UJI IN VITRO EKSTRAK AIR DAN ETANOL DARI BUAH ASAM GELUGUR, RIMPANG LENGKUAS, DAN KENCUR SEBAGAI INHIBITOR AKTIVITAS LIPASE PANKREAS
ANA FITRIYANI
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK ANA FITRIYANI. Uji in Vitro Ekstrak Air dan Etanol dari Buah Asam Gelugur, Rimpang Lengkuas, dan Kencur sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas. Dibimbing oleh DYAH ISWANTINI PRADONO dan LATIFAH KOSIM DARUSMAN. Buah asam gelugur merupakan marga Garcinia, sering digunakan sebagai obat penurun bobot badan. Lengkuas dan kencur adalah tanaman obat tradisional yang berpotensi sebagai antiobesitas yang mudah didapat dan murah karena telah diteliti mampu menurunkan fosfolipid, trigliserida, serta kolesterol. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi potensi ketiga tanaman sebagai antiobesitas melalui kemampuan ekstrak air dan etanolnya dalam menghambat aktivitas lipase pankreas secara in vitro pada pH 8,0, waktu inkubasi 45 menit, dan suhu 40°C. Penelitian ini menggunakan lipase pankreas manusia (1,4 × 10-5 µg/µL) dan minyak wijen (16,2 µg/µL) sebagai substrat. Ekstrak air dan etanol buah asam gelugur secara berurutan mengandung saponin dan alkaloid. Ekstrak lengkuas mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, dan kuinon, sedangkan ekstrak etanolnya mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, dan steroid. Ekstrak air kencur mengandung saponin dan kuinon, sedangkan ekstrak etanolnya mengandung alkaloid, flavonoid, steroid, dan kuinon. Ketiga tanaman berpotensi sebagai antiobesitas karena berdasarkan hasil uji in vitro mampu menginhibisi aktivitas lipase pankreas. Daya inhibisi tertinggi dari semua ekstrak dicapai oleh ekstrak etanol buah asam gelugur dengan nilai 86,3% pada konsentrasi 150 ppm. Daya inhibisi tertinggi lengkuas dicapai oleh ekstrak etanolnya pada konsentrasi 200 ppm, yaitu sebesar 56,2%. Daya inhibisi tertinggi ekstrak kencur dicapai oleh ekstrak etanolnya dengan nilai 37,6% pada konsentrasi 300 ppm. Nilai-nilai tersebut lebih besar jika dibandingkan dengan kontrol positif (Xenical®) pada 100 ppm, yaitu sebesar 10,6%.
ABSTRACT ANA FITRIYANI. In Vitro Assay of Water and Ethanol Extracts of Asam Gelugur Fruits, Lengkuas, and Kencur Rhizomes as Inhibitor of Pancreatic Lipase Activity. Supervised by DYAH ISWANTINI PRADONO and LATIFAH KOSIM DARUSMAN. Asam gelugur fruits of Garcinia oftenly used to reduce body weight. Lengkuas and kencur are traditional herbal that potential as inexpensive and available antiobesity because they had been studied could reduce the level of phospholipids, triglycerides, and cholesterol. This research evaluated the potencies of these herbal as antiobesity by their water and ethanol extracts capabilities in inhibiting pancreatic lipase activity in vitro at pH 8,0, incubation time 45 minutes, and temperature 40°C. This research used human pancreatic lipase (1,4 × 10-5 µg/µL) and sesame oil (16,2 µg/µL) as substrate. The water and ethanol extracts of asam gelugur fruits contained saponins and alkaliods, respectively. The water extract of lengkuas rhizomes contained alkaloids, flavonoids, saponins, dan quinones, while the ethanol extract contained alkaloids, flavonoids, saponins, and steroids. The water extract of kencur rhizomes contained saponins and quinones, while the ethanol extract contained alkaloids, flavonoids, steroids, and quinones. These plants have potencies as antiobesity based on in vitro assay in inhibiting pancreatic lipase activity. The highest inhibitory effect of all extracs was obtained from the ethanol extract of asam gelugur fruits with value of 86,3% at 150 ppm. The highest inhibitory effect of lengkuas extracts was from the ethanol extract at 200 ppm, which was about 56,2%. The highest inhibitory effect of kencur was showed by the ethanol extract with the value 37,6% at 300 ppm. These values were higher than the inhibitory effect of the positive control (Xenical®) at 100 ppm, about 10,6%.
UJI IN VITRO EKSTRAK AIR DAN ETANOL DARI BUAH ASAM GELUGUR, RIMPANG LENGKUAS, DAN KENCUR SEBAGAI INHIBITOR AKTIVITAS LIPASE PANKREAS
ANA FITRIYANI
Skripsi sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia
DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Skripsi Nama NIM
: Uji in Vitro Ekstrak Air dan Etanol dari Buah Asam Gelugur, Rimpang Lengkuas, dan Kencur sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas : Ana Fitriyani : G44204027
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Dyah Iswantini Pradono, M.Agr NIP 132 956 706
Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, M.S. NIP 130 536 681
Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor,
Dr. drh. Hasim, DEA NIP 131 578 806
Tanggal lulus:
PRAKATA Puji syukur ke hadirat Allah SWT atas segala kasih sayang, nikmat, rahmat, dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah yang berjudul Uji in Vitro Ekstrak Air dan Etanol dari Buah Asam Gelugur, Rimpang Lengkuas, dan Kencur sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas ini merupakan salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains pada Departemen kimia FMIPA IPB. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Dyah Iswantini Pradono, M.Agr dan Ibu Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, M.S. sebagai pembimbing yang telah memberikan arahan, saran, dan dorongan selama pelaksanaan penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Hibah Kompetensi atas nama Dr. Dyah Iswantini Pradono, M.Agr yang telah membantu pembiayaan penelitian dan Pusat Studi Biofarmaka IPB yang telah memberikan bantuan dalam hal tempat penelitian dan peralatan laboratorium yang penulis gunakan dalam penelitian ini . Ungkapan terima kasih penulis berikan kepada ibu, ayah, kakak, adik, dan keluarga besar Kamari yang selalu memberikan semangat, doa, dan kasih sayang dalam berbagai bentuk yang tak pernah putus. Selain itu, terima kasih kepada Laboratorium Terpadu, seluruh laboran Kimia Fisik dan Lingkungan, serta Kimia Analitik, Bu Nunuk, Mba Salina, serta semua staf dan pegawai Pusat Studi Biofarmaka atas bantuan yang diberikan selama penelitian. Ucapan terima kasih tak lupa penulis berikan kepada Kak Ita, Kak Sabet, dan Ai yang turut membantu dalam penyusunan karya ilmiah ini. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.
Bogor, Januari 2009
Ana Fitriyani
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Kendal pada tanggal 5 Mei 1987 dari ayah Masrochan dan ibu Musanah. Penulis merupakan putri ketiga dari empat bersaudara. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Kendal dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur undangan seleksi masuk IPB (USMI) di Departemen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten praktikum Kimia Dasar (2005/2006 dan 2007/2008), Kimia Fisik Layanan (2007/2008), Kimia Analitik Layanan (2007/2008), serta Kromatografi II untuk program Diploma Analisis Kimia (2007/2008). Penulis juga pernah menjadi Staf Komisi Keilmuan Dewan Perwakilan Mahasiswa Fakultas MIPA (2005/2006) dan Staf Departemen Chem Art Ikatan Mahasiswa Kimia (2006/2007). Selama perkuliahan penulis juga memperoleh beasiswa dari POM (Persatuan Orang Tua Mahasiswa) selama 2 tahun, yaitu tahun 2004-2006. Bulan Juli-Agustus 2007, penulis melaksanakan praktik lapangan di Laboratorium CQA PT Indofood Sukses Makmur Tbk, Ancol.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL........................................................................................................... vi DAFTAR GAMBAR ..................................................................................................... vi DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................................vii PENDAHULUAN .......................................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Asam Gelugur (Garcinia atroviridis) .................................................................. Lengkuas (Alpinia galanga)................................................................................. Kencur (Kaempferia galanga) ............................................................................. Lipase Pankreas.................................................................................................... Penelitian Pendukung........................................................................................... Uji Toksisitas Larva Udang ................................................................................ BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat..................................................................................................... Metode Penelitian ................................................................................................ Persiapan Contoh ................................................................................................. Penetapan Kadar Air (AOAC 2000) .................................................................... Uji Fitokimia (Harborne 1987) ............................................................................ Ekstraksi Air (Padikkala & Achuthan 1997)........................................................ Ekstraksi Etanol (Padikkala & Achuthan 1997) .................................................. Uji Toksisitas Ekstrak (Meyer et al. 1982) .......................................................... Uji in Vitro Ekstrak sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas (Han et al. 2005) .................................................................................................. Penetapan Kadar Flavonoid Total Ekstrak (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005) ................................................................................................
