INHIBISI EKSTRAK AIR DAN ETANOL DAUN ASAM JAWA DAN RIMPANG KUNCI PEPET TERHADAP LIPASE PANKREAS SECARA IN VITRO
AI SUSANTI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK AI SUSANTI. Inhibisi Ekstrak Air dan Etanol Daun Asam Jawa dan Rimpang Kunci Pepet terhadap Lipase Pankreas secara in Vitro. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO dan LATIFAH K. DARUSMAN. Asam jawa dan kunci pepet merupakan contoh tanaman obat tradisional yang berpotensi sebagai antiobesitas. Mekanisme kedua tanaman ini secara in vitro dalam menurunkan bobot badan belum diketahui dengan pasti. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi potensi kedua tanaman sebagai antiobesitas melalui kemampuan ekstrak air dan etanol kedua tanaman tersebut dalam menghambat aktivitas lipase pankreas secara in vitro pada pH 8, waktu inkubasi 45 menit, dan suhu 40°C. Lipase pankreas yang digunakan pada penelitian ini adalah lipase pankreas manusia dengan konsentrasi 1.4× 10-5 µg/µl dan substrat berupa minyak wijen dengan konsentrasi 16.2 µg/µl. Ekstrak air dan etanol daun asam jawa mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, dan tanin. Ekstrak air rimpang kunci pepet mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, dan tanin, sedangkan ekstrak etanolnya mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, dan triterpenoid. Hasil uji in vitro ekstrak daun asam menunjukkan bahwa ekstrak etanol pada konsentrasi 150 ppm memiliki daya inhibisi yang paling tinggi, yaitu sebesar 49.0%, sedangkan ekstrak rimpang kunci pepet yang memiliki daya inhibisi paling tinggi adalah ekstrak air pada konsentrasi 200 ppm, yaitu sebesar 65.1%. Nilainilai tersebut lebih besar jika dibandingkan dengan kontrol positif Xenical® 100 ppm, yang memiliki daya inhibisi 10.6%.
ABSTRACT AI SUSANTI. The Inhibition of Water and Ethanol Extracts of Tamarind Leaves and Kunci Pepet Rhizomes on Pancreatic Lipase in Vitro. Supervised by DYAH ISWANTINI PRADONO and LATIFAH K. DARUSMAN. Tamarind and kunci pepet has been used traditionally as herbal medicine to reduce body weight or used as antiobesity. But the mechanism in vitro of this herbal in reducing body weight has not been known yet. The objective of this research is to evaluate the these herbal as antiobesity by their water and ethanol extracts capability in inhibiting pancreatic lipase activity in vitro at pH 8, incubation time 45 minutes, and temperature 40°C. Pancreatic lipase used in this research was human pancreatic lipase with concentration of 1.4×10-5 µg/µl and the substrate was sesame oil with concentration of 16.2 µg/µl. The water and ethanol extracts of tamarind leaves contained alkaloids, flavonoids, saponins, steroids, and tannins. Water extract of kunci pepet contained alkaloids, flavonoids, saponins, and tannins, while ethanol extract contained alkaloids, flavonoids, saponins, and triterpenoids. The results of tamarind leaves extracts showed that ethanol extract in concentration of 150 ppm had the highest inhibitory effect, with the value of 49.0%. Water extract of kunci pepet at concentration of 200 ppm had the highest inhibition, with the value of 65.1%. These values were higher than inhibitory effect of Xenical® 100 ppm as the positive control, with the inhibition value of 10.6%
INHIBISI EKSTRAK AIR DAN ETANOL DAUN ASAM JAWA DAN RIMPANG KUNCI PEPET TERHADAP LIPASE PANKREAS SECARA IN VITRO
AI SUSANTI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Skripsi Nama NIM
: Inhibisi Ekstrak Air dan Etanol Daun Asam Jawa dan Rimpang Kunci Pepet terhadap Lipase Pankreas secara in Vitro : Ai Susanti : G44204026
Menyetujui: Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Dyah Iswantini Pradono, M. Agr. NIP 132 956 706
Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS. NIP 130 536 681
Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor,
Dr. drh. Hasim, DEA NIP 131 578 806
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah berjudul Inhibisi Ekstrak Air dan Etanol Daun Asam Jawa dan Rimpang Kunci Pepet terhadap Lipase Pankreas secara In Vitro ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains pada Departemen Kimia FMIPA IPB. Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai dengan November 2008 di Laboratorium Kimia Fisik dan Lingkungan, serta di Laboratorium Uji Bersama Pusat Studi Biofarmaka, IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Dyah Iswantini Pradono, M.Agr. dan Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS sebagai pembimbing yang telah memberikan arahan, saran, dan dorongan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Hibah Kompetensi atas nama Dr. Dyah Iswantini Pradono, M. Agr. yang telah membantu biaya penelitian dan Pusat Studi Biofarmaka IPB yang telah memberikan bantuan dalam hal tempat penelitian dan peralatan laboratorium yang Penulis gunakan dalam penelitian ini. Ungkapan terima kasih Penulis berikan kepada ibu, ayah, kakak, dan adik atas doa, kasih sayang, dan semangat yang senantiasa diberikan. Terima kasih juga kepada seluruh laboran Kimia Analitik, Kimia Fisik dan Lingkungan, serta semua staf dan pegawai Pusat Studi Biofarmaka atas bantuan yang diberikan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih turut Penulis berikan kepada Ana atas kebersamaan, dukungan, dan bantuannya selama ini, teman-teman kimia 41 khususnya Ade, Egih, Maipa, Niken, Susan, Enggar, dan Tanti, juga pada Rhoito dan Elisabeth atas bantuan serta ide-idenya. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Januari 2009
Ai Susanti
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sumedang pada tanggal 28 Oktober 1985 sebagai putri kedua dari tiga bersaudara dari pasangan E. Sutarja dan Yati. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Sumedang dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI) pada Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Kimia Analitik Layanan ITP pada tahun ajaran 2006/2007, Elektroanalitik dan Teknik pemisahan pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Analitik Layanan Biologi pada tahun ajaran 2007/2008, Spektroskopi II program keahlian Analisis Kimia Diploma IPB pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Lingkungan program keahlian Analisis Kimia Diploma IPB pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Dasar alih tahun 2008/2009, Kimia Dasar Diploma alih tahun 2008/2009, Kimia Dasar Diploma tahun ajaran 2008/2009, dan Kromatografi I tahun ajaran 2008/2009. Penulis juga aktif di Departemen Informasi dan Komunikasi Ikatan Mahasiswa Kimia (Imasika) sebagai staf pada tahun 2006/2007. Selama perkuliahan Penulis juga memperoleh beasiswa Supersemar selama 3 tahun, yaitu tahun 2005-2008. Bulan Juli-Agustus 2007, penulis melaksanakan praktik lapangan di Balai Penelitian dan Pengembangan Kehutanan, Bogor.
Untuk Ibu, Ayah, kakak-kakakku Lilis, Al Budi, adikku Nenden, keponakanku Zidane, serta kel. Karya Dinata (Alm.) dan kel. Tarmidi inilah persembahan terbaikku
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL............................................................................................................ ix DAFTAR GAMBAR ....................................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................................... x PENDAHULUAN ........................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Daun asam jawa (Tamarindus indica) .................................................................. Kunci pepet (Kaempferiae rotundae)................................................................... Kegemukan ........................................................................................................... Lipase Pankreas..................................................................................................... Uji Toksisitas tehadap Larva Udang (Artemia salina).......................................... Penelitian Pendukung............................................................................................
2 2 3 3 4 4
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat...................................................................................................... 5 Metode Penelitian ................................................................................................. 5 HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air dan Ekstraksi ........................................................................................ Uji Fitokimia ......................................................................................................... Uji Toksisitas terhadap Larva Udang ................................................................... Uji In vitro Ekstrak Terhadap Aktivitas Hidrolisis Lipase Pankreas .................... Uji Statistik .......................................................................................................... Kadar Flavonoid Total ..........................................................................................
8 8 9 10 14 15
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................................... 16 Saran ..................................................................................................................... 16 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................................... 16 LAMPIRAN .................................................................................................................... 19
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil uji fitokimia daun asam jawa............................................................................... 9 2 Hasil uji fitokimia rimpang kunci pepet ....................................................................... 9 3 Nilai LC50 ekstrak air dan ekstrak etanol sampel terhadap larva A. salina ................... 9 4 Daya inhibisi maksimum kontrol negatif, kontrol positif, dan ekstrak tanaman .......... 13
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Tanaman asam jawa ..................................................................................................... 2 2 Tanaman kunci pepet ................................................................................................... 2 3 Struktur orlistat ............................................................................................................. 4 4 Daya inhibisi kontrol positif, ekstrak air, dan ekstrak etanol daun asam jawa terhadap aktivitas lipase pankreas................................................................................. 11 5 Daya inhibisi kontrol positif, ekstrak air, dan ekstrak etanol rimpang kunci pepet terhadap aktivitas lipase pankreas................................................................................. 11 6 Daya inhibisi kontrol positif (Xenical®) pada berbagai konsentrasi terhadap aktivitas lipase pankreas ............................................................................................... 14 7 Kurva standar kuersetin ................................................................................................ 15
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan alir penelitian ................................................................................................... 20 2 Bagan alir ekstraksi air................................................................................................ 21 3 Bagan alir ekstraksi etanol .......................................................................................... 21 4 Bagan alir uji toksisitas dengan menggunakan larva udang A. salina ........................ 22 5 Bagan alir uji in vitro ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas ............................... 23 6 Pembuatan bahan-bahan uji aktivitas lipase pankreas ................................................ 24 7 Perhitungan aktivitas lipase pankreas ......................................................................... 24 8 Bagan alir penentuan kadar flavonoid total (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005) ....................................................................................................... 25 9 Penentuan kadar air..................................................................................................... 26 10 Penentuan rendemen daun asam jawa dan rimpang kunci pepet ................................ 27 11 Aktivitas ekstrak terhadap larva A. salina setelah 24 jam .......................................... 27 12 Daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas ............................................ 28 13 Perhitungan statistik ekstrak daun asam jawa dan rimpang kunci pepet .................... 28 14 Uji estimasi kurva ....................................................................................................... 31 15 Kadar flavonoid total .................................................................................................. 33
PENDAHULUAN Akhir-akhir ini, kecenderungan manusia untuk kembali ke alam semakin meningkat, termasuk penggunaan obat-obat pelangsing yang berasal dari tumbuhan. Kecenderungan ini disebabkan oleh obat pelangsing alami dari tumbuhan dirasakan mempunyai efek samping yang lebih rendah dibandingkan dengan obatobat pelangsing modern. Keanekaragaman tumbuhan obat pelangsing di Indonesia merupakan sumber metabolit sekunder yang dapat digunakan sebagai bahan baku dalam pembuatan obat pelangsing. Tumbuhan obat pelangsing asli Indonesia, pada kenyataannya sampai saat ini masih banyak digunakan oleh masyarakat. Pengetahuan ini telah diwariskan secara turuntemurun berdasarkan pada adat kebiasaan semata. Dalam rangka inilah diperlukan penelitian sehingga pengobatan secara tradisional dapat dipertanggungjawabkan penggunaannya, termasuk untuk antiobesitas. Obesitas adalah suatu penyakit multifaktorial sebagai akibat dari energi yang masuk ke dalam tubuh lebih banyak daripada energi yang dikeluarkan oleh tubuh. Obesitas bagi sebagian orang sangat mengganggu, baik dalam hal penampilan maupun kesehatan. Penyakit-penyakit yang diakibatkan oleh obesitas adalah diabetes melitus tipe II, hipertensi, radang sendi, dan penyakit jantung pembuluh darah yang dapat menyebabkan kematian (Rahardjo et al. 2005). Oleh sebab itu, banyak orang melakukan berbagai cara untuk menurunkan bobot badannya. Lemak yang terdapat di dalam tubuh dihidrolisis pada jaringan pankreas. Apabila aktivitas lipase pankreas meningkat, maka akan meningkatkan penyerapan monogliserida dan asam lemak yang berpengaruh pada obesitas (Joshita et al. 2000). Hal inilah yang akan menimbulkan penimbunan lemak dalam tubuh. Oleh karena itu, aktivitas lipase pankreas harus dihambat supaya penimbunan lemak tidak terjadi. Lipase pankreas merupakan enzim yang terdapat dalam tubuh manusia, yang terutama berperan dalam penguraian lipid untuk mengabsorpsi asam lemak (Shin et al. 2003). Cara-cara yang dapat digunakan untuk menurunkan bobot badan, yaitu olahraga yang teratur, mengkonsumsi makanan yang rendah kalori, dan mengkonsumsi obat-obat pelangsing yang banyak beredar di pasaran (Setiawati 1995). Cara lain yang dapat digunakan untuk menurunkan bobot badan adalah mengkonsumsi obat yang menghambat
nafsu makan (Amfetamin) dan menghambat absorpsi lemak melalui penghambatan aktivitas lipase pankreas (orlistat). Bahkan, sebagian kalangan wanita banyak yang menggunakan jamu untuk mengatasi masalah kegemukannya, seperti menggunakan jamu Galian Singset, Merit, Ideal, dan sebagainya. Tanaman obat yang mampu menurunkan bobot badan melalui mekanisme tersebut, di antaranya adalah daun jati belanda, rimpang bangle, malabar tamarind (Garcinia cambogia), mangrove jenis Rhizopora mucronata, daun asam jawa, rimpang kunci pepet, temu ireng, dan kemuning (Digest 2006). Malabar tamarind, misalnya, berkhasiat menekan rasa lapar dan meningkatkan rasa kenyang (Digest 2006), sedangkan tanin yang banyak terkandung di bagian daun jati belanda dapat mengurangi penyerapan makanan dengan cara mengendapkan mukosa usus yang ada dalam permukaan usus (Hendri 2006). Penelitian mengenai rimpang bangle menunjukkan bahwa ekstrak metanol, flavonoid, dan tanin dapat menghambat aktivitas lipase, sedangkan ekstrak air dan steroid meningkatkan aktivitas lipase (Iswantini et al. 2004). Ekstrak teh oolong, ekstrak herba Cassia nomame, dan rimpang jahe (Han et al. 1999, Yamamoto et al. 2000, dan Han et al. 2005), serta rimpang bangle dapat menghambat aktivitas lipase secara in vitro (Iswantini et al. 2003, Febriany 2004, Wirakusumah 2005, dan Silitonga 2008). Penelitian lain menunjukkan bahwa senyawa aktif yang berpotensi sebagai antiobesitas dalam menghambat aktivitas lipase pankreas adalah saponin yang terdapat pada tanaman Thea sinensis (Han et al. 2001) dan Platycodi radix (Xu et al. 2005), Panax japonicus (Han et al. 2005), tanaman Kochia scoparia (Han et al. 2006), dan buah Acanthopanax senticosus (Li et al. 2007), serta flavonoid dan steroid misalnya pada daun jati belanda (Darusman et al. 2001 dan Iswantini et al. 2003). Oleh karena itu, daun asam jawa yang mengandung flavonoid, saponin, tanin, steroid, dan alkaloid, serta rimpang kunci pepet yang mengandung saponin, polifenol, flavonoid, dan minyak atsiri diharapkan mampu mendukung potensi tersebut. Berdasarkan penelusuran melalui situs paten Amerika (www.uspto.gov/ 11 April 2008), banyak paten yang berhubungan dalam pemeliharaan obesitas, diantaranya adalah ekstrak Ginkgo biloba (Soudant et al. 1993), Garcinia cambogia dan bioflavonoid lemon (Alviar et al. 2002) yang dapat bermanfaat
menurunkan bobot badan. Bahkan terdapat juga paten yang berhubungan dengan identifikasi komposisi dan metode perlakuan obesitas dan kelebihan bobot badan (Subbiah 2007). Selain itu juga, terdapat paten tentang melanokortin sebagai reseptor rasa nyeri yang digunakan untuk obesitas, diabetes, dan disfungsi seksual pria dan wanita (Backer et al. 2008), serta turunan morfolin, seperti (R)2-[3-kloro-4-(2,2,2-trifluor-etoksi)benzil]morfolin sebagai reseptor rasa nyeri 5HT2C untuk penanganan obesitas yang berpotensi sebagai inhibitor lipase (Bentley et al. 2008). Berdasarkan penggunaan di masyarakat, daun asam jawa dan rimpang kunci pepet ternyata berpotensi sebagai pelangsing. Belum terdapat paten yang memuat informasi mengenai antiobesitas berbasis daun asam jawa maupun rimpang kunci pepet sehingga penelitian ini perlu dilakukan. Penelitian ini berpotensi menghasilkan suatu formula yang dapat dipatenkan. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi daya inhibisi ekstrak air dan ekstrak etanol pada daun asam jawa dan rimpang kunci pepet terhadap aktivitas lipase pankreas secara in vitro dalam potensinya sebagai antiobesitas.
