DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Oleh: ANIFA BINTAR RAHMAWATI G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
ABSTRAK ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Deteksi Afrikanisasi Pada Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria. Dibimbing oleh RIKA RAFFIUDIN dan M. CHANDRA WIDJAJA. Apis mellifera merupakan lebah madu yang persebaran alaminya meliputi daerah Mediterania, Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrik, Apis mellifera terbagi kedalam 24 subspesies yang terdiri dari kelompok garis keturunan A (Afrika), M (Eropa Utara dan Barat), C (Eropa Selatan) dan O (Timur Tengah). Peternak lebah di dunia banyak yang mengimpor A. mellifera. Peternak di Indonesia umumnya mengimpor dari Australia. Peternakan lebah menjadi terancam sejak A. m. scutellata diimpor dari Afrika ke Brazil yang keturunannya dengan A. m. ligustica menghasilkan Africanized honeybee yang bersifat agresif. Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu Indonesia khususnya di lembaga yang berwenang seperti Balai Karantina Hewan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mendeteksi afrikanisasi pada lebah A. mellifera berdasarkan gen sitokrom b dari DNA mitokondria. Keberadaan lebah AHB dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom b berdasarkan keberadaan situs pemotongan enzim BglII. Hasil amplifikasi daerah gen sitokrom b dengan menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b menghasilkan fragmen DNA berukuran 485 pb. Hasil pemotongan fragmen DNA tersebut dengan BglII menghasilkan satu mitotipe yang terdiri dari dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data DNA hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada AHB di Jawa.
ABSTRACT ANIFA BINTAR RAHMAWATI. Detection africanized of A. mellifera honeybee based on cytochrome b gene in mitochondria DNA. Supervised by RIKA RAFFIUDIN and M. CHANDRA WIDJAJA. Apis mellifera is a honeybee that spread in Mediterania, Africa, and Europe regions. Based on morphometric analysis, it comprises of 24 subspecies that consist of four lineages; namely the African (A), Western and Northern Europe (M), Southeastern Europe (C), and Near Eastern (O). Beekeepers in many countries import and distribute A. mellifera. The beekeeper in Indonesia generally imported A. mellifera from Australia. The existence of A. m. scutellata in Brazil become threatened since A. m. scutellata hybridized with A. m. ligustica and became aggressive Africanized honeybee (AHB). Until recently, there was no attempt to detect the existence of the Africanized honeybee in quarantine apiary in Indonesia. Therefore, the objective of this research was to detect Africanized honeybee based on cytochrome b gene of mitochondrial DNA. Africanized honeybee could be detected based on cytochrome b gene in mitochondria DNA by using restriction site of cyt b/BglII. DNA fragment amplified by using cyt b forward and reverse primers revealed 485 bp. Digestion of the amplified region with the BglII restriction enzyme revealed one mitotype which produced two fragments of DNA that consist of 194 and 291 bp. This indicated that there were no AHB in Java, so far.
DETEKSI AFRIKANISASI LEBAH Apis mellifera BERDASARKAN GEN SITOKROM B DARI DNA MITOKONDRIA
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Oleh: Anifa Bintar Rahmawati G34102010
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007
Judul Skripsi : Deteksi Afrikanisasi Lebah Apis mellifera Berdasarkan Gen Sitokrom B Dari DNA Mitokondria Nama : Anifa Bintar Rahmawati NRP : G34102010
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Rika Raffiudin, Msi NIP 131 999 583
Drs. Chandra Widjaja,MM NIP 080 057 508
Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS. NIP 131473999
Tanggal Lulus:
PRAKATA Alhamdulillah segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat allah SWT atas segala rahmat serta limpahan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ir. Rika Raffiudin, MSi. dan Drs. M. Chandra Widjaja, MM. atas bimbingan, saran, dan perhatiannya yang sangat besar selama ini. Terima kasih untuk Dr. Nampiah Sukarno, Msi. Atas masukan dan kritiknya terhadap karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis ucapkan untuk mbak Zulfarida dan Apriani yang telah membantu selama penelitian di Laboratorium. Ucapan terima kasih juga kepada seluruh dosen Zoologi; Ibu Taruni, Bapak Heru, Ibu Wita Farajalah, Bapak Ahmad Farajalah, Bapak Bambang Suryobroto, Bapak Tri Atmowidi, kak Berry, dan mbak Kanthi, juga staf Zoologi mbak Tini atas nasehatnya, pak Djupri, dan pak Adi. Terima kasih juga untuk teman-teman di Laboratorium Zoologi atas kebersamaannya selama ini: Isma, Adisti, Rian Haris, Ikbal, Bian, Gema, Wida, Rifah, Sanah, Sumi, Dian Erlangga, dan seluruh teman-teman Biologi 39. Ucapan terima kasih juga untuk seluruh warga Griya Amani, kelompok azzahra dan seseorang yang memberikan semangat didalam hatiku. Akhirnya, penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sangat mendalam untuk Bapak dan Ibu, adik-adik: Putra Aminudin dan Ainin Jariati atas dukungan, semangat, kasih sayang serta doanya selama ini.
