5. ENZIMEK, KOENZIMEK, VITAMINOK
5.1. Enzimek
5.1.1. Az enzimek általános tulajdonságai Az enzimek a globuláris fehérjék körébe tartoznak. A szervezet folyamataiban fontos szerepet játszanak, mint biokatalizátorok. Feladatuk abban áll, hogy a sejtekben végbemenı biokémiai
reakciók
a
fiziológiai
körülmények
között
megfelelı
sebességgel
végbemehessenek. A katalitikus folyamat során a peptidláncban egymástól távoli aminosavrészek kerülnek olyan térhelyzetbe, hogy együttesen fejthetik ki hatásukat. A fehérje felületén egy olyan sajátos szerkezeti részlet alakul ki, amelyhez a szubsztrát molekula illeszkedik, és az enzimhez kapcsolódik. Ez a kötıhely. A kötıhely a molekulában lévı ún. katalitikus hellyel együtt, ahol lejátszódhat a katalitikus reakció, az enzim aktív centrumát képezi. A katalitikus helyen azok a funkciós csoportok találhatók, amelyek a szubsztrátum átalakításában közvetlenől részt vesznek. Az enzimek királis molekulák, képesek különbséget tenni enantiotóp csoportok és felületek között, mintegy 96-98%-os sztereoszelektivitással. Az enzimmőködés részletes folyamatát a tripszin és a kimotripszin-A példáján mutatjuk be (5.1. és 5.2. ábra). Mindkét enzim a szerinproteázok csoportjába tartozik. Nevük onnan ered, hogy egyrészt proteázok, mert polipeptidek, proteinek hidrolízisét katalizálják. Másrészt pedig azért különböztethetık meg a többi proteáztól, mert a katalitikus reakcióban a szerin aminosav oldallánca játszik döntı szerepet. Mindkét enzimben a katalitikus helyen a láncban egyébként távoli három aminosav a három-dimenziós szerkezetben térközeli helyzetbe kerül: az aszparaginsav (Asp-102), a hisztidin (His-57) és a szerin (Ser-195). Alapvetı különbség a két enzim között a kötıdési hely szerkezetében található. A tripszin elınyösen olyan peptidkötést bont, melynek szomszédságában bázikus oldalláncot tartalmazó aminosav, pl. lizin, vagy arginin helyezkedik el. Ekkor a kötıhely és a szubsztrát között Coulomb-féle ionos kölcsönhatások alakulnak ki. A kimotripszin-A esetében pedig az enzim felületén olyan zsebszerő képzıdmény keletkezik, mely hidrofób kölcsönhatás révén rögzíti a szubsztrátot: a kimotripszin-A így olyan peptidkötést bont,
101
melynek szomszédságában pl. fenilalanin van. Ez illeszkedhet a hidrofób falhoz az enzim felületén. A kötıdési hely szerkezetében található alapvetı különbség határozza meg a szerinproteázok specifikusságát. A két különbözı típusú kötıhely az alábbi ábrán látható:
5.1. Ábra. A tripszin és a kimotripszin-A kötıhelyének részlete. A katalitikus reakció mechanizmusát a kimotripszin-A példáján mutatjuk be (5.2. ábra).
5.1.2. A kimotripszin-A hatásmechanizmusa Szerkezete régóta ismert. 1964-ben Hartley megállapította az aminosav-sorrendet, a térszerkezetét Blow határozta meg 1967-ben. A kimotripszin-A a hasnyálmirigybıl kristályosan izolálható, mintegy 245 aminosavat tartalmazó fehérjebontó enzim. Három peptidláncból áll, melyeket diszulfán-kötések rögzítenek. Az aktív centrum részét itt is a Ser-195, a His-57 és az Asp-102 aminosavak alkotják. Proteináz és peptidáz (hidroláz) szerepe van: kedvezményezetten olyan helyeken bont, ahol a karboxilcsoport aromás aminosav része: pl. fenilalanin, tirozin. Az enzim felületén a szubsztrát kötıdési helye egyúttal a sztereospecifikusságot is meghatározza. Ha
D-aminosav
van jelen ebben a
helyzetben, az oldallánc „rossz” irányban, a zsebbel ellenkezı oldalon helyezkedik el. Ezért
102
a szerinproteázok
D-aminosavakat
nem hidrolizálnak. Észter-kötést is bontanak, észteráz
aktivitásuk is van. A peptidkötés hidrolízisének összegzett reakciója a következı:
O R C
+ H 2O
enzim
NH Q
O +
R C
H2N Q
OH
Az egyenletben R = az N-terminális, Q = a C-terminális peptid fragmens. Az aromás oldallánc szerepe, mint említettük, abban rejlik, hogy a kötıhelyen az aromás győrő a kötıhely hidrofób falához kapcsolódik. A folyamatot az 5.2. ábrán mutatjuk be. Az I-es képen a kiindulási állapotot tüntettük fel. A hidrolizálandó peptidkötést tartalmazó fehérje aromás győrőjével már a kötıhelyhez kapcsolódott nem kovalens kötéssel. Az enzim peptidláncában egymástól távol álló, de a térszerkezetben egymáshoz közel került három aminosav, melyeket már említettünk, így kifejtheti katalitikus hatását. A hisztidin imidazol-győrője egy proton-felvétellel és egy proton-vesztéssel járó lépésben vesz részt, és kialakul a II-es képen látható enzim-szubsztrát komplexben a nukleofil szerinoldallánc. Az alkoholát anion a peptid-karbonilcsoport szénatomja ellen intéz nukleofil támadást, melynek eredménye az un. elsı átmeneti állapot, vagy „tetrahedrális” (tetragonális) átmeneti állapot, amely a III-as képen látható. Ezután a proton a C-terminális fragmenshez kapcsolódik, mely a szén-nitrogén kötés hasadása után eltávozik. Az Nterminális rész észterkötéssel kapcsolódik az enzimhez és így kialakul a gyakran „acilenzim” intermediernek nevezett vegyület, melyben a szubsztrátot és az enzimet kovalens kötés köti össze (IV). A szerin tulajdonképpen alkoholízissel bontotta el az amid-kötést. A következı lépésben keletkezik az V acil-enzim-víz komplexnek nevezett struktúra, a hisztidin egy vízmolekulát deprotonál (V), és a keletkezett hidroxidion újabb nukleofil támadással az észter szénatomhoz kötıdik. Ez egy észter-hidrolízis kezdı lépése. Kialakul az un. második átmeneti állapot (VI), melynek stabilizálódása során a második peptidfragmens is szabaddá válik és eltávozik, miközben a proton a hisztidinrıl a szerin hidroxilcsoportjára vándorol. Visszajutunk a VII-es képen bemutatott alapállapothoz: az enzim készen áll a következı amid kötés hasítására. 103
I
II ENZIM
ENZIM CH2
Ser-195 CH2 O H N
O
CH C α
Ser-195 CH2 O
O
H
NH
H
C terminális
N
His-57
C terminális
Nterminális
CH C α NH
N
N
His-57
CH2
Nterminális
H O
O
O
O Asp -102
Asp -102
IV
III ENZIM
ENZIM O CH2
Ser-195
CH2 O H
C CH α NH
Nterminális
Ser-195 CH2 O N
N Cterminális
CH2
C
CH α
Nterminális
H NH
N
His-57
N
His-57
O
C terminális
H H
O
O
O
O Asp-102
Asp -102
V
VI ENZIM
ENZIM O CH2
Ser-195
C CH α
CH2 O N
Ser-195
CH2 O H
O
CH2
C
CH α
OH
N
H O H
N
His-57
Nterminális
N
His-57 H
O
O
O
Asp-102
OH Asp -102
5.2. Ábra. A kimotripszin-A hatásmechanizmusa.
104
Nterminális
(az 5.2. ábra folytatása)
VII ENZIM
CH2 Ser-195 CH2 O H N
O
CH C α
Nterminális
OH
N
His-57
H
O
O Asp -102
Fontosak a hisztidin reakciói. Ebben az imidazolgyőrő a fiziológiás pH-n könnyő protoncserét tesz lehetıvé, mivel konjugált savának a pKa értéke ∼ 6,2. Az imidazol erısen polarizálja a szerin hidroxilcsoportját, növeli ennek nukleofilitását. Minthogy a szerin hidroximetil-csoportja rendszerint nem túlságosan reaktív, a hisztidin imidazolgyőrőjének a szerin hidroxilcsoportján a negatív töltés kialakításában alapvetıen döntı szerepe van. Ez a protonátmenet valószínőtlen, azonban az aszparaginsav (Asp-102) negatív töltésével stabilizálni képes a hisztidin heterociklusos győrőjének protonálási folyamatát. Az enzim centrumában végeredményben két egymást követı katalitikus reakció játszódik le: egy bázis-katalizált átészterezés, majd egy bázis-katalizált alkoholízis, melyben bázisként a hisztidin szerepel. A kimotripszin-A reakciómechanizmusa jó példája az enzimek mőködésének. Látható, hogy az aktivált állapotok energetikai stabilizálása és a reaktánsok meghatározott, pontos térhelyzetben történı rögzítése mennyire fontos az aktiválási szabadenergia csökkentésében. Említettük, hogy a kimotripszin-A észterhidrolízist is katalizál. Az alábbi egyszerő példa jól bizonyítja a szerin szerepét. A trimetilecetsav-p-nitrofenil-észterét a kimotripszin A-val reagáltatva, a reakció során az oldatban a p-nitrofenolát anion szabadul fel, mely UV-spetroszkópiával jól követhetı. Ha ezután a reakcióelegybıl visszanyerjük az enzimet, azt tapasztalhatjuk, hogy 105
az elvesztette aktivitását akár amid-, akár észterhidrolízises reakciókra. Így, miután a trimetilacetil molekularész sem szabadult fel, gyanítható, hogy az enzim valamely elsırendő fontosságú funkciós csoportja acilezıdött, megszüntetve az aktivitást. Végül is röntgenvizsgálatokkal derült ki, hogy ez a szerkezeti rész pontosan a szerin-195 hidroxilcsoportja.
