>P esetén d ~ t .
1.4. Automatikus sejtkövetés A sejtmozgások fenti, kvantitatív analíziséhez a sejtmozgások követése szükséges a sejttenyészetekről készült felvételsorozatokon. Az alacsony kontraszt és a változékony sejtformák miatt gyakran a követés kézzel készül (Czirók, 1998; Hegedűs 2004; Szabó 2006). Automatikus módszerek általában kontrasztos, fényességérték alapján jól szegmentálható 3
felvételek esetén lehetségesek. Például, ganglionsejtek fáziskontraszt képei esetén az egymást követő képek összehasonlításával meghatározták az átfedő, sejttesthez tartozó pixelek számát, majd ebből következtettek a sejtek a sebességére (Selmeczi, 2005). Ezt a kiértékelési módszert az tette lehetővé, hogy a sejtek mozgása a mintavételezéshez képest elegendően lassú volt, így az egymást követő képeken a sejttestek még átfedtek előző pozíciójukkal. Ritka sejtsűrűségek esetén a sejtek automatikus megtalálása azon alapul, hogy a sejtmentes háttérhez képest a sejtek területén a fényességértékek eloszlása valamilyen módon eltér (Wu, 1995), például: (i) más átlagértékű, vagy (ii) a térbeli eloszlása egyenetlenebb: nagyobb szórással, illetve meredekebb gradiensekkel jellemezhető. A sejtmag általában sötétebb a sejt többi részénél, de nem feltétlenül sötétebb, mint a sejtmentes háttér. A sejtek kontúrjának detektálásakor nehézséget jelent, hogy a fáziskontraszt képek esetében a határ egyáltalán nem látszik ha a sejt vastagsága fokozatosan csökken. Nagy sejtsűrűségek esetén további nehézséget jelenthet, ha a sejtek összeérnek, vagy sejtmembrán darabok vannak a sejtek között (Selmeczi, 2005), ezért a szegmentálást nem a háttérhez képest kell elvégezni.
1.5. Mozgás nagy sejtsűrűségek esetén Míg az egyedi sejtek mozgása viszonylag jól ismert, sokkal kevesebbet tudunk a sejtek mozgásáról olyan körülmények között, amikor a nagy sejtsűrűség miatt a sejt-sejt kölcsönhatások jelentősekké válhatnak. A kutatásokat hátráltatta, hogy a tenyészthető szöveti sejtek többsége elveszíti motilitását nagy sűrűség esetén. Ennek, a kontakt gátlásnak nevezett jelenségnek a hátterében az a molekuláris mechanizmus áll, hogy a szomszédos sejtek sejtmembránjait és sejtvázait összekapcsoló kadherin molekulák gyakran motilitáscsökkentő sejten belüli jelátviteli utakat aktiválnak (Gumbiner, 2005). Az epitél sejtek kollektív mozgásánál a jelenleg elfogadott nézet az, hogy a kemotaktikus ingerek által kiváltott vándorlás egyformán hat a sejtréteg alkotóira, valamint, hogy az erős sejt-sejt kapcsolatok nem bomlanak fel (Ridley, 2003). Ezért a sejtek mozgása összehangolódik. Amint azt a dolgozatban is megmutatjuk, megfelelő ECM és növekedési faktorok jelenlétével biztosított környezetben számos epitél sejttípus megőrzi motilitását még nagy sejtsűrűség mellett, külső kemotaktikus irányítás hiányában is. Mivel az epitél szövetekben a sejtek egy zárt sejtréteget alkotnak, nagy sűrűségű (konfluens) tenyészetekben megfigyelhető mozgásuk fejlődésbiológiai vagy orvostudományi szempontból releváns (1. ábra).
4
1. ábra Nagy sejtszámsűrűség szövetben. a: madárembrió egy részének mikroszkópos képe, az endotél sejtek sejtmagjai GFP-vel jelöltek. A szín a magasságot kódolja: piros ventrális (hasi), kék dorzális (háti). Felül található a kialakuló szívből vezető dorzális aorta pár. b: az „a” képen lévő jobb oldali aortának egy nagyított részlete, ahol négy egymást követő kép van egymásra vetítve. A három legrégebbi halványabb, mint az eredeti képek, míg az utolsó eredeti intenzitású. Így a mozgó sejtek olyan szakaszoknak látszanak, amelyeknek a fényesebb végpontja jelöli a sejt aktuális pozícióját. Amint a bekarikázott részletek mutatják, az aorta falát alkotó sejtek felfelé áramolnak, miközben a cső egésze balra forog, azaz a sejtek áramlása spirál pályán történik: A kék színű (dorzális) sejtek mozgásának nincs oldalirányú komponense, míg a sárga színnel jelölt (ventrális) sejtek balra (az embrió közepe felé) is mozognak. Ez a forgás fokozatosan közelíti a két aortát egymáshoz, és a folyamat végén a csövek összeolvadva létrehozzák a végleges szerkezetet. A c-f ábrák az érhálózat és a bal oldali dorzális aorta kialakulásának négy állomását mutatja, a dolgozatban ismertetésre kerülő sejtkövető progam által generált trajektóriákkal. A felvételek a University of Kansas Medical Center automatizált mikroszkópos laboratóriumában készültek, Rusty Lansford (CalTech) TIE1-H2B transzgenikus fürj embrióiról.