TINJAUAN PUSTAKA Daun Asam Jawa (Tamarindus indica) Asam jawa (Tamarindus indica) merupakan sebuah kultivar daerah tropis dan termasuk tumbuhan berbuah polong. Nama ilmiah asam jawa adalah Tamarindus indica dan termasuk ke dalam suku Fabaceae (Leguminosae). Nama lain asam jawa adalah asam (Malaysia), asem (Jawa), sampalok (Tagalog), ma-kham (Thailand), dan tamarind (Inggris). Asam jawa termasuk ke dalam divisi Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Fabales, famili Fabaceae, bangsa Detariae, genus Tamarindus, dan spesies Tamarindus indica (Heyne 1987). Asam jawa mempunyai pohon yang besar, daunnya berwarna hijau, tinggi 25 m, dan diameter batang di pangkal sampai 2 m. Kulit batang berwarna coklat keabu-abuan, kasar, dan beralur-alur vertikal. Tajuknya rindang, berdaun lebat, melebar, dan membulat. Daunnya majemuk menyirip genap dengan panjang 5-13 cm. Pohon asam dapat tumbuh dengan baik sampai ketinggian sekitar 1000 m dpl, pada tanah berpasir atau tanah liat, khususnya di wilayah yang musim keringnya jelas dan cukup panjang. Penyebaran tanaman ini, antara lain Sudan, Karibia, Amerika Latin, Indonesia, dan sebagainya. Asam jawa
berkhasiat untuk mengobati asma, batuk, demam, sakit panas, reumatik, sakit perut, morbili, alergi, sariawan, luka baru, eksim, dan sebagainya (Heyne 1987). Menurut Doughari (2006), tanaman asam jawa mengandung senyawa tanin, alkaloid, saponin, seskuiterpena, dan flobatamin melalui uji fitokimia.
Gambar 1 Tanaman asam jawa. Kunci Pepet (Kaempferiae rotundae) Kunci pepet disebut juga kunir putih. Daunnya bercorak indah dan tumbuhnya tidak tinggi. Bentuknya menyerupai tanaman hias sehingga sering ditanam di pekarangan atau di dalam pot. Kunci pepet dapat ditemukan tumbuh liar pada dataran rendah di beberapa tempat di bagian timur Jawa sampai ketinggian kurang dari 750 m dpl. Selain digunakan sebagai campuran jamu tradisional, kunci pepet juga sering digunakan untuk kosmetika tradisional. Dua fase tumbuh kunci pepet, yaitu fase vegetatif dan generatif. Pertumbuhan normal seperti biasa dengan daun dan batang semu pada fase vegetatif, sedangkan pada fase generatif hanya terlihat bunga-bunga (Heyne 1987).
Gambar 2 Tanaman kunci pepet. Nama simplisia kunci pepet, yaitu Kaempferiae rotundae. Berikut ini namanama kunci pepet, yaitu kunci pepet, temu rapet, ardong (Jawa), kunir putih (Sunda), konce pet (Madura), temu putri (Melayu). Rimpang kunci pepet banyak digunakan untuk mengobati penyakit antiradang, disentri, peluruh kentut (karminatif), mempercepat penyembuhan luka. Rimpang kunci pepet dapat digunakan sebagai pelangsing tubuh.
Rimpang kunci pepet rasanya pahit dan sifatnya sejuk. Rimpang kunci pepet mengandung minyak atsiri yang berwarna kuning muda, alkaloid, saponin, flavonoid, dan polifenol (Heyne 1987). Kegemukan (Obesitas) Kegemukan dalam arti bahasa adalah kelebihan berat badan, keadaan ini untuk sebagian orang sangat mengganggu penampilan pada umumnya dan wanita pada khususnya serta cenderung mengarah pada masalah kesehatan yang serius. Banyak penyakit yang timbul pada seseorang karena kelebihan berat badan, misalnya penyakit jantung dan kolesterol tinggi. Olahraga yang teratur, mengurangi makanan yang mengandung lemak tak jenuh, mengutamakan sayur dan buah, menjaga pola makan secara benar, serta mengkonsumsi tanaman obat yang telah terbukti dapat menurunkan bobot badan. Meskipun jumlah orang yang menjalani diet atau melakukan senam kebugaran bertambah, jumlah penderita kegemukan terus meningkat. Walaupun banyak orang yang sudah berusaha keras menurunkannya dan tidak mendapatkan berat badan yang diharapkan. Tidak jarang orang berusaha kurus dengan meminum obat-obatan yang dijual di pasaran. Namun dari beberapa penelitian, hal tersebut ternyata menimbulkan efek samping. Oleh karena itu, penggunaan obat terutama obat sintesis hanya dianjurkan dalam waktu singkat dan dosis yang rendah. Secara umum, cara kerja obat-obatan sintesis pelangsing tubuh, seperti Amfetamin, Diuretik, dan Water pills hanya sekedar menekan nafsu makan atau menahan rasa lapar. Bahkan, memiliki efek samping seperti sulit tidur, jantung berdebar, rasa resah, menjadi lebih agresif, sakit kepala, cemas, keringat dingin, hipertensi, dan mulut kering. Selain obat pelangsing sintesis, banyak pula masyarakat yang menggunakan teh pelangsing. Namun teh ini biasanya bersifat uretik karena menyebabkan keluarnya urine yang berlebihan. Bagi penderita kegemukan menggunakan teh bukanlah cara yang efektif karena jika dikonsumsi dalam waktu yang lama dapat mengganggu keseimbangan elektrolit tubuh dan dapat menyebabkan gangguan jantung (Wirakusumah 2005). Saat ini banyak dilakukan penelitian untuk mendapatkan obat pelangsing yang berasal dari campuran tanaman obat yang biasa dikenal sebagai jamu. Jamu ini berasal dari
alam yang diharapkan tidak menimbulkan efek samping. Lipase Pankreas Lipase pankreas adalah enzim yang diproduksi oleh sel acinar dan disekresi sebagai fungsi eksokrin pankreas. Enzim ini merupakan suatu enzim glikoprotein yang larut dalam air, disintesis oleh sel-sel parenkim pankreas, dan ditransfer ke permukaan luminar usus halus untuk menghidrolisis substrat. Senyawa-senyawa trigliserida yang dapat menjadi substrat lipase pankreas berasal dari golongan lipid, seperti minyak dan lemak dari makanan dalam bentuk triasilgliserol. Lipase pankreas menghidrolisis trigliserida makanan dalam usus menjadi 2 monogliserida dan 2 asam lemak rantai panjang, kemudian akan ditranspor menuju permukaan mikrovili untuk diserap oleh pembuluh darah (Bishop et al. 2004). Lipase pankreas terdiri atas His-263, Asp176, dan Ser-152 dengan Ser-152 sebagai sisi katalitik (Birari & Bhutani 2007). Lipase pankreas bekerja pada daerah permukaan minyak air dan titik-titik lipid yang teremulsi secara halus dibentuk oleh gerakan mekanis dalam usus dengan adanya garam empedu. Semakin aktif aktivitas enzim tersebut, maka lemak dan minyak yang dihidrolisis akan semakin banyak sehingga asam lemak bebas yang dihasilkan akan semakin banyak pula (Rahardjo 2005). Hal ini dapat memicu penimbunan lemak pada jaringan adiposa tersebut dan menyebabkan obesitas. Salah satu inhibitor lipase pankreas yang telah dikenal luas dan digunakan di pasaran sebagai pelangsing adalah orlistat (Xenical®) bekerja dengan cara menghambat absorpsi lemak melalui penghambatan aktivitas lipase pankreas sehingga meningkatkan ekskresi lemak lewat feses (Roche 2008b). Berdasarkan hasil penelitian, senyawa yang diketahui mampu menghambat aktivitas dari lipase, diantaranya adalah flavonoid yang terdapat pada rimpang bangle (Iswantini et al. 2003) dan galangal (Shin et al. 2003), tanin yang terdapat pada rimpang bangle (Iswantini et al. 2003) dan Cassia nomame (Yamamoto et al. 2000), senyawa terpenoid pada Gardenia jasminoides (Lee et al. 2005), serta saponin yang terdapat pada berbagai macam tanaman (Xu et al. 2005, Han et al. 2005 dan 2006). Berikut adalah struktur orlistat (tetrahidrolipstatin).
