VARIASI ALEL GEN 5-HTT PENYANDI AGRESIVITAS PADA ORANGUTAN SUMATERA (Pongo abelii)
CHYNTIA DESSY LESTARI AMBARWATI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
ABSTRAK CHYNTIA DESSY LESTARI AMBARWATI. VARIASI ALEL GEN 5-HTT PENYANDI AGRESIVITAS PADA ORANGUTAN SUMATERA (Pongo abelii). Dibimbing oleh R.R. DYAH PERWITASARI dan ACHMAD FARAJALLAH. Orangutan Sumatera (Pongo abelii) merupakan kera besar yang daerah persebarannya hanya di Asia. Hewan ini merupakan primata yang agresif. Agresivitas dipengaruhi oleh berbagai faktor, diantaranya oleh gen. Gen yang berperan yaitu gen 5-HTT yang merupakan penyandi transporter serotonin yang bekerja meregulasi sistem serotonergik dan reseptornya melalui modulasi konsentrasi serotonin di dalam cairan ekstraselular. Variasi yang terjadi pada daerah intron dapat mengubah regulasi transkripsi gen 5-HTT. Perubahan ekspresi dari transporter dapat berpengaruh terhadap agresivitas, emosi, fungsi motorik dan beberapa sifat kognitif pada primata. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen 5-HTT pada P. abelii. Sampel yang digunakan sebanyak 48 sampel yang terdiri dari 28 jantan dan 20 betina. Amplifikasi gen 5-HTT dilakukan secara in vitro dengan menggunakan teknik PCR. Frekuensi genotipe L/L 23.81 %, L/S 47.62 %, dan S/S 28.57%. Frekuensi alel L 0.48 dan alel S 0.52. Amplifikasi sampel Macaca nemestrina dilakukan untuk membandingkan ukuran fragmen amplikon gen 5-HTT pada monyet dan kera besar. Sampel P. abelii nomor 127 (S/S) dan 131 (L/L) dan sampel M. nemestrina nomor 12, 38, dan 39 menunjukkan kemiripan sebesar 99% dengan gen transporter serotonin manusia pada kromosom 17 dengan nomor aksesi NG_011747.1. Individu bergenotipe L/L mengekspresikan serotonin dua kali lebih banyak daripada individu bergenotipe S/S atau L/S. Alel S memiliki aktifitas transkripsi yang rendah dibandingkan alel L. Kata kunci: gen transporter serotonin, 5-HTT, orangutan Sumatera, Pongo abelii
ABSTRACT CHYNTIA DESSY LESTARI AMBARWATI. GENE VARIATION 5-HTT ALLELE CODING AGGRESSIVENESS ON SUMATRAN ORANGUTAN (Pongo abelii). Under direction of R.R. DYAH PERWITASARI and ACHMAD FARAJALLAH. Sumatran orangutan (Pongo abelii) is a great apes inhabiting Asia. This animal is an aggressive primates. Aggressiveness is influenced by various factors, including the genes. Genes that play a role is 5-HTT gene coding for the serotonin transporter, which is working to regulate the serotonergic system and its receptors via modulation of the concentration of serotonin in the extracellular fluid. Variations that occurred in the intron may alter the regulation of 5-HTT gene transcription. Changes in expression of the transporter can influence the aggressiveness, emotion, motor function and some cognitive properties in primates. This study aimed to identify the diversity of 5-HTT gene on Sumatran orangutans in among 48 samples consisting of 28 males and 20 females. 5-HTT gene amplification was performed in vitro using PCR techniques. Frequency of genotype L/L, L/S, and S/S were 23.81%, 47.62%, and 28.57% respectively. The frequency of allele L was 0.48 and allele S was 0.52. Amplification of Macaca nemestrina samples aimed to compare the size of the amplicon fragments 5-HTT gene between monkeys and great apes. Samples of P. abelii number 127 (S/S) and 131 (L/L) and samples of M. nemestrina number 12, 38, and 39 showed 99% similarity to human serotonin transporter gene on chromosome 17 with the accession number NG_011747.1. Individuals with L/L genotype express two times more serotonin than individuals with S/S genotype. The S allele has a low transcriptional activity than allele L.
