i
VARIASI ALEL DARI GEN 5-HTT (PENYANDI AGRESIVITAS) PADA Macaca nemestrina
IKKA ERNIASARI
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
ii
VARIASI ALEL DARI GEN 5-HTT (PENYANDI AGRESIVITAS) PADA Macaca nemestrina
IKKA ERNIASARI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2010
iii
ABSTRAK IKKA ERNIASARI. Variasi Alel dari Gen 5-HTT (Penyandi Agresivitas) pada Macaca nemestrina. Dibimbing oleh R.R DYAH PERWITASARI dan ACHMAD FARAJALLAH. Macaca nemestrina merupakan jenis primata yang agresif. Agresivitas ini dipengaruhi oleh berbagai faktor di antaranya oleh gen. Gen yang berperan yaitu 5-HTT yang merupakan penyandi transporter serotonin yang bekerja meregulasi sistem serotonergik dan reseptornya melalui modulasi konsentrasi serotonin di dalam cairan ekstraselular. Variasi yang terjadi pada daerah promotor dan intron dapat mengubah regulasi transkripsi gen 5-HTT. Variasi ini terutama dapat mengurangi ekspresi dari transporter dan pengambilan serotonin. Perubahan ekspresi dari transporter dapat berpengaruh terhadap agresivitas, emosi, fungsi motorik dan beberapa sifat kognitif pada primata. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi keragaman gen 5-HTT (penyandi agresivitas) pada M. nemestrina. Sampel yang digunakan adalah 56 ekor M. nemestrina yang berasal dari satu kelompok. Amplifikasi gen 5-HTT dilakukan secara in vitro dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Amplifikasi di daerah promotor menunjukkan adanya variasi yang diwakili oleh dua macam alel dan tiga macam genotip dengan frekuensi alel L sebesar 88,18% dan 11,82% untuk alel S. Sementara variasi pada daerah intron 3 diwakili oleh alel l dan s dengan frekuensi masing-masing sebesar 55,4% dan 44,6%. Tidak ditemukan adanya genotip s/s pada daerah intron 3. Alel S merupakan alel yang dominan terhadap alel L, keberadaaan dari setidaknya satu macam alel S dapat menyebabkan penurunan aktivitas transkripsi. Amplifikasi daerah promotor menghasilkan satu individu dengan genotip S/S yang kemungkinan merupakan jantan alfa dalam kelompok ini. ABSTRACT IKKA ERNIASARI. Allelic variation of the 5-HTT Gene (Encoding Aggresivity) in Macaca nemestrina. Supervised by R.R DYAH PERWITASARI and ACHMAD FARAJALLAH. Macaca nemestrina is an aggressive primate. The aggresivity is influenced by many factors, one of them is by a gene. The 5-HTT gene encodes the serotonin transporter that affects the regulation of serotonergic system and its receptor by modulating the concentration of serotonin in extracellular fluid. Variation in promoter and intron region can change the transcriptional activity of the 5-HTT gene, mainly the activity of the transporter and serotonin uptake. The transporter change activity influenced aggressivity, emotion, motor function, and some cognitive traits in primates. This research aimed to determine alelles variant of 5-HTT gene (encoding aggresivity) in M. nemestrina. Samples used in this research consisted of 56 M. nemestrina. The gene was amplified by the Polymerase Chain Reaction (PCR) method. Amplification in promoter region revealed two alleles and three genotypes with the frequencies of L and S alleles were 88,18% and 11,82%, respectively. Amplification of the third intron region showed two alleles with the frequency of l and s alleles were 55,4% and 44,6%, respectively. None of the individual had s/s genotype in the third intron region. Short allele was dominant to long allele. The presence of at least one short allele decreased transcription activity. There was one individual with S/S genotype in promoter region that was possibly to be the alpha male in the group.
