VARIASI GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) DNA MITOKONDRIA PADA LEBAH Apis cerana CAHYO NUGROHO

VARIASI GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) DNA MITOKONDRIA PADA LEBAH Apis cerana

CAHYO NUGROHO

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

ABSTRAK CAHYO NUGROHO. Variasi Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA Mitokondria pada Lebah Apis cerana. Di bawah bimbingan RIKA RAFFIUDIN dan MOCHAMAD CHANDRA. Apis cerana adalah lebah madu asli Asia yang tersebar luas, mulai dari Cina hingga Filipina. Berdasarkan basis data genetik DNA mitokondria gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) di GenBank terdapat sembilan haplotipe A. cerana dari Malaysia, Brunei, Thailand, Taiwan, Korea, Jepang, dan Rusia. Belum ada data haplotipe A. cerana gen tersebut di Indonesia. Penelitian ini bertujuan mengeksplorasi variasi haplotipe A. cerana gen COI dari Pulau Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Koleksi dan ekstraksi DNA dilakukan pada A. cerana dari empat pulau tersebut. DNA hasil ekstraksi dilanjutkan pada proses amplifikasi dan sekuens DNA pada gen COI. Alignment DNA dilakukan pada DNA A. cerana gen COI dari hasil penelitian ini dengan basis data di GenBank cerana di Indonesia dari Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Dua haplotipe masing-masing dari Jawa dan Flores serta satu haplotipe masing-masing dari Lombok dan Sumbawa. Lebah A. cerana di Jawa menunjukkan haplotipe yang sama kecuali sampel yang berasal dari Cililin, Jawa Barat. Variasi haplotipe di Jawa diduga karena isolasi daratan di daerah Cililin. Variasi haplotipe di Lombok, Sumbawa, dan Flores diduga karena isolasi pulau oleh lautan. Hasil alignment DNA menunjukkan bahwa sampel A. cerana dari Jawa, Sabah, dan Brunei membentuk satu kelompok, yang mendukung teori kesatuan daratan utama Asia pada Era Pleistocene. Haplotipe dari Lombok, Sumbawa, dan Flores berbeda dengan haplotipe lain, karena pada Era Pleistocene pulau-pulau tersebut terbentuk dari daratan di laut dangkal. Kata Kunci : A. cerana, DNA mitokondria, COI, haplotipe

ABSTRACT CAHYO NUGROHO. Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene Variations of Mitochondrial DNA of Apis cerana. Supervised by RIKA RAFFIUDIN dan MOCHAMAD CHANDRA. Apis cerana is a native honey bee of Asia, ranging from China to the Philippines. Based on genetic a databases in GenBank of mitochondrial DNA Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) A. cerana from Malaysia, Brunei, Thailand, Taiwan, Korea, Japan, and Russia occur nine haplotypes. However, there is no COI data haplotype of A. cerana from Indonesia. This study was aimed to explore haplotype variations of COI gene of A. cerana from Java, Lombok, Sumbawa and Flores. Collection and extraction of A. cerana DNA was carried out from those four islands. DNA extraction and amplification process were followed with DNA sequences of COI gene. This study revealed six new variations haplotypes A. cerana from Java, Lombok, Sumbawa and Flores Indonesia. Two haplotypes were seen each from Java and Flores as well as one haplotype each from Lombok and Sumbawa. All honey bee A. cerana in Java showed the same COI haplotype except for those samples from Cililin, West Java, this might be due to the isolation area of Cililin. Haplotypes variation in Lombok, Sumbawa, and Flores occured could be due to the isolation of these islands by sea. Alignment was performed on A. cerana COI sequences from the results of this study with GenBank database, showed that based on COI, honey bee A. cerana from Java, Sabah, and Brunei were closely related and clustered in the same group. This phenomena support the theory of the Asian unity mainland in the Pleistocene Era. Honey bee A. cerana COI haplotypes from Lombok, Sumbawa, and Flores were different from any other haplotypes. This might be due to in the Pleistocene Era, those islands were the emergen areas of a broad zone in shallow water keywords : A. cerana, mitochondrial DNA, COI, haplotype

VARIASI GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) DNA MITOKONDRIA PADA LEBAH Apis cerana

CAHYO NUGROHO

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

Judul Skripsi : Variasi gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA mitokondria pada Lebah Apis cerana Nama : Cahyo Nugroho NIM : G34070107

Disetujui: Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Ir. Rika Raffiudin, M.Si. NIP. 19670167 1992032 001

Drs. Mochamad Chandra W, M.Sc. NIP. 080057508

Diketahui, Ketua Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP 19641002 198903 1 002

Tanggal lulus:

PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Variasi Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) DNA Mitokondria pada Lebah Apis cerana” ini dilakukan mulai Februari 2011 sampai dengan Juni 2011 di Bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini didanai oleh dana Penelitian Fundamental dari Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) atas nama Dr. Ir. Rika Raffiudin. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin dan Drs. Mochamad Chandra W selaku pembimbing, serta Dr. Aris Triwahyudi yang telah banyak memberi saran. Di samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Rut Normasari M.Si, Jazirotul M. Si., Ruth Matha M.Si., teman-teman di bagian Fungsi dan Perilaku Hewan, Ibu Tini dan Ibu Ani serta keluarga besar Dosen di Zoologi atas bantuan dan saran selama penulis melakukan penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga tercinta yang senantiasa memberi cinta, doa dan dukungan, serta teman-teman tersayang khususnya di Biologi angkatan 44, Keluarga besar Observasi Wahana Alam Biologi, dan Ikatan Alumni 106 di IPB yang selalu memberikan bantuan, doa, semangat dan kasih sayang. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, Agustus 2011

Cahyo Nugroho

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor Propinsi Jawa Barat pada tanggal 28 November 1988 dari pasangan Wagiman dan Marsih. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari SMA Negeri 106 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis memilih mayor Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Avertebrata, Struktur hewan, dan Biologi Dasar pada tahun 2010-2011. Penulis juga pernah mengikuti Program Kreatifitas Mahasiswa dalam bidang penelitian dan pengembangan masyarakat di tingkat DIKTI pada tahun 2009 dan 2010 serta mengikuti Simposium Internasional dengan tema ”Issues in Global Species Conservation Efforts” di Auditorium Andi Hakim Nasution pada tahun 2011. Penulis pernah melakukan penelitian kecil dalam mata kuliah Studi Lapang berjudul Karakterisasi Bakteri di usus Serangga khas Cangkuang, Sukabumi pada tahun 2009 serta melakukan Praktik Lapang di PT. Pertamina Persero Refinery Unit VI Balongan dengan mengkaji “Program Corporate Social Responsibility PT. Pertamina RU VI Balongan mendukung perolehan PROPER”.