5
2. Célkitűzés A sejtmozgás vizsgálatakor gyakran különálló sejteket vizsgálnak. Számos biológiailag releváns esetben azonban a sejtek szöveti környezetben mozognak, ahol a nagy sejtsűrűség következtében meghatározó fontosságúak a sejt-sejt kölcsönhatások. Az itt bemutatott munka célja az volt, hogy nagysűrűségű sejttípusok kollektív mozgásának vizsgálatához egy automatikus sejtkövető programot írjak, amely a sejtmozgások statisztikai vizsgálataihoz elegendő mennyiségű adatot tud szolgáltatni. Az algoritmust két különböző típusú, epitél jellegű sejtre (2. 3. ábra) alkalmazva megmutatjuk, hogy a sejtek spontán kollektív mozgásnak különböző típusai lehetségesek.
2. ábra. Kutya veséből izolált, gyakran vizsgált epitél sejtvonal (MDCK). A látótér 900 X 670µm.
3. ábra Szarvasmarha aortából izolált endotél sejtek (BAEC). A látótér 900 X 670µm.
3. A sejtkövető program 3.1. Áttekintés Az automatikus sejtkövető program folyamatábrája a 4.ábrán látható. Az eljárás több különálló programból áll, ezek matlab és c++ nyelven íródtak. Az egyes rész-programokat bash scriptek fűzik össze.
6
4. ábra. Az automatikus sejtkövető program folyamatábrája. A lekerekített téglalapok adatfájlokat jelölnek, a szögletesek programokat. A szaggatott vonalak mentén opcionális lépések vannak.
A folyamat első lépéseként a képeket mediánszűrővel simítjuk. Az egymást követő képek részleteinek keresztkorrelációs nyomonkövetésén alapuló PIV (particle image velocimetry) algoritmus segítségével előállítjuk a képsorozat "áramlási terét", azaz azt a vektorteret, ami megmutatja, hogy átlagosan (az egyes sejtek felismerése nélkül) milyen irányú elmozdulások történnek. Ha a képsorozat lehetővé tette, a mediánszűrővel simított képeken egy fényességküszöb beállításával szegmentáltuk a képet. A fényesség küszöb megfelelő értékét, ami képenként változhat, az ImageJ (NIH, USA) program segítségével választottuk ki. A küszöbérték alatti fényességgel rendelkező szomszédos pixelek egy klaszterba tartoznak. A sejtmagokat olyan klaszterek adják, amelyek egy bizonyos mérettartományba esnek. Az automatikus klaszterezésnek – ha elvégezhető -- óriási előnye, hogy ha új sejt jelenik meg a látómezőben, akkor az rögtön azonosítót kap és elkezdődik a követése. A követési folyamat elején megadjuk a követendő sejtek kezdőkoordinátáit. Ha a képek lehetővé teszik, akkor a kezdőkoordinátákat a képsorozat első képének szegmentálásával állítjuk elő. A klasztereknek a tömegközéppontjai adják a kezdőkoordinátákat. A sejtek követése egy ciklusból áll, ami egyesével végigmegy a képsorozat elemein. Kihasználjuk, hogy a fáziskontraszt optika a vizsgált sejtek magjait sötétebbnek mutatja a sejt többi részénél. Ezért, a t-ik képre végrehajtott ciklus első felében a koordináták becsült pozícióit módosítjuk egy, az ezekből a koordinátákból indított lokális fényességminimumkereséssel. Ha a becslés eléggé jó minőségű, azaz a minimumkeresés kezdőpontja már a sejtmag területén helyezkedik el, akkor azt várjuk, hogy a művelet a sejtmagok közepéhez közelíti a koordinátákat. A ciklus második felében a PIV adatok interpolációja alapján jósolást adunk követett pontok koordinátáira a t+1 -ik képhez, amit a következő ciklusban használunk fel.