Key words: serotonin transporter gene, 5-HTT, Sumatran orangutan, Pongo abelii
VARIASI ALEL GEN 5-HTT PENYANDI AGRESIVITAS PADA ORANGUTAN SUMATERA (Pongo abelii)
CHYNTIA DESSY LESTARI AMBARWATI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011
Judul Skripsi Nama NIM
: Variasi Alel Gen 5-HTT Penyandi Agresivitas pada Orangutan Sumatera (Pongo abelii) : Chyntia Dessy Lestari Ambarwati : G34070005
Menyetujui:
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc. NIP. 19660403 199003 2 001
Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si NIP. 19650427 199002 1 002
Mengetahui, Ketua Departemen Biologi
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si. NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian dengan judul “Variasi Alel Gen 5-HTT Penyandi Agresivitas pada Orangutan Sumatera (Pongo abelii)” ini dilakukan mulai April 2011 sampai dengan Juli 2011 di Laboratorium Molekuler Bagian Biosistematika dan Ekologi Hewan, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Terimakasih penulis ucapkan kepada Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc dan Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si atas bimbingan dan pengarahan, serta seluruh perhatian dan kesabaran yang senantiasa tercurah selama penyelesaian karya ilmiah ini. Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada teman-teman seperjuangan di laboratorium serta staf laboratorium yang senantiasa membantu Penulis. Terima kasih yang tak terhingga untuk keluarga tercinta yang senantiasa memberi cinta, doa dan dukungan, serta teman-teman tersayang khususnya di Biologi angkatan 44, Wisma Chatralaya yang selalu memberikan bantuan, doa, semangat dan kasih sayang. Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, November 2011 Chyntia Dessy Lestari Ambarwati
i
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Subang Jawa Barat pada tanggal 12 Desember 1989 dari pasangan Rusmana dan Rosipah. Penulis merupakan anak keempat dari empat bersaudara. Penulis lulus dari SMP Negeri 1 Subang pada tahun 2004, kemudian melanjutkan pendidikan di SMA Negeri 2 Subang dan lulus pada tahun 2007. Setelah itu, penulis lulus seleksi masuk jurusan Biologi di Institut Pertanian Bogor melalui jalur USMI (Undangan Seleksi Masuk IPB). Penulis mempunyai pengalaman sebagai asisten praktikum pada mata kuliah Vertebrata, Struktur Hewan, dan Biologi Dasar. Selain itu, penulis pernah aktif berorganisasi di Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) pada tahun kepengurusan 2009 dan 2010 sebagai Staf Infokom, organisasi intra kampus FORCES (Forum for Scientific Studies) pada tahun 2007, serta menjadi panitia di berbagai kegiatan antara lain Biologi Interaktif 2009 dan Revolusi Sains 2009.
ii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR ………………..………………………………………………………...
iv
PENDAHULUAN …………………………………………………………………….............. Latar Belakang …………………………………………………………………………… Tujuan ……………………………………………………………………………..............
1 1 2
BAHAN DAN METODE .......................................................................................................... Waktu dan Tempat Penelitian ……………………………………………………………. Bahan dan Alat …………………………………………………………………………… Metode ……………………………………………………………………………………. Amplifikasi Gen 5-HTT ……………………………………........................................ Visualisasi Produk PCR ................................................................................................ Pengurutan DNA dan Analisis Bioinformatika ............................................................. Analisis data ..................................................................................................................
2 2 2 2 2 2 2 3
HASIL ........................................................................................................................................ Amplifikasi Gen 5-HTT, Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotipe pada P. abelii ............ Identifikasi Gen 5-HTT pada P. abelii dan M. nemestrina ...............................................
3 3 3
PEMBAHASAN ........................................................................................................................ Amplifikasi Gen 5-HTT, Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotipe pada P. abelii ............ Identifikasi Gen 5-HTT pada P. abelii dan M. nemestrina ............................................... Struktur Sosial dan Sistem Hirarki ..................................................................................... Kegunaan Penelitian Gen 5-HTT pada Primata Non Manusia ...........................................
5 5 5 5 6
SIMPULAN ……………………………………………………………………………………
6
SARAN ………………………………………………………………………………………...
6
DAFTAR PUSTAKA …………………………………………………………………………
6