Bogor, Mei 2007
Anifa Bintar Rahmawati
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Nabire Pada tanggal 2 Maret 1985 sebagai anak pertama dari tiga bersaudara pasangan Rochmadi dan Siti Qomariah. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar pada tahun 1996 di SDN 02 Karang Tumaritis Nabire. Pendidikan menegah pertama diselesaikan pada tahun 1999 di SLTPN 1 Nabire. Pendidikan menengah atas diselesaikan pada tahun 2002 di SMUN 1 Nabire dan pada tahu yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis juga pernah mengikuti organisasi Himabio dan kewirausahaan Bioworld Pada Tahun 2003/2004. Kegiatan studi lapang pernah pernah dilakukan pada tahun 2004/2005 bertempat di Situ Gunung, Sukabumi dengan topik Identifikasi Semut Epifit. Pada tahun yang sama penulis menjadi asisten mata kuliah Vertebrata, Fisiologi Hewan dan Biologi Dasar. Kegiatan praktek lapang pernah penulis lakukan pada tahun 2005 mengenai aktivitas makan kupu-kupu jeruk Papilio demoleus di Museum Serangga dan Taman Kupu, Taman Mini Indonesia Indah. Penulis juga pernah mengikuti seminar Indonesian Toray Science Fondation pada tahun 2006, sebagai peserta.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL............................................................................................... vii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... vii DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................... vii PENDAHULUAN Latar Belakang ........................................................................................................................
1
BAHAN DAN METODE Koleksi Lebah ......................................................................................................................... Ekstraksi dan Isolasi DNA ...................................................................................................... Amplikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera ......................................................................... Elektroforesis dan Visualisasi DNA........................................................................................ Pengukuran pita DNA ............................................................................................................. PCR-RFLP .............................................................................................................................. Sequencing (pengurutan) DNA dan Alignment (penjajaran) DNA..........................................
1 1 2 2 2 2 3
HASIL Amplifikasi DNA .................................................................................................................... Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplikasi dengan Enzim Restriksi BglII..................... Pengurutan DNA A. mellifera ................................................................................................ Alignment DNA......................................................................................................................
3 3 3 3
PEMBAHASAN .....................................................................................................................
7
KESIMPULAN ...................................................................................................
7
SARAN ...............................................................................................................
8
DAFTAR PUSTAKA .........................................................................................
8
LAMPIRAN........................................................................................................
9
DAFTAR TABEL Halaman 1. Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplikasi gen sitokrom b A. Mellifera ..........
2
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Hasil amplikasi gen sitokrom b A. mellifera menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b .................................................................................................................................
3
2. Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera meggunakan enzim restriksi BglII .................
3
3. Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b ..................................................................
4
4. Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera ........................................................ 5
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogyakarta, dan Jawa Barat.......................................................................................................................... 9 2. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer forward sitokrom b ............................................................................................................................... 11 3. Kromatogram hasil pengurutan DNA contoh Am19 Pati menggunakan primer reverse sitokrom b ............................................................................................................................... 12
PENDAHULUAN Latar belakang Apis mellifera termasuk kedalam Ordo Hymenoptera, famili Apidae dan subfamili Apinae (Michener 2000). Lebah A. mellifera adalah lebah madu yang dibudidayakan karena produksi madunya yang tinggi. Lebah madu ada yang hingga saat ini belum semua dapat dibudidayakan. Lebah madu yang telah dapat dibudidayakan adalah dari kelompok lebah A. mellifera, dan A. cerana, sedangkan lebah madu yang belum dapat dibudiyakan yaitu A. koscevnikovi, A. dorsata, A. andreniformis, A. florea dan A. laboriosa. Lebah A. mellifera merupakan spesies lebah madu yang persebarannya paling luas. A. mellifera ditemukan di sebagian besar daerah gurun pasir dan daerah dengan temperatur yang dingin (Ruttner 1988). Persebaran alami A. mellifera adalah di daerah Mediterania, Afrika, dan Eropa. Berdasarkan analisis morfometrika, Ruttner (1988) membagi 24 subspesies ini menjadi empat kelompok garis keturunan (lineage). Garis keturunan A terdiri dari A. mellifera yang daerah persebarannya meliputi daerah Afrika, M meliputi Eropa utara dan barat, C meliputi Eropa Selatan dan O meliputi Timur Tengah. Pengelompokan yang sama juga dihasilkan oleh Franck et al. (2000) berdasarkan DNA mitokondria. Peternak lebah di dunia banyak mengimpor beberapa subspesies A. mellifera yaitu A. m. mellifera dan A. m. ligustica dari Eropa. Hal itu karena sifat jinak serta produksi madunya yang tinggi (Gojmerac 1983). Peternakan lebah menjadi terancam sejak lebah madu A. m. scutellata yang berasal dari Afrika diimpor ke Brazil pada tahun 1956. Lebah Afrika tersebut diimpor dengan tujuan untuk mendapat galur lebah yang adaptasinya baik di daerah tropis. A. m. scutellata mengalami hibridisasi dengan lebah madu Eropa yaitu A. m. ligustica dan A. m. mellifera yang menghasilkan Africanized honey bee (AHB) (Kenneth 1999). AHB memiliki sifat ganas, sengat yang mematikan dan sangat cepat dalam perbanyakan koloni (Sheppard 1999). Keturunan lebah AHB ini tersebar dari Brazil ke Meksiko, Texas, Arizona, dan California (Schneider et al. 2003). Secara morfologi peternak lebah tidak dapat membedakan antara lebah AHB dan
lebah madu Eropa (bukan AHB). Penelitian dasar untuk mendeteksi lebah AHB dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler mitokondria DNA. Mitokondria DNA diturunkan secara maternal melalui sitoplasma, tidak mengalami rekombinasi atau sedikit terjadi rekombinasi gen (Hoy 1994). Gen sitokrom b pada DNA mitokondria yang dipotong dengan enzim BglII dapat digunakan untuk mendeteksi AHB. Berdasarkan Crozier et al. (1991) enzim BglII mampu untuk memotong gen sitokrom b yang digunakan untuk mendeteksi AHB. Selain BglII dengan gen sitokrom b, enzim dan daerah gen lain dapat digunakan untuk mendeteksi keberadaan lebah AHB. Daerah gen tersebut adalah lrRNA/Eco RI dan cox 1/Hinc II (Pinto et al. 2003). Hingga saat ini belum ada usaha untuk mendeteksi keberadaan AHB di peternakan lebah madu di Indonesia khususnya di Balai Karantina Hewan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi afrikanisasi lebah A. mellifera di pulau Jawa berdasarkan gen sitokrom b pada DNA mitokondria.
