KARAKTERISTIK GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) PADA KIJING Anodonta woodiana (Lea, 1834)
RATNA PUSPITA
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
ABSTRAK RATNA PUSPITA. Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Kijing Anodonta woodiana (Lea, 1834). Dibimbing oleh DEDY DURYADI SOLIHIN dan SATA YOSHIDA SRIE RAHAYU. Anodonta woodiana merupakan kerang air tawar yang telah banyak dibudidayakan karena kemampuannya untuk memproduksi mutiara. A. woodiana memiliki kemampuan untuk menghasilkan nacre dan kristal prismatik penghasil mutiara. Kemampuan tersebut erat kaitannya dengan informasi genetik yang dimiliki oleh spesies ini. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji karakteristik gen cytochrome oxidase subunit I (COI) pada kijing A. woodiana asal Jawa Barat. DNA genom diekstraksi dari otot kaki kijing A. woodiana asal Bogor dan Depok. DNA total hasil ekstraksi dilanjutkan pada proses amplifikasi dan sekuensing gen COI. Gen COI A. woodiana disejajarkan dengan beberapa gen COI spesies lain yaitu ingroup (famili Unionidae) dan outgroup yang diperoleh dari GenBank. Amplifikasi gen COI berhasil dilakukan dengan ukuran 608 bp. Penelitian ini belum mampu mengkarakterisasi gen COI A. woodiana dengan baik karena beberapa faktor penghambat. Panjang nukleotida A. woodiana sebesar 608 bp belum dapat dijadikan sebagai barcode dari spesies tersebut. Analisis hubungan kekerabatan pada A. woodiana menunjukkan bahwa A. woodiana terpisah dari pengelompokkan dengan anggota famili Unionidae lainnya. Kata kunci: Anodonta woodiana, COI, karakteristik
ABSTRACT RATNA PUSPITA. Characteristic of Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) Gene in Freshwater Mussel (Anodonta woodiana Lea, 1834). Supervised by DEDY DURYADI SOLIHIN and SATA YOSHIDA SRIE RAHAYU. Anodonta woodiana is one of freshwater mussel which have been widely cultivated for its ability to produce pearls. A. woodiana has the ability to produce nacre and prismatic crystal that produce pearls. This ability is closely related to genetic information in this species. The aim of this study was to examine the characteristic of cytochrome oxidase subunit I (COI) gene in freshwater mussel A. woodiana from West Java Province. Genomic DNA was extracted from tissue of A. woodiana from Bogor and Depok. Extracted DNA continued by amplification and sequencing of COI gene. COI gene was aligned with some COI genes from other species, ingroup (familiy Unionidae) and outgroup obtained from GenBank. Amplified of COI gene were successfully yielded in 608 bp. This study was not able to characterize COI gene of A. woodiana well because there are inhibitors. Nucleotid along 608 bp can not be used as a barcode. Phylogenetic analysis of A. woodiana showed that A. woodiana is separated from other family Unionidae. Key words: Anodonta woodiana, COI, characteristic
KARAKTERISTIK GEN CYTOCHROME OXIDASE SUBUNIT I (COI) PADA KIJING Anodonta woodiana (Lea, 1834)
RATNA PUSPITA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi : Karakteristik Gen Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) pada Kijing Anodonta woodiana (Lea, 1834) Nama : Ratna Puspita NIM : G34070040
Disetujui
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA NIP. 19561102 198403 1 003
Dr. S.Y. Srie Rahayu, M.Si, S. Pi NIP. 10300012364
Diketahui Ketua Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S NIP. 19641002 198903 1002
Tanggal Lulus:
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA dan Ibu Dr. S.Y. Srie Rahayu, M.Si, S.Pi selaku pembimbing atas arahan, saran, dan bimbingan selama proses penelitian dan penyusunan karya ilmiah. Terima kasih penulis sampaikan kepada ibu Dr. Ir. Nurlisa A. Butet, M.Sc atas segala bantuan, nasihat, dan doanya. Terima kasih kepada Ibu, Almarhum Bapak, serta seluruh keluarga, atas dukungan, doa, dan kasih sayangnya. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada teman seperjuangan: Dini, Dewi, Gita, Kak Nining, dan Fery atas bantuan dan semangat yang selalu diberikan selama penelitian. Penulis berharap semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Maret 2013
Ratna Puspita
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bekasi pada tanggal 25 Maret 1989 dari ayah Sukardi (Alm) dan ibu Syahira. Penulis merupakan anak ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2007 penulis lulus dari MAN 8 Jakarta. Pada tahun yang sama, penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Institut Pertanian Bogor, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Departemen Biologi. Penulis mendapatkan beasiswa Bantuan Belajar Mahasiswa (BBM) dari DIKTI pada tahun 2009 dan BCA pada tahun 2010-2012. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif mengikuti organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) dan Badan Pengawas Himpro (BPH). Selain itu, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Botani Umum pada tahun ajaran 2010/2011. Penulis telah melaksanakan Praktik Lapangan pada bulan Juli-Agustus 2010 di PT. Krama Yudha Ratu Motor dengan judul “Pengolahan Limbah Cair di PT. Krama Yudha Ratu Motor Jakarta Timur”.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .................................................................................................................vii DAFTAR LAMPIRAN ..............................................................................................................vii PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1 Latar Belakang ........................................................................................................................ 1 Tujuan ..................................................................................................................................... 1 BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 1 Waktu dan Tempat .................................................................................................................. 1 Bahan ...................................................................................................................................... 1 Metode .................................................................................................................................... 1 Ekstraksi dan Purifikasi DNA .............................................................................................. 1 Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA.......................................................................... 2 Perunutan Produk PCR (Sekuensing) ................................................................................... 2 Analisis Data dan Filogeni ................................................................................................... 