iii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Hasil amplifikasi gen 5-HTT P. abelii menggunakan pasangan primer DPF 11 ......... 3 2. Hasil amplifikasi gen 5-HTT P. abelii dan M. nemestrina menggunakan pasangan primer DPF 11 .............................................................................................................. 3 3. Hasil pengurutan DNA gen 5-HTT P. abelii (nomor 127 dan 131), M. nemestrina (nomor 12, 38, dan 39), dan dibandingkan dengan urutan DNA gen 5-HTT pada H. sapiens, P. pygmaeus, dan M. fascicularis (berdasarkan data pada GenBank) ......................................................................................................................................... 4
iv
PENDAHULUAN Latar Belakang Orangutan Sumatera (Pongo abelii) merupakan kera besar yang daerah persebarannya hanya di Asia. Kelompok kera besar dibedakan dari kelompok monyet berdasarkan ciri seperti tidak berekor, tubuh dan massa otak yang lebih besar, serta memiliki karakteristik tubuh bagian bawah yang teradaptasi untuk melakukan lokomosi secara suspensi (Dolhinow & Fuentes 1999). Hewan ini dikelompokkan ke dalam superfamili Hominoidea, famili Pongidae, dan genus Pongo (Dolhinow & Fuentes 1999). Brandon-Jones et al. (2004) menyatakan bahwa P. abelii memiliki hubungan filogeni yang terpisah dengan Pongo pygmaeus (orangutan Kalimantan). Hal ini dibuktikan dengan perbedaan struktur tulang tengkorak, dermatoglifik, serta data molekuler yang menunjukkan bahwa pemisahan kedua spesies tersebut sudah terjadi sejak dahulu akibat pemisahan dua pulau. Berdasarkan ciri fisiknya, P. abelii memiliki beberapa perbedaan dengan P. pygmaeus. Rambut pada P. pygmaeus dewasa cenderung berwarna coklat kemerahan sedangkan rambut P. abelii biasanya berwarna lebih pucat, lembut dan lemas serta berwarna putih di sekitar wajahnya (Galdikas 1984). Wajah P. abelii berbentuk lonjong dan panjang dengan kantung pipi di kedua sisi wajah. Hewan ini hidup soliter dan lebih bersifat arboreal dibandingkan jenis kera besar lainnya (Galdikas 1984). Hewan ini merupakan mamalia yang terestrial, lokomosinya di pohon dinamakan suspensory climbing, yaitu bergerak cepat dari pohon ke pohon dengan cara berayun pada cabangcabang pohon. Ketika bergerak di tanah, P. abelii bergerak secara kuadrupedal (Fleagle 1988). Ukuran tubuh P. abelii menunjukkan adanya seksual dimorfisme sehingga jantan dan betina dapat dibedakan dengan mudah. Bobot tubuh jantan dewasa sekitar 77 kg, sedangkan pada betina dewasa 37 kg (Napier & Napier 1985). Hewan ini bersifat frugivor atau pemakan buah-buahan. Agresivitas adalah istilah umum yang dikaitkan dengan segala bentuk tingkah laku yang secara langsung maupun tidak langsung bertujuan untuk menyakiti atau melukai makhluk hidup lain dengan tujuan tertentu (Baron & Richardson 1994). Individu yang menempati hirarki tinggi biasanya lebih agresif dibandingkan dengan individu yang mempunyai tingkatan di bawahnya (Napier &
Napier 1985) dan agresivitas pada jantan lebih tinggi daripada betina (Smuts et al. 1987). Kontak antar sesama jantan dewasa bertitik pusat pada hewan betina dan selalu berupa agresi atau penghindaran diri (Galdikas 1984). Selain perkelahian, bentuk agresivitas yang khas pada P. abelii adalah long calls (seruan panjang). Long calls adalah seruan intimidasi panjang yang dilakukan oleh jantan dewasa dan memiliki beberapa tujuan, yaitu untuk mengumumkan daerah teritori yang dikuasai jantan tersebut, memperingatkan jantan lain, menarik perhatian betina, dan untuk mempertahankan area (Rijksen 1978). Gen 5-HTT (5-hydroxytryptaminetransporter) merupakan gen penyandi transporter serotonin yang berpengaruh terhadap agresivitas (Barr et al. 2003), emosi, fungsi motorik, dan beberapa sifat kognitif pada primata dan manusia (Heils et al. 1996). Transporter serotonin adalah protein khusus untuk meregulasi fungsi serotonin di otak yang dilakukan dengan cara pengambilan kembali (reuptake) (Barr et al. 2003). Daerah pengatur pada serotonin transporter (5-HTT) memiliki daerah polimorfisme fungsional atau Variable Number Tandem Repeat (VNTR) yang mempengaruhi risiko pembentukan suasana hati yang negatif pada manusia (Caspi et al. 2003; Lesch et al. 1996). Daerah VNTR pada manusia merupakan suatu daerah polimorfik sebesar 16-17 unit terdapat pada intron 3 gen 5-HTT (Inoue-Murayama et al. 2008). Polimorfisme pada gen 5-HTT manusia dan kera dihasilkan oleh insersi dan delesi (Inoue-Murayama et al. 2008). Polimorfisme pada daerah promotor gen 5HTT manusia terdiri dari insersi atau delesi sebanyak 44 pb nukleotida yang termasuk ke dalam 6 sampai 8 urutan nukleotida berulang (Lesch et al. 1996). Daerah VNTR mempengaruhi aktivitas transkripsi gen. Struktur VNTR dapat berubah selama proses diferensiasi subspesies, oleh karena itu VNTR dapat digunakan untuk menentukan variasi antar spesies. VNTR pada daerah promotor juga mempengaruhi ekspresi gen 5-HTT. Kombinasi kedua daerah VNTR telah dijelaskan pada manusia, yaitu berfungsi untuk menentukan tingkat aktivitas transkripsi gen (Hralinovic et al. 2004). Individu homozigot memiliki alel panjang (genotipe L/L) yang mengekspresikan serotonin dua kali lebih banyak daripada individu dengan alel pendek (S/S atau L/S). Alel S memiliki aktivitas transkripsi yang rendah dibandingkan alel L (Lesch et al. 1996).
1
Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman alel gen 5-HTT transporter serotonin pada P. abelii.
