7
Uji in Vitro Ekstrak sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas (Han et al. 2005) Metode uji inhibisi yang digunakan berdasarkan pada metode yang digunakan oleh Han et al. (2005) dengan beberapa modifikasi. Sebanyak 1 mL campuran dari ekstrak dengan berbagai konsentrasi, 10 µg albumin 10% (b/v), lipase pankreas murni dengan konsentrasi 1,4 × 10-4 µg/µL, dan bufer fosfat pH 8 dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 40○C selama 45 menit. Setelah itu ditambahkan kloroform sebanyak 3 mL. Larutan kemudian dipisahkan dengan sentrifus selama 5 menit. Lapisan klorofom kemudian diambil sebanyak 1,0 mL dan ditambahkan larutan kloroformheptana (1:1) sebanyak 4 mL, lalu dikocok hingga homogen. Setelah homogen, ke dalam larutan ditambahkan pereaksi tembaga sebanyak 2,5 mL, dikocok selama 3 menit, lalu dimasukkan ke dalam sentrifus selama 10 menit. Setelah itu, lapisan kloroform diambil sebanyak 3 mL, kemudian larutan natrium dietilditiokarbamat 0,25% (v/v) dalam butanol ditambahkan sebanyak 0,25 mL hingga terbentuk larutan berwarna kuning. Selanjutnya, absorbans larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 435 nm. Absorbans yang diperoleh dikonversi hingga diperoleh nilai aktivitas enzim dan daya inhibisi ekstrak. Hal yang sama dilakukan untuk kontrol positif (Xenical®), sedangkan untuk kontrol negatif dilakukan tanpa penambahan larutan ekstrak. Bagan alir uji inhibisi ekstrak diperlihatkan pada Lampiran 5. Penentuan Kadar Flavonoid Total (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005) Metode ini berdasarkan pada Codex (1986) diacu dalam Nobre et al. (2005). Ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi terhadap aktivitas lipase pankreas dari setiap contoh ditimbang dengan bobot yang setara dengan 200 mg serbuknya, kemudian ekstrak tersebut dimasukkan ke dalam sistem hidrolisis yang berupa 1,0 mL larutan heksametilenatetramina 0,5% (b/v), 20 mL aseton, dan 2 mL HCl 25% dalam labu bulat. Hidrolisis ekstrak dilakukan dengan pemanasan menggunakan refluks selama 30 menit. Filtrat hasil hidrolisis disaring menggunakan kapas ke dalam labu takar 100 mL, sedangkan residunya ditambah 20 mL aseton dan direfluks kembali selama 30 menit. Filtrat digabungkan, sedangkan residunya ditambah 20 mL aseton dan dihidrolisis
kembali. Filtrat digabungkan kembali, dan larutan ditera dengan aseton. Sebanyak 20 mL filtrat hasil hidrolisis dan 20 mL akuades dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian diekstraksi dengan etil asetat (ekstraksi yang pertama dengan 15 mL etil asetat, ekstraksi kedua dan ketiga dengan 10 mL etil asetat). Fraksi etil asetat dikumpulkan dalam labu takar 50 mL, kemudian larutan ditera dengan etil asetat. Selanjutnya, larutan tersebut diambil 10 mL ke dalam labu takar 25 mL, direaksikan dengan AlCl3 2% (b/v) 1 mL, dan ditera dengan larutan asam asetat glasial dalam metanol 5% (v/v). Pengukuran larutan dilakukan pada panjang gelombang 370,8 nm. Standar dibuat dengan kuersetin murni ditimbang 0,0026 g kemudian dilarutkan dengan asam asetat glasial dalam metanol 5% (v/v) dalam labu takar 50 mL, kemudian dibuat deret standarnya dengan konsentrasi 0; 0,5; 2,5; 5,0; 7,5; dan 10 ppm. Bagan alir penentuan kadar flavonoid total diperlihatkan pada Lampiran 7.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Contoh Penetapan kadar air dari buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur dilakukan untuk mengetahui kadar air masingmasing contoh sehingga dapat diperkirakan penanganan terbaik bagi contoh dalam hal penyimpanan. Contoh dikatakan dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama apabila kadar airnya <10%. Kadar air buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur masing-masing sebesar 18,7% (b/b), 9,59% (b/b), dan 8,60% (b/b) (Lampiran 8). Hasil penentuan kadar air tersebut menunjukkan bahwa buah asam gelugur tidak baik untuk disimpan dalam jangka waktu yang lama karena memiliki kadar air >10% atau diperlukan penanganan khusus dalam penyimpanannya. Penanganan tersebut dapat dilakukan dengan pengeringan lebih lanjut hingga kadar airnya <10% dan tidak menyimpannya pada tempat yang lembab. Ekstraksi Metode ekstraksi ini berdasarkan pada penelitian Padikkala & Achuthan (1997) dengan beberapa modifikasi. Padikkala & Achuthan (1997) menggunakan nisbah antara contoh dan pelarut etanol 70% sebesar 1:10 sedangkan pada penelitian ini menggunakan nisbah 1:8 dengan pelarut etanol 70% dan air bebas ion. Ekstraksi contoh menggunakan air
8
dan etanol dilakukan karena air merupakan pelarut yang biasa digunakan masyarakat untuk mengambil ekstrak dari obat-obatan tradisional (jamu) sedangkan etanol merupakan pelarut yang umum digunakan pada industri farmasi. Menurut Harborne (1987) alkohol merupakan pelarut serba guna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan. Selain itu, menurut Darusman et al. (2001) etanol adalah pelarut yang umum digunakan dalam pembuatan jamu dan obat-obatan fitofarmaka. Maserasi dimaksudkan untuk dapat mengekstrak keseluruhan senyawa yang larut dalam pengekstrak yang digunakan. Rendemen yang dihasilkan dikoreksi dengan nilai kadar air contoh pada bentuk serbuk kering (simplisia). Nilai rendemen yang diperoleh dari hasil ekstraksi pada ketiga contoh tanaman terhadap bentuk simplisianya tersaji pada Lampiran 9 dan grafiknya diperlihatkan pada Gambar 4. 30.0 25.0
26.2 23.7 21.1
20.0 15.0 10.1
10.0
7.56 4.78
5.0 0.0 AG
EG
AL
EL
AK
EK
Ekstrak contoh
Gambar 4 Rendemen berbagai macam ekstrak contoh. : AG (ekstrak air buah asam gelugur); : EG (ekstrak etanol buah asam gelugur); : AL (ekstrak air lengkuas); : EL (ekstrak etanol lengkuas); : AK (ekstrak air kencur); : EK (ekstrak etanol kencur).