CH3 O H3C C C CH O
E(nzim) NO2
3
O +
E C
O
NO2
C(CH3)3
Ezt a tényt az a kísérleti tapasztalat is alátámasztotta, hogy az így inaktivált enzimet az erısen nukleofil hidroxilaminnal reagáltatva megkapták a trimetilecetsav hidroxámsavszármazékát, és ugyanakkor az ebben a reakcióban visszanyert enzim újra aktívnak bizonyult.
CH3 O H3C C C CH NH OH
O +
E C
H2N OH
E +
C(CH3)3
3
Másik lehetısége az enzim gátlásának a tetrahedrális köztiterméken alapul. Ezt támasztja alá a formilcsoport szerepe a gátlásban. Ez a gátló hatású aldehid polipeptidhez kötött, mégpedig oly módon, hogy a formilcsoport szomszédságában aromás győrő kell, hogy legyen. Az ilyen típusú vegyületek az aldehid-hidrát- ill. –acetál képzıdését használják fel a tetrahedrális állapot kialakítására, és így az enzim nem képes a valódi szubsztráttal kapcsolatba kerülni. O polipeptid
NH CH C H CH2
106
OH
OH
CH
C O Ser
OH
H
Az irreverzibilis, kovalensen kötıdı inhibitorok közül a foszfátokat említhetjük meg, melyek tipikusan kompetitív inhibitorok. Ilyenek a diizopropil-fluorofoszfát (DFP) és a szarin (harci gáz), melyek szintén a szerin hidroxilcsoportjához kapcsolódnak és azt blokkolják. Ezek a vegyületek minden olyan enzim inhibitorai, melyek az aktív helyen szerint tartalmaznak. Gátolják a szerin-proteázokat, így az acetilkolin-észterázt is, mely utóbbi idegi ingerület-átvitelben játszik fontos szerepet: az említett foszforvegyületekkel történı bénítása során az inhibíció az életfunkciók gyors összeomlását eredményezi. Felhasználási területük a rovarölık és ideggázok gyártása.
F O P O O diizopropil-fluorofoszfát (DFP)
F O P CH3 O szarin
5.2. Koenzimek Az enzimek nagy részénél a katalitikus funkciók mőködéséhez egy kisebb, nem fehérje természető molekulára is szükség van. Ez az un. koenzim, mely valamilyen módon kapcsolódik a fehérjéhez (az apoenzimhez) és így alakul ki a mőködésképes holoenzim. A koenzimek egy része nukleotid-származék, más része pedig a további fejezetben szereplı koenzim funkciójú vitamin.
5.2.1. Nikotinsav-amid tartalmú koenzimek Nikotinsav-amidot tartalmaz a nikotin-adenin-dinukleotid (NAD+) és 2’-foszfátja, a nikotin-adenin-dinukleotid-foszfát (NADP+).
107
NH2
4 H2NOC
N O N
O P O P O
O
1''
O OH
N
O 5'
N
O
O
1'
2'
OH
OH
N
OH
nikotin-adenin-dinukleotid NAD
4
H2NOC
NH2 N
O N
O P O P O
O
1''
O OH
N
O 5'
O
OH
N
O 2' OH
N 1'
O
O P O nikotin-adenin-dinukleotid-foszfát
O
NADP
5.3. Ábra. A NAD+ és a NADP+ szerkezete. Ezek a vegyületek voltaképpen pszeudonukleotidoknak is nevezhetık, hiszen tartalmaznak DNS-ben, RNS-ben elıforduló bázist, azonban a molekulákban található másik heterociklus nem sorolható a nukleinsav-bázisok körébe. (Az 5.3. ábrán kékkel jelöltük a nikotinamid-részt és pirossal a 2’-foszfát helyettesítıt.) Ezek a koenzimek oxidációs-redukciós folyamatokban vesznek részt, miközben hidrogént vesznek fel ill. adnak le. A redox folyamat végeredményben a piridin-győrőn játszódik le. A nitrogénatom pozitív töltése hatására a 4-es helyrıl elektronvándorlás indul meg a nitrogén irányába. Ennek következtében a 4-es hely felé hidridanion (két elektron és egy proton) intéz nukleofil támadást, mely eredményeképpen az aromás rendszer felbomlik, kinoidális szerkezet alakul ki és a hidrogén a 4-es szénatomhoz kapcsolódik.
108
pro-R H H H
O C
N
H NH2
H
H + 2e
C
+ H
H
H
NAD + H
NAD + AH2
O
N
NH2
H
NADH
A + NADH + H 5.4. Ábra.
A piridingyőrő szerepe a NAD+ redukciójában. Ilyen folyamat megy végbe pl. a májban az etil-alkohol acetaldehiddé történı oxidációjakor. Ennek a folyamatnak deutériummal jelzett vegyületek segítségével történt vizsgálata során megállapították, hogy az alkohol pirossal jelzett pro-S hidrogénje vándorol a piridingyőrőre és a folyamat az alábbi reakcióegyenlettel írható fel:
OH NAD +
CH3
C
H
O CH3 C
+ NADH + H
H
H
A NADH esetén a 4-es helyzető szénatomhoz kapcsolódó hidrogének nem ekvivalensek, hanem enantiotópok. Ezt példázza a piroszılısav tejsavvá történı redukciója is, mely a glikolízis során megy végbe. Ekkor a karbonil szénatomot mindig a pro-R hidrogén támadja. Így az enantiotóp felületet képezı karbonilcsoport szénatomját a tér olyan oldaláról éri a reagens (ebben az esetben a hidrogén) támadása, mely lehetıvé teszi a sztereospecifikus reakció végbemenetelét, vagyis azt, hogy a reakcióban ne racém, hanem L-tejsav
képzıdjön.
109
CH3
COOH
C O
HO C H L CH3
COOH
enzim NH3 O His H
N
O C
N H
O
H N NAD
CH3
O
H pro-R
C O Glu 5.5. Ábra.
A piroszılısav redukciója tejsavvá. Megemlítjük, hogy ebben a reakcióban a szubsztrátot ionos kölcsönhatások rögzítik a kötıhelyhez az enzim bázikus aminosav-oldalláncai segítségével, és a folyamatban fontos szerep jut a protoncserében szerepet játszó hisztidinnek (His), valamint a glutaminsavnak (Glu).
5.2.2. Flavin-adenin-dinukleotid Redox-folyamatok koenzimje a flavin-adenin-dinukleotid (FAD): A vegyület csak egy nukleinsav-bázist tartalmaz, ez az adenin, mely ribofuranóz és foszfátrészeken keresztől kapcsolódik az ábrán kékkel jelılt riboflavinhoz, mely a B2vitamin. A másik heterociklusos győrő az izoalloxazin, melynek alapja a pteridinváz. Ez utóbbi pirazin és pirimidin kondenzációjával írható fel az alábbi módon:
110
CH3
O
10 N
5
CH3 7
3 H N
4
6
2
9 N
N 1' 1 CH2 2'CH OH
8
O B2-vitamin: riboflavin
3' CH OH 4' CH OH 5'CH
NH2
2
N
N
O
O
O P O P O O
O
N
N
O adenozin-difoszfát OH
1 N
c
2
N 4 pirazin
4
3 b N
d 5
3
OH
7
2
a N1
6
6 pirimidin
8
9 N
5
N 10
7 6
8 N N 5
1 N
2 N3
4
pteridin = pirazino[2,3-d]pirimidin
H 1 N O 2 4 N 3 H
H N 9
N
N 3 H
N
O
O
O
alloxazin benzo[g]pteridin-2,4(1H,3H)-dion
izoalloxazin benzo[g]pteridin-2,4(3H,9H)-dion
5.6. Ábra.
A FAD szerkezete.
111
Külön figyelmet érdemel a cukorrész, mely a ribóz redukált alakja, a D-ribit(ol), mely a D- vagy L-ribóz redukciójakor keletkezik, optikailag inaktív cukoralkohol:
CH2 OH
CHO
CH2 OH
H
OH
H
OH
H C OH
H
OH
H
OH
H C OH
H
OH
H
OH
H C OH
CH2 OH
CH2 OH D-ribóz
CH2 OH D-ribit(ol)
A koenzim mőködésének mechanizmusát részletesen a vitaminok tárgyalásánál mutatjuk be.