7
A követési hibák kiszűrése érdekében mind a minimumkeresés, mind a PIV becslés után különféle vizsgálatoknak vetjük alá a koordinátákat. A követés során előforduló egyik hibatípus az, amikor a program ugyanahhoz a sejthez több koordinátát (pontot) is rendel. A minimumkeresés után előfordulhat, hogy ezek a pontok ugyanabba a minimumba kerülnek -ilyenkor a hiba detektálható és a pontok, egy kivétellel, eliminálhatóak. Ha a képsorozatot lehetséges szegmentálni, akkor a követett klaszter területének jelentős megváltozása, vagy több pont megjelenése ugyanazon a klaszteren is hibákra utal. Ha a klaszterezés utáni minimumkeresés egy olyan pixelt azonosított a sejtmag középpontjával, amelyik nem tartozik egyik klaszterhez sem, akkor a program szintén abbahagyja az adott pont követését. Ezen kívül, az olyan klaszterekhez, amelyek még nem tartalmaznak követett pontot (a követés során elvesztettük, vagy a sejt újonnan vándorolt be a látómezőbe) új pontot rendelünk. A PIV becslés során a kép széléhez közel eső pontoknál az eljárás olyan elmozdulásvektort is rendelhet, ami a minimumkeresést egy képen kívül eső, nem létező pixelről indítaná. Így a hibajavítás második részében csak azokat a pontokat tartjuk meg, amelyek a látómező szélétől elegendően távol esnek.
3.2. A minimumkeresés A fáziskontraszt képeken gyakran a sejtmag közepe a legsötétebb, ezért a sejtmag követéséhez felhasználhatunk egy alkalmas kezdőpontból indított lokális minimumkeresést. Az eljárás során gradiens módszert alkalmazunk. A ciklus egyszeri végrehajtása alatt az éppen aktuális pont körüli 5X5-ös méretű négyzetben kiválasztjuk a legsötétebb pixelt. Ez lesz a pont új pozíciója a következő ciklus elején. A ciklus addig ismétlődik, amíg a fényességértékek csökkennek -- ellenkező esetben ugyanis lokális minimumhoz jutottunk. Ha a képek elegendően nagy időfelbontással készültek ahhoz, hogy a sejtmagok elmozdulása két kép között kicsi legyen, akkor csak ezt az eljárást felhasználva lehetséges a sejtmagok követése. Az általunk vizsgált legtöbb esetben azonban két felvétel között a sejtek elmozdulása meghaladja a sejtmag méretét, ezért ez az eljárás önmagában nem elégséges.
3.3. A PIV algoritmus A PIV egy, a képrészletek keresztkorrelációjának vizsgálatán alapuló mintázatkövető módszer amivel megjósolható, hogy mekkora és milyen irányú a sejt elmozdulása két kép között (Zamir, 2005). Segítségével a minimumkeresés a sejtmag területéről indítható, ahonnan a folyamat eljuthat a sejtmag közepét gyakran jellemző fényesség minimumig. Az eljárás során a képsorozatra egy rácsot helyezünk. A rácspontok körül helyezkednek el azok a négyzet alakú képrészletek, amelyeknek az elmozdulásait meghatározzuk. A képsorozat következő képén a négyzet területét végigmozgatjuk a rácspont környezetében, és minden egyes pozíciónál kiszámítjuk az eredeti képrészlet és az elmozdított területen lévő képrészlet átfedését. Az átfedést vagy Hamming-távolságként (a pixelenkénti fényességkülönbségek négyzetöszegeként), vagy skalárszorzatként (a pixelenkénti fényességértékek szorzataként) definiálhatjuk. A képrészlet elmozdulását ennek az átfedésértéknek az optimuma határozza meg. 8
Ha a vizsgált képrészletek kicsik, akkor elegendően nagy végigpásztázott területen valószínűleg több hasonló részlet is előfordul, azaz az elmozdulást nem lehet egyértelműen meghatározni. Ha a képrészletek nagyok, akkor a mintázat már eléggé specifikus, azonban ilyen esetben a sebességtér felbontása romlik el: az áramlási térben nem lehet a képrészletek méreténél kisebb sruktúrákat megkülönböztetni. Ennek a problémának a feloldására egy kétlépcsős módszert alkalmazunk. Először egy durvább rácson megbecsüljük az elmozdulásteret. Ezután egy finomabb rácsra térünk át, de a kisebb képrészletek elmozdulását már csak egy leszűkített területen keressük, ott, ahol az előző lépésből származó elmozdulásadatok interpolációja megjósolja.