2 2 3 3 4 5
5 5 5 5 6 6 6 6 7 7
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Contoh................................................................................................. 7 Ekstraksi............................................................................................................... 7 Uji Fitokimia ........................................................................................................ 8 Uji Toksisitas ....................................................................................................... 9 Uji in Vitro Ekstrak sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas .......................10 Uji Statistik .........................................................................................................14 Kadar Flavonoid Total .........................................................................................15 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ..............................................................................................................16 Saran ....................................................................................................................16 DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................16 LAMPIRAN ...................................................................................................................19
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil uji fitokimia buah asam gelugur .......................................................................... 8 2 Hasil uji fitokimia rimpang lengkuas............................................................................ 8 3 Hasil uji fitokimia rimpang kencur ............................................................................... 9 4 Nilai LC50 ekstrak air dan etanol contoh terhadap larva udang..................................... 9 5 Daya inhibisi ekstrak contoh pada konsentrasi maksimum .......................................... 12
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Buah asam gelugur (Garcinia atroviridis).................................................................... 2 2 Rimpang lengkuas (Alpinia galanga) ........................................................................... 2 3 Rimpang kencur (Kaemferia galanga) ......................................................................... 3 4 Rendemen berbagai macam ekstrak contoh ................................................................. 8 5 Grafik daya inhibisi ekstrak air contoh terhadap aktivitas lipase pankreas .................. 11 6 Grafik daya inhibisi ekstrak etanol contoh terhadap aktivitas lipase pankreas ............. 11 7 Grafik daya inhibisi kontrol positif (Xenical®) terhadap aktivitas lipase pankreas ..... 12
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Bagan alir penelitian ..................................................................................................... 20 2 Bagan alir ekstraksi air.................................................................................................. 21 3 Bagan alir ekstraksi etanol ............................................................................................ 21 4 Bagan alir penentuan nilai LC50 ekstrak dengan menggunakan larva udang................. 22 5 Bagan alir uji in vitro inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas .................... 23 6 Prosedur pembuatan pereaksi tembaga ........................................................................ 23 7 Bagan alir penentuan kadar flavonoid total ekstrak ..................................................... 24 8 Penentuan kadar air....................................................................................................... 25 9 Rendemen berbagai ekstrak contoh dan perhitungan.................................................... 26 10 Aktivitas ekstrak terhadap larva A. salina setelah 24 jam .......................................... 27 11 Data dan perhitungan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas ......... 28 12 Perhitungan statistik ekstrak buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur ...... 30 13 Kurva estimasi berbagai ekstrak contoh dan kontrol positif ....................................... 33 14 Data dan perhitungan penentuan kadar flavonoid total............................................... 34
PENDAHULUAN Kegemukan saat ini menjadi salah satu masalah kesehatan masyarakat karena dapat menurunkan produktivitas kerja, mengganggu penampilan, dan menyebabkan beberapa penyakit degeneratif seperti diabetes melitus tipe 2, aterosklerosis, kanker, dan hipertensi. Oleh karena itu, para penderita kegemukan atau obesitas rela melakukan berbagai upaya untuk menurunkan bobot badan mereka, mulai dari mengatur kembali pola makan, berolah raga, mengonsumsi berbagai obat penurun bobot badan atau pelangsing, hingga melakukan pembedahan. Sebagian besar obat penurun bobot badan atau pelangsing sintetik di pasaran, seperti sibutramin dan orlistat dapat menimbulkan efek samping yang tidak baik bagi kesehatan (Downey et al. 2004) sehingga masyarakat lebih memilih mengonsumsi pelangsing dari tanaman obat karena dinilai lebih aman dan harganya lebih terjangkau. Mekanisme obat pelangsing salah satunya adalah menghambat penyerapan lemak melalui penghambatan aktivitas lipase pankreas sebagai sumber utama kelebihan kalori. Hal ini dikarenakan peningkatan aktivitas lipase pankreas mampu meningkatkan jumlah monogliserida dan asam lemak yang diserap tubuh, penyebab kegemukan. Inhibitor lipase yang pertama ditemukan adalah orlistat, suatu turunan lipstatin yang diisolasi dari bakteri Streptomyces toxitricini (Hadvary et al. 1988). Inhibitor lipase dari beberapa ekstrak tanaman antara lain ekstrak herba Cassia mimosoides (Yamamoto et al. 2000), biji kacang kedelai (Satouchi 1998), biji anggur (Moreno et al. 2003), rimpang galangal (Alpinia officinarum) (Shin et al. 2003), rimpang Panax japonicus (Han et al. 2005a), dan rimpang jahe (Han et al. 2005b). Selain itu, daun oolong tea (Han et al. 1999), daun Thea sinensis (Han et al. 2001), buah Kochia scoparia (Han et al. 2006), buah Juglans mandshurica (Han et al. 2007), akar Platycodin grandiflorum (Xu et al. 2005), serta akar tanaman Actinidia arguta (Jang et al. 2008) juga diketahui mampu menginhibisi lipase pankreas secara in vitro. Penelitian dari tanaman obat Indonesia menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun jati belanda (Iswantini et al. 2003a), ekstrak tunggal dan gabungan dari bangle (Iswantini et al. 2003b), serta ekstrak metanol bangle (Wirakusumah 2005) secara in vitro mampu menginhibisi lipase yang diisolasi dari Rhizopus arrhizus. Ekstrak etanol daun jati
belanda secara in vivo juga mampu menghambat aktivitas lipase serum Rattus norvegicus (Rahardjo et al. 2005). Inhibisi terhadap aktivitas lipase pankreas manusia ditunjukkan oleh ekstrak saponin, etanol, dan air dari daun jati belanda dan rimpang bangle (Silitonga 2008), serta ekstrak tunggal etanol dan air dari daun kemuning dan gabungannya dengan ekstrak daun jati belanda dan bangle secara in vitro (Martatilofa 2008). Tanaman lain yang berpotensi sebagai antiobesitas adalah Garcinia cambogia karena banyak mengandung asam hidroksisitrat (Heymsfield 1998). Bahkan telah terdapat paten mengenai pengaturan bobot badan menggunakan ekstrak Garcinia cambogia dan Gymnema sylvestre serta beberapa senyawa lainnya (Alviar et al. 2002). Jenis Garcinia lain yang ditemui di Indonesia dengan kandungan utama dan potensi yang sama adalah asam gelugur (Garcinia atroviridis). Lengkuas dan kencur sebagai tanaman obat tradisional yang mudah didapat dan murah juga berpotensi sebagai antiobesitas karena ekstrak etanolnya secara efektif dapat menurunkan kolesterol, trigliserida, serta fosfolipid total pada jaringan dan serum (Padikkala & Achuthan 1997). Senyawaan flavonoid dan terpenoid yang terkandung dalam rimpang lengkuas, serta adanya saponin, polifenol, dan flavonoid dalam rimpang kencur diharapkan mendukung potensi tersebut. Akan tetapi, mekanisme penurunan bobot badan oleh buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur melalui penghambatan terhadap aktivitas lipase pankreas belum diketahui. Penelusuran melalui situs paten Amerika (www.uspto.gov) menunjukkan beberapa hasil penelitian mengenai penanganan obesitas yang telah dipatenkan antara lain sinergitas antara ekstrak rimpang jahe dengan beberapa tanaman obat lainnya (Pushpangadan et al. 2006) serta gabungan ekstrak teh hijau, gingseng, dan bahan-bahan kimia seperti kafein dan garam-garam kalsium sebagai suplemen penurun bobot badan (Yatcilla et al. 2008). Selain itu terdapat senyawa asam 3-(4{[2-(4-etoksifenil)-etilkarbamoil]-metoksi}fenil)-2-metoksi-propionat dan beberapa asam lainnya digunakan untuk penanganan obesitas, diabetes melitus tipe 2, dan beberapa penyakit lainnya yang berkaitan dengan sindrom X dan kardiovaskuler (Crespo et al. 2008). Akan tetapi, paten yang memuat informasi mengenai ekstrak buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur sebagai antiobesitas melalui inhibisi aktivitas lipase pankreas
2
belum ditemukan. Penelitian ini bertujuan mengevaluasi daya inhibisi ekstrak air dan etanol dari buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur terhadap aktivitas lipase pankreas dalam potensinya sebagai antiobesitas.
TINJAUAN PUSTAKA Asam Gelugur (Garcinia atroviridis) Tanaman marga Garcinia tersebar di daerah tropis Asia. Jenisnya yang banyak dikenal, yaitu Garcinia cambogia umumnya dijumpai di India bagian selatan, sedangkan jenis lainnya, yaitu Garcinia atroviridis (asam gelugur) umumnya dijumpai di daerah Semenanjung Malaya (Rittirut & Siripatana 2007). Asam gelugur atau gelugor digunakan secara luas sebagai penyedap masakan oleh masyarakat Melayu. Tanaman ini masih satu famili dengan manggis dan asam kandis yang menyebar di Asia Tenggara. Tanaman ini termasuk ke dalam bangsa Guttiferales dan suku Guttiferae yang tingginya bisa mencapai 20 m (Jansen 1992). Buah asam gelugur muda berwarna hijau kekuningan, berbentuk bulat seperti buah jeruk yang sudah dikupas (Gambar 1). Buah ini biasanya dipotong dan dikeringkan, kemudian dimanfaatkan sebagai pemberi rasa asam dan penyedap masakan. Selain itu, buahnya yang tidak dikupas, apabila direbus dengan gula dapat dibuat selai (Heyne 1987a) Ekstrak daun asam gelugur yang diberikan secara oral dengan dosis 360 mg/Kg terhadap mencit memberi efek inhibitor terhadap perkembangan Plasmodium berghei penyebab malaria (Syamsudin et al. 2004).
Gambar 1 Buah asam gelugur (Garcinia atroviridis). Asam hidroksisitrat (asam 1,2-dihidroksipropana-1,2,3-trikarboksilat) dalam buah gelugur akan menghambat secara kompetitif kerja enzim ATP-sitrat liase yang berfungsi mengubah asam sitrat menjadi asetil koenzim A. Dalam siklus Krebs, asetil Ko-A akan diubah menjadi malonil Ko-A yang kemudian dikonversi menjadi asam lemak.
Penghambatan aktivitas ATP-sitrat liase oleh asam hidroksisitrat (HCA) akan menyebabkan penurunan produksi asam lemak sebagai prekursor pembentukan lemak dalam tubuh. Buah asam gelugur juga bersifat antioksidan dan mampu menurunkan bobot badan dan kolesterol (Chung 2006). Mackeen (1998) meneliti bioaktivitas ekstrak metanolDMSO dari tanaman ini yang memberikan hasil bahwa ekstrak tersebut bersifat antibakteri (akar), antifungi (buah dan daun), antioksidan (akar, buah, dan batang), dan antitumor (daun, buah, dan batang). Lengkuas (Alpinia galanga) Lengkuas (Alpinia galanga) lebih dikenal sebagai bumbu masak berbagai kuliner di Indonesia dan Malaysia. Nama lainnya adalah Languas galanga atau lebih dikenal dengan greater galangal. Lengkuas diklasifikasikan ke dalam kingdom Plantae, divisi Magnoliophyta, kelas Liliopsida, ordo Zingiberales, subfamili Alpinioideae, dan genus Alpinia (Heyne 1987b). Rimpang lengkuas besar dan tebal, berdaging, berbentuk silindris, diameter sekitar 2-4 cm, dan bercabang-cabang. Bagian luar berwarna coklat agak kemerahan atau kuning kehijauan pucat, mempunyai sisiksisik berwarna putih atau kemerahan, keras mengkilap, sedangkan bagian dalamnya berwarna putih (Gambar 2). Daging rimpang yang sudah tua berserat kasar. Rimpang dan batangnya yang muda banyak dimanfaatkan sebagai bahan sayur atau sambal. Bunganya berbentuk lonceng, berwarna putih, dan juga dapat dibuat sayur.
Gambar 2 Rimpang lengkuas (Alpinia galanga). Ada 2 jenis lengkuas yang dikenal yaitu varitas dengan rimpang berwarna putih dan rimpang merah. Lengkuas putih banyak digunakan sebagai penyedap, sedangkan lengkuas merah lebih banyak digunakan sebagai obat. Pada penelitian ini digunakan lengkuas merah. Lengkuas tumbuh di tempat terbuka yang mendapat sinar matahari penuh atau yang sedikit terlindung. Lengkuas diduga berasal
3
dari Cina dan sekarang tersebar luas di berbagai daerah di Asia antara lain Indonesia, Malaysia, Filipina, Cina bagian selatan, Hongkong, India, Bangladesh, dan Suriname. Lengkuas mengandung minyak atsiri dengan komponen utama terpinen-4-ol dan 1asetoksikalsiferol asetat yang mempunyai kemampuan sebagai antibakteri, serta flavonoid dengan komponen utama kaemferol, galangin, dan kuersetin (BPOM 2004). Komponen flavonol dan dihidroflavonol dikenal sebagai senyawa yang bersifat fungistatik dan fungisida yang terdapat pada tumbuhan Alpinia dan Kaempferia adalah alpinetin (Rahayu 2000). Pemanfaatan lengkuas antara lain untuk obat penyakit kulit, obat tetes telinga, pelancar kemih, penguat empedu, rematik, dan memperbaiki pencernaan. Beberapa penelitian sebelumnya menunjukkan kemampuan lengkuas sebagai antimikroba dengan senyawa aktifnya 1-asetoksikalsiverol asetat (Rahayu 2000). Ekstrak etanol lengkuas dan kencur secara efektif telah dipelajari dapat menurunkan kolesterol, trigliserida, fosfolipid total pada jaringan dan serum, serta mampu meningkatkan high density lipoproteins (HDL) serum secara signifikan secara in vivo pada tikus putih dengan kolesterol tinggi (Padikkala & Achuthan 1997).
daging rimpang tidak keras, rapuh, mudah patah, dan bergetah (Gambar 3). Rimpang kencur berbau harum dengan rasa pedas yang khas. Kencur banyak tumbuh liar di tepi kebun, namun saat ini sudah banyak dibudidayakan di Indonesia, terutama di pulau Jawa, selain itu juga di India, Malaysia, Taiwan, dan Cina. Kencur tumbuh subur di daerah tropis dengan curah hujan tinggi, dataran rendah, dan pegunungan. Tanaman ini tumbuh subur pada tanah yang berwarna hitam, berpasir, dan di tempat yang sedikit terlindung. Rimpang kencur mengandung saponin, flavonoid, minyak atsiri, asam metil kanilat, serta senyawaan polifenol dan pentadekan. Ekstrak etanol kencur mengandung minyak atsiri tidak kurang dari 37,9% dengan komponen utama etil-p-metoksisinamat tidak kurang dari 4,3% dan etilsinamat (BPOM 2004).