DAFTAR ISI DAFTAR TABEL ....................................................................................................................... I DAFTAR GAMBAR ................................................................................................................... I PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1 Latar Belakang ................................................................................................................ 1 Tujuan Penelitian ............................................................................................................. 1 BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 1 Koleksi Sampel A. cerana ................................................................................................ 1 Ekstraksi DNA A. cerana Gen COI .................................................................................. 1 Amplifikasi DNA A. cerana Gen COI .............................................................................. 2 Visualisasi DNA A. cerana Gen COI................................................................................ 2 Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni A. cerana Gen COI................................. 2 HASIL ........................................................................................................................................ 3 Amplifikasi, Visualisasi, dan Sekuens DNA A. cerana Gen COI....................................... 3 Alignment DNA A. cerana Gen COI................................................................................. 3 Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni A. cerana Gen COI ................................. 3 PEMBAHASAN ......................................................................................................................... 9 Enam haplotipe baru berdasarkan gen COI lebah A. cerana di Indonesia........................... 9 Empat kelompok A. cerana berdasarkan analisis Filogeni ................................................ 9 SIMPULAN ................................................................................................................................ 9 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................ 10

DAFTAR TABEL Halaman 1 Gen COI A. cerana dan A. koschevnikovi (1041 pb) berdasarkan basis data GenBank .............. 4 2 Koleksi dan jenis haplotipe A. cerana di Indonesia berdasarkan gen COI ................................. 4 3 Posisi variasi nukleotida gen COI A. cerana pada hasil penelitian ini ....................................... 5 4 Jarak genetik gen COI A. cerana, A. mellifera, dan A. koschevnikovi. H1-9 basis data GenBank, H10-15 hasil penelitian ini...................................................................................................... 7

DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Visualisasi gen COI A. cerana di PAGE 6% sebesar 800 pb..................................................... 3 2 Skema Alignment DNA A. cerana gen COI antara basis data GenBank (Tabel 1) dan hasil penelitian ini (Tabel 2) ........................................................................................................... 4 3 Alignment DNA A. cerana dan A. koschevnikovi pada gen COI. A. cerana Hap 1-9 (Tabel 1) . 6 4 Alignment asam amino putative gen COI A. cerana dan outgroup A. koschevnikovi .................. 6 5 Pohon filogeni A. cerana gen COI antara haplotipe 1-9 basis data GenBank (Tabel 1) dengan haplotipe 10-15 hasil penelitian ini (Tabel 2) ........................................................................ 8 6 Pola penyebaran A. cerana haplotipe 1-9 gen COI di Asia berdasarkan basis data GenBank (Tabel 1) dan A. cerana haplotipe baru 10-15 hasil penelitian ini (Tabel 2)........................... 8

PENDAHULUAN Latar Belakang Indonesia memiliki jenis lebah yang beragam (Ruttner 1988). Salah satunya adalah A. cerana yang memiliki ukuran tubuh sedang (Smith 1991). Lebah A. cerana adalah serangga sosial yang hidup dalam penggolongan kasta, terdiri atas lebah ratu, pejantan, dan pekerja (Winston 1991). Lebah ini dapat dibudidayakan karena hidup di dalam rongga alami maupun buatan (Woyke 2004). Lebah A. cerana memiliki kemampuan mendeteksi dan membunuh tungau secara cepat (Morse & Flottum 1997), serta menjadi polinator utama untuk tanaman perkebunan seperti brokoli (Devkota & Thapa 2005) dan Jatropha curcas (Rianti et al. 2010). Budidaya A. cerana mulai ditinggalkan oleh para peternak lebah. Hal tersebut diduga karena hasil produksi madu A. cerana lebih rendah dibandingkan A. mellifera. Faktor lain penyebab A. cerana terancam keberadaannya, yaitu deforestasi hutan tinggi serta penanganan buruk terhadap lebah ini. Penelaahan lebih lanjut terhadap A. cerana perlu dilakukan untuk meningkatkan kualitas hidupnya, baik penelaahan material genetik maupun budidaya. Studi variasi haplotipe merupakan salah satu pembelajaran mengenai material genetik di dalam spesies A. cerana. Material genetik yang digunakan untuk mengetahui jenis haplotipe di dalam spesies dapat berasal dari DNA mitokondria pada situs Cytochrom Oxidase Subunit I (COI) (Hebert et.al 2003a, 2003b). Kelebihan DNA mitokondria jika digunakan sebagai penanda genetik, yaitu: (i) mtDNA memiliki jumlah salinan yang tinggi, sehingga memudahkan untuk mengisolasi dan memurnikan DNA tersebut; (ii) ukuran dari genom mitokondria lebih kecil dibanding genom inti, yaitu sepanjang 16500 pasang basa (pb). Hal tersebut menyebabkan DNA genom mitokondria dapat dipelajari secara menyeluruh (iii) gen pada mtDNA tidak terdapat intron (Smith 1991). Berdasarkan DNA mitokondria gen COI terdapat sembilan haplotipe A. cerana di Asia dari basis data di GenBank, yaitu AF153101AF153109 (www.ncbi.nlm.nih.gov). Namun, dari sembilan data haplotipe tersebut belum ada yang berasal dari Indonesia. Kondisi geografi Indonesia yang beragam memungkinkan terjadinya variasi haplotipe. Hal tersebut menyebabkan perlunya dilakukan

penelitian untuk mengeksplorasi variasi DNA yang ada pada A. cerana di Indonesia. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah mengeksplorasi variasi haplotipe gen COI untuk A. cerana yang berasal dari Pulau Jawa, Lombok, Sumbawa dan Flores.