Bahan dan Metode Koleksi Lebah Contoh lebah diperoleh dari hasil pengkoleksian lebah madu pada tahun 2005 yang dilakukan di Pati (Jawa Tengah) dan Jember (Jawa Timur) (Raffiudin 2006). Sebanyak 70 koloni lebah yang berasal dari Pati dan Jember disimpan dalam tabung berisi etanol absolut. Ekstraksi dan Isolasi DNA Ekstraksi DNA sudah dilakukan oleh peneliti sebelumnya (Hidayat 2006, Raffiudin 2006). Secara garis besar tahap persiapan dan pelaksanaan ekstraksi DNA adalah sebagai berikut. Sebelum ekstraksi DNA dilakukan, lebah dimasukkan ke dalam Tris-EDTA (TE) 10 mM untuk menggantikan etanol dalam jaringan. Sumber DNA lebah yang digunakan adalah bagian toraks lebah. Jaringan toraks lebah dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml diletakkan dalam steroform berisi nitrogen cair lalu digerus. Ekstraksi DNA menggunakan metode ekstraksi CTAB dan presipitasi alkohol (Sambrook et al. 1989).
2
Tabel 1 Nukleotida primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen sitokrom b A. mellifera berdasarkan posisi urutan DNA mitokondria A. mellifera Crozier & Crozier (1993) Nama Primer
Susunan nukleotida primer (5’-3’)
Sitokrom b Forward Sitokrom b Reverse
TATGTACTACCTTGAGGACAAATATC ATTACACCTCCTAATTTATTAGGAAT
Sebanyak 200 µl cetyl trimetyl amonium bromida (CTAB) konsentrasi 20% dimasukkan ke dalam tabung berisi toraks yang sudah digerus untuk melisis membran. Kemudian ditambahkan 14 µl proteinase K dengan konsentrasi 5 mg/µl dan diinkubasi pada suhu 55ºC selama dua jam. Larutan berisi campuran CTAB dan proteinase K disentrifugasi 13000 rpm (10 menit). Supernatan yang berisi DNA dipindahkan ke dalam tabung steril baru, kemudian ditambahkan 250 µl Chloroform Isoamil Alkohol (C:IAA=24:1). Supernatan dikocok (5 menit) dan disentrifugasi 13000 rpm (5 menit). Fenol kloroform isoamil alkohol (P:C:I=25:24:1) kemudian disentrifugasi 13000 rpm (1menit). Larutan berisi DNA dipindahkan ke tabung 1.5 ml steril dan ditambahkan 400 µl CIAA, lalu dikocok (5 menit). Larutan berisi DNA disentrifugasi 13000 rpm (3 menit), kemudian supernatan dipindahkan ke tabung baru. DNA yang terlarut dalam supernatan dipresipitasi dengan menggunakan 600 µl isopropanol selama semalam pada suhu −4 ºC. Campuran DNA dan isopropanol disentrifugasi 13000 rpm selama 30 menit. Etanol 70% sebanyak 500 µl ditambahkan pada pelet DNA. Campuran tersebut disentrifugasi 13000 rpm (10 menit) pada suhu 4 oC. Etanol dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan cara divakum (30 menit). DNA hasil ekstraksi dilarutkan dalam TE 0.5 mM dan disimpan pada suhu −4 oC. Amplifikasi DNA Gen Sitokrom b A. mellifera DNA lebah diamplifikasi menggunakan mesin PCR TaKaRa Thermal Cycler. Pereaksi PCR terdiri atas ddH20, 2.5 µM dNTP, Mg 2+ free buffer, 25 µM MgCl2, 10 µM primer sitokrom b reverse, 10 µM primer sitokrom b forward (Tabel 1) (Crozier et al. 1991), Taq polimerase 5 unit/0.1 µl, dan DNA hasil ekstraksi. Proses PCR dilakukan dengan tahapan; denaturation (pemisahan DNA utas ganda) pada 94 ºC selama 1 menit, annealing (penempelan primer) pada 55 ºC selama 1 menit, dan elongation (pemanjangan) pada 72 º C selama 2 menit. Semua tahap dilakukan selama 30 siklus.
