VIROVÉ CHOROBY VČELY MEDONOSNÉ (APIS MELLIFERA)

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV EXPERIMENTÁLNÍ BIOLOGIE

VIROVÉ CHOROBY VČELY MEDONOSNÉ (APIS MELLIFERA) Bakalářská práce

Andrea Foralová

Vedoucí práce: RNDr. Jana Prodělalová Ph.D.

Brno 2014

Bibliografický záznam Autor:

Andrea Foralová Přírodovědecká fakulta Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie

Název práce:

Virové choroby včely medonosné (Apis mellifera)

Studijní program:

Experimentální biologie

Studijní obor:

Speciální biologie, zaměření Mikrobiologie a molekulární biotechnologie

Vedoucí práce:

RNDr. Jana Prodělalová Ph.D.

Akademický rok:

2013/2014

Počet stran:

56

Klíčová slova:

virus; infekce; včela medonosná; paralýza; deformace; kleštík včelí; hmyzomorka včelí

Bibliographic Entry Author

Andrea Foralová Faculty of Science Masaryk University Department of Experimental Biology

Title of Thesis:

Virus infections in honey bees (Apis mellifera)

Degree programme:

Experimental Biology

Field of Study:

Special Biology, specialization Microbiology and molecular biotechnology

Supervisor:

RNDr. Jana Prodělalová Ph.D.

Academic Year:

2013/2014

Number of Pages:

56

Keywords:

virus; infection; Apis mellifera; paralysis; deformation; Varroa destructor; Nosema apis

Poděkování Ráda bych na tomto místě poděkovala vedoucí mé bakalářské práce RNDr. Janě Prodělalové Ph.D. za její ochotu, připomínky a čas, který mi při zpracování bakalářské práce věnovala.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s použitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

V Brně 15.5.2014

………………………………. Andrea Foralová

Abstrakt Se včelou medonosnou (Apis mellifera) je spojeno přes 20 druhů převážně +ssRNA virů. Virové infekce včely medonosné probíhají většinou skrytě na úrovni jednotlivců i včelstev, kdy nedochází k žádným větším škodám. Replikace viru však může být při dlouhodobých stresových situacích aktivována, což vede k rozvoji onemocnění. Největším problémem v posledních 30 letech je zejména společný výskyt virů a parazitů kleštíka včelího (Varroa destructor) a hmyzomorky včelí (Nosema apis), který může ve včelstvech způsobit značné škody a v extrémních případech i jejich úhyn. V práci jsou shrnuty dosavadní poznatky o taxonomii, historii, způsobech přenosu, klinických příznacích, geografické distribuci a diagnostických metodách využívaných k detekci virových onemocnění včel.

Abstract There are more than 20, mostly +ssRNA species of viruses which are associated with the honey bee (Apis mellifera). Virus infections are usually present in individuals and colonies as a covert infection and do not cause any serious damage. However, virus replication can be activated in long-term stress situations, resulting in emergence of disease. The major problem of the last 30 years is the coincidence of viruses and parasites Varroa destructor and Nosema apis that can cause a serious harm to colonies, in extreme cases even their death. This thesis summarize the current information about taxonomy, history, modes of transmission, clinical symptoms, geographical distribution and diagnostic methods used for detection of virus diseases in honey bees.

Obsah 1

ÚVOD........................................................................................................................... 12

2

CÍL PRÁCE .................................................................................................................. 13

3

TAXONOMIE .............................................................................................................. 14

4

3.1

Čeleď Dicistroviridae ........................................................................................... 14

3.2

Čeleď Iflaviridae ................................................................................................... 15

3.3

Nezařazené viry ..................................................................................................... 16

ZPŮSOBY PŘENOSU VIRŮ ...................................................................................... 17 4.1

4.1.1

Přímý horizontální přenos .............................................................................. 17

4.1.2

Nepřímý horizontální přenos ......................................................................... 19

4.2 5

6

Horizontální přenos virů ....................................................................................... 17

Vertikální přenos virů ........................................................................................... 22

PRŮBĚH VIROVÉ INFEKCE .................................................................................... 23 5.1

Otevřená infekce ................................................................................................... 23

5.2

Skrytá infekce........................................................................................................ 24

VIROVÉ CHOROBY VČEL ....................................................................................... 25 6.1

Čeleď Dicistroviridae ........................................................................................... 25

6.1.1

Acute bee paralysis virus ............................................................................... 25

6.1.2

Kashmir bee virus .......................................................................................... 25

6.1.3

Israeli acute paralysis virus ........................................................................... 26

6.1.4

Black queen cell virus .................................................................................... 26

6.1.5

Big Sioux River virus .................................................................................... 27

6.1.6

Aphid lethal paralysis virus strain Brookings ................................................ 27

6.1.7

Cloudy wing virus .......................................................................................... 27

6.2

Čeleď Iflaviridae ................................................................................................... 28

6.2.1

Deformed wing virus ...................................................................................... 28

6.2.2

Sacbrood virus ............................................................................................... 30

6.2.3

Slow bee paralysis virus ................................................................................ 31

6.2.4

Varroa destructor virus – 1 ........................................................................... 32

6.2.5

Kakugo virus .................................................................................................. 32

6.3

DNA viry............................................................................................................... 32

6.3.1

Apis iridescent virus ...................................................................................... 32

6.3.2 6.4

Filamentous virus ........................................................................................... 33

Ostatní nezařazené viry ......................................................................................... 33

6.4.1

Chronic bee paralysis virus ............................................................................ 33

6.4.2

Chronic bee paralysis virus associate ............................................................ 36

6.4.3

Bee virus X .................................................................................................... 36

6.4.4

Bee virus Y .................................................................................................... 37

6.4.5

Egypt bee virus .............................................................................................. 37

6.4.6

Arkansas bee virus a Berkeley bee picornavirus ........................................... 37

6.4.7

Lake Sinai virus – 1 a Lake Sinai virus – 2 ................................................... 38

7

GEOGRAFICKÁ DISTRIBUCE VČELÍCH VIRŮ .................................................... 39

8

DIAGNOSTIKA VIROVÝCH ONEMOCNĚNÍ......................................................... 45

9

ZÁVĚR ......................................................................................................................... 47

Seznam použitých zkratek ABPV

Acute bee paralysis virus

ABV

Arkansas bee virus

AIV

Apis iridescent virus

ALPV

Aphid lethal paralysis virus

BBPV

Berkeley bee picornavirus

BSRV

Big Sioux River virus

BQCV

Black queen cell virus

BVX

Bee virus X

BVY

Bee virus Y

CBPV

Chronic bee paralysis virus

CBPVA

Chronic bee paralysis virus associate

CCD

Syndrom kolapsu kolonií (colony collapse disorder)

cDNA

Komplementární deoxyribonukleová kyselina

CrPV

Cricket paralysis virus

CWV

Cloudy wing virus

DNA

Deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid)

dsDNA

Dvouřetězcová deoxyribonukleová kyselina (double-stranded deoxyribonucleic acid)

DWV

Deformed wing virus

EBV

Egypt bee virus

ELISA

Imunoenzymatický test (enzyme-linked immunosorbent assay)

FV

Filamentous virus

IAPV

Israeli acute paralysis virus

IFV

Infectious flacherie virus

IGR

Mezigenový nepřekládaný úsek (intergenic untranslated region)

KBV

Kashmir bee virus

kDa

Kilodalton

KV

Kakugo virus

LSV–1

Lake Sinai virus – 1

LSV–2

Lake Sinai virus – 2

NASBA

Amplifikace sekvencí nukleových kyselin (nucleic acids sequence based amplification)

nt

Nukleotid

ORF

Otevřený čtecí rámec (open reading frame)

PCR

Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction)

RhPV

Rhopalosiphum padi virus

RNA

Ribonukleová kyselina (ribonucleic acid)

RT

Reverzní transkriptáza (reverse trancriptase)

RT-LAMP

Reverse-transcription – loop-mediated isothermal amplification

RT-PCR

Polymerázová řetězová reakce s reverzní transkripcí (reverse transcription polymerase chain reaction)

ssDNA

Jednořetězcová deoxyribonukleová kyselina (single-stranded deoxyribonucleic acid)

SBV

Sacbrood virus

SBPV

Slow bee paralysis virus

+ssRNA

Pozitivní jednořetězcová RNA (+ single-stranded ribonucleic acid)

UTR

Nepřekládáný úsek (untranslated region)

VDV–1

Varroa destructor virus – 1

VP

Virový protein (virus protein)

VPg

Virový protein vázaný na genom (genome-linked virus protein)

1 ÚVOD Včela medonosná (Apis mellifera) je hostitelem přibližně 20 popsaných druhů virů. Tyto viry postihují všechna vývojová stadia a kasty včel a mohou u nich způsobovat morfologické, fyziologické a etologické změny. Pokud tyto změny postihnou větší část včelstva, může to mít za následek jeho oslabení nebo i úhyn. Většinou však viry ve včelách přetrvávají skrytě v nízkých koncentracích, kdy replikace viru neprobíhá vůbec, nebo pouze omezeně. V tomto případě včela nevykazuje žádné příznaky onemocnění a jeví se tedy jako zcela zdravá. Za určitých okolností, jako je např. stres, nedostatek potravy, dlouhodobě špatné klimatické podmínky nebo napadení jiným patogenem, parazitem nebo škůdcem, však může dojít k aktivaci replikace a tedy i k rozvoji klinického onemocnění (Allen a Ball 1996). První záznamy o výskytu onemocnění včel, jejichž možným původcem byly viry, pochází z počátku 20. století (White 1917), intenzivní výzkum včelích virů však začal probíhat až o několik desetiletí později (Bailey et al. 1963). Ačkoli od té doby došlo k výraznému pokroku v diagnostických metodách a výzkum se tak značně usnadnil, nejsou doposud získané informace o včelích virech kompletní. Zejména co se týká mechanismu přenosu virů, jejich vzájemné interakce, geografické distribuce a faktorů spouštějících virovou infekci, zůstává i nadále řada otázek nezodpovězených, a jejich objasnění je teprve otázkou budoucnosti.

12

2 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce je vypracovat literární přehled, který se bude zabývat taxonomií, historií, původem, rozšířením, patologií, způsoby přenosu a diagnostikou nejvýznamnějších virů včely medonosné.

13

3 TAXONOMIE Většina doposud popsaných včelích virů je řazena do čeledí Dicistroviridae a Iflaviridae řádu Picornavirales. Do tohoto řádu patří celkem pět čeledí – vedle již zmíněných dvou to jsou Picornaviridae, Marnaviridae a Secoviridae, a 2 nezařazené rody – Bacillarnavirus a Labyrnavirus [URL1].

3.1 Čeleď Dicistroviridae Do této čeledi řadíme celkem dva rody virů. Prvním z nich je rod Cripavirus, do kterého je řazen Black queen cell virus (BQCV) (King et al. 2012) a Aphid lethal paralysis virus strain Brookings (ALPV-Brookings). U ALPV-Brookings však zatím není jasné, zda se jedná o nový druh, nebo pouze nový subtyp viru ALPV, který je patogenní pro mšice (Runckel et al. 2011). Typovým druhem rodu Cripavirus je Cricket paralysis virus (CrPV). Druhým rodem spadající do čeledi Dicistroviridae je rod Aparavirus zahrnující tři vzájemně příbuzné včelí viry – Acute bee paralysis virus (ABPV), Israeli acute paralysis virus (IAPV) a Kashmir bee virus (KBV). ABPV je současně typovým druhem tohoto rodu (King et al. 2012). Do čeledi je předběžně zařazen také Cloudy wing virus (CWV) [URL1] a nově objevený Big Sioux River virus (BSRV) (Runckel et al. 2011). Jedná

se

o

malé

neobalené

viry

s lineární

jednořetězcovou

pozitivní

RNA

(+ssRNA). Průměrná velikost částic je přibližně 30 nm a velikost genomu činí 8500-10000 nt (King et al. 2012). Struktura genomu virů čeledi Dicistroviridae je uvedena na Obr. 1.

Obr. 1: Struktura genomu virů čeledi Disictroviridae. Řetězec obsahuje dva otevřené čtecí rámce, ORF1 o délce 530 nt kódující nestrukturní proteiny a ORF2 o délce 2500 nt kódující strukturní (kapsidové) proteiny VP1, VP2, VP3 a u některých druhů také VP4. Velikost VP1, VP2 a VP3 činí 24–40 kDa, nejmenší VP4 je velký 4,5–9 kDa. ORF1 a ORF2 jsou od sebe odděleny mezigenovým nepřekládaným úsekem (IGR) o délce 170–530 nt a z obou stran jsou ohraničeny nepřekládanými oblastmi (UTR). Na 5´ konec řetězce je vázán malý protein VPg a 3´ konec je polyadenylován. Upraveno podle Chen et al. (2006b).

14

Viriony jsou ikosahedrálního tvaru s pseudo T=3 symetrií. Schéma stavby virionu je uvedeno na Obr. 2.

Obr. 2: Schéma virionu rodu Aparavirus. Virion se skládá ze 60 protomer, složených ze strukturních proteinů VP1, VP2 a VP3. Na vnitřním povrchu částic se u některých druhů nachází také menší VP4 a většinou zde můžeme nalézt také proteinový prekurzor VP0, vázaný na VP3 a VP4. Organizace virionů rodů Aparavirus, Cripavirus a Iflavirus je shodná. Dostupné z [URL2].