Kencur (Kaempferia galanga)
Rimpang kencur dapat digunakan sebagai obat gosok untuk bengkak karena terkilir (keseleo) atau terpukul benda tumpul, serta untuk encok dan rematik. Selain itu, rimpang kencur juga digunakan untuk mengobati masuk angin, radang lambung, kejang perut, mual, diare, penawar racun, serta sebagai obat batuk. Kencur juga dipakai untuk mengobati infeksi telinga, sakit kulit, bisul, dan dapat pula digunakan sebagai bioinsektisida. Kencur juga telah digunakan pada sistem pengobatan Ayurveda untuk menangani berbagai penyakit yang disebabkan peradangan, diabetes militus, dan obesitas (Padikkala & Achuthan 1997).
Kencur (Kaempferia galanga) dikenal sebagai salah satu rempah-rempah dan bumbu berbagai masakan di Indonesia. Kencur diklasifikasikan dalam kerajaan Plantae, divisi Magnoliophyta, kelas Liliopsida, ordo Zingiberales, famili Zingiberaceae, subfamili Zingiberoideae, dan genus Kaempferia (Heyne1987). Kencur merupakan tanaman tahunan, berbatang basal dengan tinggi lebih kurang 20 cm. Daunnya tunggal, berwarna hijau dengan pinggir merah kecoklatan bergelombang. Bentuk daunnya lebar sampai bundar, ujung runcing, dan tepinya rata. Permukaan daun bagian atas tidak berbulu, sedangkan bagian bawah berbulu halus. Tangkai daun pendek, berukuran 3-10 cm, pelepah terbenam dalam tanah dengan panjang 1,5-3,5 cm, dan berwarna putih. Bunga kencur berbentuk terompet dan tunggal dengan panjang antara 2,5-5 cm. Panjang benang sarinya sekitar 4 mm dan berwarna kuning. Putik berwarna putih atau putih keunguan. Akarnya serabut dan berwarna coklat kekuningan. Rimpangnya pendek, berwarna coklat, berbentuk jari, dan tumpul. Bagian luar rimpang seperti bersisik,
Gambar 3 Rimpang kencur (Kaempferia galanga).
Lipase Pankreas Lipase pankreas merupakan enzim yang larut dalam air. Enzim ini disintesis oleh selsel parenkim pankreas dan ditransfer ke permukaan luminar usus halus untuk menghidrolisis substratnya. Substrat enzim lipase pankreas berupa lemak atau minyak dari makanan dalam bentuk triasilgliserol (trigliserida) yang akan dihidrolisis menjadi monogliserida dan asam lemak bebas rantai panjang. Lipase pankreas menghidrolisis 5070% dari total lemak dari asupan makanan
4
(Birari &Bhutani 2007). Enzim ini memecah lipid dengan memutuskan ikatan ester yang merupakan ikatan tulang punggung gliserol pada substrat. Monogliserida yang dihasilkan akan digunakan untuk kerja oleh otot dan sebagian disimpan dalam jaringan adiposa (Santoso 2001). Lipase pankreas bekerja pada daerah permukaan minyak air dan titik-titik lipid yang teremulsi secara halus dibentuk oleh gerakan mekanis dalam usus dengan adanya garam empedu. Semakin aktif kerja enzim tersebut maka lemak dan minyak yang dihidrolisis akan semakin banyak sehingga semakin banyak pula monogliserida yang dihasilkan. Sebagai akibatnya, monogliserida yang diserap oleh usus halus dan kemudian disimpan sebagai cadangan lemak dalam jaringan adiposa pun akan meningkat. Hal ini dapat memicu penumpukan lemak dalam jaringan tersebut dan menyebabkan kegemukan atau obesitas. Salah satu inhibitor lipase yang telah digunakan sebagai pelangsing di pasaran adalah orlistat (Xenical®). Orlistat merupakan suatu turunan lipstatin yang dihasilkan oleh bakteri Streptomyces toxitricini bekerja dengan membatasi absorpsi lemak dari makanan di dalam lambung dan usus halus dengan menghambat aktivitas lipase gaster dan pankreas (Hadvary et al. 1988). Pemakaian orlistat memiliki efek samping seperti insomnia dan terjadinya malabsorbsi terhadap vitamin A, D, E, dan K yang larut lemak.
Struktur orlistat (tetrahidrolipstatin). Penelitian Pendukung Berbagai penelitian telah dilakukan untuk menentukan senyawa dari berbagai ekstrak tumbuhan yang berperan sebagai penurun bobot badan (antiobesitas) baik secara in vitro dengan menghambat aktivitas lipase maupun secara in vivo pada hewan coba. Ekstrak tanaman yang telah dipelajari mampu menghambat aktivitas lipase pankreas adalah fraksi saponin dari ekstrak air daun oolong tea (Han et al. 1999) dan senyawa aktif saponin yang terdapat pada tanaman Thea sinensis (Han et al. 2001). Senyawa saponin lainnya yang memiliki kemampuan sama adalah yang diisolasi dari platycodi radix yang merupakan akar dari tamanan Platycodon grandiflorum (Xu et al. 2005) dan chikusetsusaponin dari
rimpang Panax japonicus (Han et al. 2005a). CT-II, suatu fraksi dari ekstrak etanol tanaman Cassia mimosoides diketahui dapat menghambat aktivitas lipase secara in vitro dan in vivo (Yamamoto et al. 2000). Inhibisi lipase pankreas juga mampu dilakukan ekstrak etanol biji anggur pada konsentrasi 1 mg/mL yang mampu mencapai 80% (Moreno et al. 2003), serta senyawa 3-metiletergalangin yang diisolasi dari tanaman galangal (Alpinia officinarum) yang juga secara in vivo mampu menurunkan kadar kolesterol tikus jantan (Shin et al. 2003). Penelitian lainnya oleh Han et al. (2005b) menunjukkan bahwa ekstrak air rimpang jahe dapat menurunkan bobot jaringan adiposa mencit secara signifikan dan mampu menginhibisi hidrolisis triolein yang diemulsi dengan fosfatidilkolin oleh lipase pankreas. Aktivitas antiobesitas juga dimiliki oleh buah Juglans mandshurica (Han et al. 2007) dan beberapa triterpena dari ekstrak etanol akar tanaman Actinidia arguta , yaitu asam 3-O-trans-p-kaoumaroil aktinidat, asam ursolat, asam 23-hidroksiursolat, asam kurosolat, asam asiatat, dan asam betulinat (Jang et al. 2008). Penelitian serupa dari ekstrak tanamantanaman obat Indonesia juga banyak dilakukan. Uji in vitro terhadap aktivitas lipase yang berasal dari mikroba Rhizopus arrhizus menunjukkan bahwa ekstrak metanol daun jati belanda yang mengandung alkaloid, triterpenoid, dan steroid berpotensi sebagai inhibitor lipase baik pada konsentrasi tinggi maupun rendah (Iswantini et al. 2003a). Ekstrak etanol daun jati belanda dapat menghambat aktivitas lipase serum Rattus norvegicus secara in vivo (Rahardjo et al. 2005). Penelitian oleh Silitonga (2008) menggunakan lipase pankreas manusia menunjukkan bahwa ekstrak air, etanol, dan saponin daun jati belanda dan bangle mampu menginhibisi aktivitas lipase pankreas dengan daya inhibisi tertinggi dicapai oleh ekstrak etanol bangle. Penelitian mengenai ekstrak tanaman bangle lainnya menunjukkan bahwa ekstrak air, metanol, flavonoid, dan steroid dapat menghambat aktivitas lipase, sedangkan ekstrak tanin meningkatkan aktivitas lipase (Iswantini et al. 2003b). Ekstrak metanol dan air memiliki daya inhibisi tertinggi terhadap aktivitas lipase pada konsentrasi 100 ppm, sedangkan untuk ekstrak flavonoid dan steroidnya pada konsentrasi 200 ppm. Gabungan ekstrak flavonoid, tanin, dan steroidnya juga mampu menginhibisi lipase dengan perbandingan tertentu dengan inhibisi
5
tertinggi dicapai oleh gabungan ekstrak flavonoid dan tanin pada perbandingan 2:1 (Febriany 2004). Ekstrak kasar metanol bangle dapat menghambat aktivitas lipase Rhizoppus arrhizus pada konsentrasi 100 dan 300 ppm, sedangkan ekstrak air seduhannya pada konsentrasi 100, 300, dan 400 ppm (Wirakusumah 2005). Penelitian lainnya menyebutkan bahwa pemberian jus buah mengkudu masak dengan konsentrasi 5%, 10%, dan 20% (b/v) telah memberikan efek penurunan bobot badan tikus putih jantan masing-masing sebesar 5,02%; 7,67%; dan 11,10% (Burhanuddin et al. 2004). Martatilofa (2008) menyatakan bahwa ekstrak air kemuning mampu menghambat kerja lipase pankreas manusia dengan daya inhibisi tertinggi sebesar 25,66% pada konsentrasi 100 ppm dan ekstrak etanolnya pada konsentrasi 30 ppm dengan daya inhibisi sebesar 22,80 %, serta gabungannya dengan ekstrak etanol daun jati belanda dan bangle mencapai 21,58% dengan perbandingan 1:1:1. Penelusuran melalui situs paten Amerika (www.uspto.gov) menunjukkan banyak hasil penelitian yang berhubungan dalam pemeliharaan obesitas yang telah dipatenkan di antaranya adalah ekstrak Garcinia cambogia dan Gymnema sylvestre (Alviar et al. 2002). Paten lainnya menyebutkan bahwa Garcinia cambogia digunakan sebagai suplemen herbal penurun bobot badan (Kurk & Vital 2002). Selain itu, telah dipatenkan pula sinergitas ekstrak jahe dengan beberapa tanaman obat lainnya seperti Gentiana kurroo, Murraya koenigii, Allium sativum, Amorphophallus campanulatus, dan beberapa bahan tambahan lainnya untuk perawatan obesitas dan aterosklerosis (Pushpangadan et al. 2006). Uji Toksisitas terhadap Larva Udang Uji toksisitas merupakan suatu metode untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Salah satu metode uji bioaktivitas senyawa bahan alam adalah uji letalitas larva udang atau brine shrimp lethality test (BSLT). Keunggulan penggunaan larva udang adalah sifatnya yang peka terhadap bahan uji, waktu siklus yang cepat, mudah dibiakkan, dan murah. Konsentrasi letal 50% (LC50) ekstrak dapat diperoleh melalui BSLT. LC50 adalah dosis senyawa bioaktif yang dapat menyebabkan 50% kematian hewan uji. Umumnya, suatu senyawa kimia dikatakan berpotensi bioaktif apabila mempunyai nilai LC50 kurang dari 1000 ppm. Uji toksisitas ini merupakan uji toksisitas awal suatu ekstrak
sebelum dilakukan uji toksisitas akut atau uji aktivitas lainnya. Hasil uji ini dapat digunakan untuk menentukan batas atau kisaran konsentrasi ekstrak yang digunakan pada uji aktivitas.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Buah asam gelugur kering diperoleh dari Medan, sedangkan rimpang lengkuas dan kencur kering diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (Balitro). Lipase pankreas yang digunakan adalah lipase pankreas manusia dengan kode Sigma L978050 units. Bahan-bahan yang digunakan adalah Xenical®, asam oleat, minyak wijen, telur udang A. salina, kuersetin, pereaksi tembaga (Lampiran 6), pereaksi Meyer, Wagner, Dragendorf, dan Lieberman Buchard. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer UVVis U-2800 Hitachi. Metode Penelitian Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap, yaitu persiapan contoh, penelitian pendahuluan (penetapan kadar air dan uji fitokimia), dan penelitian utama (ekstraksi, penentuan LC50, uji in vitro inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas, dan penentuan kadar flavonoid total ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi) (Lampiran 1). Persiapan Contoh Persiapan contoh yang dilakukan meliputi pengumpulan bahan baku, pencucian, perajangan, dan pengeringan. Contoh yang sudah kering selanjutnya digiling hingga diperoleh bentuk serbuk untuk mempermudah proses ekstraksi. Penetapan Kadar Air (AOAC 2000) Cawan porselin dikeringkankan di dalam oven bersuhu 105 ○C selama 30 menit, kemudian didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang bobot kosongnya. Sebanyak ± 3 g contoh dimasukkan ke dalam cawan, kemudian dikeringkan kembali dalam oven selama 3 jam pada suhu yang sama. Setelah itu cawan didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang. Contoh dalam cawan dikeringkan kembali di dalam oven selama 3 jam pada suhu yang sama dan setelah dingin ditimbang kembali. Prosedur yang sama dilakukan hingga diperoleh bobot contoh yang konstan.