BAHAN DAN METODE Koleksi Sampel A. cerana Obyek yang digunakan adalah sampel lebah pekerja A. cerana, hasil koleksi Dr. Ir. Rika Raffiudin, M. Si. di Departemen Biologi, FMIPA IPB. Hasil koleksi lebah berasal dari beberapa daerah di Indonesia, yaitu Jawa Barat, Jawa Timur, Lombok, Sumbawa, dan Flores. Lebah A. cerana diawetkan di dalam alkohol 100%. Ekstraksi DNA A. cerana Gen COI DNA A. cerana diekstraksi dengan menggunakan metode hexadecyltrimethylammonium brommida (CTAB 0.2% (b/v) (7.5 ml Tris-HCl 1M pH 8; 3 ml NaEDTA 0.5 M pH 8; 6.135 g NaCl; 1.5 g CTAB; air hingga 75 ml)) (Sambrook 1989). Sebelum ekstraksi, lebah dimasukkan dalam larutan Tris-HCl EDTA ((TE) (Tris-HCl-EDTA 10 mM pH 8; EDTA 1 mM)) untuk menghilangkan etanol dari jaringan. Bagian tubuh yang diambil adalah toraks lebah pekerja A. cerana. Toraks lebah dipisahkan dari jaringan lainnya dengan menggunakan scalpel. Tabung berisi satu toraks lebah dimasukkan ke dalam nitrogen cair selama 15 menit, kemudian toraks tersebut digerus sampai hancur. Bufer CTAB 0.2% ditambahkan sebanyak 500 µl ke dalam tabung yang berisi hancuran toraks. Proteinase K (5 mg/ml) ditambahkan sebanyak 14 µl untuk mendegradasi protein, kemudian diinkubasi pada suhu 55 °C selama 2 jam. Setelah diinkubasi, tabung beserta isinya disentrifugasi 188.942x gravitasi (g) selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung baru, kemudian ditambahkan 500 µl larutan Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol (PCI) =25 : 24 : 1, digoyang dengan tangan perlahan selama 5 menit lalu disentrifugasi 188.942x g selama 5 menit. Lapisan atas yang berisi DNA dipindahkan ke tabung baru, kemudian ditambahkan 400 µl larutan CIAA (Chloroform : Isoamyl alcohol = 24 : 1), digoyang dengan tangan selama 5 menit agar larutan homogen dan disentrifugasi 188.942x g selama 3 menit.

2

Lapisan atas yang berisi DNA dipindahkan ke tabung baru. Presipitasi DNA dilakukan dengan menambahkan 600 µl isopropanol murni dan disimpan selama 12 jam pada suhu 4 °C. Pengendapan DNA dilakukan dengan sentrifugasi 188.942x g selama 30 menit pada suhu 4 °C. Larutan berisi isopropanol dibuang, kemudian ditambahkan 500 µl etanol 70% dan disentrifugasi 188.942x g selama 10 menit pada suhu 4 °C. Etanol 70% dibuang, kemudian pelet DNA dikeringkan dengan cara divakum selama 30 menit. Pelet DNA kemudian disuspensikan dalam TE 0.5 mM sebanyak 30-50 µl dan disimpan pada suhu –4 °C. Amplifikasi DNA A. cerana Gen COI DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan mesin thermocycler (ESCO SWIFT MAXI-BLC1). Segmen DNA yang diamplifikasi adalah gen COI pada A. cerana. DNA target diamplifikasi menggunakan pasangan primer yang didisain dari genom lengkap mitokondria A. mellifera dengan kode akses L06178. Primer forward Am_COX1b_F dengan urutan nukleotida 5’AGGAGGTGGAGATCCAATTC 3’ dan primer reverse Am_COX1b_R 5’TGGATAGTCTGAATAACGTCGTG 3’. Posisi primer forward pada gen tersebut di urutan nukleotida 2455-2475 sedangkan primer reverse di urutan nukleotida 30963120. Lokasi gen COI pada nukleotida 17943359 (Crozier & Crozier 1993) Total pereaksi yang digunakan 20 µl PCR campuran. Campuran tersebut terdiri atas 5.9 µl akuades steril, 0.8 µl primer forward 10 µM, 0.8 µl primer reverse 10 µM, 10 µl KAPA Taq ReadyMix DNA Polymerase buffer Mg2+ 1.5 mM, dNTP 0.4 mM, KAPA Taq DNA Polymerase 0.05 U/µl), penambahan 1 µl MgCl2 1.5 mM, dan 1.5 µl DNA hasil ekstraksi. Kondisi PCR sebagai berikut; inisiasi denaturasi DNA selama 4 menit pada suhu 95 °C, denaturasi DNA sebanyak 30 siklus pada suhu 94 °C, penempelan primer 1 menit pada suhu 50 °C, elongasi DNA selama 2 menit pada suhu 72 °C dan 20 menit untuk ekstensi DNA. Visualisasi DNA A. cerana Gen COI Amplikon gen COI A. cerana dimigrasikan dengan menggunakan Polyacrilamyde Gel Electrophoresis (PAGE) konsentrasi 6%. Komposisi PAGE 6 % yaitu 12 ml akuades; 4 ml TBE 5x (Tris 0.5 M, asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M); 4 ml