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April 2011 sampai Juli 2011 di Laboratorium Molekuler Bagian Biosistematika dan Ekologi Hewan, Departemen Biologi, FMIPA IPB. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah sampel DNA P. abelii dan DNA beruk (Macaca nemestrina) dalam TE (TrisEDTA) 80% yang merupakan koleksi Pusat Studi Satwa Primata (PSSP), LPPM IPB. Sebanyak 48 sampel DNA P. abelii yang digunakan terdiri dari 28 jantan dan 20 betina, sedangkan 56 sampel DNA M. nemestrina terdiri dari 11 jantan dan 45 betina. Alat yang digunakan adalah mesin Polymerase Chain Reaction (PCR) ESCO, alat sentrifugasi, penangas air, timbangan, spektrofotometer Gene Quantpro (Amersham Pharmacia Biotech) pipet mikro, alat elektroforesis, dan peralatan gelas. Metode Amplifikasi Gen 5-HTT Sampel DNA P. abelii diuji kualitasnya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Amplifikasi gen 5-HTT dilakukan secara in-vitro dengan menggunakan metode PCR. Amplifikasi menggunakan primer DPF 11 yang disusun berdasarkan fragmen DNA gen 5-HTT pada Macaca fascicularis (GenBank NC_000017) yaitu primer forward: 5’-TCTGGCGCTTC CCCTACATAT-3’ dan primer reverse: 5’TG TTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3 (InoueMurayama et al. 2008). Komposisi 12,5 µl reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen 5-HTT P. abelii terdiri dari DNA (2 µl), primer DPF 11 forward dan reverse masing-masing 25 nM (0,5 µl), akuades steril (3,25 µl), serta Readymix Kappa (6,25 µl). Kondisi reaksi PCR dalam mesin ESCO PCR dirancang dengan suhu pradenaturasi 95º C selama 5 menit, denaturasi 95º C selama 1 menit, penempelan primer pada suhu 58º C selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72º C selama 1 menit, akhir pemanjangan pada suhu 72º C selama 4 menit
dan pendinginan pada suhu 4º C. Untuk perbanyakan, siklus diulang sebanyak 30 kali. Komposisi 12,5 µl reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen 5-HTT pada M. nemestrina sama dengan komposisi pada amplifikasi P. abelii. Kondisi reaksi PCR dalam mesin ESCO dirancang dengan suhu pra-denaturasi 95º C selama 5 menit, denaturasi 95ºC selama 1 menit, penempelan primer pada suhu 60º C selama 1 menit, pemanjangan pada suhu 72º C selama 1 menit, akhir pemanjangan pada suhu 72º C selama 4 menit dan pendinginan pada suhu 4º C. Untuk perbanyakan, siklus diulang sebanyak 30 kali. Visualisasi Produk PCR Produk PCR dimigrasikan pada PAGE (Polyacrilamide gel electrophoresis) 6% dalam bufer 1x TBE (Tris-Borat EDTA) dengan voltase 200 V selama 50 menit. Gel diwarnai dengan pewarnaan perak (Byun et al. 2009). Penanda yang digunakan adalah Ready-Load 1 Kb DNA Ladder (Promega). Panjang DNA hasil amplifikasi yang diharapkan yaitu antara 200-250 pb. Penentuan ukuran DNA dilakukan dengan menggunakan kurva jarak genetik. Sumbu x mewakili jarak migrasi (cm) pita DNA pada gel. Pengukuran jarak migrasi tersebut dimulai dari ujung permukaan sumur pada gel. Sumbu y mewakili ukuran DNA (pasang basa). Kurva jarak genetik menghasilkan suatu persamaan linear yang dapat digunakan untuk menentukan ukuran DNA setelah jarak migrasinya diketahui. Pengurutan DNA dan Analisis Bioinformatika Persiapan produk amplifikasi untuk pengurutan DNA dilakukan pada suhu dan waktu yang sama seperti amplifikasi sebelumnya, yang berbeda hanya jumlah bahan-bahan yang digunakan dalam reaksi. Komposisi 50 µl reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen 5-HTT terdiri DNA (7 µl), primer DPF 11 forward dan reverse masing-masing 25 nM (2 µl), akuades steril (14 µl), serta Readymix Kappa (25 µl). Pengurutan DNA hasil amplifikasi dilakukan oleh perusahaan jasa pengurutan DNA. Hasil pengurutan diedit menggunakan program Genetyx Win, kemudian disejajarkan menggunakan program Clustal X. Analisis homologi dilakukan melalui program Basic Local Alignment Search Tool Nucleotida (BLASTN) melalui situs NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov). Hasil pengurutan gen 5-HTT pada dua sampel P. abelii dan tiga
2
sampel M. nemestrina dibandingkan dengan urutan DNA gen tersebut pada Homo sapiens, P. pygmaeus, dan M. fascicularis (berdasarkan data pada GenBank). Pembandingan ini dilakukan untuk melihat perbedaan basa, insersi, serta delesi urutan gen 5-HTT pada spesies-spesies tersebut. Analisis data Frekuensi alel dan genotipe dihitung berdasarkan jumlah individu bergenotipe homozigot (L/L dan S/S) dan heterozigot (L/S) dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
XL = (2nLL + nLS)/2n Keterangan: XL = frekuensi alel L nLL = jumlah individu bergenotipe LL nLS = jumlah individu bergenotipe LS n = jumlah total individu
XLL = (nLL/N) x 100% Keterangan: XLL = frekuensi genotipe LL nLL = jumlah individu bergenotipe LL N = total individu (Nei 1987)
bahwa sebanyak 5 sampel dari 21 sampel bergenotipe L/L, 10 sampel bergenotipe L/S dan 6 sampel bergenotipe S/S. Frekuensi alel L 0.48 dan alel S 0.52. Frekuensi genotipe L/L 23.81 %, L/S 47.62%, dan S/S 28.57%. M
2
3
4
5
6
247 pb 212 pb
200 pb
Gambar 1. Hasil amplifikasi gen 5-HTT P. abelii menggunakan pasangan primer DPF 11. Keterangan gambar: M= penanda 100 pb, nomor 1 dan 2= S/S, nomor 3 dan 4= L/L, nomor 5 dan 6= L/S. Untuk membandingkan ukuran fragmen amplikon gen 5-HTT pada monyet dan kera besar, dilakukan pula amplifikasi dan visualisasi terhadap sampel M. nemestrina dengan menggunakan pasangan primer DPF 11. Sebanyak 56 sampel DNA M. nemestrina berhasil diamplifikasi dan menghasilkan amplikon berupa pita monomorfik yang berukuran sekitar 230 pb (Gambar 2). M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
HASIL Amplifikasi Gen 5-HTT, Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotipe pada P. abelii Gen 5-HTT pada P. abelii berhasil diamplifikasi dengan menggunakan teknik PCR. Primer yang digunakan untuk amplifikasi didisain berdasarkan InoueMurayama et al. (2008). Primer DPF 11 digunakan untuk mengamplifikasi daerah intron 3 dari gen transporter serotonin 5-HTT. Sampel yang berhasil diamplifikasi yaitu sebanyak 21 sampel dari 48 sampel yang tersedia. Amplikon hasil PCR menghasilkan dua pita yang berukuran sekitar 212 dan 247 pasang basa. Amplifikasi menggunakan primer DPF 11 (forward dan reverse) menghasilkan dua alel (L dan S) dan tiga macam genotipe pada sampel yaitu L/L, L/S, dan S/S. Penentuan genotipe dilakukan berdasarkan ukuran pita DNA hasil visualisasi pada PAGE 6%. Amplikon dengan ukuran 212 pb mewakili alel S dan amplikon dengan ukuran 247 pb mewakili alel L (Gambar 1). Amplifikasi pada P. abelii menunjukkan
1
247 pb 212 pb
Gambar 2.