Ekstrak etanol buah asam gelugur menghasilkan rendemen yang paling tinggi dari semua ekstrak contoh, yaitu mencapai 26,2%. Rendemen ekstrak etanol ketiga contoh lebih besar dibandingkan rendemen ekstrak airnya. Hal ini menunjukkan bahwa etanol dapat mengekstrak lebih banyak komponen dalam contoh daripada air karena etanol mampu melarutkan senyawa polar dan nonpolar sehingga hampir semua komponen contoh ikut terekstrak. Uji Fitokimia Uji fitokimia bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dan golongan senyawa bioaktif yang terkandung di dalam setiap ekstrak contoh. Dari hasil uji fitokimia ini dapat diduga golongan senyawa
yang berperan dalam menghambat aktivitas lipase pankreas. Hasil uji fitokimia terhadap buah asam gelugur (Tabel 1) menunjukkan bahwa buah asam gelugur kering hanya mengandung alkaloid dan saponin. Saponin dalam buah gelugur diduga lebih banyak terdapat dalam bentuk glikosida sehingga hanya dapat terekstrak dengan air, sedangkan alkaloidnya bersifat lebih nonpolar sehingga lebih terekstrak oleh etanol. Tidak terdeteksinya senyawa metabolit sekunder lainnya dalam buah asam gelugur kering maupun ekstrak air dan etanolnya dapat disebabkan kadar senyawa-senyawa tersebut di dalam buah asam gelugur kering dan ekstraknya sangat sedikit atau berkurang akibat pengeringan. Oluyemi et al. (2007) menyebutkan bahwa dalam marga Garcinia lainnya, yaitu G. kola terkandung senyawa aktif biflavonoid yang berpotensi sebagai antioksidan. Asam gelugur baik dalam bentuk kering, ekstrak air, maupun ekstrak etanol tidak terdeteksi adanya flavonoid. Jenis tanaman yang berbeda dapat menyebabkan perbedaan kandungan senyawa metabolit sekundernya walaupun masih dalam satu marga. Perbedaan ini juga dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan tempat tanaman tersebut tumbuh. Jumlah flavonoid yang sangat sedikit dalam ekstrak dapat menyebabkan flavonoid tidak terdeteksi pada uji kualitatifnya. Tabel 1 Hasil uji fitokimia buah asam gelugur Asam gelugur Ekstrak Golongan senyawa kering Air Etanol Alkaloid + ++ Saponin + + Tanin Flavonoid Triterpenoid Steroid Kuinon Tabel 2 Hasil uji fitokimia rimpang lengkuas Golongan Lengkuas Ekstrak senyawa kering Air Etanol Alkaloid + + + Saponin ++ +++ ++ Tanin Flavonoid +++ ++ +++ Triterpenoid + Steroid + Kuinon + + -
9
Uji fitokimia terhadap rimpang lengkuas (Tabel 2) dan kencur (Tabel 3) menunjukkan bahwa golongan senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam lengkuas dan kencur yang terekstrak dengan etanol lebih banyak daripada yang terekstrak dengan air secara kualitatif. Hal ini dikarenakan sifat alkohol yang mampu melarutkan senyawa polar dan nonpolar. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa lengkuas kering mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, triterpenoid, dan kuinon. Hasil uji fitokimia tersebut sejalan dengan yang dikemukakan BPOM (2004) bahwa lengkuas mengandung flavonoid dan terpenoid yang berupa minyak atsiri. Flavonoid lengkuas terdiri atas kaemferol, galangin, kuersetin dan mirisetin. Uji steroid menunjukkan hasil yang negatif pada serbuk lengkuas kering, akan tetapi positif pada ekstrak etanolnya. Hal ini dapat terjadi karena jumlah steroid yang merupakan salah satu jenis triterpenoid dalam lengkuas sangat sedikit dan jenis steroid tersebut bersifat cendenrung nonpolar sehingga tidak terekstrak oleh air melainkan oleh etanol. Menurut Rahayu (2000), selain flavonoid dan terpenoid, lengkuas juga mengandung saponin dan tanin, akan tetapi pada uji tanin diperoleh hasil yang negatif. Perbedaan metode ekstraksi, lamanya waktu ekstraksi, dan perbandingan antara contoh yang diekstraksi dengan pelarut juga dapat menyebabkan perbedaan besarnya kadar suatu senyawa dalam ekstrak. Oleh karena itu, tidak terdeteksinya tanin dalam ekstrak dapat disebabkan jumlah tanin di dalam ekstrak sangat sedikit. Tabel 3 Hasil uji fitokimia rimpang kencur Golongan Kencur Ekstrak senyawa kering Air Etanol Alkaloid + + Saponin ++++ ++++ Tanin Flavonoid ++ + Triterpenoid Steroid ++ ++ Kuinon + + + Berdasarkan hasil uji fitokimia, serbuk kencur kering mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, steroid, dan kuinon. Saponin kencur terekstrak baik oleh air karena sifatnya yang polar. Busa yang dihasilkan dari hasil uji saponin pada ekstrak air kencur dan serbuk keringnya lebih banyak dan stabil dibandingkan dengan ekstrak contoh lainnya