acrylamide 30%; 15 µl tetramethylethylenediamine (TEMED); 150 µl Amonium Peroxo Sulfat (APS) 10%. Pemisahan amplikon tersebut dilakukan pada tegangan 200 V selama 55 menit. DNA divisualisasi dengan metode pewarnaan perak nitrat (Byun et al. 2009). Gel hasil elektroforesis dicuci dengan akuades, lalu direndam di dalam larutan satu (200 ml akuades, 0.2 g AgNO3, 80 µl NaOH (4 g/10 ml akuades), dan 0.8 ml NH4OH) selama 8 menit, kemudian dibilas kembali dengan akuades, selanjutnya gel direndam dalam larutan dua (200 ml akuades, 6 g NaOH, dan 100 µl formalin) hingga pita DNA muncul. Tahap akhir yaitu gel tersebut direndam di dalam larutan tiga (100 ml akuades dan 100 µl asam asetat) untuk pengawetan gel hasil visualisasi Sekuens dan Alignment DNA A. cerana Gen COI Variasi genetik gen COI untuk A. cerana dianalisis menggunakan metode sekuensing. DNA disekuens dengan menggunakan mesin sekuens 3730XL dan ABI 3100 di perusahaan jasa pelayanan sekuens. Hasil sekuens nukleotida diedit dan dianalisis dengan menggunakan program Genetyx Win Version 4.0. Hasil sekuens forward dan reverse dialignment untuk mendapatkan sekuens utuh DNA, dengan menggunakan program Clustal X (Thompson et al. 1997). Analisis homologi dilakukan melalui BLASTN untuk urutan basa melalui situs National Center for Biotechnology Information (NCBI). Keseluruhan sekuens DNA A. cerana dialignment dengan basis data gen COI A. cerana di GenBank (NCBI). Kode akses basis data yang digunakan yaitu AF153101AF153109 (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Tabel 1). Sekuens DNA yang telah diedit kemudian dideduksi menjadi asam amino dengan menggunakan Program Genetyx. Hasil deduksi asam amino di-alignment dengan menggunakan program Clustal X dan di edit dengan menggunakan program MEGA 4 (Tamura et al. 2007). Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni A. cerana Gen COI Penentuan jarak genetik dan analisis filogeni A. cerana dikonstruksi antara gen COI hasil penelitian ini (Tabel 2) dengan basis data gen COI A. cerana haplotipe 1-9 (Tabel 1) sebagai ingroup, A. mellifera (kode akses L06178) dan A. koschevnikovi (kode akses AF153110) sebagai outgroup dalam analisis

3

filogeni. Analisis konstruksi filogeni menggunakan program MEGA 4 (Tamura et al. 2007) berdasarkan metode subtitusi Kimura-2-parameter dan konstruksi Neighbour Joinning (NJ) dengan bootstrap 1000x.

HASIL Amplifikasi, Visualisasi, dan Sekuens DNA A. cerana Gen COI Dua puluh DNA A. cerana dari tempat berbeda di Indonesia telah diamplifikasi pada gen COI. Sembilan sampel A. cerana dilanjutkan untuk proses sekuens (Tabel 2), sedangkan sebelas sampel lainnya tidak disekuens. Hal tersebut disebabkan oleh pita DNA A. cerana hasil amplifikasi tidak muncul atau tipis. Pita DNA yang tipis mengindikasikan bahwa konsentrasi DNA rendah. Suhu optimum penempelan primer pada saat amplifikasi sampel yaitu 50°C. Suhu penempelan primer tersebut penting dalam proses amplifikasi, karena pada tahap ini primer akan menempel secara spesifik pada DNA target. DNA A. cerana gen COI yang menjadi target berukuran 800 pasang basa (pb) pada PAGE 6% (Gambar 1), sedangkan ukuran DNA target A. cerana gen COI yaitu 662 pb. Proses tersebut disebabkan oleh pergerakan pita DNA saat dimigrasikan tidak sempurna atau karena fenomena gel shifting. Alignment DNA A. cerana Gen COI Alignment antara gen COI A. cerana, A. mellifera, primer forward dan primer reverse dilakukan, untuk mengetahui posisi primer forward dan primer reverse (Lampiran 1). Ukuran DNA hasil alignment dengan primer tersebut, yaitu 662 pb. Sekuens A. cerana pada gen COI menunjukkan kandungan A+T sebesar 74.57%, sedangkan kandungan G+C sebesar 25.43%. Berdasarkan hasil alignment dari contiguous A cerana gen COI dari penelitian ini dengan basis data di GenBank menunjukkan 589 pb (Gambar 2). Hal ini disebabkan oleh panjang nukleotida pada setiap sampel berbeda, sehingga ketika dialignment menghasilkan ukuran nukleotida yang lebih pendek. DNA A. cerana gen COI hasil penelitian ini menghasilkan variasi haplotipe baru berdasarkan basis data GenBank (Tabel 3). Terdapat enam variasi haplotipe A. cerana yang berasal dari Jawa, Lombok, Sumbawa dan Flores. Penentuan nomor haplotipe baru pada penelitian ini berdasarkan data haplotipe 1-9 dari GenBank (Tabel 1).

Haplotipe 10 berasal dari Pandeglang, Gunung Arca, Pasuruan, dan Tretes. Hasil alignment DNA A. cerana gen COI dari empat lokasi tersebut, menunjukkan kesamaan haplotipe. Haplotipe 11 dari Cililin Jawa Barat, merupakan haplotipe yang berbeda dari hasil sekuens di Jawa. Haplotipe 12 dari Lombok, Haplotipe 13 dari Sumbawa serta Haplotipe 14 dan 15 dari Flores (Gambar 3). Terdapat variasi asam amino dari hasil analisis deduksi DNA A. cerana pada gen COI (Gambar 4). Apis cerana haplotipe 7, haplotipe 12, dan A. koschevnikovi mengalami variasi asam amino dari Valin (V) menjadi Isoleusin (I). Variasi nukleotida tersebut terletak di urutan 343-345 dengan susunan nukleotida GUU (V) menjadi AUU (I). Analisis Jarak Genetik dan Konstruksi Filogeni A. cerana Gen COI Jarak genetik A. cerana gen COI tertinggi antara haplotipe 10 dari Flores dan haplotipe 9 dari Taiwan (Tabel 4) dengan nilai kekerabatan 0.053. Berdasarkan analisis filogeni A. cerana antara sampel hasil penelitian ini dengan basis data di GenBank menunjukkan empat kelompok utama (Gambar 5). Kelompok satu H1-3 dari Malaysia dan Brunei serta H10-11 dari Jawa; Kelompok dua H12-15 dari Lombok, Sumbawa dan Flores; Kelompok tiga H4-5 dari Taiwan; Kelompok empat H6 dari Thailand, H7 dari Rusia, H8-9 dari Korea Selatan dan Jepang (Gambar 6). Analisis filogeni menunjukkan kekerabatan yang dekat antara data sampel A. cerana gen COI pada haplotipe 10 dan 11 dari Jawa dengan haplotipe 1-3 dari Malaysia dan Brunei. Sekuens gen COI A. koschevnikovi dan A. mellifera di GeneBank digunakan sebagai outgroup pada analisis ini. M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

800 pb 500 pb 400 pb Gambar 1 Visualisasi gen COI A. cerana di PAGE 6% sebesar 800 pb. Sumur 1-10: Ac Jawa H10 (1-4 = Gunung Arca, Pandeglang, Pasuruan, dan Tretes); 5 = Ac Jawa 11; 6 = Ac Lombok H12; 7 = Ac Sumbawa H13; 8 = Ac Flores H14; 9 = Ac Flores H15. M = DNA marker 100 pb (Promega).