6
Kadar air ditentukan dengan persamaan berikut. Kadar air =
a−b × 100% a
Keterangan: a = bobot contoh awal (g) b = bobot contoh akhir (g) Uji Fitokimia (Harborne 1987) Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, kuinon, dan triterpenoid/ steroid. Uji alkaloid. Sejumlah ekstrak ditambahkan 10 mL kloroform dan beberapa tetes NH3. Filtrat dipisahkan dan diasamkan dengan H2SO4 2 M. Lapisan asam yang tidak berwarna diuji dengan pereaksi Meyer, Dragendorf, dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih (dengan pereaksi Meyer), endapan merah (dengan pereaksi Dragendorf), dan endapan coklat (dengan pereaksi Wagner). Uji flavonoid. Sejumlah ekstrak ditambah air secukupnya dan dipanaskan selama 5 menit, kemudian ditambahkan serbuk Mg, 0,2 mL HCl pekat, dan beberapa tetes amil alkohol. Larutan dikocok dan dibiarkan memisah. Keberadaan flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna kuning hingga merah kecoklatan pada lapisan amil alkohol. Uji saponin. Sejumlah ekstrak ditambah air secukupnya dan dipanaskan selama 5 menit, setelah itu didinginkan dan dikocok kuat. Adanya saponin ditandai dengan timbulnya busa yang stabil selama ± 10 menit. Uji tanin. Sejumlah ekstrak dalam tabung reaksi ditambah air secukupnya dan dipanaskan selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat ditambahkan FeCl3 1% (b/v). Adanya tanin ditandai dengan terbentuknya warna hijau kebiruan. Uji kuinon. Sejumlah ekstrak dalam tabung reaksi ditambah air, dididihkan selama 5 menit, lalu disaring. Filtrat ditambah NaOH 15% (b/v). Adanya kuinon ditandai dengan terbentuknya warna merah. Uji triterpenoid/steroid. Sejumlah ekstrak ditambah etanol panas 50 ○C, kemudian disaring ke dalam pinggan dan diuapkan hingga kering. Residu yang dihasilkan ditambah eter. Lapisan eter dipipet dan diuji dengan pereaksi Lieberman Buchard (asam asetat anhidrat : H2SO4 pekat = 3:1). Warna merah atau ungu menunjukkan adanya
triterpenoid dan warna hijau atau biru menunjukkan adanya steroid. Ekstraksi Air (Padikkala & Achuthan 1997) Metode ekstraksi ini berdasarkan pada penelitian Padikkala & Achuthan (1997) dengan beberapa modifikasi. Serbuk contoh ditimbang sebanyak ± 100 g kemudian dimaserasi dengan air dengan perbandingan 1:8 selama 24 jam. Ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator. Ekstrak yang diperoleh ditimbang dan dihitung rendemennya (Lampiran 2). Ekstraksi Etanol (Padikkala & Achuthan 1997) Metode ekstraksi ini berdasarkan pada penelitian Padikkala & Achuthan (1997) dengan beberapa modifikasi. Serbuk contoh ditimbang ± 100 g kemudian dimaserasi dengan etanol 70% selama 24 jam, lalu disaring. Setelah itu ekstrak dipekatkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kering (Lampiran 3). Ekstrak ditimbang dan dihitung rendemennya dengan persamaan sebagai berikut. Rendemen ekstrak =
a × 100% × fk b
Keterangan: a = bobot ekstrak (g) b = bobot contoh awal (g)
100 ⎛ ⎞ ⎟ 100 − kadar air ⎝ ⎠
fk = faktor koreksi = ⎜
Uji Toksisitas Ekstrak (Meyer et al. 1982) Uji toksisitas ekstrak dilakukan dengan menggunakan larva udang Artemia salina. Kista A. salina sebanyak ± 50 mg dimasukkan ke dalam wadah yang berisi air laut yang sudah disaring dan dilengkapi aerator. Kista dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Setelah menetas, larva A. salina sebanyak 10 ekor dimasukkan ke dalam vial 2 mL, kemudian ditambahkan larutan stok ekstrak dengan konsentrasi 4000 ppm dan ditepatkan volumenya dengan air laut sehingga konsentrasi akhir ekstrak menjadi 0, 10, 100, dan 1000 ppm. Setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung. Nilai konsentrasi letal 50% (LC50) ditentukan dengan metode analisis probit dengan selang kepercayaan 95%. Bagan alir uji toksisitas ekstrak diperlihatkan pada Lampiran 4.
7
Uji in Vitro Ekstrak sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas (Han et al. 2005) Metode uji inhibisi yang digunakan berdasarkan pada metode yang digunakan oleh Han et al. (2005) dengan beberapa modifikasi. Sebanyak 1 mL campuran dari ekstrak dengan berbagai konsentrasi, 10 µg albumin 10% (b/v), lipase pankreas murni dengan konsentrasi 1,4 × 10-4 µg/µL, dan bufer fosfat pH 8 dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan diinkubasi pada suhu 40○C selama 45 menit. Setelah itu ditambahkan kloroform sebanyak 3 mL. Larutan kemudian dipisahkan dengan sentrifus selama 5 menit. Lapisan klorofom kemudian diambil sebanyak 1,0 mL dan ditambahkan larutan kloroformheptana (1:1) sebanyak 4 mL, lalu dikocok hingga homogen. Setelah homogen, ke dalam larutan ditambahkan pereaksi tembaga sebanyak 2,5 mL, dikocok selama 3 menit, lalu dimasukkan ke dalam sentrifus selama 10 menit. Setelah itu, lapisan kloroform diambil sebanyak 3 mL, kemudian larutan natrium dietilditiokarbamat 0,25% (v/v) dalam butanol ditambahkan sebanyak 0,25 mL hingga terbentuk larutan berwarna kuning. Selanjutnya, absorbans larutan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 435 nm. Absorbans yang diperoleh dikonversi hingga diperoleh nilai aktivitas enzim dan daya inhibisi ekstrak. Hal yang sama dilakukan untuk kontrol positif (Xenical®), sedangkan untuk kontrol negatif dilakukan tanpa penambahan larutan ekstrak. Bagan alir uji inhibisi ekstrak diperlihatkan pada Lampiran 5. Penentuan Kadar Flavonoid Total (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005) Metode ini berdasarkan pada Codex (1986) diacu dalam Nobre et al. (2005). Ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi terhadap aktivitas lipase pankreas dari setiap contoh ditimbang dengan bobot yang setara dengan 200 mg serbuknya, kemudian ekstrak tersebut dimasukkan ke dalam sistem hidrolisis yang berupa 1,0 mL larutan heksametilenatetramina 0,5% (b/v), 20 mL aseton, dan 2 mL HCl 25% dalam labu bulat. Hidrolisis ekstrak dilakukan dengan pemanasan menggunakan refluks selama 30 menit. Filtrat hasil hidrolisis disaring menggunakan kapas ke dalam labu takar 100 mL, sedangkan residunya ditambah 20 mL aseton dan direfluks kembali selama 30 menit. Filtrat digabungkan, sedangkan residunya ditambah 20 mL aseton dan dihidrolisis
kembali. Filtrat digabungkan kembali, dan larutan ditera dengan aseton. Sebanyak 20 mL filtrat hasil hidrolisis dan 20 mL akuades dimasukkan ke dalam corong pisah, kemudian diekstraksi dengan etil asetat (ekstraksi yang pertama dengan 15 mL etil asetat, ekstraksi kedua dan ketiga dengan 10 mL etil asetat). Fraksi etil asetat dikumpulkan dalam labu takar 50 mL, kemudian larutan ditera dengan etil asetat. Selanjutnya, larutan tersebut diambil 10 mL ke dalam labu takar 25 mL, direaksikan dengan AlCl3 2% (b/v) 1 mL, dan ditera dengan larutan asam asetat glasial dalam metanol 5% (v/v). Pengukuran larutan dilakukan pada panjang gelombang 370,8 nm. Standar dibuat dengan kuersetin murni ditimbang 0,0026 g kemudian dilarutkan dengan asam asetat glasial dalam metanol 5% (v/v) dalam labu takar 50 mL, kemudian dibuat deret standarnya dengan konsentrasi 0; 0,5; 2,5; 5,0; 7,5; dan 10 ppm. Bagan alir penentuan kadar flavonoid total diperlihatkan pada Lampiran 7.
