8/4/2015
VALIDASI & VERIFIKASI METODA MIKROBIOLOGI M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari 1
Penentu Kehandalan Analisis Mikrobiologi Metode Analisa
Peralatan
• Metode Standar • Modifikasi • Penyederhanaan
Analis/Pelaksana
• Neraca
• Pengetahuan
• LAF
• Ketrampilan/kompeten
• Pipet
• Ketelitian
• Inkubator • Autoklaf
VALIDASI & VERIFIKASI METODE
KALIBRASI
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
TRAINING & UJI KOMPETENSI
1
8/4/2015
Jenis Metode Uji Metode Standar : SNI, ASTM, ISO, dll Metode Resmi : Farmakope, EPA, dll Metode yang dikembangkan oleh organisasi profesional yang memiliki reputasi nasional dan internasional : AOAC, BAM Metode Pustaka In house methode Metode Modifikasi
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari 3
Pemilihan Metode Faktor yang menjadi pertimbangan : Asal metode Status metode Apakah lab. menguasai teknologinya ? Apakah SDM/Analis kompeten ? Biaya & waktu yang dibutuhkan Metode mudah diaplikasikan Kondisi akomodasi & peralatan lab. memadai ? M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
4
2
8/4/2015
Proses untuk mengkorfimasi bahwa suatu metoda mempunyai unjuk kerja yang konsisten, sesuai dengan apa yang dikehendaki dalam penerapan metode,,,,
Apa itu Validasi ??? M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari 5
Kapan Validasi dilakukan ?? Metode non standar Reagent Baru
VALIDASI METODE
Menyederhanakan Metode
In house Method Validasi harus dilakukan sebelum setiap metode non standar digunakan secara RUTIN di Laboratorium M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo 6
3
8/4/2015
Mengapa dilakukan Validasi ??? ISO/IEC 17025-2005, elemen 5.4 Metode uji & Validasi metode. Banyak lab. menggunakan metode uji dari manual book/alat bukan metode standar/resmi (SNI, ISO, AOAC, BAM, USP,dll). Lab. di daerah kesulitan mendapatkan reagensia/media tertentu biaya, ED singkat memangkas metode standar. In house method sebagai alternatif yaitu dengan memodifikasi metode standar. Bukti metode baru dapat digunakan/diadopsi oleh Lab dengan mengevaluasi kemampuan kinerja metode uji,,, M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
7
Apa yang akan dibuktikan dalam Validasi ? membuktikan bahwa metoda baru dapat menghasilkan paling tidak hasil yang sebanding dengan Metoda Standar yang dikenal (Australian Standar, ISO standar, BAM, AOAC method, dll). mempunyai tingkat sensitifitas & spesifisitas yang sama & dapat diterapkan dalam kisaran matrik contoh yang biasa diterima laboratorium untuk pengujian m.o. M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
8
4
8/4/2015
Konfirmasi melalui pengujian dan penyajian bukti bahwa persyaratan yang telah ditetapkan telah di penuhi
Apa itu Verifikasi ??? M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari 9
Apa yang akan dibuktikan dalam Verifikasi ? Membuktikan bahwa metoda standar yang digunakan telah sesuai dengan kriteria yang ditetapkan,, Mempertimbangkan dan memastikan apakah metode uji tersebut dapat dipakai atau tidak M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo 10
5
8/4/2015
METODA PENGUJIAN mikrobiologi Kuantitatif Hitungan Cawan - Pour plate : TPC, Y&M, Coliform, Enterobacteriaceae - Spread Plate : S.aureus, B.cereus MPN
: Coliform, E.coli
Petrifilm
: TPC, Y&M, Coliform
dll
•Kualitatif Isolasi - Salmonella - Vibrio Cholera - L.monocytogenes - dll M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
11
Parameter Validasi & Verifikasi Metode Uji
Kuantitatif Presisi Akurasi
Kualitatif Sensitifitas Spesifisitas False Positif False Negatif Efficiency
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
12
6
8/4/2015
Presisi Kedekatan hasil antara beberapa hasil pengukuran ulang yang diukur dengan cara yang sama. Parameter : Relatif Standar Deviasi Koefisien Variasi Repeatability Waktu analisa, alat, penguji/analis sama dalam laboratorium yang sama. Intermediate Precision Waktu analisa atau alat atau penguji/analis beda dalam laboratorium yang sama (variasi inter laboratorium) Reproducibility Waktu analisa, alat, penguji/analis beda dalam laboratorium yang berbeda. M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
13
Presisi
RSD =
∑ ((Log a – log b) / x1)2 2n
CV (coefisien of variation) = RSD x 100%
Syarat : RSD = max. 0,1 (ideal < 0,02) CV = max.10 % M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
14
7
8/4/2015
Akurasi
