VARIASI GEN lrRNA LEBAH MADU Apis cerana DI LOMBOK, SUMBAWA, DAN FLORES
INDRA ANGGRIAWAN
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ABSTRAK INDRA ANGGRIAWAN. Variasi Gen Large Ribosomal RNA (lrRNA) Lebah Madu Apis cerana di Lombok, Sumbawa, dan Flores. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA. Lebah madu Apis cerana merupakan lebah lokal Asia dengan persebaran yang sangat luas. Belum lengkapnya data genetika A. cerana menjadi dasar utama penelitian ini. Tujuan penelitian ini untuk mempelajari variasi genetika A. cerana berdasarkan lrRNA/DraI dan analisis filogenetik antara A. cerana di Indonesia dan Thailand. Koleksi A. c. indica dilakukan di Lombok, Sumbawa, dan Flores. Analisis homologi dilakukan dengan A. cerana dari Thailand (AF140508; AF140509; dan AF140511), serta haplotipe A. cerana dari Pati dan Lombok (AcPt1 dan AcLb4). Jumlah koloni yang diperoleh masing-masing 22, 3, dan 4 koloni untuk Lombok, Sumbawa, dan Flores. Ukuran nukleotida gen lrRNA yang diamplifikasi berkisar antara 625-629 pb dengan basa AT sekitar 88.90%. Berdasarkan analisis lrRNA/DraI, ditemukan dua haplotipe yaitu haplotipe A dan C. Persentase haplotipe A sebesar 72.72, 100, dan 50%, berturut-turut untuk populasi A. c. indica di Lombok, Sumbawa, dan Flores. Persentase haplotipe C sebesar 27.28 dan 50% untuk A. c. indica di Lombok dan Flores. Analisis filogenetik berdasarkan gen lrRNA menggunakan Maximum Parsimony menunjukkan bahwa populasi lebah di Thailand membentuk kelompok yang terpisah dengan A. cerana di Indonesia. Jarak genetik terbesar (3.53%) terjadi antara AF140508 dan AcLb4. Sedangkan nilai jarak genetik terkecil (0.00%) terjadi antara AcPt1 dan AcSbw5. Nilai transisi/transversi (ts/tv) >1 adalah 66.67% dan ts/tv <1 adalah 26.67%.
ABSTRACT INDRA ANGGRIAWAN. Variation of large ribosomal RNA (lrRNA) gene of Honey Bee Apis cerana from Lombok, Sumbawa, and Flores. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA. Apis cerana is a native, wide distribution honey bee in Asia and lack of its genetic data in Indonesia. Hence, the purposes of this research were to explore the genetic variations of A. cerana based on lrRNA digested by DraI (lrRNA/DraI) and performed a phylogenetic analysis with A. cerana from Thailand. Apis cerana were collected from Lombok, Sumbawa, and Flores. DNA homology analysis were carried out with A. cerana from Thailand (AF140508, AF140509, and AF140511), and from Pati and Lombok (AcPt1 and AcLb4). A total of 22, 3, and 4 collonies of A. cerana were collected from Lombok, Sumbawa, and Flores, respectively. The nucleotide sequence of lrRNA were AT-rich (88.90%), ranged from 625 up to 629 bp. There were two haplotypes, haplotype A and C, based on lrRNA/DraI analysis. The A haplotype were 72.72, 100, and 50 %, respectively for A. c. indica from Lombok, Sumbawa, and Flores. The C haplotype were 27.28 and 50%, respectively from Lombok and Flores. Phylogenetic analysis by using maximum parsimony method, showed that A. cerana from Thailand clustered separately with those of Indonesian A. cerana. The highest genetic distance (3.53%) occured between AF140508 and AcLb4. The shortest genetic distance (0.00%) was between AcPt1 and AcSbw5. Transition/transvertion (ts/tv) value >1 were 66.67% and ts/tv <1 were 26.67%.
VARIASI GEN lrRNA LEBAH MADU Apis cerana DI LOMBOK, SUMBAWA, DAN FLORES
INDRA ANGGRIAWAN
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2008
Judul : Variasi Gen lrRNA Lebah Madu Apis cerana di Lombok, Sumbawa, dan Flores Nama : Indra Anggriawan NIM : G34103075
Menyetujui :
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si NIP. 131999583
Drs. M. Chandra Widjaja, MM NIP. 080057508
Mengetahui : Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Drh. Hasim, DEA NIP. 131578806
Tanggal Lulus :
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 19 Desember 1984 sebagai putra kedua dari pasangan Sudiono dan Titin. Pendidikan yang telah ditempuh oleh penulis yaitu pendidikan dasar di SDN 04 Lubang Buaya pada tahun 1997, pendidikan menengah pertama di SLTPN 81 Lubang Buaya pada tahun 2000, dan pendidikan menengah atas di SMUN 48 Pinang Ranti pada tahun 2003. Penulis kemudian melanjutkan pendidikannya di Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Selama berkuliah di Departemen Biologi, penulis menjadi asisten untuk mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan Bersama (Bio-TPB), Perkembangan Hewan, Biologi Sel dan Molekuler, dan Avertebrata pada tahun ajaran 2006-2007. Penulis juga menjadi asisten untuk mata kuliah Bio-TPB, Studi Lapang, dan Vertebrata pada tahun ajaran 2007-2008. Selain itu penulis juga aktif di organisasi kemahasiswaan Biologi (HIMABIO). Pada tahun 2004-2005, penulis menjadi ketua bagian Nata Bioworld dan ketua bidang eksplorasi alam. Pada tahun 2005, penulis melakukan studi lapang di Taman Wisata Alam (TWA) Situ Gunung mengenai keragaman semut di TWA Situ Gunung. Pada tahun berikutnya, penulis melakukan praktek lapang mengenai perawatan dan pemeliharaan Macaca fascicularis di Pusat Penyelamatan Satwa Cikananga (PPSC) Sukabumi. Pada tahun 2007 penulis melakukan ekspedisi lebah Apis cerana dan A. dorsata di Lombok dan Sumbawa. Ekspedisi tersebut bekerja sama dengan Universitas Mataram (Program Studi Biologi), Dinas Kehutanan (Dishut) Nusa Tenggara Barat (NTB), Rajawali Citra Televisi Indonesia (RCTI) Lombok, dan kelompok tani madu di Lombok dan Sumbawa. Ekspedisi dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan, Departemen Pendidikan Nasional, atas nama Rika Raffiudin dengan judul Diferensiasi DNA Mitokondria Lebah Madu Apis cerana di Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Pada tahun yang sama, penulis juga mengikuti seminar Biologi Internasional di Universitas Gadjah Mada Jogjakarta (Advance in Biological Sciences: Contribution Toward a Better Human Prosperity, Jogjakarta, 7-8 September 2007) sebagai peserta poster, dengan judul poster Nest Characteristics of Honey Bee in Sumbawa Island.
PRAKATA Alhamdulillah, puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM atas bimbingan dan dukungannya, serta kritik dan sarannya sehingga karya ilmiah ini menjadi lebih baik lagi, dan kepada Nina Ratna Djuita, M.Si, selaku penguji atas kritik dan saran terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih penulis ucapkan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) atas dana penelitian tahun 2007 (dibiayai oleh Direktorat Jenderal Pendidikan, Departemen Pendidikan Nasional, Surat Perjanjian No.: 317/SP3/PP/DP2M/II/2006 tanggal: 1 Februari 2006 DIREKTORAT JENDERAL PENDIDIKAN TINGGI DEPARTEMEN PENDIDIKAN NASIONAL) atas nama Rika Raffiudin dengan judul Diferensiasi DNA Mitokondria Lebah Madu Apis Cerana di Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Achmad Farajallah, Bapak Tri Heru W, Bapak Tri Atmowidi, Ibu Taruni Sri P, dan Ibu Dyah Perwitasari atas segala saran, ilmu, dan nasihat yang telah diberikan. Terima kasih kepada Pak Adi, Mba Tini, Pak Wandia, Mba Zul, dan Ani atas bantuannya selama di Laboratorium. Terima kasih kepada Sinyo dan keluarga, team eksplorasi lebah Lombok (Adi dan Dedi (mahasiswa Biologi Universitas Mataram), Sumbawa (Dinas Kehutanan (Dishut) Nusa Tenggara Barat (NTB), Rajawali Citra Televisi Indonesia (RCTI) Lombok, Asrul (mahasiswa Biologi Universitas Mataram), dan kelompok tani madu Abadi), Dompu-Bima (Pak Syam, Pak Azis, dan Mas Bambang), dan Flores (Taman Nasional Kelimutu). Kepada Nico, Lusi, Wildan, Citra, Rut, Gita, Oci, Wafa, Carwan, Dian, Muley, Rini, Femi, dan Sri Maria U, serta seluruh teman-teman Biologi atas dukungan dan motivasi yang telah diberikan. Terima kasih penulis haturkan kepada keluarga tercinta atas semua dukungan dan doa yang telah diberikan.
