IDENTIFIKASI MOLEKULER GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) LOBSTER GENUS Panulirus DI YOGYAKARTA: SEBAGAI DASAR PENGELOLAAN SUMBERDAYA
WIDY TRIAPRILYANTI
DEPARTEMEN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Identifikasi Molekuler Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di Yogyakarta: sebagai Dasar Pengelolaan Sumberdaya adalah benar merupakan hasil karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Bogor, Agustus 2016
Widy Triaprilyanti NIM C24120051
ABSTRAK WIDY TRIAPRILYANTI. Identifikasi Molekuler Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di Yogyakarta: sebagai Dasar Pengelolaan Sumberdaya. Dibimbing oleh NURLISA A BUTET dan MAJARIANA KRISANTI. Panulirus homarus (lobster pasir) dan Panulirus penicillatus (lobster batu) adalah jenis dari crustase laut yang termasuk dalam genus Panulirus Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi lobster genus Panulirus berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) yang dapat membantu pengungkapan terjadinya fenomena spesies kriptik sebagai informasi dasar dalam pengelolaan sumberdaya yang akurat. Tahap isolasi dan ekstraksi DNA menghasilkan dua DNA total yang baik untuk diamplifikasi dengan PCR hingga tahap sekuensing gen COI. Gen COI P. homarus dan P. penicillatus disejajarkan dengan beberapa gen COI spesies lain, yaitu genus Palinurus sebagai outgroup yang didapatkan dari GenBank hingga menghasilkan pohon filogeni dan membuktikan perbedaan yang jelas antara genus Panulirus dengan genus Palinurus. Panulirus homarus and Panulirus penicillatus memiliki perbedaan yang signifikan dari spesies Palinurus. Kedua spesies tersebut berbeda secara signifikan berdasarkan gen COI. Kata kunci: Panulirus homarus, Panulirus penicillatus, gen COI, identifikasi molekuler
ABSTRACT WIDY TRIAPRILYANTI. Molecular Identification Gene Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) of Lobster Genus Panulirus in Yogyakarta: As The Basis of Resources Management. Supervised by NURLISA A BUTET and MAJARIANA KRISANTI. Panulirus homarus and Panulirus penicillatus are species of marine crustase included in the genus Panulirus. This research was aimed at identifying Panulirus lobster based on Cytochrome Oxidase Subunit genetic I (COI) marker to support for accurate the existence of the species cryptic phenomenon as basic information in resource management accurately. Isolation and extraction DNA steps produced two DNA total which was good for amplification using PCR technique. P. homarus and P. penicillatus COI genes were aligned with some of the other species, i.e., COI gene of the genus Palinurus as outgroup acquired from GenBank and to produce a phylogeny tree distinction for genus Panulirus. Panulirus homarus and Panulirus penicillatus were significantly different from Palinurus species. The two former spesies were also significantly distinct due to partial COI gene. Keywords: Panulirus homarus, Panulirus penicillatus, gene COI, molecular identification
IDENTIFIKASI MOLEKULER GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) LOBSTER GENUS Panulirus DI YOGYAKARTA: SEBAGAI DASAR PENGELOLAAN SUMBERDAYA
WIDY TRIAPRILYANTI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Perikanan pada Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan
DEPARTEMEN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2016
PRAKATA Puji dan syukur Penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya sehingga Penulis dapat menyelesaikan kegiatan penelitian serta penyusunan karya ilmiah ini dengan judul Identifikasi Molekuler Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Lobster Genus Panulirus di Yogyakarta: sebagai Dasar Pengelolaan Sumberdaya. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat untuk menyelesaikan studi di Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Penulis menyampaikan terimakasih kepada: 1 Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya. 2 Institut Pertanian Bogor yang telah memberikan kesempatan untuk studi. 3 Beasiswa BIDIK MISI yang telah memberikan dana pendidikan perkuliahan. 4 Beasiswa POKJA AMANAH yang telah memberikan dana pendidikan perkuliahan. 