Gambar 3 Struktur orlistat. Menurut katalog Sigma tahun 2008, orlistat disebut juga N-formil-L-leusin (1S)-1(2S,3S)-3-heksil-4-okso-2-oksetanil]metil] dodesil ester. Efek samping dari pemakaian orlistat, yaitu terjadinya malabsorbsi terhadap vitamin A, D, E, dan K yang larut lemak. Uji Toksisitas terhadap Larva Udang (Artemia salina) Metode uji toksisitas larva udang merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk pencarian senyawa aktif baru yang berasal dari tumbuhan tingkat tinggi. Metode ini merupakan metode yang cukup praktis, cepat, mudah, murah, dan cukup akurat (Meyer et al. 1982). Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Prinsip dalam uji toksisitas adalah komponen bioaktif selalu bersifat toksik jika diberikan dalam dosis yang tinggi dan obat adalah racun dari suatu komponen bioaktif pada dosis rendah. Uji toksisitas larva udang telah digunakan untuk mengetahui adanya residu pestisida, anastesik lokal, senyawa turunan morfin, mikotoksin, karsinogenisitas suatu senyawa, dan polutan pada air laut. LC50 dapat digunakan untuk menentukan toksisitas dari suatu zat. LC50 adalah konsentrasi dari suatu bahan yang menyebabkan 50% populasi mengalami kematian. Suatu senyawa yang memiliki potensi bioaktif apabila nilai LC50nya kurang dari 1000 ppm (Meyer et al. 1982). Data mortalitas hewan uji yang diperoleh diolah untuk mendapatkan nilai LC50 dengan selang kepercayaan lebih besar atau sama dengan 95% dengan menggunakan probit analysis method. Penelitian Pendukung Penelitian mengenai tanaman asam jawa dan rimpang kunci pepet sering dilakukan. Maiti et al. (2005) mengemukakan bahwa ekstrak air biji asam jawa dengan dosis 80 mg dan 120 mg/0.5 ml air distilata/100g bobot badan/hari selama 14 hari berpotensi sebagai antidiabetes karena menurunkan kadar glukosa darah pada mencit yang mempunyai
kadar glukosa darah yang tinggi. Muthu et al. (2005) mengemukakan bahwa ekstrak metanol daun asam jawa berpotensi menghambat aktivitas B. pseudomallei secara in vitro pada konsentrasi 150 µg. Menurut Doughari (2006), tanaman asam jawa mengandung senyawa tanin, alkaloid, saponin, seskuiterpena, dan flobatamin melalui uji fitokimia. Asam jawa mempunyai spektrum aktivitas sebagai antibakteri dan berpotensi sebagai antibiotik untuk kemoterapi. Penelitian mengenai rimpang kunci pepet menunjukkan bahwa dalam ekstrak kering rimpang kunci pepet hanya mengandung senyawa bisdesmetoksikurkumin dan kandungan kurkumin pada ekstrak kering rimpang kunci pepet sebesar 0.8%. Rimpang kunci pepet mengandung minyak atsiri yang berwarna kuning muda, alkaloid, saponin, flavonoid, dan polifenol (Anonim 2008). Penelitian mengenai daya inhibisi beberapa tanaman obat dalam menghambat aktivitas lipase pankreas sebagai salah satu metode untuk antiobesitas telah dilakukan. Han et al. (1999) menyatakan bahwa ekstrak tanaman teh oolong dapat menghambat aktivitas lipase pankreas sehingga dapat digunakan sebagai antiobesitas. Yamamoto et al. (2000) menyatakan bahwa ekstrak etanol CT II herba Cassia nomame mampu menghambat aktivitas lipase karena efektif untuk mengatasi kegemukan, lemak hati, dan hipertrigliseridemia pada mencit yang mempunyai lemak yang tinggi. Pengaruh antiobesitas senyawa teasaponin dalam tikus diet lemak tinggi dimediasi sebagian lewat absorpsi lemak pada usus dalam menghambat aktivitas lipase pankreas (Han et al. 2001). Shin et al. (2003) menyatakan bahwa senyawa 3-metiletergalangin yang diisolasi dari tanaman galangal (Alpinia officinarum) dapat menghambat aktivitas lipase pankreas secara in vitro dengan nilai IC50 sebesar 1.3 mg/ml dan menurunkan kadar kolesterol tikus jantan secara in vivo. Rahardjo et al. (2004 dan 2005) menyatakan bahwa lendir daun jati belanda dengan dosis 350 mg/kg BB menunjukkan adanya kenaikan bobot badan tikus dibandingkan dengan pemberian air suling sebagai kontrol dan ekstrak etanol daun jati belanda dapat menghambat aktivitas lipase serum Rattus norvegicus pada tikus putih. Lee et al. (2005) menyatakan bahwa senyawa krosin pada tanaman Gardenia jasminoides mampu menghambat aktivitas lipase pankreas pada tikus yang mempunyai kolesterol tinggi secara in vivo. Penelitian lain menunjukkan bahwa senyawa aktif yang berpotensi sebagai
antiobesitas dalam menghambat aktivitas lipase pankreas adalah saponin yang terdapat pada tanaman Platycodi radix (Xu et al. 2005) dan Panax japonicus (Han et al. 2005). Han et al. (2006) juga mengatakan bahwa senyawa saponin yang diisolasi dari tanaman Kochia scoparia mampu menghambat aktivitas lipase pankreas secara in vitro dan berpengaruh terhadap pengurangan lemak pada tikus. Li et al. (2007) menyatakan bahwa fraksi kasar saponin Acanthopanax senticosus dapat menghambat aktivitas lipase pankreas. Iswantini et al. (2003) menyatakan bahwa ekstrak metanol daun jati belanda berpotensi sebagai inhibitor lipase, sedangkan ekstrak kloroform berpotensi sebagai aktivator lipase. Ekstrak metanol daun jati belanda dapat menghambat aktivitas lipase baik pada konsentrasi tinggi maupun rendah, sedangkan ekstrak kloroform dan steroid pada konsentrasi rendah dapat berfungsi sebagai inhibitor, tetapi pada konsentrasi tinggi sebagai aktivator. Penelitian mengenai ekstrak rimpang bangle, yaitu uji in vitro terhadap aktivitas lipase dari mikrob Rhizopus arrhizus menunjukkan bahwa ekstrak air dan steroid pada rimpang bangle bersifat aktivator lipase, sedangkan ekstrak metanol, flavonoid, dan tanin bersifat inhibitor. Ekstrak gabungan antara steroid, tanin, dan flavonoid merupakan aktivator terbaik, sedangkan ekstrak gabungan antara tanin dan flavonoid merupakan inhibitor terbaik lipase (Iswantini et al. 2004). Febriany (2004) menyatakan bahwa ekstrak metanol, air, tanin, dan steroid rimpang bangle memiliki aktivitas tertinggi terhadap kerja hidrolisis lipase pada konsentrasi 300 ppm, sedangkan untuk ekstrak flavonoid pada konsentrasi 600 ppm. Ekstrak air, metanol, flavonoid, dan steroid dari rimpang bangle mampu menghambat aktivitas lipase, sedangkan ekstrak tanin meningkatkan aktivitas lipase. Menurut Wirakusumah (2005), ekstrak kasar metanol rimpang bangle pada konsentrasi 100 dan 300 ppm mampu menghambat aktivitas lipase dari mikrob Rhizoppus arrhizus, sedangkan pada konsentrasi 200 ppm berperan sebagai aktivator lipase. Penambahan ekstrak air seduhan dengan konsentrasi 200 ppm cenderung berpotensi sebagai aktivator lipase, sedangkan konsentrasi 100, 300, dan 400 ppm berpotensi sebagai inhibitor lipase. Silitonga (2008), ekstrak air daun jati belanda dan rimpang bangle pada konsentrasi 45 dan 75 ppm memiliki daya inhibisi terbesar, yaitu 15.5 dan 25.8%, sedangkan ekstrak etanol
pada konsentrasi 60 dan 100 ppm sebesar 25.3 dan 29.2%.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Lipase pankreas yang digunakan adalah lipase pankreas manusia dengan kode Sigma L9780-50 units. Sampel daun asam jawa diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro) dan rimpang kunci pepet diperoleh dari Pusat Studi Biofarmaka, Bogor. Bahan-bahan yang digunakan adalah pereaksi Dragendorf, Mayer, Wagner, pereaksi natrium dietilditiokarbamat, telur udang A. salina, asam oleat (Sigma), minyak wijen ABC, kuersetin, Xenical®, dan pereaksi tembaga. Alat-alat yang digunakan adalah rotary evaporator, kuvet persegi, dan spektrofotometer UV-Vis merk U-2800 Hitachi. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri atas beberapa tahap, yaitu persiapan sampel (pengumpulan bahan baku, sortasi basah, pencucian, perajangan, dan pengeringan), penelitian pendahuluan, (penetapan kadar air dan uji fitokimia) dan penelitian utama (ekstraksi, penentuan LC50 dengan larva udang, dan uji in vitro terhadap aktivitas lipase pankreas, dan penentuan kadar flavonoid total dari ekstrak yang memiliki daya inhibisi terbesar) (Lampiran 1). Persiapan sampel Pengumpulan bahan baku. Bahan baku rimpang kunci pepet diperoleh dari UPT Kebun Percobaan Pusat Studi Biofarmaka LPPM-IPB, sedangkan daun asam jawa dari Balai Penelitian Tanaman Obat dan Aromatik (Balittro), Bogor. Umur daun asam jawa yang digunakan, yaitu 6 tahun, sedangkan rimpang kunci pepet, yaitu 7 bulan. Sortasi basah. Kegiatan ini bertujuan memisahkan kotoran atau bahan-bahan asing lainnya dari tanaman yang akan diteliti. Pencucian. Pencucian bertujuan menghilangkan tanah dan pengotor lainnya yang masih menempel pada sampel yang sudah disortasi basah. Perajangan. mempermudah penggilingan.
Perajangan bertujuan proses pengeringan dan
Pengeringan. Pengeringan dilakukan dengan udara kering hingga kadar air kurang dari 10% agar bahan yang diperoleh tidak mudah rusak akibat mikroorganisme. Penggilingan. Sampel yang sudah kering digiling untuk mendapatkan bentuk serbuknya. Penelitian Pendahuluan Penentuan Kadar Air (AOAC 2000) Cawan porselin dikeringkan di oven pada suhu 105ºC selama 1 jam. Setelah itu, cawan porselin didinginkan dalam eksikator selama 30 menit dan cawan tersebut ditimbang bobot kosongnya. Sebanyak 3 g sampel ditimbang dan dikeringkan pada suhu 105°C selama 3 jam di dalam oven. Setelah didinginkan dalam eksikator selama 30 menit, cawan beserta isinya ditimbang. Sampel dikeringkan lagi selama satu jam sampai diperoleh bobot sampel yang konstan. Uji Fitokimia (Harborne 1987) Ekstrak yang telah diperoleh kemudian dilakukan uji kualitatif kandungan senyawa (uji fitokimia), seperti alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, triterpenoid, dan tanin dengan menggunakan metode Harborne (1987). Uji Alkaloid. Sebanyak 1 g sampel dilarutkan dalam 10 ml kloroform dan 4 tetes NH4OH, kemudian disaring dan filtratnya dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 6 ml H2SO4 2 M dan lapisan asamnya dipisahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada lempeng (spot) tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorf yang akan menimbulkan endapan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga. Uji Flavonoid dan Saponin. Sampel dimasukkan ke dalam gelas piala besar. Setelah itu, ke dalam gelas piala ditambahkan 100 ml air panas dan dididihkan selama 5 menit, kemudian disaring dan filtratnya digunakan untuk pengujian. Uji flavonoid, 10 ml filtrat ditambahkan 0.5 g serbuk Mg, 2 ml HCl pekat, dan 20 ml amil alkohol, kemudian dikocok. Apabila pada lapisan amil alkohol tersebut berwarna merah, kuning, dan jingga, maka menunjukkan adanya flavonoid dalam sampel. Uji saponin, 10 ml filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi bertutup, kemudian dikocok selama 10 detik dan dibiarkan selama
10 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil pada sampel. Uji Steroid dan Triterpenoid. Sampel ditambahkan 25 ml etanol panas 50ºC, kemudian disaring ke dalam pinggan porselin dan diuapkan sampai kering. Setelah itu, residu dilarutkan dengan eter dan dipindahkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat (uji Lieberman-Buchard). Apabila larutan tersebut berwarna merah atau ungu, maka di dalam sampel menunjukkan adanya senyawa triterpenoid, sedangkan kalau larutan tersebut berwarna hijau atau biru, maka di dalam sampel menunjukkan adanya senyawa steroid. Uji Tanin. Sampel ditambahkan air panas sebanyak 100 ml dan dididihkan selama 5 menit. Setelah itu disaring, sebagian filtrat yang diperoleh ditambah larutan FeCl3 1%. Apabila terbentuk warna hitam kehijauan, maka di dalam sampel tersebut menunjukkan adanya senyawa tanin. Penelitian Utama Ekstraksi Air (Doughari 2006) Metode ini berdasarkan pada penelitian Doughari (2006). Sampel yang sudah digiling, kemudian ditimbang sebanyak ± 100 g. Setelah itu, sampel diekstraksi secara maserasi dengan air, lalu disaring dan filtratnya dipekatkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh residu kering (ekstrak air) (Lampiran 2). Ekstrak kering ditimbang dan dihitung rendemennya. Ekstraksi Etanol (Doughari 2006) Metode ini berdasarkan pada penelitian Doughari (2006). Sampel yang sudah digiling, kemudian ditimbang sebanyak ± 100 g. Setelah itu, sampel diekstraksi secara maserasi dengan etanol 70%, lalu disaring dan dipekatkan dengan rotary evaporator sampai diperoleh residu kering (ekstrak etanol) (Lampiran 3). Ekstrak ditimbang dan dihitung rendemennya dengan persamaan sebagai berikut. Rendemen ekstrak =
a × 100% × fk b
Keterangan: a = bobot ekstrak (g) b = bobot contoh awal (g) fk = faktor koreksi = (1-kadar air)
Uji Toksisitas terhadap Larva Udang (Meyer et al. 1982) Uji toksisitas dengan menentukan nilai LC50 dilakukan untuk menentukan konsentrasi ambang untuk pengujian in vitro artinya uji in vitro akan dilakukan dibawah konsentrasi LC50-nya. Uji ini dilakukan dengan menggunakan telur udang Artemia salina. A. salina yang digunakan untuk uji toksisitas diperoleh dari hasil penetasan dengan menggunakan air laut dengan bantuan aerator untuk memenuhi kadar oksigen yang terlarut. Gelembung udara yang berasal dari aerator juga berfungsi untuk mengaduk telur secara merata sehingga telur tidak mengendap di dasar wadah. Hal ini disebabkan oleh telur akan sulit menetas akibat kekurangan oksigen. Larva udang yang digunakan berumur 48 jam setelah menetas karena pada umur ini larva A. salina bersifat peka terhadap kondisi lingkungan. Hal ini disebabkan oleh membran sel larva masih lunak sehingga memudahkan senyawa asing dalam air laut masuk ke dalam tubuh larva dan menyebabkan kematian. Uji toksisitas ekstrak dilakukan dengan menggunakan larva udang A. salina. Kista A. salina sebanyak ± 50 mg dimasukkan ke dalam wadah yang berisi air laut yang sudah disaring dan dilengkapi aerator. Kista dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Setelah menetas, larva A. salina sebanyak 10 ekor dimasukkan ke dalam vial 2 ml, kemudian ditambahkan larutan stok ekstrak dengan konsentrasi 4000 ppm dan ditepatkan volumenya dengan air laut sehingga konsentrasi akhir ekstrak menjadi 0, 10, 100, dan 1000 ppm. Setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung. Nilai konsentrasi letal (LC50) ditentukan dengan metode analisis probit dengan selang kepercayaan 95% (Lampiran 4). Uji In vitro Ekstrak terhadap Aktivitas Hidrolisis Lipase Pankreas (Han et al. 2005) Metode uji in vitro yang digunakan ini mengacu pada metode yang digunakan oleh Han et al. (2005) dengan beberapa modifikasi, yaitu menggunakan substrat triolein, bufer Ntris-(hidroksimetil)-metil-2-aminoetana-asam sulfat pada pH 7, suhu 37°C dengan waktu inkubasi 30 menit, dan larutan pengkompleks warna batokuproin dalam kloroform 0.05% (b/v). Metode uji in vitro yang digunakan kali ini berbeda dengan metode yang biasa digunakan untuk uji in vitro yang