5.2.3. A Koenzim-A szerkezete
Az egyik legismertebb koenzim a koenzim-A (CoA) (5.7. ábra). Tartalmaz egy adenin-tartalmú nukleotid részt. Az 1940-es években F. Lipmann izolálta, szintézisére 1959ben került sor (Khorana). A ribofuranozid-győrő a 3’-helyzetben foszforilezve van és az 5’helyzethez kapcsolódó két foszforsav-csoport köti össze a vitaminként is ismert pantoténsavval, amelyet a béltraktus baktériumai termelnek. A pantoténsav, melyet az ábrán kékkel
jelöltünk,
két
3,3-dimetilbutánsav,
és
3-aminopropionsav.
A
részbıl az
áll:
egy hidroxisavból,
aminosavaknál
pantoténsav
β-Ala
már
mely a
megismert
D-2,4-dihidroxi-
β-alaninból,
karbonilcsoportjához
mely a
kéntartalmú
amin
kapcsolódik: ez a ciszteamin, mely a ciszteinbıl vezethetı le (az ábrán narancssárga színnel jelölve). Fontos szerepe az acilcsoport szállítása, e szerepében legismertebb származéka az
acetil-koenzim-A (CoA-SAc). Ez a vegyület energiagazdag észter, így igen reakcióképes. A tiolésztert a kénatom molekulapályáinak az oxigénétıl eltérı tulajdonságai destabilizálják a csak oxigént tartalmazó észterekhez képest, ezért a tiolészter szabadenergiája a hidrolitikus folyamatokban megnı.
112
NH2 N
N
O O P O O
pantoténsav
O P O O
O C CH2
CH2
CH2
O
HN C CH C CH2
HN CH2
CH3
N
O
N
3' O
OH
O P O
OH CH3
O
ciszteamin koenzim-A
SH
NH2 N
N
O O P O O O P O O
O C CH2
CH2
HN
CH3
HN C CH C CH2 OH CH3
CH2
O
O
N
N
3' O
OH
O P O O
CH2 S C CH3 O acetil-koenzim-A 5.7. Ábra.
A koenzim-A és az acetil-koenzim-A szerkezete.
5.3. Vitaminok 5.3.1. A vitaminok általános tulajdonságai
Olyan szerves molekulák, melyeket a szervezet többnyire nem képes szintetizálni, és amelyekre azonban, ha kis mennyiségben is, de a biológiai folyamatokhoz alapvetıen szükségünk van. Ezek a vegyületek az élethez nélkülözhetetlen, esszenciális anyagok.
113
Elégtelen mennyíségük jellegzetes hiánybetegségeket okoz, pl. az elızıekben már megismert C-vitamin hiánya skorbutot, a D-vitamin hiánya az angolkórt. A farkasvakság az A-vitamin, különbözı ideggyulladások pedig D-vitaminok hiányára utalhatnak. A fenti problémák elsısorban a régebbi idıkben léptek fel, azonban ma is felelıssé tehetı néhány kórképben a vitaminhiány, pl. a C-vitamin hiánya szerepet játszhat a fogínyvérzések kialakulásában. Ezek a panaszok azonban a helyes táplálkozással gyakorlatilag megszüntethetık. Ha a vitaminhiány részleges, azaz a vitamin bevitele a szervezet igénye alatt marad, hipovitaminózisról beszélünk. Ezek a tünetek megfelelı mennyiségő vitamin szedésével
megszüntethetık. A teljes vitaminhiány, az avitaminózis, ma már nagyon ritka. Ez a tünetegyüttes azonban a fontosabb vitaminok teljes bevitele hiányában már irreverzibilis változásokat okozhat a szervezet mőködésében és így végzetes következményekkel járhat. Néhány vitamin, pl. az A- és D-vitaminok hatékony formája a szervezetben képzıdik és olyan receptorokon hatnak, melyeken a hormonok. A szervezetbe kerülı, több esetben kiindulási vegyületnek tekinthetı formát, melyet sokszor régebben a már aktív vitaminnak tekintettek, provitaminnak nevezzük. A szervezet a vitamin aktív formáját ezekbıl a vegyületekbıl képes szintetizálni. Ilyen pl. az A-vitamin esetén a β-karotin, vagy a D-vitaminok körében a még nem hidroxilezett, de már győrőfelnyílt struktúrák. Sok esetben a vitaminok a fejlıdésben is fontosak, gondoljunk csak a D2- és D3vitaminokra. Egyes vitaminok a szervezet káros anyagai elleni védekezésben játszanak jelentıs szerepet (A-, C- és E-vitaminok: un. gyökfogók). Ezek a káros anyagok többek között oxigén felhasználásával képzıdhetnek, ilyenek a hidroxil-, hidroperoxi- és peroxid-gyökök, melyek jelenlétének mutagén (a genetikai kódot megváltoztató), teratogén (magzatkárosító) ill. cancerogén (karcinogén: rákot okozó) hatás tulajdonítható. Ezeket figyelembe véve a vitaminok nemcsak a szervezet normális mőködéséhez szükségesek, hanem azért is, hogy a károsító anyagok hatására aktivizálódó kóros folyamatok ne léphessenek fel, ill. ezek hatását csökkentsék. Ezért hívjuk ezeket az anyagokat preventív (megelızı hatású) szereknek is.
114
5.3.2. A vitaminok csoportosítása
A vitaminok hagyományosan három nagy csoportba sorolhatók: a) vízoldható vitaminok (pl. a B-vitaminok), b) vízben nem, hanem zsírban oldódó vitaminok (pl. A-, D- E-, K-vitaminok), c) vitaminszerő anyagok (vitogének). A vízoldható vitaminok feleslege többnyire kiürül a vizelettel, azonban a zsíroldható vitaminok túladagolására ügyelni kell, mivel ezek a zsírszövetekben (mint látni fogjuk, szerkezetükbıl adódóan) elıszeretettel felhalmozódnak, és ezért nem ürülnek ki a szervezetbıl, kifejtve a szükségesnél több mennyiségben jelentkezı káros (!) hatásukat. A tipikus túladagolási jelenség a hipervitaminózis, D-vitaminok esetén pl. a kóros meszesedési folyamatok. A vízoldható vitaminok nagyobb része enzimek koenzimjének felépítésében vesz részt és így fejtik ki hatásukat, melyek részletes reakciómechanizmusát a következıkben ismertetni fogjuk. Az alábbiakban összefoglaljuk a vízoldható vitaminok néhány jellegzetes hiánybetegségét, koenzim formáját és legfontosabb biokémiai reakcióit. 1. B1-vitamin (tiamin): hiánya beri-berit okoz, koenzimje a tiamin-difoszfát (tiaminpirofoszfát, a továbbiakban: TPP), reakciója: C=O melletti C-C kötés létesítése és bontása, 2. B2-vitamin (riboflavin): hiánya dermatitiszt, növekedési problémákat okoz, koenzimje a FAD, reakciója: oxidációs-redukciós reakciók, hidrogéngyök és 1 vagy 2 elektrontranszfer, 3. Nikotinsavamid (B3-vitamin): hiánybetegsége a pellagra (gyomor-bél tünetekkel, bırés nyálkahártya-elváltozással, idegrendszeri tünetekkel járó betegség) és dermatitisz, koenzimje a NAD+, reakciója oxidációs-redukciós reakciók, hidridanion-transzfer, 4. Pantoténsav (B5-vitamin): hiányakor idegrendszeri problémák léphetnek fel, koenzimje a koenzim-A, reakciója: acetilcsoport szállítása, 5. B6-vitamincsoport
(piridoxin):
hiánya
idegrendszeri
megbetegedéseket
okoz,
koenzimje a piridoxál-foszfát, reakciói: transzaminálás, dekarboxilezés, izomerizáció, racemizálás,
115
6. liponsav: hiányára növekedési problémák vezethetık vissza, koenzimje a lipoamid, reakciója: oxidáció-redukció, hidrogén és acilcsoport átvitel, 7. Biotin (H-vitamin): hiánybetegsége a humán dermatitisz, koenzimje a biotin-karboxilszállító protein, reakciói: karboxilcsoport beépítése és szállítása, 8. Fólsav: hiánya anémiát (vérszegénység) okoz, koenzimje a tetrahidrofólsav, reakciója: egy szén-egység (metil-, hidroximetil-, formil- és metiléncsoport) átvitele, szállítása, 9. B12-vitamin:
hiánybetegsége a vészes
vérszegénység, koenzimjében adenozin
kapcsolódik hozzá (ld. ott), reakciói: kötéshasítások ill. átrendezıdések, 10. C-vitamin (aszkorbinsav): hiánya a legendás skorbut volt, ma több más káros anyag leküzdésében tulajdonítanak neki szerepet, reakciói: pl. hidroxilezés, gyökfogás.