3.2 Čeleď Iflaviridae Čeleď Iflaviridae obsahuje jediný rod, kterým je rod Iflavirus. Do tohoto rodu jsou řazeny Sacbrood virus (SBV), Deformed wing virus (DWV), Varroa destructor virus – 1 (VDV-1), Slow bee paralysis virus (SBPV) (King et al. 2012) a nedávno objevený Kakugo virus (KV) (Fuiyuki et al. 2004). Typovým druhem tohoto rodu je Infectious flacherie virus (IFV). Stejně jako v případě virů čeledi Dicistroviridae se jedná o neobalené +ssRNA viry s ikosahedrální symetrií, měřící v průměru 26–30 nm. Celková délka jejich genomu činí 8800–10100 nt (King et al. 2012). Organizace genomu je však v případě druhů této čeledi odlišná (Obr. 3).

Obr. 3: Struktura genomu virů čeledi Iflaviridae. Řetězec obsahuje jeden otevřený čtecí rámec ORF kódující strukturní proteiny na 5´ konci a nestrukturní proteiny na 3´ konci. Velikost strukturních proteinů VP1, VP2 a VP3 se pohybuje v rozmezí 28–44 kDa. U některých druhů virů se vyskytuje také VP4 o velikosti zhruba 4–12 kDa. ORF je z obou stran ohraničen nepřekládanými oblastmi (UTR), jejichž délka je druhově specifická. Na 5´ konec řetězce je vázán malý protein VPg a 3´ konec je polyadenylován. Upraveno podle Chen et al. (2006b).

15

3.3 Nezařazené viry Řada včelích virů nebyla doposud klasifikována. Jedná se celkem o dva DNA viry – Apis iridescent virus (AIV) a Filamentous virus (FV) a několik +ssRNA virů, které se v některých ohledech liší od druhů výše zmíněných. Zvláštním případem je Chronic bee paralysis virus (CBPV), který je charakteristický svými oválnými částicemi (Obr. 4) a rozdílnou organizací RNA. Ačkoli má některé shodné znaky s viry čeledí Nodaviridae a Tombusviridae, od všech známých virů se liší. V budoucnosti se tedy může stát typovým druhem pro novou skupinu +ssRNA virů (Olivier et al. 2008). Příbuznými viry jsou Lake Sinai virus – 1 (LSV–1) a Lake Sinai virus – 2 (LSV–2), které jsou viru CBPV podobné a stejně jako on se řadí na pomezí čeledí Nodaviridae a Tombusviridae (Runckel et al. 2011).

Obr. 4: Viriony CBPV. Snímek z elektronového mikroskopu. Upraveno podle Bailey (1976).

16

4 ZPŮSOBY PŘENOSU VIRŮ Včely jsou sociálním druhem hmyzu vyznačujícím se vysoce organizovaným kastovním systémem. Včelí společenstvo čítající 20 000 – 60 000 jedinců žijící v jednom úlu vytváří superorganismus, který funguje jako celek a kde má každý jedinec svoji úlohu. Tento způsob života však predisponuje včely k celé řadě onemocnění. Viry nebyly nikdy považovány za velkou hrozbu pro populaci včel, protože ve včelstvech většinou přetrvávaly, aniž by u včel způsobovaly jakékoli příznaky onemocnění. Za posledních několik desetiletí však došlo k nárůstu případů virových infekcí a s nimi souvisejících úhynů včelstev. Navíc byla zaznamenána řada případů tzv. syndromu kolapsu kolonií (CCD). Dosud není znám původce tohoto jevu, při kterém dochází ke zmizení většiny dělnic ze včelstva, avšak často je spojován právě s napadením některými druhy virů (Oldroyd 2007). Vzhledem ke kastovnímu systému včelstev, rozdělení úkolů a rozsáhlé sociální interakci včel je možné šíření virů jak mezi jedinci v rámci jednoho včelstva, tak i mezi jedinci různých včelstev. Lze rozlišit dva směry šíření infekčních částic, a to horizontální a vertikální (Obr. 7). Převládající směr šíření každého druhu viru souvisí s jeho vlastnostmi – patogenitou a virulencí. Patogenitou rozumíme druhově specifickou schopnost vyvolat onemocnění, virulence je schopnost kmene uplatnit svoji patogenitu. Kmeny s nízkou virulencí jsou zničeny imunitním systémem hostitele dříve, než dojde k rozšíření viru, naopak kmeny s příliš vysokou virulencí svého hostitele zahubí a zaniknou spolu s ním. Jelikož cílem každého viru je maximalizace jeho rozšíření, je nejvýhodnější vyrovnaná patogenita, která je výsledkem dlouhodobé adaptace (Lipsitch et al. 1996).

4.1 Horizontální přenos virů K horizontálnímu přenosu virů dochází v rámci jedné generace včel. Může k němu docházet buď přímou, anebo nepřímou cestou. Obecně lze říci, že infekce přenášené horizontálně jsou virulentnější, často doprovázené pozorovatelnými klinickými příznaky (Chen et al. 2006a).

4.1.1

Přímý horizontální přenos

Tento způsob přenosu vyžaduje blízký fyzický kontakt s infikovaným jedincem, pozření infikované potravy nebo pobyt v infikovaném prostředí. 17

V rámci jednoho včelstva hraje velkou roli při přenosu virů rozdělení úkolů dělnic na krmičky pečující o včelí plod, strážkyně bránící úl před predátory, stavitelky vytvářející plástve, uklízečky čistící úl a létavky přinášející zásoby vody a potravy. Při každé z těchto činností je včela vystavována možnosti nakažení virem při kontaktu s infikovanými jedinci, zásobami nebo materiálem a zároveň se stává i jeho potencionálním přenašečem (Chen et al. 2006a; Schmid-Hempel 1998). U řady virů je běžný přenos z dospělé včely na larvu prostřednictvím infikované potravy, kterou produkují dělnice svými podhltanovými žlázami. Takto vyprodukovaná potrava může obsahovat velké množství virových částic, jelikož právě podhltanové žlázy jsou často viry silně napadeny. Infikovaná však nemusí být jen larvální potrava či mateří kašička, ale rovněž i další včelí produkty, které přijdou do kontaktu s jejich slinami. Jde tedy také o pyl, med a nektar, jejichž prostřednictvím se viry mohou rovněž šířit (Chen et al. 2006a; Shen et al. 2005a). K přenosu infekčních částic může docházet také fyzickým kontaktem zdravých jedinců s infikovanými. Jak bylo popsáno například u viru SBV, dospělá včelí dělnice se nakazí pozřením malého množství exuviální tekutiny při odstraňování infikovaných larev z úlu (Bailey 1969). Podobným případem je přenos CBPV, kdy zdravé včely napadají infikované jedince, a při těchto útocích dochází k pozření chloupků z jejich těl. Ty jim následně způsobují v zažívacím traktu drobná poranění, kterými virus snadno pronikne do jejich organismu (Rinderer a Rothenbuhler 1975). Navíc u obnažené kutikuly dochází k snadnějšímu prostupu virových částic a přenos viru je tak možný i prostým fyzickým kontaktem těl při vysoké koncentraci jedinců na určité ploše (Bailey et al. 1983b in Aubert et al. 2008). Další možností přímého horizontálního přenosu viru je prostřednictvím infikovaných včelích výkalů. Některé studie dokazují, že včely napadené CBPV (Ribière et al. 2007), ABPV (Bailey a Gibbs 1964), DWV, BQCV (Chen et al. 2006b) a KBV (Hung 2000) vylučují ve výkalech částice viru, které jsou při pozření schopny infikovat zdravé jedince. Množství takto přenesených virových částic je však na vyvolání otevřené infekce příliš nízké (Ribière et al. 2007). Posledním, zatím neprostudovaným způsobem přímého horizontálního přenosu virů, je přenos pohlavní cestou, ke kterému může docházet při páření. Ačkoli zatím neexistuje studie, která by dokázala tento druh přenosu potvrdit, je zde jistá pravděpodobnost, že k němu opravdu dochází. Svědčí o tom zejména výsledky analýzy spermatu trubců 18

a spermaték včelích matek, ve kterých byly zaznamenány virové částice (Chen et al. 2006b). Obdobné způsoby přenosu existují rovněž mezi včelstvy navzájem. Děje se tak například zalétáváním dělnic do cizích úlů, ať už omylem nebo za účelem loupeže zásob, či zalétáváním trubců. Rovněž je možný přenos při kontaktu s infikovaným materiálem, jakým mohou být například opylované květy. Nemalý podíl na šíření nemocí mají také sami včelaři, kteří spojují slabá včelstva, aby vytvořili včelstvo silnější, nebo vyměňují mezi úly materiál. Těmito zásahy významně zvyšují riziko přenosu infekčních částic (Genersch 2008).

4.1.2

Nepřímý horizontální přenos

Nepřímý přenos viru je uskutečňován prostřednictvím přenašeče. Mezi nejvýznamnější přenašeče virů u včel patří paraziti Varroa destructor a Nosema apis. Interakce mezi Varroa destructor a včelími viry Varroa destructor neboli kleštík včelí (Obr. 5) je považován za nejvýznamnějšího parazita včely medonosné, jemuž je přisuzován hlavní podíl na šíření a vyvolávání virových onemocnění včel. Dříve byl tento druh roztoče nesprávně klasifikován jako Varroa jacobsoni, avšak v roce 2000 byl na základě výsledků analýzy mitochondriální DNA od tohoto druhu taxonomicky odlišen (Anderson a Trueman 2000).

Obr. 5: Dospělá samička Varroa destructor z ventrální a dorsální strany. Dostupné z [URL3], upraveno.

Tento exotický parazit se do Evropy dostal z Asie pravděpodobně na počátku 20. století, odkud se během několika desetiletí rozšířil do celého světa. Jeho původním hostitelem je 19

včela východní (Apis cerana), která má oproti včele medonosné při napadení varroou dvě výhody. První z nich je skutečnost, že se u ní V. destructor rozmnožuje pouze na málo početném trubčím plodu. Druhou výhodou je silný čistící pud, který se u těchto včel vyvinul jako adaptace pod vlivem dlouhodobého soužití s tímto parazitem. Dokáže tak odstraňováním jednotlivých roztočů a jimi napadených larev z úlu udržovat jeho populaci v únosné míře. Včela medonosná však tuto schopnost postrádá a rozmnožování roztoče u ní probíhá nejen na trubčím plodu, ale rovněž na plodu dělničím a matečním. Napadení V. destructor tak může mít pro včelstvo bez zásahu člověka fatální následky (Martin 1995). Vývojový cyklus V. destructor trvá přibližně stejně dlouho jako vývoj včelí larvy. Oplozené samičky roztoče se nechávají zavíčkovat společně s larvou v buňce, kde se na larvu přisají a živí se její hemolymfou. Samička zde následně klade vajíčka. Z vajíček se líhnou larvy – z prvního nakladeného vajíčka se líhne sameček, z ostatních se po několika dnech líhnou samičky. Ještě před vykuklením včely se roztoči v buňce spáří, samečci zahynou a samičky se přichytí na kuklu, kde dokončí svůj vývoj. Spolu se včelou pak opouští buňku. I když zatím není znám přesný mechanismus přenosu a aktivace virů varroou, existuje řada důkazů, že mezi těmito parazity a některými druhy virů existuje jistá spojitost. Prvním z nich je fakt, že před rozšířením V. destructor z Asie nebyly zaznamenány případy otevřených virových infekcí včel, ačkoli bylo známo, že se u nich viry běžně v nízkých koncentracích vyskytují. Po rozšíření V. destructor však byl zaznamenán výrazný nárůst případů otevřených virových infekcí, a to pouze u včelstev napadených tímto parazitem (Bailey et al. 1981). Druhým důležitým faktem je, že se virové částice vyskytují ve vyšší koncentraci u jedinců přímo napadených V. destructor než u jedinců nenapadených (Shen et al. 2005b). U těchto jedinců pak vlivem vyšší koncentrace virových částic častěji dochází k rozvoji otevřené infekce. Tato skutečnost vedla k závěru, že sliny V. destructor mají schopnost regulovat expresi genů, které jsou zodpovědné za humorální a buněčnou imunitní reakci včely. Snížená imunita pak dává prostor pro spuštění virové infekce (Yang a Cox-Foster 2005). Přenos virů prostřednictvím V. destructor byl nepřímo potvrzen také analýzou těl roztočů, která prokázala přítomnost virových částic v jejich zažívacím traktu. Jistotu však přinesl laboratorní experiment, při kterém byla samička roztoče ponechána k nasátí na včele infikované ABPV a později přenesena na zdravou včelí larvu. U této larvy byla následně prokázána přítomnost virových částic. Při tomto experimentu bylo rovněž zjištěno, že 20

někteří roztoči jsou schopni virus přenášet i více než 36 hodin po odstranění z infikované včely a nakazit i několik larev po sobě. Z toho plyne domněnka, že přenos se pravděpodobně

neděje

pouze

prostřednictvím

ústního

ústrojí

kontaminovaného

hemolymfou infikované včely, ale že se virus pozřený společně s nasátou hemolymfou hromadí v zažívacím traktu V. destructor a k přenosu dochází při vyvržení útrobního obsahu těsně před začátkem sání na hostiteli, stejně jako se tomu děje při přenosu rostlinných virů některými druhy hmyzu (Ball 1985; Wiegers 1986). Interakce mezi Nosema apis a včelími viry Nosema apis neboli hmyzomorka včelí je eukaryotický jednobuněčný organismus z říše hub způsobující onemocnění zažívacího traktu dospělých včel, tzv. nosemózu. Jde o vnitrobuněčného parazita vytvářejícího oválné jednobuněčné spory o velikosti přibližně 4×7 μm (Obr. 6) s typickým dutým tzv. pólovým vláknem, které slouží k vystřelení zárodku

spory do cytoplasmy epiteliální buňky v žaludku včely.