5 Direktur Jenderal Pendidikan Tinggi, Kementrian Pendidikan dan Kebudayaan atas biaya penelitian melalui biaya Operasional Perguruan Tinggi Negeri (BOPTN), Anggaran Pendapatan Belanja Negara (APBN), DIPA IPB Tahun Ajaran 2015 no. 083/SP2H/PL/Dit.Litabmas/11/2015 Penelitian Dasar untuk Bagian, Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi, IPB dengan judul “Analisis Populasi Lobster Panulirus spp. di Perairan Selatan Jawa dalam Menunjang Implementasi Pengelolaan Perikanan Lobster Berbasis Ekosistem” yang dilaksanakan oleh Dr Ir Yusli Wardiatno, MSc (sebagai ketua peneliti) dan Dr Ir Nurlisa A Butet, MSc, Dr Ir Luky Adrianto, MSc, Ali Mashar, SPi MSi (sebagai anggota peneliti). 6 Dr Ir Achmad Fahrudin, MSi sebagai Pembimbing Akademik. 7 Dr Ir Nurlisa A Butet, MSc sebagai ketua komisi pembimbing dan Dr Majariana Krisanti, SPi MSi sebagai anggota komisi pembimbing yang telah memberikan arahan, masukan serta bimbingan dalam penulisan skripsi ini. 8 Dr Ali Mashar, SPi MSi selaku penguji luar komisi pembimbing dan Dr Ir Niken Tunjung Murti Pratiwi, MSi selaku perwakilan Komisi Pendidikan Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan. 9 Staf Tata Usaha Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan. 10 Agus A Hakim, SPi MSi dan Yuyun Qonita, SPi MSi sebagai pembimbing laboratorium Biologi Molekuler yang telah memberikan arahan dan masukan. 11 Keluarga: Ibu Wardiah, Bapak Bardiarza, Dian A, Septian N yang telah memberikan dukungan serta Doa. 12 Sahabat Terbaik: Muggy SM, Ditta AA, Fanisa M, Nurlia A, Budi N, Risna RS, Nefi I, Agustiani PN, Rahmah S, Lisa M Br P, Yuli FN, Diah S, Endah SR, Ulfanida R, MSP 49, MSP 50, dan MSP 48. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Agustus 2016 Widy Triaprilyanti
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL DAFTAR GAMBAR DAFTAR TABEL PENDAHULUAN Latar Belakang Perumusan Masalah Manfaat Penelitian METODE Waktu dan Lokasi Prosedur penelitian Analisis Data HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Pembahasan KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Saran DAFTAR PUSTAKA RIWAYAT HIDUP
ix ix x 1 1 2 2 2 2 3 4 5 5 8 10 10 10 10 12
DAFTAR TABEL Matriks jarak genetik fragmen gen COI pada Panulirus homarus, Panulirus penicillatus, Palinurus elephas (DQ062206.1), dan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1) berdasarkan metode pairwise distance
7
DAFTAR GAMBAR 1 Spesies contoh lobster P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2) 2 Hasil pengujian isolasi DNA total otot kaki P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2) pada gel agarosa 1,2% 3 Elektroforesis DNA hasil produk PCR pada gel agarosa 1%, marker 1 kb, P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2) 4 Hasil rekonstruksi pohon filogeni gen COI dari dua jenis contoh dan dua spesies pembanding menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000
5 5 6
7
DAFTAR ISTILAH BLASTn
Conserve
DNA barcoding
GenBank Sekuensing
Spesies kriptik
Singleton Variable
: (Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide) pilihan menu dari situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) yang digunakan untuk memastikan kebenaran suatu spesies dan mengetahui kedekatan dengan spesies lain. : urutan basa nukleotida yang dipertahankan dalam jangka waktu yang sangat panjang pada suatu spesies. basa nukleotida yang bersifat tetap dari setiap spesies dalam satu situs hasil pensejajaran. : sistem yang dirancang untuk melakukan identifikasi secara cepat dan akurat berdasarkan urutan basa nukleotida dari gen penanda pendek yang telah terstandarisasi. : situs NCBI yang memuat informasi dasar mengenai bioteknologi (termasuk informasi dasar DNA). : Sebuah prosedur untuk menentukan urutan basa nukleotida dalam contoh DNA yang berguna untuk identifikasi. : dua atau lebih spesies yang berbeda diklasifikasikan dalam satu nama spesies akibat karakteristik morfologi yang samar. : satu basa nukleotida yang berbeda dari spesies lain dalam satu situs hasil pensejajaran. : basa nukleotida yang berbeda dari setiap spesies dalam satu situs dari hasil pensejajaran yang merupakan ciri khusus spesies.