5.3.3. Vízben oldható vitaminok 5.3.3.1. B1-vitamin
A B1-vitamint vagy tiamint 1912-ben Casimir Funk írta le, mint az élethez nélkülözhetetlen „vital amin”-t, és B-vitaminnak nevezte. A vegyület neve késıbb lett B1vitamin, amikor több nitrogént tartalmazó vízoldható vitamint is felfedeztek.
CH3
NH2 CH2
N H3C
N pirimidin
Cl
CH2 CH2 OH
N S
B1-vitamin : TIAMIN
tiazol (pKa : 2,4)
A vitamin két heterociklusos győrőbıl áll: helyettesített pirimidinbıl és tiazolból, melyeket a tiazol nitrogénjén keresztül metiléncsoport köt össze. Tiamin-pirofoszfát koenzim formájában az α-ketosavak (piroszılısav) oxidatív dekarboxilezésében játszik szerepet.
116
CH3
NH2 CH2
N
tiamin H3C ATP
N
AMP
O
O
CH2 CH2 O P O P O
N S
O
O
Cl koenzim forma : tiamin-pirofoszfát (TPP)
Korpában, gabonacsírában, élesztıben és nem utolsósorban a rizs héjában fordul elı. Tartalmazzák a bab, borsó és a kukorica is. Állati szövetekben, így a májban, szívben és vesében is megtalálható. Az erıs fızés roncsolja. Napi 1-3 mg szükséges a szervezet számára, de ez a mennyiség függ a táplálkozástól: szénhidrát-fogyasztás növeli, zsír-, fehérje- és alkoholfogyasztás csökkenti a szükségletet. Általában idegrendszeri károsodások kezelésére használják. Ilyen a polineuritisz (ideggyulladás), neuralgia (idegi fájdalom), isiász (ülıideg zsába) herpesz zoszter (övsömör), szklerózis multiplex (idegrendszeri kórfolyamat: az idegek velıs hüvelyének elvesztése), ill. alkoholizmus idegrendszeri következményei. Hiánybetegsége a beri-beri, melynek két változata ismert. A „száraz” változat tünetei az izomgyengeség, súlycsökkenés és idegrendszeri zavarok, míg a „nedves” beri-beri esetén ödéma, szívelégtelenség lép fel. Az ismertetett tüneteket végeredményben a piroszılısav felszaporodása okozza. Távol-Keleti betegség, a rizs hántolása okozta, hiszen ott ez a fı energiaforrás. A modern táplálkozás egyik forrása azonban a hántolatlan rizs, melynek fogyasztásával ezek a problémák elkerülhetık. Koenzimje a tiamin-pirofoszfát (TPP), mely a tiamin adenozin-trifoszfáttal (ATP) történı reakciójában keletkezik, eközben az ATP adenozin-monofoszfáttá (AMP) alakul. Reakciójában a tiazolgyőrő C-2 poziciója játszik döntı szerepet (5.8. ábra). A szomszédos elektronszívó csoport hatására a 2-es helyzető hidrogén protonként lehasad, és az így keletkezett tiamin-pirofoszfát (TPP) karbanion nukleofil támadást intéz a piroszılısav karbonilcsoportjának szénatomja ellen. Lejátszódik a nukleofil addíció, majd egy
protonfelvételt
követıen
dekarboxiláz
enzim
közremőködésével
a
vegyület
dekarboxilezıdik és kialakul az A közti termék.
117
OPP
O
-H
1 S
N 3
OPP
N
+
S
CH3
C C
2
O
H
piroszılısav
+H N
dekarboxiláz N
S
S C C
CH3
C C
N
-CO2
O
O O
O
OPP
OPP
OPP
CH3
O
CH3
O
OH
S C
+H
OH
A
OPP
OPP
-H N CH3
S
N
C OH
CH3
H
S
S S
+
(CH2 )4 COOH
C
OH B acil-anion szintézis-ekvivalens
"aciloil-tiamin"
liponsav
OPP CH3 CO S N CH3
S C S OH
-TPP
SH (CH2 )4 COOH
+ HS-CoA
S (CH2 )4 COOH SH
SH
+
CH3 CO S CoA
(CH2 )4 COOH dihidro-liponsav
5.8. Ábra.
A piroszılısav dekarboxilezésének mechanizmusa. Ebbıl protonfelvétellel az un. „aciloil-tiamin” keletkezik, mely protonleadás után a
B acil-anion szintézis-ekvivalenssé alakul (A és B egyébként a mezoméria viszonyában állnak). A B inverz polározottságú acetil-szinton (Umpolung!) ezután, mint nukleofil a
118
liponsav kénatomjára támad, a liponsav 1,2-ditiolángyőrője felnyílik és a vegyület a liponsav redukált (felnyílt) formájához kapcsolódik. A liponsav a szervezetben proteinhez kapcsolódik a proteinben található lizin aminosavon keresztül: ez a lipoxin. Errıl a továbbiakban a TPP lehasad, a dihidroliponsavhoz kötött acetilcsoport a CoA-ra kerül a dihidrolipoil-transzaciláz enzim segítségével. A reakció eredménye tehát acetil-koenzim-A és dihidroliponsav. Ez utóbbi FAD koenzim és dihidrolipoil-dehidrogenáz enzim közremőködésével visszaalakul liponsavvá és a keletkezett FADH2-t a NAD+ koenzim FAD-dá oxidálja. Így felírhatók ezek a részfolyamatok is:
dihidro-liponsav + FAD
dihidrolipoildehidrogenáz
FADH2 + NAD
liponsav + FADH2
FAD + NADH + H
A bemutatott reakciók a következıképpen összegezhetık:
CH3
C COOH +
HS
CoA + NAD
O
liponsav TPP FAD
AcS
CoA + NADH + H + CO 2
A folyamat során a piruvát dehidrogenáz ciklusról van szó: az oxidatív dekarboxilezéskor az energiadús tioészter, az acetil-CoA keletkezik (∆G‡ = -33,5 kJ/mol). A reakció lényege, hogy az umpolung segítségével az acilanion-ekvivalens a liponsav felhasználásával az acetil-CoA-t eredményezi. A folyamat jelentısége abban áll, hogy az acetil-koenzim-A, mely a citromsav-ciklus „üzemanyaga”, összeköti a glükóz- és a zsírsavmetabolizmust, a 2-oxoborostyánkısav (oxálacetát) citromsavvá alakulásához ezúton szolgáltatva az acetil-CoA-t.
119
GLÜKÓZ
ZSIRSAV-METABOLIZMUS
PIROSZİLİSAV
O C COOH CH2 COOH
ACETIL-KOENZIM-A
CH2 CO S KoA
AcS-CoA
CH2 COOH
HO C COOH
HO C COOH
CH2 COOH
oxál-ecetsav
CH2 COOH citromsav
citroil-koenzim-A
A fenti biokémiai folyamatból a szerves kémia, mint általánosítható umpolung reakciót, a Stetter-reakciót (5.9. ábra) használja 1,4-dikarbonilvegyületek elıállítására. OH NEt3
Br
N
OH
OH
S
Br
N
Ph
R-CHO
S
Br N Ph
Ph
R
S CH
O
OH O
Br N Ph
S
+
CH2
CH COOEt
R
C
OEt
O
C R
C
OH
5.9. Ábra.
A Stetter-reakció. Ez
a
reakció
jól
modellezi
a
tiaminból
keletkezı
acil-anion
szinton
reakcióképességét. A negatív polározottságú szénatom α,β-telítetlen észterekre intéz
120
nukleofil támadást a β-szénatomon keresztül, és az addíciós reakcióban a karbonilcsoportot páros helyzetben tartalmazó oxoésztereket kapunk.
5.3.3.2. B2-vitamin
A B2-vitamin, más néven riboflavin a FAD koenzim része, szerkezetével már ott találkoztunk. Növényekben, gombákban fordul elı és a májban is megtalálható. A bélbaktériumok szintetizálják. Hiánya dermatitiszt, vakságot és idegrendszeri problémákat okozhat. Nélkülözhetetlen a növekedésben. Hiányában a nyelv és az ajak duzzadása, súlyos béltünetek, fáradtság, a hemoglobinszint csökkenése is felléphet. Mőködésének alapja: oxidációs és redukciós reakciókban koenzimként funkcionál. A teljes reakció két hidrogénatom (két elektron és két proton) 1,4-addíciója. A reakció a pteridinvázas heterocikluson megy végbe, ahol R = a FAD koenzim tárgyalásánál már megismert oldallánc.
CH3
N 2 O
N 9
3 CH3
N
H
R
R
NH
2H -2H
4
CH3
N
1
N 2 O 3
CH3
N H
O sárga oxidált forma FAD
NH
4 O
szintelen redukált flavin FADH 2
Katalizátora a következı folyamatoknak: 1.) Részt vesz a triptofán oxidatív dekarboxilezésében, mely során indol-3-acetamid keletkezik: O2 CH2
C
H2O
O
COOH NH2
H2N H NH L- (vagy S) triptofán
triptofán-oxidáz-dekarboxiláz
NH indol-acetamid
121
2.) A xantin húgysavvá történı átalakításában. A húgysav volt az elsı, vizeletbıl izolált purinvázas vegyület, amelynek szerkezetét szintézissel is igazolták. O N
HN O
H2O2
H2O + O2
NH
HN xantin-oxigenáz
NH
NH
O
xantin
O
O NH
NH
húgysav
Másik funkciója az elektrontranszfer reakciók körébe tartozik. Elsı lépésben a 10-es helyzető nitrogénatom protonálódik, és a megfelelı konjugált sav keletkezik. Az így kialakult pozitív töltéső vegyület felírható egy másik mezomer határszerkezettel is.