Obr. 6: Spory Nosema apis. Snímek ze skenovacího elektronového mikroskopu. Dostupné z [URL4], upraveno.

Přítomnost nosemy v trávicím traktu včely způsobuje ztenčení výstelkového epitelu trávicí trubice, a to má za následek nedostatečnou funkci střeva. Nedokonale natrávená potrava se v něm hromadí a způsobuje průjem včel, které kálí v úlu. Trus infikovaných včel obsahuje mnoho nestrávených látek (zejména bílkoviny a glycidy), a to láká ostatní včely k jeho konzumaci. Tím se onemocnění šíří (Veselý et al. 2003). Nemocná včela hyne na sepsi v důsledku přechodu saprofytických bakterií ze střeva do hemolymfy skrz porušenou střevní stěnu (Lucký 1984).

21

N. apis je spojována zejména s virem BQCV, ale možná je i jeho role při infekci viry BVY a FV. Laboratorní experimenty prokázaly, že k syntéze částic BQCV dochází pouze tehdy, jsou-li včelám v potravě obsahující virové částice podávány současně spory tohoto parazita, nebo pokud byly spory v potravě podávány včelám, které již byly nakaženy virem BQCV. Pokud byl virus injekčně nebo v potravě bez přítomnosti spor parazita podáván zdravým včelám, k propuknutí onemocnění nedošlo. Virus se tedy ukázal být na N. apis zcela závislý (Bailey et al. 1983).

4.2 Vertikální přenos virů Jako vertikální je označován přenos viru z rodiče na potomstvo, tedy na další generaci. Dochází k němu z matky prostřednictvím vaječníků nebo z trubce prostřednictvím spermatu. První případ, přenos z matky na potomstvo, můžeme dále rozlišovat podle toho, jestli je virus z vaječníku přenášen na povrch vajíčka nebo do něj. To závisí na fázi vývoje vajíčka, ve které přijde do kontaktu s virovými částicemi (Chen et al. 2006b). Tento způsob přenosu viru byl zaznamenán u BQCV, DWV a SBV (Chen et al. 2006a). Přenos viru z trubce na potomstvo zatím není blíže prozkoumán. O jeho existenci však napovídá nález virionů ABPV a DWV v trubčím spermatu a ve spermatékách včelích matek (Chen et al. 2006b; Yue et al. 2007). Vertikálně přenášené jsou většinou skrytě probíhající infekce s nízkou virulencí, které nejsou doprovázeny žádnými pozorovatelnými klinickými příznaky (Chen et al. 2006a).

Obr. 7: Schéma přenosu virů mezi včelami. Plné čáry představují horizontální směr přenosu, přerušované čáry představují vertikální směr přenosu. Upraveno podle Chen et al. (2006b).

22

5 PRŮBĚH VIROVÉ INFEKCE V závislosti na konečném vlivu viru na hostitelskou buňku můžeme rozlišit 4 typy virové infekce: 1. Lytický cyklus viru je charakteristický produkcí velkého množství virových částic uvnitř hostitelské buňky. V konečné fázi hostitelská buňka praskne a uvolní tak viriony do svého okolí. 2. Perzistentní infekce je charakteristická neustálou produkcí malého množství virových částic. Hostitelská buňka přežívá bez poškození, nebo je množství odumřelých buněk tak malé, že je vyvažováno produkcí buněk nových. Při tomto druhu infekce tedy nevzniká žádné poškození organismu. 3. Latentní infekce je charakteristická začleněním genetické informace viru do genetické informace hostitelské buňky, při kterém nedochází k produkci dalších virových částic. Virová genetická informace je však replikována spolu s genetickou informací hostitelské buňky a ve vhodných podmínkách může dojít k jejímu vyčlenění z genomu a spuštění vlastní replikace. 4. Infekce vedoucí k neustálému dělení hostitelské buňky způsobená začleněním genetické informace viru do jejího genomu, typicky u nádorových buněk.

Nicméně viry vyskytující se u hmyzu není možné zařadit do žádné z těchto kategorií, a proto jsou u nich užívány více popisné termíny, jako je otevřená a skrytá infekce (Yue et al. 2007).

5.1 Otevřená infekce Jako otevřenou můžeme nazvat infekci, při které je produkováno velké množství virových částic a současně jsou pozorovatelné i klinické příznaky onemocnění. Otevřená infekce končí vždy buď úhynem hostitele, anebo jeho uzdravením, po kterém už k další produkci virových částic nedochází. Tento druh infekce můžeme dále rozdělit do dvou skupin, a sice na akutní a chronickou. Akutní infekce se vyznačují krátkou dobou trvání a vysokou produkcí virových částic doprovázené zřetelnými příznaky onemocnění. Při chronických infekcích je naopak produkce virových částic dlouhodobá, trvající do konce života hostitele, nebo do konce jeho infekčního životního stadia (De Miranda a Genersch 2010). 23

5.2 Skrytá infekce Skrytou infekcí rozumíme takovou infekci, která není doprovázena žádnými viditelnými příznaky, produkce virových částic je omezena nebo zastavena a hostitel při ní dále přežívá (Yue et al. 2007). Dimmock a Primrose (1987) uvádí, že je v literatuře označení skrytá často zaměňováno s označením inaparentní. Inaparentní infekce je však svým průběhem podobná spíše akutní otevřené infekci. Typická je pro ni krátká délka trvání, vysoká produkce virových částic a výhradně horizontální přenos, avšak narozdíl od akutní otevřené infekce není inaparentní infekce doprovázena žádnými klinickými příznaky.

24

6 VIROVÉ CHOROBY VČEL 6.1 Čeleď Dicistroviridae 6.1.1

Acute bee paralysis virus

Virus akutní paralýzy včel byl objeven v roce 1963 při práci na identifikaci původce paralýzy včel – viru CBPV. Bylo zjištěno, že oba viry po experimentální infekci včelám způsobují během několika dní třes a paralýzu, přičemž u ABPV dochází k nástupu příznaků a úhynu rychleji (5–6 dní) než u CBPV (7–8 dní) (Bailey et al. 1963). Kromě včely medonosné byl ABPV zaznamenán i u pěti druhů čmeláků, avšak včela medonosná je pravděpodobně jeho původním hostitelem (Bailey a Gibbs 1964). Jedinci nakažení virem ABPV v přírodních podmínkách nevykazují žádné příznaky onemocnění (Ribière et al. 2010). Někdy však může tento virus způsobit úhyn jedinců nebo i celých včelstev, zejména při jejich silném napadení V. destructor (Martin 2001). V laboratorních podmínkách však tento virus vykazuje vysokou virulenci a k usmrcení jedince během několika dní stačí pouhých 100 virionů při injekčním podání nebo 1011 virionů při podání prostřednictvím potravy (Bailey a Gibbs 1964). Právě vysoká virulence může být vysvětlením, proč nejsou ve včelstvech napadených ABPV zaznamenávány včely postižené příznaky paralýzy. K úhynu nakažených včel totiž dochází dříve, než se nahromadí jejich větší počet, který by byl člověkem zaznamenatelný (Bailey et al. 1963; Ribière et al. 2010). Za nejvýznamnějšího přenašeče ABPV je považován právě roztoč V. destructor. Malé množství částic, které není schopno vyvolat u jedince otevřenou infekci, avšak přispívá k šíření viru, je přenášeno také prostřednictvím potravy a včelích výkalů (Bailey a Gibbs 1964). Kromě horizontálního přenosu je zřejmě možný také přenos vertikální, což dokládá nález částic ABPV ve spermatu trubců (Yue et al. 2007).

6.1.2

Kashmir bee virus

KBV byl poprvé zaznamenán roku 1974 jakožto kontaminace ve vzorku AIV izolovaného z Apis cerana pocházející ze severní Indie. Následný laboratorní experiment prokázal, že injekční aplikace částic tohoto viru včele medonosné způsobovala úhyn včel během několika dní (Bailey et al. 1976; Bailey a Woods 1977). KBV je považován za nejvirulentnější včelí virus, protože letální dávku při injekčním podání činí pouhých 35 virových částic (Bailey et al. 1979). Virus se v organismu včely 25

rychle množí a už během 24 hodin dosahuje nejvyšší koncentrace. Včela hyne během tří dnů (Dall 1985 in Aubert et al. 2008). Podání velkého množství částic v potravě larvám a mladým včelám má stejný účinek. Ačkoli je tento virus blízce příbuzný viru ABPV, včely v laboratorních ani přirozených podmínkách nevykazují žádné klinické příznaky (Bailey et al. 1979). Stejně jako u ABPV je i u KBV hlavním původcem šíření a aktivace virové infekce V. destructor (Chen et al. 2004a; Shen et al. 2005b). Dalším možným způsobem přenosu je také horizontální přenos prostřednictvím kontaminované potravy a výkalů (Hung 2000). Chen et al. (2006b) rovněž připouští možnost vertikálního přenosu z matky na potomstvo.

6.1.3

Israeli acute paralysis virus

IAPV je blízce příbuzným druhem virů ABPV a KBV. K jeho objevení došlo v roce 2002, kdy byl izolován u jedné z mrtvých včel pocházející ze slábnoucího včelstva poblíž města Alon Hagalil v Izraeli. Do současnosti nebyl tento virus zaznamenán u žádného jiného hostitele než u včely medonosné. Onemocnění se zpočátku projevuje ztrátou ochlupení a v důsledku toho zčernáním špičky zadečku, které se během 3–6 dní rozšíří až na hruď včely. Nakažení jedinci jsou značně neklidní, neustále se pohybují v kruhu, téměř nelétají a nepřijímají potravu. Mezi 7. a 10. dnem onemocnění dochází ke zčernání celého zadečku a ztrátě ochlupení na hrudi. Postižené včely se přestávají pohybovat a během několika dní hynou. O způsobu šíření tohoto viru není zatím příliš známo. Při experimentální injekční aplikaci viru uhynuly všechny sledované včely během čtyř dní. O něco pomalejší byl průběh infekce po podání viru v potravě, kdy k úhynu včel došlo během deseti dní (Maori et al. 2007).

6.1.4

Black queen cell virus

První záznam o příznacích BQCV pochází z července roku 1975, následovaný dalšími záznamy o podobných příznacích v dubnu a květnu následujícího roku. Vyšetření vzorků pomocí elektronové mikroskopie prokázalo 1012 virových částic o průměru 30 nm. Jelikož příznaky onemocnění blízce připomínaly SBV, bylo pro ověření diagnózy použito antisérum SBV, které ale nevyvolalo žádnou reakci a prokázalo tak, že se jedná o odlišný druh viru (Bailey a Woods 1977). 26

Příznaky infekce jsou postiženy pouze larvy včelích matek. V raném stadiu infekce má larva světle žlutou barvu a tuhou pokožku, podobně jako je tomu u SBV. Po uhynutí larvy stěny matečníku zčernají (Ball a Bailey 1997). Virus napadá i dospělé jedince, avšak u nich nejsou patrné žádné příznaky onemocnění. K rozvoji onemocnění navíc dochází pouze pokud jsou včely současně napadeny parazitem N. apis (Bailey et al. 1983). K přenosu infekce dochází zejména prostřednictvím potravy, kterou jsou larvy budoucích matek krmeny (Chen et al. 2006a). Vysvětlením, proč k nákaze nedochází také u larev dělnic, je zřejmě fakt, že larvy dělnic jsou krmeny infikovanou mateří kašičkou méně a kratší dobu než larvy matek. Zkonzumované množství virových částic tedy u nich není dostatečné pro rozvoj otevřené virové infekce (Allen a Ball 1996). Chen et al. (2006b) ve své studií připouští také možnost vertikálního přenosu BQCV, jelikož byly sekvence virové RNA zaznamenány u matek a jejich vajíček (100 %), larev (25 %) a dospělých potomků (4 %).

6.1.5

Big Sioux River virus

BSRV je nově identifikovaným virem, jenž se nejvíce podobá jinému viru čeledi Dicistrovirade, Rhopalosiphum padi viru (RhPV) napadajícímu mšice. BSRV a RhPV mají identických 78 % aminokyselin v nestrukturních genech a 69 % v genech strukturních. Zatím není jasné, zda je tento virus včelím patogenem, či jestli se do včel dostává pouze náhodně při sběru pylu (Runckel et al. 2011).

6.1.6

Aphid lethal paralysis virus strain Brookings

ALPV–Brookings je virem vysoce podobným viru ALPV, který však napadá mšice a dosud nebyl u včel zaznamenán. Zatím není patrné, zda se jedná o dva rozdílné, avšak příbuzné druhy, či jestli jde pouze o dva subtypy jednoho viru. O patogenitě tohoto viru není dosud nic známo (Runckel et al. 2011).

6.1.7

Cloudy wing virus

Částice CWV byly objeveny v extraktech dospělých včel, které byly používány pro laboratorní experimenty s jinými druhy virů. Tyto včely měly matná, méně průsvitná křídla a docházelo k jejich předčasnému úhynu (Bailey et al. 1980a). Původně byl tento

27

virus spojován s kolapsem kolonií, nicméně laboratorní experimenty, které tuto domněnku měly potvrdit, nebyly úspěšné (Carreck et al. 2010). Tento virus je často spojován s již zmíněnou ztrátou průsvitnosti včelích křídel, avšak diagnostika založená pouze na detekci viditelných příznaků není v tomto případě příliš spolehlivá. Bailey et al. (1980a) uvádí, že „příznaky zakalených křídel se nezdají být nezaměnitelně nebo výhradně spojeny s vážnou infekcí CWV. Nepodařilo se prokázat přítomnost virových částic u uhynulých včel, které měly zakalená křídla, a na druhou stranu jsme zaznamenali mnoho virových částic v ostatních včelách, které neprojevovaly žádné příznaky onemocnění.” Pro CWV je typický přenos fyzickým kontaktem těl zdravých a infikovaných jedinců zejména při vysoké hustotě těchto jedinců na malé ploše, kdy dochází k přenosu virových částic do malých ranek na povrchu jejich těl (Bailey et al. 1980a). To vysvětluje, proč se virus vyskytuje zejména u včel chovaných v laboratorních podmínkách (Carreck et al. 2010). Množství CWV bylo také zaznamenáno u zavíčkovaného včelího plodu, což naznačuje možnost přenosu viru z dospělých včel na larvy prostřednictvím potravy. To potvrzuje i nález CWV u dospělců Braula coeca. Tyto komenzální bezkřídlé mušky se živí včelími produkty, zejména medem a nektarem, a mohou tak pozřít i produkty slinných žláz včel obsahující virové částice (Carreck et al. 2010). Dalším možným, avšak zatím nepotvrzeným, způsobem přenosu je přenos vzduchem na krátkou vzdálenost (Bailey et al. 1980a).