4

Tabel 1 Gen COI A. cerana dan A. koschevnikovi (1041 pb) berdasarkan basis data GenBank No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Sampel A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. koschevnikovi

Asal Sabah Sabah Brunei Taiwan Taiwan Thailand Rusia Korea Selatan Jepang Brunei

Kode Akses AF153101 AF153102 AF153103 AF153104 AF153105 AF153106 AF153107 AF153108 AF153109 AF153110

Haplotipe H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H1

Peneliti

Tanaka H, Roubik DW, Kato M, Liew F dan Gunsalam G

Tabel 2 Koleksi dan jenis haplotipe A. cerana di Indonesia berdasarkan gen COI No 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Spesies A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana A. cerana

Panjang nukleotida

Asal Gunung Arca (Jawa) Pandeglang (Jawa) Pasuruan (Jawa) Tretes (Jawa) Cililin (Jawa) Lombok Sumbawa Flores Flores

100 pb

Haplotipe

Kode Sampel

H10

Ac Jawa H10

H11 H12 H13 H14 H15

Ac Jawa H11 Ac Lombok H12 Ac Sumbawa H13 Ac Flores H14 Ac Flores H15

300 pb

600 pb

Ac Jepang H9 Ac Korsel H8 Ac Rusia H7 Ac Thailand H6 Ac Taiwan H5 Ac Taiwan H4 Ac Brunei H3 Ac Sabah H2 Ac Sabah H1 Ac Jawa H10 Ac Cln Jawa H11 Ac Sumbawa H13 Ac Flores H14 Ac Flores H15 Ac Lombok H12

Gambar 2 Skema alignment DNA A. cerana gen COI antara basis data GenBank (Tabel 1) dan hasil penelitian ini (Tabel 2). = Variasi nukleotida pada gen COI A. cerana, = Variasi nukleotida gen COI A. cerana hanya pada sampel tertentu.

5

Tabel 3 Posisi variasi nukleotida gen COI A. cerana. Urutan nukleotida

1 6

1 9

2 0

2 2

3 1

5 2

6 8

8 8

8 9

9 7

1 0 0

1 0 6

1 2 1

1 4 2

1 4 3

1 4 8

1 5 7

1 6 9

1 9 3

1 9 9

2 1 7

2 3 8

2 4 1

2 4 7

2 5 0

2 6 5

2 7 7

2 9 5

3 0 7

3 1 3

3 1 6

3 1 9

3 4 0

3 4 4

3 4 9

3 5 6

3 7 0

3 8 5

T . . A A A A A A A A A A A A

T . . . . . . C C . . . . . .

T . . . . . . . . C C C C C C

A . . . . . . . G . . . . . .

T . . . . . . . . . . C C C .

C . . . . . . . . T T . . T .

T . . . . . . . . . . . . . C

A . . . . . . . . . . T T . .

T . . . . . . . . . . C C . .

T . . . . . . . . . . C C C .

C . . T T T T T T T T . . . T

A . . T T T T . . . . G G . .

A . . . . . . G G . . . . . .

T . . C C C C C C . . . . . .

C . . . . . . T T . . . . . T

T . . . . . . . . . . A A A A

C . . . . . . . . . . T T T T

T . . A A A A A A . . . . . .

C . . T T T T T T A G A A A A

A . . T T T T T T . . . . . .

T . . A A A A A A A A A A A A

A . . . . . . . . G G . . . .

T . . . . . . C C . . . . . .

C . . T T T T T T . . T T T T

T . . . . . . . . A A . . . .

T . . . . . . . . . . C C . C

A . . T T T T T T . . . . . .

T . . . . . . . . . . . . . C

T . . A A A A A A . . A A A .

T . . . . . . C C . . . . . .

C . . T T T T T T T T T T . .

T . . A A A . . . . . . . . .

T . . . . . . . . . . C C C .

G . . . . A . . . . . . . . A

A . . . . . . . . . . . . G .

T . . . . . . . . . . . . . C

A . . . . . . . . . G . . . .

T . . A A A A A A . . . . . .

Asal Haplotipe Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac

Sabah H1 Brunei H3 Sabah H2 Korsel H8 Jepang H9 Rusia H7 Thailand H6 Taiwan H4 Taiwan H5 Jawa H10 Jawa H11 Flores H14 Flores H15 Sumbawa H13 Lombok H12

Asal Haplotipe

4 1 2

4 2 4

4 3 3

4 4 5

4 5 7

4 6 0

4 6 3

4 7 3

4 9 3

4 9 6

5 0 5

5 0 8

5 1 1

5 2 3

5 2 6

5 2 7

5 3 8

5 3 9

5 4 7

5 5 3

5 5 9

5 6 0

5 7 4

5 8 6

Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac Ac

T . . . . . . . . . . . . C .

T . . C C C C C C . . . . . .

T . . . . . . . . A A . . . .

T . . C C C C . . . . . . . .

C . . T T T T T T T T T T T T

C . . T T T T T T T T T T T T

C . . T T T T T T T T T T T T

C . . T T T T . . T T . . T T

C . . T T T T T T T T T T T T

A . . . . . . . . G . . . . .

A . . . . . . . . . . . G . .

A . . . . . . . . . . . . . T

C . . T T T T T T T T T T T T

T . . . . . . . . . C . . . .

A . . . . . . . T . . . . . .

C . . T T T T . . . . T T T T

A . . T T T T T T T T . . T T

T . . . . . . . . C C C C C .

A . . T T T T T T T T T T T T

A . . T T T T . . . . . . . .

A . . . . . G . . . . . . . .

T . . C C C C . . . . . . . .

T . . C C C C C C . . . . . .

T . . . . . . . . C C . . . .