sehingga diduga kencur mengandung saponin dengan kadar yang lebih tinggi dibandingkan kelima ekstrak lainnya secara kualitatif. Ekstrak etanol kencur mengandung alkaloid, flavonoid, dan kuinon yang rendah secara kualitatif. Menurut BPOM (2004) ekstrak etanol kencur banyak mengandung minyak atsiri dengan komponen etil-pmetoksisinamat dan etil sinamat. Minyak atsiri kencur memiliki bagian utama yang sama dengan triterpenoid, yaitu terpenoid. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa triterpenoid tidak terdeteksi baik pada serbuk kencur kering maupun kedua ekstraknya. Senyawa aktif lainnya, yaitu steroid di dalam ekstrak etanol kencur secara kualitatif lebih banyak daripada ekstrak contoh lainnya. Hasil uji tanin pada kencur baik yang berupa serbuk kering maupun ekstraknya menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini menunjukkan bahwa rimpang kencur tidak mengandung tanin atau kadar tanin dalam ekstrak sangat rendah. Uji Toksisitas Uji toksisitas dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui bioaktivitas dan toksisitas dari setiap ekstrak sebelum dilakukan uji aktivitas. Uji ini dilakukan menggunakan larva udang karena lebih ekonomis dan cukup akurat sebagai uji toksisitas awal. Hasil uji toksisitas yang berupa nilai konsentrasi letal 50% (LC50) akan digunakan untuk menentukan batas konsentrasi ekstrak pada uji aktivitasnya sebagai inhibitor lipase pankreas. Hasil uji toksisitas dari keenam ekstrak diperlihatkan pada Lampiran 10, sedangkan nilai LC50 ekstrak contoh tersaji pada Tabel 4. Tabel 4 Nilai LC50 ekstrak air dan etanol contoh terhadap larva udang Contoh Ekstrak LC50 (ppm) Asam gelugur Air 117,63 Etanol 103,64 Lengkuas Air 547,23 Etanol 1445,5 Kencur Air 1142,7 Etanol 47,974 Berdasarkan hasil tersebut dapat diketahui bahwa ekstrak etanol kencur memiliki bioaktivitas yang paling tinggi karena memiliki nilai LC50 yang paling rendah, yaitu 47,974 ppm. Menurut Meyer at al. (1982), suatu ekstrak tanaman dapat dikatakan memiliki bioaktivitas yang tinggi apabila memiliki nilai LC50 <1000 ppm. Dengan demikian, ekstrak etanol lengkuas dan ekstrak
10
air kencur dapat dikatakan mempunyai potensi bioaktif yang rendah karena untuk mematikan 50% populasi larva udang diperlukan konsentrasi ekstrak yang mencapai <1000 ppm. Akan tetapi, ekstrak dengan bioaktivitas tertinggi belum tentu memiliki nilai daya inhibisi tertinggi dalam uji inhibisi. Hal ini disebabkan nilai LC50 yang diperoleh hanya digunakan sebagai batas maksimum konsentrasi ekstrak pada uji inhibisi dan belum diketahui secara pasti mengenai hubungan antara nilai LC50 terhadap aktivitas (daya inhibisi) suatu ekstrak. Buah asam gelugur (Garcinia atroviridis) yang memiliki kandungan utama asam hidroksisitrat (HCA) memiliki nilai LC50 untuk ekstrak air dan etanolnya, masingmasing 117,63 ppm dan 103,64 ppm. Marga Garcinia lainnya dengan kandungan utama yang sama, yaitu Garcinia cambogia diketahui mempunyai dosis letal 50% (LD50) pada tikus >2000 mg/Kg dengan perlakuan menggunakan suntik ke dalam pembuluh darah dan >4000 mg/Kg melalui oral (Anonim 2007). Nilai LC50 tersebut tidak dapat digunakan sebagai batas konsentrasi untuk konsumsi, akan tetapi diperlukan penelitian lebih lanjut secara in vivo untuk menentukan ekstrak agar diketahui nilai LD50 keamanannya secara pasti dalam tujuannya dikonsumsi lebih lanjut sebagai obat. Uji in Vitro Ekstrak sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas Metode uji inhibisi yang digunakan mengacu pada metode yang digunakan oleh Han et al. (2005) dengan beberapa modifikasi. Han et al. (2005) menggunakan substrat triolein, bufer N-tris-(hidroksimetil)-metil-2aminoetana-asam sulfat pada pH 7,0, suhu 37 °C dengan waktu inkubasi 30 menit, dan larutan pengkompleks warna batokuproin dalam kloroform 0,05% (b/v). Penelitian ini menggunakan standar asam oleat (4,25 µmol) dengan serapan sebesar 0,041 dan substrat yang berupa minyak wijen dengan konsentrasi 16,2 µg/µL. Minyak wijen digunakan karena memiliki kandungan utama berupa asam oleat dan linoleat. Lipase yang digunakan adalah lipase pankreas manusia dengan konsentrasi 1,4 × 10-5 µg/µL. Uji aktivitas ini dilakukan pada kondisi optimum kinerja lipase pankreas, yaitu pada pH 8, suhu 40 °C, dan waktu inkubasi selama 45 menit berdasarkan hasil optimalisasi aktivitas lipase pankreas oleh Silitonga (2008). Aktivitas lipase ditentukan dengan mengukur laju asam oleat yang dihasilkan dari hidrolisis minyak wijen yang