6.2 Čeleď Iflaviridae 6.2.1

Deformed wing virus

Poprvé byl DWV izolován v Japonsku u včelstev napadených V. destructor a následně byl označen za původce ztrát včelstev v mnoha zemích (Ball 1983 in Aubert et al. 2008). Po svém objevení v roce 1982 byl považován za japonskou variantu Egyptského včelího viru, avšak dnes již je jasné, že jde o dva rozdílné druhy (Bailey a Ball 1991 in De Miranda a Genersch 2010). Zatím není známo, zda je Apis mellifera původním hostitelem DWV, či zda je původním hostitelem Apis cerana. Kromě dvou druhů včel byl DWV zaznamenán také u dvou druhů čmeláků Bombus terrestris a Bombus pascorum (Genersch et al. 2005), u trpasličí včely Apis florea (Allen a Ball 1996), 28

brouka Aethina tumida vyskytujícího se ve včelích úlech (Eyer et al. 2009) a v neposlední řadě také u Varroa destructor (Yue a Genersch 2005) a jemu podobnému včelímu ektoparazitovi Tropilaelaps mercedesae (Forsgren et al. 2009). Jak již sám název viru napovídá, mezi typické příznaky otevřené infekce DWV patří deformovaná, špatně vyvinutá křídla u nově vylíhnutých jedinců, dále je to pak menší velikostí těla a jeho bledé zbarvení (Obr. 8). Postižené včely během krátké doby hynou (Martin 2001). Je však třeba zmínit, že k postižení křídel dochází pouze v případě, že k nákaze došlo ještě před vylíhnutím včely. Pokud k přenosu viru dojde až v pozdějším věku, včela žádnými příznaky napadení netrpí (Aubert et al. 2008).

Obr. 8: Nově vylíhnutá včela postižená DWV. Dostupné z [URL5], upraveno.

Již od počátku objevení deformací křídel u včel je zřejmé, že jejich výskyt úzce souvisí s V. destructor. Původně byl tento parazit považován za výhradního původce tohoto postižení (Akratanakul a Burgett 1975 in Aubert et al. 2008), jelikož se deformované včely vyskytovaly pouze při jeho přítomnosti ve včelstvu. Ačkoli je dnes již jasné, že původcem onemocnění je virus, jeho spojitost s tímto roztočem je více než zřejmá (Ball 1993 in Aubert et al. 2008). Samotné napadení včelstva V. destructor však nemusí vždy nutně znamenat onemocnění DWV, ačkoli je pro propuknutí infekce nezbytné. Klíčovým faktorem je schopnost viru se uvnitř roztočů replikovat. Parazit zde tedy funguje nejen jako mechanický, ale rovněž jako biologický vektor (Mockel et al. 2011). Gisder et al. (2009) uvádí, že k vyvolání infekce DWV je zapotřebí alespoň 1010 kopií viru v těle parazita. Takto vysoký počet virových částic nemůže být dosažen jinak než právě 29

replikací v jeho organismu. Neméně důležitá je také celková míra napadení včelstva roztočem, jelikož byla zaznamenána pozitivní korelace mezi počtem parazitujících roztočů a množstvím virových částic u jimi napadených včel (Bowen-Walker et al. 1999). Kromě horizontálního přenosu infekce je možný také vertikální přenos, a to jak prostřednictvím infikované matky, tak i prostřednictvím trubce. Yue et al. (2007) tuto domněnku potvrdil svými laboratorními experimenty s DWV pozitivními jedinci a následnou analýzou jejich potomstva pomocí RT-PCR a in situ hybridizace. Chen et al. (2006b) uvádí možnost šíření DWV prostřednictvím výkalů infikovaných jedinců a naznačuje tak i možnou roli orálního přenosu, avšak zatím neexistují data, která by tuto možnost mohla s jistotou potvrdit.

6.2.2

Sacbrood virus

Toto onemocnění bylo vůbec prvním onemocněním včel, kterému byl v roce 1917 přisouzen jeho virový původ. Zásluhu na tomto objevu měl američan G. F. White, který prováděl experimentální aplikaci extraktů z larev vykazujících příznaky SBV zdravým larvám a podařilo se mu u nich vyvolat příznaky onemocnění (White 1917). Samotný původce onemocnění, virus SBV, byl popsán až v roce 1964 (Bailey et al. 1964). Pro toto onemocnění je charakteristické postižení vyvíjejícího se plodu. V normálním případě se larva po čtyřech dnech od zavíčkování naposledy svléká a následně kuklí. Larva napadená SBV však svoji poslední larvální pokožku nesvlékne, pouze ji oddělí od těla a poté se pod ní začíná hromadit exuviální tekutina obsahující rozpadající se tukové buňky. Larva pak vypadá jaké váček naplněný tekutinou. Její barva se mění z perleťově bílé na světle žlutou a larva postupně seschne v tmavě hnědý útvar se zvednutou hlavou a zadečkem (Obr. 9) (Bailey 1975 in Grabensteiner et al. 2001). Ačkoliv toto onemocnění postihuje pouze larvální stadium, může virus napadat i dospělé včely, avšak nezpůsobuje u nich žádné klinické příznaky (Bailey 1969). Nejčastěji je tento virus přenášen z larvy na dospělou včelí dělnici nebo z dělnice na larvu. K prvnímu případu přenosu dochází u nejmladších včel, které zastávají funkci čističek úlu (viz 4.1.1). K dalšímu přenosu pak dochází, když včela začne zastávat funkci tzv. krmičky, která krmí larvy výměšky svých podhltanových žláz (Shen et al. 2005a). Larvy jsou nejcitlivější k virové nákaze během prvních 4–8 dní života (Bailey 1969). 30

Pravděpodobně je přenos možný také prostřednictvím V. destructor. Jeho schopnost SBV přenášet byla potvrzena jak experimentálním přenosem viru na včelí larvu (Bailey 1968 in Aubert et al. 2008), tak i detekcí virových částic ve slinách roztoče (Shen et al. 2005b). Doposud však není znám jeho význam při přenosu viru na dospělé jedince v přirozených podmínkách. Většina dostupných záznamů totiž vypovídá pouze o úhynu včelího plodu na SBV (Ball 1999b in Aubert et al. 2008). Další možností přenosu viru je možný rovněž vertikálně z včelí matky na potomstvo. To dokládá analýza přirozeně infikovaných včelích matek, jejich vajíček, larev a dospělých potomků. Bylo zjištěno, že SBV obsahovalo 6 matek z 10 a 100 % jimi nakladených vajíček. Nicméně pouze 25 % larev a 10 % dospělých potomků bylo SBV pozitivní (Chen et al. 2006b).

Obr. 9: Larva s typickými příznaky napadení virem SBV. Dostupné z [URL6], upraveno.

6.2.3

Slow bee paralysis virus

SBPV byl objeven náhodně v Anglii roku 1974 při výzkumu Bee virus X (Bailey a Woods 1974). Jméno získal tento virus díky pomalejšímu průběhu infekce, než je typické pro ABPV a CBPV (Aubert et al. 2008). Po injekčním podání preparátu obsahujícího částice SBPV zdravým dospělým včelám dochází během 10–12 dní k jejich úhynu, kterému předchází paralýza prvních dvou párů končetin (Bailey a Woods 1974). Nicméně v přírodě tento virus většinou přetrvává jako skrytá infekce a k rozvoji otevřené infekce dochází jen zřídka, zejména při silném napadení včelstva V. destructor (De Miranda et al. 2010b). 31

Hlavním způsobem přenosu virových částic mezi dospělými jedinci navzájem a mezi dospělými jedinci a larvami je orální přenos prostřednictvím infikované potravy. Stejně jako u řady dalších včelích virů je však také možný nepřímý přenos prostřednictvím V. destructor (Bailey a Ball 1991 in De Miranda et al. 2010b).

6.2.4

Varroa destructor virus – 1

VDV–1 je geneticky blízce příbuzným druhem viru DWV, se kterým sdílí 84 % identických nukleotidů a 95 % aminokyselin. Oba viry mohou společně v organismu včel i V. destructor koexistovat (Ongus 2004). Mezi těmito viry může navíc docházet k vzájemné rekombinaci. Zioni et al. (2011) uvádí, že k replikaci viru dochází výhradně v hlavě nově vylíhnutých včel s deformovanými křídly a zároveň zde byla zaznamenána i přítomnost DWV-VDV–1 rekombinantů. Nově vzniklé rekombinantní DWV-VDV–1 částice mohou vykazovat vyšší virulenci než samotné DWV a VDV–1, čímž mohou významně přispívat ke vzniku otevřené infekce ve včelstvech napadených V. destructor. Modifikace genetické informace těchto virů může navíc stát za vyšší účinností přenosu viru prostřednictvím V. destructor (Ongus et al. 2006).

6.2.5

Kakugo virus

Dalším blízce příbuzným druhem viru DWV je nedávno objevený KV. Tyto viry sdílejí 96 % identických nukleotidů a 98 % identických aminokyselin. KV byl izolován z mozku útočných včelích dělnic – strážkyň, které při laboratorním experimentu aktivně napadaly pokusného sršně. Jelikož přítomnost KV nebyla prokázána u jedinců, kteří toto agresivní chování neprojevovali, existuje možná souvislost mezi přítomností KV ve včelím mozku a agresivitou, kterou tito jedinci projevují. Jak je již známo z dřívějších studií, může přítomnost některých patogenů ovlivňovat funkci nervové soustavy a může tak stát za změnami chování postižených jedinců. Přesná povaha souvislosti mezi KV a agresivním chováním včel však zatím není známa stejně jako jeho případné negativní důsledky na zdraví napadeného jedince (Fuiyuki et al. 2004, 2009).

6.3 DNA viry 6.3.1

Apis iridescent virus

Tento virus byl poprvé izolován v 70. letech 20. století z Apis cerana pocházejících ze severní části Indie, Kašmíru. Postižené včely vykazovaly známky onemocnění, jejich 32

aktivita byla značně snížená a brzy došlo k jejich úhynu. Včelstva, ze kterých tito jedinci pocházeli, vyhynula během dvou měsíců (Mahindre, osobní komunikace in Bailey et al. 1976). Všechny vzorky postižených včel obsahovaly velké množství virových částic, průměrně 1010 –1011. Po injekční aplikaci roztoku virových částic dospělým jedincům A. mellifera dochází k tvorbě duhových krystalických agregátů uvnitř cytoplasmy některých tkání, zejména tělní stěny a podhltanových žláz. Barva infikovaných tkání se současně mění na světle modrou. Pokud je navíc virus podáván orálně, dochází ke zmodrání tkání také u střevní stěny a proximálních konců Malphigiových trubic. Pokud jsou virové částice injekčně podány včelím larvám, dochází u nich k mírnému zpomalení vývoje, avšak nakonec se larva vyvine ve zdánlivě zdravého jedince. V přirozených podmínkách nebyl výskyt u A. mellifera zaznamenán (Bailey et al. 1976).

6.3.2

Filamentous virus

FV je druhým DNA virem napadajícím včelu medonosnou (Bailey et al. 1981). Příznaky onemocnění jako shlukování nakažených včel na zemi před vstupem do úlu poprvé popsal Wille a považoval je za projev napadení včelí rickettsiózou. Rovněž popsal „mléčně zbarvenou hemolymfu včel plnou malých částic, viditelných pouze pod mikroskopem s fázovým kontrastem při zvětšení nejméně 1000×” a nazval toto onemocnění Anomálie R. (Wille a Printer 1961 in Aubert et al. 2008). Nicméně pozdější výzkum, který provedl Clark (1978), prokázal, že původcem onemocnění není Rickettsia, ale FV. Experimentální injekční a orální podání částic FV mladým včelám mělo za následek jejich úhyn během pěti dní. Bailey et al. (1983) navíc uvádí, že po injekčním podání částic dospělým včelám u nich sice dochází k replikaci viru, avšak včely zůstávají dále bez jakýchkoli příznaků onemocnění. Toto onemocnění dle něj pravděpodobně souvisí s parazitem Nosema apis.

