DAYA HAMBAT EKSTRAK ETANOL BUAH MAHKOTA DEWA TERHADAP AKTIVITAS α-GLUKOSIDASE SECARA IN VITRO
TRI SEPTIAWATI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
ABSTRAK TRI SEPTIAWATI. Daya Hambat Ekstrak Etanol Buah Mahkota Dewa terhadap Aktivitas α-Glukosidase secara In Vitro. Dibimbing oleh IRMA HERAWATI SUPARTO dan WULAN TRIWAHYUNI. Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) merupakan tumbuhan obat yang telah banyak digunakan masyarakat. Tumbuhan ini terutama buahnya dipercaya berkhasiat untuk mengobati diabetes melitus. Dalam penelitian ini akan diteliti buah mahkota dewa sebagai penurun kadar glukosa darah dalam menghambat aktivitas α-glukosidase dan pencirian senyawa. Daya inhibisi aktivitas α-glukosidase diukur berdasarkan pembentukan pnitrofenol (berwarna kuning) yang dihasilkan dari hidrolisis substrat, yaitu pnitrofenil α-D-glukopiranosida oleh α-glukosidase. Etanol 30% (v/v) digunakan sebagai pelarut untuk mengekstrak buah mahkota dewa. Uji aktivitas enzim αglukosidase pada ragam konsentrasi 1, 1.5, dan 2% memiliki persen inhibisi berturut-turut sebesar 26.4, 29.22, dan 24.51%. Ekstrak pekat etanol dipisahkan menggunakan flash chromatography dan kromatografi lapis tipis (KLT) analitik. Pemisahan ekstrak menghasilkan 4 fraksi berdasarkan spot KLT. Fraksi-fraksi yang diperoleh diidentifikasi menggunakan uji fitokimia, spektrofotometer ultraviolet, dan inframerah. Dari keempat fraksi ini diduga bahwa senyawa buah mahkota dewa mengandung senyawa golongan flavonoid.
ABSTRACT TRI SEPTIAWATI. Inhibitory Activity of Ethanol Extract from Fruits of Mahkota Dewa againts α-Glucosidase Activity with In Vitro. Supervised by IRMA HERAWATI SUPARTO and WULAN TRIWAHYUNI. Mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) is a herbal plant that has been widely used by Indonesian people. This herbal, especially its fruit is believed could cure several diseases such as diabetes mellitus. This research studied the effect of mahkota dewa fruits as α-glucosidase inhibitor mechanism and characterized its compounds. Potential α-glucosidase inhibitory activity was measured based on the formation of p-nitrophenol (yellow solution) through hydrolysis of substrate pnitrophenyl α-D-glucopiranoside by α-glucosidase. Ethanol (30% v/v) was used as a solvent to extract the mahkota dewa fruits. The enzymatic test of α-glucosidase activity with different concentrations of mahkota dewa fruits 1, 1.5, and 2% showed inhibition level of 26.40, 29.22, and 24.51%, respectively. Ethanol crude extract was separated using flash chromatography and analytical of thin layer chromatography (TLC). The separation resulted four fractions based on TLC spots. These fractions were further identified by phytochemical assays, spectrophotometer ultraviolet and infrared. Based on these fractions, the mahkota dewa fruits were assumption to contain flavonoid compounds.
DAYA HAMBAT EKSTRAK ETANOL BUAH MAHKOTA DEWA TERHADAP AKTIVITAS α-GLUKOSIDASE SECARA IN VITRO
TRI SEPTIAWATI
Skripsi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008
Judul Nama NIM
: Daya Hambat Ekstrak Etanol Buah Mahkota Dewa terhadap Aktivitas α-Glukosidase secara In Vitro : Tri Septiawati : G44204045
Menyetujui: Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr.dr. Irma H. Suparto, MS NIP. 131606776
Wulan Triwahyuni, S.Si
Mengetahui, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. drh. Hasim, DEA NIP. 131578806
Tanggal Lulus:
PRAKATA Segala puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa selalu penulis ucapkan atas berkat dan kasih setia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Februari sampai Juni 2008 ini ialah uji aktifitas α-glukosidase, dengan judul Daya Hambat Ekstrak Etanol Buah Mahkota Dewa terhadap Aktivitas α-Glukosidase secara In Vitro. Penulis mengucapkan terima kasih kepada berbagai pihak yang telah membantu, terutama Ibu Dr.dr. Irma H. Suparto, MS dan Ibu Wulan Triwahyuni S.Si selaku pembimbing. Terima kasih kepada Pusat Studi Biofarmaka, LPPM IPB atas kesempatan yang telah diberikan untuk ikut terlibat dalam penelitian antidiabetes dan sebagian bantuan dana penelitian. Terima kasih kepada seluruh anggota keluargaku tersayang: Mama, Ayah, Abang Newland, Mba Uwie, dan Adik Catur, atas segala bantuan baik doa, moril, materi, dan kasih sayangnya. Terima kasih kepada rekan penelitianku Anti yang telah bekerja sama dengan baik selama penelitian. Ucapan terima kasih juga kepada PMK, komkes 41, Enny sahabatku, dan rekan-rekan Kimia 41, yang selalu mendoakan dan memberi semangat. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat. Bogor, Agustus 2008
Tri Septiawati
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 1 September 1985 dari pasangan Drs. Mangisi Gultom dan Hotna Panjaitan. Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2004 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Cibinong dan pada tahun tersebut penulis berhasil masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis memilih Program Studi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif mengikuti berbagai kegiatan organisasi kemahasiswaan. Pada tahun ajaran 2007/2008, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Analitik Layanan untuk program sarjana dan Kimia Lingkungan untuk program diploma. Pada tahun 2007 penulis melaksanakan Praktik Kerja Lapangan di PT Capsugel Indonesia yang terletak di Cibinong, Bogor.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ..........................................................................................
x
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................
x
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................
x
PENDAHULUAN .........................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Diabetes Melitus..................................................................................... Enzim .................................................................................................... Botani dan Komposisi Kimia Mahkota Dewa ....................................... Ekstraksi Senyawa Aktif dari Tumbuhan ............................................. Fraksinasi ..............................................................................................
1 2 2 3 3
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ...................................................................................... Lingkup Kerja ....................................................................................... Preparasi Sampel ................................................................................... Kadar Air................................................................................................ Ekstraksi ................................................................................................ Uji Fitokimia .......................................................................................... Uji Aktivitas α-Glukosidase ................................................................... Flash Chromatography .........................................................................
4 4 4 4 4 5 5 5
HASIL DAN PEMBAHASAN Fitokimia ................................................................................................ Uji Aktivitas α-Glukosidase ................................................................... Fraksinasi .............................................................................................. Spektrofotometer Ultraviolet ................................................................ Spektrofotometer Inframerah ................................................................
6 7 8 8 9
SIMPULAN Simpulan ............................................................................................... Saran ......................................................................................................
9 9
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................
10
LAMPIRAN ...................................................................................................
12
DAFTAR TABEL Halaman 1 Analisis fitokimia ekstrak etanol buah mahkota dewa ..............................
6
2 Panjang gelombang maksimum pada spektrum ultraviolet ......................
8
3 Bilangan gelombang inframerah dan dugaan gugus fungsi ......................
9
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Pemecahan glikogen .................................................................................
2
2 Buah mahkota dewa .................................................................................
3
3 Flash Chromatography ............................................................................
4
4 Reaksi α-glukosidase dengan p-nitrofenil α-D-glukopiranosida .............................................................
7
5 Inhibisi aktivitas α-glukosidase dari akarbosa, ekstrak mahkota dewa asal Cikabayan, dan KSH (Konservasi Sumberdaya Hutan) dengan konsentrasi 1% ......................
7
6 Inhibisi aktivitas α-glukosidase dari ekstrak mahkota dewa asal KSH dengan konsentrasi 1, 1.5, dan 2% ...........................................................................................