dinyatakan dalam μmol asam oleat/L menit dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 435 nm. Ekstrak yang ditentukan daya inhibisinya dilarutkan dalam bufer fosfat pH 8 dan setelah diinkubasi, reaksi hidrolisis lipase pankreas dihentikan dengan penambahan kloroform. Campuran pelarut organik kloroform dan heptana (1:1) berfungsi untuk mengekstrak asam oleat yang terbentuk sebagai hasil hidrolisis minyak wijen, sedangkan pereaksi tembaga berfungsi untuk mengikat asam oleat bebas. Larutan natrium dietilditiokarbamat akan membentuk kompleks warna kuning dengan lapisan kloroform-heptana yang mengandung asam oleat. Daya inhibisi ekstrak ditentukan dengan membandingkan selisih aktivitas lipase pada blanko (tanpa ekstrak) dengan ekstrak, terhadap aktivitas lipase blanko (Lampiran 11). Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini adalah Xenical® yang merupakan produk pelangsing komersial yang banyak digunakan masyarakat. Xenical® digunakan karena mempunyai kandungan utama orlistat (tetrahidrolipstatin) yang merupakan salah satu inhibitor lipase pankreas yang bersifat selektif irreversibel yang pertama kali ditemukan (Hadvary et al. 1988). Selain itu, berdasarkan pada penelitian Cariere (2001) telah diketahui bahwa orlistat menginhibisi lipase pankreas melalui mekanisme inhibisi nonkompetitif. Larutan blanko (tanpa penambahan ekstrak) digunakan sebagai kontrol negatif. Uji inhibisi ini menggunakan lima ragam konsentrasi yang sama untuk semua ekstrak yaitu dari 100-300 ppm dengan interval 50 ppm. Ragam konsentrasi ini dimaksudkan untuk melihat hubungan penambahan konsentrasi ekstrak terhadap daya inhibisi yang dicapai. Bagi beberapa ekstrak diketahui ragam konsentrasi tersebut melebihi nilai LC50nya. Hal ini dilakukan karena hubungan antara nilai LC50 dengan nilai daya inhibisi ekstrak belum diketahui secara pasti. Daya inhibisi ekstrak dengan pelarut yang sama pada kelima ragam konsentrasi (Gambar 5 dan 6) memperlihatkan bahwa ekstrak etanol dan air ketiga tanaman cenderung berpotensi sebagai inhibitor aktivitas lipase pankreas karena telah dapat menginhibisi aktivitas lipase pankreas mulai dari konsentrasi 100-300 ppm. Kemampuan ini menyerupai kemampuan CT-II, suatu fraksi dari ekstrak air tanaman Cassia mimosoides yang mampu menginhibisi 50% aktivitas lipase pankreas porsin (0,071 mg/mL) pada
11
27 .8
10 .6
14 .9
25 .5
22 .0
29 .7
17 .6
20.0
10 .6
19 .9
30.0
28 .2 32 .2
Daya inhibisi (%)
30 .3
40.0
35 .9
41 .3 41 .9
50.0
300
250
200
100
300
250
200
150
100
300
250
200
150
100
-10.0
Kontrol (+)
0.0
150
-4 .6
10.0
Konsentrasi (ppm)
Gambar 5 Grafik daya inhibisi kontrol positif, ekstrak air buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur terhadap aktivitas lipase pankreas. : kontrol positif; : ekstrak air asam gelugur; : ekstrak air lengkuas; : ekstrak air kencur. 86 .3
100.0
56 .2
15 .1
300
250
200
100
300
250
200
150
-5 .4
-1 1. 2
23 .4
23 .4
150
100
300
250
200
150
100
Kontrol (+)
0.0 -20.0
26 .1
37 .6
48 .5
-3 .3
20.0
24 .3
40.0
30 .9
41 .5
46 .7
60.0
10 .6
Daya inhibisi (%)
80.0
Konsentrasi (ppm)
Gambar 6 Grafik daya inhibisi kontrol positif, ekstrak etanol buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur terhadap aktivitas lipase pankreas. : kontrol positif; : ekstrak air asam gelugur; : ekstrak air lengkuas; : ekstrak air kencur. konsentrasi 100 ppm (Yamamoto et al. 2000). Berdasarkan gambar tersebut diketahui bahwa hubungan antara konsentrasi keenam ekstrak dengan daya inhibisinya terhadap aktivitas lipase pankreas tidak linier. Kenaikan konsentrasi ekstrak tidak selalu diiringi dengan kenaikan daya inhibisinya. Hal ini disebabkan ekstrak yang digunakan masih berupa ekstrak kasar yang terdiri atas beberapa golongan senyawa yang diduga memiliki respon berbeda yang saling mempengaruhi satu sama lain, baik berupa pengaruh sinergis maupun antagonis dalam menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi tertentu.
Ekstrak air dari ketiga contoh cenderung menginhibisi aktivitas lipase pankreas pada kelima ragam konsentrasi, kecuali ekstrak air kencur pada konsentrasi 150 ppm memperlihatkan potensinya sebagai aktivator lipase pankreas karena memiliki daya inhibisi sebesar -4,6%. Potensi yang sama juga dimiliki oleh ekstrak etanol lengkuas pada konsentrasi 250 dan 300 ppm, serta ekstrak etanol kencur pada konsentrasi 150 ppm karena masing-masing mempunyai daya inhibisi sebesar -3,3%, -11,2%, dan -5,4%. Nilai konsentrasi ekstrak pada daya inhibisi maksimum (Tabel 5) menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah asam gelugur memiliki daya inhibisi yang paling tinggi dari
12
Tabel 5 Konsentrasi kontrol ekstrak pada daya inhibisi maksimum.