3.4. Klaszterezés A klaszterezést Hoshen-Kopelman módszer (Hoshen, 1976) segítségével végezte el a program. A Hoshen-Kopelman módszer segítségével a program a szegmentált képeket áttranszformálta olyan kétdimenziós mátrixszá, hogy a klaszterekhez (sejtekhez) tartozó mátrixelemek a klaszter sorszámát kapják meg, a háttéren 0 értéket vesznek fel. A sejtek azonositója és helykoordinátája mellett eltároltuk azt is, hogy a sejthez tartozó klaszter mennyi pixelből áll.
3.5 Követési blokkok összefűzése A BAEC és az MDCK sejtvonalak esetében változott a szegmentáláshoz tartozó optimális fényességküszöb a felvétel során. Ezért 10, illetve 30 képet tartalmazó blokkokra osztottuk a felvételeket, amelyekre külön-külön lefuttattuk a sejtkövető programot. Mivel minden blokkban a sejtek új azonosítót kaptak és részben más sejteket is követtünk, ezért az azonosítók rendezésére volt szükség. Egy adott blokk legutolsó képen lévő sejteket a következő blokk legelején azokkal a sejtekkel azonosítottuk, amelyeknek a távolsága a sejtek méreténél jóval kisebb volt.
4. Eredmények 4.1. A Sejtkövetés pontossága Egy 22 sejtből álló minta eredményeit ellenőrizve azt találtuk, hogy a hibás követés lépésenkénti gyakorisága 0,003%. A kizárólag minimumkeresésre korlátozott algoritmusnál a hibagyakoriság 1%. A hiba leggyakoribb oka az volt, amikor a minimumkeresés két sejtmag között indult. Ez különösen akkor jelentkezik, amikor a sejtek elmozdulása nagy. Ilyen esetkben a program a lokális minimumot gyakran egy sötét színű szennyeződésnél találja meg. Olyan esetek is előfordulhatnak, amikor az emberi szem sem tudja egyértelműen eldönteni, hogy egy adott sejt melyik sejt volt az előző képen. 9
4.2.Trajektóriák A sejtkövető programmal két olyan sejttípus viselkedését elemeztük, amelyeknek konfluens (a tenyésztőfelületet teljesen beborító) tenyészetei is intenzíven mozognak. Az MDCK vese epitél valamint a BAEC aorta endotél sejtek tenyészeteiről az ELTE Biológiai Fizika Tanszék automatizált fáziskontraszt mikroszkópjával készültek képsorozatok, 9 (BAEC) illetve 7 (MDCK) látótérről. Az elemzett időtartam hossza átlagosan 12h. A sejtkövető eljárással meghatározott tipikus trajektória részleteket az 5. és 6. ábra mutat. Látható, hogy a sejtek nagy részét a program sikeresen felismerte és követte. A sejtek trajektóriái kezdetben pirosak és az idő múlásával zöldek, majd kékek lesznek. A sejt mindenkori pozícióját tehát a trajektóriájának a zöld, vagy a kék színű végén találhatjuk.
5. ábra a, Ahogy az irányváltások mutatják, az MDCK sejtek rugalmas anyaghoz hasonlóan mozognak. b, A BAEC sejtek folyadékszerűen áramolnak. A szaggatott vonal két, ellentétes irányba mozgó sejtcsoportot választ el egymástól. Látható, hogy szomszédos sejtek ellentétes irányba haladó áramlásokhoz tartozhatnak. A négyzettel határolt részben örvényeket tudunk megfigyelni.
10
6. ábra Inhomogén sűrűségeloszlás esetén az MDCK sejtek az egész látómezőre kiterjedően áramlanak. A sűrűséggradienssel ellentétes irányú mozgásra merőlegesen egy rezgőmozgás is szuperponálódik.
Bár mindkét sejttípus intenzíven mozog nagy sejtsűrűség mellett is, a trajektóriák részletesebb vizsgálata érdekes sejttípus-függő jelenségekre utal. Az endotél sejtek áramvonalakba rendeződnek, egy-egy ilyen együttmozgó struktúra nagyszámú, körülbelül tíz sejtet tartalmaz. Az áramvonalak határa elég éles, szomszédos sejtek külön áramvonalakba tartozhatnak, ezáltal a sejtfelszínek relatív elmozdulása jelentős lehet. Folyadékszerű viselkedésre utalnak még a megfigyelhető tranziens örvények is. Az epitél sejtek mozgását a kísérleti körülményektől függően két csoportra oszthatjuk. Ha a sejtek kiültetésekor a sejtek eloszlása nem volt egyenletes, akkor a sűrűbb részekről rendezett áramlás figyelhető meg a ritkább részek irányába. Az eltérő sejtsűrűséget ilyen esetekben jól mutatja a sejtek megváltozott területe. Ilyen áramlás hiányában a sejtcsoportok egyfajta rezgőmozgást végeznek, megnövelve illetve lecsökkentve a helyi sejtsűrűséget.