Bogor, Januari 2008
Indra Anggriawan
DAFTAR ISI Halaman
vi DAFTAR TABEL .......................................................................................................................VI vi DAFTAR GAMBAR ...................................................................................................................VI DAFTAR LAMPIRAN ...............................................................................................................VI vi PENDAHULUAN ......................................................................................................................... 1 METODE ...................................................................................................................................... 1 PENELITIAN OBJEK Objek Penelitian .…….............................................................................................................. 1 Koleksi K OLEKSILebah LEBAH.. ........................................................................................................................ 1 EKSTRAKSI DNA Ekstraksi DNA …....................................................................................................................... 2 AMPLIFIKASIDNA DNA… .................................................................................................................... 2 Amplifikasi E LEKTROFORESIS DNA Elektroforesis DNA ….............................................................................................................. 2 V ISUALISASI DNA…. ..................................................................................................................... 2 Visualisasi DNA A NALISISPCR-RFLP PCR-RFLP.................................................................................................................. 3 Analisis PPengurutan ENGURUTAN (SEQUENCING DAN ANALISIS HOMOLOGI (ALIGNMENT ) DNA ............................ 3 (Sequence) dan )Analisis Homologi (Alignment) DNA ………..... A NALISISFilogenetik POHON FILOGENI Analisis ..……........................................................................................................ 3 HASIL ........................................................................................................................................... 4 KOLEKSILebah LEBAH.. ........................................................................................................................ 4 Koleksi EKSTRAKSI DAN AMPLIFIKASI DNA........................................................................................... 4 Ekstraksi dan Amplifikasi DNA …. ANALISISPCR-RFLP PCR-RFLP.................................................................................................................. 5 Analisis PENGURUTAN (SEQUENCE ) DNA Pengurutan (Sequence) DNA …............................................................................................... 6 ANALISISHomologi HOMOLOGI (ALIGNMENT ) DNA Analisis (Alignment) DNA …................................................................................... 7 ANALISISFilogenetik FILOGENI A. Analisis A.CERANA cerana .................................................................................................. 7 PEMBAHASAN ......................................................................................................................... 10 DISTRIBUSIA.A.cerana CERANA ............................................................................................................ 10 Distribusi …. ANALISISKeragaman KERAGAMAN GENETIK LRRNA DAN1-2 COX 1-2indica A. C.………. INDICA ...................................... 10 Analisis Genetik lrRNA dan cox A. c. Persentase PERSENTASE Haplotipe HAPLOTIPE A. c. A.indica C. INDICA …… ...................................................................................... 10 VARIASINukleotida NUKLEOTIDA LRindica RNA A.……………. C. INDICA ............................................................................. 10 Variasi A. c. A NALISISPohon POHONFilogeni FILOGENI........................................................................................................ 11 Analisis SIMPULAN ................................................................................................................................ 11 SARAN ....................................................................................................................................... 11 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 11 LAMPIRAN ................................................................................................................................ 13
DAFTAR TABEL Halaman 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk amplifikasi lrRNA A. cerana berdasarkan 3 nukleotida primer Sittipraneed (2001) .................................................................................... 14 3 2 Lebah madu Apis cerana dan A. mellifera yang digunakan pada penelitian ini ........................ 15 4 3 Data lokasi koleksi lebah A. cerana ....................................................................................... 16 6 4 Data haplotipe gen lrRNA A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores ...................................... 20 5 Persentase haplotipe A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores .............................................. 18 7 8 6 Persentase nukleotida A. cerana lrRNA/DraI .......................................................................... 19 7 Jarak genetik antar koloni A. cerana lrRNA/DraI .................................................................... 20 8
DAFTAR GAMBAR Halaman
1 1 Lebah Madu A. cerana............................................................................................................ 14 5 2 Peta lokasi pengambilan sampel di (a) Lombok, (b) Sumbawa, dan (c) Flores ......................... 15 3 Pita DNA A. cerana gen lrRNA. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8: Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb ...................................................................... 19 6 4 Pita DNA A. cerana hasil pemotongan dengan DraI. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8: Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb ........................................ 20 6 5 Peta restriksi hasil pemotongan gen lrRNA/DraI A. cerana. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006). .................................................................................................... 21 6 6 Homologi urutan nukleotida gen lrRNA A. cerana. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006), Amel_lrRNA: urutan nukleotida lrRNA Apis mellifera (Acc number: L06178). TTT/AAA: situs restriksi DraI, *: homologi nukleotida. .............................................. 8 7 Konstruksi pohon filogeni A. cerana gen lrRNA berdasarkan Maximum Parsimony (Gambar a-c) dan Neighbour Joining (Gambar d), angka di atas nodus menyatakan nilai bootstrap 100x. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006), L06178: urutan 9 nukleotida lrRNA Apis mellifera..................................................................................................
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
1 2 3 4
Daerah koleksi A. c. indica Lombok dan Sumbawa (Apriani 2006) .......................................... 14 Peta persebaran A. cerana di Indonesia berdasarkan lrRNA/DraI (2006-2007) ......................... 15 Rasio substitusi transisi dengan transversi ................................................................................ 16 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcSbw5) menggunakan primer For lrRNA .............................................................................................................................. 18 5 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcSbw5) menggunakan primer Rev lrRNA .............................................................................................................................. 19 6 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcLb21) menggunakan primer For lrRNA ............................................................................................................................... 20 7 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcLb21) menggunakan primer Rev lrRNA ............................................................................................................................... 21
PENDAHULUAN Latar Belakang Lebah madu merupakan salah satu serangga sosial yang hidup dalam suatu koloni dan terdiri atas ribuan individu. Dalam koloni tersebut, terdapat tiga kasta yang dibedakan berdasarkan kemampuan reproduktif, yaitu ratu, jantan, dan pekerja (Winston 1987). Berdasarkan Michener (2000), lebah madu termasuk ke dalam ordo Hymenoptera, subordo Apocrita, infraordo Acuelata, superfamili Apoidea, famili Apidae, subfamili Apinae, tribe Apini, dan genus Apis. Lebah madu Apis cerana merupakan lebah lokal yang banyak diternakan di Indonesia. Hal itu dikarenakan A. cerana memiliki daya tahan terhadap tungau parasit Varrhoa dan daya adaptasi yang tinggi terhadap lingkungan (Morse 1997). Selain itu juga didukung dengan persebaran yang sangat luas dari lebah ini. Menurut Ruttner (1988), lebah madu A. cerana memiliki empat sub spesies yang tersebar di seluruh dunia, yaitu A. c. cerana (Asia bagian barat dan timur laut), A. c. indica (Asia selatan dan tenggara), A. c. himalaya (pegunungan Himalaya), dan A. c. japonica (Jepang).