menggunakan lipase pankreas oleh Han et al. 2005). Metode yang digunakan kali ini lebih sederhana, yaitu dengan menggunakan minyak wijen sebagai substrat dan pereaksipereaksi lain yang lebih sederhana. Sebanyak 15 μl substrat dan ekstrak sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambah dengan 10 μl albumin 10% dan larutan bufer fosfat pH 8. Setelah itu, 100 μl lipase pankreas dimasukkan ke dalam tabung reaksi tersebut dan diinkubasi pada pH 8, suhu optimum (40ºC) selama 45 menit. Setelah mencapai waktu optimum, reaksi dihentikan dengan cara menambahkan 3 ml kloroform. Larutan dalam tabung kemudian dikocok dan disentrifugasi selama 5 menit. Sebanyak 1 ml lapisan kloroform, kemudian diambil dan ditambahkan 4 ml kloroform-heptana (1:1), serta dikocok hingga homogen. Setelah itu, larutan ditambahkan 2.5 ml pereaksi tembaga, dikocok 3 menit hingga homogen, dan disentrifugasi kembali selama 10 menit. Lapisan kloroform diambil sebanyak 3 ml dan ditambahkan 0.25 ml larutan Nadietilditiokarbamat hingga berwarna kuning. Larutan diukur serapannya dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 435 nm. Nilai yang diperoleh, kemudian dikonversi dengan perhitungan sehingga diperoleh nilai aktivitas lipase pankreas. Aktivitas lipase pankreas dinyatakan dalam μmol asam oleat/l.menit. Kontrol negatif dilakukan tanpa penambahan ekstrak, sedangkan untuk kontrol positif dilakukan dengan mengganti ekstrak dengan Xenical®. Tahap ini dapat dilihat secara jelas pada Lampiran 5. Prosedur pembuatan pereaksi tembaga dan natrium dietilditiokarbamat dapat dilihat pada Lampiran 6. Perhitungan aktivitas lipase pankreas dapat ditunjukkan pada Lampiran 7. Penentuan Kadar Flavonoid Total (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005) Metode ini berdasarkan pada Codex (1986) diacu dalam Nobre et al. (2005). Ekstrak terbaik yang memiliki daya inhibisi terbesar yang setara dengan 200 mg simplisia ditimbang dan dimasukkan ke labu bulat. Sistem hidrolisis berupa 1.0 ml larutan heksametilenatetramina 0.5% b/v, 20 ml aseton, dan 2 ml HCl 25% ditambahkan ke dalam labu tersebut. Selanjutnya, ekstrak dihidrolisis dengan pemanasan hingga mendidih selama 30 menit. Campuran hasil hidrolisis disaring menggunakan kapas ke dalam labu takar 100 ml, kemudian residunya ditambahkan 20 ml aseton dan dididihkan
kembali (dilakukan 2 kali dan filtrat dikumpulkan ke dalam labu takar, lalu ditera dengan aseton). Sebanyak 20 ml filtrat hasil hidrolisis dan 20 ml akuades dimasukkan ke dalam corong pisah, lalu diekstraksi dengan etil asetat (ekstraksi yang pertama dengan 15 ml etil asetat, ekstraksi kedua dan ketiga dengan 10 ml etil asetat). Fraksi etil asetat dikumpulkan dalam labu takar 50 ml, kemudian ditera dengan etil asetat. Pengukuran spektrofotometri Sebanyak 10 ml larutan fraksi etil asetat dimasukkan ke dalam labu takar 25 ml, lalu direaksikan dengan 1 ml larutan AlCl3 2% b/v dan ditera dengan larutan asam asetat glasial 5% v/v dalam metanol. Pengukuran larutan dilakukan pada panjang gelombang 370.8 nm. Kurva standar dibuat dengan kuersetin murni dengan konsentrasi 0, 0.5, 2.5, 5, 7.5, dan 10 ppm. Tahap ini dapat dilihat secara jelas pada Lampiran 8.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air dan Ekstraksi Dengan mengetahui kadar air suatu sampel, maka dapat diperkirakan cara penyimpanan terbaik bagi sampel dan menghindari pengaruh aktivitas mikrob. Suatu bahan relatif stabil dari serangan mikrob jika kandungan air sampel tersebut kurang dari 10%. Kadar air daun asam jawa sebesar 9.2%, sedangkan kadar air rimpang kunci pepet sebesar 5.5%(Lampiran 9). Kadar air daun asam jawa dan rimpang kunci pepet yang diperoleh kurang dari 10% sehingga dapat terhindar dari serangan mikrob selama penyimpanan. Jumlah air yang terkandung dalam daun asam jawa dan rimpang kunci pepet tentunya tidak menentu karena banyak faktor yang mempengaruhi, yaitu kelembaban udara, perlakuan terhadap bahan, waktu pengambilan sampling, dan besarnya penguapan (evaporasi) (Harjadi 1987). Metode ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu maserasi dengan air deionisasi dan etanol 70% sebagai larutan pengekstrak. Metode ini berdasarkan pada penelitian Doughari (2006). Rendemen yang diperoleh dari ekstrak air dan etanol daun asam jawa berturut-turut sebesar 20.5 dan 12.2%, sedangkan ekstrak air dan etanol rimpang kunci pepet sebesar 19.2 dan 16.7% (Lampiran 10). Metode maserasi ini menggunakan banyak pelarut dan waktu yang lama dalam prosesnya, tetapi memiliki keuntungan,
yaitu dapat menjaga agar kandungan senyawa dalam sampel yang tidak tahan panas, tidak rusak, dan sampel yang diekstraksi bisa langsung dalam jumlah yang banyak. Rendemen dipengaruhi oleh kadar air. Semakin tinggi kadar air sampel, maka semakin tinggi rendemen ekstrak sampel tersebut. Air dan etanol digunakan sebagai larutan pengekstrak karena kedua pelarut ini biasa digunakan untuk analisis pendahuluan obat dan aman untuk dikonsumsi lebih lanjut. Selain itu, alkohol merupakan pelarut serba guna yang sangat baik untuk ekstraksi pendahuluan karena dapat mengekstraksi senyawa polar dan nonpolar (Harborne 1987). Penggunaan air sebagai larutan pengekstrak juga disebabkan oleh air dapat mengekstraksi senyawa-senyawa yang bersifat polar karena air bersifat polar, sedangkan etanol mempunyai dua gugus yang berbeda kepolarannya, yaitu gugus hidroksil yang bersifat polar dan gugus alkil yang bersifat nonpolar. Adanya kedua gugus tersebut pada etanol diharapkan senyawa-senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda akan terekstrak dalam etanol. Ekstrak ini selanjutnya diuji kandungan senyawa metabolit sekunder, toksisitasnya terhadap larva udang, daya inhibisi terhadap aktivitas lipase pankreas secara in vitro, dan penentuan kadar flavonoid total dari ekstrak terbaik daya inhibisinya. Uji Fitokimia Uji kualitatif fitokimia terhadap daun asam jawa kering, ekstrak kasar air, dan etanol yang diperoleh digunakan untuk mengetahui jenis senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam sampel dan golongan senyawa bioaktif yang terkandung di dalam setiap ekstrak sampel. Golongan senyawa dalam ekstrak kasar dapat ditentukan dengan melihat perubahan warna setelah ditambahkan pereaksi yang spesifik untuk setiap uji kualitatif. Hasil penapisan fitokimia daun asam jawa (Tabel 1) menunjukkan bahwa ekstrak air dan etanol daun asam jawa hampir semua mengandung senyawa metabolit sekunder yang dianalisis, kecuali triterpenoid. Triterpenoid adalah suatu senyawa yang bersifat nonpolar sehingga tidak terdeteksi pada air dan etanol karena air dan etanol bersifat polar. Hasil fitokimia ini sesuai dengan Doughari (2006), tanaman asam jawa mengandung senyawa tanin, alkaloid, saponin, seskuiterpena, dan flobatamin melalui uji fitokimia. Senyawa metabolit sekunder yang
terekstrak dengan etanol lebih banyak daripada yang terekstrak dengan air. Hal ini dapat disebabkan oleh sifat alkohol yang mampu melarutkan senyawa polar dan nonpolar. Tabel 1 Hasil uji fitokimia daun asam jawa Daun asam Golongan jawa Ekstrak Senyawa Kering Air Etanol Alkaloid + ++ +++ Flavonoid + ++ + Saponin + + +++ Steroid + + + Triterpenoid Tanin + ++ +++ Keterangan: + = terdeteksi mengandung senyawa metabolit tersebut. - = tidak terdeteksi mengandung senyawa metabolit tersebut. Tabel 2 Hasil uji fitokimia rimpang kunci pepet Rimpang Golongan kunci pepet Ekstrak Senyawa kering Air Etanol Alkaloid + + + Flavonoid + +++ +++ Saponin + ++ ++ Steroid Triterpenoid +++ Tanin + ++ Keterangan: + = terdeteksi mengandung senyawa metabolit tersebut. - = tidak terdeteksi mengandung senyawa metabolit tersebut. Uji fitokimia terhadap rimpang kunci pepet (Tabel 2) menunjukkan bahwa ekstrak air dan etanol mengandung senyawa alkaloid, flavonoid, dan saponin. Akan tetapi, selain senyawa-senyawa tersebut, ekstrak air rimpang kunci pepet juga mengandung tanin, sedangkan pada ekstrak etanol mengandung triterpenoid. Hasil fitokimia ini sesuai dengan Anonim (2008), rimpang kunci pepet mengandung minyak atsiri yang berwarna kuning muda, alkaloid, saponin, flavonoid, dan polifenol. Senyawa tanin tidak terdeteksi pada ekstrak etanol rimpang kunci pepet, sedangkan pada serbuk rimpang kunci pepet kering dan ekstrak air terdeteksi mengandung senyawa tanin. Hal ini disebabkan oleh tanin merupakan senyawa polifenol yang sifatnya
polar sehingga terekstrak dalam pelarut air dan serbuk keringnya. Tidak terdeteksinya tanin pada ekstrak etanol diduga karena tidak seragamnya umur daun yang digunakan sebagai sampel. Daun yang lebih tua akan mempunyai kadar metabolit sekunder yang lebih banyak dibandingkan dengan yang muda. Senyawa triterpenoid tidak terdeteksi pada serbuk kunci pepet kering, akan tetapi pada ekstrak etanolnya terdeteksi mengandung senyawa triterpenoid. Hal ini disebabkan oleh jumlah triterpenoid yang terdapat dalam rimpang kunci pepet sangat sedikit dan triterpenoid bersifat nonpolar sehingga hanya menunjukkan hasil yang positif pada ekstrak etanol. Kepolaran etanol lebih kecil dibandingkan dengan air sehingga triterpenoid lebih terekstrak dalam etanol. Uji Toksisitas terhadap Larva Udang Uji toksisitas larva udang pada penelitian ini dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk mengamati potensi bioaktivitas dan toksisitas dari masing-masing sampel sehingga dapat ditentukan konsentrasi ekstrak yang aman untuk pengujian. Uji ini menggunakan larva udang karena uji ini mudah, murah, praktis, dan cukup akurat. Jumlah larva udang yang mati akibat pengaruh ekstrak ditunjukkan pada Lampiran 11. Tabel 3 Nilai LC50 ekstrak air dan ekstrak etanol sampel terhadap larva A. salina LC50(ppm) Contoh Ekstrak Daun asam jawa Air 550.27 Etanol 176.41 Rimpang kunci pepet Air 1140.89 Etanol 504.43 Suatu ekstrak tanaman akan bersifat bioaktif apabila mempunyai nilai LC50 kurang dari 1000 ppm (Meyer et al. 1982). Berdasarkan Tabel 3 dapat diketahui bahwa ekstrak air daun asam jawa, ekstrak etanol daun asam jawa dan rimpang kunci pepet berpotensi sebagai senyawa bioaktif dan dapat dijadikan sebagai obat karena menghasilkan LC50 kurang dari 1000 ppm sehingga pada konsentrasi yang rendah telah mampu mematikan 50% populasi larva udang A. salina, sedangkan ekstrak air rimpang kunci pepet mempunyai bioaktivitas yang rendah karena untuk mematikan 50% pupulasi larva udang diperlukan konsentrasi ekstrak di atas 1000 ppm.
Ekstrak yang memiliki potensi bioaktif yang paling tinggi dan bersifat toksik adalah ekstrak etanol daun asam jawa. Hal ini disebabkan oleh ekstrak etanol daun asam jawa memiliki nilai LC50 yang paling rendah, yaitu 176.41 ppm yang berarti pada konsentrasi yang kecil ekstrak ini dapat mematikan setengah populasi dari larva udang A. salina. Ekstrak yang memiliki potensi bioaktif yang tinggi belum tentu mempunyai daya inhibisi yang tertinggi. Hal ini disebabkan oleh nilai LC50 hanya digunakan sebagai batas konsentrasi tertinggi pada penentuan ragam konsentrasi ekstrak dalam uji enzimatik sehingga formulasi obat akan lebih aman jika konsentrasi yang dibuat di bawah LC50. Uji In vitro Ekstrak terhadap Aktivitas Hidrolisis Lipase Pankreas Penentuan aktivitas lipase pankreas dilakukan dengan menggunakan asam oleat dengan konsentrasi 4.25 µmol sebagai standar dengan nilai serapan sebesar 0.041. Perlakuan standar dimulai pada tahap penambahan kloroform-heptana (1:1) yang selanjutnya sama seperti prosedur uji aktivitas hidrolisis lipase pankreas. Substrat yang umumnya digunakan dalam uji in vitro lipase pankreas adalah substrat murni, seperti triolein dan trilinolein. Menurut Desnuelle dan Savary (1963), pengujian in vitro terbaik terhadap aktivitas lipase pankreas adalah dengan menggunakan substrat trigliserida rantai panjang yang tidak larut dalam air dalam bentuk emulsi, seperti minyak wijen dan bimoli. Martatilofa (2008), menguji kandungan dari 2 buah substrat, yaitu minyak bimoli dan wijen yang menunjukkan bahwa bilangan asam minyak wijen, yaitu 3.8 mg KOH/g minyak, jauh lebih tinggi daripada bilangan asam minyak Bimoli sebagai pembanding, yaitu 0.43 mg KOH/g minyak. Bilangan asam menunjukkan kadar asam lemak bebas pada minyak. Semakin tinggi bilangan asam, maka semakin tengik minyak tersebut. Pengujian aktivitas lipase pankreas pada minyak wijen sebesar 4.1 × 103 μmol/l.menit, sedangkan pada minyak Bimoli sebesar 1.0×103 μmol/l.menit. Kandungan utama dari minyak wijen adalah asam oleat dan asam linoleat. Berdasarkan hal tersebut, maka substrat yang digunakan pada penelitian ini adalah minyak wijen. Hasil optimasi lipase pankreas yang dilakukan oleh Martatilofa dan Silitonga (2008) menunjukkan bahwa enzim ini memiliki aktivitas optimum pada pH 8, waktu
inkubasi 45 menit, dan suhu 40°C. Menurut Hadvary et al. (1988), lipase pankreas juga memiliki aktivitas optimum pada pH 8. Konsentrasi lipase pankreas yang digunakan sebesar 1.4 × 10-5 μg/μl, konsentrasi substrat yang digunakan sebesar 16.2 μg/μl, dan panjang gelombang yang menunjukkan serapan maksimum sebesar 435 nm sehingga penelitian ini menggunakan kondisi optimum tersebut. Suhu dan pH optimum dari suatu enzim sangat penting untuk diketahui karena pada keadaan tersebut enzim mempunyai stabilitas dan aktivitas yang optimum. Ekstrak dianalisis dengan melarutkan ekstrak ke dalam larutan bufer fosfat pH 8. Tujuan ekstrak dilarutkan dalam bufer fosfat pH 8, yaitu menghilangkan efek samping pelarut yang mungkin dapat mempengaruhi aktivitas lipase pankreas. Penambahan bufer fosfat pH 8 bertujuan mengkondisikan substrat yang akan dihidrolisis dan mempertahankan pH lipase pankreas supaya tetap ber-pH 8 sehingga hidrolisis tetap dalam keadaan optimum. Penambahan kloroform bertujuan menghentikan reaksi hidrolisis substrat oleh lipase pankreas, sedangkan penambahan campuran kloroform-heptana (1:1) bertujuan mengekstraksi asam lemak (asam oleat) yang dihasilkan dari hidrolisis minyak wijen yang terdapat dalam larutan campuran. Penambahan pereaksi tembaga bertujuan mengikat asam lemak bebas (asam oleat) hasil hidrolisis lipase pankreas, sedangkan natrium dietilditiokarbamat bertujuan mengkompleks asam lemak (asam oleat) yang dihasilkan dari reaksi hidrolisis lipase pankreas. Seluruh ekstrak diuji aktivitas lipase pankreas secara in vitro dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada berbagai konsentrasi dalam menghambat aktivitas lipase pankreas dan dihitung daya inhibisinya. Ragam konsentrasi ekstrak yang digunakan adalah 100, 150, 200, 250, dan 300 ppm serta masing-masing konsentrasi dilakukan dengan tiga kali ulangan. Pengujian pada konsentrasi bervariasi ini ditunjukkan untuk melihat pengaruh penambahan konsentrasi ekstrak terhadap peningkatan daya inhibisi dan penurunan aktivitas lipase pankreas. Selain itu juga ditunjukkan untuk melihat besarnya daya inhibisi ekstrak pada serangkaian konsentrasi di bawah nilai toksisitasnya (LC50) dan dilakukan pengamatan aktivitas lipase pankreas tanpa penambahan ekstrak (kontrol negatif) untuk melihat pengaruh inhibisi ekstrak tersebut terhadap aktivitas lipase pankreas.