HASIL DAN PEMBAHASAN Kadar Air Contoh Penetapan kadar air dari buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur dilakukan untuk mengetahui kadar air masingmasing contoh sehingga dapat diperkirakan penanganan terbaik bagi contoh dalam hal penyimpanan. Contoh dikatakan dapat disimpan dalam jangka waktu yang lama apabila kadar airnya <10%. Kadar air buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur masing-masing sebesar 18,7% (b/b), 9,59% (b/b), dan 8,60% (b/b) (Lampiran 8). Hasil penentuan kadar air tersebut menunjukkan bahwa buah asam gelugur tidak baik untuk disimpan dalam jangka waktu yang lama karena memiliki kadar air >10% atau diperlukan penanganan khusus dalam penyimpanannya. Penanganan tersebut dapat dilakukan dengan pengeringan lebih lanjut hingga kadar airnya <10% dan tidak menyimpannya pada tempat yang lembab. Ekstraksi Metode ekstraksi ini berdasarkan pada penelitian Padikkala & Achuthan (1997) dengan beberapa modifikasi. Padikkala & Achuthan (1997) menggunakan nisbah antara contoh dan pelarut etanol 70% sebesar 1:10 sedangkan pada penelitian ini menggunakan nisbah 1:8 dengan pelarut etanol 70% dan air bebas ion. Ekstraksi contoh menggunakan air
8
dan etanol dilakukan karena air merupakan pelarut yang biasa digunakan masyarakat untuk mengambil ekstrak dari obat-obatan tradisional (jamu) sedangkan etanol merupakan pelarut yang umum digunakan pada industri farmasi. Menurut Harborne (1987) alkohol merupakan pelarut serba guna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan. Selain itu, menurut Darusman et al. (2001) etanol adalah pelarut yang umum digunakan dalam pembuatan jamu dan obat-obatan fitofarmaka. Maserasi dimaksudkan untuk dapat mengekstrak keseluruhan senyawa yang larut dalam pengekstrak yang digunakan. Rendemen yang dihasilkan dikoreksi dengan nilai kadar air contoh pada bentuk serbuk kering (simplisia). Nilai rendemen yang diperoleh dari hasil ekstraksi pada ketiga contoh tanaman terhadap bentuk simplisianya tersaji pada Lampiran 9 dan grafiknya diperlihatkan pada Gambar 4. 30.0 25.0
26.2 23.7 21.1
20.0 15.0 10.1
10.0
7.56 4.78
5.0 0.0 AG
EG
AL
EL
AK
EK
Ekstrak contoh
Gambar 4 Rendemen berbagai macam ekstrak contoh. : AG (ekstrak air buah asam gelugur); : EG (ekstrak etanol buah asam gelugur); : AL (ekstrak air lengkuas); : EL (ekstrak etanol lengkuas); : AK (ekstrak air kencur); : EK (ekstrak etanol kencur).
Ekstrak etanol buah asam gelugur menghasilkan rendemen yang paling tinggi dari semua ekstrak contoh, yaitu mencapai 26,2%. Rendemen ekstrak etanol ketiga contoh lebih besar dibandingkan rendemen ekstrak airnya. Hal ini menunjukkan bahwa etanol dapat mengekstrak lebih banyak komponen dalam contoh daripada air karena etanol mampu melarutkan senyawa polar dan nonpolar sehingga hampir semua komponen contoh ikut terekstrak. Uji Fitokimia Uji fitokimia bertujuan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dan golongan senyawa bioaktif yang terkandung di dalam setiap ekstrak contoh. Dari hasil uji fitokimia ini dapat diduga golongan senyawa
yang berperan dalam menghambat aktivitas lipase pankreas. Hasil uji fitokimia terhadap buah asam gelugur (Tabel 1) menunjukkan bahwa buah asam gelugur kering hanya mengandung alkaloid dan saponin. Saponin dalam buah gelugur diduga lebih banyak terdapat dalam bentuk glikosida sehingga hanya dapat terekstrak dengan air, sedangkan alkaloidnya bersifat lebih nonpolar sehingga lebih terekstrak oleh etanol. Tidak terdeteksinya senyawa metabolit sekunder lainnya dalam buah asam gelugur kering maupun ekstrak air dan etanolnya dapat disebabkan kadar senyawa-senyawa tersebut di dalam buah asam gelugur kering dan ekstraknya sangat sedikit atau berkurang akibat pengeringan. Oluyemi et al. (2007) menyebutkan bahwa dalam marga Garcinia lainnya, yaitu G. kola terkandung senyawa aktif biflavonoid yang berpotensi sebagai antioksidan. Asam gelugur baik dalam bentuk kering, ekstrak air, maupun ekstrak etanol tidak terdeteksi adanya flavonoid. Jenis tanaman yang berbeda dapat menyebabkan perbedaan kandungan senyawa metabolit sekundernya walaupun masih dalam satu marga. Perbedaan ini juga dapat dipengaruhi oleh kondisi lingkungan tempat tanaman tersebut tumbuh. Jumlah flavonoid yang sangat sedikit dalam ekstrak dapat menyebabkan flavonoid tidak terdeteksi pada uji kualitatifnya. Tabel 1 Hasil uji fitokimia buah asam gelugur Asam gelugur Ekstrak Golongan senyawa kering Air Etanol Alkaloid + ++ Saponin + + Tanin Flavonoid Triterpenoid Steroid Kuinon Tabel 2 Hasil uji fitokimia rimpang lengkuas Golongan Lengkuas Ekstrak senyawa kering Air Etanol Alkaloid + + + Saponin ++ +++ ++ Tanin Flavonoid +++ ++ +++ Triterpenoid + Steroid + Kuinon + + -
9
Uji fitokimia terhadap rimpang lengkuas (Tabel 2) dan kencur (Tabel 3) menunjukkan bahwa golongan senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam lengkuas dan kencur yang terekstrak dengan etanol lebih banyak daripada yang terekstrak dengan air secara kualitatif. Hal ini dikarenakan sifat alkohol yang mampu melarutkan senyawa polar dan nonpolar. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa lengkuas kering mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, triterpenoid, dan kuinon. Hasil uji fitokimia tersebut sejalan dengan yang dikemukakan BPOM (2004) bahwa lengkuas mengandung flavonoid dan terpenoid yang berupa minyak atsiri. Flavonoid lengkuas terdiri atas kaemferol, galangin, kuersetin dan mirisetin. Uji steroid menunjukkan hasil yang negatif pada serbuk lengkuas kering, akan tetapi positif pada ekstrak etanolnya. Hal ini dapat terjadi karena jumlah steroid yang merupakan salah satu jenis triterpenoid dalam lengkuas sangat sedikit dan jenis steroid tersebut bersifat cendenrung nonpolar sehingga tidak terekstrak oleh air melainkan oleh etanol. Menurut Rahayu (2000), selain flavonoid dan terpenoid, lengkuas juga mengandung saponin dan tanin, akan tetapi pada uji tanin diperoleh hasil yang negatif. Perbedaan metode ekstraksi, lamanya waktu ekstraksi, dan perbandingan antara contoh yang diekstraksi dengan pelarut juga dapat menyebabkan perbedaan besarnya kadar suatu senyawa dalam ekstrak. Oleh karena itu, tidak terdeteksinya tanin dalam ekstrak dapat disebabkan jumlah tanin di dalam ekstrak sangat sedikit. Tabel 3 Hasil uji fitokimia rimpang kencur Golongan Kencur Ekstrak senyawa kering Air Etanol Alkaloid + + Saponin ++++ ++++ Tanin Flavonoid ++ + Triterpenoid Steroid ++ ++ Kuinon + + + Berdasarkan hasil uji fitokimia, serbuk kencur kering mengandung alkaloid, saponin, flavonoid, steroid, dan kuinon. Saponin kencur terekstrak baik oleh air karena sifatnya yang polar. Busa yang dihasilkan dari hasil uji saponin pada ekstrak air kencur dan serbuk keringnya lebih banyak dan stabil dibandingkan dengan ekstrak contoh lainnya
sehingga diduga kencur mengandung saponin dengan kadar yang lebih tinggi dibandingkan kelima ekstrak lainnya secara kualitatif. Ekstrak etanol kencur mengandung alkaloid, flavonoid, dan kuinon yang rendah secara kualitatif. Menurut BPOM (2004) ekstrak etanol kencur banyak mengandung minyak atsiri dengan komponen etil-pmetoksisinamat dan etil sinamat. Minyak atsiri kencur memiliki bagian utama yang sama dengan triterpenoid, yaitu terpenoid. Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa triterpenoid tidak terdeteksi baik pada serbuk kencur kering maupun kedua ekstraknya. Senyawa aktif lainnya, yaitu steroid di dalam ekstrak etanol kencur secara kualitatif lebih banyak daripada ekstrak contoh lainnya. Hasil uji tanin pada kencur baik yang berupa serbuk kering maupun ekstraknya menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini menunjukkan bahwa rimpang kencur tidak mengandung tanin atau kadar tanin dalam ekstrak sangat rendah. Uji Toksisitas Uji toksisitas dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui bioaktivitas dan toksisitas dari setiap ekstrak sebelum dilakukan uji aktivitas. Uji ini dilakukan menggunakan larva udang karena lebih ekonomis dan cukup akurat sebagai uji toksisitas awal. Hasil uji toksisitas yang berupa nilai konsentrasi letal 50% (LC50) akan digunakan untuk menentukan batas konsentrasi ekstrak pada uji aktivitasnya sebagai inhibitor lipase pankreas. Hasil uji toksisitas dari keenam ekstrak diperlihatkan pada Lampiran 10, sedangkan nilai LC50 ekstrak contoh tersaji pada Tabel 4. Tabel 4 Nilai LC50 ekstrak air dan etanol contoh terhadap larva udang Contoh Ekstrak LC50 (ppm) Asam gelugur Air 117,63 Etanol 103,64 Lengkuas Air 547,23 Etanol 1445,5 Kencur Air 1142,7 Etanol 47,974 Berdasarkan hasil tersebut dapat diketahui bahwa ekstrak etanol kencur memiliki bioaktivitas yang paling tinggi karena memiliki nilai LC50 yang paling rendah, yaitu 47,974 ppm. Menurut Meyer at al. (1982), suatu ekstrak tanaman dapat dikatakan memiliki bioaktivitas yang tinggi apabila memiliki nilai LC50 <1000 ppm. Dengan demikian, ekstrak etanol lengkuas dan ekstrak
10