7
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian ............................................................................. 13 2 Prosedur sistem reaksi enzim ................................................................... 14 3 Kadar air buah mahota dewa .................................................................... 15 4 Rendemen buah mahota dewa .................................................................. 16 5 Data absorbans dan % inhibisi α-glukosidase dari ekstrak buah mahkota dewa dan akarbosa 1% ................................. 17 6 Data absorbans dan % inhibisi α-glukosidase dari ekstrak buah mahkota dewa asal KSH pada konsentrasi 1, 1.5, dan 2% ....................................................................... 18 7 Hasil pemisahan ekstrak etanol buah mahkota dewa ............................... 19 8 Spektrum ultraviolet dari setiap fraksi ..................................................... 20 9 Spektrum inframerah dari setiap fraksi .................................................... 21
PENDAHULUAN Diabetes melitus adalah suatu keadaan yang timbul karena defisiensi insulin baik relatif maupun absolut. Karakteristik penyakit ini terutama dinyatakan oleh kadar glukosa darah yang tinggi atau hiperglikemia. Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) memperkirakan 300 juta penduduk dunia akan menderita penyakit diabetes melitus pada tahun 2025 (Pradeepa & Mohan 2002). Menurut survei yang dilakukan WHO tahun 2005, Indonesia menempati urutan ke-4 dengan jumlah penderita diabetes terbesar di dunia setelah India, Cina dan Amerika Serikat. Prevalensi diabetes melitus di Indonesia sekitar 8.6%, diperkirakan akan meningkat dari 4.5 juta di tahun 1995 menjadi 12.4 juta pada tahun 2025 (Depkes 2005). Penyakit ini merupakan penyakit yang bersifat universal, dapat terjadi pada semua lapisan masyarakat, baik yang tingkat sosial ekonominya tinggi maupun yang rendah. Demi tercapainya peningkatan kesehatan yang merata, perlu tersedia obat yang efektif, aman, murah, dan tepat guna. Pada penderita diabetes penggunaan insulin dan obat antidiabetik oral untuk mempertahankan kadar glukosa darah normal cukup menyulitkan karena membutuhkan biaya yang tidak sedikit. Oleh karena itu, penggunaan obat tradisional sebagai pengobatan alternatif antidiabetik meningkat. Antara lain, pemanfaatan buah mahkota dewa (Phaleria macrocarpa) yang telah banyak digunakan masyarakat karena tanaman ini dipercaya dapat menurunkan kadar glukosa darah, murah, dan mudah diperoleh. Mahkota dewa termasuk ke dalam famili Thymelaeaceae. Tumbuhan ini terutama buahnya dipercaya berkhasiat untuk mengobati diabetes melitus, jantung, kanker, hepatitis, darah tinggi, penambahan stamina, gangguan ginjal, menghentikan pendarahan pada luka, insomnia, jerawat, rematik, luka gigitan serangga, dan penyakit kulit (Harmanto 2003; Winarto 2003). Penelitian ilmiah buah mahkota dewa sebagai antidiabetes telah dilakukan, antara lain oleh Sugiwati (2005) yang berhasil membuktikan khasiat buah mahkota dewa asal Jawa Tengah yang diekstraksi dengan metode perebusan menggunakan pelarut air dapat menghambat aktivitas α-glukosidase sebesar 33.01% dan Shalahudin (2005) menggunakan buah mahkota dewa asal KSH (Konservasi Sumberdaya Hutan) Institut Pertanian Bogor yang diekstraksi dengan metode refluks
menggunakan pelarut air dapat menurunkan kadar glukosa darah sebesar 46.10% pada tikus diabetes. Namun, pada penelitian Shalahudin (2005) belum diketahui mekanisme kerjanya dan identifikasi senyawa yang terdapat dalam buah mahkota dewa. Mekanisme pengobatan diabetes melitus antara lain melalui tiga cara, yaitu penambahan insulin dari luar, merangsang sekresi insulin, dan menurunkan kadar glukosa darah melalui penghambatan aktivitas α-glukosidase (Waring 2007). Dalam penelitian ini akan diteliti kerja ekstrak buah mahkota dewa sebagai penurun kadar glukosa darah dalam menghambat aktivitas αglukosidase dan identifikasi senyawa pada buah mahkota dewa dengan menggunakan spektrofotometer ultraviolet dan inframerah. Penelitian ini bertujuan mempelajari daya hambat ekstrak etanol buah mahkota dewa terhadap aktivitas α-glukosidase yang dilakukan secara in vitro. Pada penelitian ini diukur persentasi aktivitas inhibisi αglukosidase dari ekstrak etanol buah mahkota dewa untuk membuktikan manfaatnya sebagai antidiabetes.
TINJAUAN PUSTAKA Diabetes Melitus Diabetes melitus (DM) adalah penyakit serius yang ditandai dengan hiperglikemia. Di Indonesia bahan makanan pokok yang biasa dimakan ialah beras, jagung, sagu, dan terkadang singkong atau umbi-umbian lainnya. Bahan makanan tersebut memiliki kandungan utama berupa karbohidrat sebagai sumber penghasil tenaga, yang terdapat sebagai amilum atau pati. Karbohidrat tidak hanya terdapat sebagai amilum atau pati saja tetapi juga terdapat sebagai gula yang berasal dari tumbuh-tumbuhan. Pola makan yang demikian dapat menyebabkan tubuh kelebihan karbohidrat yang kemudian oleh tubuh akan disimpan baik dalam bentuk glukosa dalam darah atau glikogen dalam otot dan lemak (Poedjiadi 1994). Posprandial hiperglikemia adalah meningkatnya kadar glukosa darah setelah makan (Lee et al. 2007) Secara klinis diabetes melitus dikelompokkan ke dalam: 1. Diabetes melitus tipe I (DM I) Penyakit ini disebabkan oleh defisiensi insulin absolut. Ketidakmampuan pankreas untuk mensekresi insulin ini dapat diakibatkan oleh virus, reaksi autoimun maupun faktor
genetika sehingga sel-sel β pulau Langerhans pankreas mengalami kerusakan. Penderita diabetes ini secara mutlak bergantung pada pasokan insulin eksogen selama hidupnya. 2. Diabetes melitus tipe II (DM II) Penyakit ini umumnya terjadi pada pasien obesitas yang berusia lebih dari 40 tahun. Pada tipe ini disebabkan jumlah reseptor insulin yang terdapat pada permukaan sel berkurang sehingga masuknya glukosa ke dalam sel terhambat. Penderita diabetes tipe ini tidak bergantung pada insulin dan tidak dapat disembuhkan, tetapi dapat dikontrol dengan obat antidiabetes (Waspadji 1996). Ada dua macam obat antidiabetes, yaitu berupa suntikan dan tablet yang disebut antidiabetes oral. Antidiabetes oral digolongkan menjadi empat macam, yaitu golongan sulfonilurea, biguanid, thiazolidinedion, dan inhibitor α-glukosidase. Saat ini telah dikenal inhibitor α-glukosidase sintetik seperti miglitol dan akarbosa dengan merk dagang di wilayah Eropa, Amerika Utara, dan Kanada berturut-turut sebagai Glucobay®, Precose®, dan Prandase® (™Bayer AG). Obat-obatan ini diketahui dapat menurunkan posprandial hiperglikemia dengan menghambat reaksi α-glukosidase dalam usus kecil, sehingga dengan cara demikian penyerapan glukosa dapat terhambat (Tuyet & Chuyen 2007). Golongan obat ini bekerja secara kompetitif di dalam saluran cerna. Inhibitor kompetitif terhadap kerja αglukosidase dapat dilakukan dengan menggunakan tumbuhan obat. Inhibitor kompetitif ini (senyawa tertentu dalam tumbuhan tersebut) akan berkompetisi dengan substrat untuk mengikat bagian yang aktif dari enzim sehingga substrat (karbohidrat) tidak dapat lagi dipecah menjadi produk glukosa (Girindra 1990).