60.0 49.0
D a y a i n h i b i s i (% )
50.0
42.3
45.0
41.1
65.1 56.2
60.00
36.9 36.5
32.0 10.8 20.00 10.6 40.00
26.6 4.1
0.00
-20.00
100
150
200
250
300
-18.7
-2.5
-40.00
30.0
10.0
80.00
39.4
40.0
20.0
inhibisi yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak air daun asam jawa dan kontrol positif terhadap aktivitas lipase pankreas manusia. Hal ini disebabkan oleh jumlah kandungan senyawa metabolit sekunder yang dimiliki oleh ekstrak etanol lebih banyak dibandingkan dengan ekstrak air daun asam jawa. Hasil ini senada dengan penelitian yang dilakukan oleh Han et al. (1999) dan Rahardjo et al. (2005) menyatakan bahwa ekstrak air tanaman teh oolong dan ekstrak etanol daun jati belanda dapat menghambat aktivitas lipase. Hal ini senada juga dengan Silitonga (2008) yang menyatakan bahwa ekstrak etanol daun jati belanda dan rimpang bangle memiliki daya inhibisi lebih besar dibandingkan dengan ekstrak air. Hal ini sama dengan kemampuan ekstrak etanol CT-II dari buah Cassia nomame yang menunjukkan bahwa ekstrak etanol dari buah tersebut mampu menghambat aktivitas lipase pankreas porsin secara in vitro pada konsentrasi 0.07 sampai dengan 0.1 mg/ml dengan daya inhibisi sebesar 50% dan triolein sebagai substrat, serta pengaruh antiobesitas pada tikus yang mempunyai lemak yang tinggi secara in vivo, sehingga dapat digunakan sebagai zat tambahan untuk pencegahan obesitas dan hipertrigliseridemia pada manusia (Yamamoto et al. 2000).
D a y a in h ib is i (% )
Aktivitas lipase pankreas dengan penambahan ekstrak dihitung dengan membandingkan nilai serapannya dengan serapan standar, yaitu asam oleat (Lampiran 7), kemudian aktivitas lipase pankreas dihitung sebagai μmol asam oleat/l.menit. Daya inhibisi ekstrak dilihat dari penurunan aktivitas lipase pankreas yang dihitung dari selisih nilai aktivitas lipase pankreas kontrol negatif (tanpa ekstrak) dengan zat uji. Pengaruh penambahan ekstrak air dan etanol 70% daun asam jawa pada berbagai konsentrasi ditunjukkan oleh Gambar 4. Berdasarkan semua ragam konsentrasi memiliki kemampuan sebagai inhibitor lipase pankreas, daya inhibisinya lebih besar dibandingkan dengan kontrol positif, dan peningkatan daya inhibisi lipase pankreas tidak berbanding lurus dengan peningkatan konsentrasi ekstrak. Artinya, peningkatan konsentrasi ekstrak yang ditambahkan tidak selalu meningkatkan daya inhibisinya. Berdasarkan pernyataan di atas tipe inhibitor lipase pankreas ini tidak dapat disimpulkan karena pada penelitian ini tidak dilakukan penelitian yang lebih lanjut tentang kinetika enzim. Kontrol positif memiliki daya inhibisi sebesar 10.6% pada konsentrasi 100 ppm, ekstrak air daun asam jawa memiliki daya inhibisi yang terbesar pada konsentrasi 300 ppm sebesar 39.4%, dan ekstrak etanol memiliki daya inhibisi terbesar pada konsentrasi 150 ppm sebesar 49.0% (Gambar 4). Artinya, ekstrak air dan etanol daun asam jawa pada konsentrasi 300 dan 150 ppm mampu menghambat akivitas enzim lipase pankreas untuk menghidrolisis asam oleat sebesar 39.4 dan 49.0%.
24.5
21.6
Konsentrasi (ppm)
21.4
10.6 5.8
Kontrol positif Ekstrak air kunci pepet Ekstrak etanol kunci pepet
6.0
0.0 100
150
200
250
300
Konsentrasi (ppm) Kontrol positif Ekstrak air daun asam jawa Ekstak etanol daun asam jawa
Gambar 4 Daya inhibisi kontrol positif, ekstrak air, dan ekstrak etanol daun asam jawa terhadap aktivitas lipase pankreas. Berdasarkan Gambar 4 terlihat bahwa ekstrak etanol daun asam jawa memiliki daya
Gambar 5 Daya inhibisi kontrol positif, ekstrak air, dan etanol rimpang kunci pepet terhadap aktivitas lipase pankreas. Hasil pengujian ekstrak rimpang kunci pepet terhadap aktivitas lipase pankreas terlihat pada Gambar 5. Berdasarkan Gambar 5 terlihat bahwa tidak semua ragam konsentrasi ekstrak etanol rimpang kunci pepet memiliki kemampuan sebagai inhibitor
lipase pankreas, sedangkan semua ragam konsentrasi ekstrak air rimpang kunci pepet memiliki kemampuan sebagai inhibitor lipase pankreas. Daya inhibisi ekstrak air dan etanol rimpang kunci pepet pada konsentrasi 100 ppm lebih besar dibandingkan dengan kontrol positif. Ekstrak air rimpang kunci pepet memiliki daya inhibisi maksimum pada konsentrasi 200 ppm dengan daya inhibisi sebesar 65.1% dan ekstrak etanol pada konsentrasi 250 ppm dengan daya inhibisi sebesar 36.5%. Ekstrak etanol rimpang kunci pepet pada konsentrasi 200 dan 300 ppm memiliki daya inhibisi bernilai negatif dan aktivitas lipase pankreas meningkat. Hal ini diduga ekstrak yang digunakan masih berupa ekstrak kasar yang belum murni karena masih berupa gabungan dari beberapa golongan senyawa yang kemungkinan memiliki respon yang berbeda atau bahkan bersifat antagonis satu sama lain dalam menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi tertentu. Berdasarkan hasil tersebut terlihat bahwa ekstrak air memiliki daya inhibisi yang paling tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol. Walaupun dari hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etanol rimpang kunci pepet lebih banyak mengandung senyawa metabolit sekunder. Hasil ini didukung oleh penelitian Han et al. (1999) yang menyatakan bahwa ekstrak air teh oolong dapat menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi 500-2000 μg/ml dan senyawa kafein diidentifikasi sebagai aktivator noradrenalin yang menyebabkan lipolisis. Lee et al. (2005) menyatakan bahwa senyawa krosetin dan krosin yang diisolasi dari ekstrak air Gardenia fructus berpotensi sebagai inhibitor lipase pankreas secara in vitro dengan nilai IC50 sebesar 2.1 dan 2.7 mg/ml (triolein sebagai substrat), krosin dan krosetin juga berpotensi dalam aktivitas hipolipidemik (antiobesitas) pada Triton WR133 atau minyak jagung yang diberikan pada tikus yang mempunyai lemak tinggi secara in vivo. Daya inhibisi tertinggi ekstrak etanol kedua tanaman melebihi daya inhibisi tertinggi ekstrak etanol beberapa tanaman lainnya terhadap aktivitas lipase, seperti ekstrak etanol daun jati belanda, yaitu 25.3% pada konsentrasi 60 ppm dan rimpang bangle sebesar 29.2% pada konsentrasi 100 ppm (Silitonga 2008), serta daun kemuning sebesar 22.8% pada konsentrasi 30 ppm (Martatilofa 2008). Daya inhibisi ekstrak etanol lebih besar pada daun asam jawa karena pada ekstrak
etanol lebih banyak senyawa yang terekstrak dan senyawa tersebut dapat menghambat aktivitas lipase pankreas, sehingga meningkatkan pengaruh penghambatan terhadap enzim tersebut, sedangkan ekstrak air pada rimpang kunci pepet mempunyai daya inhibisi yang paling besar dibandingkan dengan ekstrak etanol. Senyawa-senyawa yang diperkirakan dapat menghambat aktivitas lipase pankreas pada ekstrak air dan ekstrak etanol daun asam jawa, yaitu flavonoid, saponin, steroid, dan tanin. Senyawa yang diduga dapat menghambat aktivitas lipase pankreas pada ekstrak air rimpang kunci pepet, yaitu flavonoid, tanin, dan saponin, sedangkan senyawa yang diduga dapat menghambat aktivitas ekstrak etanol rimpang kunci pepet, yaitu flavonoid, saponin, dan triterpenoid. Senyawa flavonoid terbukti dapat menghambat aktivitas lipase secara in vitro, di antaranya yaitu yang terdapat pada rimpang bangle (Iswantini et al. 2003) dan galangal (Shin et al. 2003). Saponin juga terbukti dapat menghambat aktivitas lipase baik secara in vitro maupun in vivo, yaitu yang terdapat pada daun Thea sinensis dan rimpang Panax japonicus (Han et al. 2001dan 2005). Han et al. (2001) menyatakan bahwa senyawa teasaponin yang terdapat dalam daun Thea sinensis dapat menghambat hidrolisis triolein yang diemulsi dengan lesitin, Triton X-100 atau 4-metilumbeliferioleat. Han et al. (2005) menyatakan bahwa senyawa chikusetsusaponin III, chikusetsusaponin IV, 28deglukosilchikusetsusaponin IV, dan 28deglukosilchikusetsusaponin yang diisolasi dari fraksi saponin total rimpang Panax japonicus mampu menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi 125-500 µg/ml secara in vivo. Li et al. (2007) menyatakan bahwa fraksi kasar saponin Acanthopanax senticosus yang mengandung senyawa silfiosida F, kopterosida B, hederagenin 3-O-β-D-glukuronopiranosida dapat menghambat aktivitas lipase pankreas dengan nilai IC50 sebesar 0.22, 0.25, 0.26, dan 0.29 mM. Kim et al. (2005) menyatakan bahwa ekstrak saponin kasar ginseng merah Korea dapat mengurangi bobot badan tikus pada konsentrasi 200 ppm selama 3 minggu yang dilakukan secara in vivo. Selain itu, senyawa tanin pada ekstrak tanin rimpang bangle juga memiliki potensi dalam menghambat aktivitas lipase (Iswantini et al. 2003). Senyawa triterpenoid yang terdapat pada ekstrak etanol rimpang kunci pepet dapat menghambat aktivitas lipase
pankreas. Hal ini senada dengan Xu et al. (2005) yang menyatakan bahwa senyawa triterpenoid pada Platycodi radix yang mengandung senyawa platikodin A, C, D, dan deaploplatikodin D diketahui dapat menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi 500 μg/ml dengan daya inhibisi sebesar 3.3, 5.2, 34.8, dan 11.7%. Adanya senyawa alkaloid pada ekstrak etanol rimpang kunci pepet diduga mengakibatkan adanya peningkatan aktivitas lipase pankreas sehingga daya inhibisinya menurun, akan tetapi belum ada literatur yang mengatakan bahwa senyawa alkaloid mampu meningkatkan aktivitas lipase pankreas. Oleh karena itu, adanya alkaloid akan memberikan pengaruh yang berlawanan dan mengakibatkan daya inhibisi ekstrak menurun, sedangkan adanya flavonoid, saponin, dan tanin akan memberikan pengaruh yang sinergis dan mengakibatkan daya inhibisi ekstrak meningkat. Tabel 4 Daya inhibisi maksimum kontrol negatif, kontrol positif, dan ekstrak tanaman Ekstrak Kontrol (-) Air daun asam jawa Etanol daun asam jawa Air rimpang kunci pepet Etanol rimpang kunci pepet Kontrol (+)
Konsentrasi (ppm) 0
Daya Inhibisi (%) 0.0
300
39.4
150
49.0
200
65.1
250
36.5
100
10.6
Tabel 4 memuat data daya inhibisi maksimum tiap ekstrak tanaman, kontrol negatif (tanpa penambahan ekstrak), dan kontrol positif (dengan penambahan Xenical®). Berdasarkan data tersebut terlihat bahwa semua ekstrak tanaman mempunyai daya inhibisi lebih besar dibandingkan dengan daya inhibisi Xenical® sebagai kontrol positif. Ekstrak air rimpang kunci pepet paling berpotensi dalam menghambat aktivitas lipase pankreas dibandingkan dengan yang lainnya karena daya inhibisinya lebih dari 50%. Ekstrak air rimpang kunci pepet dapat menurunkan aktivitas enzim dari 2.11 × 104 µmol/l.menit menjadi 1.68 × 104 µmol/l.menit pada konsentrasi 200 ppm. Shin et al. (2003) dan Lee et al. (2005) menyatakan bahwa daya inhibisi ekstrak 3-metileter galangin dari Alpinia officinarum dan krosetin dari Gardenia jasminoides terhadap aktivitas
lipase pankreas secara in vitro dengan menggunakan substrat triolein lebih kecil dibandingkan dengan daya inhibisi orlistat sebagai kontrol positif. Krosin dan krosetin dapat menghambat biosintesis trigliserida sebagaimana halnya kolesterol dan absorpsinya dari intestin dalam darah. Krosin dan krosetin berpotensi sebagai inhibitor pada dosis 50 mg/kg, sedangkan Xenical® pada dosis 10 mg/kg. Jika memperhatikan data tersebut, maka hasil penelitian kali ini membuktikan bahwa ekstrak daun asam jawa dan rimpang kunci pepet memiliki pengaruh yang lebih besar terhadap penghambatan aktivitas lipase pankreas, sehingga sangat memungkinkan untuk digunakan sebagai obat antiobesitas. Kontrol positif yang digunakan, yaitu Xenical® yang mengandung zat aktif berupa orlistat (tetrahidrolipstatin). Xenical® (orlistat) merupakan antiobesitas pertama yang tidak bekerja sebagai penekan nafsu makan, tetapi bekerja dengan cara menghambat aktivitas lipase pankreas. Cara kerja orlistat, yaitu sebagai penghambat lemak, lemak yang dikonsumsi dari 30% tidak dapat diserap oleh usus. Dengan demikian, terjadi defisit kalori yang akan menghasilkan penurunan berat badan secara signifikan. Lemak diserap dalam bentuk trigliserida yang mengandung satu molekul monogliserida dan dua molekul asam lemak bebas. Sebagian besar proses pencernaan lemak terjadi pada bagian pertama usus kecil (duodenum) yang banyak mengandung cairan pankreas dan tempat berlangsungnya reaksi enzimatik. Lemak akan diemulsifikasi (dipecah menjadi butiranbutiran kecil) membentuk globula lemak yang tipis dan berdiameter 200 sampai dengan 5000 nm. Mekanisme orlistat dalam menghambat aktivitas lipase pankreas ialah nonkompetitif, yaitu dengan cara membentuk suatu ikatan kovalen pada bagian serin yang aktif dari lipase pankreas dan lambung, sehingga mengubah enzim tersebut menjadi nonaktif (Roche 2008a). Xenical® digunakan sebagai kontrol positif, yaitu untuk membandingkan mekanisme antara sampel dengan kontrol positif terhadap lipase pankreas, tetapi pada penelitian ini mekanisme sampel terhadap lipase pankreas tidak diketahui karena tidak dilakukan penelitian yang lebih lanjut mengenai mekanisme sampel terhadap lipase pankreas. Berdasarkan Gambar 6 dapat terlihat bahwa daya inhibisi terbesar kontrol positif (Xenical®) sebesar 10.6% pada konsentrasi 100 ppm, sedangkan pada konsentrasi 150
sampai dengan 300 ppm daya inhibisinya bernilai negatif. Artinya, kontrol positif (Xenical®) bekerja maksimum dalam menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi 100 ppm. Nilai daya inhibisi Xenical® tersebut berbeda dengan yang dikemukakan oleh Silitonga (2008) dengan konsentrasi yang sama, yaitu sebesar 17.5%. Hal ini dapat disebabkan oleh konsentrasi substrat yang digunakan berbeda, yaitu 16.7 µg/µl dan pada waktu dilarutkan Xenical® tidak larut sempurna dengan bufer fosfat pH 8 karena Xenical® lebih larut dalam etanol dan metanol (Roche 2008a). Akan tetapi, hasil ini tidak senada dengan Hadvary et al. (1988). Hadvary et al. (1988) menyatakan bahwa orlistat mampu menghambat lipase pankreas hingga 50% pada konsentrasi 0.1 µg/ml secara in vitro dan 0.3 µg/ml secara in vivo pada cairan usus tikus. Xenical® yang digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian ini tidak berupa orlistat murni. Metode dan bahan-bahan yang digunakan pun berbeda. Hadvary et al. (1988) menggunakan substrat triolein murni, bufer Tris/HCl, NaCl, CaCl2, dimetil sulfoksida pada suhu ruang, dan waktu inkubasi 10 menit. 15.0
10.6
D a y a in h ib is i (% )
10.0 5.0 0.0 -5.0
100
150
200
250
-10.0
-9.3
-15.0 -20.0
-18.3
-25.0 -30.0
300
-23.4 -26.3 Konsentrasi (ppm)
Gambar 6 Daya inhibisi kontrol positif (Xenical®) pada berbagai konsentrasi terhadap aktivitas lipase pankreas. Perbedaan metode uji inhibisi, substrat, dan waktu inkubasi akan sangat mempengaruhi nilai daya inhibisi yang diperoleh dari setiap percobaan. Metode yang digunakan pada penelitian ini dapat dikatakan lebih efektif karena dengan menggunakan substrat dan pereaksi-pereaksi lain yang lebih murah dan sederhana telah dapat memperlihatkan kemampuan inhibisi ekstrakekstrak contoh terhadap aktivitas lipase pankreas.