Kontrol (-)
Konsentrasi optimum (ppm) 0
Daya inhibisi (%) 0,0
Air gelugur
150
41,9
Etanol gelugur
150
86,3
Air lengkuas
150
32,2
Etanol lengkuas
200
56,2
Air kencur
250
35,9
Etanol kencur
300
37,6
Kontrol (+)
100
10,6
Ekstrak
Nilai-nilai daya inhibisi tersebut lebih tinggi daripada yang dicapai oleh kontrol positif (Xenical®) yang hanya mampu menginhibisi lipase pankreas sebesar 10,6% pada konsentrasi 100 ppm. Nilai daya inhibisi Xenical® tersebut berbeda dengan yang dikemukakan oleh Silitonga (2008), yaitu sebesar 17,53% pada konsentrasi yang sama. Hal ini dapat disebabkan konsentrasi substrat yang digunakan pada penelitian Silitonga (2008) berbeda, yaitu 16,6750 µg/µL. Kelarutan orlistat yang lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak-ekstrak contoh dalam bufer fosfat dapat menyebabkan nilai daya inhibisi kontrol positif cenderung lebih rendah daripada ekstrak. Kontrol positif juga diuji pada ragam konsentrasi yang sama dengan ekstrak contoh, yaitu 100-300 ppm dengan selang 50 ppm. Hasil uji inhibisi tersebut diperlihatkan pada Gambar 7. Berdasarkan Gambar 7 dapat diketahui bahwa kontrol positif (Xenical®) mampu menginhibisi lipase pankreas pada konsentrasi 100 ppm, namun mulai dari konsentrasi 150-300 ppm memperlihatkan potensi sebagai aktivator lipase pankreas. Hasil ini berbeda dengan hasil penelitian Hadvary et al. (1988) yang menggunakan orlistat murni, substrat triolein murni, bufer Tris/HCl, NaCl, CaCl2, dan dimetil sulfoksida yang diinkubasi pada suhu ruang selama 10
menit. Dari penelitian tersebut diperoleh bahwa kemampuan orlistat dalam menginhibisi aktivitas lipase pankreas cenderung meningkat dengan meningkatnya konsentrasi dengan daya inhibisi mencapai 50% pada konsentrasi 0,1 µg/mL secara in vitro dan 0,27 µg/mL secara in vivo pada cairan usus tikus. 15.0
10.6
10.0 5.0
D aya in h ib isi (% )
semua ekstrak contoh, yaitu sebesar 86,3% pada konsentrasi 150 ppm. Ekstrak air buah asam gelugur dan lengkuas masing-masing memiliki daya inhibisi tertinggi sebesar 41,9% dan 32,2% pada konsentrasi 150 ppm, sedangkan ekstrak air kencur mencapai daya inhibisi tertinggi pada konsentrasi 250 ppm sebesar 35,9%. Ekstrak etanol lengkuas memiliki daya inhibisi tertinggi sebesar 56,2% pada konsentrasi 200 ppm, sedangkan ekstrak etanol kencur memiliki daya inhibisi tertinggi sebesar 37,6% pada konsentrasi 300 ppm.
0.0 -5.0
100
150
200
250
-10.0
300 -9.3
-15.0 -20.0
-18.3
-25.0 -30.0
-23.4 -26.3
Konsentrasi (ppm)
Gambar 7 Grafik daya inhibisi kontrol positif (Xenical®) terhadap aktivitas lipase pankreas. Hasil penelitian ini tidak dapat dibandingkan dengan hasil penelitian oleh Hadvary et al. (1988) tersebut karena orlistat yang terkandung di dalam kontrol positif (Xenical®) tidak murni sehingga konsentrasi orlistat yang digunakan berbeda. Selain itu, suhu, waktu inkubasi, pH, metode uji inhibisi, pereaksi, peralatan, serta jenis dan konsentrasi substrat yang digunakan pun berbeda. Kondisi inkubasi pada penelitian ini diduga bukan merupakan kondisi optimum inhibisi orlistat terhadap lipase pankreas. Meskipun demikian, metode yang digunakan pada penelitian ini dapat dikatakan lebih efektif karena dengan menggunakan substrat dan pereaksi-pereaksi lainnya yang lebih murah telah dapat memperlihatkan kemampuan inhibisi ekstrak ketiga contoh terhadap aktivitas lipase pankreas. Berdasarkan data pada Tabel 5 juga diketahui bahwa ekstrak etanol dari ketiga contoh memiliki daya inhibisi yang lebih tinggi daripada ekstrak airnya. Hal ini dapat disebabkan jumlah senyawa metabolit sekunder yang diduga berperan dalam proses inhibisi aktivitas lipase pankreas lebih banyak terekstrak oleh etanol. Golongan senyawa yang berperan dalam menginhibisi aktivitas lipase pankreas dapat diduga dari hasil uji fitokimia ekstrak. Ekstrak air buah gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur secara kualitatif diketahui mengandung saponin dengan jumlah
13
yang lebih banyak daripada golongan senyawa metabolit sekunder lainnya dalam ekstrak tersebut sehingga saponin diduga sebagai senyawa yang paling berperan dalam proses inhibisi tersebut. Telah dijelaskan sebelumnya bahwa daya inhibisi tertinggi ekstrak air ketiga tanaman dicapai oleh ekstrak air buah asam gelugur dengan daya inhibisi sebesar 41,9% pada konsentrasi 150 ppm. Kemampuan ini lebih baik dibandingkan dengan ekstrak saponin dari beberapa tanaman yang telah diketahui, misalnya fraksi saponin dari ekstrak air daun oolong tea (Han et al. 1999) yang mulai aktif menginhibisi lipase pankreas pada konsentrasi 500-2000 µg/mL dan saponin dari daun Accantopanax sessiliflorus, yaitu sessilosida dan chiisanosida yang masing-masing memiliki nilai IC50 sebesar 0,36 dan 0,75 mg/mL (Yoshizumi et al. 2006). Akan tetapi kemampuan ekstrak air buah asam gelugur tersebut hampir sama dengan yang dimiliki oleh chikusetsusapinin III, 28-deglukosilcikusetsusaponin