osz¨ onetnyilv´ an´ıt´ as H´al´as sz´ıvvel k¨osz¨on¨om t´emavezet˝omnek, Czir´ok Andr´asnak mindazt a rengeteg ´es felbecs¨ ulhetetlen seg´ıts´eget, amelyben k¨oz¨os munk´ank sor´an r´eszem volt. Az elm´ ult ´evek alatt sz´amtalan dolgot tanulhattam meg t˝ole a kutat´omunk´ar´ol, a k¨ ul¨onb¨oz˝o mikroszk´opok kezel´es´er˝ol, az adatok feldolgoz´as´ar´ol ´es ki´ert´ekel´es´er˝ol, valamint a Linux oper´aci´os rendszerr˝ol. Term´eszetesen k¨osz¨on¨om seg´ıts´eg´et szakdolgozatom elk´esz´ıt´es´eben is. Szakmai ir´anymutat´asa mellett k¨ ul¨on k¨osz¨on¨om szem´elyes t´amogat´as´at, t¨ urelm´et, ´es hogy mindig mellettem a´llt. K¨osz¨on¨om M´ehes El˝odnek, hogy bevezetett egy sejtbiol´ogiai laborat´orium mindennapjaiba. K¨ ul¨on k¨osz¨on¨om, hogy a k´es˝obbiekben is figyelemmel k´ıs´erte, illetve tapasztalataival ´es l´enyegl´at´o gondolataival seg´ıtette munk´amat. K¨osz¨onetet szeretn´ek mondani Szab´o Andr´asnak, akihez b´armikor, b´armilyen probl´em´aval fordulhattam, mindig k´eszs´eggel sietett a ¨ seg´ıts´egemre. K¨osz¨on¨om Unnep Ren´at´anak ´es Harangoz´o J´ozsefnek tan´acsaikat ´es biztat´asukat. H´al´aval tartozom Paul Rupp-nak, Mike Filla-nak ´es Tracey Cheuvrontnak a University of Kansas Medical Center Anat´omiai ´es Sejtbiol´ogiai Tansz´ek´en, akik seg´ıtett´ek ottani beilleszked´esemet, ´es tov´abb b˝ov´ıtett´ek biol´ogiai ´es mikroszk´op-technikai ismereteimet. K¨osz¨on¨om Sz¨ uleimnek, Nagysz¨ uleimnek, H´ ugomnak ´es Bar´ataimnak a sok-sok szeretetet, t¨ urelmet ´es b´ator´ıt´ast. V´eg¨ ul szeretn´em megk¨osz¨onni az ELTE Biol´ogiai Fizika Tansz´ek´enek, els˝osorban Vicsek Tam´asnak, hogy az ELTE RET projekt keretein bel¨ ul lehet˝os´eget biztos´ıtott sz´amomra munk´am megval´os´ıt´as´ara.
39
Irodalomjegyz´ ek Ambler, C. A., J. L. Nowicki, A. C. Burke, and V. L. Bautch (2001). Assembly of trunk and limb blood vessels involves extensive migration and vasculogenesis of somite-derived angioblasts. Dev Biol 234 (2), 352–364. Bauer, A. L., T. L. Jackson, and Y. Jiang (2009). Topography of extracellular matrix mediates vascular morphogenesis and migration speeds in angiogenesis. PLOS Comp. Biol. 5, e1000445. Czirok, A., P. A. Rupp, B. J. Rongish, and C. D. Little (2002). Multi-field 3d scanning light microscopy of early embryogenesis. J Microsc 206 (Pt 3), 209–17. Czirok, A., E. A. Zamir, M. B. Filla, C. D. Little, and B. J. Rongish (2006). Extracellular matrix macroassembly dynamics in early vertebrate embryos. Current Topics in Developmental Biology 73, 237–58. Czirok, A., E. A. Zamir, A. Szabo, and C. D. Little (2008). Multicellular sprouting during vasculogenesis. Curr Top Dev Biol 81, 269–289. Davis, G. E., S. M. Black, and K. J. Bayless (2000). Capillary morphogenesis during human endothelial cell invasion of three-dimensional collagen matrices. In Vitro Cell Dev Biol Anim 36 (8), 513–519. Drake, C. J., S. J. Brandt, T. C. Trusk, and C. D. Little (1997). Tal1/scl is expressed in endothelial progenitor cells/angioblasts and defines a dorsalto-ventral gradient of vasculogenesis. Dev Biol 192, 17–30. Ellis, L., M. and J. Hicklin, D. (2008). Vegf-targeted therapy: mechanisms of anti-tumour activity. Nature Reviews Cancer 8, 579–591. Ffrench-Constant, C. and O. Hynes, R. (1988). Pattern of fibronectin gene expression and splicing during cell migration in chicken embryos. Development 104, 369–382. Fishman, M., C. and R. Chien, K. (1997). Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions. Development 124, 2099–2117. Forgacs, G., R. A. Foty, Y. Shafrir, and M. S. Steinberg (1998). Viscoelastic properties of living embryonic tissues: a quantitative study. Biophys J 74 (5), 2227–2234. Foty, R. A. and M. S. Steinberg (2005). The differential adhesion hypothesis: a direct evaluation. Dev Biol 278 (1), 255–263. 40
´ IRODALOMJEGYZEK
41