230 pb
Hasil amplifikasi gen 5-HTT P. abelii dan M. nemestrina menggunakan pasangan primer DPF 11. Keterangan gambar: M= penanda 100 pb, nomor 1-6= amplikon dari sampel P. abelii, nomor 7-9= amplikon dari sampel M. nemestrina.
Identifikasi Gen 5-HTT pada P. abelii dan M. nemestrina Identifikasi gen 5-HTT dilakukan dengan menganalisis homologi hasil pengurutan gen tersebut pada sampel P. abelii nomor 127 (S/S) dan nomor 131 (L/L) serta sampel M. nemestrina nomor 12, 38, dan 39 dengan data yang terdapat pada GenBank menggunakan
3
sampel P. abelii dan tiga sampel M. program BLASTN. Kedua sampel P. abelii nemestrina, serta dibandingkan dengan urutan tersebut dipilih berdasarkan genotipe yang DNA gen tersebut pada H. sapiens, P. dimilikinya, sehingga dapat mewakili seluruh pygmaeus, dan M. fascicularis (berdasarkan sampel P. abelii yang berhasil diamplifikasi. data pada GenBank). Pada Gambar 3, insersi Sampel P. abelii dan M. nemestrina tersebut terdapat pada seluruh sampel M. nemestrina menunjukkan kemiripan sebesar 99% dengan dan P. abelii nomor 131 dan terletak pada gen transporter serotonin manusia yang posisi basa 111-145 (34 pb). Delesi hanya terletak pada kromosom 17 dengan nomor terdapat pada P. pygmaeus pada posisi basa 1aksesi NG_011747.1. Gambar 3 merupakan 36 (36 pb). hasil pengurutan DNA gen 5-HTT pada dua .... Pa_127 TTCTGGCGCTTCCCCTACATATGTTACCAGAATGGAGGGGGTCAGTATCACAGGCTGCGC 60 Pa_131 Mn_12 Mn_38 Mn_39 Hs Pp Mf
-TCTGGCGCTTCCCCTACATATGTTACCAGAATGGAGGGGGTCAGTATCACAGGCTGCGTTCTGGCGCTTCCCCTACATATGTTACCAGAATGGAGGAGGTCAGTATCACAGGCTGCG-TCTGGCGCTTCCCCTACATATGTTACCAGAATGGAGGAGGTCAGTATCACAGGCTGCGTTCTGGCGCTTCCCCTACATATGTTACCAGAATGGAGGAGGTCAGTATCACAGGCTGCG-TCTGGCGCTTCCCCTACATATGTTACCAGAATGGAGGGGGTCAGTATCACAGGCTGCG------------------------------------GGCTGTGACCCGGGTGGGCTGTGA -TCTGGCGCTTCCCCTACATATGTTACCAGAATGGAGGAGG-------------------
58 59 58 59 58 24 40
Pa_127 Pa_131 Mn_12 Mn_38 Mn_39 Hs Pp Mf
AGTAGA--GGCTGTGACCCGGG-TG-GGCTGTGACCTGGGGTTGA-TAGAG--------AGTAGA--GGCTGTGACCCGGG-TG-GGCTGTGACCTGGGGTGGG-CTGTGACCCGGGTG AGTAGA--GGCTATGACCTGGGGTG-GACTGTGAGCCGGGGTGGG-CTGAGACCCGGGTG AGTAGA--GGATGTGACCTGGGGTGAGGCTGTGAGCAGGGGTGGG-TTGAGACCCGGGTG AGTAGA--GGCTGTGACCTGGGGTG-GGCTGTGAGCCGGGGTGGG-CTGAGACCCGGGTG AGTAGA--GGCTGTGACCCAGGGTG-GGCTGTGACCCGGAGTGGG-CTGTGACCGGGGTG CCTGGGTGGGCTGTGACCCGGG-TG-GGCTGTGACCTGGGGTGGG-CTGTGA-------------------------------------------------------------------
106 113 115 115 115 114 73
Pa_127 Pa_131 Mn_12 Mn_38 Mn_39 Hs Pp Mf
-------------------------CCCGGGTGGGCTGTGACCTGGGGTGGGCTGTAGGT GGCTGTGACCTGGGGGGGACTGTGACCCGGGTGGGCTGTGACCTGGGGTGGGCTGTAGGT GGCTGTGA-----------------CCCGGGTGGGCTGCGACCTGGGGTGGGCTGTAGGT GGCTGTGA-----------------CCCGGGTGGGCTGCGACCTGGGGTGGGCTGTAGGT GGCTGTGA-----------------CCCAGGTGGGCTGCGACCTGGGGTGGGCTGTAGGT GGCTGTGA-----------------CCCGGGTGGGCTGCGACCTGGGGTGGGCTGT----------------------------CCCGGGTGGGCTGTGACCTGGGGTG---------------------------------------------------------------------
141 173 158 158 158 153 98
Pa_127 Pa_131 Mn_12 Mn_38 Mn_39 Hs Pp Mf