Struktur molekul akarbosa (Park et al. 2008)
sebagai katalisator dalam sel dan sifatnya sangat khas, karena hanya bekerja pada substrat tertentu dan bentuk reaksi tertentu. Enzim α-glukosidase dengan nama kimia α-D-glukosida glukohidrolase terletak dalam permukaan membran dalam sel usus (Gao et al. 2008). Enzim ini merupakan enzim utama pemecah karbohidrat menjadi glukosa dalam usus kecil (Lee et al. 2007). Enzim αglukosidase terlibat dalam degradasi glikogen dan memiliki pH optimum 7 (Coma et al. 1992). Degradasi lanjutan dari glikogen oleh fosforilase dapat terjadi hanya setelah kerja αglukosidase, yang mengkatalis dua reaksi. Pada reaksi pertama, enzim memindahkan tiga dari residu glukosa yang tersisa ke ujung cabang-cabang di sebelah luar molekul lain.
Gambar 1 Pemecahan glikogen (Stryer 1995). Enzim ini menghidrolisis ikatan α(1-6) pada titik percabangan dan menghasilkan Dglukosa dan membuat residu glukosa dengan ikatan α(1-4) pada rantai lanjutan molekul tersebut terbuka terhadap kerja glikogen fosforilase. Aktivitas α-glukosidase membantu dalam pemecahan rantai polisakarida pada ikatan α(1-6) pada setiap titik percabangan yang tidak dapat dipecahkan oleh enzim fosforilase (Gambar 1) (Stryer 1995). Pada penelitian ini kerja α-glukosidase akan dihambat dengan menggunakan tumbuhan obat, yaitu ekstrak etanol buah mahkota dewa yang diduga mengandung senyawa inhibitor α-glukosidase. Botani dan Komposisi Kimia Mahkota Dewa
Enzim Enzim dikatakan sebagai suatu kelompok protein yang berperan sangat penting dalam proses aktivitas biologis. Enzim ini berfungsi
Mahkota dewa merupakan tumbuhan asli Indonesia yang berasal dari Papua. Tumbuhan ini umumnya hidup liar di daerah hutan dari ketinggian 10-1200 meter di atas permukaan
laut dengan curah hujan rerata 1000-2500 mm/tahun (Harmanto 2003; Winarto 2003). Klasifikasi lengkap dari tumbuhan mahkota dewa adalah sebagai berikut: Divisi Spermatophyta, Subdivisi Angiospermae, Kelas Dicotyledonae, Bangsa Thymelacales, Suku Thymelacaceae, Marga Phaleria, Spesies Phaleria macrocarpa.
Gambar 2 Buah mahkota dewa. Kandungan senyawa aktif yang terdapat pada tanaman mahkota dewa adalah alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, terpenoid, dan steroid (Satria 2005). Bagian mahkota dewa yang umumnya digunakan adalah daun, buah, dan batang. Sedangkan bagian akar belum terbukti dapat digunakan untuk pengobatan. Daun mahkota dewa dilaporkan dapat menyembuhkan penyakit lemah syahwat, disentri, dan tumor. Mahkota dewa yang dilaporkan secara empiris dapat mengobati kanker, diabetes melitus, penghalus kulit, penambah stamina, liver, jantung, dan asam urat (Harmanto 2003; Taryono 2002; Lisdawati 2002). Buah mahkota dewa memiliki kandungan senyawa aktif berupa alkaloid, flavonoid, terpenoid, steroid, saponin, dan tanin (Tiagarna 2004; Wulandari 2005; Shalahudin 2005; Satria 2005; Sugiwati 2005) yang berhasil diekstrak dengan baik menggunakan pelarut etanol, metanol, dan air. Sedangkan pada penelitian Sugiwati (2005), ekstrak metanol untuk fraksi etilasetat, n-butanol, dan air telah berhasil menghambat kerja αglukosidase dan menurunkan kadar gula pada tikus percobaan yang diberi larutan sukrosa. Ekstraksi Senyawa Aktif dari Tumbuhan Ekstraksi dilakukan untuk mengambil zatzat yang terkandung dalam suatu campuran. Ekstraksi merupakan proses yang secara selektif mengambil zat terlarut dengan bantuan pelarut. Perlakuan pendahuluan sebelum ekstraksi bergantung pada sifat senyawa dalam bahan yang akan diekstraksi. Perlakuan pendahuluan dapat dilakukan dengan beberapa cara diantaranya dengan pengeringan bahan baku sampai kadar air tertentu dan penggilingan
untuk mempermudah proses ekstraksi dengan memperbesar kontak antara bahan dan pelarut (Harborne 1996; Robinson 1995). Ekstraksi bahan alam terutama yang akan digunakan untuk obat dapat dilakukan dengan cara perebusan, penyeduhan, maserasi, perkolasi atau cara lain yang sesuai dengan sifat bahan alam yang diekstraksi. Selain itu cara dan prosedur ekstraksi yang dilakukan mengacu pada Farmakope Indonesia atau cara lain yang disetujui oleh Direktur Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. Metode maserasi digunakan untuk mengekstraksi contoh yang relatif mudah rusak oleh panas. Metode ini dilakukan dengan merendam contoh dalam suatu pelarut baik tunggal maupun campuran dengan lama waktu tertentu yang umumnya 1 hingga 2 hari perendaman tanpa diberikan pemanasan. Kelebihan metode ini diantaranya adalah relatif sederhana, yaitu tidak memerlukan alatalat yang rumit, relatif mudah, murah dan dapat menghindari rusaknya komponen senyawa akibat panas (Meloan 1999). Ekstrak kasar yang diperoleh diuji aktivitasnya terhadap α-glukosidase, kemudian difraksinasi untuk mengidentifikasi kelompok senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak tersebut. Fraksinasi Fraksinasi adalah proses pemisahan komponen dalam suatu ekstrak menjadi kelompok-kelompok senyawa yang memiliki kemiripan karakteristik secara kimia (Houghton & Raman 1998). Metode fraksinasi digunakan antara lain untuk mengambil kembali (recovery) komponen yang dipisahkan tersebut. Cara yang sering dilakukan adalah fraksinasi dengan menggunakan kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom. Flash chromatography merupakan teknik cepat dari kromatografi kolom preparatif yang berdasar pada optimasi kolom sebelum pengepakan melalui pelarut yang dipompakan pada laju alir yang tinggi. Alat ini sederhana dan ekonomis untuk kromatografi cair preparatif. Untuk pemurnian komponen senyawa organik, flash chromatography merupakan teknik yang cepat dan murah. Alat ini pertama kali dikembangkan pada tahun 1978 oleh W.C.Still dari Universitas Columbia dan hingga kini flash chromatography menjadi metode yang populer untuk pemurnian dan pemisahan senyawa yang menggunakan fase normal (Still et al. 1978).
