Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Etanol 70% Daun Binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis) terhadap Enzim α-glukosidase secara In Vitro [Inhibition Activity Test 70% Ethanol Leaf Extract Binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis) against α-glucosidase enzyme in vitro] Kholid Akhirianto, Husain Nashrianto, Sri Wardatun Program Studi Farmasi FMIPA-Universitas Pakuan, Bogor ABSTRAK Diabetes mellitus ditandai dengan metabolisme glukosa yang abnormal akibat kekurangan insulin dan berkurangnya kerja insulin beresiko untuk perkembangan komplikasi mikrovaskular dan makrovaskular. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas inhibisi ekstrak etanol 70% daun binahong (Andredera condifolia (Ten.) Steenis) terhadap enzim α-glukosidase secara in vitro. Berdasarkan hasil pengujian fitokimia diketahui bahwa daun binahong mengandung senyawa alkoloid, flavonoid, saponin,steroid-triterpenoid dan polifenol. Pengujian daya hambat terhadap aktivitas αglukosidase dihitung dalam IC50 dengan pembanding acarbose. Hasil penghambatan ekstrak etanol 70% daun binahong terhadap aktivitas enzim α-glukosidase menunjukkan hasil sebesar 5565,79 ppm dan acarbose sebesar 0,182 ppm. Dari hasil penelitian ekstrak binahong memiliki aktivitas penghambatan yang rendah terhadap enzim α-glukosidase. Kata kunci: antidiabetes, daun binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis), inhibitor α-glukosidase ABSTRACT Diabetes mellitus is characterized by abnormal glucose metabolism due to insulin deficiency and insulin reduced risk for the development of microvascular and macrovascular complications. This study aims to determine the inhibitory activity of 70% ethanol extract of the leaves binahong (Andredera condifolia (Ten.) Steenis) against αglucosidase enzymes in vitro. Based on the test results of phytochemical known that the leaves contain compounds binahong alkoloid, flavonoids, saponins, steroid-triterpenoids and polyphenols. Testing the inhibition of the activity of α-glucosidase with IC50 calculated in comparison acarbose. Results inhibition of 70% ethanol extract of leaves binahong against α-glucosidase enzyme activity showed a yield of 5565.79 ppm and 0.182 ppm of acarbose. From the research binahong extract has a low inhibitory activity against α-glucosidase enzyme. Keywords: antidiabetic, leaves binahong (Andredera condifolia (Ten.) Steenis), inhibitor α-glucosidase
PENDAHULUAN Diabetes mellitus merupakan penyakit yang tidak dapat disembuhkan, tetapi dapat dikontrol dengan melakukan upaya-upaya seperti perencanaan diet, mempertahankan bobot badan normal dan melakukan cukup olah raga. Obat diberikan bila upaya tersebut tidak berhasil mengendalikan kadar glukosa darah (Ganiswara et al. 1999). Ada dua macam antihiperglikemik, yaitu berupa suntikan insulin dan obat hipoglikemik oral yang meliputi golongan inhibitor alfaglukosidase (Silva, 2004). Inhibitor alfa-glukosidase digunakan untuk mengobati diabetes mellitus tipe II. Kerja antihiperglikemik dari inhibitor alfaglukosidase berasal dari inhibisi reversibel, kompetitif terhadap enzim hidrolase alfa-amilase pankreatik dan enzim-enzim pencernaan di usus halus seperti isomaltase, sukrase dan maltase. Enzim-enzim ini berperan pada hirolisis karbohidrat makanan menjadi glukosa dan monosakarida lainnya. Pada penderita diabetes mellitus, inhibisi terhadap enzim ini menyebabkan penghambatan absorbsi