CCTCTTGAGAGGCCAGAAGACAGATCATGTCTTTTCAGTCTTCACTGGCGTAAGACTAGG CCTCTTGAGAGGCCAGAAGACAGATCATGTCTTTTCAGTCTTCACTGGCGTAAGACTAGG CCTCTTGAGAGGCCAGAACACAGATCACATCTTTTCAGTCTTCACTGGCGTAAGACTAGG C----------------------------------------------------------CCTCTTGAGAGGCCAGAACACAGATCACATCTTTTCAGTCTTCACTGGCGTAAGACTAGG ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
201 233 218 159 218
Pa_127 Pa_131 Mn_12 Mn_38 Mn_39 Hs Pp Mf
AACAA AACAA AACAA ----AACAA -------------
206 238 223 223
Gambar 3. Hasil pengurutan DNA gen 5-HTT P. abelii (nomor 127 dan 131), M. nemestrina (nomor 12, 38, dan 39), dan dibandingkan dengan urutan DNA gen 5-HTT pada Homo sapiens, Pongo pygmaeus, dan Macaca fascicularis (berdasarkan data pada GenBank). Keterangan: Pa= P. abelii, Mn= M. nemestrina, Hs= Homo sapiens (GenBank NG_011747.1), Pp= Pongo pygmaeus (GenBank AB308393.1), Mf= Macaca fascicularis (GenBank EF126285.1); huruf berwarna= menunjukkan perbedaan basa, garis bawah= daerah insersi atau delesi.
4
PEMBAHASAN Amplifikasi Gen 5-HTT, Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotipe pada P. abelii Pengujian sampel DNA dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer DNA. Spektrofotometri merupakan metode utama untuk mengetahui kualitas dan kuantitas DNA. DNA yang terdapat pada pelarut cair memiliki penyerapan cahaya maksimal pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan protein memiliki penyerapan cahaya pada panjang gelombang 280 nm. Nilai perbandingan antara penyerapan cahaya pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm menunjukkan tingkat kemurnian DNA. Nilai perbandingan 1,7-2,0 menunjukkan bahwa DNA yang diuji adalah DNA yang murni, nilai <1,7 menunjukkan bahwa DNA terdegradasi; dan nilai >1,7 menunjukkan bahwa DNA masih tercampur dengan pengotor-pengotor seperti protein dan fenol (Ahn, Costa, & Emmanuel 1996). Sampel DNA P. abelii yang tidak berhasil diamplifikasi memiliki nilai perbandingan < 1,7; sehingga dapat disimpulkan bahwa DNA yang terdapat pada sampel tersebut telah terdegradasi. Amplifikasi pada P. abelii menghasilkan frekuensi alel L 0.48 dan alel S 0.52; sedangkan frekuensi genotipe L/L 23.81 %, L/S 47.62%, dan S/S 28.57%. Berdasarkan Nei (1987), dapat disimpulkan bahwa gen transporter serotonin merupakan daerah polimorfi karena jumlah alel bersama dalam populasi lebih dari satu dengan frekuensi alel yang paling umum kurang dari atau sama dengan 0,99. Alel L bersifat dominan terhadap alel S, sehingga biasanya memiliki frekuensi yang lebih besar di dalam suatu populasi. Hasil amplifikasi P. abelii menunjukkan frekuensi alel S yang lebih besar daripada alel L. Hal ini terjadi karena sampel yang digunakan tidak berasal dari populasi alami, melainkan dari pusat rehabilitasi orangutan. Pusat rehabilitasi dapat menyediakan orangutan sebagai subjek penelitian etologi, veteriner, dan psikologi. (Kilbourn et al. 2003; Russon 2002). Pada suatu pusat rehabilitasi orangutan, terdapat kemungkinan individuindividu di dalamnya tidak berasal dari populasi yang sama, sehingga frekuensi genotipe dan frekuensi alel yang diperoleh dari penelitian ini tidak mencerminkan kondisi kesetimbangan seperti yang terjadi pada populasi alami.