2 HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................................................................... 3 Hasil ....................................................................................................................................... 3 Ekstraksi DNA Total ........................................................................................................... 3 Amplifikasi Daerah COI ...................................................................................................... 3 Sekuens dan Perunutan Produk PCR Daerah COI................................................................. 3 Analisis Filogeni ................................................................................................................. 4 Pembahasan............................................................................................................................. 4 SIMPULAN ................................................................................................................................ 5 SARAN ....................................................................................................................................... 5 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 5
1
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Hasil ekstraksi DNA total otot kijing pada gel agarosa 1.2%................................................…..3 2 Hasil amplifikasi gen COI pada gel agarosa 1.2%................................................................…..3 3 Visualisasi hasil pre-treatment produk PCR pada gel agarosa 1%........................................…..4 4 Posisi segmen gen COI A. woodiana berdasarkan gen COI M. edulis...................................…..4 5 Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan runutan 495 nukleotida COI dengan metode Neighboor-Joining, bootstrapped 1000x, model p-distance.......................................................4
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Pensejajaran berganda nukleotida (612 nt) pada gen COI A. woodiana dengan sekuen Mytilus edulis yang berasal dari GenBank.............................................................................…..8 2 Pensejajaran berganda nukleotida (495 nt) pada gen COI A. woodiana dengan sekuen lain yang berasal dari GenBank.................................................................................................10 3 Matriks perbedaan rata-rata nukleotida berdasarkan metode pairwise distance daerah COI pada A. woodiana dengan beberapa pembandingnya (ingroup dan outgroup) yang berasal dari GenBank.…………............................................................................………17
1
PENDAHULUAN Latar belakang Kerang air tawar Anodonta woodiana (Kijing Taiwan) merupakan salah satu sumberdaya perikanan air tawar yang memiliki potensi ekonomi dan ekologi yang besar bagi masyarakat Indonesia (Hamidah 2006). Kijing bivalvia famili Unionidae ini dapat dimakan, cangkangnya berguna untuk bahan baku industri kancing, dan pakan ternak. A. woodiana bersifat filter feeder, dapat mengurangi pencemaran lingkungan (Rahayu et al. 2013). Berdasarkan hasil penelitian Krolak dan Zdanowski (2001), kijing ini memiliki kemampuan sebagai bioakumulator sehingga dapat mengurangi kadar logam berat di Danau Konin, Polandia. Saat ini, kijing A. woodiana telah banyak dibudidayakan karena kemampuannya untuk memproduksi mutiara (Rachman et al. 2009). Secara fisiologis, A. woodiana mempunyai kemampuan untuk menghasilkan nacre dan kristal prismatik penghasil mutiara (Ram dan Misra 2003). Kualitas lapisan mutiara (nacre) merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kualitas mutiara yang dihasilkan (Rachman et al. 2009). Kemampuan tersebut erat kaitannya dengan faktor genetik yang dimiliki oleh spesies ini. Oleh karena itu, karakteristik genetik dari organisme ini menarik untuk dipelajari. Informasi mengenai karakteristik genom hewan ini masih terbatas sehingga perlu dilakukan penelitian dasar yang dapat mendukung kemudahan penggalian informasi lebih mendalam. Informasi genetik dalam hewan disimpan dalam DNA inti dan DNA organel (mitokondria dan kloroplas) (Nuryanto dan Solihin 2006). Penggunaan DNA mitokondria (mtDNA) dalam studi keragaman genetik memiliki beberapa kelebihan. mtDNA terdapat dalam jumlah kopi yang tinggi sehingga mudah diisolasi untuk berbagai keperluan analisis genom. Ukuran mtDNA relatif kecil sehingga dapat dipelajari secara menyeluruh sebagai satu kesatuan yang utuh (Solihin 1994). Gen cytochrome oxidase subunit I (COI) merupakan salah satu gen penyandi protein di dalam genom mitokondria (mtDNA). Gen COI digunakan untuk mempelajari karakteristik genetik antar spesies maupun antar individu (Hebert et al. 2003). COI juga dapat digunakan sebagai barcode.
Perkembangan literatur tentang barcode DNA menunjukkan bahwa sebuah fragmen pendek COI dapat digunakan sebagai penanda variasi yang secara akurat dapat mengidentifikasi berbagai macam hewan sampai tingkat spesies (Luo et al. 2011). Kajian molekuler terhadap A. woodiana di Indonesia masih sangat kurang. Berdasarkan basis data genetik di GenBank, belum ada data lengkap genom spesies A. woodiana terutama asal Indonesia. Hasil penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai informasi dasar mengenai karakteristik genetik kijing A. woodiana. Tujuan Penelitian bertujuan untuk mengkaji karakteristik gen cytochrome oxidase subunit I (COI) pada kijing Anodonta woodiana asal Jawa Barat. BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan September 2011 hingga bulan Desember 2012, bertempat di Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) dan Laboratorium Terpadu Departemen Biologi. Bahan Bahan yang digunakan adalah otot kaki kijing Anodonta woodiana. Sampel kijing diperoleh dari dua tempat berbeda, yaitu kolam Departemen Budidaya Perairan, Institut Pertanian Bogor dan kolam Balai Penelitian dan Pengembangan Budidaya Ikan Hias (BPPBIH) Depok. Metode Ekstraksi dan Purifikasi DNA Ekstraksi DNA total otot kijing A. woodiana dilakukan terhadap 18 sampel asal Bogor dan 7 sampel asal Depok. DNA A. woodiana diekstraksi dengan menggunakan metode CTAB. Metode ini mengikuti metode Solihin (1997). Sampel otot yang telah dicacah dan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf 1.5 ml diberi larutan LowTE (1 mM Tris HCl, 10 mM EDTA) sebanyak 500 μl. Sampel tersebut diinkubasi pada suhu 37°C selama satu bulan. Sampel yang telah diinkubasi lalu disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama tiga menit. Supernatan dibuang, pelet berupa otot dihaluskan menggunakan mortar dan ditambah larutan CTAB sebanyak 600 μl.