R
R N 10 N H
N
O
N NH
N
NH
N H
O
O
O
e
R FADH2
H
N
N NH
N H
O
O
szemikinon 5.10. Ábra.
A FADH2 keletkezése FAD redukciójával. Egy elektron felvételével az un. szemikinon intermediert eredményezi. A páratlan elektront tartalmazó gyök egy hidrogénatomot vesz fel ez idáig nem teljesen tisztázott
122
folyamatban, és a FAD redukált formája, a FADH2 a reakciósor végeredménye. A folyamatot az 5.10. ábrán vázoltuk fel. 3.) A rendszer képes egyelektronos oxidációval a nem hemoglobinhoz kötött vas(II)-t vas(III)-má oxidálni:
FeII
FeIII
4.) Részt vesz kétszer egyelektronos redukcióban: az oxigént hidrogén-peroxiddá alakítja.
O2
2e
H O O H
Így oxidáz és dehidrogenáz reakciókban, pl. a NADH redukáló ágens és a Fe3+ egy elektronos oxidáló ágens között intermedierként funkcionál. Ez a szerepe a mitokondriális elektrontranszportban.
5.3.3.3. Pantoténsav A koenzim-A alkotórésze. B5-vitaminnak is nevezik. Két szerkezeti egységbıl tevıdik össze, egyik az ábrán lilával jelzett β-alanin, mely amidkötéssel kapcsolódik a dihidroxisavhoz. A koenzim-A felépítéséhez szükséges, szabályozza az élesztı növekedését. Bélbaktériumok is termelik.
β-Ala
H OH CH2OH HOOC CH2 CH2 NH C C C O H3C CH3 pantoténsav Hiánya az élı szervezetekben a növekedés és a szaporodás gátlását idézi elı. Az egészséges szervezet mindenféle sejtjében megtalálható. Gazdag forrása az élesztı, a máj és a tojássárgája, valamint a zöld növényi részek.
123
5.3.3.4. Niacinamid A niacinamid vagy B3-vitamin tulajdonképpen nikotinamid, a nikotin-adenindinukleotid (NAD+) és 2'-foszfátja a NADP+ koenzimek fontos része. A koenzimeknél már tisztáztuk az oxidációs és redukciós reakciókban betöltött szerepét. Sav formája a niacin, vagy nikotinsav.
CONH2 N nikotinsavamid : niacinamid
COOH N nikotinsav : niacin
A "vitamin" fogalomtól eltérıen az emberi szervezet képes szintetizálni a triptofánból B6-vitamin segítségével. Növényekben és állati szervezetekben is széleskörően megtalálható, így a rizskorpában, búzakorpában, élesztıben, májban, húsfélékben, vesében és a halakban (elsısorban a heringben). Hiánya elsısorban a nagyrészt kukorica alapú táplálékon élıkön mutatkozik. Fáradtság, gyomor-bélrendszeri zavarok, száj- és nyálkahártya gyulladások a tünetek. Fellép a pellagra két formája: érdes bır és fekete elszínezıdések a nyelven és a bırön, a nyelv dagadása, hasmenés, valamint idegrendszeri zavarok is észlelhetık. A tünetek a niacin vagy a niacinamid adagolására elmúlnak. Miután a biológiai rendszerekben a savamid (niacinamid) fordul elı, ezért ezt tekintik vitaminnak annak ellenére, hogy a sav (niacin) amidálása az állati szervezetben könnyen végbemenı folyamat.
5.3.3.5. B6-vitamincsoport Ebbe a csoportba a következı piridin-származékok tartoznak: Ide sorolható a piridoxál, mely a 4-es helyzetben könnyen karbonsavvá oxidálódható aldehid-csoportot tartalmaz, a piridoxin vagy piridoxol, az elıbbi alkohollá redukált formája, valamint a piridoxamin, amelyben aminometil-csoport a reakciókban résztvevı funkciós csoport. Mindhárom vegyület további fenolos hidroxil- ill. metilcsoport helyettesítıket tartalmaz. 124
CH2OH
CHO HO H3C
CH2OH
HO
CH2OH
H3C
N
CH2NH2 HO
N
H3C
Koenzimjeként
a
3-as
helyen
lévı
N piridoxamin
piridoxin vagy piridoxol
piridoxál
CH2OH
hidroximetil-csoport
alkoholos
hidroxilcsoportjának foszforilezett származéka, a piridoxál-foszfát szerepel.
CHO
CHO CH2OH
HO
ATP
HO
O CH2 O P OH OH
H3C
N
H3C
N
koenzim forma: piridoxál-foszfát Növényi magvakban fordul elı. Hiánybetegsége során, amely ritkán figyelhetı meg, bırelváltozások, vérszegénység, gyengeség, idegrendszeri bántalmak léphetnek fel. A szervezetnek általában kevés B6-vitaminra van szüksége, melyet a normális étrend többnyire fedez, azonban bizonyos gyógyszerek szedése növelheti az igényt. Ilyen például a tuberkulózis kezelésére használatos IZONIAZID, melynek szerkezete izonikotinsavhidrazid. A vegyület a piridoxál aldehidcsoportjával hidrazont képezve blokkolja a vitamint, mely ebben a formában nem képes a megfelelı biokémiai folyamatokban részt venni. Biokémiai reakciói során az aminosavak metabolizmusában vesz részt. A transzaminálás során oxosavakból aminosavak keletkeznek, a bemutatott példában glutaminsav és oxálecetsav reakciójában α-ketoglutársav és aszparaginsav keletkezik. A folyamatban a glutaminsav az amindonor aminosav, az oxálecetsav pedig az akceptor. A reakcióban a glutamin-aszparagin-transzamináz vagy aminotranszferáz enzim is részt vesz. A glutaminsav (vagy ahogy a biokémia tankönyvekben a fiziológiás körülmények között elıforduló anionos formáját helyesen emlegetik, a glutamát), mint az ammónia-asszimiláció
125
terméke kulcsszerepet játszik a transzaminálásban. Legtöbbször, de nem mindig, aminosav/ketosav párként a glutamát/α-oxoglutársav (vagy α-oxoglutarát; α-ketoglutarát) pár az aminotranszferázok szubsztrátja. Ugyanígy szerepel az aszpartát (aszparaginsav anionos formája) ill. az oxálacetát is ebben a rendszerben, valamint az alanin/piruvát (piroszılısav anionos formája) is. Az ezekhez az oxosav/aminosav párokhoz kapcsolódó enzimek fontosak a klinikai diagnosztikában. Ilyenek a humán megbetegedésekben jellemzı mértékő szérum glutamát-oxálacetát transzamináz (SGOT) és a szérum glutamát-piruvát transzamináz (SGPT) aktivitások. Ezek az enzimek, melyek nagy mennyiségben megtalálhatók a szív és a máj szöveteiben, a sejtek sérülése esetén, melyeket pl. a miokardiális infarktus ill. a fertızı májgyulladás, esetleg más szerv kóros állapota okoz, felszabadulnak a sejtbıl. Ezen enzimek aktivitásának mérése a vér szérumban felhasználható egyrészt a diagnózis felállításában, másfelıl pedig a beteg kezelés hatására történı reagálásának nyomon követésére is.
COOH
COOH
CH2 CH2 CH NH2 COOH glutaminsav (donor aminosav)
+
CH2
glutamin-aszparagin-transzamináz
COOH COOH
CH2
C O
CH2
COOH
C O
+
COOH oxálecetsav (akceptor)
α−keto-glutársav
CH2 CH NH2 COOH aszparaginsav
A következı katalizált reakció, a dekarboxilezés során aminosavakból aminok, mégpedig un. biogén aminok keletkeznek, melyeknek a szervezet mőködésében igen fontos szerepük van. A glutaminsav ezen az úton alakul át γ-aminovajsavvá a glutamindekarboxiláz enzim közremőködésével, mely aminovegyületet az angol elnevezése (γ-
aminobutyric acid) alapján GABA rövidítéssel használnak. A GABA rendkívül fontos idegi ingerületátvivı anyagként mőködik a szervezetben. Ebbe a folyamatba avatkozik be pl. a gyilkos galóca a mérgezés során.