Flash chromatography terdiri atas sebuah kolom plastik yang diisi oleh zat padat pendukung, yang biasanya adalah silika gel. Sampel mahkota dewa yang akan dipisahkan dimasukkan melalui bagian atas kolom ini kemudian kolom dialiri dengan pelarut, baik pelarut isokratik maupun pelarut gradien dengan menggunakan bantuan tekanan yang memampukan sampel bergerak melalui kolom sehingga dapat dipisahkan. Fraksi-fraksi yang diperoleh dari flash chromatography selanjutnya dapat diidentifikasi menggunakan spektrofotometer ultraviolet dan infra merah.
triterpenoid, dan steroid yang dilakukan dengan metode Harborne (1987). Setelah itu dilakukan uji in vitro ekstrak terhadap aktifitas enzim α-glukosidase, fraksinasi ekstrak, uji fitokimia terhadap hasil fraksinasi serta identifikasi menggunakan spektrofotometer ultraviolet dan inframerah (Lampiran 1). Preparasi Sampel Buah mahkota dewa (bagian daging dan kulit) yang berasal dari Cikabayan dan KSH IPB yang berwarna hijau kemerahan, dipotong kecil-kecil hingga ukuran buah mahkota dewa dengan ketebalan ± 5-7 mm, kemudian dikeringkan pada oven pada suhu ± 50oC selama 30 jam. Buah mahkota dewa sebanyak 300 gram digiling hingga halus dengan ukuran 40 mesh . Penentuan Kadar Air
Gambar 3 Flash chromatography.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah buah mahkota dewa yang berasal dari kebun percobaan Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB daerah Cikabayan, Bogor dan Konservasi Sumberdaya Hutan (KSH) IPB, C2H5OH 30%, akuades, serbuk Mg, HCl pekat, amil alkohol, dietil eter, CH3COOH, H2SO4 pekat, CHCl3, NH4OH, H2SO4 2M, FeCl3 1%, enzim α-glukosidase (Bacillus stearothermophilus, Sigma-Aldrich USA), kolom silika gel (diameter 12 mm dan panjang 150 mm), pnitrofenil α-D-glukopiranosida (SigmaAldrich USA), serum bovin albumin (MerckDarmstadt), akarbosa (Bayer, Indonesia), pereaksi Wagner, Mayer, dan Dragendorff. Alat-alat yang digunakan adalah spektrofotometer ultraviolet (UV) berkas ganda, flash chromatography, FTIR (Shimadzu), dan pelat kromatografi lapis tipis. Lingkup Kerja Penelitian ini dilakukan dengan tahaptahap sebagai berikut; preparasi sampel, penentuan kadar air, dan pembuatan ekstrak etanol buah mahkota dewa. Ekstrak tersebut selanjutnya dilakukan uji fitokimia untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekundernya. Uji fitokimia meliputi uji alkaloid, flavonoid, tanin, saponin,
Penentuan kadar air sampel sebelum ekstraksi dilakukan untuk mengetahui kandungan air dalam sampel. Cawan porselin dikeringkan pada suhu 105oC selama 3 jam, kemudian didinginkan dalam eksiksator selama 30 menit dan ditimbang. Sebanyak ± 3 gram sampel dimasukkan ke dalam cawan porselin dan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 105oC selama 6 jam, kemudian didinginkan dan ditimbang kembali. Prosedur dilakukan berulang-ulang sampai diperoleh bobot yang tetap (AOAC 1984). Kadar air (%) = a – b x 100% a a = bobot contoh sebelum pemanasan (g) b = bobot contoh setelah pemanasan (g) Ekstraksi Ekstraksi sampel buah mahkota dewa dilakukan dengan sebanyak 120 gram buah mahkota dewa kering dimaserasi dengan pelarut etanol 30% sebanyak 1400 ml selama 1 hari pada suhu kamar di dalam erlenmeyer. Kemudian rendaman disaring, filtratnya disimpan sementara residunya direndam kembali dalam pelarut yang sama selama 1 hari. Perlakuan ini diulang sebanyak empat kali hingga filtrat tidak berwarna. Filtrat yang diperoleh dijadikan satu kemudian dipekatkan dengan penguap putar sehingga diperoleh ekstrak kasar kering dari pelarut etanol 30%. Ekstrak yang telah dipekatkan selanjutnya dianalisis kandungan senyawa aktifnya dengan cara uji fitokimia dan diuji aktivitas inhibisinya terhadap enzim α-glukosidase.
Uji Fitokimia (Harborne 1987) Uji alkaloid. Sebanyak 1 gram ekstrak mahkota dewa dilarutkan dalam 10 ml kloroform dan beberapa tetes NH4OH kemudian disaring ke dalam tabung reaksi tertutup. Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan penambahan 10 tetes H2SO4 2 M kemudian lapisan asamnya dipindahkan ke dalam tabung reaksi yang lain. Lapisan asam ini diteteskan pada plat tetes dan ditambahkan pereaksi Mayer, Wagner, dan Dragendorff. Hasil positif ditandai dengan adanya endapan warna berturut-turut putih, cokelat, dan merah jingga untuk masingmasing pereaksi. Uji flavonoid. Sebanyak 1 gram ekstrak mahkota dewa dari masing-masing sumber ditambahkan 100 ml air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Filtrat yang diperoleh kemudian diambil sebanyak 5 ml, ditambah dengan serbuk Mg 0.5 gram, 1 ml HCl pekat, dan 1 ml amil alkohol. Campuran dikocok kuat-kuat. Hasil positif ditandai dengan munculnya warna merah, kuning, atau jingga pada lapisan amil alkohol. Uji saponin. Sebanyak 1 gram ekstrak mahkota dewa ditambahkan dalam 100 ml air panas kemudian dididihkan selama 5 menit lalu disaring. Sebanyak 5 ml filtrat dikocok dalam tabung reaksi tertutup selama 10 detik untuk kemudian dibiarkan 10 menit. Hasil positif pada saponin ditunjukkan dengan terbentuknya buih yang stabil. Uji tanin. Sebanyak 1 gram ekstrak mahkota dewa ditambahkan ke dalam 100 ml air panas kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring. Sebanyak 5 ml filtrat ditambah FeCl3 1%. Hasil positif ditandai munculnya warna hijau kehitaman. Uji triterpenoid dan steroid. Uji ini menggunakan pereaksi Lieberman-Buchard. Pada pengujian ini, sebanyak 1 gram ekstrak mahkota dewa dari masing-masing sumber dimaserasi dengan 10 ml dietil eter selama 1 jam kemudian disaring. Ke dalam filtratnya ditambahkan 3 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat secara berurutan. Larutan dikocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya warna merah atau ungu untuk triterpenoid serta hijau atau biru untuk steroid. Uji Aktivitas α-Glukosidase (Sutedja 2003) Preparasi sampel. Sampel yang diuji dilarutkan dalam pelarut dimetil sulfoksida (DMSO) dengan konsentrasi 1, 1.5, dan 2% (b/v).
Uji in vitro ekstrak buah mahkota dewa terhadap aktifitas α-glukosidase. Larutan enzim dibuat dengan melarutkan 1.0 mg αglukosidase dalam larutan bufer fosfat (pH 7) yang mengandung 200 mg serum bovin albumin. Sebelum digunakan sebanyak 1 ml larutan enzim tersebut diencerkan 25 kali dengan bufer fosfat (pH 7). Campuran pereaksi terdiri dari 250 µl p-nitrofenil α-Dglukopiranosida (p-NPG) 20 mM sebagai substrat, 490 µl larutan bufer fosfat (pH 7) 100 mM, dan 10 µl larutan contoh dalam dimetil sulfoksida (DMSO) 1% (b/v). Setelah itu campuran pereaksi diinkubasi pada suhu 37oC selama lima menit, 250 µl larutan enzim α-glukosidase ditambahkan kemudian diinkubasi kembali selama 15 menit. Reaksi enzim dihentikan dengan sebanyak 1000 µl sodium karbonat (Na2CO3) 200 mM dan absorbans dari p-nitrofenol diukur dengan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 400 nm. Kontrol positif dibuat dengan melarutkan tablet akarbosa dalam bufer fosfat (pH 7) dan HCl 2N dengan konsentrasi larutan standar yang digunakan sama dengan konsentrasi 1%. Larutan ini kemudian disentrifuse, supernatan dimasukan ke dalam campuran pereaksi seperti pada sampel. Hasil reaksi tersebut diukur dengan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 400 nm. Data kontrol positif ini digunakan sebagai pembanding dengan sampel yang diuji. Persentasi inhibisi dapat dihitung menggunakan persamaan: dengan S adalah absorbans sampel (S1-S0 dengan S1 adalah absorbans sampel dengan penambahan enzim dan S0 adalah absorbans sampel tanpa penambahan enzim) dan C adalah absorbans blanko. Sistem reaksi enzim selengkapnya untuk satu sampel dengan volume total 2 ml dapat dilihat pada Lampiran 2. Flash Chromatography Ekstrak kasar etanol buah mahkota dewa yang telah dipekatkan difraksinasi dengan menggunakan flash chromatography, dengan fase diam silika gel. Langkah pertama yang dilakukan adalah melarutkan ekstrak pekat buah mahkota dewa dalam pelarut etanol 30% dengan nisbah sekitar 1:1. Selanjutnya flash chromatography terlebih dahulu dijenuhkan dengan eluen yang akan dipakai. Laju alir yang digunakan adalah 10 mL/menit, sedangkan eluennya adalah campuran butanol:
asam asetat: air dengan nisbah 60:15:25 (Wulandari 2005). Fraksi-fraksi yang dihasilkan pada flash chromatography ditampung kemudian dianalisis menggunakan metode KLT dan nilai Rf yang sama dijadikan satu fraksi, kemudian dilanjutkan identifikasi setiap fraksi tersebut melalui uji fitokimia dan spektrofotometer ultraviolet dan inframerah.