Taiwan, Koera, Nepal, dan Filipina menunjukkan adanya variasi DNA mitokondria pada daerah tRNAleu dan daerah Cytochrome Oxidase I-II (CO I-II) (Deowanish et al. 1996). Pada tahun 1999, dilakukan analisis dengan menggunakan enzim restriksi DraI pada daerah gen srRNA, lrRNA, dan daerah intergenik CO III. Dari 170 koloni yang digunakan, ditemukan variasi dari ketiga gen tersebut yaitu masingmasing dengan dua, empat, dan tujuh haplotipe (Sihanuntavong et al. 1999). Sedangkan dari hasil analisis RFLP dengan menggunakan gen lrRNA/DraI pada 225 koloni di Thailand, menghasilkan empat haplotipe (Sittipraneed et al. 2001). Penelitian mengenai keragaman genetik mtDNA dari A. cerana di Indonesia telah dilakukan sebelumnya oleh Raffiudin pada tahun 2006. Penelitian tersebut menggunakan analisis gen lrRNA/DraI, dengan jumlah koloni yang digunakan 97 koloni, yang masing-masing berasal dari pulau Jawa (81 koloni), Kalimantan (enam koloni), Lombok (tujuh koloni), dan Sumbawa (tiga koloni). Dari hasil analisis tersebut diperoleh dua haplotipe untuk pulau Jawa, satu haplotipe untuk pulau Kalimantan, dan dua haplotipe untuk pulau Lombok dan Sumbawa. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi lebih lanjut variasi genetika A. cerana indica berdasarkan gen lrRNA di pulau Lombok, Sumbawa, dan Flores. Selain itu, penelitian ini mempelajari filogeni A. cerana hasil penelitian ini dengan A. cerana asal Thailand. Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat melengkapi database mengenai haplotipe dan urutan nukleotida gen lrRNA A. c. indica di Indonesia.
Gambar 1 Lebah madu A. cerana.
METODE
DNA mitokondria (mtDNA) merupakan informasi genetik yang hanya diturunkan secara maternal, sehingga analisis mtDNA dapat digunakan untuk mempelajari evolusi hewan, keragaman populasi, dan aliran gen. Gen large ribosomal RNA (lrRNA) merupakan salah satu gen pada mtDNA yang tidak menyandi protein. Gen ini memiliki persentase A-T yang tinggi yaitu 83.33% (Crozier & Crozier 1993). Analisis Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) yang dilakukan pada populasi lebah di Jepang, Thailand, Vietnam,
Objek Penelitian Objek penelitian yang digunakan adalah lebah madu A. c. indica yang berasal dari Lombok, Sumbawa, dan Flores (hasil koleksi dari penelitian ini) dan koleksi Rika Raffiudin di Lab. Zoologi Departemen Biologi FMIPA IPB. Koleksi di Flores dilakukan oleh Islamul Hadi (Staf pengajar Program Studi Biologi, Universitas Mataram). Koleksi Lebah Koleksi lebah dilakukan di pulau Lombok (tujuh daerah), Sumbawa (tiga daerah), dan Flores (tiga daerah). Dari masing-masing
2
koloni diambil 10-15 individu lebah pekerja dan kemudian disimpan di dalam tabung yang berisi etanol absolut. Ekstraksi DNA Ekstraksi DNA dilakukan dengan menggunakan metode cetyl trimethyl ammonium bromide (CTAB) 20% dan presipitasi etanol (Sambrook et al. 1989). Ekstraksi dilakukan terhadap dua individu lebah pekerja dari tiap koloni. Sebelum diekstraksi, lebah dimasukkan ke dalam 10 mM Tris HCl pH 8; 1 mM EDTA (TE) sebanyak tiga kali. Pencucian tersebut bertujuan untuk mengganti etanol dalam jaringan dengan TE. Toraks lebah kemudian dipotong dengan menggunakan pisau scalpel steril dan dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml. Setelah itu tabung yang berisi toraks lebah direndam dalam nitrogen selama 20 menit. Toraks kemudian digerus hingga hancur dengan menggunakan grinder. Sebanyak 500 μl bufer CTAB (10 ml 1 M Tris-HCl pH 8; 4 ml 0.5 M NaEDTA pH 8; 8.18 g NaCl; 2 g CTAB dan air hingga 100 ml) dan 14 μl Proteinase K (5 mg/ml) ditambahkan ke dalam tabung yang berisi hancuran jaringan toraks. Tabung kemudian diinkubasi pada suhu 55°C selama dua jam dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm (10 menit). Supernatan yang terbentuk kemudian dipindahkan ke tabung 1.5 ml baru dan ditambahkan 250 μl fenol dan 250 μl CIAA (kloroform isoamil alkohol). Tabung lalu dikocok perlahan selama satu menit dan disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama lima menit. Sentrifugasi akan membentuk dua lapisan yaitu lapisan atas yang mengandung DNA dan lapisan bawah yang merupakan campuran antara fenol dan isoamil alkohol. Lapisan bawah tersebut kemudian dibuang dan tabung disentrifugasi kembali selama satu menit. Lapisan atas yang mengandung DNA kemudian dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan larutan CIAA sebanyak 400 μl. Tabung kemudian dikocok perlahan selama satu menit dan disentrifugasi selama tiga menit pada kecepatan 13.000 rpm. Kemudian lapisan bawah hasil sentrifugasi dibuang dan tabung disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama satu menit. Lapisan atas yang mengandung DNA dipindahkan ke tabung baru dan ditambahkan 600 μl isopropanol kemudian dipresipitasi selama semalam pada suhu 4°C. Tabung yang berisi campuran DNA dan isopropanol kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 13.000 rpm (30 menit) pada suhu 4°C. Larutan isopropanol kemudian dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl etanol 70%, selanjutnya tabung disentrifugasi kembali 13.000 rpm (10 menit) pada suhu 4°C. Supernatan lalu dibuang dan endapan (pelet) DNA dikeringkan dengan cara divakum selama 30 menit. Pelet DNA hasil ekstraksi kemudian dilarutkan dalam TE 0.5 M dan disimpan pada suhu 4°C. Amplifikasi DNA DNA hasil ekstraksi kemudian diamplifikasi (diperbanyak) secara in vitro dengan menggunakan metode PCR (mesin PCR Takara Thermal Cycle). Komposisi pereaksi yang digunakan pada proses PCR terdiri atas 6.4 μl destilata water (DW) steril, 1 μl dNTP 2.5 mM, 1.25 μl Mg2+ free buffer, 1.5 μl MgCl2 25 mM, 0.1 μl Taq polymerase 5 μM, 1 μl DNA hasil ekstraksi, 0.625 μl primer For lrRNA 10 μM, dan 0.625 μl primer Rev lrRNA 10 μM (Tabel 1). Total volume pereaksi yang digunakan sebanyak 12.5 μl. Amplifikasi dilakukan dalam tiga tahap, yaitu tahap predenaturasi dengan suhu 940C selama satu menit. Kemudian dilakukan perbanyakan sebanyak 30 siklus dengan suhu denaturasi (pemisahan utas ganda DNA) 940C, annealing (penempelan primer) 610C, dan elongation (pemanjangan segmen DNA) 720C, masing-masing selama 1 menit. Tahap terakhir yaitu sintesis DNA dengan suhu 720C selama tujuh menit. Elektroforesis DNA DNA yang telah diamplifikasi kemudian dipisahkan dengan menggunakan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 5% dengan bufer 1xTBE (Tris 0.5 M, Asam borat 0.65 M, EDTA 0.02 M). Gel akrilamid 5% terdiri atas 4 ml akrilamid 30%, 4 ml bufer 5xTBE, 12.5 ml destilata water (DW) steril, 15 μl TEMED, dan 150 μl APS 10%. Fragmen DNA kemudian dimigrasikan dengan menggunakan arus listrik sebesar 145 Volt selama 100 menit. Proses ini menggunakan DNA ladder 100 bp (Promega) sebagai penanda DNA. Visualisasi DNA Pita DNA pada gel akrilamid divisualisasi dengan menggunakan metode pewarnaan silver nitrate (Tegelstrom 1986). Tahapan visualisasi DNA ini meliputi pencucian dengan larutan CTAB (0.2 g/200 ml akuades) selama 10 menit, dilanjutkan dengan akuades (200 ml) selama 2x2 menit. Kemudian gel direndam dalam
3
NH4OH (2 ml/200 ml akuades) selama 8 menit. Setelah itu gel direndam dalam campuran AgNO3 (0.32 g AgNO3, 0.8 ml NH4OH, 80 μl, dan 200 ml akuades) selama 20 menit. Gel lalu dicuci kembali dengan akuades selama 2x2 menit. Selanjutnya gel direndam dalam campuran NaCO3 (4 g NaCO3, 100 μl formaldehida, dan 200 ml akuades) sampai muncul pita DNA. Tahap terakhir yaitu gel direndam dalam larutan asam asetat 1% (200 μl asam asetat 1% dan 200 ml akuades). Analisis PCR-RFLP PCR produk kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi DraI. Enzim restriksi ini memiliki situs pemotongan TTT/AAA. Komposisi pereaksi yang digunakan pada proses PCR-RFLP terdiri atas 1.1 μl DW steril, 0.4 μl bufer B, 0.5 μl enzim restriksi DraI (10 U/μl), dan 2 μl PCR produk. Total volume pereaksi yang digunakan sebanyak 4 μl. Campuran tersebut kemudian diinkubasi selama semalam pada suhu 37°C. Hasil pemotongan kemudian dimigrasikan dengan menggunakan gel akrilamid 5% pada 145 Volt selama 100 menit. Pita DNA kemudian divisualisasi dengan menggunakan
metode pewarnaan silver nitrate (Tegelstrom 1986). Pengurutan (Sequencing) dan Analisis Homologi (Alignment) DNA Nukleotida lrRNA hasil PCR diurutkan dengan menggunakan jasa Lembaga Biologi Molekuler Charoen Pockphan Jakarta. Selanjutnya hasil pengurutan dianalisis dengan menggunakan program Genetyx Win 4.0 dan Clustal X (Thompson et al. 1997). Analisis homologi nukleotida lrRNA dilakukan antara haplotipe yang ditemukan pada penelitian ini dengan haplotipe Sittipraneed et al. (2001) dari GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) dengan Accession number (Acc number): AF140508; AF140509; dan AF1405011, haplotipe dari hasil Apriani (2006): AcPt1 dan AcLb4, dan sebagai outgroup digunakan urutan nukleotida A. mellifera (Acc number: L06178) (Tabel 2). Analisis Filogenetik Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan program PAUP 4.10 (PPC) versi Macintosh. Rekonstruksi yang digunakan pada analisis ini yaitu Maximum Parsimony (MP) dan Neighbour Joining (NJ), dengan menggunakan bootstrap 100x.
Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk amplifikasi lrRNA A. cerana berdasarkan nukleotida primer Sittipraneed (2001) No 1 2
Primer Forward lrRNA Reverse lrRNA
Urutan Nukleotida Primer (5`-3`) GGG ACG ATA AGA CCC TAT AG CAA CCC TGA TAC AAA GGT ACA AAA
Tabel 2 Lebah madu A. cerana dan A. mellifera yang digunakan pada penelitian ini Kelompok Ingroup
Outgroup
Lebah A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. mellifera
Kode Sampel AcLb21 AcSbw5 AcFlr3 AcFlr4 AcPt1 AcLb4 AF140508 AF140509 AF140511 L06178
Lokasi
Acc Number
Kolektor
Lombok Sumbawa Flores Flores Pati Lombok Thailand Thailand Thailand -
AF140508 AF140509 AF140511 L06178
Anggriawan I Anggriawan I Hadi I Hadi I Apriani Hadi I Sittipraneed S Sittipraneed S Sittipraneed S Crozier RH
4
HASIL Koleksi Lebah Lebah madu A. c. indica yang berhasil dikoleksi berjumlah 29 koloni. Koloni diambil dari tujuh kecamatan di Lombok yaitu Kec. Selaparang (satu koloni), Kec. Pamenang (dua koloni), Kec. Pujut (tiga koloni), Kec. Tanjung (lima koloni), Kec. Santong (lima koloni), Kec. Kelayu (satu koloni), dan lima koloni dari Kec. Masbagik (Tabel 3, Gambar 2a). Selain itu, koloni tersebut juga berasal dari tiga tempat yang berbeda di Sumbawa yaitu Kec. Moyo Utara, Desa Pungka, dan Desa Pelat, dengan jumlah koloni masing-masing satu koloni (Tabel 3, Gambar 2b). Serta empat koloni yang berasal dari tiga desa di Flores, yaitu Desa Walogai (satu koloni), Desa Walogai Atas (dua koloni), dan Desa Moni (satu koloni) (Tabel 3, Gambar 2c). Budidaya lebah A. c. indica di Lombok umumnya dikelola oleh peternakan keluarga. Peternak memperoleh lebah dengan menangkap lebah langsung dari hutan, kemudian
lebah disimpan dalam stup (kotak) dan glodok (potongan batang pohon kelapa yang dilubangi). Kotak stup disusun di rak atau digantung di pohon-pohon sekitar rumah mereka. Selain peternakan keluarga, di Lombok juga terdapat beberapa kelompok tani madu hasil binaan dinas kehutanan (Dishut) Nusa Tenggara Barat (NTB). Sedangkan di Sumbawa, A. c. indica umumnya diternakkan secara liar yang banyak ditemukan di lubang-lubang pohon. Di pulau ini peternakan lebah lebih banyak dikelola oleh kelompok tani madu binaan Dishut NTB. Selain A. cerana, kelompok tani madu di Sumbawa juga membudidayakan lebah A. dorsata. Kondisi budi daya lebah di Flores, tidak jauh berbeda dengan kondisi di Sumbawa. Di pulau ini, umumnya para peternak membudidayakan A. c. indica secara liar. Ekstraksi dan Amplifikasi DNA Ekstraksi dilakukan terhadap 58 individu lebah pekerja. Dari hasil amplifikasi dengan menggunakan primer For lrRNA dan Rev lrRNA diperoleh pita dengan ukuran + 900 pb (pasang basa) (Gambar 3).
Tabel 3 Data lokasi koleksi lebah A. cerana Pulau Lombok
Kode Sampel AcLb11
Lokasi
Koordinat 80 34’ 57’’ 1160 05’ 35”
AcLb12
Kampus lama Univ. Mataram, Kec. Selaparang, Mataram Kelayu, Lombok Timur
AcLb13-16
Santong
AcLb17
Santong
AcLb18-19
Sumbawa
AcSbw4
Flores
AcSbw5 AcSbw6 AcFlr1
Desa Bentek, Kec. Pamenang, Lombok Barat Desa Kuta, Kec. Pujut, Lombok Tengah Desa Sire, Kec. Tanjung, Lombok Barat Desa Lendang Nangka, Kec. Masbagik Gili Ngara, Kec. Moyo Utara, Sumbawa Desa Pelat, Sumbawa Desa Pungka, Sumbawa Desa Walogai, Flores
AcFlr2-3
Desa Walogai Atas, Flores
AcFlr4
Desa Moni, Flores
AcLb20-22 AcLb23-27 AcLb28-32
Total
80 39’ 19’’ 1160 32’ 46” 80 18’ 30’’ 1160 17’ 01” 80 18’ 14’’ 1160 16’ 32” 80 43’ 1160 10’ 80 53’ 53’’ 116018’ 01’’ 80 21’49’’ 1160 18’ 01” 80 36’ 01’’ 1160 27’ 00” 80 30’18’’ 117035’45” 80 42’ 08’’ 121048’13.2” 80 42’ 25’’ 1210 48’ 30.9” 80 46’ 12’’ 1210 49’ 59.2”
Ketinggian (m dpl) 10
Jumlah Koloni 1
12
1
8
4
10
1
105
2
3
3
4
5
206
5
15
1
837
1 1 1
1.084
2
1.212
1 29
5
Utara, Desa Pelat, dan Desa Pungka (Sumbawa), serta Desa Walogai dan Desa Walogai Atas (Flores), sedangkan haplotipe C ditemukan pada koloni yang berasal dari Kec. Santong, Kec. Pujut, dan Kec. Masbagik (Lombok), serta Desa Walogai Atas dan Desa Moni (Flores) (Tabel 3, Tabel 4). Perbedaan posisi pemotongan dapat dilihat pada setiap urutan nukleotida (Gambar 5).