IV, dan 28-deglukosilcikusetsusaponin V yang diisolasi dari fraksi total saponin rimpang Panax japonicus yang aktif menginhibisi lipase pada konsentrasi 125-500 µg/mL (Han et al. 2005b). Ekstrak saponin dari bangle dan daun jati belanda juga memiliki kemampuan yang lebih rendah daripada ekstrak air ketiga contoh karena daya inhibisi tertingginya masing-masing sebesar 10,22% pada konsentrasi 30 ppm dan 12,61% pada konsentrasi 60 ppm (Silitonga 2008) dengan metode ekstraksi dan uji inhibisi yang sama. Secara kualitatif saponin dalam ekstrak air kencur lebih banyak daripada ekstrak air buah asam gelugur, akan tetapi daya inhibisi yang dicapai oleh ekstrak air kencur cenderung lebih rendah daripada ekstrak air buah asam gelugur. Perbedaan jenis dan kadar saponin yang terkandung dalam setiap ekstrak tanaman mempengaruhi besarnya daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas. Kadar saponin dalam ekstrak air buah asam gelugur dan rimpang kencur tidak ditentukan secara kuantitatif sehingga tidak dapat dibandingkan. Selain itu, adanya senyawa lain yang terkandung dalam ekstrak dapat mempengaruhi kemampuan saponin dalam menghambat aktivitas lipase pankreas. Kemampuan saponin buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur dalam menghambat aktivitas lipase pankreas perlu dipastikan melalui penelitian lebih lanjut. Ekstrak etanol ketiga contoh juga memperlihatkan kemampuannya sebagai
inhibitor lipase dan daya inhibisi tertinggi dicapai oleh ekstrak buah asam gelugur yang mampu menghambat hingga 86,3% aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi 150 ppm (Gambar 6). Kemampuan tersebut hampir sama dengan yang dimiliki oleh ekstrak etanol biji anggur yang mampu menginhibisi lipase pankreas secara in vitro sebesar 80% pada konsentrasi 1 mg/mL dengan waktu inkubasi 5 menit dan suhu 37 °C (Moreno et al. 2003), akan tetapi golongan senyawa yang berperan dalam proses inhibisi tersebut belum diketahui. Daya inhibisi tertinggi ekstrak etanol ketiga tanaman melebihi daya inhibisi tertinggi ekstrak etanol beberapa tanaman lainnya terhadap aktivitas lipase, seperti ekstrak etanol daun jati belanda, yaitu 25,31% pada konsentrasi 60 ppm dan bangle sebesar 29,17% pada konsentrasi 100 ppm (Silitonga 2008), serta daun kemuning sebesar 22,80% pada konsentrasi 30 ppm (Martatilofa 2008). Berdasarkan hasil uji fitokomia, ekstrak etanol buah asam gelugur hanya mengadung alkaloid sehingga diduga alkaloid asam gelugur yang berperan sebagai inhibitor lipase pankreas, akan tetapi belum ada literatur yang mengatakan bahwa senyawa alkaloid mampu menginhibisi lipase pankreas. Dengan demikian, tidak menutup kemungkinan bahwa senyawa selain hasil metabolit sekunder yang juga berperan dalam proses inhibisi tersebut. Kandungan asam hidroksisitrat (HCA) dalam asam gelugur yang mencapai 45,17% (Muzakki 2006) dan sifat HCA yang mudah larut dalam air dan alkohol mendukung dugaan tersebut. Adanya gugus trikarboksilat pada asam ini diduga mampu menghambat hidrolisis asam lemak yang juga memiliki gugus karboksilat oleh lipase pankreas secara kompetitif. Akan tetapi, mekanisme tersebut belum dapat dipastikan hanya berdasarkan hasil uji inhibisi tersebut. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui ciri senyawa aktif dan mekanisme inhibisi ekstrak etanol buah asam gelugur dalam menghambat aktivitas lipase pankreas.
Sruktur asam hidroksisitrat. Berdasarkan hasil uji toksisitas diketahui bahwa ekstrak etanol buah asam gelugur memiliki bioaktivitas yang lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak air kencur (Tabel 4), akan tetapi daya inhibisi yang
14
dicapai oleh ekstrak etanol asam gelugur lebih tinggi daripada yang dapat dicapai oleh ekstrak etanol kencur, yaitu sebesar 37,6%. Hal ini membuktikan bahwa ekstrak yang memiliki bioaktivitas tertinggi belum tentu memiliki daya inhibisi yang tertinggi pula. Ekstrak etanol lengkuas dan kencur secara kualitatif mengandung flavonoid dan steroid sehingga kedua senyawa tersebut diduga berperan dalam menginhibisi aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi tertentu dari ekstrak. Potensi flavonoid dan steroid dalam menginhibisi lipase dari Rhizopus arrhizus sebelumya telah diteliti oleh Febriany (2004) dari ekstrak rimpang bangle pada konsentrasi 200 ppm akan tetapi mekanisme inhibisi kedua golongan senyawa tersebut belum diketahui. Inhibitor lipase pankreas lain dari golongan flavonoid adalah 3-metiletergalangin yang diisolasi dari ekstrak etanol rimpang Alpinia officinarum yang memiliki nilai IC50 sebesar 1,3 mg/mL dengan substrat berupa triolein (Shin et al. 2003), akan tetapi mekanisme hambatannya belum diketahui. Alpinia officinarum masih satu ordo dengan kencur dan satu marga dengan lengkuas. Tanaman dengan marga dapat mengandung senyawa yang sama dan mekanisme inhibisi suatu senyawa dapat diduga dari struktur senyawa tersebut.