126
COOH CH2 CH2 CH NH2 COOH
COOH glutamin-dekarboxiláz -CO2
CH2 CH2
(γ-amino-vajsav)
H C NH2 H GABA
Végül példaként megemlítjük az aminosavak izomerizációs ill. racemizációs reakcióit is, melyekben e vitamincsoportnak szintén szerepe van. A reakciók részletes mechanizmusát az 5.11. ábrán mutatjuk be. A piridoxál Schiff-bázist képez az apoenzim lizin aminosavjának ω-aminocsoportjával, ily módon kötıdve az enzimhez. A lizin helyére az átalakítandó aminosav addíciós-eliminációs reakcióval kerül át, szintén aldimint képezve. Az intermediert stabilizálja a fenolos hidroxilcsoport segítségével kialakult hidrogénhíd kötés. E forma stabilizálásában gyakran fémionok, pl. Al3+ és Cu2+ ionok is szerepet játszanak. Ezután a molekula kétféle köztitermékké alakulhat, attól függıen, hogy milyen folyamatot katalizál az összetett reakcióban résztvevı enzim. A protonálódott nitrogénatom irányába történı elektronáramlás hatására megtörtént dekarboxilezést követı protonfelvétel és az imin kötés hidrolízise a megfelelı biogén aminhoz vezet. Másfelıl a kiindulási aminosav-piridoxál Schiff-bázis protonvesztéssel az ábrán látható kinoidális intermedierré alakulhat át. Ekkor az aminosav α-szénatomja és az α-helyzető nitrogénatom között kettıs kötés jön létre. Ez a planáris szerkezet sztereotóp felületként szerepel a következı protonfelvétel során. A bekapcsolódó proton ugyanis a planáris struktúra két oldaláról közelítheti meg a támadás helyét. Amennyiben az enzimkomplexben van kitüntetett támadási iránya a reagensnek, esetünkben a hidrogénnek, úgy optikailag aktív aminosav keletkezik. Ha a reakció egyforma valószínőséggel játszódik le a sík mindkét oldala irányából, akkor racemizáció történik. Bár a piridoxál-foszfát ezekben a reakciókban koenzimként mőködik, a reaktív forma mégsem az aldehid, hanem inkább az aldimin struktúra, amely a vitamin és az átalakítandó aminosav között jön létre. Ha pl. az így keletkezett aldimin szén-nitrogén kettıs kötését (C=N) nátrium-tetrahidrido-boráttal (NaBH4) redukáljuk, az irreverzibilis változás következtében (eltőnik a kettıs kötéses planáris felület) a rendszer elveszti aktivitását, és alkalmatlanná válik aminosavak átalakítására.
127
O C
R
apoenzim
H C COO NH
(L)
N
R CH COO NH3
CH HO
N H
CH
O
CH2OP
CH2OP
LIZIN
H
H, H2O -CO2
CHO HO
N
enzim-Lys (Ad + E)
N
CH2 OP + N
-H
(dekarboxilezés) R CH2 NH2 (biogén amin)
H
R α COO C
R C COO N
N CH
HO
CH +H
CH2OP
(izomerizáció v. racemizáció)
N H
+ H2O
HO
CH2OP N H
(kinoidális intermedier) CHO CH2 OP
HO
+
(D)- vagy racém aminosav
N
5.11. Ábra. A B6-vitamin szerepe aminosavak dekarboxilezésében és izomerizációjában. A vitamin által katalizált reakciókba a transzaminálás is beletartozik. Ekkor a piridoxamin forma játszik fontos szerepet, melyben az aminofunkció adja az oxosavval történı kapcsolódás lehetıségét szintén imin formájában. Végeredményben ez a vitamincsoport mintegy 60 specifikus reakció katalízisében vesz részt. 128
5.3.3.6. Liponsav Hidrogénezési, dehidrogénezési folyamatok koenzimje. Az apoenzimhez történı kapcsolódása az oldalláncban elhelyezkedı karbonsav funkción keresztül történik lizin aminocsoportjával savamid formájában (lipoxin). Az ábrán az oxidált és a redukált formáját tüntettük fel.
COOH
S S
SH
liponsav
SH
COOH
dihidro-liponsav
Az emberi szervezet, eltérıen a többi vitamintól képes szintetizálni. A máj és az élesztı gazdag liponsavban, egyúttal néhány baktérium növekedési faktoraként is ismert. Szerepét az α-ketosavak dekarboxilezésében (acetilcsoport átvitel) már a tiamin tárgyalásakor bemutattuk.
5.3.3.7. Biotin A vitamint H-vitaminnak is nevezik, biotinként mégis jobban ismert. Fıleg az élesztıben és a májban fordul elı. Hiánya bırbetegséget okoz, ilyenkor gyulladásos pír lép fel az egész testen (dermatitisz: bırgyulladás), valamint hámlás, szırkihullás és körömsérülések is tapasztalhatók. Innen a H-vitamin név. Németül a bır ui. Haut. Biciklusos vegyület, telített imidazol és telített tiofén kondenzációjával vezethetı le. A győrőkapcsolat cisz-konfigurációjú, a sztereocentrumok 2S,3S,4R-konfigurációjúak. Jobbra forgató, optikailag aktív molekula. O 1' 3' HN 2' NH H
H 4 3 2 H 5 S 1 6
(+)-2S,3S,4R-biotin
COOH 10
129
5.12. Ábra. A biotin térbeli szerkezete. A biotin a tojásfehérje egyik összetevıjével, az avidin nevő fehérjével komplexet képez, így biológiailag inaktívvá válik: az avidin (mint bázikus protein) tehát erıs antagonistája a biotinnak (amely karboxilcsoportot tartalmaz). Pl. a sok madártejfogyasztás esetén biotinhiány léphet fel. A tojásfehérje leköti a biotint, azonban melegítés hatására, amikor denaturálódás következik be, a vegyület újra szabad állapotba kerül. A biotin a karboxilcsoportja segítségével protein lizin aminosav aminocsoportjához kötıdik peptidkötéssel, így a protein és a biotin proteidet alkot (lipoxin). Biokémiai funkciója karboxilcsoport bevitele (CO2 beépítése), a reakciót a biotinfüggı karboxiláz enzim katalizálja. A reakció mechanizmusa során a biotin molekulán elıször karboxilátcsoport épül az 1'-helyzetbe (5.13. ábra). Ennek forrása a széndioxid felvételével keletkezı hidrokarbonátion, valamint a folyamathoz adenozin-trifoszfát (ATP) is szükséges. A biotin 1'-helyzető nitrogénatom szabad elektronpárja irányából elektronátmenet indul a hidrokarbonát-ion karbonil szénatomja felé. Ebben a lépésben alakul ki a biotin-1-karboxilát, mely diacilaminként viselkedve erıs acilezıszer.
130
O
O O
C +
ATP O P OH
HO
HN +
O
NH
H
H H
OH S CO2
CO NH Lys protein
O OOC N
NH
H
+ ADP + P
H H S CO NH Lys protein
5.13. Ábra. A biotin karboxilezése. Ez utóbbi a megfelelı, koenzim-A-hoz kötött acilcsoporttal, az 5.14. ábrán R = H esetén acetil-koenzim-A-val reagál oly módon, hogy az acilcsoporton protonvesztéssel keletkezett karbanion nukleofil támadást intéz az N-karboxilát karbonil-helyettesítı szénatomja ellen. A folyamat a transzkarboxiláz enzim katalízisével megy végbe, a reakcióban pl. R = H esetén malonil-koenzim-A keletkezik. Ez utóbbi fontos szerepet játszik a zsírsavak metabolizmusában. A bruttó reakció szabadenergiája, ∆Go: -2,1 kJ/mol.
131
O
O C N O
+
R CH
H
C O
NH H H S
S CoA
CO NH
(R=H, acetil-koenzim-A)
Lys protein transzkarboxiláz
O +
R CH C S CoA
BIOTIN
C O
O
(R=H, malonil-koenzim-A) 5.14. Ábra. Karboxilcsoport bevitele biotin segítségével. Hasonló reakcióban az akceptor ketosav, így piroszılısav is lehet, ekkor oxálacetát képzıdik.
CH3 C O + H2O + CO2 + ATP COO piroszılısav
132
COO biotin
CH2 C O COO oxálacetát
+ ADP + P + H
5.3.3.8. Fólsav B10-vitaminnak is nevezik. Három fı részbıl áll, a 2-amino-4-hidroxi-6metilpteridinbıl, p-aminobenzoesavból és L-glutaminsavból.
fólsav
COOH CH2
7
CH2 H C NH C COOH
9 6 10 NH CH2
O
L-glutaminsav p-amino-benzoesav
8 N N 5
1 N 2 NH2 4 OH
N3
pteridin-komponens
A természetben elıforduló fólsav nemcsak egy glutaminsavat tartalmaz, hanem többet is. Ezek száma egymáshoz kapcsolódva 3-8 között van, vagy esetenként még több is. A glutaminsavak nem a szokásos peptid-kötéssel kapcsolódnak egymáshoz, hanem az αaminocsoport és a γ-karbonsav funkció között jön létre savamid-kötés. Ez a szerkezet valószínőleg azt a célt szolgálja, hogy a fólsav a sejtben maradhasson, miután a sejtbıl csak a fólsav monoglutamát formája képes kijutni. Koenzim formája a tetrahidrofólsav (H4F). A koenzim két lépésben alakul ki (5.15. ábra): a folát-reduktáz enzim elıször a fólsavat NADPH koenzim közremőködésével dihidrofólsavvá (H2F) alakítja, amely egy további redukciós lépésben alakul át a koenzimmé. Ebben a származékában a pteridin szerkezeti egység pirazingyőrője telített formában létezik. Növényi levelekbıl izolálható. Jelentıs mennyisége található az élesztıben, májban és a vesében. Baktériumok növekedéséhez szükséges, ezért baktériumok specifikus növekedési faktorának tekinthetı. Erre vezethetı vissza, hogy pl. a baktériumellenes hatású szulfonamidok, melyek a p-aminobenzamid résznek bioizosztér analogonjaiként léphetnek fel, gátolják a baktériumok növekedését és reprodukcióját. Voltaképpen a fólsav bioszintézise során a szulfonamid a p-aminobenzamid szerkezeti egység helyébe épül be, amely így már nem képes kifejteni a baktériumok fejlıdésében egyébként fontos szerepét.