HASIL DAN PEMBAHASAN Sampel yang diperoleh pada penelitian ini lebih dahulu dikeringkan dan selanjutnya ditentukan kadar airnya (Lampiran 3). Rerata kadar air simplisia buah mahkota dewa dari Cikabayan dan KSH berturut-turut sebesar 6.42 dan 7.38%. Pengeringan merupakan proses penentuan kadar air sampai batas terbaik, yaitu 8-10% karena pada tingkat kadar air tersebut waktu simpannya relatif lama dan sampel terhindar dari pencemaran yang disebabkan oleh jamur, bakteri, dan insektisida (Hernani & Mulyono 1997). Hasil penelitian Satria (2005) dan Wulandari (2005) mengenai kandungan air dalam buah mahkota dewa memberikan kisaran sebesar 6-13%. Hal ini menunjukkan kandungan air dalam buah mahkota dewa sangat bervariasi, tergantung kondisi penyimpanan dan kadar kematangan buah. Sampel kering buah mahkota dewa diekstraksi menggunakan pelarut etanol 30%. Pemilihan pelarut etanol 30% mengacu pada Harborne (1987) bahwa bahan segar dapat diekstraksi dengan alkohol absolut, tetapi untuk bahan kering dan kayu diekstraksi menggunakan campuran alkohol dan air. Alkohol merupakan pelarut yang baik untuk ekstraksi pendahuluan. Faktor penting dalam ekstraksi adalah pemilihan pelarut, selektivitas, sifat pelarut, kemampuan untuk mengekstrak, tidak bersifat racun, dan kemudahan untuk diuapkan (Harborne 1987). Ekstraksi sampel kering buah mahkota dewa dilakukan secara maserasi. Kelebihan metode ini di antaranya relatif sederhana, yaitu tidak memerlukan alat-alat yang rumit, relatif mudah, murah, dan dapat menghindari rusaknya komponen senyawa akibat panas. Maserasi dilakukan sebanyak empat kali dengan asumsi maserasi sudah tidak efektif mengekstrasi komponen tumbuhan dalam jumlah yang berarti jika dilakukan lebih dari empat kali (Sugiwati 2005). Rendemen ekstrak etanol 30% pada buah mahkota dewa yang berasal dari Cikabayan
lebih besar dari KSH (Lampiran 4). Rendemen ekstrak yang diperoleh untuk buah mahkota dewa dari Cikabayan sebesar 23.51% dan dari KSH sebesar 22.17%. Hasil penelitian Sofianti (2006) dan Saleh (2007) menunjukkan rendemen ekstrak yang diperoleh dengan metode refluks menggunakan etanol 70% ialah sekitar 30%. Berdasarkan hasil tersebut dapat diketahui bahwa konsentrasi pelarut dan metode ekstraksi yang digunakan mempengaruhi jumlah rendemen yang dihasilkan. Fitokimia Uji fitokimia merupakan uji awal untuk mengetahui terdapatnya metabolit sekunder yang diharapkan dapat berfungsi sebagai antidiabetes. Dari hasil analisis fitokimia diketahui ekstrak etanol buah mahkota dewa baik yang berasal dari Cikabayan maupun KSH menunjukkan adanya alkaloid, tanin, steroid, dan flavonoid (Tabel 1). Senyawa flavonoid pada tanaman Origanum majorana dapat menghambat aktivitas α-glukosidase (Kawabata et al. 2003). Tabel 1 Analisis fitokimia buah mahkota dewa Uji
ekstrak etanol
Ekstrak etanol buah mahkota dewa Cikabayan KSH +++ +++ + ++ +++ ++++ + +
Alkaloid Flavonoid Tanin Triterpenoid Saponin Steroid Keterangan: (+) :terbentuk warna yang diinginkan dan menyatakan intensitas warna (-) :tidak terbentuk warna yang diinginkan Hasil uji fitokimia ini sama dengan yang dilaporkan oleh Shalahudin (2005) bahwa ekstrak buah mahkota dewa mengandung alkaloid, steroid, tanin, dan flavonoid. Namun, saponin tidak ditemukan pada ekstrak buah mahkota dewa baik yang berasal dari Cikabayan maupun KSH, hal ini tidak sesuai dengan pernyataan Sugiwati (2005) yang menyatakan bahwa saponin terdapat dalam buah mahkota dewa asal Jawa Tengah yang diekstraksi dengan pelarut air. Perbedaan kandungan metabolit sekunder pada jenis tanaman yang sama seringkali terjadi karena perbedaan jenis pelarut yang digunakan saat ekstraksi, variasi genetik
individual, dan kondisi geografis tempat tumbuh (Kardono 2003). Uji Aktivitas α-Glukosidase Uji daya inhibisi terhadap α-glukosidase dilakukan dengan menggunakan ekstrak etanol buah mahkota dewa yang berasal dari Cikabayan dan KSH. Daya inhibisi aktivitas α-glukosidase diukur berdasarkan pembentukan p-nitrofenol yang dihasilkan dari hidrolisis substrat, yaitu p-nitrofenil α-Dglukopiranosida (p-NPG) menjadi p-nitrofenol (berwarna kuning) dan α-glukosa oleh αglukosidase (Gambar 4). Inhibisi terhadap aktivitas α-glukosidase dapat menurunkan jumlah p-nitrofenol yang dihasilkan sehingga intensitas warna p-nitrofenol berkurang.