Posisi nukelotida primer pada mitokondria total 11400-11425 11859-11884
Elektroforesis dan Visualisasi DNA DNA hasil amplifikasi dipisahkan dengan polyacrilamide gel electrophoresis (PAGE) 6% menggunakan bufer 1 x Tris 0.5 M, Asam borat 0.65 M, EDTA 0.02M (TBE). Arus listrik yang digunakan sebesar 160 V selama 90 menit. Visualisasi DNA dalam gel poli akrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Silver staining) yang dilakukan dalam shaking bath (Tegelstrom 1986). Gel hasil elektroforesis dicuci dengan larutan CTAB (0.2 gr/200 ml akuades) selama 8 menit. Kemudian gel dicuci dengan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel dibilas lagi dalam larutan NH4OH (2 ml/200 ml akuades) selama 6 menit. Selanjutnya gel direndam dalam campuran larutan 0.32 AgNO3, 0.8 ml NH4OH, dan akuades 200 ml selama 10 menit. Kemudian gel dicuci lagi menggunakan aquades dua kali masing-masing 2 menit. Setelah itu gel direndam dalam campuran larutan 4 gr Na2CO3, 100 µl formaldehida, dan 200 ml akuades sampai muncul pita DNA. Terakhir, gel direndam dalam larutan asam asetat 1% dalam 200 ml akuades untuk pengawetan pita DNA. Pengukuran pita DNA Pengukuran pita DNA dilakukan untuk mengetahui ukuran DNA berdasarkan gel akrilamida. Pengukuran ini dilakukan pada pita penanda DNA dan pada DNA target. Penentuan ukuran pita DNA target berdasarkan regresi menggunakan program R (the R Development Core Team Version 1.6.0) (Venables & Ripley 1999). PCR-RFLP DNA A. mellifera hasil amplifikasi dipotong menggunakan enzim restriksi BglII. Enzim restriksi BglII merupakan enzim pemotong enam basa. Situs pemotongannya adalah AGATCT (Griffiths et al. 1999) memotong basa ke 291 gen sitokrom b pada GenBank L06178. Komposisi pereaksi RFLP dalam total reaksi 4 µl terdiri atas DNA hasil amplifikasi 2 µl, 10 x bufer enzim BglII 0.4 µl, enzim BglII 10 unit/0.5 µl, air destilata
3
steril 1.1 µl. Campuran pereaksi RFLP kemudian disentrifugasi 4500 rpm selama 1 menit, lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama semalam. Hasil pemotongan dimigrasikan pada gel akrilamida 6% dengan arus 120 V selama 90 menit. Visualisasi DNA dalam gel poliakrilamid dilakukan dengan pewarnaan perak (Tegelstrom 1986). Pengurutan DNA dan Alignment DNA Pengurutan hasil amplifikasi DNA gen sitokrom b dilakukan menggunakan jasa Lembaga Biologi Molekuler Charoen Pockphan Jakarta, menggunakan mesin ABI 310 Applied Biosystem. Pengurutan DNA dilakukan dari ujung 5' dan 3' menggunakan primer sitokrom b forward dan reverse. Hasil pengurutan DNA dilakukan analisis homologi dengan cara alignment DNA. Alignment DNA dilakukan antara gen sitokrom b A. m 19 Pati dengan gen A. mellifera (Crozier dan Crozier 1993); Acc Number L0 6178 pada GenBank menggunakan program Clustal X (Thompson 1997). Analisis homologi juga dilakukan antara gen sitokrom b Am 19 Pati, A. mellifera (Crozier dan Crozier 1993) dan AHB haplotipe satu: Genbank Acc Number EF016646 dan AHB haplotipe dua: Acc Number EF016647.
HASIL Amplifikasi DNA Hasil amplifikasi dan RFLP gen sitokrom b dilakukan pada seluruh contoh A. mellifera. Seluruh contoh menghasilkan ukuran PCR produk yang sama (500 pb) (Gambar 1). Data gambar PCR produk dan RFLP diperoleh dari contoh A. mellifera asal Jawa Timur (koloni 61-70, sesuai Lampiran 1). Data gambar tersebut mewakili data dari seluruh contoh A. mellifera pada penelitian ini. pb M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
500 400 300 Gambar 1 Hasil amplifikasi gen sitokrom b A. mellifera yang diimpor ke Indonesia M = marker (DNA 100 bp), 110 = nomor contoh A. mellifera Jawa Timur dengan no. koloni 6170 (lampiran 1).