iv
Judul Skripsi : Variasi Alel dari Gen 5-HTT (Penyandi Agresivitas) pada Macaca nemestrina Nama : Ikka Erniasari NIM : G34051374
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
(Dr. Ir. R.R. Dyah Perwitasari, M.Sc.) NIP. 19660403 199003 2 001
(Dr. Ir. Achmad Farajallah, M.Si.) NIP. 19650427 199002 1 002
Mengetahui: Ketua Departemen Biologi
(Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.Si.) NIP. 19641002 198903 1 002
Tanggal Lulus:
v
PRAKATA Alhamdulillahirobbil’alamiin Puji dan syukur Penulis panjatkan kepada ALLAH SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis diberi kekuatan, kesabaran, dan kemampuan untuk menyelesaikan karya ilmiah ini. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Ibu Dr. R. R. Dyah Perwitasari dan Bapak Dr. Achmad Farajallah selaku pembimbing yang telah memberikan saran, kritik, motivasi dan bantuan yang tak terhingga sehingga penelitian ini berjalan dengan lancar. Ucapan terima kasih juga diberikan kepada Pusat Studi Satwa Primata (PSSPLPPM, IPB) atas sampel DNA Macaca nemestrina yang telah digunakan dalam penelitian ini serta kepada Bapak Dr. Ir. Miftahudin sebagai penguji yang telah memberikan saran dan perbaikan dalam laporan ini. Selain itu, penghargaan penulis sampaikan kepada seluruh staf pengajar Zoologi, Ibu Tini, Pak Adi dan Mba Ani selaku staf laboratorium Biosains Hewan atas bantuannya sehingga penelitian ini dapat berjalan dengan lancar. Penulis juga ingin mengucapkan terima kasih kepada Bapak Khoirul, Ibu Bibah, Wildan N., atas latihan-latihannya. Kepada sahabat-sahabat tercinta: Sylvia NP, Jazirotul F, Nur ACD, Ika Rezza, Gilang H, Apria W, Vina V, Diaz S, Femi Aprilia Z, Darojatul U, Kanthi AW, Puji Rianti, Ruth Martha W, R. Fadillah Yassin dan warga zoologi atas persahabatan dan kebersamaannya selama penelitian ini. Serta kepada teman-teman Wisma Mega1 Umi C, Henny W, Dede W, Kartika SH, Nur S, dan Biologi 42 yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penghargaan terbesar penulis haturkan untuk Ayah, Ibu dan adik-adikku Ryan Ryawan dan Putri Nurmalasari atas segala dukungan, kasih sayang yang tercurah dan hantaran do’a yang senantiasa diberikan. Penulis berharap semoga laporan masalah khusus ini dapat bermanfaat.
Bogor, Januari 2010
Ikka Erniasari
vi
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 31 Maret 1987 dari ayahanda Dalimun dan ibunda Ngatiyem. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Tahun 1999 penulis lulus dari SDI Al-ma’ruf Jakarta, tahun 2002 lulus dari SMP Negeri 233 Jakarta, kemudian melanjutkan ke SMA Negeri 99 Jakarta. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 99 Jakarta dan di tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa tingkat persiapan bersama Institut Pertanian Bogor melalui jalur Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB). Penulis kemudian terpilih masuk ke Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB Bogor. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Perkembangan Hewan pada tahun 2007/2008, Biologi Dasar pada tahun ajaran 2008/2009 dan 2009/2010, Struktur Hewan pada tahun ajaran 2008/2009, Pengantar Genetika Molekuler pada tahun ajaran 2008/2009, Genetika Dasar pada tahun ajaran 2009/2010, dan Vertebrata pada tahun ajaran 2009/2010. Pada tahun 2007 penulis melakukan studi lapang di Wana Wisata Cangkuang dengan judul Distribusi Primata di Wana Wisata Cangkuang. Pada tahun 2008, penulis menjadi pengajar biologi di bimbingan belajar B-Expert dan pada tahun yang sama penulis melakukan praktik lapangan di PT Saung Mirwan dengan judul Budidaya Bunga Kalanchoe (Kalanchoe sp.) dalam pot di PT Saung Mirwan.
vii
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1 Latar Belakang ............................................................................................................................. 1 Tujuan........................................................................................................................................... 2 Waktu dan Tempat ....................................................................................................................... 2 BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 2 Bahan ............................................................................................................................................ 2 Metode.......................................................................................................................................... 2 Ekstraksi dan Isolasi DNA ....................................................................................................... 2 Amplifikasi Gen 5-HTT ........................................................................................................... 2 Visualisasi Produk PCR ........................................................................................................... 3 Analisis Data ............................................................................................................................ 3 HASIL ............................................................................................................................................... 3 Amplifikasi dan Visualisasi Gen 5-HTT ...................................................................................... 3 Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina............................. 3 PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4 Amplifikasi dan Visualisasi Gen 5-HTT ...................................................................................... 4 Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina............................. 4 SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................................................. 5 Simpulan....................................................................................................................................... 5 Saran ............................................................................................................................................. 6 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 6
viii
DAFTAR GAMBAR Halaman 1.
Hasil amplifikasi gen 5-HTT menggunakan pasangan primer DPF12 berdasarkan Lesch et al. (1997) dan Inoue-Murayama et al. (2000)…………………………………………………4
2.