4.3. Autokorrelációs függvények A nagy sejtsűrűségű tenyészetekben megfigyelhető sejtmozgások kvantitatív jellemzéséhez első lépésként meghatároztuk a sebességtér térbeli és időbeli autokorrelációs függvényeit. Két v v sebességvektor ( v és u ) hasonlóságát úgy határozzuk meg, hogy először mindkét vektorból v levonjuk a drift értékét (az adott t időpontban mérhető sebességeknek V (t ) térbeli átlagát), majd az így kapott vektorok skalárszorzatát normáljuk a sebességértékek σ (t ) szórásával: v v v v v (t ) − V (t ) u (t ') − V (t ') v v C (v (t ), u (t ')) = (4) σ (t )σ (t ')
[
][
]
Időkorreláció esetén meghatározzuk, hogy az egyes sejtek mennyire változtatják időben a mozgásukat v v C idő (t ) = C (vi (t '), vi (t '+t )) i ,t ' (5)
11
v Ahol vi (t ) jelöli az i-ik sejt sebességét a t pillanatban, a
i ,t '
átlag pedig az összes sejtre és
összes lehetséges t’ időpontra történik. A 7. ábra alapján a korreláció időben jó közelítéssel exponenciálisan csökken, úgy, mint a kis sűrűségű tenyészetekben mozgó sejtek esetén. A BAEC sejtek mozgása azonban időben korreláltabb, mint az MDCK sejteké, és ez a korreláció időben tovább fenn is marad. A sebességek térbeli korrelációját az 5. képlethez hasonló módon számoljuk:
v v v C tér (r ) = C (vi (t ), v j (t ))
(6)
t , xi − x j ~ r
ahol az átlagot az összes t időpontra valamint az összes olyan sejtpárra számoljuk, amelyeknek a távolsága közelítőleg r. Ahogy a 7.ábra mutatja, a megfigyelhető korrelációs értékek hasonlóak mindkét sejtvonal esetén. Ugyanakkor a BAEC sejtek között 300-400 mikrométeres távolságokban még észlelhető korreláció, míg az MDCK sejtek esetében ez nagyjából fele akkora távolságnál eltűnik. Mindkét sejttípus sejtjei körülbelül azonos nagyságúak. Ha a sejtek alakját ellipszissel közelítjük, akkor BAEC sejtek esetében a nagytengely átlagosan 15 µm, a kistengely pedig 5,5 µm. MDCK sejtek esetében a két tengely hossza 22 µm és 9 µm.
7. ábra. a, időkorreláció b, térkorreláció a két sejttípus esetén. A kék szaggatott vonal az átlagos sejtméretet jelöli.
4.4. Áramlási tér egy sejt körül r r A mozgó sejteket körülvevő V (r ) átlagos áramlási tér szemléletesen azt mutatja meg, hogy egy tetszőleges mozgó sejt környezetében (a sejt pozíciójához és mozgásának irányához v v viszonyított r helyen) a szomszédos sejtek átlagosan milyen V sebességeket vesznek fel. A vizsgálat során feltételezzük, hogy nincs különbség a különböző mozgásirányok között, azaz térben elforgatott konfigurációkra is kiátlagolunk: v v v V (r ) = R−ϕi (t ) v j (t ) i , j ,t (7) ahol ϕ i (t ) az i-ik sejt sebességének az iránya (önkényesen választva a szög nulla ha a sejt az x tengely irányába mozog), Rϕ a ϕ szöggel való forgatási operátor, a
{i , j ,t }
átlagolás minden
lehetséges t időpontban azokra az i,j sejtpárokra történik, amelyekre 12
v v v R−ϕi (t ) (x j (t ) − xi (t )) = r
(8)
v v A V (r ) áramlási teret a laboratóriumunkban mások által kifejlesztett program segítségével határoztuk meg. Ahogy várható, a mozgó sejtek együtt haladnak a közvetlenül előttük illetve mögöttük lévő szomszédaikkal (8.ábra). Az áramlási terek ugyanakkor jól demonstrálják azt a jelentős különbséget, amit a két sejtvonal mozgása között a trajektóriák vizsgálatánál láttunk. A BAEC esetében a sejtek visszaáramlása gyorsan lecsökkenti a mozgásra merőleges irányban a sebességkorreláció értékét, az áramlási tér jellegzetes „csokornyakkendő” alakot mutat. Az MDCK sejtek esetében azonban a sejtek egy nagyobb területen mozognak együtt, és a sebességek hasonlóak maradnak a mozgásra merőleges irányban is.