2
Supernatant dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf baru lalu ditambah Proteinase K 10 μl. Sampel diinkubasi pada suhu 55°C selama semalam. Suspensi yang telah diinkubasi ditambah phenol 400 μl, CIAA 400 μl, dan NaCl 5M 40 μl lalu dikocok pelan selama 30 menit pada suhu ruang. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama tiga menit. Supernatan dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf baru, ditambah dengan 400 μl CIAA, dikocok selama 20 menit. Setelah itu, supernatan dipindahkan ke dalam tabung Eppendorf baru dan ditambah etanol absolut sebanyak 2x volume. Sampel disimpan di dalam freezer selama semalam. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama lima menit lalu supernatan dibuang sehingga didapatkan endapan (DNA). Pada endapan, ditambah 800 µl etanol 70%, disentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm selama lima menit. Supernatan dibuang. DNA (endapan putih) dikeringudarakan selama 15-30 menit. Endapan ditambah 35100 µl larutan TE-RNAse, kemudian diinkubasi pada suhu 370 C selama 15 menit dan disimpan di dalam freezer. DNA hasil ekstraksi dilihat dengan cara dimigrasikan pada elektroforesis gel agarosa 1.2% menggunakan buffer 1xTAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) selama 35 menit. Gel agarosa diwarnai dengan ethidium bromide (0.5 g/ml), diamati, dan difoto menggunakan GELDOC di bawah sinar ultraviolet 400 nm. Amplifikasi dan Visualisasi Fragmen DNA Amplifikasi DNA hasil purifikasi dilakukan melalui teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Fragmen DNA yang diamplifikasi yaitu gen COI pada A.woodiana, dengan menggunakan pasangan primer koleksi Dr. Dedy D. Solihin, DEA dan Ir. Nurlisa A. Butet, MSc dengan primer forward AGF (5’AGCCGGCAGGTCTTTATGTAGAAGTT AG-3’) dan primer reverse AGR (5’TAAACCTCCGGGTGTCCAAAAAACCA -3’). Produk PCR yang dihasilkan nantinya adalah sebesar 608 bp. Komposisi pereaksi PCR terdiri atas 3 µl DNA template, 12.5 µl Go Taq® Green 2x, 3.3 µl ddH2O, 2 µl enhancer, 2 µl MgCl2 50 mM, 1 µl dNTP, 1 µl primer forward 20 ρmol, 1 µl primer reverse 20 ρmol dan 0.2 µl Taq Polymerase (Invitrogen) dalam volume total reaksi 25 µl.
Siklus PCR dilakukan sebanyak 35 kali dengan suhu predenaturasi 94ºC selama 5 menit, denaturasi 94ºC selama 45 detik, annealing (penempelan primer) 59ºC selama satu menit 30 detik, ekstensi atau elongasi 72ºC selama satu menit, post-elongasi 72ºC selama 7 menit. Mesin PCR (Termal Cycler) yang digunakan adalah Veriti. Produk PCR dimigrasikan pada elektroforesis gel agarosa 1.2% dan diwarnai dengan ethidium bromide selama 60 menit. Setelah itu, divisualisasikan menggunakan GELDOC di bawah sinar ultraviolet (UV). Perunutan Produk PCR (Sekuensing) Sekuensing merupakan metode yang digunakan untuk mengetahui variasi genetik gen COI. Pembacaan sekuens DNA dilakukan untuk mengetahui urutan nukleotida dan asam amino suatu gen, juga menganalisis kekerabatan dan jalur evolusinya (Albert et al. 1994). DNA cetakan hasil PCR digunakan untuk reaksi perunutan nukleotida. Produk PCR disekuensing di PT Genetika Science, Indonesia dengan primer forward dan reverse. Analisis Data dan Filogeni Pensejajaran runutan nukleotida gen penyandi COI dianalisis menggunakan program Clustal W yang terdapat pada software MEGA 4.0 (Tamura et al. 2007). Runutan nukleotida gen COI A. woodiana dengan primer forward dan reverse diedit dan dianalisis untuk mendapatkan sekuens DNA dari gen COI. Runutan nukleotida yang telah diedit, disejajarkan dengan urutan baku nukleotida dari GenBank yang satu famili dengan Unionidae (ingroup) dengan kode akses DQ340804.1 (A. woodiana), GU230747.1 (A. anatina), AY655021.1 (Strophitus subvexus), JX046553.1 (Unio crassus), JX046690.1 (Unio pictorum) dan yang bukan famili Unionidae (outgroup) DQ272383.1 (Margaritifera falcata), JN243891.1 (Margaritifera margaritifera), AY484747.1 (Mytilus edulis), JN612835.1 (Cucumerunio novaehollandiae). Analisis filogeni menggunakan perangkat lunak MEGA 4.0 dengan metode bootstrapped Neighbor-Joining (NJ) memakai 1000 kali pengulangan. Analisis dengan program MEGA tersebut menghasilkan matriks jarak genetik berdasarkan persamaan dan perbedaan basa nukleotida.
3
1
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Ekstraksi DNA Total Ekstraksi DNA total otot A. woodiana menunjukkan hasil yang cukup baik. Dari 18 sampel asal Bogor yang diekstraksi, 14 sampel, yaitu AB1, AB2, AB3, AB4, AB6, AB7, AB8, AB9, AB10, AB11, AB12, AB13, AB20, dan AB21 memiliki kualitas DNA yang baik, ditunjukkan dengan adanya pita DNA yang tebal. Sampel asal Depok yang berhasil diekstraksi sebanyak empat sampel, yaitu AD2, AD4, AD5, dan AD6. Contoh hasil ekstraksi DNA total yang memiliki kualitas DNA yang baik disajikan pada Gambar 1. DNA total tersebut selanjutnya digunakan sebagai DNA cetakan untuk amplifikasi gen COI dengan menggunakan teknik PCR. 1
2
3
Gambar 1 Hasil ekstraksi DNA total otot kijing pada gel agarosa 1.2%. 1= AB1, 2= AB4, 3= AD4.
Amplifikasi Daerah COI Amplifikasi daerah COI mtDNA menggunakan primer AGF-AGR pada sampel A. woodiana menghasilkan pita tunggal berukuran 608 pb. Dari 18 sampel yang hasil ekstraksinya baik (14 sampel asal Bogor dan empat sampel asal Depok), hanya lima sampel yang berhasil diamplifikasi. Empat sampel asal Bogor dan satu sampel asal Depok. Namun, sampel yang dapat dianalisis lebih lanjut ke tahap sekuensing hanya tiga sampel, yaitu AB1, AB4, dan AD4. Hasil visualisasi amplifikasi gen COI dapat dilihat pada Gambar 2 berikut.