Hasil amplifikasi gen 5-HTT menggunakan pasangan primer DPF11 berdasarkan InoueMurayama et al. (2008)………………………………………………………………………..4
1
PENDAHULUAN Latar Belakang Beruk (Macaca nemestrina) merupakan spesies primata yang banyak ditemukan di Indonesia. Hewan ini termasuk ke dalam subordo Anthropoidae dan famili Cercopithecidae (Napier & Napier 1967; Dolhinow & Fuentes 1999). Spesies ini merupakan genus Macaca berbadan besar dan tegap yang memiliki rambut berwarna coklat keabu-abuan sampai agak keemasan; sekeliling wajahnya terdapat rambut coklat yang mengembang dan lebih terang (Lekagul & McNeely 1977). Macaca nemestrina dapat hidup di hutan primer dan sekunder, daerah pedalaman dan pesisir, hutan dataran rendah dan dataran tinggi. Wilayah Asia yang menjadi habitat alami dari spesies ini meliputi wilayah Asia Selatan dan Asia Tenggara. Sementara di Indonesia, habitat alami spesies ini berada di pulau Sumatera, Kalimantan, dan kepulauan Mentawai (Fooden 1987). Berdasarkan aktivitas hariannya, M. nemestrina digolongkan ke dalam hewan diurnal (Napier & Napier 1967) yang melakukan perpindahan secara terestrial karena ukuran tubuhnya yang besar dan ekor yang pendek. Seperti kebanyakan jenis primata lainnya, M. nemestrina hidup berkelompok dalam hirarki sosial yang beranggotakan banyak jantan dan banyak betina. Beberapa alasan jenis primata ini hidup berkelompok di antaranya adalah sebagai perlindungan diri dari predator, sumberdaya, efisiensi dalam pencarian pakan, dan peningkatan perawatan terhadap keturunan (Else & Lee 1987). Eimerl dan De Vore (1980) menyatakan bahwa pada saat istirahat, M. nemestrina lebih menyukai kegiatan menyelisik (grooming) dibandingkan kegiatan lainnya. Kegiatan ini selain untuk membersihkan badan, juga sarana untuk menjalin hubungan sosial antar individu di dalam kelompok. Hirarki sosial yang ada pada M. nemestrina jelas. Individu yang menempati hirarki tinggi merupakan pemimpin dalam kelompok dan biasa disebut alfa dan individu di bawahnya merupakan individu subordinan yang disebut beta, gamma dan seterusnya. Perbedaan tingkat sosial dari primata ini dipengaruhi oleh banyak faktor. Faktor tersebut di antaranya adalah ukuran tubuh, dimorfisme seksual, umur, kesehatan, keturunan, lingkungan, dan demografi kelompok (Dolhinow & Fuentes 1999).
Agresivitas adalah istilah umum yang dikaitkan dengan segala bentuk tingkah laku yang secara langsung maupun tidak langsung bertujuan untuk menyakiti atau melukai mahluk hidup lain dengan tujuan tertentu (Baron & Richardson 1994). Tingkah laku agresif didefinisikan sebagai tingkah laku yang ditujukan pada keberhasilan menyakiti atau melukai mahkluk hidup lain. Tingkah laku agresif ini merupakan tindakan yang sengaja dilakukan oleh pelaku untuk mencapai tujuan tertentu seperti menakuti dan menyakiti orang lain (Zeanah 2005). Agresivitas merupakan sifat umum yang dimiliki oleh primata. Sifat ini biasanya dipengaruhi oleh hirarki. Individu yang menempati hirarki tinggi biasanya lebih agresif dibanding dengan individu di bawahnya (Napier & Napier 1985; Drea & Kim 1999; Miller-Butterworth et al. 2007). Agresivitas pada individu jantan lebih tinggi dibandingkan dengan pada betina (Smuts et al. 1987). Agresivitas pada suatu individu juga berkaitan dengan habitat dan makanan yang tersedia di habitat. Miller-Butterworth et al. (2007) menyebutkan bahwa spesies yang hidup di habitat alami memiliki agresivitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan spesies dalam penangkaran. Kelangkaan makanan, air, dan tempat perlindungan di alam bebas dapat memicu konflik dan kompetisi antar individu yang dapat menimbulkan dominansi antara satu individu dengan yang lainnya (Dolhinow & Fuentes 1999). Kemiripan habitat dan sumber pakan juga menyebabkan M. nemestrina dapat hidup berdampingan dengan spesies primata dan hewan lain yang mempunyai relung ekologi sama sehingga dapat berpengaruh terhadap agresivitasnya (Iskandar 1998). Macaca nemestrina merupakan hewan