1 PENDAHULUAN
Latar Belakang Udang barong (Spiny lobster) disebut juga udang karang karena hidup di batu-batu karang dan dasar laut yang berpasir halus (Windyarto 2000). Udang karang atau lobster merupakan salah satu komoditas yang memiliki nilai ekonomis tinggi, baik untuk pasar dalam negeri maupun luar negeri. Daerah penyebaran lobster meliputi daerah berbatu karang, pasir berbatu, karang halus, dan tempat-tempat berbatu karang yang tidak jauh dari pantai, pulau, dan teluk (Utami 1999). Lobster genus Panulirus yang terdapat di Indonesia ada tujuh jenis, yaitu Panulirus versicolor (lobster bambu), Panulirus penicillatus (lobster batu), Panulirus longipes (lobster batik), Panulirus homarus (lobster pasir), Panulirus ornatus (lobster mutiara) (Windyarto 2000), Panulirus polyphagus (lobster pakistan) (Moosa 1984), Panulirus femoristriga (lobster batik) (Chan dan Ng 2001). Genus Panulirus memiliki keragaman paling besar dari famili Palinuridae (Abdullah 2009). Genus Panulirus telah lama menjadi objek menarik para peneliti dunia disebabkan oleh tingginya keragaman spesies, daerah penyebaran yang luas, dan juga nilai ekonominya yang tinggi (Junaidi et al. 2010). Penyebaran udang karang di Indonesia banyak terdapat di perairan Selatan Pulau Jawa, Pulau Sulawesi, Ambon dan Pulau Sumatera (Nawangwulan 2001). Daerah penghasil lobster di Pulau Jawa yang potensial salah satunya adalah di perairan Selatan Yogyakarta (Fauzi et al. 2013). Pada saat penangkapan dan pemanfaatan lobster di daerah tersebut melibatkan nelayan setempat. Agar pemanfaatan sumberdaya lobster di perairan ini tetap lestari maka perlu dilakukan pengelolaan yang rasional dengan mempertimbangkan masukan dari aspek biologi. Penelitian mengenai udang barong atau udang karang di Indonesia telah banyak dilakukan meliputi hubungan panjang-berat (Fauzi et al. 2013), tingkat pemanfaatan (Utami 1999), genetika molekuler (Abdullah 2009), dan ciri morfologi (Yusnaini et al. 2009). Penelitian mengenai genus Panulirus belum banyak dilakukan terutama mengenai keragaman genetik. Oleh karena itu diperlukan metode yang akurat dalam mengidentifikasi spesies. Pengetahuan dasar mengenai keragaman populasi genetik diperlukan sebagai acuan dalam pengelolaan sumberdaya perikanan. Salah satu teknik identifikasi molekuler yang populer yang dapat digunakan adalah teknik DNA barcoding. Teknik DNA barcoding dapat digunakan dalam identifikasi suatu organisme mulai spesies hingga subspesies yang dilakukan secara akurat terhadap berbagai spesies yang sulit untuk dibedakan secara morfologi (Tudge 2000). DNA barcoding adalah suatu sistem yang dirancang untuk identifikasi spesies secara cepat dan akurat sebagai penanda spesies (Hebert et al. 2005). Sumber DNA pada hewan eukariot terbagi atas DNA inti dan DNA mitokondria. Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) merupakan bagian dari DNA mitokondria yang sering digunakan untuk barcoding spesies maupun subspesies. Menurut Avise et al. (1987) menyatakan bahwa hubungan kekerabatan dapat dianalisis secara filogenik menggunakan DNA mitokondria.
2
Perumusan Masalah Indonesia memiliki potensi yang besar untuk mengembangkan udang karang, namun pengembangan dan pemanfaatan genus Panulirus belum banyak dilakukan di Indonesia. Tahap identifikasi merupakan tahap awal yang penting untuk kepastian taksonomi spesies. Kepastian taksonomi (taxonomy certainty) sangat diperlukan dalam menentukan pengelolaan dan konservasi suatu sumberdaya hayati. Pendekatan molekuler menjadi salah satu cara untuk mengatasi masalah tersebut. DNA barcoding merupakan salah satu metode untuk mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat, dengan menggunakan fragmen sekuen nukleotida. Salah satu habitat udang karang ditemukan di Yogyakarta yang terletak di perairan Selatan Jawa. Penentuan klasifikasi genus Panulirus berdasarkan karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena fenomena spesies kriptik yang banyak terjadi pada hewan-hewan akuatik. Oleh sebab itu, teknik identifikasi yang lebih akurat sangat diperlukan, diantaranya identifikasi berdasarkan marka molekuler. Teknik identifikasi yang digunakan adalah teknik DNA barcoding untuk mengetahui situs nukleotida spesifik yang menjadi pembeda antarspesies di dalam genus Panulirus yang mendiami perairan Selatan Yogyakarta. Penggunaan marka molekuler ini mampu mengungkap fenomena spesies kriptik, sehingga pengelolaan sumberdaya genus Panulirus dapat diterapkan dengan tepat.
Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi lobster genus Panulirus berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) yang dapat membantu pengungkapan terjadinya fenomena spesies kriptik sebagai informasi dasar dalam pengelolaan sumberdaya yang akurat.
Manfaat Penelitian Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kepastian spesies dari genus Panulirus yang terdapat di perairan Selatan Yogyakarta berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI).