2
3
4
5
6
608 bp 500 bp
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen COI pada gel agarosa 1.2%. 1= marker 100 bp, 2-6= AB1, AB2, AB4, AB12, AD4. Sekuens dan Perunutan Produk PCR Daerah COI Produk PCR diuji kualitasnya terlebih dahulu melalui pre-treatment oleh jasa pelayanan sekuens PT. Genetika Science sebelum dilakukan proses cycle sequencing (Gambar 3). Perunutan DNA dilakukan dari dua arah, yaitu forward dan reverse. Dari tiga sampel yang disekuens, dua sampel asal Bogor yaitu AB1 dan AB4 tidak menampakkan hasil sekuensing yang baik sehingga tidak diikutkan dalam analisis data dan filogeni. Sampel tersebut memiliki panjang nukleotida yang lebih pendek dan memiliki banyak huruf N yang menunjukkan basa nukleotida tidak terdeteksi. Berdasarkan hasil sekuensing dan hasil pensejajaran (Alignment), sampel AD4 memiliki panjang nukleotida sebesar 608 bp. Posisi segmen gen COI Anodonta woodiana berdasarkan gen COI Mytilus edulis (AY484747.1) dapat dilihat pada Gambar 4. Komposisi nukleotida dari gen COI AD4 terdiri atas 40.5% basa T, 15.8% basa C, 21.7% basa adenin A, dan 22.0% basa G. Basa yang mendominasi yaitu T dan A. Data sekuens AD4 selanjutnya disejajarkan dengan ingroup (famili Unionidae) dan dengan outgroup (non famili Unionidae) yang berasal dari GenBank. Panjang basa nukleotida hasil pensejajaran adalah 495 nt. Berdasarkan hasil pensejajaran berganda diperoleh nilai conserved sebesar 33.73% (167/495) dan nilai variable sebesar 65.25% (323/495). Sementara itu, nilai conserved
4
dan nilai variable antara AD4 dengan M. edulis masing-masing sebesar 61.60% (377/612) dan 36.93% (226/612). 1
2
3
4
608 bp 500 bp 250 bp
Gambar 3 Visualisasi hasil pre-treatment produk PCR pada gel agarosa 1%. 1= marker 1 kb, 2= AB1, 3= AB4, 4= AD4.
COI M. edulis (1656 bp)
Gambar 4 Posisi segmen gen COI A. woodiana berdasarkan gen COI M. edulis. Analisis Filogeni Hubungan kekerabatan antar famili Unionidae (A. anatina, S. subvexus, U. crassus, dan U. pictorum) serta famili lainnya (C. novaehollandiae, M. falcata, M. margaritifera, dan M. edulis) dapat dibandingkan berdasarkan jarak genetiknya. Jarak genetiknya berkisar antara 0.387-0.435
(38.7%-43.5%). Data runutan nukleotida gen COI A. woodiana yang berasal dari GenBank juga disertakan dalam analisis filogeni. Hal ini disebabkan hanya ada satu sampel dalam penelitian ini, sehingga harus ada data dari spesies yang sama sebagai pembanding. AD4 dengan A. woodiana memiliki jarak genetik sebesar 0.431 (43.1%) atau memiliki persentase kesamaan sebesar 56.9%. Jarak genetik terkecil adalah antara AD4 dengan M. edulis (0.387) sedangkan jarak genetik terbesar adalah dengan M. margaritifera (0.435). Rekonstruksi pohon filogeni AD4 dengan spesies dari sesama famili Unionidae dan dari famili yang berbeda berdasarkan jarak genetiknya dapat dilihat pada Gambar 5. Pada gambar 5 dapat dilihat bahwa AD4 terletak pada nodus yang sama (nodus A) hanya dengan M. edulis yang bukan merupakan anggota famili Unionidae. Sebaliknya, A. woodiana (DQ340804.1) terletak di nodus yang berbeda (nodus B). Pembahasan Produk PCR yang berkualitas baik dicirikan dengan pita tunggal yang tebal, yang mengindikasikan bahwa kuantitas DNA tersebut tinggi. DNA dari sampel AB1, AB4, dan AD4 memiliki kualitas yang baik tetapi produk PCR nya kurang baik. Sampel asal Bogor memiliki pita tunggal yang sangat tipis. Sementara itu, pita yang dihasilkan oleh sampel asal Depok adalah multistrand yang menunjukkan banyak pita yang bukan target. Kualitas produk PCR tersebut berhubungan dengan kualitas DNA yang dihasilkan. Otot kaki A. woodiana yang digunakan untuk ekstraksi DNA mengandung banyak polisakarida dan protein polifenol yang dapat mengkontaminasi
Gambar 5 Rekonstruksi pohon filogeni berdasarkan runutan 495 nukleotida COI dengan metode Neighboor-Joining, bootstrapped 1000x, model p-distance.
5
DNA dan mengganggu proses polimerase enzimatik asam nukleat (Pereira et al. 2011). Kualitas DNA yang bagus sangat penting di dalam proses PCR, dimana kelebihan debris sel dan protein dapat menghambat proses ampilifikasi (Popa et al. 2007). Selain itu, hasil PCR yang kurang baik mungkin disebabkan karena primer yang digunakan kurang spesifik. Pasangan primer AGF dan AGR dibuat berdasarkan sekuens basa COI M. edulis. AB1, AB4, dan AD4 kemungkinan memiliki sekuens basa nukleotida yang berbeda dengan M. edulis, sehingga primer tidak menempel secara spesifik pada target. Hambatan juga terjadi di dalam penentuan komposisi PCR dan suhu optimum annealing (penempelan primer) agar DNA teramplifikasi dengan baik. Menurut Newton dan Graham (1997), jika suhu penempelan primer terlalu tinggi dari suhu optimum, menyebabkan primer tidak menempel dengan DNA cetakan. Jika suhu penempelan primer terlalu rendah dari suhu penempelan optimum menyebabkan mispriming, yaitu penempelan primer pada tempat yang salah pada DNA cetakan sehingga dihasilkan produk non spesifik. Oleh karena itu, dilakukan optimasi terhadap suhu penempelan primer. Pendekatan filogenetik dengan jarak genetik antar sekuens dapat digunakan untuk menunjukkan kedekatan kekerabatan. Persentase jarak genetik sampel AD4 dengan ingroup (A. anatina, S. subvexus, U. crassus, dan U. pictorum) sebesar 39.1%40.6%. Sedangkan persentase jarak genetik AD4 dengan outgroup (M. edulis, C. novaehollandiae, M. falcata, dan M. margaritifera) sebesar 38.7%-43.5%. Berdasarkan analisis filogeni, AD4 terletak pada nodus yang sama (nodus A) hanya dengan M. edulis yang bukan merupakan anggota famili Unionidae. Sebaliknya, A. woodiana (DQ340804.1) terletak di nodus yang berbeda (nodus B). Berdasarkan taksonomi, seharusnya AD4 berada pada satu nodus dengan anggota famili Unionidae. Hal ini mungkin disebabkan karena kesalahan dalam komposisi nukleotida sampel AD4. Menurut Foster dan Hickey (1997) komposisi bias di dalam urutan DNA dapat mempengaruhi analisis filogenetik yang berdasarkan urutan DNA tersebut. Komposisi COI yang umum digunakan di dalam studi filogenetik dipengaruhi oleh perbedaan komposisi pada tingkat DNA. Hal ini sesuai dengan
pendapat Bussche et al. (1998) bahwa komposisi nukleotida yang bias dapat mengakibatkan analisis filogenetik tidak akurat. Salah satu faktor penyebab kesalahan dalam komposisi nukleotida adalah tingginya kandungan basa adenin (A) dan timin (T). Kandungan A dan T sampel AD4 sangat dominan, yaitu 21.7% dan 40.5%. Beberapa faktor lain yang dapat mempengaruhi rekonstruksi pohon filogeni, yaitu heterogenitas dalam tingkat substitusi antara garis keturunan, mutasi, substitusi nukleotida, dan komposisi dari empat basa nukleotida. Kualitas produk PCR yang kurang baik serta kemungkinan kesalahan komposisi nukleotida mengakibatkan analisis filogeni dalam penelitian ini terganggu.