yang bersifat agresif baik terhadap sesama jenis maupun terhadap satwa yang berbeda jenisnya (Oi 1990). Perkelahian merupakan salah satu penanda agresivitas yang ada pada primata. Aktivitas ini ditandai dengan ancaman mimik muka atau gerakan badan, menyerang dan memburu lawannya, baku hantam, dan diakhiri dengan kekalahan lawannya (Else & Lee 1987). Individu yang memenangkan konflik akan menjadi superior dibanding dengan yang lainnya dan menjadi pemimpin dalam kelompok atau biasa disebut sebagai jantan alfa. Sikap subordinan ditandai dengan perilaku menunjukkan bagian belakang tubuh kepada
2
individu dominan, sedangkan sifat agresif ditandai dengan perilaku menggoyangkan dahan pohon. Gen 5-HTT (5-hydroxytritaminetransporter) merupakan penyandi transporter serotonin yang berpengaruh terhadap agresivitas (Barr et al. 2003), emosi, fungsi motorik, dan beberapa sifat kognitif pada primata dan manusia (Heils et al. 1996). Gen ini diketahui dapat meregulasi sistem serotonergik dan reseptornya melalui modulasi konsentrasi serotonin di dalam cairan ekstraselular (Murphy et al. 2004; Izquierdo et al. 2007). Gen 5-HTT terdiri dari daerah promotor yang merupakan daerah polimorfik pada banyak spesies primata. Analisis in vitro daerah promotor pada gen 5-HTT menunjukkan penurunan aktivitas transkripsi yang berasosiasi dengan alel S dan L pada manusia dan beberapa primata. Alel S merupakan alel yang mempunyai aktivitas transkripsi lebih rendah dibandingkan dengan alel L (MillerButterworth 2007). Variasi juga terdapat pada intron 3 gen 5-HTT (Inoue-Murayama et al. 2008). Varian di daerah promotor dan intron pada manusia dapat mengubah regulasi transkripsi dari gen 5-HTT, terutama dapat mengurangi ekspresi dari transporter dan pengambilan serotonin (Lesch et al. 1996; Heils et al. 1996; Miller-Butterworth et al. 2007). Keberadaan setidaknya satu macam alel S pada daerah promotor maupun intron dapat berpengaruh terhadap mekanisme regulator yang mengatur ekspresi dari gen 5HTT (Inoue-Murayama et al. 2008). Alel S pada manusia berkaitan dengan tingkat kecemasan, depresi, dan stres sebagai respon otak terhadap emosi (Izquierdo et al. 2007). Varian ini juga berpengaruh terhadap ekspresi dari gen 5HTT antara lain mempengaruhi emosi dan beberapa kelainan kejiwaan lainnya. Tujuan Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi keragaman alel gen 5-HTT (penyandi agresivitas) pada Macaca nemestrina. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret 2009 sampai September 2009 di Bagian Sistematika dan Ekologi Hewan, Departemen Biologi, FMIPA IPB.
BAHAN DAN METODE Bahan Sampel darah beruk yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel darah yang diawetkan dalam alkohol koleksi Pusat Studi Satwa Primata (PSSP-LPPM, IPB). Sebanyak 56 sampel yang digunakan dipilih dari satu populasi yang terdiri dari 11 jantan dan 45 betina. Metode Ekstraksi dan Isolasi DNA Ekstraksi dan isolasi DNA dari darah dilakukan menggunakan Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kits. Sel-sel darah disuspensikan ke dalam 180 µl bufer pelisis ATL dan 20 µl proteinase-K 5 mg/ml, kemudian diinkubasi pada suhu 55oC selama 3 jam sambil dikocok pelan. Selanjutnya campuran ditambah dengan 200 µl bufer purifkasi AL dan diinkubasi pada suhu 70°C selama 10 menit. Selanjutnya campuran ditambahkan dengan 200 µl etanol absolut dan dipindahkan ke kolom pemisah. Molekul-molekul DNA diendapkan dengan cara disentrifugasi 8000 rpm selama 1 menit. Sisa garam dalam sampel DNA dicuci dengan bufer pencuci AW sebanyak 500 µl. Endapan DNA disuspensikan dengan 400 µl bufer elusi AE (10 mM Tris-Cl; 0.5 mM EDTA; pH 9.0). Sampel DNA yang diperoleh diuji kualitasnya dengan spektrofotometer GeneQuantpro (Amersham Phamarcia Biotech) pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm. Amplifikasi Gen 5-HTT Amplifikasi gen 5-HTT dilakukan secara in vitro dengan menggunakan metode Polymerase Chain Reaction (PCR). Amplifikasi pada bagian promotor menggunakan primer DPF12 yang disusun berdasarkan fragmen DNA gen 5-HTT pada manusia (GenBank EF126284) yaitu forward primer 5'-GGCGTTGCCGCTCTGAATGC-3’ dan reverse primer 5’-GAGGGACTGAGCTGGACAACCAC-3’ (Lesch et al. 1997; Inoue-Murayama et al. 2000). Amplifikasi daerah intron 3 menggunakan primer DPF11 yang disusun berdasarkan fragmen DNA gen 5-HTT pada M. fascicularis (GenBank NC_000017) yaitu forward primer 5'-TCTGGCGCTTCCCCTACATAT-3' dan reverse primer 5'-TGTTCCTAGTCTTACGCCAGTG-3' (InoueMurayama et al. 2008). Panjang DNA hasil