METODE Waktu dan Lokasi Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2015 hingga Februari 2016. Pengambilan contoh dilakukan di perairan Selatan Yogyakarta dan analisis di Laboratorium Biologi Molekuler Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan
3 dan Laboratorium Terpadu Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Prosedur Penelitian Pengambilan contoh Spesies contoh genus Panulirus adalah koleksi laboratorium yang diperoleh dari pengumpul di perairan Selatan Yogyakarta. Spesies yang diperoleh sebanyak lima spesies yaitu P. versicolor, P. penicillatus, P. longipes, P. homarus, dan P. ornatus. Spesies tersebut telah diawetkan bagian daging atau otot kaki kemudian dimasukkan ke dalam tabung koleksi berukuran 100 mL yang berisi alkohol 96%, proses ini merupakan proses pengawetan dari lobster Panulirus spp. agar contoh yang akan digunakan untuk proses selanjutnya tidak rusak. Isolasi dan ekstraksi DNA Isolasi dan ekstraksi DNA dilakukan terhadap daging dan otot kaki lobster Panulirus spp. yang telah diawetkan dalam alkohol 96%. Spesies contoh yang telah diawetkan tersebut ditimbang dengan berat otot 30 mg, dicuci menggunakan akuades, dan divortex sebanyak 10 kali. Kemudian contoh dikeringkan dan dimasukkan ke dalam microtube untuk selanjutnya dilakukan proses isolasi dan ekstraksi DNA. Bahan isolasi dan ekstraksi DNA ini menggunakan kit komersil (Gene Aid). Prosedur isolasi dan ekstraksi mengikuti instruksi dari manual pabrik dengan beberapa modifikasi. Uji kualitas DNA Pengujian kualitas DNA dilakukan dengan metode elektroforesis menggunakan gel agarosa 1,2% yang telah diwarnai dengan ethidium bromide (EtBr), direndam dalam larutan buffer TAE 1x (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) kemudian dialiri listrik 100 volt selama 30 menit. Penggunaan EtBr bertujuan untuk memberikan warna pada DNA, sehingga pita DNA dapat terlihat saat dilakukan visualisasi dibawah sinar UV. Volume DNA total yang digunakan adalah sebanyak 2,5 μl. Gel agarosa kemudian diamati dibawah sinar UV. DNA total dengan kualitas baik akan memiliki pita DNA yang tebal saat divisualisasikan di bawah sinar UV. Amplifikasi DNA dengan metode PCR Amplifikasi DNA dilakukan dengan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) menggunakan kit komersial Kapa Extra Hot Start. Fragmen DNA yang diamplifikasi adalah gen COI. Primer yang digunakan adalah primer universal yang didesain oleh Butet (2013, unpublish data) untuk beberapa biota akuatik. Amplifikasi DNA dilakukan dalam beberapa tahap, yaitu predenaturasi pada suhu 95 oC selama 3 menit, denaturasi pada suhu 95 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 52 oC selama 1 menit, elongasi pada suhu 72 oC selama 1 menit, postelongasi pada suhu 72 oC selama 5 menit, dan penyimpanan pada suhu 15 oC selama 10 menit.
4 Sekuensing DNA gen marka genetik COI Produk PCR yang memiliki kualitas DNA yang baik dapat dilanjutkan ke tahap sekuensing atau pembacaan sekuens DNA untuk selanjutnya ditentukan sekuen basa nukleotida. Proses produk PCR dilakukan dengan menggunakan metode Sanger (1977) dengan mengirimkan produk PCR tersebut ke perusahaan jasa pelayanan sekuensing.
Analisis Data Validasi spesies Hasil sekuensing data kromatogram berupa urutan basa nukleotida gen COI pada genus Panulirus divalidasi menggunakan BLASTn (National Center for Biotechnology Information) dan disejajarkan dengan spesies lain dari GenBank. Identifikasi molekuler dari genus Panulirus dengan menggunakan sekuen gen COI telah dipastikan kebenaran dan kedekatannya antarspesies berdasarkan BLASTn. Pensejajaran genus Panulirus gen COI lobster genus Panulirus Hasil sekuensing diedit secara manual untuk mendapatkan urutan basa nukleotida gen COI dari genus Panulirus. Urutan basa nukleotida genus Panulirus kemudian akan disejajarkan dengan spesies lainnya menggunakan metode Clustal W pada software MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011). Hasil sekuen nukleotida gen COI genus Panulirus diedit dan dianalisis untuk mendapatkan sekuen DNA dari gen COI tersebut. Jarak genetik Jarak genetik sekuen gen COI antarspesies Panulirus spp. dihitung menggunakan metode pairwise distance yang terdapat pada program MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011). Hasil Penghitungan jarak genetik disajikan dalam bentuk matriks data yang digunakan untuk melakukan analisis hubungan kekerabatan antarspesies berdasarkan pohon filogeni. Analisis filogeni Pohon filogeni dikonstruksi berdasarkan jarak genetik antarspesies. Konstruksi pohon filogeni berfungsi untuk mengetahui hubungan kekerabatan antarspesies. Analisis filogeni dilakukan menggunakan metode bootstrapped Neighbour Joining Tree dengan 1000 kali pengulangan pada software MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011).
5
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil DNA total Isolasi dan ekstraksi DNA P. homarus dan P. penicillatus (Gambar 1) merupakan contoh koleksi laboratorium yang berasal dari perairan Selatan Yogyakarta. Hasil isolasi dan ekstraksi DNA P. homarus dan P. penicillatus menghasilkan kualitas DNA yang cukup baik.