Pemotongan DNA A. mellifera Hasil Amplifikasi dengan Enzim Restriksi BglII Seluruh produk sitokrom b A. mellifera dipotong dengan enzim restriksi BglII. Hasil gel menunjukkan satu mitotipe yang memiliki dua pita DNA berukuran kurang lebih 200 dan 300 pb. Dengan demikian terdapat satu situs pemotongan yang monomorfik (seragam) (Gambar 2). Daerah restriksi gen sitokrom b hasil pemotongan enzim BglII berdasarkan sekuen DNA menghasilkan dua fragmen dengan ukuran 194 pb & 291 pb (Gambar 3). Posisi BglII dari hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b A. mellifera terdapat pada basa ke 291 pb (Gambar 4). M 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
300 200
Gambar 2 Hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera dengan menggunakan enzim restriksi BglII M=marker (DNA 100 bp), 1-10=nomor contoh A. mellifera dengan no koloni (61-70) (lampiran 1) Pengurutan DNA A. mellifera Contoh A. mellifera yang dipilih untuk dilakukan pengurutan DNA adalah A. mellifera koleksi Pati dengan nomor koloni 19. Pemilihan nomor koloni Am 19 untuk pengurutan DNA berdasarkan pada produk DNA hasil amplifikasi yang baik. Proses pengurutan DNA menggunakan primer forward dan reverse sitokrom b. Hasil pengurutan DNA berupa kromatogram (Lampiran 2 & 3) telah diedit secara manual. Hasil edit kemudian dimasukkan ke dalam program Genetyx (Genetyx Win Versi 4.0) untuk analisis lebih lanjut. Hasil pengurutan DNA pada nomor contoh A. mellifera 19 Pati menggunakan primer sitokrom b forward dan reverse didapatkan 485 pb (Gambar 5). Alignment DNA Analisis alignment DNA dilakukan untuk mengetahui homologi nukleotida. Nomor contoh A. mellifera 19 Pati dilakukan alignment DNA dengan lebah A. mellifera yang
4
telah diteliti sebelumnya oleh Crozier dan Crozier (1993) diperoleh dari Gen Bank ACC Number L06178. Proses alignment DNA menggunakan program Clustal X (Thompson 1997). Hasil alignment DNA menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan urutan nukleotida antara nomor contoh A. mellifera 19 Pati dengan A. melli-
fera hasil dari Crozier dan Crozier (1993) Acc Number L06178. Hasil alignment DNA sitokrom b Am 19 Pati dengan AHB dari GenBank Acc Number EF016647 dan EF016647 menunjukkan bahwa terdapat perbedaan urutan nukleotida, yaitu terdapat sembilan substitusi nukleotida (Gambar 5).
10 20 30 40 50 60 tatgtactaccatgaggacaaatatcatattgaggtgcaacagttattactaatctttta 70 80 90 100 110 120 tcagcaattccttatattggtgatacaattgtattatgaatttgaggtggattttcaatt 130 140 150 160 170 180 aataatgctacattaaatcgatttttttctttacattttattttaccattattaatttta 190 200 210 220 230 240 tttatagttattcttcatttatttgccttacatttaactggatcatctaatcctcttgga 250
260
270
280
290
300
tcaaattttaataattataaaatttcatttcatccatatttttcaattaaagatctttta BglII
310 320 330 340 350 360 ggattttatatcatcttatttatctttatattcattaattttcaatttccatatcattta 370 380 390 400 410 420 ggagatccagacaatttcaaaattgcaaatccaataaatactccaactcatattaaacct 430 440 450 460 470 480 gaatgatatttcctatttgcatattcaattttacgagcaattcctaataaattaggaggt 490 gtaat Gambar 3 Hasil pengurutan nukleotida DNA gen sitokrom b A. mellifera. Nukleotida yang digaris bawah adalah nukleotida tempat situs pemotongan enzim BglII
1
BglII
485
100 pb
Gambar 4 Peta restriksi hasil pemotongan gen sitokrom b A. mellifera dengan enzim restriksi BglII. Hasil pemotongan dengan enzim restriksi BglII menghasilkan dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb
5
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
ATGAAAAAATTTATAAACTTTTTTAGTTCCAATGAATTTCTAAAAATAATTATATCTACA 60 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
ATTTATTTACCAACTCCAGTAAATATTAATTATATATGAAATTTTGGATCAATTCTTGGA 120 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
ATTTTTTTAATAATTCAAATCATTTCTGGATTTATTTTATCAATACATTATTGTCCAAAT 180 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
ATTGATATTGCTTTCTGATCAATTACTAATATTATAAAAGATATAAATTCAGGATGATTA 240 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
TTTCGTTTAATTCACATAAATGGAGCATCATTTTATTTTTTAATAATATATATTCATATT 300 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
AGTCGAAATTTATTTTATTGTTCATATAAATTAAATAATGTATGAGGAATTGGAATTATA 360 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
ATTCTTTTAATATCAATAGCAGCTGCATTTATAGGATATGTACTACCATGAGGACAAATA ------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA ------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA ------------------------------------TATGTACTACCATGAGGACAAATA ************************
420 24 24 24
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT TCATATTGAGGTGCAACAGTCATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT TCATATTGAGGTGCAACAGTTATTACTAATCTTTTATCAGCAATTCCTTATATTGGTGAT ******************** *************************************** 1 2 3 4 ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT ACAATTGTATTATGAATTTGAGGTGGATTTTCAATTAATAATGCTACATTAAATCGATTT ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT ACAATTGTATTATGAATCTGAGGTGGGTTCTCAATTAATAATGCTACCTTAAATCGATTT ***************** ******** ** ***************** ************
480 84 84 84
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT TTTTCTTTACATTTTATTTTACCATTATTAATTTTATTTATAGTTATTCTTCATTTATTT ************************************************************
600 204 204 204
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT GCCTTACATTTAACTGGATCATCTAATCCTCTTGGATCAAATTTTAATAATTATAAAATT ************************************************************ 5 6 TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGATCTTTTAGGATTTTATATCATCTTATTTATC TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC TCATTTCATCCATATTTTTCAATTAAAGACCTTTTAGGATTTTATATTATCTTATTTATC ***************************** ***************** ************
660 264 264 264
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
540 144 144 144
720 324 324 324
6
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
7 8 TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGACAATTTCAAAATT TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT TTTATATTCATTAATTTTCAATTTCCATATCATTTAGGAGATCCAGATAATTTTAAAATT *********************************************** ***** ******