inhibisi sebesar 99.34%. Meskipun daya inhibisi akarbosa sangat tinggi namun kerja akarbosa memberikan segi efek yang tidak diinginkan bagi tubuh manusia seperti kembung, diare, dan kejang perut (Lee et al. 2007) sehingga inhibitor α-glukosidase yang berasal dari bahan alam termasuk mahkota dewa dapat menjadi alternatif. Dibandingkan dengan daya inhibisi terhadap aktivitas α-glukosidase yang dimiliki oleh tanaman lain yang telah diteliti sebelumnya, daya inhibisi buah mahkota dewa lebih rendah. Daya inhibisi tanaman Sophora japonica, Nelumbo nucifera, Psidium guajava, dan Camellia sinensis menurut Tuyet dan Chuyen (2007) pada uji in vitro dengan konsentrasi 20 mg/ml secara berturut-turut sebesar 47.5, 51.4, 60.8, 65.4, dan 68.2%. % Inhibisi
100 80 60 40
26.48
29.22
24.51
1.0
1.5
2.0
20 0
Gambar 4 Reaksi α-glukosidase dengan pnitrofenil α-D-glukopiranosida. Uji inhibisi aktivitas α-glukosidase oleh ekstrak mahkota dewa asal Cikabayan maupun KSH pada konsentrasi 1% menunjukkan bahwa kedua ekstrak memberikan inhibisi dengan persen daya inhibisi masing-masing sebesar 24.59 dan 27.17% (Gambar 5). 100
99.34
% Inhibisi
80 60 40
24.59
27.17
MD-C
MD-K
20 0 A
Ekstrak
Gambar 5 Inhibisi aktivitas α-glukosidase dari akarbosa (A), ekstrak buah mahkota dewa asal Cikabayan (MD-C), dan KSH (MD-K). Ekstrak buah mahkota dewa asal KSH memiliki daya inhibisi lebih besar dibandingkan Cikabayan, yang menunjukkan bahwa daya inhibisi ekstrak buah mahkota dewa berasal dari KSH lebih baik daripada Cikabayan. Bagaimanapun juga daya inhibisi dari kedua ekstrak jauh lebih rendah dibanding akarbosa yang memiliki daya
Konsentrasi (%)
Gambar 6 Inhibisi aktivitas α-glukosidase dari ekstrak buah mahkota dewa asal KSH dengan konsentrasi 1% (0.05 g /ml), 1.5% (0.075g/ml), dan 2% (0.1g/ml). Daya inhibisi ekstrak buah mahkota dewa berasal dari KSH memiliki hasil yang lebih baik daripada Cikabayan. Oleh karena itu uji daya inhibisi aktivitas α-glukosidase dilakukan kembali hanya menggunakan sampel ekstrak buah mahkota dewa yang berasal dari KSH untuk melihat daya hambat ekstrak dengan konsentrasi yang berbeda. Sampel dibuat dengan ragam konsentrasi, yaitu 1, 1.5, dan 2 dengan hasil yang diperoleh berturut-turut sebesar 26.48, 29.22, dan 24.51%. Daya inhibisi yang diperoleh berbeda dengan penelitian Sugiwati (2005) yang memiliki daya inhibisi sebesar 33.01% pada konsentrasi 1%. Hasil yang berbeda disebabkan karena beberapa faktor antara lain karena perbedaan metode ekstraksi, pelarut, dan sumber buah mahkota dewa yang digunakan. Buah mahkota dewa yang diperoleh Sugiwati berasal dari Jawa Tengah yang memiliki banyaknya kandungan senyawa metabolit sekunder yang berbeda dengan sampel asal KSH. Sedangkan metode
ekstraksi yang dipakai, yaitu dengan cara perebusan menggunakan air sebagai pelarutnya. Pada Gambar 6 daya inhibisi ekstrak pada konsentrasi 1% sebesar 26.48% dan meningkat menjadi 29.22% pada konsentrasi 1.5%. Namun, pada konsentrasi 2% daya inhibisinya menurun menjadi 24.51%. Menurunnya daya inhibisi ekstrak pada konsentrasi 2% kemungkinan disebabkan sifat ekstrak yang berfungsi sebagai aktivator pada konsentrasi yang cukup tinggi. Aktivitas αglukosidase dipengaruhi oleh beberapa faktor di antaranya konsentrasi enzim, pH, suhu, konsentrasi substrat, senyawa inhibitor dan aktivator serta waktu penyimpanan (Lehninger 1982). Enzim memiliki sisi aktif yang dapat mengenali secara spesifik substratnya yang sesuai, sehingga memungkinkan untuk merancang inhibitor enzim yang dapat menghalangi pengikatan substrat pada enzim. Dengan terikatnya inhibitor pada enzim, maka dapat menghambat terbentuknya produk dari suatu metabolit yang tidak diinginkan (King 1994). Konsentrasi ekstrak 1.5% memiliki daya inhibisi terbesar dibandingkan konsentrasi 1% dan 2%. Peningkatan daya inhibisi menunjukkan bahwa ekstrak buah mahkota dewa memiliki aktivitas untuk menghambat kerja α-glukosidase dengan persen inhibisi yang berbeda tergantung pada konsentrasinya. Daya inhibisi α-glukosidase juga dipengaruhi oleh senyawa kimia yang terdapat didalam ekstrak yang dapat memberikan efek antihiperglikemik dengan menurunkan kadar glukosa. Senyawa ini bekerja sebagai inhibitor kompetitif terhadap kerja α-glukosidase, sehingga enzim tidak dapat menghidrolisis substrat (p-NPG) menjadi p-nitrofenol dan glukosa (Sugiwati 2005). Fraksinasi Penentuan keberadaan senyawa dalam ekstrak buah mahkota dewa yang berasal dari KSH dapat dianalisis secara kualitatif dengan pemisahan ekstrak menjadi beberapa fraksi menggunakan flash chromatography. Hasil ekstrak yang telah dipisahkan ditampung sebanyak 2 ml dalam tiap tabung reaksi. Pemisahan ekstrak tersebut menghasilkan 19 tabung reaksi dengan warna larutan yang berbeda. Selanjutnya hasil penampungan 19 tabung reaksi tersebut dianalisis dengan metode KLT. Fase gerak yang digunakan adalah butanol, asam asetat, dan air (60:15:25) sedangkan fase diam yang digunakan adalah
silika gel. Pemisahan dengan KLT didasarkan pada interaksi antara fase gerak, fase diam, dan analat. Berdasarkan sifat kepolarannya, fase diam yang digunakan yaitu silika gel bersifat polar, sedangkan fase gerak yang digunakan yaitu butanol, asam asetat, dan air yang merupakan campuran dari tiga macam pelarut yang berbeda kepolarannya, yaitu butanol yang bersifat sedikit lebih polar dibandingkan dengan asam asetat dan air yang memiliki polaritas tinggi. Hal ini mengakibatkan fase gerak yang merupakan ketiga campuran pelarut yang digunakan tersebut bersifat sedikit polar. Fase gerak ini memberikan pola pemisahan yang jelas. Spot yang terbentuk dideteksi di bawah sinar UV 254 dan 366 nm. Kromatogram dari metode ini menghasilkan 16 spot (Lampiran 7). Selanjutnya larutan dari tiap tabung reaksi yang memiliki spot dengan nilai Rf yang sama digabungkan menjadi satu fraksi, sehingga diperoleh empat fraksi. Fraksi ini kemudian diuji fitokimianya. Hasil dari uji fitokimia menyatakan bahwa keempat fraksi mengandung senyawa golongan flavonoid. Keempat fraksi ini kemudian diidentifikasi menggunakan spektrofotometer ultraviolet dan inframerah untuk melihat serapan maksimum dan dugaan gugus fungsinya. Spektrofotometer Ultraviolet (UV) Ekstrak buah mahkota dewa asal KSH memberikan hasil fraksi sebanyak empat, yaitu fraksi 4,7,5-6, dan 8-12. Masing-masing dari fraksi tersebut memberikan serapan panjang gelombang maksimum yang berbeda (Tabel 2). Tabel 2 Panjang gelombang maksimum pada spektrum UV Serapan Serapan Fraksi maksimum (nm) tambahan(nm) 4 259 278,310,369 5-6 259 280,310,370 7 259 246,318,369 8-12 260 247,318,370 Serapan maksimum keempat fraksi pada panjang gelombang 259-260 nm (Lampiran 8). Hasil tersebut menunjukkan transisi π- π*. Transisi elektron π- π* dapat dihasilkan dari kromofor C=O dan C=C. Serapan tambahan pada panjang gelombang 246-370 nm pada keempat fraksi menunjukkan transisi n-π*. Pita serapan dengan intensitas sangat rendah pada daerah 270-300 nm merupakan hasil dari transisi n-π* dari keton dan aldehida (Sudjadi 1983).
