Vitaminok A vitaminok általunk nem előállítható, szervezetünk számára elengedhetetlenül fontos, kis mennyiségben szükséges anyagok. A vitaminok primer metabolitok. A mikroorganizmusok felhasználhatók tiamin (B1), riboflavin (B2), fólsav (B10), pantoténsav (B5), biotin (H-vitamin), piridoxál (B6), B12 vitamin és ergoszterin (D2 provitamin) előállításához.
Bizonyos
vitaminok
szintézisének
meghatározott
lépései
mikroorganizmusokkal végeztethetőek, katalizálhatóak, például a D-szorbit L-szorbózzá történő bio-oxidációja Acetobacter suboxidans segítségével a C-vitamin szintézise során. Ipari méretekben azonban csak a B12 és B2 vitaminok előállítása gazdaságos.
A-vitamin Az A-vitamin (retinol) karotinoidokból képződik. A karotinoidok az A-vitamin provitaminjai, izoprén vázas vegyületek, melyekben konjugált kettős kötés rendszer található. Karotinoidok a növényekben, és egyes moszatokban
is
megtalálhatóak
(például
vörösmoszatokban, barnamoszatokban). A provitaminok vitaminná történő átalakítása során a β-karotin körülbelül hatodrésze, az egyéb karotinoknak csupán a tizede alakul át retinollá. A növényi eredetű β-karotin karoténdioxigenáz hatására alakul A-vitaminná. Állati eredetű táplálék fogyasztásával kész Avitaminhoz is juthatunk. Az 1. ábrán karotinoidok szerkezete látható. Míg az α- és β-karotin szerkezetében két gyűrű is található, addig a γ-karotin csak egy gyűrűt tartalmaz, a likopén pedig egyetlen gyűrűt sem. A zeoxanthin hidroxilált β-karotin származék. Előállítás •
Kémiai szintézissel (polimerizáció): ez a leggyakoribb, legjellemzőbb előállítási mód
•
Növényekből (sárgarépa), algákból is izolálható
•
Élesztővel fermentációs úton Blakeslea
trispora
élesztő
bizonyult
a
leghatékonyabb
β-karotin
termelő
fonalasgombának. Kevert tenyészettel 3 g/l-es vitaminkoncentráció érhető el. A fermentációs eljárás azonban nem versenyképes (bár sokféle mikroorganizmus képes karotinoidok előállítására), a szintetikus technológiák olcsóbban kivitelezhetőek. A 1
nyersanyagárak növekedésével ezek az arányok a jövőben megváltozhatnak a fermentációs előállítás javára. Felhasználás Humán vitaminként történő használata mellett az A-vitamin margarin, sajt, tojástermékek engedélyezett élelmiszerszínezéke. Más színezékekkel szemben előnyösebb, mert szervezetbarát (természetes színezék). Elsőként a Roche cég állított elő β-karotint élelmiszeripari célokra. Az A-vitamin felhasználás körülbelül 100 tonna évente a világon.
1. ábra: Karotinoidok szerkezete
2
B12-vitamin (kobalamin) A B12-vitamin ún. C1-átvivő, így egyszénatomos egységek szállításában vesz részt. A C1 egységek a metil-, metilén-, metenil-, formil-, és formimino-csoportok. (A C1 egységeket a szervezetben a metil-terahidrofolát, betain, metil-B12, S-adenozilmetionin hordozzák.) Az 1920-as évekig halálos betegségnek számító vészes vérszegénység gyógyítója két orvos volt, George Richards Minot és William Perry Murphy. Rájöttek, hogy ha betegeik nagy mennyiségű marha májat esznek, azzal a betegség kordában tartható. 1926-os felfedezésükért 1934-ben Nobel-díjat kaptak. Az 1930-as évek folyamán a kutatók világszerte próbálták izolálni a májban található gyógyító hatóanyagot, melyről úgy hitték egy B-vitamin, ezért a B12 nevet adták az anyagnak, jóval az izolálása előtt. 