780 384 384 384
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
9 GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTCCTATTTGCATAT GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT GCAAATCCAATAAATACTCCAACTCATATTAAACCTGAATGATATTTTCTATTTGCATAT *********************************************** ************
840 444 444 444
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAATCGGATTAGTAATATCAATT TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------TCAATTTTACGAGCAATTCCTAATAAATTAGGAGGTGTAAT------------------*****************************************
900 485 485 485
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
CTTATTCTTTATATTATAATTTTTTATAATAATAAAATAATAAACAATAAATTTAATATA 960 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
TTAAATAAAATTTATTATTGAATATTTATTAATAACTTCATTTTATTAACATGATTAGGT 1020 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
AAACAATTAATTGAATATCCATTTACTAATATTAATATATTATTTACAACAACATATTTT 1080 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
TTATATTTTTTCTTAAATTTCTATTTAAGAAAATTATGAGATAATTTAATTTGAAATTCA 1140 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
CYTBL06178 AM19PT EF016646_1 EF016647_2
CCATTAAATTAA 1152 ----------------------------------
Gambar 5 Homologi urutan nukleotida gen sitokrom b A. mellifera . Cyt B = sitokrom b; Cyt B L06178 berasal dari GenBank Acc Number L06178, Am 19 pt adalah hasil urutan gen sitokrom b A. mellifera asal Pati. EF016646_1 adalah AHB haplotipe satu, EF016647_2 adalah AHB haplotipe dua berasal dari GenBank. * = kesamaan (homologi) nukleotida. Angka disamping kanan adalah nomor nukleotida. Nukleotida digarisbawah adalah situs restriksi BglII. Nukleotida di dalam kotak adalah perbedaan AHB satu dan AHB dua. =Perbedaan AHB dan bukan AHB. Angka diatas urutan nukleotida menunjukkan substitusi yang terjadi antara Am 19 Pt dengan AHB haplotipe satu dan AHB haplotipe dua.
7
PEMBAHASAN Penelitian dasar untuk mendeteksi AHB dilakukan dengan menggunakan penanda molekuler. Salah satu penanda molekuler yang banyak digunakan adalah DNA mitokondria karena sifatnya yang diturunkan secara maternal. Ada beberapa penanda molekuler yang dapat digunakan untuk membedakan AHB dan bukan AHB. Crozier et al. (1991) di Australia telah menggunakan gen sitokrom b yang dipotong dengan enzim restriksi BglII. Hasil penelitiannya menghasilkan satu fragmen DNA berukuran 485 pb untuk AHB. Dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb dihasilkan untuk yang bukan AHB. Penelitian yang sama juga telah dilakukan di Amerika Serikat oleh Pinto et al. (2003). Gen sitokrom b/BglII dapat membedakan antara A. mellifera dari garis keturunan Afrika dan garis keturunan A. mellifera yang lain. Satu fragmen DNA berukuran 485 pb dihasilkan A. mellifera yang termasuk garis keturunan Afrika. Dua fragmen DNA berukuran 194 pb dan 291 pb untuk keturunan A. mellifera selain Afrika. Crozier & Koulinous (1996) telah melakukan penelitian yang sama di Australia. Dengan menggunakan gen sitokrom b/BglII dapat membedakan antara kelompok garis keturunan asal Afrika dan Eropa. Hal tersebut diketahui berdasarkan keberadaan situs pemotongan BglII. Hasil penelitiannya menunjukkan bahwa tidak ada situs pemotongan BglII pada A. mellifera dari garis keturunan Afrika. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Hidayat (2006), mengenai asal lebah madu impor A. mellifera di Indonesia berdasarkan daerah intergenik cox 1-2/Dra1 DNA mitokondria, menyatakan bahwa A. mellifera yang ada di Indonesia merupakan keturunan A. m. ligustica yang diimpor dari Australia. Pada penelitian ini ukuran DNA seluruh contoh A. mellifera hasil amplifikasi gen sitokrom b berdasarkan sekuen DNA ialah 485 pb. Daerah gen sitokrom b hasil pemotongan enzim BglII berdasarkan sekuen DNA menghasilkan dua fragmen DNA. Fragmen tersebut berukuran 194 pb dan 291 pb. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Crozier et al. (1991) pada gen sitokrom b/BglII. Apis mellifera membutuhkan sumber pakan yang lebih banyak dibanding lebah lain. Untuk mensiasati pemenuhan sumber pakan berupa bunga, maka lebah ini perlu dipindahkan (diangon). Sekitar bulan Mei, Juni, Juli pohon randu di daerah Jawa Tengah dan
Timur sedang mengalami musim bunga. Pada saat itu lebah dari peternak di Jawa Barat membawa lebahnya untuk diangon di Jawa Timur. Selain contoh lebah dari Jawa Tengah dan Jawa Timur, contoh lebah dari Jawa Barat juga ikut diambil untuk dianalisa pada penelitian ini. Dari seluruh contoh A. mellifera yang dideteksi yaitu contoh yang berasal dari Jawa Tengah, Jawa Barat, dan Jawa Timur tidak membawa gen AHB. Hal tersebut karena dari hasil amplifikasi fragmen DNA dapat dipotong oleh enzim BglII. Analisis homologi dilakukan antara nukleotida A. mellifera dari Crozier dan Crozier dengan Acc.Number: L06178, A. mellifera asal Pati dan A. m. scutellata (AHB) haplotipe satu dan haplotipe dua. Berdasarkan hasil Alignment diketahui bahwa contoh A. mellifera pada penelitian ini mempunyai urutan nukleotida yang sama dengan A. mellifera dari Crozier dan Crozier (1993) pada GenBank Acc Number: L06178 yang dimulai dari nukleotida ke 396. Situs BglII terdapat pada posisi nukleotida ke 694. Pencarian data dari GenBank diperoleh dua haplotipe AHB yaitu EF016646 (AHB haplotipe satu) dan EF 016647 (AHB haplotipe dua). Berdasarkan analisis homologi, kedua haplotipe tersebut berbeda pada posisi nukleotida ke 65 (Gambar 4). Perbedaan antara AHB dan bukan AHB adalah terdapat substitusi pada nukleotida ke 295 (Gambar 5. Mutasi no 5). Nukleotida timin (T) yang dikenali oleh enzim BglII pada Am 19 pt mengalami mutasi menjadi nukleotida sitosin (C)n pada lebah AHB. Hal ini menyebabkan pada AHB tidak terdapat situs restriksi BglII sehingga hanya satu pita pada hasil RFLP. Berdasarkan hasil alignment DNA, terdapat sembilan substitusi yang membedakan antara Am 19 pt dari hasil penelitian ini dengan AHB haplotipe satu dan haplotipe dua.