Contoh 1 Contoh 2 Gambar 1 Spesies contoh lobster P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2) Kualitas DNA yang baik dapat ditentukan melalui pengujian terhadap DNA total pada agarosa 1,2%. Adanya pita DNA yang tebal dan terang merupakan hasil kualitas DNA total yang baik (Gambar 2). Kualitas DNA total tersebut diperoleh dari hasil isolasi dan ekstraksi DNA. DNA total yang memiliki kualitas yang baik layak dijadikan sebagai cetakan amplifikasi gen COI dengan menggunakan teknik PCR.
Gambar 2 Hasil pengujian isolasi DNA total otot kaki P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2) pada gel agarosa 1,2%
6 Amplifikasi DNA gen COI genus Panulirus Amplifikasi DNA gen COI dilakukan dengan menggunakan teknik PCR dengan penempelan primer pada suhu optimum 54oC dan 53oC. Panjang urutan basa nukleotida gen COI dari hasil amplifikasi kedua contoh Panulirus tersebut berukuran antara 500-750 pb (pasang basa) (Gambar 3). Produk PCR yang baik dari ke 2 contoh DNA tersebut dimurnikan sehingga diperoleh kualitas yang baik dan layak dijadikan sebagai cetakan dalam proses sekuensing untuk memperoleh fragmen gen COI dari lobster genus Panulirus.
Gambar 3 Elektroforesis DNA hasil produk PCR pada gel agarosa 1,2%, marker 1 kb, P. homarus (contoh 1) dan P. penicillatus (contoh 2) Sekuensing dan validasi DNA gen marka genetik COI genus Panulirus Data urutan nukleotida fragmen gen COI lobster genus Panulirus dari hasil sekuensing, dianalisis menggunakan program BLASTn (Basic Local Alignment Search Tool-nucleotide) yang tersedia di GenBank. Sekuen nukleotida gen COI P. homarus dan P. penicillatus diunggah pada BLASTn pada situs NCBI (National Center for Biotechnology Information) untuk validasi dari kedua spesies tersebut serta mengetahui kekerabatan kedua spesies tersebut dengan spesies lain. Berdasarkan hasil sekuensing dalam fragmen gen COI, basa-basa nukleotida gen COI tersebut disejajarkan dengan primer forward dan reverse menggunakan program MEGA 5.2 (Tamura et al. 2011). Diperoleh hasil panjang nukelotida dari P. homarus dan P. penicillatus, yaitu masing-masing sebesar 658 pb dan 667 pb. Kedua sekuen nukleotida contoh tersebut disejajarkan dan didapatkan hasil sepanjang 660 pb nukleotida fragmen gen COI lobster genus Panulirus. Hasil analisis dari komposisi basa P. homarus dan P. penicillatus, selanjutnya dilakukan pensejajaran sekuen nukleotida gen COI dengan spesies dari famili Palinuridae pada genus yang berlainan, yaitu genus Palinurus. Urutan basa gen COI Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1) yang diperoleh dari GenBank, kemudian dijadikan sebagai outgroup untuk analisis kekerabatan. Berdasarkan hasil analisis dari pensejajaran basa nukleotida menghasilkan nilai conserve sebesar 35,58% (185/520), variabel sebesar 64,43% (335/520), dan singleton sebesar 22,08% (120/520). Dari informasi tersebut dapat diketahui bahwa nilai variabel terdapat variasi basa nukleotida antara spesies ingroup, yaitu P. homarus dan P. penicillatus dengan spesies outgroup, yaitu Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1) yang merupakan pembeda dari masing-masing spesies.
7
Jarak genetik dan analisis filogeni gen COI genus Panulirus Penghitungan jarak genetik antara genus Panulirus spp. dan Palinurus spp. menghasilkan nilai antara 0,759 dan 0,782. Nilai jarak genetik yang tinggi ini menunjukkan kepastian pemisahan genus. Penghitungan jarak genetik interspesies Panulirus spp. yang berasal dari perairan Selatan Yogyakarta menunjukkan kekerabatan yang rendah dengan nilai jarak genetik sebesar 0,132 (13,2%) (Tabel 1). Menurut Hebert et al. (2003), jarak genetik melebihi 3% menunjukkan spesies yang berbeda. Kemiripan morfologi berhasil dibuktikan perbedaan spesies antara P. homarus dan P. penicillatus. Tabel 1 Matriks jarak genetik fragmen gen COI pada P. homarus (contoh 1), P. penicillatus (contoh 2), Palinurus elephas (DQ062206.1), dan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1) berdasarkan metode pairwise distance Panulirus Panulirus Palinurus Palinurus homarus penicillatus elephas mauritanicus 1 2 Panulirus homarus 1 Panulirus penicillatus 2 0.132 Palinurus elephas 0.760 0.759 Palinurus mauritanicus 0.782 0.769 0.051 Hasil Penghitungan jarak genetik pada matriks tersebut kemudian dapat dijadikan sebagai data untuk analisis hubungan kekerabatan berdasarkan pohon filogeni. Hasil analisis tersebut menunjukkan tingkat kekerabatan ingroup. Nilai jarak genetik menjadi dasar untuk merekonstruksi pohon filogeni famili Palinuridae (Gambar 4). Konstruksi pohon filogeni famili Palinuridae menghasilkan DNA kelompok berbeda yang masing-masing mewakili genus Panulirus dan Palinurus. Panulirus homarus Panulirus penicillatus Palinurus elephas (DQ062206.1) Palinurus mauritanicus (DQ062207.1)