SIMPULAN Penelitian ini belum mampu mengkarakterisasi gen COI A. woodiana dengan baik. Hal ini dapat disebabkan karena faktor kualitas DNA, kualitas produk PCR, dan primer yang kurang spesifik sehingga komposisi urutan nukleotida gen COI tidak sempurna. Panjang nukleotida A. woodiana sebesar 608 bp belum dapat dijadikan barcode untuk spesies tersebut.
SARAN Penambahan jumlah sampel dan lokasi sampling perlu dilakukan agar diperoleh urutan nukleotida gen COI yang akurat dan untuk menguji sifat conserve COI terutama pada tingkat individu. Desain primer spesifik A. woodiana juga sangat dibutuhkan dalam studi karakteristik gen COI.
DAFTAR PUSTAKA Albert J, Wahlberg J, Leitner T, Escamilla D, Uhlen M. 1994. Analysis of a rape case by direct sequencing of the human immunodeficiency virus type 1 pol and gag genes. J. Virol 68: 5018-24. Bussche RAVD, Baker RJ, Huelsenbeck JP, Hillis DM. 1998. Base compositional bias and phylogenetic analyses: a test of the “flying DNA” hypotesis. Molecular Phylogenetics and Evolution 13: 408416.
6
Foster PG, Hickey DA. 1999. Compositional bias may affect both DNA-based and protein-based phylogenetic reconstruction. J Mol Evol 48: 284-290. Hamidah A. 2006. Pengaruh penggunaan berbagai jenis ikan sebagai inang terhadap kelangsungan hidup glochidia Kijing Taiwan (Anodonta woodiana Lea). Biota 11: 185-189. Hebert PDN, Ratnasingham S, De Waard JR. 2003. Barcoding animal life: cytochrome c oxidase subunit 1 divergences among closely related species. Proc R Soc 270: 96–99. Krolak E, Zdanowski B. 2001. The bioaccumulation of heavy metals by the mussel Anodonta woodiana (LEA, 1834) and Dreissena polymorpha (Pall) in the heated Konin Lakes. Arch. Of Polish Fisheries 9: 229-237. Luo et al. 2011. Potential efficacy of mitochondrial genes for animal DNA barcoding: a case study using eutherian mammals. BMC Genomics 12: 84-96. Newton CR, Graham A. 1997. PCR Introduction to Biotechnique. Second Edition. Oxford: Bios Scientific Publisher Ltd. Nuryanto A, Solihin DD. 2006. Variasi sekuens gen mitokondrial Sitokrom C Oksidase I dari Siput Lola (Trochus niloticus). Biosfera 23: 31-37. Popa OP, Murariu D, Popa LO. 2007. Comparison of four DNA extraction methods from invasive freshwater bivalve species (mollusca: bivalvia) in Romanian Fauna. Grigore Antipa L: 527-536. Pereira JC, Chaves R, Bastos E, Leitao A, Pinto HG. 2011. An efficient method for genomic DNA extraction from different molluscs species. Int J Mol Sci 12: 80868095. Rachman B, Winanto T, Maskur, Sukmajaya Y. 2009. Pengaruh kedalaman terhadap proses pelapisan inti bulat pada kerang air tawar (Anodonta woodiana). J Biol 6: 71-78. Rahayu SYS, Solihin DD, Manalu W, Affandi R. 2013. Nucleus pearl coating process of freshwater mussel Anodonta woodiana. Hayati J Biosci 20: 24-30. Ram KJ, Misra G. 2003. Homogenic and xenogenic implantation in pearl mussel. Current Science 85: 727-729. Solihin DD. 1994. Peran DNA mitokondria (mtDNA) dalam studi keragaman genetik
dan biologi populasi pada hewan. Hayati 1: 1-4. Solihin DD. 1997. Isolasi dan Purifikasi Mitochondrian (mtDNA). Bogor: Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB. Tamura K, Dudley J, Nei M, Kumar S. 2007. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol Bio Evol 24: 1596-1599.
LAMPIRAN
8
Lampiran 1 Pensejajaran berganda nukleotida (612 nt) pada gen COI A. woodiana dengan sekuen Mytilus edulis yang berasal dari GenBank.
#MEGA !Title COI; !Format DataType=Nucleotide NSeqs=2 NSites=612 Identical=. Missing=? Indel=-;
!Domain=Data; [ 1 [ 1234567890 #AD4 TGCCGGCAGG #M._edulis AT..T.G..C
1111111112 1234567890 TCTTTTTGTT AG.A...T.A
2222222223 1234567890 GAAGTTAATC A..AGAG..T
3333333334 1234567890 AATTGTATAA GG..T.....
4444444445 1234567890 TGTGATTTTT ....G..G..
5555555556 1234567890 ACGAGGCCTG ..A.CA.AC.
6666666667 1234567890 CATGTTAATA .C.-.A.TA.
7777777778 ] 1234567890 ] TGATTTTTTT .A.....C..
[ [ [ #AD4 #M._edulis
8888888889 1234567890 TTTCGTTATA .GCT..A...
1 9999999990 1234567890 CCAGTAATAA ..GA.TC...