air kencur dapat dikatakan mempunyai potensi bioaktif yang rendah karena untuk mematikan 50% populasi larva udang diperlukan konsentrasi ekstrak yang mencapai <1000 ppm. Akan tetapi, ekstrak dengan bioaktivitas tertinggi belum tentu memiliki nilai daya inhibisi tertinggi dalam uji inhibisi. Hal ini disebabkan nilai LC50 yang diperoleh hanya digunakan sebagai batas maksimum konsentrasi ekstrak pada uji inhibisi dan belum diketahui secara pasti mengenai hubungan antara nilai LC50 terhadap aktivitas (daya inhibisi) suatu ekstrak. Buah asam gelugur (Garcinia atroviridis) yang memiliki kandungan utama asam hidroksisitrat (HCA) memiliki nilai LC50 untuk ekstrak air dan etanolnya, masingmasing 117,63 ppm dan 103,64 ppm. Marga Garcinia lainnya dengan kandungan utama yang sama, yaitu Garcinia cambogia diketahui mempunyai dosis letal 50% (LD50) pada tikus >2000 mg/Kg dengan perlakuan menggunakan suntik ke dalam pembuluh darah dan >4000 mg/Kg melalui oral (Anonim 2007). Nilai LC50 tersebut tidak dapat digunakan sebagai batas konsentrasi untuk konsumsi, akan tetapi diperlukan penelitian lebih lanjut secara in vivo untuk menentukan ekstrak agar diketahui nilai LD50 keamanannya secara pasti dalam tujuannya dikonsumsi lebih lanjut sebagai obat. Uji in Vitro Ekstrak sebagai Inhibitor Aktivitas Lipase Pankreas Metode uji inhibisi yang digunakan mengacu pada metode yang digunakan oleh Han et al. (2005) dengan beberapa modifikasi. Han et al. (2005) menggunakan substrat triolein, bufer N-tris-(hidroksimetil)-metil-2aminoetana-asam sulfat pada pH 7,0, suhu 37 °C dengan waktu inkubasi 30 menit, dan larutan pengkompleks warna batokuproin dalam kloroform 0,05% (b/v). Penelitian ini menggunakan standar asam oleat (4,25 µmol) dengan serapan sebesar 0,041 dan substrat yang berupa minyak wijen dengan konsentrasi 16,2 µg/µL. Minyak wijen digunakan karena memiliki kandungan utama berupa asam oleat dan linoleat. Lipase yang digunakan adalah lipase pankreas manusia dengan konsentrasi 1,4 × 10-5 µg/µL. Uji aktivitas ini dilakukan pada kondisi optimum kinerja lipase pankreas, yaitu pada pH 8, suhu 40 °C, dan waktu inkubasi selama 45 menit berdasarkan hasil optimalisasi aktivitas lipase pankreas oleh Silitonga (2008). Aktivitas lipase ditentukan dengan mengukur laju asam oleat yang dihasilkan dari hidrolisis minyak wijen yang
dinyatakan dalam μmol asam oleat/L menit dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 435 nm. Ekstrak yang ditentukan daya inhibisinya dilarutkan dalam bufer fosfat pH 8 dan setelah diinkubasi, reaksi hidrolisis lipase pankreas dihentikan dengan penambahan kloroform. Campuran pelarut organik kloroform dan heptana (1:1) berfungsi untuk mengekstrak asam oleat yang terbentuk sebagai hasil hidrolisis minyak wijen, sedangkan pereaksi tembaga berfungsi untuk mengikat asam oleat bebas. Larutan natrium dietilditiokarbamat akan membentuk kompleks warna kuning dengan lapisan kloroform-heptana yang mengandung asam oleat. Daya inhibisi ekstrak ditentukan dengan membandingkan selisih aktivitas lipase pada blanko (tanpa ekstrak) dengan ekstrak, terhadap aktivitas lipase blanko (Lampiran 11). Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini adalah Xenical® yang merupakan produk pelangsing komersial yang banyak digunakan masyarakat. Xenical® digunakan karena mempunyai kandungan utama orlistat (tetrahidrolipstatin) yang merupakan salah satu inhibitor lipase pankreas yang bersifat selektif irreversibel yang pertama kali ditemukan (Hadvary et al. 1988). Selain itu, berdasarkan pada penelitian Cariere (2001) telah diketahui bahwa orlistat menginhibisi lipase pankreas melalui mekanisme inhibisi nonkompetitif. Larutan blanko (tanpa penambahan ekstrak) digunakan sebagai kontrol negatif. Uji inhibisi ini menggunakan lima ragam konsentrasi yang sama untuk semua ekstrak yaitu dari 100-300 ppm dengan interval 50 ppm. Ragam konsentrasi ini dimaksudkan untuk melihat hubungan penambahan konsentrasi ekstrak terhadap daya inhibisi yang dicapai. Bagi beberapa ekstrak diketahui ragam konsentrasi tersebut melebihi nilai LC50nya. Hal ini dilakukan karena hubungan antara nilai LC50 dengan nilai daya inhibisi ekstrak belum diketahui secara pasti. Daya inhibisi ekstrak dengan pelarut yang sama pada kelima ragam konsentrasi (Gambar 5 dan 6) memperlihatkan bahwa ekstrak etanol dan air ketiga tanaman cenderung berpotensi sebagai inhibitor aktivitas lipase pankreas karena telah dapat menginhibisi aktivitas lipase pankreas mulai dari konsentrasi 100-300 ppm. Kemampuan ini menyerupai kemampuan CT-II, suatu fraksi dari ekstrak air tanaman Cassia mimosoides yang mampu menginhibisi 50% aktivitas lipase pankreas porsin (0,071 mg/mL) pada
11
27 .8
10 .6
14 .9
25 .5
22 .0
29 .7
17 .6
20.0
10 .6
19 .9
30.0
28 .2 32 .2
Daya inhibisi (%)
30 .3
40.0
35 .9
41 .3 41 .9
50.0
300
250
200
100
300
250
200
150
100
300
250
200
150
100
-10.0
Kontrol (+)
0.0
150
-4 .6
10.0
Konsentrasi (ppm)
Gambar 5 Grafik daya inhibisi kontrol positif, ekstrak air buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur terhadap aktivitas lipase pankreas. : kontrol positif; : ekstrak air asam gelugur; : ekstrak air lengkuas; : ekstrak air kencur. 86 .3
100.0
56 .2
15 .1
300
250
200
100
300
250
200
150
-5 .4
-1 1. 2
23 .4
23 .4
150
100
300
250
200
150
100
Kontrol (+)
0.0 -20.0
26 .1
37 .6
48 .5
-3 .3
20.0
24 .3
40.0
30 .9
41 .5
46 .7
60.0
10 .6
Daya inhibisi (%)
80.0
Konsentrasi (ppm)
Gambar 6 Grafik daya inhibisi kontrol positif, ekstrak etanol buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur terhadap aktivitas lipase pankreas. : kontrol positif; : ekstrak air asam gelugur; : ekstrak air lengkuas; : ekstrak air kencur. konsentrasi 100 ppm (Yamamoto et al. 2000). Berdasarkan gambar tersebut diketahui bahwa hubungan antara konsentrasi keenam ekstrak dengan daya inhibisinya terhadap aktivitas lipase pankreas tidak linier. Kenaikan konsentrasi ekstrak tidak selalu diiringi dengan kenaikan daya inhibisinya. Hal ini disebabkan ekstrak yang digunakan masih berupa ekstrak kasar yang terdiri atas beberapa golongan senyawa yang diduga memiliki respon berbeda yang saling mempengaruhi satu sama lain, baik berupa pengaruh sinergis maupun antagonis dalam menghambat aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi tertentu.
Ekstrak air dari ketiga contoh cenderung menginhibisi aktivitas lipase pankreas pada kelima ragam konsentrasi, kecuali ekstrak air kencur pada konsentrasi 150 ppm memperlihatkan potensinya sebagai aktivator lipase pankreas karena memiliki daya inhibisi sebesar -4,6%. Potensi yang sama juga dimiliki oleh ekstrak etanol lengkuas pada konsentrasi 250 dan 300 ppm, serta ekstrak etanol kencur pada konsentrasi 150 ppm karena masing-masing mempunyai daya inhibisi sebesar -3,3%, -11,2%, dan -5,4%. Nilai konsentrasi ekstrak pada daya inhibisi maksimum (Tabel 5) menunjukkan bahwa ekstrak etanol buah asam gelugur memiliki daya inhibisi yang paling tinggi dari
12
Tabel 5 Konsentrasi kontrol ekstrak pada daya inhibisi maksimum.
Kontrol (-)
Konsentrasi optimum (ppm) 0
Daya inhibisi (%) 0,0
Air gelugur
150
41,9
Etanol gelugur
150
86,3
Air lengkuas
150
32,2
Etanol lengkuas
200
56,2
Air kencur
250
35,9
Etanol kencur
300
37,6
Kontrol (+)
100
10,6
Ekstrak
Nilai-nilai daya inhibisi tersebut lebih tinggi daripada yang dicapai oleh kontrol positif (Xenical®) yang hanya mampu menginhibisi lipase pankreas sebesar 10,6% pada konsentrasi 100 ppm. Nilai daya inhibisi Xenical® tersebut berbeda dengan yang dikemukakan oleh Silitonga (2008), yaitu sebesar 17,53% pada konsentrasi yang sama. Hal ini dapat disebabkan konsentrasi substrat yang digunakan pada penelitian Silitonga (2008) berbeda, yaitu 16,6750 µg/µL. Kelarutan orlistat yang lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak-ekstrak contoh dalam bufer fosfat dapat menyebabkan nilai daya inhibisi kontrol positif cenderung lebih rendah daripada ekstrak. Kontrol positif juga diuji pada ragam konsentrasi yang sama dengan ekstrak contoh, yaitu 100-300 ppm dengan selang 50 ppm. Hasil uji inhibisi tersebut diperlihatkan pada Gambar 7. Berdasarkan Gambar 7 dapat diketahui bahwa kontrol positif (Xenical®) mampu menginhibisi lipase pankreas pada konsentrasi 100 ppm, namun mulai dari konsentrasi 150-300 ppm memperlihatkan potensi sebagai aktivator lipase pankreas. Hasil ini berbeda dengan hasil penelitian Hadvary et al. (1988) yang menggunakan orlistat murni, substrat triolein murni, bufer Tris/HCl, NaCl, CaCl2, dan dimetil sulfoksida yang diinkubasi pada suhu ruang selama 10
menit. Dari penelitian tersebut diperoleh bahwa kemampuan orlistat dalam menginhibisi aktivitas lipase pankreas cenderung meningkat dengan meningkatnya konsentrasi dengan daya inhibisi mencapai 50% pada konsentrasi 0,1 µg/mL secara in vitro dan 0,27 µg/mL secara in vivo pada cairan usus tikus. 15.0
10.6
10.0 5.0
D aya in h ib isi (% )
semua ekstrak contoh, yaitu sebesar 86,3% pada konsentrasi 150 ppm. Ekstrak air buah asam gelugur dan lengkuas masing-masing memiliki daya inhibisi tertinggi sebesar 41,9% dan 32,2% pada konsentrasi 150 ppm, sedangkan ekstrak air kencur mencapai daya inhibisi tertinggi pada konsentrasi 250 ppm sebesar 35,9%. Ekstrak etanol lengkuas memiliki daya inhibisi tertinggi sebesar 56,2% pada konsentrasi 200 ppm, sedangkan ekstrak etanol kencur memiliki daya inhibisi tertinggi sebesar 37,6% pada konsentrasi 300 ppm.