8. ábra. Az a, b, ábrán látható az MDCK sejtek körüli sebességtér, a c, d, ábrán a BAEC sejteké. Az ábrákon az origóban helyezkedik el a sejtmagja az x tengely pozitív irányába mozgó sejtnek. A b és d ábra a
v v V (r ) sebességtér x irányú komponensét mutatja a színkódos ábrázolással.
4.5. Szomszédos sejtek eltávolodása A folyadékszerű illetve rugalmas viselkedést a sebességterektől függetlenül is alátámasztjuk azzal, hogy megmutatjuk, hogyan változik időben a kezdetben szomszédos sejtpárok távolsága. A legelső képen mindegyik sejthez kiválasztottuk a hozzá legközelebbi sejtet, és meghatároztuk távolságukat a felvételsorozat képein. Ahogy a 9.ábrán látható, BAEC sejtek esetében ez az eltávolodás lényegesen gyorsabban nő mint az MDCK sejteknél. 13
Ezek a vizsgálatok tehát arra engednek következtetni, hogy a sejtrétegek önhajtott mozgásának több lehetséges típusa van: viselkedhetnek örvényes folyadékként, vagy rugalmas, deformálódó membránként is.
9. ábra Sejtpárok eltávolodása az időben.
5. Diszkusszió 5.1 Kollektív mozgás
Az élőlények kollektív mozgása számos korábbi vizsgálat tárgya volt. A kutatásokat az motiválta, hogy az élőlények egyik legszembetűnőbb tulajdonsága a mozgás, valamint az a képességük, hogy mozgásukat össze tudják hangolni társaikkal. A növényevő halakból, madarakból és emlősökből álló rajok, illetve csordák a túlélési esélyeik növelése céljából csoportosulnak. Mozgásuk gyakran önszervező módon hangolódik össze, azaz nem egy vezért követnek: Több ezer madár képes egyszerre felszállni és másodpercek alatt rendeződve ugyanabba az irányba elrepülni, még akkor is, ha eredetileg nem egy irányba néztek és sokuk takarásban volt az indulás pillanatában (Vicsek, 2001). A kutatások egyik meghatározó modellje az ELTE Biológiai Fizika Tanszékén, Vicsek Tamás csoportjában készült (Vicsek, 1995). A statisztikus fizikai ihletésű modell sok hasonló részecskéből áll, amelyek között egy egyszerű kölcsönhatás hat: a részecskék önhajtottak, állandó nagyságú sebességgel mozognak. Sebességüket a környező lokális átlagsebességhez igazítják, amit valamekkora hibával tudnak csak megbecsülni:
θ i (t + 1) = θ j (t )
j (i )
(9)
+η
ahol θ i az i-ik részecske mozgásiránya, az irányok
j (i )
átlagát azokra a j részecskékre
számoljuk amelyek az i-ik részecske egységsugarú környezetében vannak. Az η zaj egy egyenletes eloszlású véletlen változó a [-A, A] intervallumból, ahol A a zaj amplitúdója. Ez a tag reprezentálja az élőlények tökéletlen ismeretét vagy alkalmazkodását a környező átlagos mozgásirányhoz. Ez a modell “fenomenologikus” olyan értelemben, hogy a kölcsönhatás pontos biológiai mechanizmusát nem vizsgálja; számos, biológiailag nagyon különböző hatás 14
(látás, víznyomás ingadozásának érzékelése, sejtfelszíni receptorok állapotának megváltozása) eredményezheti a mozgásirányok helyi rendeződési tendenciáját. A modell előnye a nagyfokú egyszerűség, rögzített sebesség és rendszerméret esetén csak a részecskék sűrűsége és a zaj erőssége a két kontrollparaméter. A modell, és az általa motivált elméleti vizsgálatok (Vicsek, 1995; Tu, 1995) megmutatták, hogy ha a rendeződés pontossága meghalad egy küszöbértéket (vagyis a zaj amplitúdója elegendően kicsi) akkor ez a lokális rendeződés szétterjed az egész rendszeren, és a részecskék mozgásiránya a rendszer minden részében hasonló lesz. Ez az eredmény azért figyelemreméltó, mert az egyensúlyi statisztikus fizika analóg modellje, a klasszikus kétdimenziós ferromágnesekből álló XY modell csak zérus hőmérsékleten rendezett. A részecskék mozgása tehát szükséges a nagyskálájú rendeződés kialakulásához. Numerikus szimulációk tanúsága szerint egy adott (tetszőleges) zaj esetén a sűrűség növelésével is biztosítható a rendezettség: ha a részecskék