3
amplifikasi yang diharapkan yaitu antara 500-700 bp. Komposisi 25 µl reaksi PCR untuk mengamplifikasi gen 5-HTT terdiri dari 10100 ng DNA, masing-masing primer 25 nM, serta Greenmix (Promega) yang terdiri dari dNTP, Taq polymerase dan bufer. Kondisi reaksi PCR dalam mesin TaKaRa PCR Thermal Cycler MP (TaKaRa Biomedicals) dirancang dengan suhu pra-denaturasi 94°C selama 5 menit, denaturasi 94°C selama 1 menit, penempelan primer pada suhu 6063°C selama 30 detik, pemanjangan pada suhu 720C selama 1 menit, akhir pemanjangan pada suhu 72°C selama 4 menit dan pendinginan pada suhu 4°C. Untuk perbanyakan, siklus diulang sebanyak 30 kali. Visualisasi Produk PCR Produk PCR dimigrasikan pada PAGE (Polyacrilamide gel electrophoresis) 6 % dalam bufer 1x TBE (Tris-Borat EDTA) dengan voltase 200 V selama 50 menit. Gel diwarnai dengan pewarnaan perak menurut Tegëlstrom (1986). Penanda yang digunakan adalah Ready-Load™ 1 Kb DNA Ladder (Invitrogen). Analisis Data Frekuensi alel dihitung berdasarkan jumlah individu genotip homozigot (LL dan SS) dan heterozigot (LS) dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
XL = (2nLL +nLS)/2n Keterangan: XL = frekuensi alel L nLL = jumlah individu bergenotip LL nLS = jumlah individu bergenotip LS n = jumlah total individu (Nei 1987) Frekuensi genotip dihitung berdasarkan rumus sebagai berikut:
XLL = (nLL/N) x 100% Keterangan: XLL = frekuensi genotip LL nLL = jumlah individu bergenotip LL N = total individu
HASIL Amplifikasi dan Visualisasi Gen 5-HTT Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina berhasil diamplifikasi dengan menggunakan teknik PCR. Primer yang digunakan didisain berdasarkan Lesch et al. (1997) dan InoueMurayama et al. (2000). Primer DPF12 digunakan untuk mengamplifikasi daerah promotor 5-HTT di genus Macaca. Dari 56 sampel yang diamplifikasi, satu sampel tidak berhasil diamplifikasi yaitu pada sampel dengan nomor urut 35. Amplifikasi dengan menggunakan pasangan primer ini menghasilkan dua buah pita berukuran sekitar 648 bp dan 561 bp (Gambar 1). Amplifikasi kedua menggunakan pasangan primer DPF11 berhasil mengamplifikasi daerah intron 3 dari gen serotonin transporter. Sampel yang berhasil diamplifikasi yaitu sebanyak 37 sampel dari 56 sampel yang tersedia. Amplikon yang terbentuk dari hasil PCR juga menghasilkan dua buah pita berukuran 623 bp dan 575 bp (Gambar 2). Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina Adanya dua alel (L dan S) dan tiga macam genotip pada sampel yang diamplifikasi dengan menggunakan pasangan primer DPF12 yaitu L/L, L/S, dan S/S. Masing-masing genotip ditentukan berdasarkan banyak dan ukuran pita DNA dalam PAGE 6%. Amplikon dengan ukuran 648 bp mewakili alel L dan amplikon dengan ukuran 561 bp mewakili alel S. Sebanyak 43 sampel dari 56 sampel yang ada bergenotip L/L, 11 sampel bergenotip L/S dan 1 sampel bergenotip S/S. Frekuensi untuk genotip L/L sebesar 78,2%, L/S sebesar 20%, dan S/S sebesar 1,8%. Sementara frekuensi untuk alel L sebesar 88,18% dan 11,82% untuk alel S. Pada amplifikasi dengan menggunakan pasangan primer DPF11 ditemukan dua alel yang diwakili oleh dua pita yang bermigrasi pada gel elektroforesis. Pita dengan panjang 632 bp mewakili alel l dan pita dengan ukuran 575 bp mewakili alel s. Dari kedua alel ini diperoleh dua jenis genotip yaitu l/l dan l/s. Sebanyak empat sampel dari 56 sampel bergenotip l/l, dan 33 sampel bergenotip l/s dengan frekuensi masing-masing alel yaitu sebesar 55,4% untuk alel l dan 44,6% untuk alel s. Tidak ditemukan adanya genotip s/s dan sebanyak 19 sampel tidak teramplifikasi dengan menggunakan pasangan primer