glukosa sehingga menurunkan keadaan hiperglikemia setelah makan (Slagle, 2002; Bayer, 2004). Daun binahong (Andredera cardifolia (Ten.) Steenis) termasuk dalam famili : Baselleceae merupakan tanaman hias yang dikenal secara empiris dapat menyembuhkan penyakit tertentu. Penyakit tersebut diantaranya kerusakan ginjal, diabetes, pembengkakan jantung, pembengkakan hati, penyembuhan luka, maag, sesak nafas, asam urat dan stroke (Manoi, 2009). Berdasarkan pemberian senyawa triterpenoid yang diisolasi dari daun binahong (Andredera cardifolia (Ten.) Steenis) juga dapat menstimulasi penurunan kadar glukosa darah tikus yang mengalami hiperglikemia Penelitian ini bertujuan untuk menguji daya hambat ekstrak etanol 70% daun binahong (Andredera condifolia (Ten.) Steenis) terhadap aktivitas α-
glukosidase yang dilakukan secara in vitro, untuk membuktikan manfaat dari ekstrak etanol 70% daun binahong sebagi antidiabetes alternatif bagi masyarakat terutama pedesaan dimana tidak tersedia obat jadi atau karena tidak terjangkau oleh daya beli masyarakat. METODE PENELITIAN Bahan Daun Andredera cordifolia (Ten.) Steenis, akuades, etanol 70%, enzim αglukosidase, p-nitrofenil-α-Dglukopiranosida (PNG), larutan buffer fosfat (pH 7), serum bovine albumin, acarbose, dimetilsulfoksida (DMSO), HCl 2N, Na2CO3dan bahan lainnya. Pembuatan Simplisia Daun binahong dibersihkan dari kotoran yang menempel, kemudian dicuci bersih dan dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung sampai kering, setelah kering digiling dan diayak menggunakan ayakan mesh 20, (DepKes RI, 1985a). Analisis Karakteristik Serbuk Simplisia Analisis karakteristik serbuk simplisia daun salam dilakukan dengan penetapan kadar air dan kadar abu. Pembuatan Ekstrak Ekstrak dibuat dengan metode maserasi menggunakan pelarut etanol 70%. maserat hasil maserasi diuapkan dengan vacum rotary evaporator sampai seluruh pelarut menguap. Rendemen yang diperoleh dihitung dengan menggunakan rumus: Bobot ektrak Rendemen = x 100 % Bobot simplisia
Analisis Fitokimia (Harborne 1987) Alkaloid: Sejumlah sampel ekstrak kental dilarutkan dalam beberapa tetes H2SO4 2N kemudian diuji dengan tiga pereaksi alkoloid yaitu pereaksi Dragendorff, pereaksi Meyer dan pereaksi Wagner.
Hasil uji dinyatakan positif bila dengan pereaksi Mayer terbentuk endapan putih kekuningan, endapan coklat dengan pereaksi Wagner dan endapan merah hingga jingga dengan pereaksi Dragendorff. Flavonoid: Sejumlah sempel ekstrak kental ditambahkan serbuk magnesium 0,10 mg dan 0,40 mL amil alkohol (campuran asam klorida 37% dan etanol 95% dengan volume yang sama) dan 4 mL alkohol kemudian campuran dikocok. Warna merah, kuning atau jingga yang terbentuk pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya flavonoid. Saponin: Saponin dapat dideteksi dengan uji busa dalam air panas. Busa yang stabil selama 30 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2N menunjukkan adanya saponin. Steroid – Triterpenoid: Sejumlah sampel ekstrak kental dilarutkan dalam 2 mL kloroform dalam tabung reaksi kering. Lalu, 10 tetes anhidrida asetat dan 3 tetes H2SO4 pekat ditambahkan kedalamnya. Larutan berwarna merah yang terbentuk untuk pertama kali kemudian berubah menjadi biru dan hijau, menunjukkan reaksi positif. Polifenol: Sebanyak 0,5 g sampel ektrak kental ditambahkan 10 mL FeCl3 1 %. Adanya polifenol ditunjukkan dengan terbentuknya warna hijau, biru atau keunguan, DepKes RI (1995b). Uji Aktifitas α-Glukosidase (Shruti et al., 2009) Campuran reaksi terdiri 50 μL 0,1 M buffer fosfat (pH7.0), 25 μL 0,5 mM pnitrofenil α-D-glukopiranosida (dilarutkan dalam 0,1 M buffer fosfat, pH 7,0), 10 μL sampel uji dan 25 uL larutan αglukosidase (larutan stok dari 1 mg/mL dalam 0,01 M buffer fosfat, pH 7,0 diencerkan 0,04 Unit/mL dengan buffer yang sama (pH 7,0) sebelum uji). Campuran reaksi kemudian diinkubasi pada suhu 37 ° C selama 30 menit. Kemudian, reaksi dihentikan dengan