Analisis PCR-RFLP Analisis PCR-RFLP yang dilakukan pada 29 koloni lebah A. c. indica dengan menggunakan enzim restriksi DraI menunjukkan adanya variasi genetika, yaitu dengan ditemukan dua haplotipe (A dan C) (Gambar 4). Haplotipe A ditemukan pada koloni yang berasal dari Kec. Selaparang, Kec. Santong, Kec. Pamenang, Kec. Tanjung, dan Kec. Masbagik (Lombok), Kec. Moyo
Ac 13-16 Lb Ac 17 Lb Ac 23-27 Lb
Ac 4 Sbw Ac Ac4Sbw 6 Sbw Ac6Sbw Ac 5 Sbw Ac5Sbw Ac 3 Sbw Ac 2 Sbw Ac3Sbw Ac2Sbw
Ac 18-19 Lb Ac 7 Lb Ac 9 Lb Ac 4, 11 Lb Ac 6 Lb Ac 5 Lb Ac 10 Lb
Ac 28-32 Lb Ac 12 Lb
Sungai di Sumbawa Lokasi A. cerana Gunung di Sumbawa
Ac 20-22 Lb
Lokasi A. cerana Sungai di Lombok Gunung di Lombok
(b)
(a)
Ac 2-3 Flr Ac 1 Flr Ac 4 Flr
Lokasi A. cerana Sungai di Flores Gunung di Flores
(c) Gambar 2 Peta lokasi pengambilan sampel di (a) Lombok, (b) Sumbawa, dan (c) Flores.
6
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
Tabel 4 Data haplotipe gen lrRNA A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores No
900
Gambar 3
M
1
Pita DNA A. cerana gen lrRNA. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8: Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb. 2
3
4
5
6
7
8
9
10
400 300
100
Gambar 4
Pita DNA A. cerana hasil pemotongan dengan DraI. M: penanda DNA 100 pb Promega, 1-2: Ac21Lb, 3-4: Ac22Lb, 5-6: Ac4Sb, 7-8 : Ac5Sb, 9-10: Ac6Sb.
Berdasarkan perhitungan persentase haplotipe, haplotipe A merupakan haplotipe umum yang ditemukan pada koloni lebah Lombok, Sumbawa, dan Flores, dengan persentase sebesar 72.72% (Lombok), 100% (Sumbawa), dan 50% (Flores), sedangkan haplotipe C memiliki persentase sebesar 27.28% (Lombok) dan 50% (Flores) (Tabel 5).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Asal Lombok Ac Lb 11 Ac Lb 12 Ac Lb 13 Ac Lb 14 Ac Lb 15 Ac Lb 16 Ac Lb 17 Ac Lb 18 Ac Lb 19 Ac Lb 20 Ac Lb 21 Ac Lb 22 Ac Lb 23 Ac Lb 24 Ac Lb 25 Ac Lb 26 Ac Lb 27 Ac Lb 28 Ac Lb 29 Ac Lb 30 Ac Lb 31 Ac Lb 32 Sumbawa Ac Sbw 4 Ac Sbw 5 Ac Sbw 6 Flores Ac Flr 1 Ac Flr 2 Ac Flr 3 Ac Flr 4
Haplotipe A C A A C A A A A A C C A A A A A A A C A A A A A A C A C
AF 140508 AF 140509 AF 140511 AcPt1 AcSbw5
Pengurutan (Sequence) DNA Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan primer For dan Rev lrRNA pada masing-masing haplotipe yang berbeda (haplotipe A dan C). Masing-masing haplotipe tersebut mewakili individu asal Lombok, Sumbawa, dan Flores yaitu AcSbw5, AcLb21, dan AcFlr4 dengan panjang DNA hasil pengurutan + 599 pb, + 595 pb, dan + 598 pb. Panjang DNA tersebut ditambah dengan panjang urutan nukleotida primer (For + Rev) sebesar + 30 pb, sehingga panjang DNA yang sebenarnya adalah + 629 pb, + 625 pb, dan + 628 pb. Hasil pengurutan ditampilkan dalam bentuk kromatogram (Lampiran 4-9).
AcFlr3 AcLb4 AcLb21 AcFlr4
Gambar 5 Peta restriksi hasil pemotongan gen lrRNA/DraI A. cerana. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006).
7
tida A (43.834%) dan T (42.103%) (Tabel 6). Jarak genetik terbesar terjadi antara AF140508 dan AcLb4 dengan nilai 3.53%, sedangkan nilai genetik terkecil terjadi antara AcPt1 dan AcSbw5 dengan nilai 0.00% (Tabel 7). Rasio substitusi transisi terhadap tranversi antar pasangan koloni menunjukkan nilai tertinggi yaitu 2.20%, antara AF140508 dan AcFlr3. Sedangkan nilai terendah yaitu 0.00%, antara AcLb4 dan ACLb21. Total rasio transisi terhadap transversi yaitu 66.67% untuk ts/tv >1 dan 26.67% untuk ts/tv <1 (Lampiran 3). Konstruksi pohon filogenetik dilakukan berdasarkan urutan nukleotida gen lrRNA A. cerana dengan metode Maximum Parsimony (MP) (Gambar 7a-c) dan Neighbour Joining (NJ) (Gambar 7d). Dari hasil analisis dengan menggunakan MP, terdapat 512 karakter yang konstan, 69 karakter yang parsimony uninformative, dan hanya 21 karakter yang parsimony informative.
Analisis Homologi (alignment) DNA Analisis kesamaan (homologi) dilakukan pada masing-masing haplotipe yang ditemukan pada penelitian ini dengan haplotipe hasil penelitian Sittipraneed et al. (2001) yang diambil dari GenBank dengan Acc Number: AF140508, AF140509, dan AF140511, haplotipe hasil penelitian Apriani (2006), dan urutan nukleotida A. mellifera dengan Acc number L06178. Hasil alignment DNA dengan haplotipe Sittipraneed (2001) ditemukan adanya tiga situs pemotongan yang berbeda. Posisi situs pemotongan yang berbeda disebabkan karena adanya perubahan nukleotida. (Gambar 6). Analisis Filogenetik A. cerana Analisis filogenetik dilakukan dengan menggunakan program PAUP 4.10 (PPC) versi Macintosh. Dari hasil analisis didapat bahwa urutan nukleotida dari koloni A. cerana yang dianalisis lebih didominasi oleh nukleo-
Tabel 5 Persentase haplotipe A. cerana Lombok, Sumbawa, dan Flores
Lokasi
Jumlah koloni (a)
Persentase haplotipe Jumlah koloni (%) (b)
Persentase haplotipe (a-b) (%)
A
C
A
C
A
C
A
C
5 -
72.72
1
75.86
24.14
100
27.28 -
6
Sumbawa
17 3
2
1
83.33
16.67
Flores
2
2
50
50
-
-
50
50
Lombok
Ket : (a) data hasil penelitian tahun 2007; (b): data hasil penelitian Apriani (2006) AcLb4 AcLb21 AF140509 AF140511 AF140508 AcPt1 AcSbw5 AcFlr3 AcFlr4 L06178 AcLb4 AcLb21 AF140509 AF140511 AF140508 AcPt1 AcSbw5 AcFlr3 AcFlr4 L06178
AATTTAATCATTATCACTATATTTTTTAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATTAATAA AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATTAATAA AATTTAATCATTATCACTATATTTCAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA AATTTAATCATTATCACTATATCTTAAAAATTAAAATATATGTTTTTATAGAATAAATAA AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA AATTTAATCATTATCACTATATTTTAAAAATTAAAATATATATTTTTATAGAATAAATAA AATCTAATCACTATTTCTATATTTTATTAATTAAAATATAAATTTTTATAGAA-AAATAA *** ****** *** ****** * ************ *********** ***** AATTTAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AATTTAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AATTTAAAATTTAAATTTTTTAAA--TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AATTTAAAATTTAAATTTTTTAAA--TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AATTCAAAATTTAAATTTTTAAAAA-TTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AACTTAAAATTTAAATTTTTTAAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AACTTAAAATTTAAATTTTTTAAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AACTTAAAATTTAAATTTTTTTAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AACTTAAAATTTAAATTTTTTTAAAATTAATAAC--TAAATTATTAAATTTTTTATATTA AATATAAA-TTTAAATCATTATTAATTTATAAATATTAAATTATTAAATTATTAAAATTA ** *** ******* ** * *** ** ************** ** * ****
297 297 297 297 297 300 300 297 299 288 354 354 353 353 354 358 358 355 357 347
8
AcLb4 AcLb21 AF140509 AF140511 AF140508 AcPt1 AcSbw5 AcFlr3 AcFlr4 L06178
ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATTAAAAATTTTTATAAATAAATTT ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATTAAAAATTTTTATAAATAAATTT ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT ATAAAAAATATTAACTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT ATAAAAAATATTAATTTCATAATATTATAAATAAAATCAAAAATTTTTATAAATAAATTT AAGAAAAATATTATCTCTATAACATTAAAAATTAAAATTAAA-TTTTTATCT-TAAATTT * ********** * **** **** **** *** *** ******* ******* ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATATCATAAA-TAAATTTTAATGTA ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATATCATAAA-TAAATTTTAATGTA ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAAGGTA ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA ATAGTTTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATACTATAAA-TAAATTTTAATGTA ATAGATTATCCCATAAATTTTTAATATAAAAATTAATAAATTAAAATAAAATTTAATTTA **** ********************************* **** **** ***** ** TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAACTTCG TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATCAATAAGTTCG TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG TTAAAAATTTTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG CTAAAATAATTATATCTAAATTAAATTTATTTCTAAAAAAACTAGATATTAATAAGTTCG ***** **************************************** ***** ****
AcLb4 AcLb21 AF140509 AF140511 AF140508 AcPt1 AcSbw5 AcFlr3 AcFlr4 L06178 AcLb4 AcLb21 AF140509 AF140511 AF140508 AcPt1 AcSbw5 AcFlr3 AcFlr4 L06178
Gambar 6
414 414 413 413 414 418 418 415 417 405 473 473 472 472 473 477 477 474 476 465 533 533 532 532 533 537 537 534 536 525
Homologi urutan nukleotida gen lrRNA A. cerana. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006), Amel_lrRNA: urutan nukleotida lrRNA Apis mellifera (Acc number: L06178). TTT/AAA: situs restriksi DraI, *: homologi nukleotida.