4
DPF11. Frekuensi genotip l/l sebesar 10,8% dan l/s sebesar 89,2%. M
2
1
3
4
648 bp 512 bp 300 bp 200 bp
Gambar 1
Hasil amplifikasi gen 5-HTT menggunakan pasangan primer DPF12 berdasarkan Lesch et al. (1997) dan InoueMurayama et al. (2000). Keterangan: M= penanda, nomor 1dan 3= L/S; nomor 2= L/L; nomor 4= S/S
M 1
2
3 4
623 bp 575 bp 400 bp
Gambar 2 Hasil amplifikasi gen 5-HTT menggunakan pasangan primer DPF11 berdasarkan InoueMurayama et al. (2008). Keterangan: M= penanda, nomor 1= l/l; nomor 2-4= l/s
PEMBAHASAN Amplifikasi dan Visualisasi Gen 5-HTT Lesch et al. (1997) berhasil mengamplifikasi gen 5-HTT M. mulatta menggunakan pasangan primer DPF12 dengan produk PCR sebesar 419 bp yang mewakili alel L dan 398 bp yang mewakili alel S. Sementara amplifikasi yang dilakukan pada sampel M. nemestrina menghasilkan amplikon dengan ukuran 648 bp dan 561 bp. Amplikon yang diharapkan yaitu sebesar 500-700 bp. Target ini didapatkan dari hasil penempelan primer pada beberapa genus Macaca di beberapa penelitian sebelumnya. Hal ini sesuai dengan penelitian yang dilakukan Lesch et al. (1996) pada manusia yang menyatakan daerah polimorfik pada gen ini yaitu pada daerah promotor dapat mengalami
penyisipan ataupun delesi sebanyak 44 bp atau lebih. Penyisipan maupun delesi ini dapat terjadi secara acak di daerah promotor. Pada M. nemestrina penyisipan maupun delesi ini juga dapat terjadi. Perkiraan amplikon yang terbentuk jika tidak terjadi penyisipan maupun delesi adalah 506 bp sampai 528 bp. Frekuensi Alel dan Frekuensi Genotip Gen 5-HTT pada Macaca nemestrina Suatu lokus dinyatakan polimorfik apabila jumlah alel bersama dalam populasi lebih dari satu dengan frekuensi alel yang paling umum kurang atau sama dengan 0,99 (Nei 1987). Frekuensi alel pada populasi M. nemestrina yaitu sebesar 88,18% untuk alel L dan 11,82% untuk alel S. Dapat dikatakan bahwa lokus tempat gen serotonin transporter ini berada merupakan daerah polimorfik. Hal ini diperkuat dengan frekuensi alel pada M. mulatta yaitu sebesar 66% untuk alel L dan sebesar 34% untuk alel S (Lesch et al. 1997). Studi keragaman genetik dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan VNTR atau keragaman alel pada jumlah salinan DNA berulang dari daerah hipervariabel. Variable Number Tandem Repeated (VNTR) merupakan urutan nukleotida pendek antara 14-100 nukleotida yang terorganisasi ke dalam kelompok yang terdiri dari dua pasangan berulang. Dalam setiap kali peristiwa VNTR, terdapat empat sampai 40 kali perulangan. Urutan nukleotida berulang ini dapat ditemukan pada banyak kromosom dan memiliki panjang yang bervariasi antar individu. Varian ini dapat digunakan untuk mempelajari keragaman genetik, analisis forensik, penentuan pola persilangan atau perkawinan pada hewan, dan lain sebagainya (Kasai et al. 1990; Ting Ting et al. 2009). Sampel M. mulatta yang diamplifikasi oleh Lesch et al. (1997) memiliki frekuensi genotip untuk L/L, L/S, dan S/S masingmasing sebesar 44%, 45%, dan 11%. Frekuensi genotip pada 154 sampel menunjukkan tingginya keragaman. Berbeda halnya dengan frekuensi genotip pada populasi M. nemestrina yang menunjukkan keragaman yang rendah karena frekuensi genotip L/L yang lebih besar yaitu sebesar 78,18% dibandingkan frekuensi kedua genotip lainnya sebesar 20% untuk genotip L/S dan 1,82% untuk genotip S/S. Inoue-Murayama et al. (2000) juga berhasil mengamplifikasi gen 5-HTT pada
5