penambahan 100 μL 0,2 M larutan natrium karbonat. Kemudian larutan diukur pada panjang gelombang 410 nm dengan microplate reader. Blanko dibuat dari campuran bufer fosfat (pH 7) dengan p-NPG, larutan blanko dan standar disentrifus, supernatan diambil sebanyak 50 μL dan dimasukkan ke dalam campuran reaksi seperti dalam sampel.Hasil campuran (sampel, blanko dan standar) tersebut diukur dengan microplate reader pada panjang gelombang 410 nm. Masing-masing pengujian daya hambat sampel terhadap aktivitas αglukosidase dihitung dalam persen inhibisi dengan rumus sebagai berikut. % inhibisi=
x 100 %
Keterangan : C = Absorban larutan tanpa adanya ekstrak (kontrol) S = Absorban larutan dengan pemberian ekstrak dari sampel (Sl – So), dimana Sl = absorbansi sampel dengan penambahan enzim dan So = absorbansi sampel tanpa penambahan enzim. Nilai IC50 (Inhibition Concentration 50) diperoleh dari perpotongan garis antara 50% daya hambat dengan sumbu konsentrasi menggunakan persamaan (y = bx + a), dimana y = 50 dan x menunjukkan nilai IC50. HASIL DAN PEMBAHASAN Sampel yang digunaka dalam penelitian ini berupa daun binahong, kemudian dibuat menjadi serbuk, selanjutknya dilakukan pemeriksaan terhadap karakteristik dari serbuk yaitu penentuan kadar air dan kadar abu.Hasil pemeriksaan karakterisasi serbuk sampel dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil Karakteristik Serbuk Serbuk Daun Kadar air Kadar abu Binahong (%) (%) 1 4,25 19,87 2 4,82 20,04 Rata-rata 4,53 19,95 Kadar air adalah salah satu parameter standarisai suatu simplisia, adanya air dalam simplisia tanaman akan memungkinkan pertumbuhan mikroba, selain itu kadar air juga dapat mempengaruhi penyimpanan, oleh sebab itu kadar air merupakan salah satu faktor penting yang harus diperhatikan. Penentuan kadar dilakukan sebanyak dua kali dengan persyaratan yaitu kurang dari 5%. Berdasarkan Tabel 1 hasil penetapan kadar air memenuhi syarat kurang dari 5%. Berdasarkan Tabel 1 didapat persentase sebesar 19.95%, hasil tersebut tidak memenuhi persyaratan yang seharusnya kurang dari 15%, hal tersebut dapat dikarenakan pada saat penimbangan, pengeringan bahan/wadah belum cukup, belum tercapainya bentuk penimbangan yang tepat, kertas saring yang belum habis terbakar, penguraian endapan karena pemijaran/pemanasan berlebihan, reduksi endapan oleh kertas saring, penyerapan H2O dari udara, kontaminasi karena endapan lain, kehilangan endapan sewaktu menyaring karena air pencucian atau masih adanya tanah/pengotor mineral yang menempel pada simplisia. Setelah sampel daun diketahui karakteristiknya kemudian diekstraksi menggunakan pelarut etanol 70% dengan cara maserasi. Maserasi bertujuan untuk menghindari terjadinya kerusakan terhadap komponen organik penyusun dan memudahkan penarikan senyawa kimia di dalamnya. Rendemen yang diperoleh yaitu sebesar 22,35%, besar rendemen ekstrak menunjukkan banyaknya jumlah komponen senyawa aktif yang terekstrak selama proses maserasi.