egész rendszerre vett átlagsűrűsége meghalad egy küszöbértéket, akkor az összes részecske hasonló irányban mozog (Vicsek, 1995). Ezt az átalakulást kísérletileg is sikerült hal keratocita sejttenyészetekben megfigyelni (Szabó, 2006). Az itt bemutatott eredmények arra engednek következtetni, hogy az önhajtott részecskék (sejtek) nagysűrűségű rendszereiben megjelenhetnek olyan fázisok, amelyek különböznek a fenti modell által jósolt homogén sebességtértől. Feltételezésünk szerint ez azért lehetséges, mert a sejt-sejt kapcsolatok bonyolultabb kölcsönhatások közvetítésére is képesek, mint a sebességek rendeződése. Figyelemre méltó, hogy az önhajtott folyadék fázis megjelenik nagysűrűségű baktérium szuszpenziók mozgásában is (Dombrowski, 2004), azaz több, biológiai szempontból jelentősen különböző rendszerben is megfigyelhető ugyanaz a viselkedés. 5.2 Az általánosított Potts modell A sejtek mozgását több kutatócsoport próbálja úgy modellezni, hogy a modellben a sejteket kiterjedt objektumok reprezentálják (Glazier, 1993; Newman, 2005). Az egyik ilyen modell a sejteket egy ferromágneses Potts modell doménjeivel ábrázolja. Azaz, egy rács pontjaiba olyan Potts spineket helyezünk, amelyek n lehetséges állapotban lehetnek. Az egy állapotban lévő szomszédos spinek egy domént alkotnak. Hogy az i állapotú spinek doménje az i-ik sejtet reprezentálhassa, figyelembe kell vennünk, hogy ugyanaz a sejt nem fordulhat elő egyszerre több helyen és nem lehet lyukas. Tehát, a sejtek Potts spinmodelljének doménjeitől elvárjuk, hogy egyszeresen összefüggőek legyenek. Ez alól kivételt képez a 0 spinérték, ami a sejtmentes területet reprezentálja. A sejtek mozgását olyan elemi lépések összessége adja, amelyek során véletlenszerűen választott spinek rámásolják állapotukat a szomszédos rácspontokra. Az egyes elemi lépések valószínűségének meghatározásához a Potts rendszer konfigurációihoz egy H energiaértéket rendelünk. A rendszer időbeli változása során ezt a H értéket igyekszik csökkenteni. A rendszer Hamilton-függénye: 2 H Potts = J ((σ (i, j )), (σ (i ' , j '))) + λ ∑ (a(σ ) − Aσ ) (10) ∑ ( i , j )( i ', j ') szomszédok
σ >0
Ahol σ (i, j ) az i,j-edik rácspontban lévő spinnek az állapota, és az összegzés olyan szomszédos rácspontokra történik, amelyek különböző doménekhez tartoznak. A rendszer szempontjából energetikailag kedvezőbb, ha a szomszédos rácspontokon levő spinek 15
sejtekhez tartoznak: J(0,a)>J(b,a) ha b>0. Tehát, a szomszédos spinekre összegző első tag felelős a sejtek összetapadásáért. Az is növeli a konformáció energiáját, ha a sejtek területe eltér az adott sejttípusra előírt területtől (A). A modell alapját egy Metropolis Monte-Carlo szimuláció képezi. Egy lépés során egy véletlenszűen választott rácspont állapotát megpróbáljuk rámásolni egy szomszédos rácspontra, ha ezt megengedik az összefüggőségi kényszerek. Ennek a lépésnek a p valószínűsége exponenciális függvénye a Hamilton-függvény megváltozásának: (11) ln p = min(0,−∆H ) Ahhoz, hogy a kollektíven mozgó sejtek folyadékszerű áramlásait visszakapjuk, elég a modellben lévő doméneket a perzisztens mozgás képességével felruházni. A domének memóriával rendelkeznek: megjegyzik azt, hogy milyen irányban mozognak (Selmeczi 2005). A szimuláció során kisebb valószínűséggel történik olyan lépés, ami nem a domén preferált mozgásirányában történik, azaz az elemi lépések valószínűségét egy nemegyensúlyi taggal módosítjuk: (12) ln p = min (0,−∆H + w) ahol w pozitív, ha a lépés az aktuális mozgásiránnyal megegyező irányú. Ahogy a 11. ábra mutatja, a laboratóriumunk tagjai által készített szimuláció jól visszaadja a sejtek kollektív áramlását.
11. ábra A laboratóriumunkban készített szimuláció reprodukálja a BAEC sejtvonal sebességeloszlás terét.