133
COOH CH2
7
CH2
9 6 10 NH CH2
H C NH C COOH
O
L-glutaminsav p-amino-benzoesav
8 N
1 N 2 NH2
N 5
(NADPH)
4 OH
pteridin-komponens
COOH
H
CH2
H
N
H
CH2 H C NH C COOH
folát-reduktáz
N3
NH CH2
N
O
N
NH2 N
OH dihidro-fólsav (H2F)
COOH
H
CH2
H H
CH2 H C NH C COOH
NH CH2 H
O
N
N N
N H
NH2
OH
tetrahidro-fólsav (H4F)
5.15. Ábra. A tetrahidrofólsav kialakulása. Központi biokémiai funkciója egy szénegység átvitele (5.16. ábra). A folyamat során hangyasav, ATP és tetrahidrofólsav enzimkatalizált reakciójában elıször a 10-es helyzető nitrogénen formilezett származék keletkezik (N10-formil-H4F). A formilcsoportnak a pteridingyőrő 5-ös nitrogénjére történı győrőzárásakor a formil-vegyület 5 tagú, kondenzált győrőt alakít ki a pteridin-részhez kapcsolódva. Ez az N5,10-meteniltetrahidrofólsav. Az
N5,10-metenil-H4F a továbbiakban elıször metilén-származékká redukálódik a NADPH
134
koenzim segítségével. Az így keletkezett fólsav-származék metiléncsoport átvitelében játszik szerepet. További hasonló (NADPH) redukció győrőfelnyílással a pteridingyőrő 5-ös nitrogénjén metilcsoporttal szubsztituált tetrahidrofólsavhoz vezet (N5-metil-H4F), melynek a metilcsoport szállításában van jelentısége.
NH szintetáz
H4F + ATP + HCOOH
L-Glu
10 N CH2
C O
NH2 NH
NH
C O
N
+ Pi
O
H
+ ADP +
N10-formil-H4F
NH N CH2
N
NH2 NADPH
NH
N
L-Glu
C O
O
CH2
NH
N CH2 H
N
CH
N
NH2 NH
5 O
N5,10-metenil-H 4F
NADPH
NH
10 N CH2
N
NH2 NH
N O
CH3 N5-metil-H 4F
5.16. Ábra. Az N5-metiltetrahidrofólsav bioszintézise. Metiléncsoport átvitelére a glicinbıl történı szerin-bioszintézist említhetjük (5.17. ábra). A piridoxál-foszfáthoz Schiff-bázis formájában kapcsolódott glicin az N5,10-metilénH4F és szerin-hidroximetil-transzferáz enzim reakciója hatására átalakul, hidroximetilcsoport épül be a szerin α-szénatomjára A következı hidrolitikus lépésben a szerin és a piridoxál-foszfát szabaddá válik.
135
COO H2N CH2 COOH
CH
+ piridoxál-foszfát
N
Gly
CH HO
CH2OP NH
OOC CH CH2 OH
N5,10-metilén-H4F szerin-hidroximetil-transzferáz
N CH H2O
HO
CH2OP N H
HOOC CH CH2OH
+
piridoxál-foszfát
NH2 Ser
5.17. Ábra. Glicin átalakulása szerinné. A metilcsoport átvitelére példa a nukleinsavak körében a dezoxiuridilsav uracil bázisának metilezése az 5-ös helyzetben, mely reakció során dezoxitimidilsav keletkezik, valamint az aminosavak bioszintézisénél a homocisztein metioninná történı alakítása:
HOOC CH CH2 CH2 SH NH2 homocisztein
B12
HOOC CH CH2 CH2 S CH3 NH2 metionin
Mindkét esetben a metilcsoport átvitelében az N5-metiltetrahidrofólsav játszik jelentıs szerepet.
136
5.3.3.9. B12-vitamin Szerkezete hasonlóságot mutat a porfirinvázzal (5.18. ábra).
NH2 O O
Me
H2N
H
Me
NH2
H
H2N
CN
O Me H2N
N Me H
O
N
Me Me
N
korrin-váz
H
H Me
NH
Me
N
Me
O H
Co
O
H
O
HO
O Me
N
5,6-dimetil-benzimidazol
P
O O
NH2
N
O
O CH2OH
H
Me
α-ribofuranozid
5.18. Ábra. A B12-vitamin szerkezete. Központi részét négy pirrolgyőrőbıl álló rendszer képezi, mely azonban a porfirinváztól eltérıen nem alkot delokalizált planáris struktúrát. Ez a korrinváz. Központi atomja a kobalt, amely heterociklusos bázishoz, az 5,6-dimetilbenzimidazolhoz kötıdik. A hatodik koordinációs kötést a cianidion foglalja el, ez azonban az izolálás során került oda. Ezen a részen a vitamin a szövetekben vizet (akvakobalamin), vagy hidroxidiont (hidroxokobalamin) tartalmaz. Szerkezetét totálszintézis segítségével állapították meg. Koenzimjében a cianocsoport helyett adenozin ribofuranóz molekulájának 5'-helyzető szénatomja kapcsolódik a kobalthoz.
137
Állati szervezetekben, fıleg a májban, húsban, tojásban és tejben, valamint mikroorganizmusokban található. Csak mikroorganizmusok szintetizálják. Növényekben nem fordul elı, amire ügyelniük kell a vegetáriánusoknak. Hiánya vészes vérszegénységet okoz. Felszívódása a gyomor nyálkahártyája segítségével történik, ez glikoproteint választ ki ("intrinsic factor"), amely megköti a vitamint és megvédi az elbomlástól. Éppen ezért hiányát a felszívódás zavarai is okozhatják. A vérben a transzkobalamin nevő speciális fehérjéhez kötıdik, és a szervezet a májban tárolja. Biokémiai szerepe a metabolizmusban sokrétő. Részt vesz átrendezıdésekben (mutázok), kötések hasításában, szén-szén kötés hasításában, pl.:
COO
COO
H3C C H
CH2
CO SCoA
CH2
CO SCoA
L-metil-malonil-koenzim-A
szukcinil-koenzim-A
Szén-nitrogén-kötés hasításában, pl. a lizin metabolizmusában:
CH2CH2CH2CH2 CH COOH NH2
D-α−lizin-mutáz
CH3
NH2
CH CH2CH2 CH COOH NH2
NH2
Koenzimként szerepet játszik metilcsoport aktiválásában, így a metildonor N5-metiltetrahidrofólsavval együtt a homocisztein metioninná történı átalakításában. A szén-oxigén kötés hasításában is részt vesz, ez a folyamat tulajdonképpen átrendezıdésnek tekinthetı:
CH3
CH CH2
diol-dehidráz
O CH3
CH2 C
H
OH OH
Szerepe van ezen kívől a ribonukleotidok dezoxiribonukleotidokká történı redukciós átalakulásában is (ribonukleotid reduktáz).
138
5.3.4. Zsírban oldódó vitaminok A továbbiakban a zsíroldható vitaminok közül az E- és K-vitaminokat mutatjuk be, az A- és D-vitaminok az elızı fejezetekben már ismertetésre kerültek.
5.3.4.1. Az E-vitamin Az
E-vitamin,
más
néven
α-tokoferol,
fenolos
hidroxilcsoporttal
és
metilcsoportokkal helyettesített benzopirángyőrőt, valamint alifás, apoláris és így hidrofób, vagyis lipofil oldalláncot tartalmaz. Az oldalláncban az aszimmetrikus szénatomok (R)konfigurációjúak. Növényi olajokban (pl. búzacsíraolajban) fordul elı.