1111111111 0000000001 1234567890 TGGGGGGGTT .C.AA.CT..
1111111111 1111111112 1234567890 TGGTAATTGA .........G
1111111111 2222222223 1234567890 CTGATTCCAA ........TC
1111111111 3333333334 1234567890 TTATAGTTGG .AT....A..
1111111111 4444444445 1234567890 GTGTGGGGAT TG..AAA...
1111111111 ] 5555555556 ] 1234567890 ] ATAAGACACC ....TTT.T.
[ [ [ #AD4 #M._edulis
1111111111 6666666667 1234567890 CACGTTTAAA ....GA....
1111111111 7777777778 1234567890 TAATTTTAGC ......G..T
1111111111 8888888889 1234567890 TACTGAGCCA ..T..GTTAT
1111111112 9999999990 1234567890 TTCCTGGTGC C....AA...
2222222222 0000000001 1234567890 TTTATTCATA GC...ATT..
2222222222 1111111112 1234567890 GTTTTCATGT C..A.AT.A.
2222222222 2222222223 1234567890 CAGCGTTGAT .TTTTAGA.C
2222222222 ] 3333333334 ] 1234567890 ] TGAGGGGGGG G..TAAA...
[ [ [ #AD4 #M._edulis
2222222222 4444444445 1234567890 GCCGGTACTG .TA...G...
2222222222 5555555556 1234567890 GATGAACTCT ....G...A.
2222222222 6666666667 1234567890 TTACCCTCCC ......G..A
2222222222 7777777778 1234567890 CTTTCTGGTT T.G....TA.
2222222222 8888888889 1234567890 GGATCTATCA ATCCT.....
2222222223 9999999990 1234567890 TAGAAGTCCG ...CG.G...
3333333333 0000000001 1234567890 GCGCTGGATA AG.A.A...G
3333333333 ] 1111111112 ] 1234567890 ] TGGTTATTCT .TC.....G.
9
[ [ [ #AD4 #M._edulis
3333333333 2222222223 1234567890 TTCGTTGCAT G..C......
3333333333 3333333334 1234567890 ATTGCTGGGT T.A.......
3333333333 4444444445 1234567890 TTGGTTCAAT .AA....TT.
3333333333 5555555556 1234567890 GATAAGGTCT .G.GG.TG..
3333333333 6666666667 1234567890 TTAAATTTTA A.T......G
3333333333 7777777778 1234567890 TGTGTACTACTA....C.A
3333333333 8888888889 1234567890 TAATTACAAG C..AA...TA
3333333334 ] 9999999990 ] 1234567890 ] TCGTTTTTAT C.AG.....G
[ [ [ #AD4 #M._edulis
4444444444 0000000001 1234567890 -GCTATAATT A.A..A..GG
4444444444 1111111112 1234567890 CCA--GAGCG AG.AC....T
4444444444 2222222223 1234567890 GATACCTGTG ..GCTT.A..
4444444444 3333333334 1234567890 TTTTGTTGGT .CC.AAG.A.
4444444444 4444444445 1234567890 CGATGTTTGT .AGA...AC.
4444444444 5555555556 1234567890 TACATCTTGG GC.G.A...C
4444444444 6666666667 1234567890 TTATTATTAT .A......--
4444444444 ] 7777777778 ] 1234567890 ] TTTCTTTACC --...A.T..
[ [ [ #AD4 #M._edulis
4444444444 8888888889 1234567890 TGTCTTGGCT G..T..A.GA
4444444445 9999999990 1234567890 GGCGGTTTAA ..G...A.C.
5555555555 0000000001 1234567890 ATATACTTCT CA...A....
5555555555 1111111112 1234567890 TACTTATCGC GTT.G....G
5555555555 2222222223 1234567890 CATATTAATA A..T....C.
5555555555 3333333334 1234567890 GTTCTTTTTT CAA.A.....
5555555555 4444444445 1234567890 TCAACCCCAA .G.T..AGC.
5555555555 ] 5555555556 ] 1234567890 ] GGGGGAGGGG ..A..G..T.
[ [ [ #AD4 #M._edulis
5555555555 6666666667 1234567890 ATCCTTTATT .C...G.C..
5555555555 7777777778 1234567890 GTTCCAACAT ...T......
5555555555 8888888889 1234567890 TTGTTTTGGT .....C..A.
5555555556 9999999990 1234567890 TTTATGGACA ...T...G..
6666666666 0000000001 1234567890 CCCCAAAGTT ...TG.G..G
66] 11] 12] TA ..
10
Lampiran 2 Pensejajaran berganda nukleotida (495 nt) pada gen COI A. woodiana dengan sekuen lain yang berasal dari GenBank. #MEGA !Title COI; !Format DataType=Nucleotide NSeqs=10 NSites=495 Identical=. Missing=? Indel=-;
!Domain=Data; [ 6666666667 7777777778 ] [ 1234567890 1234567890 ] #AD4_A._woodiana CATGTTAATA TGATTTTTTT #A._woodiana_(DQ340804.1) .T.-..GTA. .......C.. #Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) .T.-..GT.. .A........ #Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) .T.-...TA. .A........ #Unio_crassus_France_(JX046553.1) .T.-.C.TA. .......C.. #Unio_pictorum_France_(JX046690.1) .T.-...TG. .......C.. #Cucumerunio_novaehollandiae .T.-...TG. .......C.. #Margaritifera_falcata .T.-...TA. .A.....C.. #M._margaritifera_USA_(JN243891.1) .T.-...TA. .A.....C.. #Mytilus_edulis_(AY484747.1) .C.-.A.TA. .A.....C..
1 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 TGCCGGCAGG TCTTTTTGTT GAAGTTAATC AATTGTATAA TGTGATTTTT ACGAGGCCTG GA....GG.. .T.GA.A.CA A.---.G.A. .GC.A...T. .TCA...A.A ...GCT.AC. GC..T.G... .G.AA.A.G. A.---.G.G. .GC.T...T. .TCT...G.. ..TGCT.A.. A...A.GGA. AT.A..G.GG ..---.G... .G........ ...T...G.. ...GCT.A.. AA..T.GGA. AT.G..A.G. ..---.G... .G........ ...C...G.. ..AGCT.A.. AA..T.GGA. GT.A..G.GC ..---.G... ..C....... ...T...G.. ...GCT.A.. AA..T.GGA. G.....A.G. ..---.G... .......... ......CG.A ...GCT.A.. AA..T.GTA. .T.G..G.GG ..---.G... .G........ C..T...G.. ...GCT.A.. AA..T.GTTC .T.GC.G.G. ..---.G... ....A..C.. ...T...G.. ...GCT.A.. AT..T.G..C AG.A...T.A A..AGAG..T GG..T..... ....G..G.. ..A.CA.AC.