Tabel 6 Persentase nukleotida A. cerana lrRNA/DraI Taxon
A
C
0.43834
G
0.09005
T
0.05057
0.42103
Tabel 7 Jarak genetik antar koloni A. cerana lrRNA/DraI
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
AcLb4 AcLb21 AF140509 AF140511 AF140508 AcPt1 AcSbw5 AcFlr3 AcFlr4 L06178
1 2 0.34 2.69 2.36 2.52 2.19 3.53 3.19 2.35 2.01 2.35 2.01 2.18 1.85 2.18 1.85 12.69 12.69
3 0.19 1.51 1.34 1.34 1.85 1.85 13.04
4
1.35 1.17 1.17 1.68 1.68 12.87
5
1.85 1.85 2.69 2.69 13.34
6
0.00 1.17 1.17 13.16
7
8
1.17 1.17 0.00 13.16 12.83
9
10
12.83
-
9
73
AF140509 AF140511
71
AcSbw5
28
AcFlr3
93
AF140508
41
AcPt1
87
AcFlr4
40
AcPt1 87 11 AcSbw5 AcLb21
73 71
11
AF140509 AF140511
88
22
AF140508
AcLb4
AcFlr3
93
88
AcFlr4
AcLb21
AcLb4 L06178
L06178
(a)
(b)
73 71
AcLb21
AF140509
88
AF140511
AcLb4
AF140508
41
AF 140509 73
AcPt1 22
87
71
AF 140511
40 AcSbw5
AF 140508
41 93
11
AcFlr3 AcPt1 AcFlr4
87 AcSbw5
88
AcLb21 AcFlr3 93 AcLb4 AcFlr4 L06178
L06178
(c) Gambar 7
(d)
Konstruksi pohon filogeni A. cerana gen lrRNA berdasarkan Maximum Parsimony (Gambar a-c) dan Neighbour Joining (Gambar d), angka di atas nodus menyatakan nilai bootstrap 100x. AcLb21, AcSbw5, AcFlr3, dan AcFlr4: hasil penelitian ini. AF140508, AF140509, dan AF140511: Sittipraneed (2001), AcPt1 dan AcLb4: Apriani (2006), L06178: urutan nukleotida lrRNA Apis mellifera.
10
PEMBAHASAN Distribusi A. cerana Lebah madu A. cerana merupakan lebah lokal Asia dengan persebaran yang sangat luas. Berdasarkan Smith (2000), persebaran A. cerana di Indonesia mencapai kepulauan Timor. Hal itu sesuai dengan hasil koleksi pada penelitian ini, yaitu dengan ditemukannya A. c. indica di Flores Lebah ini merupakan lebah terbanyak kedua yang dibudidayakan oleh masyarakat Indonesia setelah A. mellifera, sehingga data mengenai distribusi dan keragaman genetik A. cerana perlu dieksplorasi, untuk memberikan gambaran mengenai keragaman dari A. cerana di Indonesia. Analisis Keragaman Genetik lrRNA dan cox 1-2 A. c. indica DNA mitokondria (mtDNA) merupakan informasi genetik yang hanya diturunkan secara maternal. DNA ini banyak digunakan untuk mempelajari tentang aliran gen dan keragaman populasi. Berdasarkan Crozier & Crozier (1993), persentase AT pada mtDNA sangat tinggi yaitu 83.33%. Persentase yang tinggi juga diperoleh pada penelitian ini yaitu 88.90%. Salah satu gen yang digunakan pada analisis mtDNA adalah gen large ribosomal RNA (lrRNA). Gen ini umum digunakan karena tidak menyandikan protein dan memiliki laju mutasi yang tinggi. Analisis keragaman genetik dengan menggunakan analisis gen lrRNA telah banyak dilakukan di antaranya di Thailand oleh Sihanuntavong et al. (1999) dan Sittipraneed et al. (2001). Di Indonesia, penelitian mengenai keragaman genetik A. cerana dengan menggunakan analisis gen lrRNA/DraI telah dilakukan oleh Raffiudin & Hadi (2006) terhadap 97 koloni asal Jawa, Kalimantan, Lombok, dan Sumbawa (penelitian pendahuluan untuk tahun 2007). Keragaman genetik A. c. indica asal Lombok, Sumbawa, dan Flores dengan analisis gen lrRNA/DraI ditemukan dua haplotipe yaitu haplotipe A dan C (penamaan berdasarkan Raffiudin & Hadi (2006)). Berdasarkan peta restriksi, diperoleh enam pita DNA untuk haplotipe A dengan ukuran 9, 47, 79, 91, 95, dan 278 pb, sedangkan pada haplotipe C terdapat tujuh pita dengan ukuran 7, 8, 38, 79, 91, 94, dan 278 pb. Haplotipe A pada penelitian ini hampir sama dengan
haplotipe C pada penelitian Sihanuntavong et al. (1999). Hal itu dapat dilihat dari ukuran pita DNA hasil pemotongan lrRNA/DraI yaitu 8, 91, 94, 124, dan 278 pb. Untuk mendapatkan data yang lebih informatif mengenai keragaman genetika A. c. indica asal Lombok, Sumbawa dan Flores, dilakukan analisis pada daerah intergenik cox 1-2. Dari hasil analisis dengan menggunakan enzim restriksi DraI, diperoleh lima haplotipe. Keragaman genetik yang diperoleh dari analisis pada daerah intergenik cox 1-2 lebih banyak dibandingkan analisis gen lrRNA. Hal itu karena daerah intergenik cox 1-2 memiliki laju mutasi yang lebih tinggi daripada gen lrRNA. Persentase Haplotipe A. c. indica Haplotipe A merupakan haplotipe umum yang ditemukan pada koloni asal Lombok, Sumbawa, dan Flores. Hal itu dibuktikan melalui perhitungan persentase terhadap kedua haplotipe. Berdasarkan perhitungan persentase, haplotipe A memiliki persentase sebesar 72.72% (Lombok), 100% (Sumbawa), dan 50% (Flores), sedangkan haplotipe C memiliki persentase sebesar 27.28% (Lombok) dan 50% (Flores). Perhitungan tersebut mempengaruhi persentase haplotipe A. c. indica Lombok, dan Sumbawa pada penelitian sebelumnya (Apriani 2006). Dengan adanya penambahan jumlah koloni yaitu tujuh koloni untuk Lombok dan tiga koloni untuk Sumbawa, terjadi perubahan persentase kedua haplotipe. Pada koloni asal Lombok, terjadi peningkatan persentase pada haplotipe A menjadi 75.86%, sedangkan haplotipe C mengalami penurunan menjadi 24.14%. Begitu juga dengan koloni asal Sumbawa, pada haplotipe A terjadi penurunan sebesar 16.67% menjadi 83.33%, sedangkan haplotipe C meningkat menjadi 16.67% (Lampiran 2). Terdapat kesamaan haplotipe antara koloni asal Jawa dengan koloni asal Lombok, Sumbawa, dan Flores (haplotipe A). Hal itu terjadi karena pada awalnya pulau Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores bersatu dengan Asia membentuk suatu daratan (Hall 1997). Karena itulah terjadi aliran gen dari pulau Jawa sampai Flores. Variasi Nukleotida lrRNA A. c. indica Hasil alignment DNA dengan haplotipe hasil Sittipraneed et al. (2001), haplotipe Apriani (2006), dan urutan nukleotida