Uji Statistik Berdasarkan data yang diperoleh kemudian dilakukan uji statistik, yaitu uji beda perlakuan menggunakan uji Duncan dengan rancangan acak lengkap. Uji ini dilakukan untuk menguji apakah tiap perlakuan memiliki perbedaan yang nyata dalam menghambat aktivitas lipase pankreas (Hanafiah 2005). Perlakuan yang dibandingkan adalah ekstrak air dan etanol pada daya inhibisi maksimum dari kedua tanaman, serta perlakuan dengan kontrol negatif dan kontrol positif. Berdasarkan perhitungan yang telah dilakukan (Lampiran 13) terlihat bahwa daya inhibisi ekstrak etanol dari daun asam jawa dan rimpang kunci pepet tidak berbeda nyata karena daya inhibisi kedua tanaman tersebut tidak berbeda jauh. Untuk ekstrak air, daya inhibisi dari kedua tanaman ini berbeda nyata. Hal ini disebabkan oleh nilai daya inhibisi ekstrak air rimpang kunci pepet yang jauh lebih besar dibandingkan dengan ekstrak air daun asam jawa. Uji beda perlakuan terhadap hasil inhibisi terbaik, yaitu ekstrak etanol daun asam jawa, ekstrak air rimpang kunci pepet, kontrol negatif, dan kontrol positif menyatakan bahwa semua perlakuan memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata. Perlakuan tersebut, yaitu ekstrak etanol daun asam jawa dengan kontrol negatif, ekstrak air rimpang kunci pepet dengan kontrol negatif, ekstrak etanol daun asam jawa dengan kontrol positif, ekstrak air rimpang kunci pepet dengan kontrol positif, ekstrak etanol daun asam jawa dengan ekstrak air rimpang kunci pepet, dan kontrol negatif dengan kontrol positif. Data daya inhibisi masing-masing ekstrak digunakan untuk menentukan kurva estimasi dengan program SPSS. Selanjutnya dari program tersebut akan diperoleh persamaan kurva estimasi. Estimasi kurva yang diuji adalah kurva linier, kuadratik, logaritmik, inverse, dan kubik. Berdasarkan uji tersebut diperoleh nilai koefisien determinasi (R2) dibawah 50% untuk semua ekstrak (Lampiran 14). Artinya keragaman dari konsentrasi ekstrak tidak dapat dijelaskan dengan baik oleh model dari masing-masing kurva. Hal ini memperlihatkan bahwa grafik daya inhibisi dari masing-masing ekstrak tidak mewakili salah satu dari kelima pola kurva yang diuji. Hal ini dapat diakibatkan oleh jumlah data (variasi konsentrasi) yang sedikit, sehingga sulit untuk menentukan pola dari masingmasing ekstrak.
Metode ini berdasarkan pada Codex (1986) diacu dalam Nobre et al. (2005) dengan beberapa modifikasi, yaitu sistem hidrolisis yang berupa 1.0 ml urotropin 0.5% dan 2 ml asam hidroklorat diganti dengan larutan heksametilenatetramina 0.5% (b/v) dalam metanol dan 2 ml HCl 25%, serta panjang gelombang yang digunakan dari 425 nm diganti dengan 370.8 nm. Kadar flavonoid dan senyawa fenolik lain di dalam tanaman berbeda-beda di antara setiap bagian, jaringan, dan umur tanaman, serta dipengaruhi oleh faktor-faktor lingkungan. Faktor-faktor yang mempengaruhi, yaitu temperatur, sinar UV, sinar tampak, nutrisi, ketersediaan air, dan kadar CO2 pada atmosfer. Oleh karena itu, pada penelitian ini perlu dilakukan penentuan kadar flavonoid total pada ekstrak yang memiliki daya inhibisi terbesar. Ekstrak yang dinalisis kadar flavonoid totalnya, yaitu ekstrak etanol daun asam jawa dan ekstrak air rimpang kunci pepet. Metode analisis yang biasa digunakan untuk menentukan kadar flavonoid dalam simplisia tanaman obat, yaitu dengan spektrofotometri UV (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005), kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Merken & Beecher 2000), dan elektroforesis kapiler (Marchart et al. 2003). Metode-metode tersebut melibatkan serangkaian tahapan yang membutuhkan waktu yang lama dalam pelaksanaannya. Metode lain yang dapat digunakan untuk menentukan kadar flavonoid, yaitu teknik infra red (IR) yang digabungkan dengan kemometrik. Pada penelitian ini metode yang digunakan, yaitu metode Codex (1986) diacu dalam Nobre et al. (2005) disebut juga metode AlCl3. Analisis kadar flavonoid total diawali dengan memilih sampel yang memiliki daya inhibisi terbesar. Setelah didapatkan ekstrak sampel yang memiliki daya inhibisi terbesar, maka dilakukan analisis kadar flavonoid total. Rendemen ekstrak etanol daun asam jawa dan ekstrak etanol rimpang kunci pepet yang diperoleh adalah 12.2 dan 19.2% (b/b). Berdasarkan metode analisis Chang et al. (2002), flavonoid total yang terukur termasuk dari golongan flavon dan flavonol yang terdapat pada ekstrak karena kedua golongan ini yang dapat membentuk kompleks stabil dengan AlCl3. Kadar flavonoid total dihitung berdasarkan kurva standar kuersetin sehingga diperoleh persamaan regresi linear, yaitu y = 0.1064 x + 0.0245 dengan R2 = 0.9932 yang selanjutnya
akan digunakan untuk menghitung konsentrasi flavonoid dan kadar flavonoid total. Berdasarkan hasil percobaan, konsentrasi flavonoid ekstrak etanol daun asam jawa dan ekstrak air rimpang kunci pepet berturut-turut sebesar 0.40 dan 0.024 ppm, sedangkan kadar flavonoid total dari ekstrak etanol daun asam jawa dan ekstrak air rimpang kunci pepet berturut-turut sebesar 0.03 dan 0.02 ×10-2% (b/b) (Lampiran 15). 1.2
y = 0.1064x + 0.0245 R2 = 0.9932
1 A b s o rb a n s
Kadar Flavonoid Total
0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
2
4
6
8
10
12
Konsentrasi (ppm)
Gambar 7 Kurva standar kuersetin. Sebagaimana penelitian yang dilakukan sebelumnya oleh Kurniasari dan Wahyuningrum (2006) dengan metode yang sama, kadar flavonoid total daun Meniran Bantar Kambing, Darmaga, dan Cisarua berturut-turut sebesar 1.6, 1.4, dan 1.1% (b/b), sedangkan daun Tempuyung Jawa Tengah, Cimanggu, dan Leuwiliang berturut-turut sebesar 0.8, 0.6, dan 0.8% (b/b). Kadar flavonoid ekstrak etanol daun asam jawa lebih besar dibandingkan dengan ekstrak air rimpang kunci pepet. Hal ini berarti kadar flavonoid total daun asam jawa dan rimpang kunci pepet yang diperoleh lebih kecil dibandingkan dengan daun Meniran dan Tempuyung. Umar (2008) melakukan optimasi penentuan kadar flavonoid total pada daun jati belanda yang diekstraksi menggunakan pelarut etanol dengan metode refluks. Hasil optimalisasi tersebut adalah kadar flavonoid total daun jati belanda secara optimal diperoleh dengan nisbah antara simplisia dengan pelarut adalah sebesar 1:10 yang direfluks selama 3 jam menggunakan etanol 70%. Pada penelitian ini ekstrak etanol daun asam jawa dan ekstrak air rimpang kunci pepet yang diperoleh menggunakan etanol 70% dan air deionisasi dengan nisbah 1:5 secara maserasi selama 3×24 jam. Optimalisasi kondisi ekstraksi sampel pada penelitian ini tidak dilakukan sebelumnya sehingga kadar flavonoid ekstrak yang diperoleh diduga belum optimal.
Day dan Underwood (2001) mengemukakan bahwa hasil analisis kuantitatif perolehan analit dapat digolongkan menjadi 3 kelompok, yaitu analit yang merupakan konstituen utama, konstituen minor, dan konstituen jejak atau runut. Analisis kuantitatif flavonoid pada ekstrak etanol daun asam jawa menunjukkan keberadaan flavonoid sebagai konstituen minor karena kadar yang diperoleh berada di antara 0.01-1%, sedangkan ekstrak air rimpang kunci pepet menunjukkan keberadaan flavonoid sebagai konstituen jejak atau runut karena kadar yang diperoleh kurang dari 0.01%.
SIMPULAN Ekstrak air dan etanol daun asam jawa dan rimpang kunci pepet berpotensi sebagai antiobesitas karena mampu menghambat aktivitas lipase pankreas. Ekstrak air rimpang kunci pepet memiliki daya inhibisi tertinggi dari semua ekstrak, yaitu sebesar 65.1% pada konsentrasi 200 ppm. Daya inhibisi yang dimiliki oleh ekstrak etanol daun asam jawa, ekstrak air rimpang kunci pepet, kontrol negatif, dan kontrol positif secara statistik berbeda nyata. Ekstrak etanol daun asam jawa memiliki kadar flavonoid dengan konstituen minor, sedangkan ekstrak air rimpang kunci pepet memiliki kadar flavonoid dengan konstituen jejak atau runut.
SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak, yang secara khusus berpotensi menghambat aktivitas lipase pankreas. Penggunaan substrat murni perlu dilakukan agar hasil reaksi yang diperoleh lebih optimum. Selain itu, perlu dilakukan uji in vivo terhadap hewan uji untuk mengetahui kemampuan senyawa aktif dalam sampel yang berpotensi sebagai antiobesitas.
DAFTAR PUSTAKA Alviar B et al., penemu; Access Business Group International LLC. 2 Jul 2002. Diet composition and method of weight management. US patent 6413545. [Anonim]. 2008. Kunci pepet. [terhubung berkala]. http://google.com/google/Kunci pepet. [5 Feb 2008].
[AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2000. Official Methods of Analysis of AOAC International. Volume ke-1. Ed ke-17. Agricultural Chemicals, Contaminants, Drugs. Maryland: AOAC International. Backer RT et al., penemu; Eli Lilly and Company. 1 Jan 2008. Melanocortin receptor agonist. US patent 7314879. Bentley JM et al., penemu; Hoffman-La Roche Inc, Vernaly Research Limited. 29 Jan 2008. Morpholine derivatives as 5HT2C receptor agonists for the treatment of obesity. US patent 7323466. Birari RB, Bhutani KK. 2007. Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential. Drug Discovery Today 12:379-389. Bishop ML, Fody EP, Schoeff LE. 2004. Clinical Chemistry. Fifth Edition. Washington DC: Wolters Kluwer Health.. Chang CC, Yang MH, Wen HM, Chern JC. 2002. Estimation of total flavonoids content in propolis by two complementary colorimetric methods. J Food Drug Anal 10: 178-182. Darusman LK, Rohaeti E, Sulistiyani. 2001. Kajian senyawa golongan flavonoid asal tanaman bangle sebagai senyawa peluruh lemak melalui aktivitas lipase. Bogor: Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian, IPB. Day RA, Underwood AL. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Iis Sopyan. Penerjemah. Terjemahan dari: Quantitative Analysis. Sixth Edition. Jakarta: Erlangga. Desnuelle P, Savary P. 1963. Specifities of lipases. J Lipid Res 4:369-384. Digest Otc. 2006. Memilih obat pelangsing. [terhubung berkala]. http://sehat bugar. multiply.com/journal. [29 Des 2008]. Doughari JH. 2006. Antimicrobial activity of Tamarindus indica Linn. Tropical J Pharmaceu Res 5(2):597-603. Febriany S. 2004. Potensi ekstrak tunggal bangle dan gabungannya dalam meningkatkan aktivitas enzim lipase secara in vitro [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia, FMIPA. Bogor: IPB. Girindra A. 1993. Biokimia I. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
Hadvary P, Lengsfeld H, Wolfer H. 1988. Inhibition of pancreatic lipase in vitro by the covalent inhibitor tetrahydroplastin. J Biochem 256:357-361.
Joshita D, Azizahwati, Wahyuditomo. 2000. Pengaruh daun jati belanda terhadap kerja enzim lipase secara in vitro. Warta Tumbuhan Obat Indonesia 6(2):16-22.
Han LK, Takaku T, Li J, Kimura Y, Okuda H. 1999. Anti-obesity action of oolong tea. Int J Obesity 23:98-105.
Kim JH et al. 2005. Effect of crude saponin of Korean Red Ginseng on high fat dietinduced obesity in the rat. J Pharmacol Sci 97:124-131.
Han LK et al. 2001. Anti-obesity effects in rodents of dietary teasaponin, a lipase inhibitor. Int J Obesity 25:1459-1464. Han LK, Zheng NY, Yoshikawa M, Okuda H, Kimura Y. 2005. Anti-obesity effects of chikusetsusaponins isolated from Panax japonicus rhizomes. BioMed Central 5:110. Han LK et al. 2006. Reduction of fat storage in mice fed a high-fat diet long term by treatment with saponins prepared from Kochia scoparia fruit. Phytother Res 20:877-882. Hanafiah KA. 2005. Rancangan Percobaan Aplikatif. Jakarta: Raja Grafindo Persada. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Terjemahan K. Padamawinata & I. Soediro. Bandung: ITB. Hendri J. 2006. Jati belanda si pelangsing pengusir kaki gajah. [Artikel]. Anekaplantasia. Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid ke-1. Jakarta: Yayasan Sarana Warna Jaya. Heyne K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid ke-3. Jakarta: Yayasan Sarana Warna Jaya. Iswantini D, Darusman LK, Gunawan E, Nurulita Y. 2003. Identifikasi senyawa bioaktif daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) sebagai pelangsing dengan menggunakan metode enzimatis (enzim lipase). Jurnal Ilmiah Pertanian Gakuryoku 9:138-142. Iswantini D, Darusman LK, Febriany S. 2004. Pengaruh ekstrak tunggal dan gabungan dari bangle terhadap aktivitas enzim lipase dalam kajian sebagai pelangsing. Di dalam: Tanaman Obat Indonesia XXIV. Prosiding Seminar dan Pameran Nasional; Bogor, 19-20 September 2003. Bogor: Pusat Studi Biofarmaka Lembaga Penelitian Institut Pertanian Bogor. hlm 276-283.
Kurniasari I. 2006. Metode cepat penentuan flavonoid total Meniran (Phyllanthus niruni L.) berbasis teknik spektrometri IR dan kemometrik [skripsi]. Jurusan Kimia. FMIPA. Bogor: IPB. Lee IA, Lee JA, Baek NI, Kim DH. 2005. Antihiperlipidemic effect of crocin isolated from the fructus of Gardenia jasminoides and its metabolite crocetin. Biol Pharm Bull 28(11):2106-2110. Lehninger AL. 1982. Dasar-Dasar Biokimia. Jilid I. Terjemahan Maggy Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga. Li F, Li W, Fu H, Zhang Q, Koike K. 2007. Pancreatic lipase-inhibiting triterpenoid saponin from fruit of Acanthopanax senticosus. Chem Pharm Bull 55(7):10871089. Maiti R, Das UK, Ghosh D. 2005. Attenuation of hyperglycemia in Streptozotocininduced diabetic rats by aqueous extract of seed of Tamarindus indica. Biol Pharm Bull 28(7):1172-1176. Marchart E, Krenn L, Kopp B. 2003. Quantificication of the flavonoid glycosides in Passiflora incarnata by capillary electrophoresis. Planta Med 69:452-456. Martatilofa E. 2008. Daya inhibisi ekstrak bangle, jati balanda, kemuning, dan formula biolangsing terhadap lipase pankreas [skripsi]. Jurusan Kimia. FMIPA. Bogor: IPB. Merken HM, Beecher GR. 2000. Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones. J Chromatogr A 897:177-184. Meyer et al. 1982. Brine shrimp: A convient general bioassay for active plant constituents. Planta Medica 45:31-34. Muthu SE, Nandakumar S, Rao UA. 2005. The effect of methanolic extract of Tamarindus indica Linn. On the growth of clinical isolates of Burkholderia
pseudomallei. Indian J Med Res 122:525528. Nobre CP, Raffin FN, Moura TF. 2005. Standardization of extracts from Momordica charantia L. (Cucurbitaceae) by total flavonoids content determination. Acta Farm. Bonaerense 24(4): 562-566. Pramono, S., Nurwati, S., Sugiyanto. 2000. Pengaruh lendir daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.). Warta Tumbuhan Obat Indonesia 6(2):14-15. Rahardjo SS. 2004. Pengaruh ekstrak etanol daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) terhadap aktivitas enzim lipase serum Rattus norvegicus [tesis]. Jurusan Kedokteran. Yogyakarta: UGM. Roche. 2008a. Xenical® (Orlistat). [terhubung berkala]. http://www. roche. co.id/bahasa/index.htm [7 Des 2008]. Roche. 2008b. Xenical: Drug Description. [terhubung berkala]. http://www. roche.co.id/bahasa/index.htm. [7 Des 2008]. Setiawati A. 1995. Adrenergik dalam Farmakologi dan Terapi. Ed ke-4. Jakarta: UI Press. Shin JE, Han MJ, Kim DH. 2003. 3Methylethergalangin isolated from Alpinia officinarum inhibits pancreatic lipase. Biol Pharm Bull 26(6): 854-857. Silitonga RF. 2008. Daya inhibisi ekstrak daun jati belanda dan bangle terhadap ativitas lipase pankreas sebagai antiobesitas [skripsi]. Jurusan Kimia. FMIPA. Bogor: IPB. Soudant E, Nadaud, Francois J, penemu; L’Oreal. 16 Mar 1993. Slimming composition based on Ginkgo biloba as an alpha-2-blocker. US patent 5194259. Subbiah, Ven, penemu; Phytumyco Research Corporation. 5 Jun 2007. Identification of composition, composition, and methods treatment of obesity and overweight conditions. US patent 7226625. Umar F. 2008. Optimasi kadar flavonoid total daun jati belanda [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia. FMIPA, IPB. Wahyuningrum A. 2006. Penentuan flavonoid total Tempuyung (Sonchus arvensis L.) secara cepat dengan teknik spektroskopi IR dan kemometrik [skripsi]. Jurusan Kimia. FMIPA. Bogor: IPB.
Wirakusumah LH. 2005. Fraksinasi dan karakterisasi senyawa aktif flavonoid dari ekstrak kasar metanol rimpang Bangle (Zingiber cassumar Roxb.). [skripsi]. Jurusan Kimia. FMIPA. Bogor: IPB. Xu BJ, Han LK, Zheng YN, Lee JH, Sung CK. 2005. In vitro inhibitory effect of triterpenoidal saponins from Platycodi radix on pancreatic lipase. Arch Pharm Res 28(2): 180-185. Yamamoto M et al. 2000. Anti-obesity effects of lipase inhibitor CT-II. An extract from edible herbs, Nomame Herba, on rats fed a high-fat diet. Int J Obesity. 24:758-764.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan alir penelitian Daun asam jawa dan rimpang kunci pepet Pencucian Perajangan Pengeringan Penggilingan Simplisia Uji fitokimia pada simplisia
Ekstraksi dengan menggunakan pelarut air
Penentuan kadar air
Ekstraksi dengan menggunakan pelarut etanol 70%
Penapisan Fitokimia 1. Uji Flavonoid 2. Uji Terpenoid/steroid 3. Uji Alkaloid 4. Uji Saponin 5. Uji Tanin
Uji toksisitas larva udang
Uji aktivitas hidrolisis lipase pankreas secara in vitro
Ekstrak terbaik yang memiliki daya inhibisi terbesar dihitung kadar flavonoid total
Lampiran 2 Bagan alir ekstraksi air Sampel daun asam jawa dan rimpang kunci pepet kering dibersihkan dari kotoran (dicuci) dirajang dikeringkan digiling Sampel yang telah halus dan kering diekstraksi dengan air deionisasi disaring filtrat dipekatkan Ekstrak kasar air
Hitung rendemen Lampiran 3 Bagan alir ekstraksi etanol Sampel daun asam jawa dan rimpang kunci pepet kering dibersihkan dari kotoran (dicuci) dirajang dikeringkan digiling Sampel yang telah halus dan kering diekstraksi dengan etanol 70% disaring filtrat dipekatkan Ekstrak kasar etanol
Hitung rendemen
Lampiran 4 Bagan alir uji toksisitas dengan menggunakan larva udang air laut + telur udang (ditetaskan 48 jam)
0.1000 g ekstrak
25 ml air laut
Larutan ekstrak 4000 ppm
1
10 ekor larva udang + 1500 µl air laut + 500 µl larutan ekstrak (1000 ppm, triplo)
2
10 ekor larva udang + 1950 µl air laut + 50 µl larutan ekstrak (100 ppm, triplo)
3
10 ekor larva udang + 1995 µl air laut + 5 µl larutan ekstrak (10 ppm, triplo)
4
10 ekor larva udang + 2000 µl air laut (kontrol, triplo)
dibiarkan 24 jam (Triplo)
Jumlah larva udang yang mati dihitung
ditentukan nilai LC50 menggunakan Probit Analysis Method
Lampiran 5 Bagan alir uji in vitro ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Substrat (15 μl), bufer fosfat pH 8, albumin 10% (10 μl), lipase pankreas (100 μl), dan ekstrak
diinkubasi pada suhu 40°C, pH 8 selama 45 menit + 3 ml kloroform dikocok disentrifugasi selama 5 menit diambil 1 ml lapisan kloroform I + 4 ml kloroform-heptana (1:1) dikocok + 2.5 ml pereaksi tembaga dikocok 3 menit disentrifugasi selama 10 menit diambil 3 ml lapisan kloroform II + 0.25 ml natrium dietilditiokarbamat
Larutan berwarna kuning diukur serapan dengan spektrofotometer pada λ maksimum (435 nm) serapan dihitung nilai aktivitas Aktivitas hidrolitik lipase pankreas
Daya inhibisi
Lampiran 6 Pembuatan bahan-bahan uji aktivitas lipase pankreas a. Pereaksi Tembaga NaCl sebanyak 71.25 g dilarutkan dengan 150 ml akuades, kemudian diaduk hingga larut dan ditempatkan pada labu Erlenmeyer 250 ml. Ke dalam larutan NaCl ditambahkan 6.04 g tembaga nitrat trihidrat dan 21.25 g trietanolamin, aduk hingga larut. Selanjutnya, ditambahkan asam asetat glasial sebanyak 0.7125 ml dan dicukupkan dengan akuades sampai tanda tera. b. Pereaksi Natrium dietilditiokarbamat Natrium dietilditiokarbamat sebanyak 125 mg dilarutkan dengan butanol sampai 50 ml.