Struktur 3-metiletergalangin. Senyawa 3-metiletergalangin memiliki dua buah gugus hidroksil dan gugus metil eter pada karbon ke-3nya. Struktur ini berbeda dengan struktur trigliserida sebagai substrat lipase pankreas yang terdiri atas gugus karboksilat dan gliserol yang terikat dengan ikatan ester. Oleh karena itu, mekanisme inhibisi yang terjadi diduga bukan secara kompetitif. Hal tersebut dapat dipastikan dengan penelitian lebih lanjut. Salah satu senyawa yang telah diketahui mekanisme inhibisinya terhadap aktivitas lipase pankreas adalah orlistat. Orlistat menginhibisi lipase pankreas secara nonkompetitif dengan membentuk suatu ikatan kovalen pada gugus serin, yaitu sisi aktif dari lipase pankreas dan lambung sehingga enzim tersebut menjadi nonaktif (Cariere 2001). Mekanisme inhibisi lipase pankreas oleh ekstrak buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur belum
tentu sama dengan orlistat. Mekanisme inhibisi lain yang dimungkinkan adalah secara kompetitif (bersaing dengan substrat mengikat sisi aktif enzim) dan unkompetitif (merusak struktur enzim) (Tze & Wong 1975). Mekanisme hambatan ekstrak kasar dari ketiga contoh dan senyawa yang paling berperan dalam proses tersebut dapat diketahui melalui penelitian lebih lanjut. Berdasarkan hasil uji inhibisi tersebut juga diketahui bahwa beberapa ekstrak mencapai daya inhibisi maksimum pada konsentrasi di atas nilai LC50nya, antara lain ekstrak air dan etanol buah asam gelugur, serta ekstrak etanol kencur. Hasil ini masih dapat diterima karena uji toksisitas menggunakan larva udang yang telah dilakukan hanya merupakan uji toksisitas awal. Penelitian lebih lanjut secara in vivo perlu dilakukan untuk mengetahui tingkat toksisitas akut keenam ekstrak tersebut untuk mengetahui keamanannya apabila akan dikonsumsi lebih lanjut sebagai obat. Uji Statistik Uji statistik dilakukan untuk mengetahui pengaruh daya inhibisi antar ekstrak contoh. Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap Perlakuan yang dibandingkan adalah konsntrasi ekstrak air dan etanol ketiga tanaman pada daya inhibisi maksimum, serta perlakuan dengan kontrol negatif dan kontrol positif. Berdasarkan hasil uji statistik (Lampiran 12) diketahui bahwa ekstrak air ketiga contoh memberikan pengaruh daya inhibisi terhadap aktivitas lipase pankreas yang tidak berbeda nyata, karena nilai Fhitung yang diperoleh, yaitu 1,478 lebih kecil dari Ftabel (5,143), sementara itu ekstrak etanolnya memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas karena karena Fhitung (17,910) lebih besar dari Ftabel (5,143). Uji beda perlakuan terhadap ekstrak etanol asam gelugur, lengkuas, dan kencur, serta kontrol negatif dan positif menyatakan bahwa paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata. Melalui uji Duncan diperoleh 9 perlakuan yang berbeda nyata pengaruhnya terhadap daya inhibisi lipase pankreas. Perlakuan-perlakuan tersebut adalah kontrol negatif dengan ekstrak etanol kencur, kontrol negatif dengan ekstrak etanol lengkuas, kontrol negatif dengan ekstrak etanol asam gelugur, kontrol positif dengan ekstrak etanol kencur, kontrol positif dengan ekstrak etanol lengkuas, kontrol positif dengan ekstrak etanol asam gelugur, ekstrak etanol kencur
15
dengan ekstrak etanol lengkuas, ekstrak etanol asam gelugur dengan ekstrak etanol lengkuas, dan ekstrak etanol asam gelugur dengan ekstrak etanol kencur. Lampiran 13 memperlihatkan kurva estimasi hubungan antara konsentrasi ekstrak dan kontrol positif dengan daya inhibisinya menggunakan kurva linier, logaritmik, kuadratik, power, dan eksponensial untuk mengetahui model inhibisinya. Kadar Flavonoid Total Ekstrak Metode ini berdasarkan pada Codex (1986) diacu dalam Nobre et al. (2005) dengan beberapa modifikasi, yaitu sistem hidrolisis yang berupa 1,0 mL urotropin 0,5% dan 2,0 mL asam hidroklorat R diganti dengan larutan heksametilentetramina 0,5% (b/v) dalam metanol dan 2,0 mL HCl 25%, serta panjang gelombang yang digunakan dari 425 nm diganti dengan 370,8 nm. Penentuan kadar flavonoid total ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi didasarkan pada hasil uji fitokimia. Kadar flavonoid ini ditentukan untuk mengetahui jumlah flavonoid yang terdapat dalam ekstrak yang diduga berpotensi atau bahkan merupakan senyawa yang paling berperan sebagai inhibitor lipase pankreas. Sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya, ekstrak etanol ketiga contoh mampu memberikan hambatan yang lebih tinggi daripada ekstrak airnya. Berdasarkan uji fitokimia ekstrak etanol asam gelugur tidak mengandung flavonoid sehingga penentuan kadar flavonoid total hanya dilakukan pada ekstrak etanol lengkuas dan kencur. Metode untuk menentukan kadar flavonoid total antara lain metode spektrofotometri UV (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005), kromatografi cair kinerja tinggi (Merkeen & Beecher 2000), elektroforesis kapiler (Marchant et al. 2003), serta spektrofotometer IR yang digabungkan dengan kemometrik. Metode ini dipilih karena lebih cepat dan murah. Metode ini juga disebut dengan metode AlCl3 karena digunakan AlCl3 sebagai pengkompleks warna. Flavonoid total yang terukur adalah sumbangan dari golongan flavon dan flavonol yang terdapat dalam ekstrak karena hanya senyawa-senyawa tersebut yang mampu membentuk kompleks stabil dengan AlCl3. Penentuan kadar flavonoid total ini menggunakan standar kuersetin murni. Kuersetin digunakan sebagai standar karena merupakan jenis flavonoid yang umum ditemukan pada tumbuhan serta terkandung dalam lengkuas dan kencur. Larutan standar