Identifikasi Gen 5-HTT pada P. abelii dan M. nemestrina Daerah VNTR yang berukuran besar ditemukan pada manusia dan kera, kecuali orangutan. Daerah VNTR pada orangutan hanya memiliki 4 atau 6 alel berulang. Insersi atau delesi dapat terjadi untuk dapat menghasilkan polimorfisme pada daerah VNTR. Alel pada orangutan tidak memiliki urutan berulang yang unik dan bervariasi seperti yang ditemukan pada manusia, simpanse, gorilla, dan gibon. Perubahan daerah polimorfisme gen 5-HTT diduga terjadi selama proses hominisasi. Hominisasi adalah proses evolusi menuju sifat-sifat manusia yang membedakan hominid dengan primata lainnya (Malassé 1993). Variasi daerah VNTR yang berukuran panjang terjadi pada manusia dan kera kecuali orangutan (Inoue-Murayama et al. 2008). Subspesies yang berlainan dapat saja memiliki jumlah alel berulang yang berbeda. Dua subspesies simpanse memiliki alel berulang yang spesifik dengan jumlah ulangan 18 dan 19 (Pan troglodytes verus) atau 23 dan 34 (Pan troglodytes schweinfurthii), yang mengindikasikan bahwa struktur VNTR dapat berubah selama proses diferensiasi subspesies. Gen 5-HTT bersifat unik pada manusia dan primata simian. Urutan progenitor 5-HTT diduga merupakan DNA virus atau elemen loncat yang telah terintroduksi ke dalam genom manusia dan primata pada 40 juta tahun yang lalu, sehingga urutan 5-HTT dapat digunakan sebagai informasi untuk membandingkan hubungan kekerabatan spesies dan filogeni antara monyet, kera besar, dan manusia (Inoue-Murayama et al. 2008). Struktur Sosial dan Sistem Hirarki Orangutan merupakan primata yang hidup di pepohonan dan menunjukkan struktur sosial yang relatif sederhana yang terdiri dari hanya satu individu atau sedikit anggota keluarga apabila dibandingkan dengan simpanse dan gorilla. Jumlah anggota suatu unit sosial berbeda-beda pada primata, tergantung dari tipe struktur sosialnya. Perkembangan alel yang bervariasi dan peningkatan jumlah alel berulang yang lebih pendek selama proses hominisasi menunjukkan perubahan pada struktur sosial (Inoue-Murayama et al. 2008). Orangutan memiliki keunikan di antara kera besar lainnya karena hewan ini tidak memiliki unit sosial. Orangutan yang telah sepenuhnya dewasa bersifat soliter dan memiliki
5
organisasi sosial yang disebut noyau. Jantan dan betina tidak hidup bersama dalam organisasi sosial ini. Interaksi di antara orangutan jantan dewasa biasanya bersifat agresif; ketika jantan-jantan dewasa bertemu dapat mengakibatkan perkelahian tetapi lebih sering berupa saling bertukar suara (Fleagle 1988). Hirarki sosial terbentuk akibat terdapat perbedaan kualitas individu dalam kelompok. Individu yang mempunyai kualitas tertentu dan lebih unggul daripada individu lain disebut dominan (Ray 1999). Dominasi ini mempunyai pengaruh terhadap perilaku berkompetisi, sehingga terdapat individu yang lebih dominan daripada individu lain. Perilaku sosial dipengaruhi oleh sistem hirarki. Jantan alfa menduduki hirarki tertinggi (Swindler 1998). Pada penelitian ini ditemukan enam individu yang bergenotipe S/S dari total populasi sebanyak 21 individu (28,57%). Individu dengan alel S memiliki kemampuan yang lebih rendah dalam mentransportasikan kembali serotonin ke dalam sel. Individu yang memiliki sedikitnya satu alel S cenderung memiliki tingkat kecemasan dan ketakutan yang tinggi serta menunjukkan perilaku sosial yang rendah dibandingkan dengan individu bergenotipe L/L (Barr et al. 2003). Hirarki sosial pada jantan lebih bersifat tetap. Hirarki sosial dapat berubah dalam rentang waktu yang cukup lama. Perubahan hirarki sosial yang terjadi disebabkan adanya jantan yang meninggalkan kelompok, masuknya jantan baru ke dalam kelompok, dan terjadinya perkelahian yang menimbulkan luka parah dan kematian. Hirarki sosial pada betina lebih dinamis karena dipengaruhi oleh siklus estrus dan kehadiran anak (Eimerl & DeVore 1978). Struktur sosial berupa hirarki tidak selalu merupakan hasil ekspresi satu gen saja. Faktor lingkungan dan efek pleiotropi dari gen-gen lain juga berpengaruh terhadap hirarki sosial dari seekor hewan (MillerButterworth et al. 2007). Kegunaan Penelitian Gen 5-HTT pada Primata Non Manusia Primata non manusia telah digunakan secara luas sebagai subjek dalam penelitian perkembangan dan telah didisain untuk dapat mengetahui perkembangan psikopatologi. Hal ini disebabkan oleh terdapatnya berbagai macam kesamaan di antara primata non manusia dan manusia, misalnya kesamaan perilaku dan fisiologi (Champoux et al. 2002). Salah satu penelitian yang penting mengenai
perilaku manusia adalah kelainan perilaku (mood disorders). Beberapa penelitian telah menunjukkan bahwa kelainan perilaku terbentuk akibat peranan dari faktor genetik dan lingkungan, tetapi hanya sedikit gen yang diketahui bertanggung jawab atas pembentukan kelainan perilaku ini (Zalsman et al. 2006). Gen 5-HTT diketahui menjadi salah satu gen yang mempengaruhi perilaku dan kepribadian, antara lain kecemasan, depresi, gagasan untuk bunuh diri, dan memiliki keterkaitan dengan ketergantungan terhadap alkohol. Oleh karena itu, penelitian mengenai gen 5-HTT berguna untuk menjelaskan mekanisme terjadinya kelainan perilaku tersebut sehingga dapat diperoleh solusi yang tepat.