Urutan nukleotida

Sabah H1 Brunei H3 Sabah H2 Korsel H8 Jepang H9 Rusia H7 Thailand H6 Taiwan H4 Taiwan H5 Jawa H10 Jawa H11 Flores H14 Flores H15 Sumbawa H13 Lombok H12

Keterangan : Urutan nukleotida dibaca secara vertikal / kolom. H1-9 basis data GenBank (Tabel 1). H10-15 Haplotipe baru hasil penelitian ini (Tabel 2).

6

Haplotipe/urutan Ac.H1 Sabah Ac.H3 Brunei Ac.H2 Sabah Ac.H8 Korsel Ac.H9 Jepang Ac.H7 Rusia Ac.H6 Thailand Ac.H4 Taiwan Ac.H5 Taiwan Ak_Brunei Ac.H10 Jawa Ac.H11 Cln_Jawa Ac.H14 Flores Ac.H15 Flores Ac.H13 Sumbawa Ac.H12 Lombok

320 pb 360 340 pb ATTAGCTACATATCACGGTTCAAAATTAAAATTAAATATTTCAGTTTTATGATCTTTAGG ............................................................ ............................................................ ......A........T..A......................................... ......A........T..A......................................... ......A........T..A........................A................ ......A........T............................................ ......A.....C..T............................................ ......A.....C..T............................................ ............C..T..A....................C...A..C.T.....A..... ...............T............................................ ...............T............................................ ......A........T.......................C.................... ......A........T.......................C.................... ......A................................C........G........... ...........................................A...........C....

pb [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360] [360]

Gambar 3 Alignment DNA A. cerana dan A. koschevnikovi pada gen COI. A. cerana Hap 1-9 (Tabel 1), A. koschevnikovi basis data GenBank, dan H10-15 haplotipe baru A. cerana pada penelitian ini (Tabel 2). Nomor dalam kurung = posisi nukleotida, . = nukleotida homolog, = variasi nukleotida.

Haplotipe/urutan 120 80 100 Ac.H1 Sabah GFIVWAHHMFTVGLDVDTRAYFTSATMIIAVPTGIKVFSWLATYHGSKLKLNISVLWSLG [120] Ac.H2 Sabah ............................................................ [120] Ac.H3 Brunei ............................................................ [120] Ac.H8 Korsel ............................................................ [120] Ac.H9 Jepang ............................................................ [120] Ac.H6 Thailand ............................................................ [120] Ac.H5 Taiwan ............................................................ [120] Ac.H4 Taiwan ............................................................ [120] Ac.H7 Rusia ......................................................I..... [120] Ak brunei ......................................................I..... [120] Ac.H11 Cln_Jawa ............................................................ [120] Ac.H13 Sumbawa ............................................................ [120] Ac.H14 Flores ............................................................ [120] Ac.H15 Flores ............................................................ [120] Ac.H12 Lombok ......................................................I..... [120] Ac.H10 Jawa ............................................................ [120]

Gambar 4 Alignment asam amino putative gen COI A. cerana dan outgroup A. koschevnikovi. Hap 1-9 basis data GenBank (Tabel 1), Hap 10-15 hasil penelitian ini (Tabel 2). Nomor dalam kurung = posisi asam amino, = variasi asam amino.

7

Tabel 4 Jarak genetik gen COI A. cerana, A. mellifera, dan A. koschevnikovi. H1-9 basis data GenBank (Tabel 1), H10-15 hasil penelitian ini (Tabel 2) 1 [ 1] [ 2]0.000 [ 3]0.000 [ 4]0.049 [ 5]0.049 [ 6]0.051 [ 7]0.049 [ 8]0.046 [ 9]0.049 [10]0.094 [11]0.037 [12]0.038 [13]0.042 [14]0.044 [15]0.042 [16]0.042 [17]0.102

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

0.000 0.049 0.049 0.051 0.049 0.046 0.049 0.094 0.037 0.038 0.042 0.044 0.042 0.042 0.102

0.049 0.049 0.051 0.049 0.046 0.049 0.094 0.037 0.038 0.042 0.044 0.042 0.042 0.102

0.000 0.002 0.003 0.021 0.024 0.079 0.042 0.044 0.046 0.047 0.044 0.044 0.102

0.002 0.003 0.021 0.024 0.079 0.042 0.044 0.046 0.047 0.044 0.044 0.102

0.005 0.022 0.026 0.077 0.044 0.046 0.047 0.049 0.046 0.042 0.100

0.021 0.024 0.083 0.042 0.044 0.046 0.047 0.044 0.044 0.102

0.003 0.086 0.042 0.044 0.048 0.049 0.048 0.044 0.100

0.086 0.046 0.047 0.051 0.053 0.051 0.047 0.102

0.092 0.092 0.092 0.094 0.086 0.084 0.086

0.007 0.037 0.038 0.030 0.033 0.102

0.040 0.042 0.033 0.037 0.104

Keterangan : Nomor di dalam tabel = jarak genetik antar haplotipe [ 1] Ac Sabah H1 [ 6] Ac Rusia H7 [ 2] Ac Brunei H3 [ 7] Ac Thailand H6 [ 3] Ac Sabah H2 [ 8] Ac Taiwan H4 [ 4] Ac Korsel H8 [ 9] Ac Taiwan H5 [ 5] Ac Jepang H9 [10] Apis koschevnikovi

[11] Ac Jawa H10 [12] Ac Jawa H11 [13] Ac Flores H14 [14] Ac Flores H15 [15] Ac Sumbawa H13

13

14

15

16

17

0.002 0.017 0.019 0.031 0.033 0.028 0.092 0.094 0.096 0.084

[16] Ac Lombok H12 [17] Apis mellifera

8

Ac Brunei H3 100 52

Ac Sabah H2 Ac Sabah H1

Kelompok I

Ac Jawa H10 61

100

Ac Jawa H11 Ac Lombok H12 Ac Sumbawa H13

50 99

Ac Flores H14

93 100

Kelompok II

Ac Flores H15

100 Ac Taiwan H4

Ac Taiwan H5

Kelompok III

Ac Thailand H6

98

Ac Rusia H7

99 65

Ac Korsel H8

Kelompok IV

53 Ac Jepang H9

Apis koschevnikovi Brunei Apis mellifera

Outgroup

0.01

Gambar 5 Pohon filogeni A. cerana gen COI antara haplotipe 1-9 basis data GenBank (Tabel 1) dengan haplotipe 10-15 hasil penelitian ini (Tabel 2).