kuersetin berwarna kuning sehingga pengukuran absorbansi deret standar dilakukan pada panjang gelombang 370,8 nm yang kemudian dibuat plot terhadap konsentrasi standar untuk memperoleh kurva standar (Lampiran 14). Konsentrasi flavonoid ekstrak ditentukan dari persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar. Absorbans flavonoid ekstrak etanol lengkuas terukur sebesar 0,055 sehingga diperoleh kadar flavonoid totalnya sebesar 0,08% yang diduga terdiri atas kaemferol, galangin, kuersetin, dan mirisetin (Rahayu 2000, BPOM 2004). Flavonoid pada ekstrak etanol kencur memiliki absorbans 0,038 sehingga diperoleh kadar totalnya sebesar 0,04 %, lebih kecil daripada dalam ekstrak etanol lengkuas. Day dan Underwood (2001) menggolongkan perolehan analat hasil analisis kuantitatif dalam 3 kelompok, yaitu konstituen utama, minor, dan jejak atau runut. Hasil penentuan flavonoid total ekstrak etanol lengkuas dan kencur ini termasuk ke dalam konstituen minor karena memiliki kadar di antara 0,011%. Nilai kadar flavonoid total tersebut hampir sama dengan yang diperoleh Wahyuningrum (2006), menggunakan teknik spektroskopi IR dan kemometrik pada tanaman tempuyung dari tiga daerah yang berbeda, yaitu antara 0,62-0,82%. Nilai kadar flavonoid total yang diperoleh tersebut tidak menunjukkan kadar flavonoid total dari contoh sebenarnya, akan tetapi hanya kadar flavonoid total yang terekstrak oleh pelarut, yaitu etanol 70% secara maserasi. Kadar flavonoid total yang diperoleh tersebut dapat dipengaruhi oleh lingkungan tempat tumbuh tanaman seperti temperatur, sinar UV dan tampak, nutrisi, ketersediaan air, dan kadar CO2 di atmosfer karena senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan tanaman merupakan bentuk adaptasi tanaman terhadap lingkungan untuk bertahan hidup. Jenis pelarut, metode, lamanya waktu ekstraksi, serta nisbah antara jumlah pelarut dan contoh yang digunakan juga sangat mempengaruhi kadar senyawa metabolit sekunder dalam ekstrak. Apabila flavonoid di dalam tanaman tersebut banyak terdapat dalam bentuk glikon (terikat pada gugus gula) maka akan cenderung lebih terekstrak dengan pelarut yang lebih polar seperti air, sedangkan apabila dalam bentuk aglikon (tidak terikat pada gugus gula) maka akan lebih terekstrak dengan pelarut dengan kepolaran lebih rendah daripada air, seperti alkohol. Umar (2008) melakukan optimalisasi penentuan kadar flavonoid total pada daun jati
16
belanda yang diekstrak menggunakan pelarut etanol dengan metode refluks. Hasil optimalisasi tersebut adalah kadar flavonoid total daun jati belanda secara optimal diperoleh dengan nisbah antara simplisia dengan pelarut sebesar 1:10 yang direfluks selama 3 jam menggunakan etanol 70%. Pada penelitian ini ekstrak etanol lengkuas dan kencur diperoleh dengan maserasi selama 24 jam menggunakan etanol 70% dengan nisbah 1:8. Optimalisasi kondisi ekstraksi contoh pada penelitian ini tidak dilakukan sebelumnya sehingga kadar flavonoid ekstrak yang diperoleh diduga belum optimal.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak air dan etanol dari buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur berpotensi sebagai antiobesitas melalui inhibisi aktivitas lipase pankreas dengan daya inhibisi tertinggi dicapai oleh ekstrak etanol buah asam gelugur sebesar 86,3% pada konsentrasi 150 ppm. Uji statistik menunjukkan bahwa interaksi daya inhibisi aktivitas lipase pankreas antara kontrol negatif, kontrol positif, dan ekstrak etanol dari ketiga contoh berbeda nyata satu dengan lainnya, kecuali interaksi antara kontrol positif dengan kontrol negatif. Flavonoid total dalam ekstrak etanol lengkuas dan kencur yang diduga berperan dalam proses inhibisi tersebut termasuk dalam konstituen minor.
Saran Pencirian senyawa aktif dalam ekstrak perlu dilakukan untuk mengetahui senyawa yang berpotensi sebagai inhibitor aktivitas lipase pankreas. Mekanisme inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas juga perlu diteliti lebih lanjut. Selain itu, uji in vivo terhadap hewan coba juga diperlukan untuk mengetahui kemampuan senyawa aktif dalam ekstrak sebagai antiobesitas.
DAFTAR PUSTAKA Alviar B et al., penemu; Access Business Group International LLC. 2 Juli 2002. Diet composition and method of weight management. United States Patents No. 6413545. [AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2000. Official Methods of Analysis of AOAC International. Volume
ke-1. Ed ke-17. Agricultural Chemicals, Contaminants, Drugs. Maryland: AOAC International. [Anonim]. 2007. Extract HCA or hydroxycitric acid calcium salt? [terhubung berkala]. http://www.mdidea. com/products/herbextract/hca/data.html. [27 Mei 2008]. Birari RB, Bhutani KK. 2007. Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential. Drug Discovery Today 12:379-389. [BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2004. Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia. Volume 1. Jakarta: Badan POM RI. Burhanuddin et al. 2004. Pengaruh jus buah mengkudu masak (Morinda citrifolia L.) terhadap penurunan bobot badan tikus putih jantan. Di dalam: Buku Panduan Seminar Nasional XXV Tumbuhan Obat Indonesia; Tawangmangu, 27-28 Apr 2004. hlm 21. abstr no M-33. Cariere F et al. 2001. Inhibition of gastrointestinal lipolysis by OrlistatTM during digestion of test meals in healthy volunteers. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 281(1): G16-G28. Chung CS. 2006. Sweet and sour, the lovely gelugor. Gardenwise 26:18-19. Crespo RF, Martin MD, Finger O, penemu; Eli Lilly and Company. 22 Jan 2008. Selective peroxisome poliferator activated reseptor modulators. United States Patents No. 7231056. Darusman LK, Rohaeti E, Sulustiyani. 2001. Kajian senyawa golongan flavonoid asal tanaman bangle sebagai senyawa peluruh lemak melalui aktivitas lipase. Bogor: Pusat Studi Biofarmaka, Lembaga Penelitian IPB. Day RA, Underwood AL. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Iis Sopyan, penerjemah. Ed ke-6. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari Quantitative Analysis. Downey M, JS Stern, Kazaks A. 2005. Future and implications of reimbursement for obesity treatment. [terhubung berkala]. http://www.clevelandclinic.org/ health/healthinfo/docs/2400/2451.asp?ind ex=9472. [21 Feb 2008].