KESIMPULAN Amplifikasi daerah gen sitokrom b DNA mitokondria Apis mellifera berdasarkan urutan DNA menghasilkan produk sebesar 485 pb. Pemotongan DNA hasil amplifikasi dengan enzim restriksi BglII menghasilkan dua fragmen DNA masing-masing berukuran 194 pb dan 291 pb. Data sitokrom b/BglII hasil restriksi menunjukkan bahwa belum ada lebah AHB di pulau Jawa. Dengan demikian, keberadaan lebah Africanized dapat dideteksi dari DNA mitokondria melalui gen sitokrom b
8
berdasarkan keberadaan situs pemotongan BglII.
SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui tingkat akurasi daerah gen lain pada DNA mitokondria dengan enzim restriksi yang berbeda.
DAFTAR PUSTAKA Clarke et al. 2002. The Africanization of honeybees (Apis mellifera ligustica) of the Yucatan: study massive hybridization event across time. Evolution 56:14621474 Crozier RH, Koulinos S, Crozier YC. 1991. An improved test for africanized honeybee mitochondrial DNA. Experientia 47:968-969 Crozier RH & Koulianos S. 1996. Mitochondrial DNA sequence data provides further evidence that the honeybees of Kangaroo Islands, Australia, are of hybrid origin. Apidologie 27:165-174 Crozier YC & Crozier RH 1993. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization. Genetics 133:97-117 Franck P et al. 2000. Molecular confirmation of a fourth lineage in honeybees in the Near East. Apidologie 31(2):167-180. Gojmerac W.L. 1983. Bees, Beekeeping, Honey and Pollination. Connecticut: AVI Pub. Griffiths AJ et al. 1999. Modern Genetic Analysis. Freeman & Company, Madison Avenue, New York. Hidayat RM. 2006. Asal Lebah Madu Impor Apis mellifera Di Indonesia Berdasarkan Daerah Intergenik cox 1/cox 2 DNA Mitokondria [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor Hoy MA. 1994. Insect Molecular Genetics: An Introduction to Principles and Applications. Academic Press. Inc. Kenneth TK & Oguro J. 1999. Update on the status of Africanized honeybees in the Western States. British Medical Association. West J Med 170:220-222 Michener DC. 2000. The Bees of the World. Baltimore and London. The Johns Hopkins University Pr. Pinto AM et al. 2003. Identification of Africanized honey bee (Hymenoptera: Apidae) mitochondrial DNA: Validation of a rapid
polymerase chain reaction based assay. Ann Entomol 96(5):679-684 Raffiudin R. 2006. Mitochondrial DNA Evidence of the Imported Honey Bee Apis mellifera in Indonesia. Report in Indonesian Toray Science Foundation (ITSF) Seminar on Science and Technology, Jakarta, 1 February 2006. Ruttner F. 1988. Biogeography and Taxonomy of Honey Bees. Berlin: Springer Hiedelberg New York. Sambrooks J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning a Laboratory Manual. Ed ke-2. New York: Cold Spring Harbor Pr. Schneider, Hoffman DG, Smith DR. 2003. The African honeybee: factors contributing to a successful biological invasion. Ann Entomol 49:351-368 Sheppard et al. 1993. Analysis of Africanized honeybee mitochondrial DNA reveals further diversity origin. Genet Mol Biol 22:1415-1757 Suwanda O. 1986. Pengelolaan lebah madu oleh pramuka. Di dalam: Budi Daya dan Biologi Lebah Madu. Prosiding Lokakarya Pembudidayaan Lebah Madu untuk Peningkatan Kesejahteraan Masyarakat: Sukabumi, 20-22 Mei 1986. Jakarta: Perum Perhutani.hlm 273-292 Tegelstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in natural population : an improved routine for screening of genetic variation based on sensitif silver staining. Electrophoresis 7:226-229. Thompson JD et al. 1997. The Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acid Res 25:4876-4882 Venables EO & Ripley BD. 1999. Modern Applied Statistics with S-plus. New York: Springer