0.0 -5.0
100
150
200
250
-10.0
300 -9.3
-15.0 -20.0
-18.3
-25.0 -30.0
-23.4 -26.3
Konsentrasi (ppm)
Gambar 7 Grafik daya inhibisi kontrol positif (Xenical®) terhadap aktivitas lipase pankreas. Hasil penelitian ini tidak dapat dibandingkan dengan hasil penelitian oleh Hadvary et al. (1988) tersebut karena orlistat yang terkandung di dalam kontrol positif (Xenical®) tidak murni sehingga konsentrasi orlistat yang digunakan berbeda. Selain itu, suhu, waktu inkubasi, pH, metode uji inhibisi, pereaksi, peralatan, serta jenis dan konsentrasi substrat yang digunakan pun berbeda. Kondisi inkubasi pada penelitian ini diduga bukan merupakan kondisi optimum inhibisi orlistat terhadap lipase pankreas. Meskipun demikian, metode yang digunakan pada penelitian ini dapat dikatakan lebih efektif karena dengan menggunakan substrat dan pereaksi-pereaksi lainnya yang lebih murah telah dapat memperlihatkan kemampuan inhibisi ekstrak ketiga contoh terhadap aktivitas lipase pankreas. Berdasarkan data pada Tabel 5 juga diketahui bahwa ekstrak etanol dari ketiga contoh memiliki daya inhibisi yang lebih tinggi daripada ekstrak airnya. Hal ini dapat disebabkan jumlah senyawa metabolit sekunder yang diduga berperan dalam proses inhibisi aktivitas lipase pankreas lebih banyak terekstrak oleh etanol. Golongan senyawa yang berperan dalam menginhibisi aktivitas lipase pankreas dapat diduga dari hasil uji fitokimia ekstrak. Ekstrak air buah gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur secara kualitatif diketahui mengandung saponin dengan jumlah
13
yang lebih banyak daripada golongan senyawa metabolit sekunder lainnya dalam ekstrak tersebut sehingga saponin diduga sebagai senyawa yang paling berperan dalam proses inhibisi tersebut. Telah dijelaskan sebelumnya bahwa daya inhibisi tertinggi ekstrak air ketiga tanaman dicapai oleh ekstrak air buah asam gelugur dengan daya inhibisi sebesar 41,9% pada konsentrasi 150 ppm. Kemampuan ini lebih baik dibandingkan dengan ekstrak saponin dari beberapa tanaman yang telah diketahui, misalnya fraksi saponin dari ekstrak air daun oolong tea (Han et al. 1999) yang mulai aktif menginhibisi lipase pankreas pada konsentrasi 500-2000 µg/mL dan saponin dari daun Accantopanax sessiliflorus, yaitu sessilosida dan chiisanosida yang masing-masing memiliki nilai IC50 sebesar 0,36 dan 0,75 mg/mL (Yoshizumi et al. 2006). Akan tetapi kemampuan ekstrak air buah asam gelugur tersebut hampir sama dengan yang dimiliki oleh chikusetsusapinin III, 28-deglukosilcikusetsusaponin IV, dan 28-deglukosilcikusetsusaponin V yang diisolasi dari fraksi total saponin rimpang Panax japonicus yang aktif menginhibisi lipase pada konsentrasi 125-500 µg/mL (Han et al. 2005b). Ekstrak saponin dari bangle dan daun jati belanda juga memiliki kemampuan yang lebih rendah daripada ekstrak air ketiga contoh karena daya inhibisi tertingginya masing-masing sebesar 10,22% pada konsentrasi 30 ppm dan 12,61% pada konsentrasi 60 ppm (Silitonga 2008) dengan metode ekstraksi dan uji inhibisi yang sama. Secara kualitatif saponin dalam ekstrak air kencur lebih banyak daripada ekstrak air buah asam gelugur, akan tetapi daya inhibisi yang dicapai oleh ekstrak air kencur cenderung lebih rendah daripada ekstrak air buah asam gelugur. Perbedaan jenis dan kadar saponin yang terkandung dalam setiap ekstrak tanaman mempengaruhi besarnya daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas. Kadar saponin dalam ekstrak air buah asam gelugur dan rimpang kencur tidak ditentukan secara kuantitatif sehingga tidak dapat dibandingkan. Selain itu, adanya senyawa lain yang terkandung dalam ekstrak dapat mempengaruhi kemampuan saponin dalam menghambat aktivitas lipase pankreas. Kemampuan saponin buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur dalam menghambat aktivitas lipase pankreas perlu dipastikan melalui penelitian lebih lanjut. Ekstrak etanol ketiga contoh juga memperlihatkan kemampuannya sebagai
inhibitor lipase dan daya inhibisi tertinggi dicapai oleh ekstrak buah asam gelugur yang mampu menghambat hingga 86,3% aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi 150 ppm (Gambar 6). Kemampuan tersebut hampir sama dengan yang dimiliki oleh ekstrak etanol biji anggur yang mampu menginhibisi lipase pankreas secara in vitro sebesar 80% pada konsentrasi 1 mg/mL dengan waktu inkubasi 5 menit dan suhu 37 °C (Moreno et al. 2003), akan tetapi golongan senyawa yang berperan dalam proses inhibisi tersebut belum diketahui. Daya inhibisi tertinggi ekstrak etanol ketiga tanaman melebihi daya inhibisi tertinggi ekstrak etanol beberapa tanaman lainnya terhadap aktivitas lipase, seperti ekstrak etanol daun jati belanda, yaitu 25,31% pada konsentrasi 60 ppm dan bangle sebesar 29,17% pada konsentrasi 100 ppm (Silitonga 2008), serta daun kemuning sebesar 22,80% pada konsentrasi 30 ppm (Martatilofa 2008). Berdasarkan hasil uji fitokomia, ekstrak etanol buah asam gelugur hanya mengadung alkaloid sehingga diduga alkaloid asam gelugur yang berperan sebagai inhibitor lipase pankreas, akan tetapi belum ada literatur yang mengatakan bahwa senyawa alkaloid mampu menginhibisi lipase pankreas. Dengan demikian, tidak menutup kemungkinan bahwa senyawa selain hasil metabolit sekunder yang juga berperan dalam proses inhibisi tersebut. Kandungan asam hidroksisitrat (HCA) dalam asam gelugur yang mencapai 45,17% (Muzakki 2006) dan sifat HCA yang mudah larut dalam air dan alkohol mendukung dugaan tersebut. Adanya gugus trikarboksilat pada asam ini diduga mampu menghambat hidrolisis asam lemak yang juga memiliki gugus karboksilat oleh lipase pankreas secara kompetitif. Akan tetapi, mekanisme tersebut belum dapat dipastikan hanya berdasarkan hasil uji inhibisi tersebut. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan untuk mengetahui ciri senyawa aktif dan mekanisme inhibisi ekstrak etanol buah asam gelugur dalam menghambat aktivitas lipase pankreas.
Sruktur asam hidroksisitrat. Berdasarkan hasil uji toksisitas diketahui bahwa ekstrak etanol buah asam gelugur memiliki bioaktivitas yang lebih rendah dibandingkan dengan ekstrak air kencur (Tabel 4), akan tetapi daya inhibisi yang
14
dicapai oleh ekstrak etanol asam gelugur lebih tinggi daripada yang dapat dicapai oleh ekstrak etanol kencur, yaitu sebesar 37,6%. Hal ini membuktikan bahwa ekstrak yang memiliki bioaktivitas tertinggi belum tentu memiliki daya inhibisi yang tertinggi pula. Ekstrak etanol lengkuas dan kencur secara kualitatif mengandung flavonoid dan steroid sehingga kedua senyawa tersebut diduga berperan dalam menginhibisi aktivitas lipase pankreas pada konsentrasi tertentu dari ekstrak. Potensi flavonoid dan steroid dalam menginhibisi lipase dari Rhizopus arrhizus sebelumya telah diteliti oleh Febriany (2004) dari ekstrak rimpang bangle pada konsentrasi 200 ppm akan tetapi mekanisme inhibisi kedua golongan senyawa tersebut belum diketahui. Inhibitor lipase pankreas lain dari golongan flavonoid adalah 3-metiletergalangin yang diisolasi dari ekstrak etanol rimpang Alpinia officinarum yang memiliki nilai IC50 sebesar 1,3 mg/mL dengan substrat berupa triolein (Shin et al. 2003), akan tetapi mekanisme hambatannya belum diketahui. Alpinia officinarum masih satu ordo dengan kencur dan satu marga dengan lengkuas. Tanaman dengan marga dapat mengandung senyawa yang sama dan mekanisme inhibisi suatu senyawa dapat diduga dari struktur senyawa tersebut.