11
[ 1111111111 1111111111 ] [ 4444444445 5555555556 ] [ 1234567890 1234567890 ] #AD4_A._woodiana GTGTGGGGAT ATAAGACACC #A._woodiana_(DQ340804.1) ....CCC... ...GC.TTT. #Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) A..CCCA... ...TC.TTT. #Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) TGC.CCT... ..GGCTTTT. #Unio_crassus_France_(JX046553.1) TGC.CCT... ..GGCTTTT. #Unio_pictorum_France_(JX046690.1) TGC.CCT..C ...GCTTTT. #Cucumerunio_novaehollandiae .GC.CCT... ..GGCTTTT. #Margaritifera_falcata .GC.CCC... ..GGCTTTT. #M._margaritifera_USA_(JN243891.1) .GC.CCT... ..GGCTTTT. #Mytilus_edulis_(AY484747.1) TG..AAA... ....TTT.T.
1 1111111111 1111111111 1111111111 1111111111 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 TTTCGTTATA CCAGTAATAA TGGGGGGGTT TGGTAATTGA CTGATTCCAA TTATAGTTGG .GCT.....G ..T.CT.... .A..A..T.. ...G..A..G ..TT.G..T. .......G.. .GCT..A..G ..T.C..... .......T.. ...G.....G ..TG.G.... .......... ...G..A... ..TA...... .T..T..T.. .........G ..T.....TT .G...A.... ...A..A... ...A...... .T..T..A.. ...G...... ..T.....TC ....GA.... ...G..G..G ...A...... .T..C..A.. ...G...... ..T.....TC .....A.... ...A..G..G ..TA.G..G. .T..T..... ...G...... ..A.....TT .A..GT.G.. ...G.....G ...A...... .T.....T.. .......... ..T......C ....GA.... ...G.....G ...A....G. .T..A..T.. ...C.....G ..T.....CC ....GA.... .GCT..A... ..GA.TC... .C.AA.CT.. .........G ........TC .AT....A..
12
[ 2222222222 2222222222 ] [ 2222222223 3333333334 ] [ 1234567890 1234567890 ] #AD4_A._woodiana CAGCGTTGAT TGAGGGGGGG #A._woodiana_(DQ340804.1) ..ATAC..GA G........T #Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) ..AT...TG. A..A.....T #Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) .TT.AC..G. G...A.A..T #Unio_crassus_France_(JX046553.1) .TT.T...G. A...A.A..T #Unio_pictorum_France_(JX046690.1) .GT.T...G. A...A.A... #Cucumerunio_novaehollandiae .TT.T..AG. ....A.T..T #Margaritifera_falcata .TT....AG. G...A.T..T #M._margaritifera_USA_(JN243891.1) .TT.T...G. G...A.T..T #Mytilus_edulis_(AY484747.1) .TTTTAGA.C G..TAAA...
1111111111 1111111111 1111111111 1111111112 2222222222 2222222222 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 0000000001 1111111112 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 CACGTTTAAA TAATTTTAGC TACTGAGCCA TTCCTGGTGC TTTATTCATA GTTTTCATGT .T..G..... ...CG.C..A .TT...TTGT CGTT....T. .GG...TT.G A..GGATGA. .C........ ....G.G..A .TT...TTAT .ATT....T. .GGG..TT.. C.AAGATG.. .T..A..... ......G..G .TT...CTTC ..GTGCCG.. ...G..TT.. T.G..A.G.. .T..G..... ......A..G .TT...TTAC .CGTACCA.. ...G..TT.. C.G..A.G.. .T..G..... ....C.G..G .TT..GTTGC ..GTGCCG.. ...G..TT.. T.GC.G.GA. .T.....G.. ......A..G .TT..GTTGC ..GT.CCA.. G..G..TT.G T.AC.T.G.. .C..CC.T.. C.....G..G .TT...TTGC ..GTGCC... .C.T...T.G T.A..G.GT. .T..GC.T.. ......A..G .TT..GTTGC ..GTGCCG.. .C.T..TT.. T.A..A.GT. ....GA.... ......G..T ..T..GTTAT C....AA... GC...ATT.. C..A.AT.A.
13
[ 3333333333 3333333333 ] [ 0000000001 1111111112 ] [ 1234567890 1234567890 ] #AD4_A._woodiana GCGCTGGATA TGGTTATTCT #A._woodiana_(DQ340804.1) T.TA.A...G .A..G...T. #Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) ..TA.....G .A..A..... #Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) T.AG.....T ...C....T. #Unio_crassus_France_(JX046553.1) T.AG.A..CT ...C....T. #Unio_pictorum_France_(JX046690.1) T.AG.A...T ...C....T. #Cucumerunio_novaehollandiae T..G.T...T ...CG...T. #Margaritifera_falcata T.TG.A...T .A.C....T. #M._margaritifera_USA_(JN243891.1) T.TG.A..CT ...C....T. #Mytilus_edulis_(AY484747.1) AG.A.A...G .TC.....G.
2222222222 2222222222 2222222222 2222222222 2222222222 2222222223 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 8888888889 9999999990 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 GCCGGTACTG GATGAACTCT TTACCCTCCC CTTTCTGGTT GGATCTATCA TAGAAGTCCG TGT..G.... ....G...AC ...T..A..T T.G..AAA.A AA..G.T.A. .TCT..AAT. TGT....... ........A. ...T..G..T T.A...AA.A A.G.T.T... .TCTG.GATA .TT.....A. .T..G..AG. A..T...... T.A..A..GA .CG.TGC... .TCTG.GG.T .TT..G.... .T..G..AG. G..T.....T T.A.....GA ATG.GGC... .TCCG.GG.T .TT..A.... .T.....AG. G..T..C... T.G.....AA ATG.AGC... .TCTG.GG.T .TT..G.... .G..G...G. ...T..A..G T.G.....GA AT..TGC... .TCTG.AG.T .TT....... .T..G...G. ...T..C..T T.G..AA.GA ATG.T.CA.. .TCTG.GG.T .TT....... .G..G...G. ......G..T T.A..AA.GA ATG...C... .TCTG.GG.T .TA...G... ....G...A. ......G..A T.G....TA. ATCCT..... ...CG.G...