1934-ben Ricke és Smith májból izolálták a vészes vérszegénységet gyógyító vitamint. A vitamint először kristályos formában 1948-ban állították elő mg-os mennyiségben, mintegy hat tonna máj feldolgozásával. (A B12-vitamin szerkezetének felderítésében nagy szerepet játszott Dorothy Hodgkin munkája, melyért 1964-ben kémiai Nobel-díjat is kapott.) Az 1950-es években először melléktermékként nyerték ki a B12-vitamint sztreptomicin és klóramfenikol, vagy neomicin fermentációk fermentleveiből. A vitamin hozam ekkor körülbelül 1 mg/l volt. A B12-vitamint az emberi szervezetben a bélmikroflóra képes megtermelni a vastagbélben, de ott a vitamin nem tud felszívódni, csak a gyomor és a vékonybél nyálkahártyája által kiválasztott glikoproteinhez kapcsolódva (intrinsic faktor). Az esetek többségében vitaminhiány akkor lép fel, ha nem képződik a kobalaminokat szállító intrinsicfaktor. A vitamint élelmiszerekből is felvehetjük (máj, vese, szív, hal, tojás, tejtermékek). A vitamin gyógyszerként használatos vészes vérszegénység kezelésére. A B12 a takarmányiparban is használt vitamin, sertések és szárnyasok tenyésztése során alkalmazzák. Növényi takarmányok kiegészítője, így felhasználásával állati fehérjét lehet megtakarítani, illetve növényi fehérjékkel helyettesíteni. Sertés és csirketápok esetében 10-15 mg B12-vitamint adagolnak 1 tonna takarmányhoz. Az így használt feed grade vitamin ára 4,5 $/g (sertés, ló, csirke).
3
A B12-vitamint Magyarországon is gyártották az 1960-as években, majd megszűnt az előállítás az 1970-es évek végére. Ma már azonban kristályos B12 termelés nincs Magyarországon. (Dorog-Komárom: 900 kg kristályt termeltek.) A B12 a legnagyobb forgalmú, fermentáció segítségével előállított vitamin. Éves előállítás (kg/év) B12
12 000
cianokobalamin
3 500
hidroxokobalamin
2 000
koenzim B12
1 000
metil-kobalamin
500
1. táblázat: B12-vitaminnak és változatainak előállított mennyiségei
A B12-vitamin bioszintézise kezdetben a porfirinekkel és klorofillal közös utat követ. glicin szukcinil-KoA
δ-amino-levulinsav
×2
×2
porfobilinogén
uroporfirinogén III
-CH3 csoportok Co2+
koprogén III
kobirinsav
1-amino-2-propanol NH3 kobinamid
protoporfirin IX 5'-dezoxi-adenozin Fe2+
5'-dezoxiadenozil-kobinamid
hem
hemoglobin citokróm kataláz Fe2+
Mg2+
GTP 5'-dezoxiadenozil-kobinamidguanozin-difoszfát
klorofill Mg2+ 5,6-dimetil-benzimidazol
riboflavin
5'-dezoxiadenozil-kobalamin-foszfát
5'-dezoxiadenozil-kobalamin (B12-vitamin) Co2+
2. ábra: Porfirinváz bioszintézise
4
Felépítés, szerkezet A B12-vitamint olyan tetrapirrol gyűrű (koringyűrű, mely a porfirinhez hasonló) építi fel, melyben. kobalt található. (Ha a kobaltot magnézium helyettesíti, akkor klorofillról, ha vas, akkor hem alegységről beszélünk.) A kobamidban a ribóz C-1 atomja az 5,6-dimetilbenzimidazol bázisával kapcsolódik össze, amely a CN mellett kobaltot tartalmaz további koordinációs pontként.
3. ábra: A kobalamin származékok szerkezete
5
Előállítás A B12-vitamin előállítására többféle eljárás és többféle mikroorganizmus használatos. •
sztreptomicin
fermentáció
melléktermékeként
(1
mg/l-es
koncentráció,
törzsfejlesztéssel eljutottak a 3,3 mg/l vitamin koncentrációig ) •
biológiai szennyvíztisztító Az eleveniszapban a sejtekben felhalmozódik a vitamin (4-10 mg B12/kg iszap).