6.4 Ostatní nezařazené viry 6.4.1

Chronic bee paralysis virus

První záznamy o viru chronické paralýzy pochází z doby před více než 2000 lety, kdy Aristoteles popsal černé lysé včely, které nazýval „zloději“ (Bailey et al. 1963). Že jde 33

o onemocnění virového původu zjistil C. E. Burnside v roce 1945 při svém laboratorním experimentu se zdravými včelami, kterým podával extrakty ze včel napadených paralýzou a podařilo se mu u nich vyvolat příznaky onemocnění (Burnside 1945 in Aubert et al. 2008). Trvalo ale dalších 18 let, než byl tento virus poprvé izolován a popsán a stal se tak spolu s ABPV prvním popsaným virem, který napadá včelu medonosnou (Ribière et al. 2010). CBPV je jediným virovým onemocněním dospělých včel, které má pozorovatelné jak morfologické, tak etologické příznaky. Tyto příznaky se v literatuře tradičně dělí do dvou skupin. První skupinu příznaků tvoří roztřesený pohyb křídel a celého těla, doprovázený neschopností létat. Napadené včely lezou po česně úlu, po zemi před úlem nebo vylézají po stéblech trávy k vrcholu. Díky zduřenému mednímu váčku mají zvětšený zadeček a rozložená křídla. Nemocní jedinci hynou během několika dní, vážné případy napadení včelstev mohou skončit až jejich úhynem. Druhou skupinou příznaků je ztráta ochlupení, takže se postižené včely jeví jako černé, lesklé a celkově drobnější, než zdraví jedinci (Obr. 10). Ostatní včely na ně často útočí. Díky černému zbarvení nejsou tito jedinci strážkyněmi u vchodu rozeznáni a vpuštěni do úlu, což je důvodem, proč se velké množství infikovaných včel zdržuje venku před úlem (Berenyi et al. 2006). Během několika dní nastupuje u nemocných jedinců třes, ztrácejí schopnost letu a hynou (Ball and Bailey 1997).

Obr. 10: Včela napadená CBPV se ztrátou ochlupení zadečku. Dostupné z [URL7], upraveno.

Během výzkumu bylo zjištěno, že ať včely trpí příznaky první nebo druhé skupiny, obsahují vždy srovnatelné množství virových částic, které jsou sérologicky nerozlišitelné (Rinderer a Green 1976). Rozdíl v příznacích je tedy pravděpodobně 34

způsoben sekundárními vlivy (Bailey 1965). V jedné kolonii se mohou vyskytovat včely s příznaky obou skupin (Ball a Bailey 1997). K přenosu CBPV dochází zejména horizontálním směrem, a to jak přenosem prostřednictvím potravy (Bailey 1965), tak i fyzickým kontaktem těl infikovaných a zdravých jedinců (viz 4.1.1) (Bailey et al. 1983). Ribière et al. (2007) navíc zmiňuje i možnost přenosu prostřednictvím výkalů infikovaných jedinců. Laboratorními experimenty bylo dokázáno, že nejúčinnější je injekční podání, při kterém k vyvolání infekce stačí cca 100 částic viru (Bailey et al. 1963; Bailey 1965). Ačkoli tento výsledek napovídá, že při šíření viru může mít velký vliv V. destructor, ve skutečnosti nikdy nebyla zaznamenána souvislost mezi onemocněním CBPV a tímto parazitem (Ball a Allen 1988 in Aubert et al. 2008). Donedávna nebyl tento virus zaznamenán ani u vzorků analyzovaných roztočů (Tentcheva et al. 2004). Nález tohoto viru u V. destructor poprvé dokládá Celle et al. (2008) u vzorku roztočů pocházejících ze včelstva napadeného CBPV. Počet kopií viru v těle roztoče však byl relativně nízký, řádově 104 kopií na jedince (pro srovnání: dospělá dělnice s příznaky paralýzy obsahuje cca 1,9 × 1013 kopií, dělnice a trubci bez příznaků maximálně 3,4 × 106 kopií viru). Jako méně účinné se ukázalo podání na kutikulu zbavenou chloupků, kdy k vyvolání otevřené infekce bylo potřeba aplikovat minimálně 107 částic viru (Ribière et al. 2004 in Aubert et al. 2008). Nejméně účinné bylo podání prostřednictvím potravy (Bailey 1965), jelikož minimální dávka viru dostačující k vyvolání otevřené infekce musela obsahovat alespoň 1010 částic (Bailey et al. 1983). I když je nepravděpodobné, že by v přirozených podmínkách mohlo dojít k pozření takto vysoké dávky viru, může tento druh šíření významně přispívat k šíření viru mezi jedinci (Bailey 1965). Kromě horizontálního šíření je možné i šíření vertikální, a to z matky na potomstvo. Analýzou pomocí metod molekulární biologie bylo zjištěno, že částice CBPV byly nalezeny jak u matek (67 %), tak u vajíček (50 %), larev (17 %) a dospělých potomků (17 %) pocházejících od těchto matek. Nicméně v případě matek nebyly částice CBPV nalezeny v jejich vaječnících, ale pouze v těle a hemolymfě. Vysvětlením však může být nízká koncentrace virových částic ve vaječnících, kterou nebylo možné zachytit (Chen et al. 2006b).

35

6.4.2

Chronic bee paralysis virus associate

Během výzkumu CBPV bylo v použitých vzorcích nalezeno velké množství izometrických částic o velikosti 17 nm. Tyto částice se ukázaly být nejen morfologicky, ale rovněž sérologicky odlišné od částic CBPV (Bailey et al. 1980a). Bailey et al. (1980a) uvádí, že „částice CBPVA nebyly zjištěny v kuklách včelích dělnic po tom, co byly usmrceny injekcí surového preparátu CBPV obsahující také částice CBPVA, ačkoli u nich došlo k výraznému namnožení CBPV. Nicméně mateční kukly i dospělé matky a rovněž některé kukly trubců produkovaly množství CBPVA úměrné množství vyprodukovaného CBPV.“ Pokud byly částice CBPVA podány včelám (kuklám nebo dospělcům) v čisté formě, k jejich rozmnožování nedocházelo. Jejich rozmnožování se tak ukázalo být závislé na přítomnosti CBPV, jelikož CBPV zřejmě funguje jako poskytovatel proteinů potřebné k replikaci CBPVA. Přítomnost CBPVA snižuje množství replikovaných částic CBPV, jejich délku a sedimentační koeficient (Ball et al. 1985). Jelikož délka částic CBPV zřejmě souvisí s jejich infektivitou a platí, že nejdelší částice jsou nejvíce infekční, může CBPVA souviset s obranným mechanismem včel, a zejména pak včelích matek (Bailey 1976).

6.4.3

Bee virus X

BVX byl objeven v roce 1974 při výzkumu a laboratorních experimentech s Arkansaským včelím virem (ABV). O jeho historii však je známo pouze to, že byl izolován z dospělých včel pocházejících z Arkansasu (USA). Od ostatních virů jej odlišovaly jeho 35 nm velké částice (Bailey a Woods 1974). Stejně jako u mnoha včelích virů je i pro BVX typický skrytý průběh onemocnění nedoprovázený klinickými příznaky. Jediným projevem onemocnění se ukázala být výrazně zkrácená délka života včel chovaných v laboratorních podmínkách, nikoli však včel chovaných přirozeně. Při čtyři roky trvajícím výzkumu asi 200 včelstev uhynulých během pozdní zimy až časného jara nebyla zaznamenána statisticky významná souvislost mezi úhyny těchto včelstev a BVX (Bailey et al. 1983). Během zmíněného výzkumu byla zjištěna jistá souvislost mezi nákazou BVX a parazitem Malphigamoeba mellificae. Ačkoli jedinci krmení potravou obsahující současně BVX a tohoto parazita žili podstatně kratší dobu, než jedinci konzumující potravu obsahující pouze jednoho z těchto patogenů, nebyla mezi nimi zaznamenána 36

přímá závislost a oba se tak mohou u včel vyskytovat i samostatně (Bailey a Woods 1974). Za jejich společným výskytem zřejmě stojí stejný způsob přenosu, kdy k nakažení dochází při pozření kontaminovaných výkalů včel při čištění úlu (Ball a Bailey 1997). Přenos orální cestou byl potvrzen také laboratorním experimentem, kdy bylo mladým včelám podáváno v potravě 106–109 částic viru. Pokud byly tyto včely drženy při 30 ˚C, zvýšil se u nich obsah virových částic během tří týdnů na 1010 a během pěti týdnů na 1011. U obdobně infikovaných včel držených při 35 ˚C byl počet zaznamenaných virových částic zanedbatelný (Bailey a Woods 1974).

6.4.4

Bee virus Y

Tento virus byl poprvé izolován ve Velké Británii z mrtvých včel pocházejících z jinak zdravých včelstev. Stejně jako u vzdáleně příbuzného BVX, nebyly ani u BVY zaznamenány žádné související klinické příznaky (Bailey et al. 1980b). Virus úzce souvisí s parazitem N. apis, ale na rozdíl od BQCV není BVY na N. apis přímo závislý a jeho výskyt u včel je tak možný i bez přítomnosti parazita. Přesná povaha spojitosti mezi nákazou N. apis a BVY není zatím známa, ale je pravděpodobné, že napadení včely nosemózou snižuje její odolnost k infekci a narušené buňky zažívacího traktu se stávají vstupní bránou pro virové částice. Stejně jako u BVX je přenos BVY možný pouze orální cestou a k množení viru dochází pouze tehdy, jsou-li včely chovány při 30 ˚C (Bailey et al. 1983).

6.4.5

Egypt bee virus

EBV byl poprvé izolován roku 1977 u jedinců včely medonosné pocházejících z Egypta. Sérologicky je EBV blízce příbuzný viru DWV, avšak na rozdíl od něj nezpůsobuje u včel žádné klinické příznaky (Bailey et al. 1979).

6.4.6

Arkansas bee virus a Berkeley bee picornavirus

Tyto dva viry byly objeveny v USA a je o nich známo jen velmi málo informací (Bailey a Woods 1974). Výsledky několika izolací ze včel prokázaly, že se ABV a BBPV většinou vyskytují společně. Nebyla však mezi nimi zaznamenána replikační závislost, sérologický vztah ani genetická příbuznost. U napadených jedinců nebyly zaznamenány žádné pozorovatelné klinické příznaky (Lommel et al. 1985).

37

6.4.7

Lake Sinai virus – 1 a Lake Sinai virus – 2

Tyto dva blízce příbuzné druhy byly identifikovány při velké metagenomické studii probíhající v letech 2009 a 2010 v USA. Ačkoli patří mezi vůbec nejpočetnější částice včelího mikrobiomu, díky skutečnosti, že se značně liší od ostatních virů napadajících hmyz, zůstávaly dlouhou dobu bez povšimnutí. Svými geny kódujícími nestrukturní proteiny se nejvíce podobají viru CBPV a dalším členům řádu Nodavirales. Strukturní proteiny a organizace genomu se však nejvíce podobají tetravirům (Runckel et al. 2011).

38

7 GEOGRAFICKÁ DISTRIBUCE VČELÍCH VIRŮ Viry napadající včelu medonosnou jsou celosvětově rozšířené a byly identifikovány na všech kontinentech (s výjimkou Antarktidy). Jejich zastoupení na jednotlivých územích se však vlivem mnoha faktorů výrazně liší a současně se mění v čase. Míra napadení souvisí s geografickou polohou a klimatickými podmínkami daného území, jež ovlivňují především počet zde chovaných včelstev. Obecně lze říci, že čím více včelstev žije na určitém území, tím pravděpodobnější je přenos virů mezi nimi. K šíření virů významně přispívá také pohyb včelstev a s nimi i jejich parazitů. Globalizace obchodu jim umožňuje překračovat nejen hranice států, ale také přirozené hranice, jakými jsou například pohoří nebo oceány. Patogeny jsou tak šířeny do nových i značně vzdálených oblastí, kde mohou infikovat nové hostitele (Ryba et al. 2012). Bohužel v současné době zatím existuje jen velmi málo studií zabývajících se rozšířením a zastoupením virových onemocnění ve světě, a proto je tato kapitola zaměřena pouze na výskyt šesti nejvýznamnějších virů ABPV, BQCV, CBPV, DWV, KBV a SBV. Acute bee paralysis virus ABPV je častým virem na všech kontinentech. Jeho výskyt byl zaznamenán ještě před rozšířením V. destructor, avšak tehdy způsoboval pouze skrytě probíhající infekce. Teprve po rozšíření roztoče byly v napadených oblastech poprvé zaznamenány případy otevřených infekcí akutní paralýzy způsobující slábnutí nebo úhyn celých včelstev (Bailey a Gibbs 1964; Bailey et al. 1981; Allen a Ball 1996). První potíže spojené s výskytem V. destructor byly zaznamenány v 70. letech na území Ruska a Německa, kde byly během letních měsíců pozorovány larvy včel vykazující známky onemocnění. Výsledky laboratorních vyšetření prokázaly vysokou koncentraci ABPV (Allen a Ball 1996). Podobné výsledky byly následně zaznamenány také v Nizozemí, Itálii (Ball a Allen 1988 in Genersch a Aubert 2010), zemích bývalé Jugoslávie (Kulincevic 1990 in Genersch a Aubert 2010), Francii (Faucon 1992 in Genersch a Aubert 2010), Maďarsku (Békési et al. 1999), Rakousku (Berenyi et al. 2006), Dánsku (Nordström 1999) a USA (Hung 1996). Tentcheva et al. (2004) uvádí, že byl ABPV na území Francie zaznamenán v případě dospělých včel v 58 % a v případě larev v 23 % z 36 sledovaných včelínů. V těchto 39

včelínech však byly pokaždé napadeny jen některá včelstva, a sice 25 % u dospělých včel a pouhá 3 % u larev. Nejvyšší výskyt byl zaznamenán během pozdního léta a podzimu, což odpovídá populačnímu vrcholu V. destructor. Obdobná studie byla provedena také v Rakousku, kde byly vzorky mrtvých včel odebrány ze včelstev vykazujících známky onemocnění (snížení populace, neobvykle tmavé zbarvení včel, paralýza, napadení varroou). ABPV byl prokázán u 68 % vzorků. Zcela odlišný výsledek byl získán v Dánsku, kde studii provedli Nielsen et al. (2008). Přítomnost ABPV byla prokázána u pouhých 11 % vzorků. Autor uvádí možnou souvislost takto nízkého procenta případů s léčbou varroázy, ke které jsou v Dánsku užívány organické kyseliny. Tyto látky mají proti V. destructor nižší účinnost než běžně používané komerční přípravky, což ve spojitosti s vyšší mírou napadení včelstev tímto parazitem mohlo mít za následek vyhynutí slabších, méně odolných včel, které byly viry napadeny nejvíce. V Německu je používán stejný způsob léčby varroázy jako v Dánsku, avšak zde zjištěná míra napadení včelstev ABPV byla výrazně vyšší. Při studii probíhající v letech 2004 a 2005 a bylo vyšetřeno 110 včelstev v 11 včelínech. V roce 2004 byl ABPV zaznamenán u 73 % včelstev, o rok později dokonce u 80 % včelstev (Siede et al. 2008). Nízký výskyt ABPV u vzorků včel byl zaznamenán také v České republice, a to 17 % (Ryba et al. 2012). Na jihozápadě Velké Británie byl virus prokázán u 29 % včelstev (Baker et al. 2008). V Maďarsku byl virus zaznamenán v 37 % včelínů (Forgách et al. 2008). ABPV však není rozšířen pouze na evropském kontinentu. Teixeira et al. (2008) uvádí, že byl tento virus zaznamenán rovněž v Brazílii, a to v 27 % analyzovaných vzorků, a vyskytoval se zde dokonce častěji než DWV. Výrazně vyšší výskyt byl zaznamenán v Číně, kde byl tento virus prokázán u 68 % zkoumaných vzorků (Ai et al. 2012).