beberapa spesies kera, Hylobates, dan manusia. Amplikon berukuran 484 bp mewakili alel dengan 14 daerah perulangan, sedangkan amplikon 528 bp mewakili alel dengan 16 daerah perulangan. Produk sebesar 484 bp mewakili alel S sementara produk lainnya mewakili alel L. Frekuensi genotip pada sampel kera ini juga menunjukkan adanya keragaman. Penelitian yang dilakukan menggunakan sampel M. fascicularis oleh MillerButterworth et al. (2007) tidak menemukan adanya variasi genotip walaupun ditemukan adanya dua macam alel pada produk hasil PCR. Semua sampel yang diamplifikasi dengan menggunakan primer yang sama pada M. nemestrina menunjukkan hasil homozigot. Amplifikasi dengan menggunakan pasangan primer DPF11 sebelumnya telah berhasil dilakukan oleh Inoue-Murayama et al. (2008) pada beberapa primata. Simpanse, gorila, dan orangutan merupakan spesies yang memiliki variasi alel yang tinggi. Sementara pada sampel dari genus Macaca seperti Macaca fuscata dan Erythrocebus patas yang diamplifikasi, tidak ditemukan adanya variasi. Pada sampel M. nemestrina ditemukan adanya variasi genotip pada daerah intron 3 ini. Penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Higley et al. (1996) menyebutkan bahwa adanya hubungan positif antara dominansi dengan aktivitas serotonergik pada M. fascicularis. Keberadaan dari setidaknya satu macam alel S pada daerah promotor gen 5-HTT (dapat berupa genotip S/S atau L/S) dapat mengurangi aktivitas dari promotor dan penurunan aktivitas transkripsi. Alel ini juga terdapat di daerah intron 3 gen 5-HTT, keberadaannya bersama daerah promotor menyebabkan terjadinya penurunan ekspresi dari transporter (Lesch et al. 1996; Heils et al. 1996; Miller-Butterworth et al. 2007). Transporter berfungsi mengatur neurotransmisi serotonergik dengan cara menentukan besar dan lamanya respon serotonin di cairan ekstraselular. Individu dengan alel S memiliki kemampuan yang lebih rendah dalam mentransportasikan kembali serotonin ke dalam sel. Daerah promotor pada gen 5-HTT merupakan daerah yang bertanggung jawab terhadap awal, tempo, dan waktu dari proses transkripsi atau merupakan daerah yang berfungsi sebagai regulator. Variasi atau perbedaan yang ada pada daerah ini akan berpengaruh terhadap kerja dari transporter
secara keseluruhan. Individu dengan sedikitnya satu alel S cenderung memiliki tingkat kecemasan dan ketakutan yang tinggi serta menunjukkan perilaku sosial yang rendah seperti tingkat agresivitas yang tinggi dan interaksi sosial yang rendah, umumnya perilaku bermain, dibandingkan dengan individu dengan genotip L/L (Barr et al. 2003). Dari hasil amplifikasi menggunakan pasangan primer DPF12 hanya ada satu individu mempunyai genotip S/S, sehingga dapat dikatakan individu ini merupakan individu yang dominan dibandingkan individu lainnya. Pada primata, individu yang dominan menempati hirarki yang lebih tinggi dan biasa disebut alfa. Sampel dengan nomor urut 38 merupakan individu jantan, kemungkinan individu ini merupakan jantan alfa di kelompok tersebut. Amplifikasi kedua dengan menggunakan pasangan primer yang didisain untuk mengamplifikasi daerah intron 3 pada gen 5HTT menunjukkan tidak adanya individu yang bergenotip s/s. Walaupun tidak ada individu dengan genotip tersebut, tidak dapat dikatakan bahwa dalam populasi yang diteliti tidak ada individu yang agresif. Interaksi antara variasi yang ada pada daerah promotor dan intron 3 dapat menyebabkan adanya perbedaan sifat agresif dan tingkat sosial dari individu. Hirarki sosial tidak selalu dapat diamati dari ekspresi satu gen saja. Ada banyak faktor yang berpengaruh terhadap hirarki dari primata. Kemungkinan ada efek pleiotropi antara promotor dan intron gen 5HTT, maupun antara promotor gen 5-HTT dan gen-gen lain yang bersifat memacu. Faktor lingkungan dan efek dari gen lain seperti dopamin D4 reseptor juga berpengaruh terhadap hirarki sosial dari seekor hewan (Miller-Butterworth et al. 2007). Meskipun begitu tidak diragukan bahwa variasi genetik dari gen serotonin transporter juga berpengaruh di beberapa fenotip pada Macaca yang mungkin berpengaruh pada status sosial.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Variasi gen 5-HTT (penyandi agresivitas) berhasil diidentifikasi pada satu kelompok M. nemestrina. Varian di daerah promotor dan intron 3 gen ini diwakili oleh alel S dan alel L. Terdapat satu individu dengan genotip S/S.