Kedekatan hasil analisis dengan nilai sebenarnya. Parameter : Recovery (Perolehan Kembali) Teknik analisis yang dilakukan dengan menambahkan kultur acuan pada konsentrasi tertentu dalam suatu matriks contoh. Perhitungan H x 100 % A H = Hasil pengujian dengan metode (sample + spike) sample A = Hasil sebenarnya dari MO target (spike) Syarat : > 70 % Catatan : Gunakan sample yang tidak mengandung MO M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
15
Sensitifity : kemampuan metoda dalam memberikan hasil positif terhadap sampel yang positif Spesificity : kemampuan metoda dalam memberikan hasil negatif terhadap sampel yang negatif False positive rate : persentase jumlah sampel yang salah identifikasi sebagai positif False negative rate : persentase jumlah sampel yang salah identifikasi sebagai negatif Confidence limit :95 % M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
16
8
8/4/2015
Tahapan Validasi/Verifikasi Memilih Organisme Uji Memilih matriks sample Melakukan pengujian sesuai prosedur Interpretasi hasil
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
17
Syarat,,,, Menggunakan terkalibrasi
peralatan
yang
Dilakukan oleh personil yang kompeten Media/Reagent yang digunakan sesuai spesifikasinya. Kondisi lingkungan memadai
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
18
9
8/4/2015
Memilih Organisme Uji Sesuai SR 02 - MO acuan berasal dari koleksi yang diakui
- Menjamin ketertelusuran - Dipelihara oleh Penanggungjawab MO acuan - Pemeliharaan sebagai berikut :
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
19
Strain (ATCC, NTCC) Subkultur sekali
* Persediaan acuan (Liofilisasi)
Dicairkan
Kultur kerja
* (Penggunaan rutin) * : uji kemurnian
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
20
10
8/4/2015
Memilih Organisme Uji 3-5 strain untuk validasi dan min. 1 strain untuk verifikasi dari organisme target. Kultur acuan yang dinyatakan sebagai kontrol positif harus merupakan salah satu dari strain tersebut. Strain yang lain dipilih dari hal berikut : Strain dari organisme target yang diisolasi oleh laboratorium dari sampel terdahulu dalam matrik yang diperiksa. Strain dari organisme target yang dikumpulkan oleh cultur collection. M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
21
Memilih Matrik Sampel Tujuan seleksi sampel adalah untuk memilih sampel yang mewakili lingkup variasi yang akan ditemui dalam matriks yang telah ditentukan. Dapat menggunakan sample yang tercemari secara alami atau dapat menggunakan sample yang dicemari (spike sample). Perhatian harus diutamakan pada mendeteksi jumlah dan homogenitas kontaminan. M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo 22
11
8/4/2015
Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke 1 1 loop
Biakan murni dalam agar miring
Inkubasi selama 18-24jam pada suhu 35-37 0C
BHIBroth/media lainnya 10 ml
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
23
Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke 2 10-1
1 ml BHI-Broth 10 ml Hit. Jumlah koloni/ml
10-2
1 ml
BPW 9 ml
10-3
1 ml
BPW 9 ml
Dst 10-7 .
1 ml
BPW 9 ml
10-8
1 ml
BPW 9 ml
10-9
1 ml
BPW 9 ml
BPW 9 ml
1 ml Inkubasi selama 48 jam pada suhu 36±1 0C M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
24
12
8/4/2015
Metode Spike Sample Menghitung Populasi pada Biakan Murni Hari ke 4 Menghitung jumlah bakteri dalam cawan petri Ulangan
10-7
10-8
10-9
Hasil
1
241
24
3
2,4 x 109 kol/ml
2
238
22
2
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
25
Persiapan matriks Pipet 100 gr/ ml sample
900 ml BPW (Buffer Peptone Water)
Homogenisasi Catatan,,, Gunakan sample yang tidak tercemari MO target M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
26
13
8/4/2015
Pembuatan Spike Populasi Rendah Dst 10-2 . 10-8
10-1
1 ml BHI-Broth 10 ml
90 ml sample 1 ml
BPW 9 ml
1 ml
BPW 9 ml
10 ml
BPW 9 ml
Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi rendah (2 kol/ml atau/gr) M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
27
Pembuatan Spike Populasi Sedang Dst 10-2 . 10-7
10-1
1 ml BHI-Broth 10 ml
90 ml sample 1 ml
BPW 9 ml
1 ml
BPW 9 ml
10 ml
BPW 9 ml
Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi sedang (2,0 x 101 kol/ml atau/gr)
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
28
14
8/4/2015
Pembuatan Spike Populasi Tinggi
10-1
1 ml BHI-Broth 10 ml
10-2
1 ml
BPW 9 ml
BPW 9 ml
10-6
1 ml BPW 9 ml
90 ml sample
10 ml
Didapatkan 1 : 10 spike sample populasi tinggi (2,0 x102 kol/ml atau /gr) M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
29
Prosedur Validasi & Verifikasi Kuantitatif (Hitungan Cawan) - Lakukan pengujian sedikitnya 15 kali
(perkiraan populasi pada contoh : rendah, sedang, tinggi) - Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila
menggunakan metode spike sample) atau tidak mengandung organisme target.