George, E. L., E. N. Georges-Labouesse, R. S. Patel-King, H. Rayburn, and R. O. Hynes (1993). Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development 119, 1079–91. Gray, D., J. Tien, and C. Chen (2003). Repositioning of cells by mechanotaxis on surfaces with micropatterned young’s modulus. J Biomed Mater Res A. 66, 605–14. Hamburger, V. and H. Hamilton (1951). A series of normal stages in the development of the chick embryo. J. Morphol. 88, 49 – 92. Heged˝ us, B., A. Czir´ok, I. Fazekas, T. B´abel, E. Madar´asz, and T. Vicsek (2000). Locomotion and proliferation of glioblastoma cells in vitro: statistical evaluation of videomicroscopic observations. J. Neurosurg. 92, 428–434. Heged¨ us, B., F. Marga, K. Jakab, K. L. Sharpe-Timms, and G. Forgacs (2006). The interplay of cell-cell and cell-matrix interactions in the invasive properties of brain tumors. Biophysical Journal 91 (7), 2708–16. PMID: 16829558. Hynes, R., O. (1992). Integrins, versatility, modulation and signaling in cell adhesion. Cell 69, 11–25. Izaguirre, J. A., R. Chaturvedi, C. Huang, T. Cickovski, J. Coffland, G. Thomas, G. Forgacs, M. Alber, G. Hentschel, S. A. Newman, and J. A. Glazier (2004). Compucell, a multi-model framework for simulation of morphogenesis. Bioinformatics 20 (7), 1129–1137. Jiang, G., A. H. Huang, Y. Cai, M. Tanase, and M. P. Sheetz (2006). Rigidity sensing at the leading edge through alphavbeta3 integrins and rptpalpha. Biophys J 90, 1804–9. Korff, T. and G. Augustin, H. (1999). Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. J. Cell Sci. 112, 3249–58. Kov´acs, M., J. T´oth, C. Het´enyi, A. M´aln´asi-Csizmadia, and R. Sellers, J. (2004). Mechanism of blebbistatin inhibition of myosin ii. J. Biol. Chem. 279(34), 35557–63. Lo, C. M., H. B. Wang, M. Dembo, and Y. L. Wang (2000). Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophys J 79 (1), 144–152. Lough, J. and Y. Sugi (2000). Endoderm and heart development. Dev. Dynamics 217, 327–342. Murphy, E., A., K. Majeti, B., A. Barnes, L., M. Makale, M. Weis, S., K. Lutu-Fuga, W. Wrasidlo, and D. A. Cheresh (2008). Nanoparticlemediated drug delivery to tumor vasculature suppresses metastasis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 9343–9348.
´ IRODALOMJEGYZEK
42
Pardanaud, L., C. Altmann, P. Kitos, F. Dieterlen-Lievre, and C. Buck (1987). Vasculogenesis in the early quail blastodisc as studied with a monoclonal antibody recognizing endothelial cells. Development 100, 339–49. Poole, T. and J. Coffin (1989). Vasculogenesis and angiogenesis: Two distinct morphogenetic mechanisms establish embryonic vascular pattern. J. Exp. Zool. 251, 224–231. R´ez, G. (2002). A daganatok ´errendszere. Term´eszet Vil´aga 133,11. Risau, W. and I. Flamme (1995). Vasculogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73 – 91. Rumpold, H., D. Wolf, R. Koeck, and E. Gunsilius (2004). Endothelial progenitor cells: a source for therapeutic vasculogenesis? J Cell Mol Med 37, 493–503. Rupp, P. A., A. Czirok, and C. D. Little (2003). Novel approaches for the study of vascular assembly and morphogenesis in avian embryos. Trends Cardiovasc Med 13, 283–8. Rupp, P. A., A. Czirok, and C. D. Little (2004). alphavbeta3 integrindependent endothelial cell dynamics in vivo. Development 131 (12), 2887–97. Sneddon, I., N. (1965). The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. Int. J. Engng. Sci. 3, 47–57. Szabo, A., E. Mehes, E. Kosa, and A. Czirok (2008). Multicellular sprouting in vitro. Biophys J 95 (6), 2702–2710. Szabo, A., E. D. Perryn, and A. Czirok (2007). Network formation of tissue cells via preferential attraction to elongated structures. Phys Rev Lett 98 (3), 038102. Veitonmaki, N., J. Fuxe, M. Hultdin, G. Roos, R. F. Pettersson, and Y. Cao (2003). Immortalization of bovine capillary endothelial cells by htert alone involves inactivation of endogenous p16ink4a/prb. FASEB J 17 (6), 764–766. Vernon, R., S. Lara, C. Drake, M. Iruela-Arispe, J. Angello, C. Little, T. Wight, and E. Sage (1995). Organized type I collagen influences endothelial patterns during spontaneous angiogenesis in vitro”: planar ” cultures as models of vascular development. In Vitro Cell Dev Biol Anim 31(3), 120 – 131. Vicsek, T. (1992). Fractal growth phenomena (2nd Edition). Singapore: World Scientific Publishing Co. Vicsek, T. (Ed.) (2001). Fluctuations and Scaling in Biology. New York: Oxford University Press.
´ IRODALOMJEGYZEK
43
Weinstein, B. (1999). What guides early embryonic blood vessel formation? Dev. Dynamics 215, 2–11. Wu, X., E. Rabkin-Aikawa, K. J. Guleserian, T. E. Perry, Y. Masuda, F. W. H. Sutherland, F. J. Schoen, J. E. J. Mayer, and J. Bischoff (2004). Tissue-engineered microvessels on three-dimensional biodegradable scaffolds using human endothelial progenitor cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol 287, H480–7. Yancopoulos, G. D., S. Davis, N. W. Gale, J. S. Rudge, S. J. Wiegand, and J. Holash (2000). Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature 407 (6801), 242–8.