LAMPIRAN
9
Lampiran 1 Daftar nama dan alamat peternak A. mellifera di Jawa Timur, Jawa Tengah, Yogya, dan Jawa Barat (Raffiudin 2006). No Peternak 1 Pusbahnas 2 Pusbahnas 3 Ari puspa(Joko) 4 Muria agung (Nurcholis) 5 Ramli 6 Rifa'I 7 Harno 8 Mashudi 9 Mashudi 10 Mashudi 11 Santoso 12 UP3 Regaloh (Marsudi) 13 UP3 Regaloh (Marsudi) 14 Harno 15 Rahayu (Supri dan kani) 16 Bambang suseno 17 KUD Batu (Bashori) 18 Harwi 19 Serangga mas (Herman) 20 Serangga mas (Herman) 21 Serangga mas (Herman) 22 Serangga mas (Herman) 23 Serangga mas (Herman) 24 Sudar 25 Apiari madu (Geri) 26 Herman 27 Karya sari (Sutrisno) 28 Karya sari jaya (Sutirisno) 29 Djaenuri 30 Darsono jenggin 31 Kelp.tani lebah madu sariwono (wien) 32 Cipta apiari (Budi) 33 Sartono 34 Sartono 35 Pramuka (Wawan) 36 Perhutani gunung arca (Solichin) 37 Heru 38 Kelompok tani Yogya (Sutrisno) 39 Madu sekarsari (Untung) 40 Mulyadi 41 Sari alam (Susanto) 42 Yapet 43 Suharjo
Nama sampel Am 1 Am 2 Am 3 Am 4 Am 5 Am 6 Am 7 Am 8 Am 9 Am 10 Am 11 Am 12 Am 13 Am 14 Am 15 Am 16 Am 17 Am 18 Am 19 Am 20 Am 21 Am 22 Am 23 Am 24 Am 25 Am 26 Am 27 Am 28 Am 29 Am 30 Am 31 Am 32 Am 33 Am 34 Am 35 Am 36 Am 37 Am 38 Am 39 Am 40 Am 41 Am 42 Am 43
Alamat Parung panjang, Bogor Parung panjang, Bogor Ds.Glagah kulon RT 1/RW 1, Kudus Sragen Jawa tengah Jawa tengah Purwasari, Tlogowungu, Pati Ds.Tlogorejo, Tlogowungu Ds.Tlogorejo, Tlogowungu Ds.Tlogorejo, Tlogowungu Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Purwosari, Tlogowungu, Pati Yogyakarta Jawa tengah Jl.Diponegoro no 8 kota Batu Jawa tengah Yogyakarta, Mojosongo, solo Yogyakarta Yogyakarta Yogyakarta Yogyakarta Jawa tengah Malang Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Temanggung, Jawa tengah Sukabumi, Jawa barat Ketanggan, Gembong, Pati Pringsurat, Temanggung Yogyakarta Jawa tengah Ds.Bedono, dusun wawarkidul RT 2/3 Ambarawa Jawa tengah Jawa tengah
10
No 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70
Peternak Suharjo Cepi Cepi Khoirudin Mustika apiaris (Nanang haryono) Mustika apiaris (Nanang haryono) Prima (Supri) Santoso (Hawai) Nuhana (Holland) Santoso (Australia) Santoso (Cina) Nuhana madu (Nuhana) Sumber madu (Junaidi) KSR (Kasrin) KS (Liem) Mekarsari (Samsul) Warna muria (H.mustamar) AL (Hasan) Sumber madu (Marsito) Nektarindo abadi (Trisukow8ibowo) AL ihsan (H.tato) Bintang apiari KUD Batu (Adrian sembodo) Lebah alam (Mulyo haryono) Omega madu (Narko/purnomo) Tasmuji Lestari (ketang)
Nama sampel Am 44 Am 45 Am 46 Am 47 Am 48 Am 49 Am 50 Am 51 Am 52 Am 53 Am 54 Am 55 Am 56 Am 57 Am 58 Am 59 Am 60 Am 61 Am 62 Am 63 Am 64 Am 65 Am 66 Am 67 Am 68 Am 69 Am 70
Alamat Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Jawa tengah Banyuwangi, Jawa timur Banyuwangi, Jawa timur Jawa tengah Perhutani regaloh (Hawai) Dusun Purworejo, Ds bringin pare, Kediri Gringsing,Batang Perhutani regaloh (Hawai) Dusun Purworejo, Ds bringin pare, Kediri Ds.Lumbang,kec.Lumbang, Probolinggo Singosari, Malang Surabaya Jember Gembong,Pati, Jawa timur Tempurejo, Jember Ds.Kepung pare, Kediri Purwosari, Pasuruan Wajak, Malang Batu, Malang Jl.Diponegoro no 8 kota Batu Punten batu, Malang Dorok manggis RT 05/03,puncu, Kediri Pare, Kediri Taraken, Kediri
11
Lampiran 2 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. mellifera sampel Am 19 Pati menggunakan primer forward sitokrom b
12
Lampiran 3 Kromatogram hasil pengurutan DNA A. mellifera sampel Am 19 Pati menggunakan primer reverse sitokrom b