Hasil serapan maksimum dari keempat fraksi memiliki panjang gelombang maksimum pada kisaran 259-260 nm. Menurut Harborne (1987) pada kisaran panjang gelombang 230-560 nm merupakan serapan maksimum keberadaan senyawa flavonoid. Spektrofotometer Inframerah (IR) Ekstrak buah mahkota dewa asal KSH memberikan hasil pola spektrum inframerah yang hampir sama pada keempat fraksi (Tabel 3). Keempat fraksi memiliki serapan kuat uluran OH dengan puncak serapan pada panjang gelombang 3436.09-3435.32 cm-1 (Sudjadi 1983; Hollas 2002). Tabel 3 Bilangan gelombang inframerah dan dugaan gugus fungsi Fraksi
Puncak serapan (cm-1)
Intensitas
4
3369.72
kuat
Uluran O-H
2926.24
sedang
C-H aromatik
1701.84
sedang
C=O keton
1468.83
sedang
C=C aromatik
3427.43
kuat
Uluran O-H
2926.00
sedang
C-H aromatik
2362.13
lemah
C≡C
1624.36
sedang
C=O keton
1455.14
sedang
C=C aromatik
3392.56
kuat
Uluran O-H
2927.00
sedang
C-H aldehida
2364.07
lemah
C≡C
1623.89
sedang
C=O keton
5-6
7
8-12
Dugaan gugus fungsi
1407.66
sedang
C=C aromatik
3389.81
kuat
Uluran O-H
2928.17
sedang
C-H aromatik
2361.69
lemah
C≡C
1629.91
sedang
C=O keton
1411.16
sedang
C=C aromatik
Selain terdapat uluran OH juga teridentifikasi adanya uluran C-H aromatik pada bilangan gelombang 2900-2700 cm-1 (Skoog et al. 1998), dan adanya tekukan C=O keton pada bilangan gelombang 1740-1720 cm-1 (Skoog et al. 1998). Hasil dari fraksi 5-6,7, dan 8-12 memiliki serapan gugus fungsi C≡C dengan puncak serapan pada panjang gelombang 2260-2240 cm-1 (Skoog et al. 1998). Tekuk C=C aromatik terdapat pada keempat fraksi dengan
kisaran bilangan gelombang 1400-1600 cm-1 (Sudjadi 1985; Hollas 2002). Hasil dari penapisan fitokimia, spektrum ultraviolet, dan inframerah pada masingmasing fraksi diduga bahwa ekstrak buah mahkota dewa sumber KSH mengandung senyawa golongan flavonoid. Gambar spektrum keempat fraksi selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 8.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Buah mahkota dewa asal Cikabayan dan KSH mengandung senyawa metabolit sekunder golongan alkaloid, flavonoid, tanin, dan steroid. Uji aktivitas α-glukosidase memberikan hasil bahwa ekstrak etanol buah mahkota dewa yang berasal dari KSH memiliki potensi sebagai antihiperglikemik dengan persen daya inhibisi terbaik pada konsentrasi 1.5% sebesar 29.22%. Pemisahan ekstrak mahkota dewa asal KSH menghasilkan 4 fraksi. Hasil dari penapisan fitokimia, spektrum ultraviolet, dan inframerah pada keempat fraksi diduga bahwa ekstrak buah mahkota dewa sumber KSH mengandung senyawa golongan flavonoid. Saran Perlu dilakukan uji aktivitas enzim lebih lanjut dengan ragam konsentrasi yang lebih tinggi untuk menentukan sifat senyawa dalam ekstrak sebagai inhibitor atau aktivator dan uji aktivitas enzim pada masing-masing fraksi untuk mengetahui fraksi teraktif. Selain itu untuk keperluan elusi dengan struktur sempurna yang bertanggung jawab terhadap inhibisi aktivitas α-glukosidase diperlukan juga karakterisasi dengan LC-MS dan spektroskopi NMR untuk menentukan suatu senyawa secara kuantitatif.
DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Assosiation of Official Analytical Chemist. 1984. Official Methods of Analysis of AOAC International. Washington DC: AOAC International. Coma P. et al. 1992. α-Glucosidase and Nacetyl-β-D-Glucosaminidase Isoenzymes in Serum. Clin Chem 38(2):223-226.
Departemen Kesehatan. 2005. Jumlah Penderita Diabetes Indonesia Ranking ke-4 di Dunia. [terhubung berkala]. http://www.depkes.go.id/index.php. [7 Januari 2008] Gao H, Huang Y, Gao B, Kawabata J. 2008. Chebulagic acid is a potent α-glucosidase inhibitor. Biosci Biotechnol Biochem 72(2):601-603. Girindra A. 1990. Biokimia I. Jakarta: Gramedia. Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia, Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Bandung: Penerbit ITB. Harborne JB. 1996. Metode Fitokimia, Cara Menganalisis Tanaman. Bandung: Penerbit ITB. Harmanto N. 2003. Mahkota Dewa, Obat Pusaka Para Dewa. Jakarta: PT. Agromedika Pustaka. Hernani, Mulyono E. 1997. Pengolahan dan Penganekaragaman Hasil. Monograf No.3 Jahe. Bogor: Balitro. Hollas JM. 2002. Basic Atomic and Molecular Spectroscopy. Bristol: Wiley Interscience. Houghton J, Raman. 1998. Laboratory Handbook for the Fractination of Natural Extract. London: Chapman & Hall. Kardono LBS. 2003. Kajian Kandungan Kimia Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) dalam Prosiding Seminar Sehari Mahkota Dewa. Depkes: Puslitbang farmasi dan obat tradisional Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Kawabata J et al. 2003. 6-Hydroxyflavonoids as α-Glucosidase Inhibitors from Marjoram (Origanum majorana) Leaves. Biosci Biotechno. Biochem 67(2):445-447. King FD. 1994. Medicinal Chemistry: Principles and Practise. Cambridge: The Royal Society of Chemistry. Lee SK et al. 2007. Inhibitory activity of Euonymus alatus against alpha-glucosidase in vitro and in vivo. Nutrition Research and Practice. 1(3):184-188.
Lehninger AL. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 2. Terjemahan Maggy Thenawidjaja. Jakarta: Penerbit Erlangga. Lisdawati V. 2002. Brine Shrimp Lethality Test (BSLT), Bioassay Antikanker in vitro dengan Sel Leukimia L1210, dan Isolasi Penentuan Struktur Molekul Senyawa Kimia dari Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) [tesis]. Jakarta: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Meloan CE. 1999. Chemical Separation. New York: J Willey. Park H et al. 2008. Discovery and biological evaluation of novel α-glucosidase inhibitor with in vivo antidiabetic effect. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 9:60-89. Poedjiadi A. 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press. Pradeepa R, Mohan V. 2002. The changing of diabetic epidemic implications for sIndia. Indian J Med Res.116:163-176. Robinson T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung: ITB. Saleh I. 2007. Aktivitas Antioksidan Daging Buah dan Daun Mahkota Dewa Berdasarkan Pengukuran Kapasitas Reduksi Ce(IV) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Satria E. 2005. Potensi Antioksidan dari Daging Buah Muda dan Daging Buah Tua Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Shalahuddin I. 2005. Efek Antihiperglikemik Ekstrak Air Buah Mahkota Dewa pada Tikus Diabetes yang Diinduksi Streptozotosin [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sofianti D. 2006. Potensi Antioksidan Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Still WC, Kahn M, Mitra A. 1978. Flash Chromatography. J Org. Chem. 1978, 43, 2923-2925. [terhubung berkala] http://www.labhut.com/education/flash/abs tract.php. [10 Juli 2008]
Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) pada Mencit Putih. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Stryer L. 1995. Biochemistry. New York: Freeman.
Tuyet T, Chuyen NV. 2007. Antihiperglycemic activity of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry. Biosci Biotechnol Biochem 71(1):69-76.
Sudjadi. 1983. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Bandung: Ghalia Indonesia Sugiwati S. 2005. Aktivitas Antihiperglikemik dari Ekstrak Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Scheff.) Boerl.) sebagai Inhibitor α-Glukosidase in vitro dan in vivo pada Tikus Putih [disertasi]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Sutedja L. 2002. Bioprospecting Tumbuhan Obat Indonesia sebagai Sediaan Fitofarmaka Antidiabetes. Laporan Kemajuan Tahap II Riset Unggulan Terpadu, Pusat Penelitian Kimia-LIPI. Taryono, Ruhnayat A. 2002. Mahkota Dewa Si Raja Obat. Warta Balitro No. 45:45-49. Tiagarna P. 2004. Uji Toksisitas Akut Ekstrak Etanol 30% dan Ekstrak Air dari Buah
Waring WS. 2007. Antidiabetic Elsevier Medicine 35(11):590-591.
drugs.