6
Saran Ekspresi dari satu gen belum tentu berpengaruh terhadap suatu sifat dari organisme tertentu. Kombinasi antar gen mungkin dapat dijadikan alternatif yang baik dalam penentuan sifat agresivitas pada jenis primata.
DAFTAR PUSTAKA Barr CS et al. 2003. The utility of nonhuman primate model for studying gene by environment interactions in behavioral research. Genes Brain Behav 2:336-340. Baron RA, Richardson DR. 1994. Human Aggression. 2nd Edition. New York: Plenum. Dolhinow P, Fuentes A. 1999. The Nonhuman Primates. California: Mayfield Publishing Company. Drea CM, Kim W. 1999. Low-status monkeys “play dumb” when learning in social groups. PNAS 22:12965-12969. Eimerl S, De Vore I. 1980. Primates. Jakarta: Pustaka Alam Life. Else JG, Lee PC. 1987. Primate Ontogeny, Cognition and Social Behavior. London: Cambridge University. Fooden J. 1975. Taxonomy and Evolution of Liontail and Pigtail Macaques (Primates: Cercopithecidae). Field Museum of Natural History: Chicago. Heils A et al. 1996. Allelic variation of human serotonin transporter gene expression. J Neurochem 6: 26212624. Higley JD et al. 1996. Stability of interindividual differences in serotonin functions and its relationship to severe aggression and competent social behavior in rhesus macaque females. Neuropsychopharmacology 14:67-76. Inoue-Murayama et al. 2000. Allelic variation of the serotonin transporter gene polymorphic region in apes. Primates 41(3): 267-273. Inoue-Murayama et al. 2008. Interspecies and intraspecies variations in the serotonin transporter gene intron 3 VNTR in nonhuman primates. Primates 49: 139-142.
Iskandar E. 1998. Studi tingkah laku seksual pasangan Macaca nemestrina dan Macaca fascicularis dewasa di pusat studi satwa primata LP-IPB, Bogor [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana. Institut Pertanian Bogor. Izquierdo A et al. 2007. Genetic modulation of cognitive flexibility and socioemotional behavior in rhesus monkeys. PNAS 104: 1412814133. Kasai K, Nakamura Y, White R. 1990. Amplification of variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science. J Forensic Sci 35 (5): 196-200. Lekagul B, McNeely JA. 1977. Mammals of Thailand. Bangkok: Assosiation for Conservation of Wild Life. Lesch et al. 1996. Association of anxietyrelated traits with a polymorphism in the serotonin transporter gene regulatory region. Science 274: 1527-1531. Lesch et al. 1997. The 5-HT transporter gene-linked polymorphic region (5-HTTLPR) in evolutionary perspective: alternative biallelic variation in rhesus monkeys. J Neural Transm 104: 1259-1266. Miller-Butterworth CM et al. 2007.The serotonin transporter: sequence variation in Macaca fascicularis and its relationship to dominance. Behav Genet 37:678-696. Murphy DL et al. 2004. Serotonin transporter: gene, genetic disorder, and pharmacogenetic. Mol Interv 4(2):109-123. Napier JR, Napier PH. 1967. A Handbook of Living Primates. London: Academic. Napier JR, Napier PH. 1985. The Natural History of Primates. Massachusetts: The MIT press. Nei M. 1987. Molecular Evolutionary Genetics. New York: Columbia University. Oi T. 1990. Patterns of dominance and affiliation in wild pig-tailed macaque in Sumatra Barat. International Journal of Primatology 11 (4): 339-356.
7
Smuts BB et al. 1987. Primate Societies. Chicago: The University of Chicago. Tegëlstrom H. 1986. Mitochondrial DNA in natural populations: An improved routine for the screening of genetic variation based on sensitive silver staining. Electrophoresis 7:226229.
Ting-Ting L, En-Min Y, Kirk Lin Y. 2009. Social and Genetic Mating Systems of the Asian Lesser White-toothed Shrew, Crocidura shantungensis, in Taiwan. J Mammal 90 (6): 13701380. Zeanah CH. 2005. Handbook of Infant Mental Health. 2nd Edition. New York: The Guilford.