5.3 Összefoglalás
A dolgozatban készítettünk egy új algoritmust, ami a nagysűrűségű sejttenyészetek automatikus követését teszi lehetővé. A programot az epitél és az endotél sejttípus konfluens tenyészeteire alkalmazva megmutattuk, hogy a sejtek kollektív mozgásának több típusa is lehetséges. Viselkedhetnek örvényes folyadékként, vagy rugalmas, deformálódó membránként is.
16
6. Irodalomjegyzék: M.R. Chicoine and D.L. Silbergeld: The in vitro motility of human gliomas increases with increasing grade of malignancy. Cancer, Vol. 75, 2904-2909, (1995) A. Czirók, K. Schlett, E. Madarász, and T Vicsek: Exponential Distribution of Locomotion Activity in Cell Cultures, Physical Review Letters, Vol. 81, No. 14, (1998) C. Dombrowski, L. Cisneros, S. Chatkaew, R. Goldstein, and J. Kessler: Self-Concentration and Large-Scale Coherence in Bacterial Dynamics, Physical Review Letters, Vol. 93, No 9. 098103-(1-4) (2004). J. A. Glazier and F. Graner: Simulation of the differental adhesion-driven rearrangement of biological cells. PRE 47:2128 (1993). B. M. Gumbiner: Regulation of cadherin mediated adhesion in morphogenesis, Nature Reviews, Vol. 6, 622-634 (2005) B. Hegedűs, J. Zách, A. Czirók, J. Lővey, T. Vicsek: Irradiation of Taxol treatment results in non-monotonous dose-dependent changes in motility of glioblastoma cells. J Neurooncology 67: 147-157 (2004) J. Hoshen and R. Kopelman: Percolation and Cluster Distribution. I. Cluster Multiple Labeling Technique and Critical Concentration Algorithm. Phys. Rev. B., 1(14) , 3438-3445, (1976)
P. Huang, A. Allam, and A. Taghian. Growth and metastatic behavior of human glioblastoma compared with nine other histological types of human tumor xenografts in SCID mouse. J. Neurosurg., 83:308-315 (1995) Dr. Kelemen Ottó, A keloid és a hipertófiás heg kezelésének klinikai és kórszövettani vizsgálatai és megelőzés lehetőségei, Egyetemi doktori értekezés, Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Sebészeti Tanszék, (2008). D. A. Lauffenburger and A. F. Horwitz: Cell Migration, A Physically Integrated Molecular Process Cell, Vol. 84, 359–369, (1996) C. L. Manaham, P. A. Iglesias, Y. Long, and P. N. Devreot: Chemoattractant signaling in dictyostelium discoideum, Annu. Rev. Cell Dev. Biol, 223-253 (2004) S. Munevar, Y. Wang and M. Dembo: Traction Force Microscopy of Migrating Normal and H-ras Transformed 3T3 Fibroblasts, Biophysical Journal, Vol. 80, 1744–1757, (2001) T. J. Newman:, Modeling multicellular systems using subcellular elements, Mathematical Biosciences and Engineering, Vol. 2, No. 3, 611-622 (2005)
17
D. Psychoyos and C. D. Stern: Fates and migratory routes of primitive streak cells in the chick embryo, Development, Vol. 122, 1523-1534 (1996) A. J. Ridley, M. A. Schwartz, K. Burridge, R. A. Firtel, M. H. Ginsberg, G. Borisy, J. T. Parsons, A. R. Horwitz: Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back, Science, Vol. 302, 1704-1709 (2003) J. Toner, Y. Tu :Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: How birds fly together, Phys. Rev. Lett. Vol. 75. 4326-4329, (1995) B. Szabó, G. J. Szöllösi, B. Gönci, Zs. Jurányi, D. Selmeczi and T. Vicsek: Phase transition in the collective migration of tissue cells: Experiment and model, Physical Review E 74, 061908-(1-5) (2006) G. Szabó: Sejtbiológia, Medicina Könyvkiadó Rt. 2004 T. Vicsek, A. Czirók, E. Ben-Jacob, I. Cohen and O. Shochet: Novel Type of Phase Transition in a System of Self-Driven Particles, Physical Review Letters, Vol. 75, No.6, 1226-1229, (1995) T. Vicsek: Fluctuations and scaling in Biology, Oxford University Press, 2001. E. A. Zamir, A. Czirók, B. J. Rongish, and C. D. Little: A Digital Image-Based Method for Computational Tissue Fate Mapping During Early Avian Morphogenesis, Annals of Biomedical Engineering, Vol. 33, No.6, 854-865 (2005)
18
Köszönetnyilvánítás
Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Czirók Andrásnak, aki nagy segítséget nyújtott a sejtkövető program, illetve a TDK írása közben. Köszönöm Szabó Andrásnak, hogy a program írása közben mindig válaszolt kérdéseimre.
19