Ac Jawa H11

Ac Lombok H12

Ac Sumbawa H13 Ac Flores H14 & H15

Ac Jawa H10

Gambar 6 Pola persebaran A. cerana haplotipe 1-9 gen COI di Asia berdasarkan basis data GenBank (Tabel 1) dan A. cerana haplotipe baru 10-15 hasil penelitian ini (Tabel 2).

9

PEMBAHASAN Enam Haplotipe Baru Gen COI pada Lebah A. cerana di Jawa dan Nusa Tenggara Hasil penelitian ini dapat digunakan untuk melengkapi data molekular ekologi untuk A. cerana. Hasil sekuens A. cerana pada gen COI menunjukkan bahwa keragaman genetik A. cerana di Indonesia tinggi. Hal tersebut dapat ditinjau dari jumlah haplotipe yang dihasilkan. Terdapat enam haplotipe baru dari Jawa, Lombok, Sumbawa, dan Flores berdasarkan gen COI. Terdapat dua jenis subtitusi nukleotida pada penelitian ini yaitu transisi dan transversi. Subtitusi transisi adalah perubahan basa nitrogen jenis purin (A dan G) menjadi purin, atau basa nitrogen jenis pirimidin (C dan T) menjadi pirimidin (Griffiths et al. 1999). Contoh dari subtitusi transisi terjadi pada A. cerana haplotipe 12 dari Lombok di urutan nukleotida ke-344, dengan perubahan nukleotida G → A. Selanjutnya, subtitusi transversi adalah perubahan basa nitrogen jenis purin menjadi pirimidin, atau jenis basa pirimidin menjadi purin (Griffiths et al. 1999). Adapun contoh dari subtitusi transversi terjadi pada A. cerana haplotipe 13, 14, dan 15 dari Sumbawa serta Flores di urutan ke 307, dengan perubahan nukleotida T → A. Empat Kelompok lebah A. cerana Berdasarkan Analisis Filogeni pada Gen COI Analisis filogeni berdasarkan gen COI A. cerana menghasilkan empat kelompok utama lebah A. cerana (Gambar 5). Kelompok pertama yaitu: Kelompok satu H1-H3 dari Malaysia dan Brunei serta H10-H11 dari Jawa; Kelompok dua H12-H15 dari Lombok, Sumbawa dan Flores; Kelompok tiga H4-H5 dari Taiwan; Kelompok empat H6 dari Thailand, H7 dari Rusia, H8-H9 dari Korea Selatan dan Jepang. Kelompok satu didukung oleh teori Daratan Utama Asia pada Era Pleistocene, yaitu daratan Kalimantan, Sumatra, dan Jawa merupakan kesatuan daratan utama Asia Tenggara (Hall 1996). Lebah A. cerana dari Cililin berbeda dari beberapa sampel di Jawa. Hal tersebut disebabkan oleh mekanisme isolasi geografik. Cililin, Jawa Barat yang menyebabkan proses kawin silang di dalam koloni sendiri dalam beberapa generasi. Haplotipe 10 yang berasal dari Pandeglang, Gunung Arca, Pasuruan, dan Tretes

merupakan haplotipe umum pada penelitian ini. Kelompok dua pada analisis filogeni, menunjukkan suatu kelompok yang khas. Kelompok tersebut terdiri atas haplotipe 12H15 dari Lombok, Sumbawa, dan Flores. Kelompok tersebut merupakan kawasan yang memiliki isolasi geografi lautan (Gambar 3). Ketiga pulau ini pada Era Pleistocene tidak termasuk kedalam daratan utama Asia, tetapi merupakan pulau yang muncul dari daratan yang dangkal di bawah permukaan laut dengan posisi di sebelah utara Australia (Hall 1996). Kelompok tiga merupakan H4-H5 dari Taiwan. Terjadi mekanisme isolasi geografi berdasarkan penghalang lautan pada daerah ini. Kelompok empat terdiri atas H6 dari Thailand, H7 dari Rusia, H8 dari Korea Selatan, dan Hap 9 dari Jepang. Haplotipe tersebut menunjukkan sedikit variasi, karena pada Era Pleistocene keempat daerah tersebut merupakan daratan utama Asia di bagian utara. Empat kelompok utama pada analisis filogeni di atas mendukung data sebelumnya, dalam penggolongan A. cerana berdasarkan morfometri (Ruttner 1988). Kelompok satu dan dua termasuk ke dalam penggolongan A. c. indica, kelompok tiga dan empat ke dalam A. c. cerana dan A. c. japonica. DNA mitokondria gen COI pada A. koschevnikovi dan A. mellifera digunakan sebagai outgroup pada analisis filogeni. Penggunaan outgroup berfungsi sebagai faktor koreksi dalam penentuan karakter diantara ingroup yang ada (Maddison 1984). Deforestasi hutan serta penanganan yang kurang baik terhadap budidaya lebah di Indonesia membuat data penelitian ini menjadi penting. Variasi genetik yang diperoleh dapat digunakan untuk konservasi data genetik A. cerana, serta pemilihan koloni lebah yang akan dibudidayakan, dengan memperhitungkan kondisi geografi dan variasi genetik pada lebah tersebut.

SIMPULAN Hasil sekuens gen COI A. cerana yang berasal dari Jawa Barat, Jawa Timur, Flores, Sumbawa, dan Lombok adalah 589 pb. Penelitian ini menghasilkan enam haplotipe baru A. cerana pada gen COI, yaitu haplotipe 10, 11, 12, 13, 14 dan 15. Haplotipe 10 dari Pasuruan, Tretes, Gunung Arca, dan Pandeglang (Jawa); Haplotipe 11 dari Cililin,

10

Jawa Barat; Haplotipe 12 dari Lombok; Haplotipe 13 dari Sumbawa; serta Haplotipe 14 dan 15 dari Flores. Berdasarkan hasil penelitian ini diduga bahwa, geografi Indonesia yang luas menyebabkan terbentuknya variasi haplotipe gen COI yang tinggi.