Gambar 4 Hasil rekonstruksi pohon filogeni gen COI dari dua jenis contoh dan dua spesies pembanding menggunakan metode NJ dengan bootsrap 1000 Nukleotida spesifik dan situs mutasi gen COI genus Panulirus Situs nukleotida spesifik dan situs mutasi gen COI P. homarus, P. penicillatus dari genus Panulirus dilakukan melalui pensejajaran sekuen nukleotida gen COI dengan spesies dari genus Palinurus. Setelah dilakukan pensejajaran basa nukleotida fragmen gen COI antargenus dari famili Palinuridae, didapatkan hasil sebesar 120 situs nukleotida spesifik yang menunjukkan adanya perubahan spesifik pada genus Panulirus tersebut. Situs spesifik menunjukkan
8 bahwa basa nukleotida dari genus Panulirus sebagai penciri yang dapat membedakan dengan spesies dari genus Palinurus. Pensejajaran sekuen nukleotida gen COI P. homarus dan P. penicillatus dari genus Panulirus didapatkan hasil dari situs mutasi sebesar 22 situs nukleotida. Situs mutasi tersebut merupakan basa nukleotida dari spesies P. homarus dan P. penicillatus yang mengalami perubahan delesi dan insersi. Situs mutasi yang mengalami perubahan delesi terdiri dari 15 situs nukleotida, sedangkan situs yang mengalami perubahan insersi terdiri dari 7 situs nukleotida. Pembahasan Identifikasi molekuler dari genus Panulirus, yaitu P. homarus dan P. penicillatus menggunakan fragmen gen COI memberikan informasi mengenai kepastian spesies dari genus Panulirus khususnya yang terdapat di perairan Selatan Yogyakarta. Menurut FAO (1998), P. homarus memiliki panjang baku maksimum 31 cm, panjang karapas 12 cm serta panjang total rata-rata antara 2025 cm, sedangkan P. penicillatus memiliki panjang baku maksimum 40 cm dan panjang total rata-rata 30 cm. Spesies P. homarus dan P. penicillatus termasuk dalam filum Arthropoda, kelas Malacostraca, ordo Decapoda, famili Palinuridae dan genus Panulirus (Lovett 1881). Penentuan klasifikasi genus Panulirus berdasarkan karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena fenomena spesies kriptik yang banyak terjadi pada hewan-hewan akuatik. Oleh sebab itu, teknik identifikasi yang lebih akurat sangat diperlukan. Menurut Tudge (2000), teknik DNA barcoding dapat digunakan dalam identifikasi suatu organisme secara akurat terhadap berbagai spesies yang sulit dibedakan secara morfologi. Kepastian kedua spesies ini diidentifikasi berdasarkan marka genetik Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) dengan spesies P. homarus dan P. penicillatus menggunakan BLASTn pada situs NCBI dengan masing-masing nilai sebesar 97% dan 99% yang terbukti sangat akurat bahwa hasil identifikasi kedua contoh tersebut termasuk dalam satu genus, yaitu genus Panulirus dalam famili Palinuridae (Hajibabaei et al. 2006). Hasil tersebut menunjukkan bahwa lobster genus Panulirus khususnya P. homarus dan P. penicillatus berbeda dengan spesies lobster lainnya. Hubungan kekerabatan antarspesies di dalam famili Palinuridae dapat dianalisis melalui pensejajaran basa nukleotida fragmen gen COI, menggunakan program MEGA 5.2 melalui metode pairwise distance (Tamura et al. 2011). Urutan basa nukleotida pada kedua spesies dari genus Panulirus disejajarkan dengan spesies Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1) sebagai outgroup yang didapat dari GenBank. Menurut Maddison (1984), adanya penggunaan outgroup bertujuan sebagai faktor koreksi dalam penentuan suatu karakter diantara ingroup yang ada. Hasil jarak genetik terbesar antara genus Panulirus spp. dan Palinurus spp. adalah 0,782. Jarak genetik tersebut diperoleh antara P. homarus dengan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1). Menurut Hebert et al. (2003), perbedaan jarak genetik antara P. homarus dengan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1) dengan spesies lainnya yang dapat diperoleh dari GenBank sebesar 3% atau lebih maka secara molekuler dipastikan bahwa P. homarus dan P. penicillatus berbeda