Hasil Uji Fitokimia Berdasarkan Tabel 2 baik serbu maupun ekstrak etanol 70% daun binahong mengandung alkoloid, flavonoid, saponin, steroid-triterpenoid dan polifenol. Tabel 2. Hasil Uji Fitokimia Serbuk dan Ekstrak Daun Binahong Senyawa Hasil Serbuk Ekstrak etanol 70% Alkaloid + + Flavanoid + + Saponin + + Steroid+ + Triterpenoid Polifenol + + Keterangan: (+)positif = mengandung golongan senyawa (-)negatif = tidak mengandung golongan senyawa Uji alkaloid menunjukkan hasil yang (+) positif dengan terbentuknya endapan jingga dengan pereaksi Dragendorff, atom nitrogen pada struktur alkaloid akan membentuk ikatan kovalen koordinat dengan K+ yang merupakan ion logam. Reaksi alkoloid dengan pereaksi Dregendroff Bi(NO3) + 3KI BiI3 + 3KNO3 BiI3 + KI K[BiI3] N-alkaloid + K[BiI3] N-K+ (kalium-alkaloid) jingga + [BiI3](Marlina et al., 2005) pada pereaksi Mayer terbentuk endapan putih disebabkan nitrogen pada alkaloid akan bereaksi dengan ion logam K+ dari kalium tetraiodomerkurat (II) membentuk kompleks kalium-alkaloid yang mengendap. HgCl2 + 2KI HgI2 + 2KCl HgI2 + 2KI K2[HgI4] N-alkaloid + K2 [HgI4] N-K+ (kalium-alkaloid) + K [HgI4] (Marlina et al., 2005) Uji flavonoid menunjukkan (+) positif setelah beberapa saat didiamkan
membentuk warna merah, kuning atau jingga yang terbentuk pada lapisan amil alkohol. . Hal ini terjadi karena reduksi flavonoid dengan Mg menghasilkan senyawa kompleks yang berwarna merah atau jingga pada flavonol, flavonon dan xanton (Marliena et al., 2005) Saponin diuji dengan uji busa/buih timbulnya buih menunjukkan adanya glikosida yang mempunyai kemampuan membentuk buih dalam air yang terhidrolisis menjadi glukosa dan senyawa lainnya. Uji steroid-triterpenoid hasil menunjukkan (+) positif Senyawa steroidtriterpenoid merupakan senyawa yang sukar larut dalam pelarut polar oleh karena itu dalam uji steroid-triterpenoid digunakan kloroform agar steroidtriterpenoid dapat terekstraksi. Uji polifenol menunjukkan hasil (+) positif, dimana penambahan garamgaram besi (FeCl3), mengakibatkan polifenol membentuk garam fenolat yang larut air berwana hijau. Aktivitas Inhibisi α-Glukosidase Prinsip dasar pengujian aktivitas αglukosidase ini adalah mengukur absorbansi dari p-nitrofenol yang merupakan produk dari reaksi katalis enzim α-glukosidase terhadap subtrat pnitrofenil α-D-glukopiranosida. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali (triplo) pada larutan uji. Dari hasil pengujian tersebut akan diperoleh nilai serapan sampel dihitung sebagai persen inhibisi (% inhibisi), IC50 merupakan bilangan yang menunjukkan konsentrasi sampel (ppm) yang mampu menghambat kerja enzim sebesar 50%. Semakin kecil nilai IC50 berarti semakin tinggi aktivitas penghambatan enzim.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa ektrak etanol 70% daun binahong memiliki aktivitas inhibisi kerja αglukosidase yang rendah, hal tersebut dapat dilihat dari hasil IC50 sampel yaitu 5565,79 ppm yang jauh berbeda dengan hasil IC50 acarbose sebesar 0,182 ppm. Tingginya aktivitas penghambatan acarbose sebagai kontrol positif menyebabkan acarbose dijadikan obat antidiabetes. Walaupun aktivitas hipoglikemik ekstrak binahong sangat rendah tetapi berdasarkan empiris ekstrak binahong digunakan sebagai antidiabetes hal ini didukung oleh beberapa pustaka diantaranya: Senyawa Triterpenoid yang terkandung pada ekstrak etanol 70% daun binahong diketahui dapat menstimulasi pengambilan glukosa oleh sel otot, dikarenakan triterpenoid berperan sebagai insulin (insulinotropik), sehingga mampu berikatan dengan reseptor insulin (Lee & Thoung, 2010). Menurut Kemila (2010), flavonoid berperan sebagai agen antioksidan yang memperbaiki sel β pankreas yang rusak akibat radikal bebas sehingga dapat meningkatkan sekresi insulin. Menurut Ebadi (2002), senyawa aktif yang berperan dalam menurunkan kadar glukosa darah adalah saponin yang memiliki sam seperti obat hipogikemik oral (OHO) golongan sulfonilure. Jadi, daun binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis) dapat digunakan sebagai obat alami alternatif antidiabetes disamping dengan obat sintetik yang dapat menyebabkan efek samping. Penggunaan obat sintetik ini menyebabkan efek samping, misalnya kembung, diare, dan kram usus.