Black queen cell virus Tento virus je kompletně závislý na včelím parazitovi Nosema apis a bez jeho přítomnosti k propuknutí onemocnění nedochází. To potvrzuje i studie z Velké Británie provedená v letech 1977–1979. Při ní byly sérologicky vyšetřeny vzorky mrtvých včel

40

pocházející z 25 včelstev, z nichž 90 % vykazovalo velké množství částic BQCV a všechny tyto vzorky byly současně infikovány N. apis (Bailey et al. 1981). Vysoký výskyt BQCV byl zaznamenán také ve Francii, a to zejména u dospělých včel. Tentcheva et al. (2004) uvádí, že BQCV byl zaznamenán u dospělých včel v 86 % sledovaných včelínech a u 76 % z nich pocházejících včelstev. Výskyt u larev však byl výrazně nižší. Jedinci pozitivní na BQCV byli nalezeni v 23 % včelínech u pouhých 2 % včelstev. Většina pozitivních případů byla zaznamenána během letních měsíců (58 %), avšak u některých včelstev byla infekce přítomna po celý rok (16 %). Výrazně nižší výskyt BQCV byl zaznamenán v ostatních evropských zemích. V České republice byla přítomnost viru prokázána v 11 % vyšetřovaných vzorků (Ryba et al. 2012), v Rakousku u 30 % vzorků (Berenyi et al. 2006) a ve Velké Británii v 11 % včelstev (Baker et al. 2008). V Dánsku byl virus zaznamenán pouze v jednom sledovaném včelíně (1 %) (Nielsen et al. 2008). V Maďarsku bylo zasaženo 54 % včelínů (Forgách et al. 2008). Mimo evropský kontinent byl zaznamenaný výskyt tohoto viru relativně vysoký. Teixeira et al. (2008) uvádí, že v Brazílii byl BQCV zaznamenán u 37 % analyzovaných vzorků včel. Ai et al. (2012) ve své čínské studii uvádí, že zde byl tento virus zaznamenán v 44 % včelínů. Zajímavý je výsledek z africké Ugandy, kde byl tento virus zaznamenán v 35,6 % analyzovaných vzorků včel (87,5 % dospělých a 12,5 % larev), avšak nebyl zaznamenán u žádné včelí kukly, a to ani v případě, že pocházela z jinak pozitivního včelstva. BQCV byl také jediným ze sedmi hledaných virů, který byl v Ugandě zaznamenán (Kajobe et al. 2010). V Austrálii je tento virus považován za nejčastější příčinu úhynu larev včelích matek. Sérologickými testy byla virová nákaza potvrzena u 19 % vzorků vykazujících příznaky nákazy. Infekčnostními testy byl virus rovněž potvrzen u všech vzorků larev matek, které neměly žádné příznaky onemocnění (Anderson 1993 in Aubert et al. 2008).

Chronic bee paralysis virus Předpokládá se, že je tento virus široce rozšířený po celém světě, avšak není příliš běžný a vyskytuje se v nízkých koncentracích pouze u malého procenta jedinců v mnoha

41

včelstvech. Je proto důležité a také obtížné získat pro výzkum vhodné vzorky (Ball 1999a in Aubert et al. 2008). Donedávna byla jedinou oblastí s dosud nepotvrzeným výskytem CBPV Jižní Amerika, avšak Antúnez et al. (2005) prokázal, že alespoň co se týká jihoamerické Uruguaye, je zde CBPV široce rozšířený. Nicméně ve své studii neuvádí, v jakých koncentracích byl virus detekován, a tak není možné určit, jestli právě tento virus stojí za zdejšími častými úhyny včelstev. Výskyt viru byl zaznamenán pouze u dospělých jedinců a to během celého roku, z čehož plyne jeho nezávislost na ročním období. Nejvíce případů úhynů včel však bylo zaznamenáno na jaře a v létě (Tentcheva et al. 2004). Ve Francii byl tento virus zaznamenán v 28 % včelínů. Celkově však byla během letních měsíců napadena pouhá 4 % z 360 sledovaných včelstev (Tentcheva et al. 2004). Z ostatních evropských zemí byl virus zaznamenán pouze v České republice u 3 % (Ryba et al. 2012) a v Rakousku u 10 % analyzovaných vzorků (Berenyi et al. 2006).

Sacbrood virus Grabensteiner et al. (2001) ve své studii uvádí, že byly identifikovány nejméně tři rozdílné genetické linie SBV, a to linie evropská, jihoafrická, a linie dálného východu. SBV je považován za časté onemocnění zejména ve východní Asii, kde však nejvíce potíží způsobuje ve včelstvech A. cerana. Jak dokazují Ai et al. (2012) v čínské studii, přítomnost SBV byla zjištěna v 86 % včelínů A.cerana, zatímco včelínů A. mellifera bylo napadeno jen 21 %. Včela medonosná se tak zdá být rezistentnější vůči zdejšímu typu SBV. V Evropě měl SBV vůbec nejvyšší zjištěné zastoupení na území Dánska, a to v 87 % včelínů (Nielsen et al. 2008). Stejně vysoký výskyt byl zaznamenán také ve Francii. Tentcheva et al. (2004) uvádí, že zde byl tento virus zjištěn u dospělých včel v 86 % včelínů (73 % včelstev), u larev pak u 80 % včelínů (28 % včelstev). Nejvyšší výskyt byl zaznamenán během jara a léta (jaro 44 %, léto 64 %, podzim 26 % pozitivních včelstev), kdy dochází k nárůstu množství včelího plodu. V Rakousku byl SBV prokázán u 49 % analyzovaných vzorků (Berenyi et al. 2006), zatímco v České republice byl tento virus prokázán u pouhých 5 % vzorků (Ryba et al. 2012). Vůbec nejméně napadených včelstev, a to 1 %, bylo zjištěno ve Velké Británii 42

(Baker et al. 2008). Bailey (1967) však uvádí, že ve Velké Británii je přes 80 % larev s příznaky onemocnění, které nemá bakteriálního původce, nakaženo SBV. Několik larev uhynulých na SBV se rovněž nachází v 30 % zdravých včelstev. Výsledky studií tedy velmi závisí na výběru vzorků. V Austrálii je SBV považován za nejběžnější virové onemocnění včel, které má na svědomí velké ztráty včelího plodu. Bylo zde zjištěno coby inaparentní infekce u 40 % zdravého dělničího plodu a jako otevřená infekce u více než 90 % včelstev (Anderson a Gibbs 1988).

Deformed wing virus DWV je považován za vůbec nejrozšířenější včelí virus, který byl zaznamenán v mnoha zemích coby hlavní původce deformací včel a úhynů včelstev napadených V. destructor. Záznamy o jeho výskytu pocházejí z celé Evropy, Afriky, Asie a Střední a Severní Ameriky (Allen a Ball 1996). Ve Francii byl DWV zaznamenán u dospělých včel v 97 % včelínů a 94 % z nich pocházejících včelstev. U larev byl výskyt mírně nižší, pozitivní výskyt byl zaznamenán v 94 % včelínů a celkem v 66 % včelstev. Četnost napadených jedinců postupně narůstala od jara do podzimu (jaro 56 %, léto 66 %, podzim 85 % včelínů pozitivních na infikované dospělce, 16 %, 38 % a 54 % včelínů pozitivních na infikované larvy) (Tentcheva et al. 2004). Obdobně častý výskyt je zřejmý i v dalších evropských státech. V Rakousku byl tento virus zjištěn v 91 % vyšetřovaných vzorků včel vykazujících příznaky onemocnění (Berenyi et al. 2006). Ve Velké Británii byla přítomnost DWV potvrzena u celkem 97 % včelstev (Baker et al 2008). V případě Dánska bylo však zaznamenáno jen 57 % včelínů napadených DWV (Nielsen et al. 2008). Tento nízký výsledek může souviset s již zmíněnou léčbou včelstev organickými kyselinami. V České republice byla přítomnost viru prokázána u 31 % vyšetřených vzorků (Ryba et al. 2012). Výskyt DWV byl potvrzen také v brazilské a čínské studii. V Brazílii byl DWV prokázán pouze v 20 % vyšetřovaných vzorků, a byl tak až třetím nejčastěji se vyskytujícím včelím virem, po BQCV a ABPV (Teixeira et al. 2008). Naproti tomu v Číně se četnost napadení DWV rovnala výsledkům z většiny evropských zemí. DWV zde byl zaznamenán v 94 % včelínů (Ai et al. 2012). 43

Kashmir bee virus O původu a geografické distribuci KBV zatím není příliš známo. Tento virus byl zaznamenán u celkem 3 hostitelů – včely medonosné (Apis mellifera), včely východní (Apis cerana) a také u vosy útočné (Vespula germanica), jejíž původní domovinou je Evropa, Severní Afrika a Asie, avšak dnes již zdomácněla i v Austrálii a na Novém Zélandu, kde je KBV nejvíce rozšířený (Bailey et al. 1979; Crosland 1991; Bailey a Woods 1977). Včela medonosná není v Austrálii původním druhem. Všechny zde žijící včely jsou potomky včel dovezených z Evropy a Severní Ameriky. Jak ale dokazují výsledky studií, v Evropě se KBV téměř nevyskytuje (Bailey et al. 1979). Existují tedy dvě možnosti, jak se KBV do Austrálie dostal a proč je právě zde tak rozšířený. Jednou z těchto možností je, že původním hostitelem KBV je některý z původních australských a jihoasijských druhů hmyzu a postupně došlo k adaptaci viru na včelu medonosnou. Tuto možnost naznačuje i vysoká variabilita proteinových profilů izolátů KBV, která je pro včelí viry netypická (Allen a Ball 1995). Druhou možností je, že se KBV ve včele medonosné přirozeně vyskytuje, ale k jeho multiplikaci dochází v Austrálii více než kdekoli jinde díky specifickým faktorům prostředí (Bailey et al. 1979) Kromě Austrálie a Nového Zélandu byl tento virus zaznamenán u včely medonosné také v Kanadě, Španělsku (Allen a Ball 1995), u včelstev afrikanizovaných včel na Costa Rice a v USA, kde se ukázal být velmi rozšířeným coby inaparentní infekce (Calderon et al. 2003). V Evropě je výskyt KBV spíše vzácný. Byl nalezen ve Francii u 17 % včelstev (Tentcheva et al. 2004), u jednoho včelstva v Dánsku (Siede et al. 2005), u 23 ze 127 včelstev v Německu a u dvou včelstev ze tří v Lucembursku (Nielsen et al. 2008). Žádný případ nebyl zaznamenán v Rakousku (Berenyi et al. 2006), Maďarsku, Polsku, Slovinsku (Siede et al. 2005), Velké Británii (Baker et al. 2008) ani České republice (Ryba et al. 2012).