Waspadji S. 1996. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Ed ke-3. Jakarta: Balai Penerbit FKUI. Winarto WP. 2003. Mahkota Dewa: Budi Daya dan Pemanfaatan Untuk Obat. Jakarta: Penebar Swadaya. Wulandari NDM. 2005. Perbandingan Metode Ekstraksi Buah Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa) dan Uji Toksisitas Subkronis pada Tikus Putih [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Diagram alir penelitian Buah Mahkota dewa segar dari 2 sumber
Cikabayan
KSH IPB
Dipotong-potong
Dipotong-potong
Pengeringan, digiling hingga halus
Pengeringan, digiling hingga halus
Maserasi dengan Etanol 30%
Maserasi dengan Etanol 30%
Ekstrak
Ekstrak
Pekatkan (penguap putar)
Pekatkan (penguap putar)
Uji fitokimia
Uji fitokimia
Uji Inhibisi Enzim α-Glukosidase
Uji Inhibisi Enzim α-Glukosidase
Fraksinasi
Hasil inhibisi terbaik
Uji fitokimia
Ultraviolet
Inframerah
Lampiran 2 Prosedur sistem reaksi enzim untuk satu sampel dengan volume total 2 ml Larutan
Blanko (µL)
Kontrol (µL)
S0 (µL) -
10
10
490 250 (5 menit) 250 250 -
490 250
Sampel
-
DMSO Buffer Substrat
10 490 250 Inkubasi 37oC 250 -
10 490 250
1000 Inkubasi 37oC
1000
Buffer Enzim Na2CO3
S1 (µL)
1000 (15 menit)
250 1000
Keterangan : B = Blanko K = Kontrol blanko So = Kontrol sampel S1 = Sampel Rumus : % inhibisi = Aterkoreksi kontrol – (Aterkoreksi S1 – Aterkoreksi S0) x 100% Aterkoreksi kontrol = (K-B) – [(S1-B)-(S0-B)] x 100% (K-B)
Lampiran 3 Kadar air buah mahkota dewa Sampel Sumber
Cikabayan
KSH
n 1 2 3 1 2 3
(g) 3.0046 3.0061 3.0053 3.0068 3.0087 2.9975
Cawan kosong (g) 17.6764 20.7420 20.5101 16.6218 18.9250 18.2730
Cawan + Kadar Rerata Sampel kering air (g) (%) (%) 20.4800 6.42 23.5527 6.50 6.42 23.3247 6.35 19.4097 7.28 21.7163 7.23 7.38 21.0421 7.62
Contoh perhitungan kadar air buah mahkota dewa asal Cikabayan: Bobot sampel (a) = 3.0046 g Bobot cawan kosong (b) = 17.6764 g Bobot cawan + sampel kering (c) = 20.4880 g Bobot sampel kering (d = c-b) = 2.8116 g % Kadar air = (a – d) x 100% a = (3.0046 g – 2.8116 g) x 100% 3.0046 g = 6.42 %
Lampiran 4 Rendemen buah mahkota dewa Sumber Cikabayan KSH
Sampel yang diekstrak (g) 120.0547 100.0122
Ekstrak Rendemen pekat (g) (%) 28.2263 23.51 22.1726 22.17
Contoh perhitungan rendemen buah mahkota dewa asal Cikabayan: % Rendemen = bobot ekstrak pekat x 100% bobot sampel yang diekstrak = 28.2263 g x 100% 120.0547 g = 23.51 %
Lampiran 5 Daya inhibisi α-glukosidase dari ekstrak buah mahkota dewa (MD dan akarbosa 1% Sampel Blanko Kontrol S0- Akarbosa Akarbosa - 1 Akarbosa - 2 Akarbosa - 3 S0- MDc MDc - 1 MDc - 2 MDc - 3 S0- MDk MDk - 1 MDk - 2 MDk - 3
Absorbans 0.088 2.569 0.082 0.110 0.091 0.094 0.342 2.187 2.208 2.244 0.370 2.143 2.187 2.201
Absorbans terkoreksi 2.481 -0.006 0.022 0.003 0.006 0.254 2.099 2.120 2.156 0.282 2.055 2.099 2.113
inhibisi (%) 98.87 99.64 99.52 25.63 24.79 23.34 28.54 26.76 26.20
Keterangan: S0 = Kontrol sampel MDc = Mahkota dewa asal Cikabayan MDk = Mahkota dewa asal KSH Contoh perhitungan daya inhibisi buah mahkota dewa asal Cikabayan: % inhibisi = Aterkoreksi kontrol – (Aterkoreksi S1 – Aterkoreksi S0) x 100% Aterkoreksi kontrol = 2.481- (2.099-0.254) x 100% 2.481 = 25.63 %
Rerata (%)
99.34
24.59
27.17
Lampiran 6 Daya inhibisi α-glukosidase dari ekstrak buah mahkota dewa (MD) asal KSH pada konsentrasi 1, 1.5, dan 2% Larutan MD KSH 1 % Blanko Kontrol S0 S1- 1 S1- 2 MD KSH 1.5 % Blanko Kontrol S0 S1- 1 S1- 2 MD KSH 2 % Blanko Kontrol S0 S1- 1 S1- 2
Absorbans
Absorbans terkoreksi
Inhibisi (%)
Rerata (%)
0.088 2.569 0.370 2.187 2.201
2.481 0.282 2.099 2.113
26.76 26.20
26.48
0.060 2.137 0.710 2.180 2.187
2.077 0.650 2.120 2.127
29.22 29.22
29.22
0.060 2.137 0.633 2.194 2.208
2.077 0.573 2.134 2.148
24.84 24.17
24.51
Contoh perhitungan daya inhibisi buah mahkota dewa konsentrasi 1%: % inhibisi = Aterkoreksi kontrol – (Aterkoreksi S1 – Aterkoreksi S0) x 100% Aterkoreksi kontrol = 2.481- (2.099-0.282) x 100% 2.481 = 26.76 %
Lampiran 7 Hasil pemisahan ekstrak etanol buah mahkota dewa
Tabung ke1 2 3 4 5
Jarak Spot Rf dari start (cm) 5.2 0.69 1.2 0.16 1.7 0.23 4 0.53 5.2 0.69 6 1.2 0.16 1.7 0.23 3.95 0.53 5.2 0.69 7 1.2 0.16 1.7 0.23 8 1.2 0.16 9 1.2 0.16 10 1.1 0.15 11 1.1 0.15 12 1.1 0.15 13 14 15 16 17 18 19 Contoh perhitungan : Jarak migrasi spot 5.2 Rf = = 0.69 = Jarak migrasi eluen 7.5
Lampiran 8 Spektrum UV dari setiap fraksi b) fraksi 5-6
391
405
403
378
387
364
351
337
324
310
297
λ maks = 260 nm
Absorban
0.5 0.4 0.3 0.2
Panjang gelombang (nm)
371
355
339
323
307
291
275
259
0 243
406
390
373
357
340
324
307
291
274
258
0.1
241
Absorban
d) fraksi 8-12 λ maks = 259 nm
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
283
Panjang gelombang (nm)
Panjang gelombang (nm)
c) fraksi 7
270
243
A bsorban 403
388
374
359
345
330
316
301
287
272
258
λ maks = 259 nm
1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 256
λ maks = 259 nm
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 243
Absorban
a) fraksi 4
Panjang gelombang (nm)
Lampiran 9 Spektum Inframerah dari setiap fraksi a) Fraksi 4
b) Fraksi 5-6
Lanjutan c) Fraksi 7
d) Fraksi 8-12