11
A. mellifera (Acc number: L06178) menunjukkan persamaan dan perbedaan situs pemotongan enzim restriksi. Terdapat tiga situs pemotongan enzim restriksi yang berbeda, yaitu pada posisi 260, 300, dan 315 pada AcLb21. Perbedaan situs pemotongan enzim restriksi terjadi karena adanya perubahan nukleotida. Perubahan tersebut dapat terjadi karena adanya mutasi, seperti transversi (purin↔pirimidin), transisi (purin↔purin atau pirimidin↔pirimidin), delesi, dan insersi. Analisis Pohon Filogeni Hasil analisis karakterisasi gen lrRNA menunjukkan nukleotida A dan T lebih mendominasi urutan nukleotida pada setiap koloni dengan nilai 43.834% dan 42.103%. Berdasarkan Saccone et al. (1999), komposisi A+T sangat tinggi pada genom serangga dan nematoda. Perbedaan nukleotida yang terjadi pada semua koloni lebih didominasi oleh transisi. Hal itu dapat dilihat dari nilai rasio subtitusi transisi terhadap transversi. Dari hasil perhitungan, nilai rasio transisi terhadap transversi (ts/tv) terbesar terjadi antara AF140508 dan AcFlr4 sebesar 2.20%, sedangkan nilai ts/tv terkecil terjadi antara AcLb4 dan AcLb21 sebesar 0.00%. Total rasio yang diperoleh untuk ts/tv >1 sebesar 66.67% dan untuk ts/tv <1 sebesar 26.67%. Jarak genetik terbesar terjadi antara AF140508 dan AcLb4 dengan nilai 3.53%, sedangkan nilai genetik terkecil terjadi antara AcPt1 dan AcSbw5 dengan nilai 0.00%. Konstruksi yang dilakukan dengan menggunakan Maximum Parsimony menghasilkan tiga pohon dengan topologi yang berbeda. Perbedaan tersebut dapat dilihat dari koloni yang menempati bagian basal di dalam ingroup. Pada pohon (a), posisi basal di dalam ingroup ditempati oleh AcFlr3 dan AcFlr4, sedangkan pada pohon (b) dan (c) ditempati oleh AcLb4 dan AcLb21. Adanya perbedaan tersebut dikarenakan analisis ini hanya berdasarkan satu gen saja. Berdasarkan Cao et al. (1994), analisis dengan menggunakan set data yang besar dapat memberikan hasil yang lebih kuat dibandingkan dengan analisis berdasarkan gen tunggal. Akan tetapi, dari ketiga pohon tersebut terdapat kesamaan bahwa koloni A. cerana asal Thailand (AF140508, AF140509, dan AF140511) membentuk cluster tersendiri yang terpisah dengan koloni asal Indonesia.
SIMPULAN Koleksi A. c. indica dilakukan di tujuh kecamatan di Lombok, tiga desa di Sumbawa, dan tiga desa di Flores. Budidaya lebah A. c. indica di Lombok umumnya dikelola oleh peternakan keluarga, sedangkan A. c. indica diternakkan secara liar di Sumbawa dan Flores. Ukuran nukleotida gen lrRNA yang diamplifikasi berkisar antara 625-629 pb dengan basa AT sekitar 88.90%. Berdasarkan analisis lrRNA/DraI, ditemukan dua haplotipe yaitu haplotipe A dan C. Persentase haplotipe A sebesar 72.72, 100, dan 50%, berturut turut untuk populasi A. c. indica di Lombok, Sumbawa, dan Flores. Persentase haplotipe C sebesar 27.28 dan 50% untuk A. c. indica di Lombok dan Flores. Analisis filogeni berdasarkan gen lrRNA menggunakan Maximum Parsimony menunjukkan bahwa populasi lebah di Thailand membentuk kelompok yang terpisah dengan A. cerana di Indonesia. Jarak genetik terbesar (3.53%) terjadi antara AF140508 (A. cerana asal Thailand) dan AcLb4 (asal Lombok), sedangkan nilai jarak genetik terkecil (0.00%) terjadi antara AcPt1 (Pati) dan AcSbw5 (Sumbawa). Nilai rasio transisi terhadap tranversi (ts/tv), untuk ts/tv >1 sebesar 66.67% dan untuk ts/tv <1 sebesar 26.67%.
SARAN Perlu adanya penelitian selanjutnya dengan memperluas daerah pengambilan sampel terutama pada daerah-daerah yang belum dieksplorasi, seperti Sumatra, Kalimantan, Bali, Sulawesi, dan Timor. Sehingga data mengenai distribusi dan variasi genetika dari lebah madu A. c. indica di Indonesia lebih lengkap.
DAFTAR PUSTAKA Apriani. 2006. Keragaman genetik lebah madu A. cerana di Indonesia berdasarkan DNA mitokondria gen ribosoma besar (lrRNA) [Skripsi]. Departemen Biologi. Institut Pertanian Bogor: Bogor. Cao Y, Adachi A, Janke A, Paabo S, Hasegawa M. 1994. Phylogenetic relationship among eutherian orders estimated from inferred protein sequences of mitochondrial proteins: instability of a tree based on a single gene. J Mol Evol 39: 519-527.
12
Crozier
RH, Crozier YC. 1993. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera L: complete sequence and genome organization. Genetics 133: 97-117 Deowanish S, Nakamura J, Matsuka M, Kimura K. 1996. MtDNA variation among subspesies of Apis cerana using restriction fragment length polymorphism. Apidologie 27: 407413. Hall R. 1997. Reconstructing cenozoic South East Asia. Geological Soc London Spec Publ 106: 153-184. Michener CD. 2000. The Bees of The World. London: The Johns Hopkins Univ Pr. Morse RA, Flottum K, editor. 1997. Honey bee Pests, Predators, and Diseases. 3rd Ed. Root Company. Raffiudin R, Hadi I. 2006. Diferensiasi DNA mitokondria lebah madu Apis cerana di Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Laporan Penelitian Fundamental Tahun I. Ditjen Pendidikan Tinggi. Ruttner F. 1988. Biogeography and Taxonomy of Honeybees. Springer-Verlag: Berlin. Saccone C, De Giorgi C, Gissi C, Pesole G, Reyes A. 1999. Evolutionary genomics in Metazoa: the mitochondrial DNA as a model system. Gene 238: 195-209.