Tabel 3. Hasil pengujian sampel terhadap inhibisi α-glukosidase Sampel IC50 (ppm) Etanol 70% daun Binahong 5565,79 Acarbose 0,182
KESIMPULAN DAN SARAN Aktivitas penghambatan α-glukosidase ekstrak etanol 70% daun Binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis) sebesar 5565,79 ppm.
aktivitas -glukosidase acarbose sebesar 0,182 ppm.
Saran Dilakukan pengujian potensi antidiabetes ekstrak etanol daun binahong menggunakan hewan coba. DAFTAR PUSTAKA DepKes RI. 1985a. Cara Pembuatan Simplisia. Direktorat Jendral Pengawasan Obatdan Makanan, Jakarta. Hal 2-22 DepKes RI. 1995b. Materia Medika Indonesia. Jilid VI. Cetakan Keenam. Direktoran Jenderal Pengawasan Obat Dan Makanan, Jakarta. Ebadi, M. S. 2002. Pharmachodynamic basis of herbal medicine. CRC Press LLC, Boca Roton. Ganiswara SG, Ellenberg M, Harold R et al, editor. 1999. Diabetes mellitus: Theory and Practice. Ed ke-3. New York: Medical Examination Publishing Co., Inc. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari Phytochemical Methods. Kemila, M. 2010. Uji aktivitas antidiabetes melitus infusan daun binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis) pada tikus putih jantan. (Skipsi) jurusan farmasi FMIPAUII, Yogyakarta. Lee, M. S. & P. T. Thoung. 2010 Stimulation of glucose uptake by triterpenoids from Wiegela subsessilis. Phytotherapy Resarch. Manoi, F. 2009. Binahong (Andredera cordifolia (Ten.) Steenis Sebagi Obat. Jurnal Warta Penelitian Dan Pengembangan Tanaman Industri. Volume 15 Nomor 1:3.
Marliena SD, Suryanti V, Suyono. 2005. Skrining Fitokimia dan Analisis Kromatografi Lapis Tipis Komponen Kimia Buah Labu Siam (Sechium edule Jacq. Swartz.) dalam Ekstrak Etanol. (Skripsi). Surakarta: Biofarmasi 3 (1): 26-36, Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta. Silva ML da. 2004. Diabetes Means Siphon Insulin Comes from the Island. http://www.apol.net/dightonrock /diabetes_history.html. (6 desember 2012) Slagle M. 2002. Alpha-Glucosidase Inhibitor. Southern Medical Journal. http://static.highbeam.com/s/sout hernmedicaljournal/january0120 02/alphaglucosidaseinhibitormed icationupdatebriefart/index.html. (6 desember 2012) Shruti Sancheti, Sandesh, Sung-Yum Soe. 2009. Chaenomeles Sinensis: A Potent α-and β-Glucosidase Inhibitor. American Journal of Pharmacology and Toxicology. 4 (1): 8-11. 2009. .