9 dari spesies Palinurus elephas (DQ062206.1) dan Palinurus mauritanicus (DQ062207.1). Hal ini menunjukkan bahwa teknik molekuler mampu mengidentifikasi perbedaan antara kedua spesies tersebut dengan spesies outgroup diwakili oleh jarak genetik antara kedua spesies tersebut. Pohon filogeni dikonstruksi berdasarkan jarak genetik. Konstruksi pohon filogeni fragmen COI menunjukkan adanya pemisahan yang jelas antara genus Panulirus dengan genus Palinurus. Rekonstruksi pohon filogeni digambarkan berdasarkan adanya hubungan kekerabatan analisis filogeni dengan menggunakan metode Neighborjoining. Pemisahan yang terjadi disebabkan masing-masing spesies mempunyai situs nukleotida spesifik. Perbedaan urutan basa nukleotida antarspesies yang menyebabkan jarak genetik antarspesies semakin besar, sehingga hubungan kekerabatan antarkeduanya semakin jauh. Situs nukleotida spesifik merupakan penciri yang membedakan spesies pada genus Panulirus dengan spesies lainnya pada genus Palinurus. Situs nukleotida spesifik menandakan adanya pembeda dari kedua contoh yang diteliti, yaitu P. homarus dan P. penicillatus dengan spesies yang dibandingkan, yaitu Palinurus elephas dan Palinurus mauritanicus. Situs nukleotida spesifik tersebut dapat ditemukan sebanyak 120 situs spesifik yang berarti bahwa dengan adanya situs tersebut juga terjadi mutasi yang spesifik terhadap genus Panulirus, sehingga mampu membedakan antara genus Panulirus dengan genus Palinurus. Situs nuklotida spesifik sebanyak 120 situs menjadi penciri pada kedua spesies genus Panulirus tersebut. Pada level spesies, sekuen nukleotida pada gen COI P. homarus dan P. penicillatus menunjukkan adanya urutan nukleotida yang bersifat conserve. Sekuen nukleotida gen COI genus Panulirus mengalami delesi dan insersi. Situs mutasi insersi adalah mutasi yang terjadi karena adanya penambahan satu atau lebih basa nukleotida ke dalam urutan DNA, sedangkan mutasi delesi adalah mutasi yang menjadi karena kehilangan satu atau lebih basa nukleotida di dalam DNA. Mutasi menjadi penyebab utama perbedaan variasi nukleotida pada gen COI, sehingga menyebabkan variasi pada susunan nukleotida, variasi yang kecil dapat mempengaruhi keidentikan suatu spesies (Sala dan Knowlton 2006). Hasil situs nukleotida mutasi terdapat 22 situs nukleotida mutasi gen COI genus Panulirus. Terdapat 15 situs nukleotida delesi dan 7 situs nukleotida insersi. Tahap identifikasi merupakan tahap awal yang penting untuk kepastian taksonomi suatu spesies yang sangat diperlukan dalam pengelolaan dan konservasi sumberdaya hayati. Penentuan klasifikasi genus Panulirus berdasarkan karakteristik morfologi pernah mengalami ketidakpastian karena fenomena spesies kriptik yang sering terjadi pada biota perairan (Bickford et al. 2006). DNA barcoding merupakan salah satu metode yang akurat dan cepat untuk mengidentifikasi spesies dengan menggunakan fragmen sekuen nukleotida. Penelitian ini berhasil mengidentifikasi spesies P. homarus dan P. penicillatus dengan akurat, diharapkan permasalahan pengelolaan yang kurang tepat (mismanagement) yang bersumber dari kesalahan identifikasi spesies dari genus Panulirus dapat dihindarkan. Pada umumnya kesalahan dalam pengelolaan suatu stok atau spesies bersumber dari ketidakpastian spesies, karena fenomena spesies kriptik dan kompleks menjadi permasalahan utama dalam identifikasi biota perairan.
10
KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Marka gen COI mampu membedakan spesies P.homarus dan P. penicillatus secara akurat, sehingga permasalahan fenomena spesies kriptik dapat diatasi secara molekuler. Adanya kepastian status taksonomi ini, maka pengelolaan kedua spesies dari genus Panulirus dapat dibedakan. Saran Informasi molekuler dari marka gen selain COI dapat diperoleh lebih lanjut untuk mendukung pengelolaan sumberdaya lobster, selain itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai kajian aspek biologi lobster seperti reproduksi, dinamika populasi, dan lain-lain di perairan Selatan Yogyakarta sehingga diperoleh informasi lebih lengkap mengenai kepastian lobster genus Panulirus.