- Hitung RSD dari masing-masing populasi dan gabungan
semua populasi.
Catatan. Jika dilakukan oleh analis berbeda, dapat dihitung presisi dari masingmasing analis untuk mengetahui kinerja analis M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
30
15
8/4/2015
Kuantitatif MPN (Most Probable Number) Kriteria Sensitifity Spesificity False positive rate False negative rate Efficiency Confidence limit :95 %
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo 31
Prosedur Siapkan sampel (kontaminasi alami atau sengaja) sesuai prosedur. Inokulasi larutan contoh pada media atau tabung-tabung pertumbuhan. Hitung jumlah tabung yang positif dan negatif. Konfirmasi dengan uji biokimia terhadap koloni yang terdapat pada cawan atau setiap tabung yang positif dan negatif. Hitung Sensitifity, Spesificity, False Positif, False Negatif, dan Efficiency. M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo 32
16
8/4/2015
Konfirmasi Validasi Semua presumptive positive dan negative harus dikonfirmasi
Verifikasi Semua presumptive positive yang dikonfirmasi M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari 33
Perhitungan Confirmed
Presumtive Positif
Negatif
Positif
A (positive)
B (false negative)
Negatif
C (false positive)
D (negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100
Efficiency = (a+d)/n x 100
Spesifitas = D/(C+D) x 100 False positive rate = c/(a+c) x 100 False negatif rate = b/(b+d) x 100 Jumlah tabung : a + b + c + d = n M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo 34
17
8/4/2015
Kualitatif Lakukan pengujian sedikitnya 10 kali (perkiraan populasi pada contoh : rendah dan tinggi) - Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila menggunakan metode spike sample) atau tidak mengandung organisme target. -Hitung Sensitifity, Spesificity, False Positif, False Negatif, dan Efficiency M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari 35
Penghitungan Verifikasi Confirmed
Presumtive positif negatif A (positive)
positif negatif
C (false positive)
B (false negative) D (negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100 Spesifitas = D/(C+D) x 100
Jumlah contoh : a + b + c + d = n
False positive rate = c/(a+c)
Efficiency = (a+d)/n x 100
False negatif rate = b/(b+d) M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
36
18
8/4/2015
Perhitungan Validasi Confirmed
Metoda non standar positif negatif
positif negatif
A (positive)
B (false negative)
C (false positive)
D (negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100 Spesifitas = D/(C+D) x 100 False positive rate = c/(a+c) x 100
Jumlah contoh : a + b + c + d = n Efficiency = (a+d)/n x 100
False negatif rate = b/(b+d) x 100 M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari 37
Method Validation of Microbiological Methods, Guidance Note : C & B and ENV 002. Singapore Acreditation Council, July 2002 M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari Embrio Biotekindo
38
19
8/4/2015
Kapan Validasi kultur Media dilakukan ? Kultur media diganti dengan media baru (XLD Agar diganti dengan Rambach Agar) Kultur media diganti dengan brand lain (OXOID diganti dengan MERCK) Kultur media diganti dengan non kultur test (XLD diganti dengan Singlepath Salmonella) Metode kultur diganti dengan metode lain Mis. ELISA, PCR 39
Performance Kultur Media Misalnya : media Baird Parker Agar untuk pengujian S.aureus Reference media : TSA
Parameter
Strain
Uji
Kriteria
Karakteristik koloni
Produktivitas
S.aureus ATCC 25923
Kuantitatif
> 0,5
Black colonies with lightening halo
Selektivitas
E.coli ATCC 25922
Kualitatif
Total penghambat
-
S.epidermidis ATCC 12228
Kualitatif
-
Black colonies without lightening halo
Elektivitas
PRoduktivitas = Test method Reference method Non Selektif : > 0.7 40
20
8/4/2015
The end….. M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan Embrio Biotekindo dalam ijin tertulis dari menggandakan Mbentuk -BRIO apapun Trainingtanpa Proprietary - dilarang dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
16 41
21