•
de novo szintézises fermentáció (Farmitalia (I); Glaxo (UK); Merck (USA); Rhone-Poulenc (F); Gistt-Brocades (NL))
A
leggyakrabban
alkalmazott
mikroba
a
Pseudomonas
denitrificans
(ezzel
a
mikroorganizmussal a Merck gyógyszergyár fejlesztett ki technológiát először, mely eljárást szabadalmaztattak is az 1950-es években). Különböző Propionibacteriumok (P. shermanii, P. Freudenreichii) is alkalmazhatóak (Chinoin), valamint metántermelő anaerob baktériumok (Richter), metanol szénforráson alkalmazva. Az alkalmazott szénforrás lehet glükóz, vagy metanol. Glükózon végzett fermentációk: Streptomyces olivaceus (3,3 mg/l) Propionibacter shermanii (30-40 mg/l) (100 mg/l) Pseudomonas denitrificans (60 mg/l) Protaminobacter ruber és Rhodopseudomonas spheroides protoplaszt fúziójával a Farmitalia által létrehozott Pseudomonas putida segítségével 120-150 mg/l koncentráció érhető el. Metanol szénforráson a sejtek termelnek B12-vitamint, mely a C1-metabolizmus koenzimje, ezért feltétlenül szükség van jelenlétére a sejtekben a C1-átvitelhez. Metanol szénforráson végzett fermentációk:Methanosarcina bankerii (42 mg/l) Eleveniszap (35 mg/kg) Propionibacterium freudenreichii ATCC 6207, Propionibacterium shermanii ATCC 13673 A fermentáció kétlépcsős, egy 2-4 napig tartó anaerob és 3-4 nap hosszú aerob szakaszból áll. Így 100 mg/l-es koncentráció érhető el, azonban a termék intracelluláris, így sejtfeltárásra van szükség. Ezt hőkezelés segítségével oldják meg, melynek hatására a sejtek felszakadnak és a kiáramló vitaminnak köszönhetően vörösre festik a fermentlevet. A kezelés 10-30 perces forralásból áll, 80-120 °C-on, 6,5-8,5 pH-n.
6
Az így kapott termék az instabil hidroxikobalamin, melyet kémiai konverzióval alakítanak már stabilis cianokobalaminná. A nyers termék körülbelül 80%-os tisztaságú, a gyógyszertisztaság pedig 95-98%-os, ezért a kapott vegyületet kromatográfiás eljárás segítségével tisztítják (az átlátszó oszlopon követhető a vörös színű B12-vitamin). A hozam 75%-os. 1. Pseudomonas denitrificans A fermentáció során prekurzor vegyületeket adagolnak, például 5,6-dimetilbenzimidazolt. A melaszon végrehajtott fermentáció előrehaladását betain adagolással segítik, mely növeli a bioszintézis hatékonyságát, emellett a sejtmembrán permeabilitását is növelheti. Ezt a fermentációs eljárást nem emelték ipari szintre, a kísérletek laboratóriumi körülmények között folytak (3 l). Tizenkét éves törzsfejlesztés során a kezdeti elérhető 0,6 mg/l B12-vitamin koncentrációt sikerült 60 mg/l-re növelni. 2. metanolhasznosítók A Kőbányai Gyógyszergyárban dolgozó Johan Béla jelentős eredményeket ért a hazai B12-vitamin gyártásban. (Szentirmai Attila-kísérletek a Richter Gedeon Rt-nél)A Richter Gedeon Rt. nagy sikereket ért el korábban B12-vitamin gyártási technológiájával és a világpiacon is jelentős szerepet töltött be. (Az 1960-as években a Szovjetunió jelentős szállítója volt, a 70-es évektől pedig egyre nagyobb mértékű lett a nyugati export is.) 1000 m3-es anaerob reaktort alkalmaztak, metanol rátáplálást, félfolytonos technológiával. Állandó keveréktenyészetet, mely 2-3 B12 termelő és emelett 3-4 „szinbionta” törzsből állt. (Korábban az inokulum a szennyvíztelepről érkezett.) A cég a világon az egyetlen volt, mely keveréktenyészetekkel állíttatta elő a B12-vitamint. A cég dorogi üzemében alkalmazták a keverék tenyészetes eljárást. A befertőződés veszélye csekély, mert a kizárólagos szénforrásként adott metanol sterilizáló hatást is kifejt. A fermentáció folyamatos, újraoltásra nincs szükség. Az 1950-es években a világtermelés (700 g) felét hazánkban gyártották (362 g). A folyamat nagyon olcsó, mert az eljárás anaerob (nincs szükség levegőztetésre), nem steril, közönséges vaslemez tartályokban (4 x 1000 m3) kivitelezhető, keverési igénye minimális (naponta négyszer negyedóra). Ez tette gazdaságossá a viszonylag alacsony 7
hatóanyag koncentráció ellenére is. Az üzem az ezredfordulóig működött, ekkor már annyira elhasználódott, hogy a felújítása nem lett volna gazdaságos. A sejtfeltárást hőkezeléssel és pH állítással végezték, majd a kapott terméket cianid hozzáadásával alakították át (hidroxikobalamin → cianokobalamin).