DAFTAR PUSTAKA Abdullah MF. 2009. Molecular Genetic Relationship of The Spiny Lobster Genus Panulirus In Pacific And Indian Oceans Using RAPD Method. [skripsi]. Bogor (ID): Bogor Agricultural University. Avise JC, Arnold J, Ball AM, Bermingham E, Lamb T, Neigel JE, Reeb CA, Saunders NC. 1987. Intraspecific Phylogeography: The Mitochondrial DNA Bridges I Between Population Genetics and Systematics. Ann. Rev. Ecol. Syst. 18:489-522. Bickford D, Lohman DJ, Sodhi NS, Ng PKL, Meier R, Winker K, Ingram KK, Das I. 2006. Cryptic species as a window on diversity and conservation. Ecology and Evolution. 22(3):148-155. Chan TY dan Ng PKL. 2001. On The Momenculture of The Commercially Important Spiny Lobster Panulirus longipes femoristriga (Von Martens, 1872), P. bispinosus Borradaile, 1899, and P. albiflagellum Chan & Chu, 1996 (Decapoda, Palinuridae). Koninklijke Bril NV Leiden. Crustaceana 74(1): 123-127. FAO. 1998. The Living Marine Resources of The Western Central Pacific :Volume 2. Cephalopods, Crustaceans, Holothurians And Sharks. Carpenter KE, Niem VH, editor. Rome (IT): FAO. Fauzi M, Prasetyo AP, Hargiyatno IT, Satria F, Utama AA. 2013. Hubungan Panjang-Berat Dan Faktor Kondisi Lobster Batu (Panulirus Penicillatus) Di Perairan Selatan Gunung Kidul Dan Pacitan. Bawal. 5(2): 97-102. Hajibabaei M, Smith MA, Janzen DH, Rodriguez JJ, Whitfield JB, Hebert PDN. 2006. A Minimalist Barcode Can Identify A Specimen Whose DNA Is Degraded. J Compilation Blackwell Publishing. 6: 959-964. Hebert PDN, Cywinska A, Ball SL, DeWaard JR. 2003. Biological Identifications Through DNA Barcodes. Proceedings of the Royal Society of London Series B, Biological Sciences. 270: 313- 321.
11 Hebert PDN dan Gregory TR. 2005. The Promise of DNA Barcoding for Taxonomy. Syst. Biol. 54(5): 852-859. Junaidi M, Cokrowati N, Abidin Z. 2010. Aspek Reproduksi Lobster (Panulirus sp.) di Perairan Teluk Ekas Pulau Lombok. Kelautan. 3(1):29-36. Lovett DL. 1981. A Guide to The Shrimps, Prawns, Lobster and Crabs of Malaysia And Singapore, Faculty of Fisheries And Marine Science. Universiti Pertanian Malaysia. Malaysia. Maddison WP, Donoghue MJ, Maddison DR. 1984. Outgroup Analysis And Parsimony. Syst Zool. 33:83-103. Moosa MK. 1984. Udang karang (Panulirus Spp.) Dari Perairan Indonesia. Lembaga Oseanologi Nasional, LIPI, Jakarta : 40 p. Nawangwulan S. 2001. Analisis Sistem Penangkapan Lobster (Panulirus Sp.) Di Perairan Pengandaran Kabupaten Ciamis Jawa Barat [Skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Sala E dan Knowlton N. 2006. Global Marine Biodiversity Trends. Annu Review of Environment and Resources. 31:93-122. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA Sequencing with Chainterminating Inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 74: 5463-5467. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2011. Mega 5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. J Mol Biol Evol. 28(10):2731–2739. Tudge C. 2000. The Variety of Life. New York (US): Oxford University Press. Utami DDY. 1999. Analisis Sumberdaya dan Tingkat Pemanfaatan Lobster (Panulirus Sp.) yang didaratkan di Pangandaran, Ciamis, Jawa Barat. [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Windyarto A. 2000. Studi Tentang Perikanan Udang Karang (Spiny Lobster, Panulirus Spp) di Daerah Pameungpeuk Kabupaten Garut, Jawa Barat. [skipsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Yusnaini, Nessa MN, Djawad MI, Trijuno DD. 2009. Ciri Morfologi Jenis Kelamin dan Kedewasaanlobster Mutiara (Panulirus ornatus) Sex Morphologycal Characteristics and Maturity of The Ornated Lobster Panulirus ornatus. Torani. 19 (3): 166– 174.
12
RIWAYAT HIDUP Penulis bernama lengkap Widy Triaprilyanti, lahir di Lampung Barat, 17 April 1994, merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara dari ibu bernama Wardiah dan ayah Bardiarza. Penulis mulai mengikuti pendidikan sekolah dasar di SDN 1 Liwa dan lulus pada tahun 2006. Melanjutkan di SMPN 1 Liwa dan lulus pada tahun 2009 serta dilanjutkan di SMAN 1 Liwa dan lulus pada tahun 2012. Penulis lulus seleksi menjadi mahasiswa di Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN) Undangan pada tahun 2012 sebagai mahasiswa Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Kegiatan di luar akademik, Penulis aktif dalam organisasi seni khususnya dalam bidang seni Tari Kreasi Tradisional dan dalam bidang Olahraga. Selain mengikuti perkuliahan, Penulis berkesempatan menjadi asisten mata Kuliah Biologi Populasi Ikan (2014/2015). Penulis juga aktif berpartisipasi dalam berbagai kepanitiaan di lingkungan kampus IPB.