14
[ 3333333333 3333333334 ] [ 8888888889 9999999990 ] [ 1234567890 1234567890 ] #AD4_A._woodiana TAATTACAAG TCGTTTTTAT #A._woodiana_(DQ340804.1) .GTAA.A.TA CGCG..AGTG #Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) ..T.A.T.T. CGAAC.AATA #Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) .GG.A.T.T. CG..C.CCTG #Unio_crassus_France_(JX046553.1) .GGGA.T.T. CGA.C.CCTG #Unio_pictorum_France_(JX046690.1) .GGAA.T.T. CGA.C.CCTG #Cucumerunio_novaehollandiae .GGGA.T.TA CG..C.G.TG #Margaritifera_falcata .GG.A.T.T. CGC.CCCCTG #M._margaritifera_USA_(JN243891.1) .GG.A...TA CGT.C.CCGG #Mytilus_edulis_(AY484747.1) C..AA...TA C.AG.....G
3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 3333333333 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 6666666667 7777777778 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 TTCGTTGCAT ATTGCTGGGT TTGGTTCAAT GATAAGGTCT TTAAATTTTA TGTGTACTA...TC.T... T.A..A..TG ..TCA..... TCATG.A..A .......... .TAC...A.T ...T.....C T.A..C..TG ..TCA..... TC.TG....A .......... .TAC.....T C..T..A... C.......TG C.TCG..... TT..G.TG.. G.T....... .T.C....GT ...T..A... C.......TG C.TCA..T.. TT..G..G.. A.T....... .T.C....GT ...T...... C.......TG C.TC...T.. TT.GG.TG.. A.T.....C. .C.C...CGT ...T...... C.......TG C.TC...T.. CC.TG..G.. A.T....... .T.C...CGT ...T.....C C.......TG CGTC...T.. TT.GG..G.. A.T....... .T.CG...GT ...T.....C C....C..TG CATCC..T.. TT.GG..G.. A.T..C.... .T.CG...GT G..C...... T.A....... .AA....TT. .G.GG.TG.. A.T......G CTA....C.A
15
[ 4444444444 4444444444 ] [ 6666666667 7777777778 ] [ 1234567890 1234567890 ] #AD4_A._woodiana TTATTATTAT TTTCTTTACC #A._woodiana_(DQ340804.1) .......G-- --.....T.. #Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) .A..GG..-- --.....T.. #Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) .GG..GC.-- --G.C..... #Unio_crassus_France_(JX046553.1) .AG.AGC.-- --G....... #Unio_pictorum_France_(JX046690.1) .GG.AGCC-- --G....G.. #Cucumerunio_novaehollandiae .GG..GC.-- --.....G.. #Margaritifera_falcata .AG.GGCG-- --G.A..G.. #M._margaritifera_USA_(JN243891.1) .AG.GGCG-- --G.AC.... #Mytilus_edulis_(AY484747.1) .A......-- --...A.T..
4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 4444444444 0000000001 1111111112 2222222223 3333333334 4444444445 5555555556 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 1234567890 -GCTATAATT CCA--GAGCG GATACCTGTG TTTTGTTGGT CGATGTTTGT TACATCTTGG TTA....TGC TG.GC..ATT CC.TTG.T.. ...GA.CT.. TTCGTG.ACA GCAG.T.... TTT.GCGGG. TG.GC..ATA CC.TTA.T.. ...GA.CT.. TTTA...ACG GCTGGT..A. GTT..GTTGC .G.GC..ATT CC.TTA.T.. ...GAGCT.. TACG..AACA GCTG.T...T G.T..GTTGC TG.AC..ATT CCATTA.T.. ...GAGCT.. TAC.A..AC. GCA..T...T G.T..GTTGC TG.AC..ATT CC.TTA.TC. ...GAGCT.. TAC....AC. GCA..T...T G.T.GGTGGC TG.GC.TATT CCGTTG.T.. .G.G.GCT.. TACG..GACG GCGG.T...C GCG..GTTGC TG.AC..ATT CCATTG.TC. .G.GAGCC.. .ACA..GACG GCT..T...T GAG.GGTTGC TG.GC..ATT CC.TTG.TC. .G.GAGCT.. TACG..GACG GCT..T...T A.A..A..GG AG.AC....T ..GCTT.A.. .CC.AAG.A. .AGA...AC. GC.G.A...C
16
[ [ [ #AD4_A._woodiana #A._woodiana_(DQ340804.1) #Anodonta_anatina_Poland_(GU230747.1) #Strophitus_subvexus_USA_(AY655021.1) #Unio_crassus_France_(JX046553.1) #Unio_pictorum_France_(JX046690.1) #Cucumerunio_novaehollandiae #Margaritifera_falcata #M._margaritifera_USA_(JN243891.1) #Mytilus_edulis_(AY484747.1)
4444444444 8888888889 1234567890 TGTCTTGGCT ...A..A..A ...A.....A A..T..A... ......A... ...T..A... ...G...... ...T.....A G..T.....A G..T..A.GA
44444] 99999] 12345] GGCGG ..T.C ..T.C ..T.C ..T.C ..T.C ..G.C ..T.C ..G.C ..G..
17
Lampiran 3 Matriks perbedaan rata-rata nukleotida berdasarkan metode pairwise distance daerah COI pada A. woodiana dengan beberapa pembandingnya (ingroup dan outgroup) yang berasal dari GenBank.
[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] [9] [10]
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0.431 0.391 0.398 0.400 0.406 0.404 0.418 0.435 0.387
0.211 0.342 0.335 0.342 0.337 0.344 0.348 0.420
0.319 0.317 0.331 0.342 0.317 0.331 0.416
0.126 0.143 0.199 0.174 0.182 0.414
0.112 0.170 0.170 0.172 0.402
0.174 0.166 0.180 0.404
0.197 0.195 0.412
0.108 0.418
0.412
Keterangan: [1] Anodonta woodiana (AD4) [2] Anodonta woodiana [3] Anodonta anatina [4] Strophitus subvexus [5] Unio crassus [6] Unio pictorum [7] Cucumerunio novaehollandiae [8] Margaritifera falcata [9] M. margaritifera [10] Mytilus edulis
10