B2-vitamin (riboflavin, laktoflavin) 1933-ban György Pál és Richard Kuhn izolálták, azonosították tejsavóból, majd 1935-ben Kuhn és Karrer a vitamin szerkezetét is felderítették. A vitamin nevét színéről (zöldessárga) és a kémiai szerkezetét alkotó ötszénatomos molekuláról kapta. A riboflavin egy alloxazin származék, melynek redukált formája színtelen, oxidált
formája
vöröses-barnás
színű.
A
flavin-mononukleotid
valójában
riboflavinfoszfát, amelyben a cukoralkohol ötödik szénatomjához egy foszforsav kapcsolódik. A flavin-adenin-dinukleotid (FAD) egy adenilsavval kapcsolódó riboflavin-foszfát.
4. ábra: A B2-vitamin szerkezete
Megtalálható a tejben, májban, vesében, tojásban, azonban csak a tejben fordul elő szabadon a riboflavin, egyéb élelmiszerekben kötött formában, flavoproteinként. A riboflavin sok humán- és állatgyógyászati készítmény alkotóeleme, hiánya növekedészavart,
8
bőrgyulladást (dermatitis) és szemkárosodást okozhat, ezért javasolt vitaminban dúsított kenyér (B2, B1, nikotinsav) fogyasztása.
Előállítás: Kémiai szintézissel a teljes vitamin mennyiség 20%-át, vegyes kémiai és biológiai eljárásokkal 50%-át (glükózból Bacillus pumilus segítségével D-ribóz, mely felhasználható a vitaminszintézishez), míg fermentációs úton 30%-át állítják elő. Évente körülbelül 200 tonna B2-vitamint termelnek. Riboflavint viszonylag sok mikroorganizmus képes szintetizálni, közöttük több baktérium, fonalasgomba és élesztő, ipari alkalmazásban azonban két fonalasgombának van nagyobb jelentősége. Kezdetben Eremothecium ashbyii törzsekkel végezték a fermentációt, majd egy genetikailag stabilabb törzsre, az Ashbya gossypii törzsre dolgoztak ki fermentációs eljárást. Ezzel a törzzsel jelentős hozamok érhetőek el, azonban így is erőteljes versenyben áll a fermentációs vitamintermelés a kémiai szintézissel. Az
Ashbya
gossypii-vel
(NRRL
Y-1058
mutáns)
végrehajtott
fermentáció
körülményei: Szénforrásként alkalmazható kukoricalekvár (CSL) + pepton + szójaolaj, glükóz, inozit rátáplálással. Enyhe levegőztetés szükséges (0,3 vvm). A kívánt termék intracelluláris, ezért hőkezeléssel tárják fel a sejteket. A fermentációval 15 g/l vitaminkoncentráció érhető el. Fermentáció során alkalmazzák a Clostridium acetobutilicum (97 mg/l) törzset is, melyet Fe jelenléte akadályoz a vitamin termelésben (C. Weizmann Starub F. Brund), Eremothecium ashbyii (2500 mg/l), melyet a Fe nem akadályoz és Ashbya gossypii (6500 mg/l) melyet Fe jelenléte szintén nem akadályoz.
C-vitamin (L-aszkorbinsav) A vitamint Szent-Györgyi Albert izolált 1928-ban, majd munkásságát 1937-ben orvosi és élettani Nobel-díjjal ismerték el. A vízoldékony, erősen redukáló vegyület szervezetünkben rendkívül fontos antioxidáns, emellett számos reakciót segít elő különböző biokémiai folyamatokban.
9
5. ábra: Az L-aszkorbinsav szerkezete
Előállítása általában kémiai szintézissel történik, azonban biokonverziót is alkalmaznak, szorbit-szorbóz átalakítás során. (1923-ban sikerült Acetobacter suboxydans segítségéval D-szorbitolt L-szorbózzá alakítani [Kluyver, 1924], mely a későbbi aszkorbinsav szintézis kulcslépésévé vált [Reichstein, 1934].)
10