SIMPULAN Variasi gen 5-HTT (penyandi agresivitas) berhasil diidentifikasi pada P. abelii. Keragaman di daerah intron 3 gen ini diwakili oleh alel S dan alel L. Frekuensi untuk genotipe L/L 23,81 %, L/S 47,62 %, dan S/S 28,57%. Frekuensi alel L 0,48 dan alel S 0,52. Deteksi gen 5-HTT pada M. nemestrina menghasilkan pita monomorfik. Sampel P. abelii nomor 127 (S/S) dan 131 (L/L) serta sampel M. nemestrina nomor 12, 38, dan 39 menunjukkan kemiripan sebesar 99% dengan gen transporter serotonin manusia pada kromosom 17 dengan nomor aksesi NG_011747.1.
SARAN Analisis perilaku dibutuhkan untuk mempelajari polimorfisme gen 5-HTT secara lebih lanjut dan detail pada populasi primata. Kombinasi antar gen mungkin dapat dijadikan alternatif dalam penentuan sifat agresivitas pada jenis primata.
DAFTAR PUSTAKA Ahn SJ, Costa J, Emmanuel JR. 1996. PicoGreen quantitation of DNA: effective evaluation of samples preor post- PCR. Nucleic Acids Research 24: 2623–2625. Baron RA, Richardson DR. 1994. Human Aggression. 2nd edition. New York: Plenum.
6
Barr CS et al. 2003. The utility of nonhuman primate model for studying gene by environtment interactions in behavioral research. Genes Brain Behavior 2: 336-340. Brandon-Jones D et al. 2004. Asian primate classification. American Journal of Primatology 25: 97-164. Byun SO, Fang Q, Zhou H, Hickford JGH. 2009. An effective method for silverstaining DNA in large numbers of polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry 385: 174-175. Caspi A et al. 2003. Influence of life stress on depression: moderation by a polymorphism in the 5-HTT gene. Science 301: 386-389. Champoux M et al. 2002. Serotonin transporter gene polymorphism, differential early rearing, and behavior in rhesus monkey neonates. Molecular Psychiatry 7: 1058–1063. Dolhinow P, Fuentes A. 1999. The Non Human Primates. California: Mayfield Publishing. Eimerl S, deVore I. 1978. Primata. Timan Th S, penerjemah. Jakarta: Tira Pustaka. Terjemahan dari: The Primates. Fleagle JG. 1999. Primate Adaptation and Evolution. San Diego: Academic Press. Galdikas BMF. 1984. Adaptasi Orangutan di Suaka Tanjung Puting, Kalimantan Tengah. Jakarta: Universitas Indonesia Press. Heils A et al. 1996. Allelic variation of human serotonin transporter gene expression. Journal of Neurochemistry 6: 2621-2624. Hralinovic et al. 2004. Serotonin Transporter Promoter and Intron 2 Polymorphisms: Relationship Between Allelic Variants and Gene Expression. Biological Psychiatry 55: 1090–1094. Inoue-Murayama et al. 2008. Interspecies and intraspecies variations in the serotonin transporter gene intron 3 VNTR in nonhuman primates. Primates 49: 139-142. Kilbourn A et al. 2003. Health evaluation of free-ranging and semi-captive orangutans (Pongo pygmaeus pygmaeus) in Sabah, Malaysia. Journal of Wildlife Diseases 39: 7383. Lesch et al. 1996. Association of anxietyrelated traits with a polymorphism in
the serotonin transporter gene regulatory region. Science 274:15271531. Malassé Anne D. 1993. Continuity and discontinuity during hominization. Quaternary International 19: 85-100. Miller-Butterworth CM et al. 2007. The serotonin transporter: sequence variation in Macaca fascicularis and its relationship to dominance. Behavior Genetics 37: 678-696. Napier JR, Napier PH. 1985. The Natural History of Primates. Massachussets: The MIT Press. Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York: Columbia University. Ray E. 1999. The Macaques. In: Dolhinow P, Fuentes A, editor. The Non Human Primates. California: Mayfield Publishing. Rijksen HD. 1978. A Field Study on Sumatera Orangutan (Pongo pygmaeus abelii Lesson 1927). Wageningen: H. Veenman & Zonin BV. Russon AE. 2002. Return of the native: cognition and site-specific expertise in orangutan rehabilitation. International Journal of Primatology 23: 461-478. Smuts BB et al. 1987. Primate Societies. Chicago: The University of Chicago. Swindler DR. 1998. Introduction to The Primate. Seatle: University of Washington Press. Zalsman G et al. 2006. Association of a triallelic serotonin transporter gene promoter region (5-HTTLPR) polymorphism with stressful life events and severity of depression. American Journal of Psychiatry 163:1588–1593.
7