44

8 DIAGNOSTIKA VIROVÝCH ONEMOCNĚNÍ Pro včasné rozpoznání onemocnění je zapotřebí rychlá a přesná identifikace jeho původce. Mnoho včelařů však stále spoléhá pouze na identifikaci na základě pozorování klinických příznaků. Tato metoda je sice levná a rychlá, avšak v případě virových onemocnění nemusí být vždy dostačující. Virová onemocnění totiž velmi často probíhají asymptomaticky, případně může být jedinou známkou onemocnění zvýšený úhyn včel, který je zejména v počáteční fázi onemocnění těžko postřehnutelný (Aubert et al. 2008). Některá onemocnění navíc mohou být zaměnitelná díky stejným či podobným příznakům (paralýza) a jejich rozpoznání bez použití dalších metod je takřka nemožné. Potíže při identifikaci původce onemocnění může způsobovat rovněž infekce několika viry současně, kdy dochází k vzájemnému překrývání nebo kombinaci příznaků (Chen et al. 2004b). V dnešní době je k dispozici množství metod sloužících k diagnostice virových onemocnění, např. kultivace viru uvnitř hostitele a jeho následná izolace, sérologické metody sloužící k detekci antigenů a protilátek, či řada metod molekulární biologie sloužících k detekci virových nukleových kyselin. Donedávna

bylo

mikroskopie

a

k diagnostice sérologických

onemocnění metod,

nejčastěji

jakými

jsou

využíváno například

elektronové imunodifuzní

a radioimunodifuzní testy či vůbec nejpoužívanější metoda ELISA (Bowen-Walker et al. 1999). Vzhledem k výraznému vývoji diagnostických metod jsou však již dnes upřednostňovány rychlejší a spolehlivější metody molekulárně-biologické, zatímco metody kultivace a izolace virů a sérologie jsou využívány již jen zřídka (Storch 2000). Molekulárně-biologické metody jsou využívány nejen pro kvalitativní průkaz virové nukleové kyseliny (DNA nebo RNA), ale i pro stanovení jejího množství, určení sekvence bází, identifikaci genotypu patogenu či k průkazu mutací. Existuje celé spektrum metod zahrnující neamplifikační metody (např. hybridizace) a běžněji používané metody amplifikační, jejichž cílem je zmnožení nukleové kyseliny. Výhodou těchto metod je vedle jejich rychlosti a spolehlivosti také citlivost, která umožňuje zaznamenat i velmi nízké koncentrace virů, které jsou typické pro skrytě probíhající infekce. PCR je bezpochyby nejběžnější a nejuniverzálnější amplifikační metodou využívanou pro detekci nukleových kyselin. Jde o cyklicky probíhající enzymovou syntézu 45

vybraných úseků DNA s využitím enzymu DNA-polymerázy. K syntéze dochází po připojení krátkých oligonukleotidů, tzv. primerů, nasedajících na 3´ konce protilehlých templátových vláken ssDNA, která vznikla denaturací dsDNA. Primery na ně nasedají v protisměrné orientaci, čímž vzniká ohraničení žádaného amplikonu (produktu PCR) a k syntéze nových řetězců pomocí DNA-polymerázy dochází ve směru 5´ 3´. Počet probíhajících cyklů se většinou pohybuje od 25 do 35 a výsledkem každého cyklu je namnožení komplementárních řetězců DNA, které slouží jako templát pro nový reakční cyklus. Pro detekci nukleových kyselin RNA virů (týká se tedy většiny včelích virů) je nejčastěji využívána RT-PCR, při které je virová RNA přepsána na cDNA pomocí enzymu reverzní transkriptázy (RT) a následně probíhá samotná PCR. Produkty amplifikace

jsou

následně

vyhodnocovány

pomocí

gelové

elektroforézy

v polyakrylamidovém gelu, která využívá rozdílné pohyblivosti molekul v elektrickém poli. Rozdílná pohyblivost je dána především velikostí molekul, přičemž velké molekuly se v důsledku vyššího tření v gelu pohybují pomaleji než molekuly malé. Alternativou RT-PCR pro amplifikaci RNA virů jsou metody NASBA a RT-LAMP, jejichž hlavní výhodou oproti RT-PCR je, že probíhají za konstantní teploty, a tedy není potřeba využívat drahé zařízení zajišťující střídání teplot během reakce (Read 2000; Boubourakas et al. 2009). Zmíněné metody jsou však vhodné pouze pro stanovení jednoho druhu viru v jedné reakci. Jelikož jsou však včely často napadeny několika viry současně, je pro jejich stanovení vhodné využít multiplex-RT-PCR, při níž je použito několik párů primerů. Metoda tak umožňuje stanovení několika přítomných virů v jedné reakci, což značně šetří čas i náklady na analýzu (Chen et al. 2004b). Zmnoženou nukleovou kyselinu lze také podrobit další analýze, např. sekvencování, při kterém je stanoveno pořadí nukleotidů (primární struktura) dané molekuly. Znalost primární struktury nukleové kyseliny nebo její části umožňuje studovat rozdíly mezi jednotlivými sekvencemi a porovnávat je se sekvencemi již známými. Tímto způsobem je možné identifikovat nejen již známé viry, ale také viry dosud nepopsané.

46

9 ZÁVĚR Včela medonosná má v přírodě významnou funkci opylovače a díky ní je tak možné rozmnožování řady volně rostoucích i kulturních druhů rostlin. Přítomnost včel je tak nezbytným předpokladem pro udržování stability ekosystémů a zemědělství. Výrazný pokles počtu včel nebo jejich úplné vymizení by tak značně omezilo rozmnožování většiny kvetoucích rostlin. Mimo jiné mají včely význam i jako producenti řady produktů využívaných v potravinářském, kosmetickém i farmaceutickém průmyslu. Napadení včelstev viry v součinnosti s dalšími faktory a následné snižování včelí populace tak představuje závažný ekologický, zemědělský a ekonomický problém. Viry u včel nejsou nebezpečné samy o sobě, ale potíže způsobují, pokud se ve včelstvech

vyskytují

současně

s

některými

bezobratlými

parazity,

z nichž

nejvýznamnější je V. destructor. Tento parazit působí u včely medonosné jako mechanický a biologický vektor, který má schopnost viry nejen mezi včelami přenášet, ale také u nich virové infekce aktivovat. Kontrola výskytu a snaha o snížení stavu tohoto roztoče ve včelstvu je tedy hlavním krokem při boji s virovými chorobami včel. Ke snížení výskytu V. destructor by mohlo napomoci šlechtění varroatolerantních včel, které mají geneticky zakódovaný silný čisticí pud a dokáží tak aktivně odstraňovat roztoče z úlu. V praxi byl již případ rezistence vůči patogenům zaznamenán u tzv. afrikanizovaných včel vyskytujících se v celé Jižní a Střední Americe (Rosenkranz 1999). Tyto včely vznikly křížením dvou poddruhů evropské včely medonosné Apis mellifera mellifera a Apis mellifera ligustica s africkým poddruhem Apis mellifera scutellata (Vandame et al. 2002). Porozumění mechanismu, díky kterému tito jedinci vykazují zvýšenou odolnost vůči patogenům, by tak mohlo vnést více světla do této problematiky a určit, jakým směrem se má šlechtění včel dále ubírat. Cílem této bakalářské práce bylo podat formou literární rešerše ucelený souhrn informací o virech napadajících včelu medonosnou. První kapitola je věnována taxonomickému zařazení těchto virů a jsou zde nastíněny také jejich základní morfologické a molekulárně-biologické charakteristiky. Většina virů včel náleží do čeledí Dicistroviridae a Iflaviridae řádu Picornavirales. Vědecká práce na klasifikaci virů však postupuje velmi pomalu a tak zůstávají některé druhy prozatím taxonomicky nezařazené. Další kapitola je zaměřena na způsoby přenosu virů, které probíhají jak horizontálním, tak vertikálním směrem. Část této kapitoly je 47

věnována také interakci virů s včelími parazity Varroa destructor a Nosema apis, jelikož právě tito paraziti mají na průběh virových onemocnění zásadní vliv. Nejrozsáhlejší část práce se zabývá jednotlivými virovými chorobami, jejich historií, klinickými příznaky a konkrétními způsoby přenosu. Tato část je následována kapitolou o rozšíření virových chorob včel u nás a ve světě. Obecně lze říci, že včelí viry jsou rozšířeny celosvětově, avšak jejich zastoupení se v jednotlivých částech světa liší. V závěrečné kapitole jsou ve zkratce popsány nejčastěji využívané diagnostické metody, ve kterých svojí rychlostí, přesností a citlivostí dominují metody molekulární biologie.

48

Seznam použité literatury Ai H., Yan X., Han R. (2012) Occurrence and prevalence of seven bee viruses in Apis mellifera and Apis cerana apiaries in China. Journal of Invertebrate Pathology, 109 (1): 160-164. Allen M., Ball B.V. (1995) Characterisation and serological relationship of strains of Kashmir bee virus. Annals of Applied Biology, 126 (3): 471-484. Allen M., Ball B.V. (1996) The incidence and the world distribution of honey bee viruses. Bee World 77 (3): 141-162. Anderson D.L., Gibbs A. (1988) Inapparent virus infections and their interactions in pupae of the honey bee (Apis mellifera Linnaeus) in Australia. Journal of General Virology, 69 (7): 1617-1625. Anderson D.L., Trueman J.W. (2000) Varroa jacobsoni (Acari: Varroidae) is more than one species. Experimental & Applied Acarology, 24 (3): 165-189. Antúnez K., Alessandro B., Corbella E., Zunino P. (2005) Detection of Chronic bee paralysis virus and Acute bee paralysis virus in Uruguayan honeybees. Journal of Invertebrate Pathology, 90 (1): 69-72. Aubert M., Ball B., Fries I., Moritz R., Milani N., Bernardinelli I. (eds.) (2008) Virology and the honey bee. Directorate-generale for research, European commission, 460 s. Bailey L. (1965) Paralysis of the honey bee, Apis mellifera Linnaeus. Journal of Invertebrate Pathology, 7 (2): 132-140. Bailey L. (1967) The incidence of virus diseases in the honey bee. Annals of Applied Biology, 60 (1): 43-48. Bailey L. (1969) The multiplication and spread of sacbrood virus of bees. Annals of Applied Biology, 63 (3): 483-491. Bailey L. (1976) Viruses attacking the honey bee, in: Lauffer M.A., Bang F.B., Maramorosch K., Smith K.M. (Eds.) Advances in virus research, Academic press, New York, 20: 286. Bailey L., Gibbs A.J. (1964) Acute infection of bees with paralysis virus, Journal of Insect. Pathology, 6 (4): 395-407. Bailey L., Woods R. (1974) Three previously undescribed viruses from the honey bee. Journal of General Virology, 25 (2): 175-186.

49

Bailey L., Woods R. (1977) Two more small RNA viruses from honey bees and further observations on Sacbrood and Acute bee paralysis viruses. Journal of General Virology, 37 (1): 61-108. Bailey L., Gibbs A., Woods R., Grilione P., Federici F., Miller M. (1963) Two viruses from adult honey bees (Apis mellifera Linnaeus). Virology, 21 (3): 599-605. Bailey L., Gibbs A., Woods R. (1964) Sacbrood virus of the larval honey bee (Apis mellifera linnaeus). Virology, 23 (3): 425-429. Bailey L., Ball B., Woods R. (1976) An Iridovirus from bees. Journal of General Virology, 31 (3): 459-461. Bailey L., Carpenter J., Woods R. (1979) Egypt bee virus and Australian isolates of Kashmir bee virus. Journal of General Virology, 43 (3): 641-647. Bailey L., Ball B., Carpenter J., Woods R. (1980a) Small virus-like particles in honey bees associated with Chronic paralysis virus and with a previously undescribed disease. Journal of General Virology, 46 (1): 149-155. Bailey L., Carpenter J., Govier D., Woods, R. (1980b) Bee virus Y. Journal of General Virology, 51 (2): 405-407. Bailey L., Ball B., Perry J. (1981) The prevalence of viruses of honey bees in Britain. Annals of Applied Biology, 97 (1): 109-118. Bailey L., Ball B., Perry J. (1983) Association of viruses with two protozoal pathogens of the honey bee. Annals of Applied Biology, 103 (1): 13-20. Baker A., Schroeder D. (2008) Occurrence and genetic analysis of picorna-like viruses infecting worker bees of Apis mellifera L. populations in Devon, South West England. Journal of Invertebrate Pathology, 98 (2): 239-242. Ball B. (1985) Acute paralysis virus isolates from honeybee colonies infested with Varroa jacobsoni, Journal of Apicultural Research, 24: 115-119. Ball B., Overton H., Buck K., Bailey L., Perry, J. (1985) Relationships between the multiplication of Chronic bee-paralysis virus and its associate particle. Journal of General Virology, 66 (7): 1423-1429. Ball B., Bailey L. (Eds.) (1997) Viruses, in: Morse, R.A. and Flottum, K. Honey bee pests, predators & diseases, A.I. Root Company, Medina, s. 11-32. Békési L., Ball B.V., Dobos-Kovacs M., Bakonyi T., Rusvai M. (1999) Occurrence of acute paralysis virus of the honey bee (Apis mellifera) in a Hungarian apiary infested with the parasitic mite Varroa jacobsoni. Acta veterinaria Hungarica, 47(3): 319-324.