H3C
CH3 8 7
HO 6
1 O
CH3 CH3 CH3 CH3 R 2 (CH2)3 CH (CH2)3 CH (CH2)3 CH CH3 3 R R 4
5 CH3 benzopirán
E-vitamin: α-tokoferol (α-TH)
Hiánya jellegzetes tüneteket okozhat a reprodukciós képesség csökkenésében, valamint izomsorvadás léphet fel. A hormontermelı mirigyek tevékenysége is kórosan megváltozik. Természetes táplálkozás esetén azonban a vitaminhiány kialakulása meglehetısen ritkán fordul elı. Az α-tokoferolban a győrőn lévı metilcsoportok az 5-, 7- és 8-as helyzető szénatomokhoz kapcsolódnak. Más tokoferolok is ismertek, így a β-tokoferol, melyben két metilcsoport található az 5-ös és 8-as helyeken, a γ-tokoferol, melynek 7,8-dimetilszubsztituált benzopirán az alapváza. A δ-tokoferol csak egy metilcsoportot tartalmaz, a 8-as helyen. Természetesen a 6-os helyzető fenolos hidroxilcsoport és a terpenoid jellegő oldallánc mindegyik változatban megtalálható. Erıs antioxidáns, képes szabad gyökök „megfogására”, azaz redukciójára. Ebben jelentıs szerepe van a fenolos hidroxi-szubsztituensnek. A molekula tulajdonképpen győrőbe zárt hidrokinonnak tekinthetı, és mint ezt az 5.19. ábrán látható részletes
139
reakciómechanizmus is mutatja, a vegyület a szabad gyökök redukciója folyamán kinonná oxidálódik.
H3C
CH3 8 7
HO 6
1 O
CH3 CH3 CH3 CH3 R 2 (CH2)3 CH (CH2)3 CH (CH2)3 CH CH3 3 R R 4
-H
5 CH3 benzopirán α-tokoferol (α-TH)
CH3 H3C
O
CH3
CH3 -H , -H
R
H3C
+H2O
O
O
CH3 R
O
CH3 α-TH (R=fenti oldallánc) CH3 H3C
O
OH CH3 R
O CH3 α-tokoferol-kinon
5.19. Ábra. Az E-vitamin oxidációja α-tokoferol-kinonná. A különbözı helyeken metilcsoportokkal helyettesített vegyületekben a metilhelyettesítık a hidrokinonnak megfelelı forma elektródpotenciálját befolyásolják, amely hatással van az illetı tokoferol-származék redukciós készségére. A reakció során elsı lépésben az α-tokoferol (α-TH) hidrogénatomot veszít, mely lezárhatja egy szabad gyök lánc végét, pl. peroxidgyököt hidroperoxid-csoporttá alakítva. Az
140
így keletkezett tokoferol-gyök ezután újabb hidrogénatomot és protont veszítve vízzel reagál. Az aromás rendszer megbomlik, a benzopirángyőrő felnyílik és kialakul a stabilis αtokoferol-kinon. Ez az útja annak, hogy az elsı lépésben keletkezett tokoferol-gyök stabilizálódhat. A vegyületnek fontos szerepe van többszörösen telítetlen zsírsavak peroxidációjának gátlásában. Ismeretes, hogy a membrán lipidek részét alkotó többszörösen telítetlen zsírsavak kettıs kötései között metiléncsoportok találhatók. A következı ábrán a lipidnek ezt a kis részletét rajzoltuk fel, ahol L a lipidet jelenti, vagyis az LH képlettel azt a hidrogént is jelöljük, amely gyökösen lehasadhat az oxidációs folyamat során. A lipid-peroxidok újabb lipidekkel reagálva lipidgyököket hozhatnak létre. Mind ez utóbbiak, mind pedig a peroxidgyökök az α-tokoferollal történı reakcióban semleges molekulákká alakulnak:
LH (L=lipid) H H L LOO + LH LOO + α−ΤΗ L + α−ΤΗ
LOOH LOOH + α−Τ LH + α−Τ
A fenti ábrán vázoltuk fel a folyamatot, melynek során a keletkezett tokoferolgyökök az elıbbi mechanizmus szerint kinonná stabilizálódnak. Az emellett keletkezı hidroperoxidcsoport hidroxilcsoporttá történı redukcióját a glutation végzi glutation-peroxidáz enzim katalízisével, így a láncok lezáródhatnak. (Megjegyezzük, hogy hasonló hatású a szelén is.)
5.3.4.2. K-vitaminok A K1-vitamin vagy fillokinon növényekben (spenótban, káposztában, általában a zöld levelekben) található:
141
O CH3 CH2
(
CH2CH2 CH CH2)3
H
O 2-metil-1,4-naftokinon K1-vitamin: fillokinon Fı része 2-metil-1,4-naftokinon, melyhez apoláris oldallánc kapcsolódik egy telítetlen kötéssel, amely egy izoprén egység része. A K2-vitamin, más néven menakinon, mely a bélben, illetve baktériumokban található, hasonló szerkezető. Ekkor azonban a naftokinon-győrőhöz kapcsolódó oldallánc izoprén-egységekbıl áll.
O CH3
n=6-9
( CH2 CH C CH2 )n H O K2-vitamin: menakinon Az apoláris oldallánc biztosítja a vegyületek zsíroldhatóságát. A K-vitamin szükséges faktora a véralvadásnak, illetve néhány faktorának (II, VII—X), és hiánya vérzékenységet okoz. Bizonyos antibiotikumok hatására mennyiségük csökkenhet. Ilyenkor csökkenhet a véralvadáshoz szükséges idıtartam. Éppen ezért e gyógyszerek szedésénél erre ügyelni kell. Szerepére az 5.20. ábrán bemutatott folyamat írható fel.
142
OH protein
O2
+
protein
+
H2O +
R OH
CH2
CH2
KH2 (R=apoláris oldallánc)
CH2 COO
O +
CH COO
γ-glutamil-karboxiláz CO2 O R
O protein
K-vitamin epoxid
CH2 CH COO COO
a Ca2+ ion kötı oldala
5.20. Ábra.
A Ca2+ kötı oldal kialakulása K-vitamin segítségével. A protrombin nevő fehérje N-terminális aminocsoportja mellett glutaminsav található. A K-vitamin elısegíti ennek acilezését oly módon, hogy a reakció eredményeképpen a protrombin Ca2+ iont köthessen meg. Ez az elıfeltétele a protrombin → trombin átmenetnek. Ezt követi a fibrinogén fibrinné történı átalakulása és megkezdıdhet a vérlemezkék kicsapódása, a véralvadás folyamata. Az itt leírt igen vázlatos folyamatot a következı reakciók indítják meg. A K-vitamin elıször a NADH koenzim segítségével a redukált származékává (KH2) alakul. Ezután a protein-glutaminsavnak a karboxilcsoporttal szomszédos szénatomjáról a K-vitamin redukált formájával (KH2) történt reakciójában és oxigén felhasználásával protonvesztéssel karbanion keletkezik, valamint a K-vitamin epoxidja. Az így keletkezett karbanion széndioxiddal a γ-glutamil-karboxiláz enzim
143
katalizálta reakcióban alakul át olyan származékká, mely már két ionizált karboxilcsoportot tartalmaz. Ez a szerkezeti részlet már alkalmas kálciumion megkötésére, ezen az úton alakul ki a Ca2+ ion kötı oldala.
5.3.5. Vitaminszerő anyagok: az ubikinon Ebbe a csoportba sorolhatók a már érintılegesen tárgyalt inozit, kolin, karnitin (a zsírsav transzportját segítı enzim része), „p-aminobenzoát” és ubikinon. Közülük az ubikinont tárgyaljuk. Ezt a kinonokhoz tartozó vitaminnak is tekinthetı vegyületet a mitokondrium tartalmazza:
O CH3O
CH3 CH3 ( CH2 CH C CH2 )n H
CH3O O
A vegyület kinon, melyhez izoprenoid típusú oldallánc kapcsolódik. Baktériumokban az ubikinon 6 izoprénegységet tartalmaz (n=6), míg állati szövetekben n=10, vagyis az oldallánc tíz izoprén egységbıl áll, ez utóbbit nevezik néha koenzim-Q10-nek vagy Q10-nek. Ez a vegyület is zsíroldható, az apoláris oldalláncának köszönhetıen. Fontos szerepe van a sejtlégzésben és az elektron-transzportban. Ennek folyamán az ubikinon
elıször
elektron-felvételével
gyökanionná
alakul,
melyet
szabad
gyök
intermediernek neveznek, majd ez utóbbi protont vesz fel. Ez a lépés az un. protonált szabad gyökhöz vezet. Ezt újra egy elektron, majd egy proton felvétele követi, melynek során az ubikinon redukált, hidrokinon formája keletkezik (5.21. ábra).
144
1 R
O
O
3 R
2 R
R
R1
+e
R
2 R
4
O
3
1 R
+H
2 R
4 R
O szabad gyök intermedier
1 R
OH
2 R
+H
4 R
1 R
3 R
2 R
4 R
O
R3
+e
4 R
O protonált szabadgyök
OH R3
OH
R1=R2= CH3O, R3= CH3, R4= izoprenoid oldallánc
OH hidrokinon
5.21. Ábra.
Az ubikinon redukciójának mechanizmusa. Az oxidációs-redukciós folyamatokban újabb kutatások eredményei szerint szemikinon intermedier is jelentıs szerepet játszik.
O CH3O
CH3 R = a fenti oldallánc
CH3O
R OH
szemikinon intermedier
Az ubikinon egy- és kételektronos reakciókban vesz részt. Egyelektronos folyamatban a szemikinon keletkezik. Reakcióiban jelentıs szerepe van a citokrómoknak. Végeredményben megfelelı közbensı struktúrát jelent a két elektront szállító flavinkoenzim és az egy elektront hordozó citokrómok számára.
145
146