Lampiran 7 Perhitungan aktivitas enzim lipase pankreas Aktivitas lipase pankreas (μmol/l.menit) = A × C × 1 × E × 1 B D F G dengan A = Absorbans sampel B = Absorbans standar = 0.041 C = Jumlah standar (asam oleat) yang digunakan = 4.3 μmol D = Volume enzim = 100 μl = 10-4 liter E = Volume zat pengekstraksi (kloroform-heptana (1:1)) = 4.00 ml F = Volume zat yang diukur = 3.00 ml G = Waktu inkubasi = 45 menit Bobot standar = 0.0155 g [standar] = 0.0155 g × 103 ml × 103 mg = 1.24 × 104 mg/l = 1.24 × 104 ppm 1.25 ml 1l 1g [standar] setelah pengenceran ke dalam 1 ml V1M1 = V2M2 1.24 × 104 ppm × 97.0 µl = 1.00 ml × M2 M2 = 1.20 × 103 ppm 6 3 1.00 mol 1.00 l 1.00 g 1.20x10 mg 10 μmol × × 1.00 ml × × × = 3 3 1.00 l 1.00mol 10 ml 282.4614 g 10 mg
= 4.25 µmol Perhitungan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Daya inhibisi =
Aktivitas enzim blanko - Aktivitas enzim ekstrak Aktivitas enzim blanko
× 100%
Lampiran 8 Bagan alir penentuan kadar flavonoid total (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005)
Ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi ditimbang ~ 200 mg simplisia sistem hidrolisis (refluks) 30 menit • 1.0 ml larutan HMT 0.5% b/v • 20 ml aseton • 2 ml HCl 25% filtrat
residu + 20 ml aseton
labu takar 100 ml
dihidrolisis filtrat
tera dengan aseton ekstrak 20 ml ekstrak + 20 ml akuades + 15 ml etil asetat ekstraksi dalam corong pisah ditampung dalam labu takar 50 ml ditera dengan etil asetat fraksi etil asetat 10 ml larutan + 1 ml AlCl3 2% b/v ditera dengan asam asetat glasial 5% v/v larutan contoh Standar kuersetin 0; 0.5; 2.5; 5.0; 7.5; 10 ppm Fotometri pada λ = 370.8 nm
Lampiran 9 Penentuan kadar air Kadar air daun asam jawa Ulangan Bobot Sample Cawan (g) kosong 1 3.0014 17.9450 2 3.0157 23.9525 3 3.0073 20.3086
Bobot (g) cawan + sampel 20.9464 26.9682 23.3159
Kadar air rimpang kunci pepet Ulangan Bobot sampel (g) 1 2 3
3.0107 3.0049 3.0762
Cawan kosong 17.9500 24.6683 15.5991
Bobot (g) cawan + sampel 20.9607 27.6732 18.6753
Kadar air Cawan + sampel kering 20.6683 26.6874 23.0429 rerata
cawan + sampel kering 20.7953 27.5054 18.5072 Rerata
Contoh perhitungan: Bobot sampel basah = (Bobot cawan + sampel) awal – (Bobot cawan kosong) = (20.9464 – 17.9450) g = 3.0014 g Bobot sampel kering = (Bobot cawan + sampel kering) – (Bobot cawan kosong) = (20.6683 – 17.9450) g = 2.7233 g Kadar air (%) = bobot sampel basah – bobot sampel kering × 100% bobot sampel basah = 3.0014 g – 2.7233 g × 100% 3.0014 g = 9.3%
(%) 9.3 9.3 9.1 9.2
Kadar air (%) 5.5 5.6 5.5 5.5
Lampiran 10 Penentuan rendemen daun asam jawa dan rimpang kunci pepet Rendemen daun asam jawa Bobot (g) Rendemen Sampel Ekstrak awal ekstrak (%) Daun asam jawa Air 100.0000 18.5722 20.5 Etanol 100.4211 11.1002 12.2 Rendemen rimpang kunci pepet Bobot (g) Sampel
Ekstrak
Rimpang Kunci Pepet
Air etanol
awal 100.0180 100.0213
Rendemen (%) ekstrak 18.1284 15.7558
19.2 16.7
Contoh perhitungan: Ekstrak air daun asam jawa Bobot ekstrak × 100% Rendemen = Bobot awal (1 − kadar air) =
18.5722 g 100 g (1 − 9.2%)
× 100%
= 20.5% Lampiran 11 Aktivitas ekstrak terhadap larva A. salina setelah 24 jam Ekstrak daun asam jawa Bahan uji Konsentrasi Jumlah larva udang yang mati (ppm) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 Blanko 0 0 0 0 Ekstrak air
10 100 1000
1 1 10
0 2 8
0 0 10
Ekstrak etanol
10 100 1000
0 0 10
0 0 10
0 2 10
Ekstrak rimpang kunci pepet Bahan uji Konsentrasi (ppm) Blanko 0
Ulangan 1 0
Jumlah larva udang yang mati Ulangan 2 Ulangan 3 0 0
Ekstrak air
10 100 1000
2 1 6
2 4 5
2 2 6
Ekstrak etanol
10 100 1000
3 1 10
2 4 10
0 1 10
Lampiran 12 Daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Sampel
Ekstrak
Kontrol (-) Daun asam jawa
air
etanol
Rimpang Kunci pepet
air
etanol
Kontrol (+)
Konsentrasi
Absorbans
Rerata
Aktivitas enzim
Daya inhibisi (%) 0
(ppm) 0
1 1.548
2 1.587
3 1.573
1.569
(104µmol/l.menit) 4.82
100 150 200 250 300 100 150 200 250 300
1.458 1.286 1.121 1.308 0.926 1.223 0.875 0.823 0.855 0.915
1.382 1.462 1.254 1.222 0.981 1.184 0.813 0.775 0.708 0.816
1.590 1.680 1.313 1.174 0.950 1.146 0.711 0.990 1.207 0.982
1.477 1.476 1.229 1.235 0.952 1.184 0.800 0.863 0.923 0.904
4.54 4.53 3.78 3.79 2.92 3.64 2.46 2.65 2.84 2.78
5.8 6.0 21.6 21.4 39.4 24.5 49.0 45.0 41.1 42.3
100 150 200 250 300 100 150 200 250 300
1.465 0.536 0.653 0.766 1.121 1.051 1.377 1.672 0.870 1.783
1.486 0.734 0.582 0.991 1.288 1.068 1.278 1.939 1.199 1.294
1.245 0.792 0.401 1.215 1.054 1.081 1.854 1.979 0.919 1.747
1.399 0.687 0.545 0.991 1.154 1.067 1.503 1.863 0.996 1.608
4.30 2.11 1.68 3.04 3.54 3.28 4.62 5.72 3.06 4.94
10.8 56.2 65.1 36.9 26.6 32.0 4.1 -18.7 36.5 -2.5
100 150 200 250 300
1.397 1.821 2.009 1.900 1.757
1.413 1.783 1.951 2.036 1.818
1.399 1.959 1.987 1.876 1.577
1.403 1.854 1.982 1.937 1.717
4.31 5.70 6.09 5.95 5.27
10.6 -18.3 -26.3 -23.4 -9.3
Lampiran 13 Perhitungan statistik ekstrak daun asam jawa dan rimpang kunci pepet a. Ekstrak air (1 faktor daya inhibisi tertinggi) Daya inhibisi (%) ekstrak air daun asam jawa dan rimpang kunci pepet terhadap aktivitas lipase pankreas Ekstrak air Ulangan ∑Yj Daun asam jawa Rimpang kunci pepet 1
41.1
58.5
99.6
2
37.6
62.9
100.5
3
39.4
113.9
∑Yi
118.1
74.5 195.9
314.0
Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak air terhadap Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak air terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel Perlakuan 1 1.04 × 103 1.04 × 103 29.71 7.709 Galat 4 1.40 × 102 35 Total 5 1.18 × 103 H0 : μ1 = μ2 (semua perlakuan memberikan daya inhibisi yang sama terhadap aktivitas lipase pankreas) H1 : μi ≠ μj (paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan daya inhibisi yang berbeda terhadap aktivitas lipase pankreas) FK =
Y .. 2 (314) 2 = = 1.64 × 104 (2x3) p⋅r
⎛ 118.12 + 195.9 2 ⎞ ΣYi 2 ⎟ - 1.64 × 104 = 1.04 × 103 JKP = − FK = ⎜ ⎜ ⎟ 3 r ⎝ ⎠ JKT = ΣΣ Yij2 – FK = (41.12 + … + 74.52) - 1.64 × 104 = 1.18 × 103 JKG = JKT – JKP = 1.18 × 103 – 1.04 × 103 = 1.40 × 102 JKP 1.04 x 10 3 KTP = = = 1.04 × 103 1 dbp KTG =
JKG 140 = = 35 4 dbg
KTP 1.04 x 10 3 F hitung = = 29.71 = 35 KTG F0,05(1,4) = 7.709 Fhitung > Ftabel Æ Kesimpulan : Tolak H0 (berarti ekstrak air daun asam jawa dan rimpang kunci pepet memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas). b. Ekstrak etanol Daya inhibisi (%) ekstrak etanol terhadap aktivitas lipase pankreas Ekstrak etanol Ulangan Daun asam jawa Rimpang kunci pepet
∑Yj
1
44.2
44.6
88.8
2
48.1
23.7
71.8
3
54.8 147.1
41.5
96.3
109.8
256.9
∑Yi
Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak etanol terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber keragaman db JK KT F-hitung Perlakuan 1 2.31 × 102 2.31 × 102 2.96 Galat 4 3.12 × 102 0.78 × 102 Total 5 5.43 × 102
F-tabel 7.709
Fhitung < Ftabel Æ Kesimpulan : Terima H0 (berarti ekstrak etanol daun asam jawa dan rimpang kunci pepet memberikan pengaruh daya inhibisi yang tidak berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas). c. Uji statistika daya inhibisi maksimum dari ekstrak daun asam jawa dan rimpang kunci pepet terhadap kontrol negatif dan positif Perlakuan: I : tanpa penambahan ekstrak (kontrol negatif) II : penambahan ekstrak etanol daun asam jawa 150 ppm III : penambahan ekstrak air rimpang kunci pepet 200 ppm IV : penambahan Xenical® 100 ppm (kontrol positif) Daya inhibisi (%) sampel terhadap aktivitas lipase pankreas Ulangan
Perlakuan
∑Yj
II
III
IV
1
I 0.0
44.2
58.5
11.0
113.7
2
0.0
48.1
62.9
10.0
121
3
0.0 0.0
74.5 195.9
10.8 31.8
140.1
ΣYi
54.8 147.1
374.8
µ
0.0
49.0
65.3
10.6
124.9
Analisis sidik ragam daya inhibisi sampel terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber db JK KT Fhitung keragaman Perlakuan 3 8.64 × 103 2.88× 103 115.2 2 Galat 8 2.00 × 10 25 Total 11 8.84 × 103
Ftabel 4.066
H0 : μ1 = μ2 = μ3 = μ4 (semua perlakuan memberikan daya inhibisi yang sama terhadap aktivitas lipase pankreas) H1 : μi ≠ μj (paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan daya inhibisi yang berbeda terhadap aktivitas lipase pankreas) 2 Y .. 2 (374.8) FK = = = 1.17 × 104 (4x3) p⋅r KTP 2.88 x 10 3 = 115.2 = F hitung =
25
KTG
F0,05(3,8) = 4.066 Fhitung > Ftabel Æ Kesimpulan : Tolak H0 (berarti perlakuan memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas). Untuk melihat perlakuan mana yang memberikan pengaruh yang berbeda, dilakukan uji Duncan Uji Duncan: Rp = r0.05 (p,dbg)
KTG
r
Tolak Ho jika |ýi - ýj| > Rp R2 = r0.05(2,8)
25
R3 = r0.05(3,8)
25
3 3
= 3.26
25
= 3.39 25
3 3
= 9.41 = 9.79
R4 = r0.05(4,8)
25
3
= 3.46 25
Urutan perlakuan:
3
= 9.99
ý1 = 0.0 (kontrol negatif) ý2 = 10.6 (kontrol positif) ý3 = 49.0 (etanol daun asam jawa) ý4 = 65.3 (air rimpang kunci pepet)
|ý1 – ý2| = 10.6 < R2 Æ Tolak Ho |ý1 – ý3| = 49.0 > R3 Æ Tolak Ho |ý1 – ý4| = 65.3 > R4 Æ Tolak Ho |ý2 – ý3| = 38.4 > R2 Æ Tolak Ho |ý2 – ý4| = 54.7 > R3 Æ Tolak Ho |ý3 – ý4| = 16.3 > R2 Æ Tolak Ho Kesimpulan: yang memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata adalah ekstrak etanol daun asam jawa dengan kontrol negatif, ekstrak air rimpang kunci pepet dengan kontrol negatif, ekstrak etanol daun asam jawa dengan kontrol positif, ekstrak air rimpang kunci pepet dengan kontrol positif, ekstrak etanol daun asam jawa dengan ekstrak air rimpang kunci pepet, dan kontrol negatif dengan kontrol positif. Lampiran 14 Uji estimasi kurva *Ekstrak Air Daun Asam Jawa Linear R 0.93867
R Square 0.8811
Model Summary Adjusted R Square 0.84147
Std. Error of the estimate 31.47713
R Square 0.88417
Model Summary Adjusted R Square 0.84556
Std. Error of the estimate 31.06882
R Square 0.82294
Model Summary Adjusted R Square 0.76392
Std. Error of the estimate 38.41212
R Square 0.89701
Model Summary Adjusted R Square 0.79403
Std. Error of the estimate 35.87925
Logaritmik R 0.9403 Inverse R 0.90716 Kuadratik R 0.94711
*Ekstrak Etanol Daun Asam Jawa Linear R 0.4683
R Square 0.21931
Model Summary Adjusted R Square -0.04092
Std. Error of the estimate 80.65831
Logaritmik R 0.5322
R Square 0.28324
Model Summary Adjusted R Square 0.04431
Std. Error of the estimate 77.28542
R Square 0.34006
Model Summary Adjusted R Square 0.12008
Std. Error of the estimate 74.15871
R Square .89185
Model Summary Adjusted R Square 0.78371
Std. Error of the estimate 36.76739
Inverse R 0.58315 Kuadratik R 0.94438
*Ekstrak Air Rimpang Kunci Pepet Linear R 0.08469
R Square 0.00717
Model Summary Adjusted R Square -0.32377
Std. Error of the estimate 90.9591
R Square 0.08989
Model Summary Adjusted R Square -0.21349
Std. Error of the estimate 87.08783
R Square 0.24756
Model Summary Adjusted R Square -0.00326
Std. Error of the estimate 79.18563
R Square 0.52845
Model Summary Adjusted R Square 0.05689
Std. Error of the estimate 76.77513
Logarimik R 0.29981 Inverse R 0.49755 Kuadratik R 0.72694
*Ekstrak Etanol Rimpang Kunci Pepet Linear R 0.24715
R Square 0.06108
Model Summary Adjusted R Square -0.25189
Std. Error of the estimate 88.45511
R Square 0.53393
Model Summary Adjusted R Square 0.37858
Std. Error of the estimate 62.32076
Inverse R 0.73071
Kuadratik R 0.24858
R Square 0.06179
Model Summary Adjusted R Square -0.87641
Std. Error of the estimate 108.29396
R Square 0.94377
Model Summary Adjusted R Square 0.77508
Std. Error of the estimate 37.49338
Kubik R 0.97148
*Kontrol positif (Xenical®) Linear R 0.48279
R Square 0.23309
Model Summary Adjusted R Square -0.02255
Std. Error of the estimate 79.94329
R Square 0.6826
Model Summary Adjusted R Square 0.5768
Std. Error of the estimate 51.42952
R Square 0.51491
Model Summary Adjusted R Square 0.02983
Std. Error of the estimate 77.86897
R Square 0.75892
Model Summary Adjusted R Square 0.03568
Std. Error of the estimate 77.63357
Inverse R 0.8262 Kuadratik R 0.71757 Kubik R 0.87116
Lampiran 15 Kadar flavonoid total Konsentrasi Absorbans (ppm) Larutan Standar 1 0 0.003 Standar 2 0.5000 0.055 Standar 3 2.5000 0.334 Standar 4 5.0000 0.557 Standar 5 7.5000 0.863 Standar 6 10.0000 1.048 Sampel EAJ 0.3994 0.033 Sampel AKP 0.0235 0.025 Keterangan: EAJ = ekstrak etanol daun asam jawa AKP = ekstrak air rimpang kunci pepet Persamaan regresi linear
y = 0.1064 x + 0.0245 R2 = 0.9932
A
[sampel]
Perhitungan: [sampel EAJ]
= 0.033 – 0.0245 × 50ml 0.1064 10 ml = 0.40 ppm
Kadar flavonoid total = 0.40 mg × 1 l × 25 ml × 100ml × 12.2% 20ml 22.4mg 1l 103 ml = 0.03% (b/b) [sampel AKP]
= 0.025 - 0.0245 x 50 ml 0.1064 10 ml = 0.024 ppm
Kadar flavonoid total = 0.024mg × 1 l × 25 ml × 100ml × 19.2% 20ml 36.3 mg 1l 103 ml = 0.02 × 10 -2 % (b/b)