50

Berenyi O., Bakonyi T., Derakhshifar I., Koglberger H., Nowotny N. (2006) Occurrence of six honeybee viruses in diseased Austrian apiaries. Applied and Environmental Microbiology, 72 (4): 2414-2420. Boubourakas I., Fukuta S., Kyriakopoulou P. (2009) Sensitive and rapid detection of peach latent mosaic viroid by the reverse transcription loop-mediated isothermal amplification. Journal of Virological Methods, 160 (1-2): 63-68. Bowen-Walker P., Martin S., Gunn A. (1999) The transmission of Deformed wing virus between honeybees (Apis melliferaL.) by the ectoparasitic mite Varroa jacobsoni Oud. Journal of Invertebrate Pathology, 73 (1): 101-106. Calderon R.A., Van Veen J., Arce H.G., Esquivel M.E. (2003) Presence of deformed wing virus and Kashmir bee virus in Africanized honey bee colonies in Costa Rica infested with Varroa destructor. Bee World 83 (3): 122-116. Carreck N., Ball B., Martin S. (2010) The epidemiology of cloudy wing virus infections in honey bee colonies in the UK. Journal of Apicultural Research, 49 (1): 66-71. Celle O., Blanchard P., Olivier V., Schurr F., Cougoule N., Faucon J., Ribière M. (2008) Detection of Chronic bee paralysis virus (CBPV) genome and its replicative RNA form in various hosts and possible ways of spread. Virus Research, 133 (2): 280284. Chen Y., Pettis J.S., Evans J.D., Kramer M., Feldlaufer M.F. (2004a) Transmission of Kashmir bee virus by the ectoparasite mite Varroa destructor. Apidologie 35 (4): 441448. Chen Y., Siede, R., Wright W. (2004b) Multiple virus infections in the honey bee and genome divergence of honey bee viruses. Journal of Invertebrate Pathology, 87 (2-3): 185-193. Chen Y., Pettis J., Collins A., Feldlaufer M. (2006a) Prevalence and transmission of honeybee viruses. Applied and Environmental Microbiology, 72 (1): 606-611. Chen Y., Evans J., Feldlaufer M. (2006b) Horizontal and vertical transmission of viruses in the honey bee, Apis mellifera. Journal of Invertebrate Pathology, 92 (3): 152-159. Clark T.B. (1978) A filamentous virus of the honeny bee. Journal of Invertebrate Pathology, 32 (3): 332-340. Crosland M.W. (1991) The spread of the social wasp, Vespula germanica, in Australia, New Zealand Journal of Zoology, 18 (4): 375-388. De Miranda J., Cordoni G., Budge G. (2010a) The Acute bee paralysis virus–Kashmir bee virus–Israeli acute paralysis virus complex. Journal of Invertebrate Pathology, 103 Suppl. 1: 30-47. 51

De Miranda J., Genersch E. (2010) Deformed wing virus. Journal of Invertebrate Pathology, 103 Suppl: S48-S61. De Miranda J., Dainat B., Locke B., Cordoni G., Berthoud H., Gauthier L., Neumann P., Budge G., Ball B., Stoltz D. (2010b) Genetic characterization of slow bee paralysis virus of the honeybee (Apis mellifera L.). Journal of General Virology, 91 (10): 2524-2530. Dimmock N.J, Primrose S.B. (1987) Introduction to modern virology. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 536 s. Eyer M., Chen Y., Schäfer M., Pettis J., Neumann P. (2009) Small hive beetle, Aethina tumida, as a potential biological vector of honeybee viruses. Apidologie, 40 (4): 419-428. Forgách P., Bakonyi T., Tapaszti Z., Nowotny N., Rusvai M. (2008) Prevalence of pathogenic bee viruses in Hungarian apiaries. Journal of Invertebrate Pathology, 98 (2): 235-238. Forsgren E., De Miranda J., Isaksson M., Wei S., Fries I. (2009) Deformed wing virus associated with Tropilaelaps mercedesae infesting European honey bees (Apis mellifera). Experimental & Applied Acarology, 47 (2): 87-97. Fujiyuki T., Takeuchi H., Ono M., Ohka S., Sasaki T., Nomoto A., Kubo T., (2004) Novel insect Picorna-like virus identified in the brains of aggressive worker honeybees. Journal of Virology, 78 (3): 1-27. Fujiyuki T., Matsuzaka E., Nakaoka T., Takeuchi H., Wakamoto A., Ohka S., Sekimizu K., Nomoto A., Kubo T., Amdam G., Ihle K., Page R. (2009) Distribution of Kakugo virus and its effects on the gene expression profile in the brain of the worker honeybee Apis mellifera L. Journal of Virology, 83 (22): 1003-1027. Genersch E. (2008) Paenibacillus larvae and American Foulbrood – long since known and still suprising Journal für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, 3(4): 429-434. Genersch E., Yue C., Fries I., De Miranda, J. R., (2005) Detection of Deformed wing virus, a honey bee viral pathogen, in bumble bees (Bombus terrestris and Bombus pascorum) with wing deformities. Journal of Invertebrate Pathology, 91: 61-63. Genersch E., Aubert M. (2010) Emerging and re-emerging viruses of the honey bee (Apis mellifera L.). Veterinary Research, 41 (6): 105-120. Gisder S., Aumeier P., Genersch E. (2009) Deformed wing virus. Journal of General Virology, 90 (2): 463-467.

52

Grabensteiner E., Ritter W., Carter M., Davison S., Pechhacker H., Kolodziejek J., Boecking O., Derakhshifar I., Moosbeckhofer R., Licek E., Nowotny N. (2001): Sacbrood virus of the honeybee (Apis mellifera). Clinical and Vaccine Immunology, 8 (1): 93-104. Hung A., Ball B., Adams J., Shimanuki H., Knox D. (1996) A scientific note on the detection of American strains of acute paralysis virus and Kashmir bee virus in dead bees in one US honey bee (Apis mellifera L) colony. Apidologie, 27 (1): 55-56. Hung A. (2000) PCR detection of Kashmir bee virus in honey bee excreta. Journal of Apicultural Research, 39 (3–4): 103-106. Kajobe R., Marris G., Budge G., Laurenson L., Cordoni G., Jones B., Wilkins S., Cuthbertson A., Brown M. (2010) First molecular detection of a viral pathogen in Ugandan honey bees. Journal of Invertebrate Pathology, 104 (2): 153-156. King A., Lefkowitz E., Adams M.J., Carstens E.B. (2012) Virus taxonomy: classification and nomenclature of viruses: ninth report of the International committee on Taxonomy of Viruses. Waltham, MA: Academic Press, s. 840-849. Lipsitch M., Siller S., Nowak M.A. (1996): The evolution of virulence in pathogens with vertical and horizontal transmission. Evolution 50 (5): 1729-1741. Lommel S., Morris T., Pinnock D. (1985) Characterization of nucleic acids associated with Arkansas bee virus. Intervirology, 23 (4): 199-207. Lucký Z. (1984) Nemoci včel: určeno pro posluchače Vysoké školy veterinární v Brně. Státní pedagogické nakladatelství, Praha. 187 s. Maori E., Lavi S., Mozes-Koch R., Gantman Y., Peretz Y., Edelbaum O., Tanne E. Sela I. (2007) Isolation and characterization of Israeli acute paralysis virus, a dicistrovirus affecting honeybees in Israel. Journal of General Virology, 88 (12): 3428-3438. Martin S.J. (1995) Ontogenesis of the mite Varroa jacobsoni Oud. in drone brood of the honeybee Apis mellifera L. under natural conditions. Experimental and Applied Acarology, 19 (4): 199-210. Martin S.J. (2001) The role of Varroa and viral pathogens in the collapse of honey bee colonies: a modeling approach. Journal of Applied Ecology. 38 (5): 1082-1093. Mockel N., Gisder S., Genersch E. (2011) Horizontal transmission of deformed wing virus. Journal of General Virology, 92 (2): 370-377. Nielsen S., Nicolaisen M., Kryger P. (2008) Incidence of acute bee paralysis virus, black queen cell virus, chronic bee paralysis virus, deformed wing virus, Kashmir bee virus and sacbrood virus in honey bees (Apis mellifera) in Denmark. Apidologie, 39 (3): 310-314. 53

Nordström S., Fries I., Aarhus A., Hansen H., Korpela S. (1999) Virus infections in Nordic honey bee colonies with no, low or severe Varroa jacobsoni infestations, Apidologie, 30 (6): 475-484. Oldroyd B. (2007) What's killing American honey bees? PLoS Biology [online], 5 (6): [cit. 2014-03-28], dostupné z http://www.plosbiology.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pbio.0050168 Olivier V., Blanchard P., Chaouch S., Lallemand P., Schurr F., Celle O., Dubois E., Tordo N., Thiéry R., Houlgatte R., Ribière M. (2008) Molecular characterisation and phylogenetic analysis of Chronic bee paralysis virus, a honey bee virus. Virus Research, 132 (1-2): 59-68. Ongus J. (2004) Complete sequence of a picorna-like virus of the genus Iflavirus replicating in the mite Varroa destructor. Journal of General Virology, 85 (12): 3747-3755. Ongus J., Roode E., Pleij C., Vlak J., Oers M. (2006) The 5' non-translated region of Varroa destructor virus–1 (genus Iflavirus). Journal of General Virology, 87 (11): 3397-3407. Read S. (2000) Molecular techniques for clinical diagnostic virology. Journal of Clinical Pathology, 53 (7): 502-506. Rinderer T., Rothenbuhler W. (1975) The fate and effect of hairs removed from honeybees with hairless-black syndrome. Journal of Invertebrate Pathology, 26 (3): 305-308. Rinderer T., Green T. (1976) Serological relationship between chronic bee paralysis virus and the virus causing hairless-black syndrome in the honeybee. Journal of Invertebrate Pathology, 27 (3): 403-405. Ribière M., Lallemand P., Iscache A., Schurr F., Celle O., Blanchard P., Olivier V., Faucon J. (2007) Spread of infectious Chronic bee paralysis virus by honeybee (Apis mellifera L.) feces. Applied and Environmental Microbiology, 73 (23): 7711-7716. Ribière M., Olivier V., Blanchard P. (2010) Chronic bee paralysis: A disease and a virus like no other? Journal of Invertebrate Pathology, 103 Suppl.: S120-S131. Rosenkranz P. (1999) Honey bee (Apis mellifera L.) tolerance to Varroa jacobsoni Oud. in South America. Apidologie, 30 (2-3): 159-172. Runckel C, Flenniken, M.L., Engel J.C., Ruby, J.G., Ganem D., Andino R., DeRisi J.L. (2011) Temporal analysis of the honey bee microbiome reveals four novel viruses and seasonal prevalence of known viruses, Nosema, and Crithidia. PLoS ONE, 6 (6): [cit. 2014-03-20], dostupné z http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0020656 54

Ryba S., Titera D., Schodelbauerova-Traxmandlova I., Kindlmann P. (2012) Prevalence of honeybee viruses in the Czech Republic and coinfections with other honeybee disease. Biologia, 67 (3): 590-595 Schmid-Hempel P. (1998) Parasites in socilal insects, Princeton University Press, Princeton N.J. s. 119-123 Siede R., Derakshifar I., Otten C., Berenyi O., Bakonyi T., Koglberger H., Büchler R. (2005) Prevalence of Kashmir bee virus in central Europe. Journal of Apicultural Research, 44 (3): 129 Siede, R., König, M., Büchler, R., Failing, K. & Thiel, H. (2008). A real-time PCR based survey on acute bee paralysis virus in German bee colonies. Apidologie, 39 (6): 650-661. Shen M. L.W., Cui, N., Ostiguy D., Cox-Foster D. (2005a) Intricate transmission routes and interactions between picorna-like viruses (Kashmir bee virus and Sacbrood virus) with the honeybee host and the parasitic varroa mite. Journal of General Virology, 86 (8): 2281-2289. Shen M., Yang X., Cox-Foster D., Cui L.. (2005b) The role of varroa mites in infections of Kashmir bee virus (KBV) and deformed wing virus (DWV) in honey bees. Virology, 342 (1): 141-149. Storch G. (2000) Diagnostic Virology. Clinical Infectious Diseases, 31 (3): 739-751. Teixeira E., Chen Y., Message D., Pettis, J., Evans J. (2008) Virus infections in Brazilian honey bees. Journal of Invertebrate Pathology, 99 (1): 117-119. Tentcheva D., Gauthier L., Zappulla N., Dainat B., Cousserans F., Colin M., Bergoin M. (2004) Prevalence and seasonal variations of six bee viruses in Apis mellifera L. and Varroa destructor mite populations in France. Applied and Environmental Microbiology, 70 (12): 7185-7191. Vandame R., Morand S., Colin M., Belzunces L. (2002) Parasitism in the social bee Apis mellifera. Apidologie, 33 (5): 433-445. Veselý V., Kubišová S., Haragsim O., Kamler K., Krieg P., Škrobal D., Ptáček V., Titěra D., Peroutková M., Drobníková V., Bacílek J., Kamler F. (2003) Včelařství. Brázda, Praha, s. 215-217. White G.F. (1917) Sacbrood., US Department of Agriculture Bulletin No. 431 Wiegers F.P. (1986) Transmission of honeybee viruses by Varroa jacobsoni Oud. European research of varroatosis control, Udine, Italy, in: Cavaloro R. (Ed.), Commision of the European Communities, Joint Research centre, Ispra, Luxembourg.

55

Yang X, Cox-Foster D. (2005) Impact of the ectoparasite on the imunity and patology of the invertebrate: evidence for host imunnosupresion and viral amplification. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102 (21): 7470-7475. Yue C. Genersch E. (2005) RT-PCR analysis of Deformed wing virus in honeybees (Apis mellifera) and mites (Varroa destructor). Journal of General Virology, 86 (12): 3419-3424. Yue C., Schroder M., Gisder S., Genersch E. (2007) Vertical-transmission routes for deformed wing virus of honeybees (Apis mellifera). Journal of General Virology, 88 (8): 2329-2336. Zioni N., Soroker V., Chejanovsky N. (2011) Replication of Varroa destructor virus 1 (VDV-1) and a Varroa destructor virus 1–deformed wing virus recombinant (VDV-1-DWV) in the head of the honey bee. Virology, 417 (1): 106-112.

Internetové zdroje [URL1]: The Pirbright institute, http://www.picornavirales.org/, citováno 16.3.2014 [URL2]: ViralZone, http://viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/2156.html, převzato 20.2.2014 [URL3]: Joachim Eberhardt, http://www.die-honigmacher.de/kurs1/showzoom_360_53 201.html, převzato 25.3.2014 [URL4]: Ad Staals, http://www.imkerpedia.nl/wiki/index.php/Nosema_apis, převzato 10.4.2014 [URL5]: The University of Florida, http://entnemdept.ufl.edu/creatures/misc/bees/varro a_mite.htm, převzato 15.3.2014 [URL6]: The University of Georgia, http://www.caes.uga.edu/departments/ent/bees/diso rders/viral-diseases.html, převzato 18.3.2014 [URL7]: Neznámý autor, http://www.apivet.eu/2009/06/a-propos-du-virus-de-laparalysie-chronique-cpv-ou-virus-de-la-maladie-noire.html, převzato 2.3.2014

56