Sambrooks J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke 2. New York: Cold Spring Harbor Lab Pr. Sihanuntavong D, Sittipraneed S, Klinbunga S. 1999. Mitochondrial DNA diversity and population structure of the honey bee, Apis cerana in Thailand. J Apic Res 38: 211-219. Sittipraneed S. Sihanuntavong D, Klinbunga S. 2001. Genetic differentiation of honeybee (Apis cerana) in Thailand revealed by polymorphism of a large subunit of mitochondrial ribosomal DNA. J Insect Soc 48: 266-272. Smith D.R, Villafuerte L, Otis G, Palmer M.R. 2000. Biogeography of Apis cerana F and A. nigrocincta Smith: insight from mtDNA studies. Apidologie 21: 265-279. Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in natural population: an improved routine for screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Electrophoresis 7: 226-229. Winston LM. 1987. The Biology of the Honeybee. Cambridge: Harvard Univ Pr.
LAMPIRAN
14
Lampiran 1 Daerah koleksi A. c. indica Lombok dan Sumbawa (Apriani 2006) a. Lombok
1
Kode Sampel Ac Lb 4
2
Ac Lb 5
3
Ac Lb 6
4
Ac Lb 7
No
5
6 7
Ac Lb 8
Ac Lb 9 Ac Lb 10
b. Sumbawa Kode No Sampel 1
Ac Sb 1
2
Ac Sb 2
3
Ac Sb 3
Lokasi
Koordinat
Mataram, Kec. Selaparang, Mataram Trunojoyo, Kec. Ampenan, kodya Mataram Gomong, Kec. Mataram Barat, Kodya Mataram Bertais, Kec. Cakranegara, Kodya Mataram Jorong, Kelayu, Kec. Mataram Barat, Kodya Mataram Gomong, Kec. Mataram Barat, Kodya Mataram Kec. Selong, Kab. Lombok Timur
80 34’ 57’’ 1160 05’ 35” 80 34’ 46.4’’ 1160 05’ 09” 80 35’ 36.4’’ 1160 10’ 56” 80 35’ 10’’ 1160 05’ 53”
Lokasi Desa Jorok, Kec. Unteriwes, Kab. Sumbawa Kec. Moyo Utara, Olat Rawa, Kab. Sumbawa Dusun Rapit Doya, Kec. Unteriwes, Kab. Sumbawa
Ketinggian (meter)
Jumlah Koloni
-
1
-
1
-
1
-
1
-
-
80 35’05’’ 1160 06’ 20” 80 39’ 27’’ 1160 08’ 39”
-
1
Koordinat
Ketinggian (meter)
Jumlah Koloni
-
-
1
-
1
-
1
80 31’ 05’’ 1170 33’ 55” 80 32’ 14’’ 1170 22’ 18”
1 1
Lampiran 2 Peta persebaran A. cerana di Indonesia berdasarkan lrRNA/DraI (2006-2007)
D
B
100%
1.53% A 94.46%
24.14%
16.67% C
50%
C A
A
75.86% 83.33%
A C 50%
Lampiran 3 Rasio substitusi transisi dengan transversi ---ti-- -------tv------ -------ident------ prop ti/tv Taxa AG CT AC AT CG GT AA CC GG TT diff ratio total -----------------------------------------------------------------------AcLb4 vs. AcLb21 0 0 0 2 0 0 259 50 30 254 0.00 0.00 595 AcLb4 vs. AF140509 1 8 0 6 1 0 254 48 29 246 0.03 1.29 593 AcLb4 vs. AF140511 1 7 0 6 1 0 254 48 29 247 0.03 1.14 593 AcLb4 vs. AF140508 2 11 0 6 1 1 255 48 29 242 0.04 1.62 595 AcLb4 vs. AcPt1 1 7 0 6 0 0 256 49 30 246 0.02 1.33 595 AcLb4 vs. AcSbw5 1 7 0 6 0 0 256 49 30 246 0.02 1.33 595 AcLb4 vs. AcFlr3 0 6 0 7 0 0 257 48 30 247 0.02 0.86 595 AcLb4 vs. AcFlr4 0 6 0 7 0 0 257 48 30 247 0.02 0.86 595 AcLb4 vs. L06178 3 20 3 46 0 2 233 41 26 209 0.13 0.45 583 AcLb21 vs. AF140509 1 8 0 4 1 0 256 48 29 246 0.02 1.80 593 AcLb21 vs. AF140511 1 7 0 4 1 0 256 48 29 247 0.02 1.60 593 AcLb21 vs. AF140508 2 11 0 4 1 1 257 48 29 242 0.03 2.17 595 AcLb21 vs. AcPt1 1 7 0 4 0 0 258 49 30 246 0.02 2.00 595 AcLb21 vs. AcSbw5 1 7 0 4 0 0 258 49 30 246 0.02 2.00 595 AcLb21 vs. AcFlr3 0 6 0 5 0 0 259 48 30 247 0.02 1.20 595 AcLb21 vs. AcFlr4 0 6 0 5 0 0 259 48 30 247 0.02 1.20 595 AcLb21 vs. L06178 3 20 3 46 0 2 234 41 26 208 0.13 0.45 583 AF140509 vs. AF140511 0 1 0 0 0 0 258 54 30 251 0.00 --594 AF140509 vs. AF140508 1 5 0 2 0 1 256 54 30 244 0.02 2.00 593 AF140509 vs. AcPt1 0 5 0 2 1 0 257 52 30 247 0.01 1.67 594 AF140509 vs. AcSbw5 0 5 0 2 1 0 257 52 30 247 0.01 1.67 594 AF140509 vs. AcFlr3 1 6 0 3 1 0 257 50 29 247 0.02 1.75 594 AF140509 vs. AcFlr4 1 6 0 3 1 0 257 50 29 247 0.02 1.75 594 AF140509 vs. L06178 4 20 5 44 1 2 232 42 25 207 0.13 0.46 582 AF140511 vs. AF140508 1 4 0 2 0 1 256 54 30 245 0.01 1.67 593 AF140511 vs. AcPt1 0 4 0 2 1 0 257 52 30 248 0.01 1.33 594 AF140511 vs. AcSbw5 0 4 0 2 1 0 257 52 30 248 0.01 1.33 594 AF140511 vs. AcFlr3 1 5 0 3 1 0 257 50 29 248 0.02 1.50 594 AF140511 vs. AcFlr4 1 5 0 3 1 0 257 50 29 248 0.02 1.50 594 AF140511 vs. L06178 4 19 5 44 1 2 232 42 25 208 0.13 0.44 582 AF140508 vs. AcPt1 1 6 0 2 1 1 258 53 30 243 0.02 1.75 595 AF140508 vs.
17
Lampiran 3 (Lanjutan) AcSbw5 AF140508 vs. AcFlr3 AF140508 vs. AcFlr4 AF140508 vs. L06178 AcPt1 vs. AcSbw5 AcPt1 vs. AcFlr3 AcPt1 vs. AcFlr4 AcPt1 vs. L06178 AcSbw5 vs. AcFlr3 AcSbw5 vs. AcFlr4 AcSbw5 vs. L06178 AcFlr3 vs. AcFlr4 AcFlr3 vs. L06178 AcFlr4 vs. L06178
1
6
0
2
1
1
258
53
30
243 0.02
1.75
595
2
9
0
3
1
1
258
50
29
242 0.03
2.20
595
2
9
0
3
1
1
258
50
29
242 0.03
2.20
595
5
22
6
41
1
3
233
42
25
205 0.13
0.53
583
0
0
0
0
0
0
261
55
31
252 0.00
---
599
1
3
0
3
0
0
259
52
30
248 0.01
1.33
596
1
3
0
3
0
0
260
52
30
249 0.01
1.33
598
4
21
5
45
0
2
233
42
26
206 0.13
0.48
584
1
3
0
3
0
0
259
52
30
248 0.01
1.33
596
1
3
0
3
0
0
260
52
30
249 0.01
1.33
598
4
21
5
45
0
2
233
42
26
206 0.13
0.48
584
0
0
0
0
0
0
262
52
30
252 0.00
---
596
3
21
4
45
0
2
235
41
26
207 0.13
0.47
584
3
21
4
45
0
2
235
41
26
207 0.13
0.47
584
Lampiran 4 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcSbw5) menggunakan primer For lrRNA
Lampiran 5 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcSbw5) menggunakan primer Rev lrRNA
Lampiran 6 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcLb21) menggunakan primer For lrRNA
Lampiran 7 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. c. indica (AcLb21) menggunakan primer Rev lrRNA
22