DAFTAR PUSTAKA Byun S, Fang Q, Zhou H, Hickford J. 2009. An effective method for silver-stainning DNA in large number of poly-acrylamide gels. Anal Biochem 385: 174-175. Crozier RH, Crozier YC. 1993. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization. Genetics 133: 97117 Devkota F, Thapa R. 2005. Foraging preference of Apis cerana F. and Apis mellifera L. to broccoli under caged and open condition in Chitwan. J Inst Agric Anim Sci 26: 167-168. Griffiths A, William MG, Jeffrey HM, Richard CL. 1999. Modern Genetic Analysis. New York: W.H. Freeman and Company. Hall R. 1996. Reconstructing cenozoic SE Asia. In: Hall R, Blundell D (eds) Tectonic evolution of SouthEast Asia. Geol Soc Lond 106: 153-184. Hebert PD, Cywinska A, Ball SL, deWaard JR. 2003a. Biological identifications through DNA barcodes. Proc. R. Soc. Lond 270: 313-321. Hebert PD, Ratnasingham S, deWaard JR. 2003b. Cytochrome c oxidase subunit I divergences among closely related species. Proc R Soc Lond 270: 96-99.

Lunt DH, Zhanx D, Szymura J, Hewitt G. 1996. The insect cytochrome oxidase subunit I gene: Evolutionary patterns and conserved primers for phylogenetic studies. Insect Mol Biol 5: 153-165. Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup analysis and parsimony. Syst Zool 33: 83-103. Morse RA, Flottum K. 1997. Honey Bee Pests, Predators, and Diseases. Ohio: The A.I. Root Company. Rianti P, Suryobroto B, Atmowidi T. 2010. Diversity and effectiveness of insects pollinator of Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae). Hayati J Biosci 17: 3842. Ruttner F. 1988. Biogeography and Taxonomy of Honeybees. New York: Springer Verlag. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratorium Manual Second Edition. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Smith D. 1991. Diversity in the Genus Apis. Oxford: Westview Press. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Biol Evol 24:1596-1599. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmousgin F, Higgins DG. 1997. The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nuc Acid Res 25:4876-4882. Winston ML. 1987. The Biology of The Honey Bee. London: Harvard University Press. Woyke J, Wilde J, Reddy C. 2004. Open air nesting honey bees Apis Dorsata and Apis laboriosa differ from the cavity nesting Apis mellifera and Apis cerana in brood hygiene behavior. J Invert Path 86 : 1-6.

LAMPIRAN

12

Lampiran 1 Posisi primer forward dan reverse pada sekuens gen COI A. cerana Jawa H10 (Ac_Jawa_H10_COI) dan A. mellifera (Am_COI) Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

>>>>> -----------------------------------------------------TTAGGAG 7 -------------------------------------------------------AGGAG 5 CAATTACTATACTATTATTTGATCGAAATTTTAATACATCATTTTTCGATCCTATAGGAG 2460 ***** >>>>>>>>>>>>>>> GTGGAGATCCAATTCTATATCAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGTTTATA 67 GTGGAGATCCAATTC--------------------------------------------- 20 GTGGAGATCCAATTCTTTATCAACATTTATTTTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGTTTATA 2520 ***************

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

TTTTAATTCTTCCAGGATTTGGATTAATTTCTCATATTGTAATAAATGAAAGAGGAAAAA 127 -----------------------------------------------------------TTTTAATTTTACCTGGATTTGGATTAATCTCTCATATTGTAATAAATGAAAGAGGAAAAA 2580

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

AAGAAATTTTTGGAAATCTAGGTATAATTTACGCAATATTAGGTATTGGATTTTTAGGAT 187 -----------------------------------------------------------AAGAAATTTTTGGTAATTTAAGAATAATTTATGCAATATTAGGAATTGGATTTCTAGGTT 2640

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

TTATTGTGTGAGCACATCATATATTTACTGTAGGATTAGATGTTGATACACGGGCTTATT 247 -----------------------------------------------------------TTATTGTTTGAGCACATCACATATTTACAGTCGGATTAGATGTTGATACTCGAGCATATT 2700

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

TCACATCAGCAACAATAATTATTGCTGTTCCAACAGGAATTAAAGTATTTAGATGATTAG 307 -----------------------------------------------------------TTACTTCAGCAACAATAATCATTGCTGTACCAACAGGAATTAAAGTTTTTAGATGATTAG 2760

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

CTACATATCATGGTTCAAAATTAAAATTAAATATTTCAGTTTTATGATCTTTAGGTTTTA 367 -----------------------------------------------------------CAACTTATCATGGTTCAAAATTAAAATTAAATATTTCAATTTTATGATCACTAGGTTTTA 2820

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

TTATGTTATTTACAATTGGTGGATTAACAGGAATTATACTTTCAAATTCATCAATTGATA 427 -----------------------------------------------------------TTATACTATTTACTATTGGTGGATTAACAGGAATTATATTATCAAATTCTTCTATTGATA 2880

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

TTATTCTACATGATACATATTATGTAGTTGGTCATTTTCATTATGTATTATCAATAGGAG 487 -----------------------------------------------------------TTATTCTTCATGATACATATTACGTTGTTGGACATTTTCATTATGTTCTTTCAATAGGTG 2940

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

CAGTATTTGCAATTATTTCAAGATTTATTCATTGATACCCACTAATTACAGGTCTACTTC 547 -----------------------------------------------------------CAGTATTTGCAATTATTTCAAGATTTATTCATTGATATCCATTAATTACTGGATTATTAT 3000

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

TTAATGTAAAATGATTAAAAATTCAATTTATTATAATATTCATTGGTGTAAATTTAACAT 607 -----------------------------------------------------------TAAATATTAAATGATTAAAAATTCAATTTATTATAATATTTATTGGAGTAAATCTAACTT 3060

Ac_Jawa_H10_COI Primer_Forward Am_COI

Primer reverse <<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<<< TTTTTCCTCAACATTTTTTAGGATTAATATCTATACCACGACGTTATTCAGACTATCCAA 667 -----------------------------------------------------------TCTTTCCTCAACATTTTTTAGGACTAATATCTATACCACGACGTTATTCAGACTATCCAG 3120