Struktur 3-metiletergalangin. Senyawa 3-metiletergalangin memiliki dua buah gugus hidroksil dan gugus metil eter pada karbon ke-3nya. Struktur ini berbeda dengan struktur trigliserida sebagai substrat lipase pankreas yang terdiri atas gugus karboksilat dan gliserol yang terikat dengan ikatan ester. Oleh karena itu, mekanisme inhibisi yang terjadi diduga bukan secara kompetitif. Hal tersebut dapat dipastikan dengan penelitian lebih lanjut. Salah satu senyawa yang telah diketahui mekanisme inhibisinya terhadap aktivitas lipase pankreas adalah orlistat. Orlistat menginhibisi lipase pankreas secara nonkompetitif dengan membentuk suatu ikatan kovalen pada gugus serin, yaitu sisi aktif dari lipase pankreas dan lambung sehingga enzim tersebut menjadi nonaktif (Cariere 2001). Mekanisme inhibisi lipase pankreas oleh ekstrak buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur belum
tentu sama dengan orlistat. Mekanisme inhibisi lain yang dimungkinkan adalah secara kompetitif (bersaing dengan substrat mengikat sisi aktif enzim) dan unkompetitif (merusak struktur enzim) (Tze & Wong 1975). Mekanisme hambatan ekstrak kasar dari ketiga contoh dan senyawa yang paling berperan dalam proses tersebut dapat diketahui melalui penelitian lebih lanjut. Berdasarkan hasil uji inhibisi tersebut juga diketahui bahwa beberapa ekstrak mencapai daya inhibisi maksimum pada konsentrasi di atas nilai LC50nya, antara lain ekstrak air dan etanol buah asam gelugur, serta ekstrak etanol kencur. Hasil ini masih dapat diterima karena uji toksisitas menggunakan larva udang yang telah dilakukan hanya merupakan uji toksisitas awal. Penelitian lebih lanjut secara in vivo perlu dilakukan untuk mengetahui tingkat toksisitas akut keenam ekstrak tersebut untuk mengetahui keamanannya apabila akan dikonsumsi lebih lanjut sebagai obat. Uji Statistik Uji statistik dilakukan untuk mengetahui pengaruh daya inhibisi antar ekstrak contoh. Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap Perlakuan yang dibandingkan adalah konsntrasi ekstrak air dan etanol ketiga tanaman pada daya inhibisi maksimum, serta perlakuan dengan kontrol negatif dan kontrol positif. Berdasarkan hasil uji statistik (Lampiran 12) diketahui bahwa ekstrak air ketiga contoh memberikan pengaruh daya inhibisi terhadap aktivitas lipase pankreas yang tidak berbeda nyata, karena nilai Fhitung yang diperoleh, yaitu 1,478 lebih kecil dari Ftabel (5,143), sementara itu ekstrak etanolnya memberikan pengaruh yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas karena karena Fhitung (17,910) lebih besar dari Ftabel (5,143). Uji beda perlakuan terhadap ekstrak etanol asam gelugur, lengkuas, dan kencur, serta kontrol negatif dan positif menyatakan bahwa paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata. Melalui uji Duncan diperoleh 9 perlakuan yang berbeda nyata pengaruhnya terhadap daya inhibisi lipase pankreas. Perlakuan-perlakuan tersebut adalah kontrol negatif dengan ekstrak etanol kencur, kontrol negatif dengan ekstrak etanol lengkuas, kontrol negatif dengan ekstrak etanol asam gelugur, kontrol positif dengan ekstrak etanol kencur, kontrol positif dengan ekstrak etanol lengkuas, kontrol positif dengan ekstrak etanol asam gelugur, ekstrak etanol kencur
15
dengan ekstrak etanol lengkuas, ekstrak etanol asam gelugur dengan ekstrak etanol lengkuas, dan ekstrak etanol asam gelugur dengan ekstrak etanol kencur. Lampiran 13 memperlihatkan kurva estimasi hubungan antara konsentrasi ekstrak dan kontrol positif dengan daya inhibisinya menggunakan kurva linier, logaritmik, kuadratik, power, dan eksponensial untuk mengetahui model inhibisinya. Kadar Flavonoid Total Ekstrak Metode ini berdasarkan pada Codex (1986) diacu dalam Nobre et al. (2005) dengan beberapa modifikasi, yaitu sistem hidrolisis yang berupa 1,0 mL urotropin 0,5% dan 2,0 mL asam hidroklorat R diganti dengan larutan heksametilentetramina 0,5% (b/v) dalam metanol dan 2,0 mL HCl 25%, serta panjang gelombang yang digunakan dari 425 nm diganti dengan 370,8 nm. Penentuan kadar flavonoid total ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi didasarkan pada hasil uji fitokimia. Kadar flavonoid ini ditentukan untuk mengetahui jumlah flavonoid yang terdapat dalam ekstrak yang diduga berpotensi atau bahkan merupakan senyawa yang paling berperan sebagai inhibitor lipase pankreas. Sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya, ekstrak etanol ketiga contoh mampu memberikan hambatan yang lebih tinggi daripada ekstrak airnya. Berdasarkan uji fitokimia ekstrak etanol asam gelugur tidak mengandung flavonoid sehingga penentuan kadar flavonoid total hanya dilakukan pada ekstrak etanol lengkuas dan kencur. Metode untuk menentukan kadar flavonoid total antara lain metode spektrofotometri UV (Codex 1986 diacu dalam Nobre et al. 2005), kromatografi cair kinerja tinggi (Merkeen & Beecher 2000), elektroforesis kapiler (Marchant et al. 2003), serta spektrofotometer IR yang digabungkan dengan kemometrik. Metode ini dipilih karena lebih cepat dan murah. Metode ini juga disebut dengan metode AlCl3 karena digunakan AlCl3 sebagai pengkompleks warna. Flavonoid total yang terukur adalah sumbangan dari golongan flavon dan flavonol yang terdapat dalam ekstrak karena hanya senyawa-senyawa tersebut yang mampu membentuk kompleks stabil dengan AlCl3. Penentuan kadar flavonoid total ini menggunakan standar kuersetin murni. Kuersetin digunakan sebagai standar karena merupakan jenis flavonoid yang umum ditemukan pada tumbuhan serta terkandung dalam lengkuas dan kencur. Larutan standar
kuersetin berwarna kuning sehingga pengukuran absorbansi deret standar dilakukan pada panjang gelombang 370,8 nm yang kemudian dibuat plot terhadap konsentrasi standar untuk memperoleh kurva standar (Lampiran 14). Konsentrasi flavonoid ekstrak ditentukan dari persamaan garis yang diperoleh dari kurva standar. Absorbans flavonoid ekstrak etanol lengkuas terukur sebesar 0,055 sehingga diperoleh kadar flavonoid totalnya sebesar 0,08% yang diduga terdiri atas kaemferol, galangin, kuersetin, dan mirisetin (Rahayu 2000, BPOM 2004). Flavonoid pada ekstrak etanol kencur memiliki absorbans 0,038 sehingga diperoleh kadar totalnya sebesar 0,04 %, lebih kecil daripada dalam ekstrak etanol lengkuas. Day dan Underwood (2001) menggolongkan perolehan analat hasil analisis kuantitatif dalam 3 kelompok, yaitu konstituen utama, minor, dan jejak atau runut. Hasil penentuan flavonoid total ekstrak etanol lengkuas dan kencur ini termasuk ke dalam konstituen minor karena memiliki kadar di antara 0,011%. Nilai kadar flavonoid total tersebut hampir sama dengan yang diperoleh Wahyuningrum (2006), menggunakan teknik spektroskopi IR dan kemometrik pada tanaman tempuyung dari tiga daerah yang berbeda, yaitu antara 0,62-0,82%. Nilai kadar flavonoid total yang diperoleh tersebut tidak menunjukkan kadar flavonoid total dari contoh sebenarnya, akan tetapi hanya kadar flavonoid total yang terekstrak oleh pelarut, yaitu etanol 70% secara maserasi. Kadar flavonoid total yang diperoleh tersebut dapat dipengaruhi oleh lingkungan tempat tumbuh tanaman seperti temperatur, sinar UV dan tampak, nutrisi, ketersediaan air, dan kadar CO2 di atmosfer karena senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan tanaman merupakan bentuk adaptasi tanaman terhadap lingkungan untuk bertahan hidup. Jenis pelarut, metode, lamanya waktu ekstraksi, serta nisbah antara jumlah pelarut dan contoh yang digunakan juga sangat mempengaruhi kadar senyawa metabolit sekunder dalam ekstrak. Apabila flavonoid di dalam tanaman tersebut banyak terdapat dalam bentuk glikon (terikat pada gugus gula) maka akan cenderung lebih terekstrak dengan pelarut yang lebih polar seperti air, sedangkan apabila dalam bentuk aglikon (tidak terikat pada gugus gula) maka akan lebih terekstrak dengan pelarut dengan kepolaran lebih rendah daripada air, seperti alkohol. Umar (2008) melakukan optimalisasi penentuan kadar flavonoid total pada daun jati
16
belanda yang diekstrak menggunakan pelarut etanol dengan metode refluks. Hasil optimalisasi tersebut adalah kadar flavonoid total daun jati belanda secara optimal diperoleh dengan nisbah antara simplisia dengan pelarut sebesar 1:10 yang direfluks selama 3 jam menggunakan etanol 70%. Pada penelitian ini ekstrak etanol lengkuas dan kencur diperoleh dengan maserasi selama 24 jam menggunakan etanol 70% dengan nisbah 1:8. Optimalisasi kondisi ekstraksi contoh pada penelitian ini tidak dilakukan sebelumnya sehingga kadar flavonoid ekstrak yang diperoleh diduga belum optimal.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Ekstrak air dan etanol dari buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur berpotensi sebagai antiobesitas melalui inhibisi aktivitas lipase pankreas dengan daya inhibisi tertinggi dicapai oleh ekstrak etanol buah asam gelugur sebesar 86,3% pada konsentrasi 150 ppm. Uji statistik menunjukkan bahwa interaksi daya inhibisi aktivitas lipase pankreas antara kontrol negatif, kontrol positif, dan ekstrak etanol dari ketiga contoh berbeda nyata satu dengan lainnya, kecuali interaksi antara kontrol positif dengan kontrol negatif. Flavonoid total dalam ekstrak etanol lengkuas dan kencur yang diduga berperan dalam proses inhibisi tersebut termasuk dalam konstituen minor.
Saran Pencirian senyawa aktif dalam ekstrak perlu dilakukan untuk mengetahui senyawa yang berpotensi sebagai inhibitor aktivitas lipase pankreas. Mekanisme inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas juga perlu diteliti lebih lanjut. Selain itu, uji in vivo terhadap hewan coba juga diperlukan untuk mengetahui kemampuan senyawa aktif dalam ekstrak sebagai antiobesitas.
DAFTAR PUSTAKA Alviar B et al., penemu; Access Business Group International LLC. 2 Juli 2002. Diet composition and method of weight management. United States Patents No. 6413545. [AOAC] Association of Official Analytical Chemist. 2000. Official Methods of Analysis of AOAC International. Volume
ke-1. Ed ke-17. Agricultural Chemicals, Contaminants, Drugs. Maryland: AOAC International. [Anonim]. 2007. Extract HCA or hydroxycitric acid calcium salt? [terhubung berkala]. http://www.mdidea. com/products/herbextract/hca/data.html. [27 Mei 2008]. Birari RB, Bhutani KK. 2007. Pancreatic lipase inhibitors from natural sources: unexplored potential. Drug Discovery Today 12:379-389. [BPOM] Badan Pengawas Obat dan Makanan. 2004. Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia. Volume 1. Jakarta: Badan POM RI. Burhanuddin et al. 2004. Pengaruh jus buah mengkudu masak (Morinda citrifolia L.) terhadap penurunan bobot badan tikus putih jantan. Di dalam: Buku Panduan Seminar Nasional XXV Tumbuhan Obat Indonesia; Tawangmangu, 27-28 Apr 2004. hlm 21. abstr no M-33. Cariere F et al. 2001. Inhibition of gastrointestinal lipolysis by OrlistatTM during digestion of test meals in healthy volunteers. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 281(1): G16-G28. Chung CS. 2006. Sweet and sour, the lovely gelugor. Gardenwise 26:18-19. Crespo RF, Martin MD, Finger O, penemu; Eli Lilly and Company. 22 Jan 2008. Selective peroxisome poliferator activated reseptor modulators. United States Patents No. 7231056. Darusman LK, Rohaeti E, Sulustiyani. 2001. Kajian senyawa golongan flavonoid asal tanaman bangle sebagai senyawa peluruh lemak melalui aktivitas lipase. Bogor: Pusat Studi Biofarmaka, Lembaga Penelitian IPB. Day RA, Underwood AL. 2001. Analisis Kimia Kuantitatif. Iis Sopyan, penerjemah. Ed ke-6. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari Quantitative Analysis. Downey M, JS Stern, Kazaks A. 2005. Future and implications of reimbursement for obesity treatment. [terhubung berkala]. http://www.clevelandclinic.org/ health/healthinfo/docs/2400/2451.asp?ind ex=9472. [21 Feb 2008].
17
Febriany S. 2004. Potensi ekstrak tunggal bangle dan gabungan dalam meningkatkan aktivitas enzim lipase secara in vitro [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia. FMIPA, IPB. Hadvary P, Lengsfeld H, Wolfer H. 1988. Inhibition of pancreatic lipase in vitro by the covalent inhibitor tetrahydroplastin. J Biochem 256:357-361. Han LK, Takaku T, Li J, Kimura Y, Okuda H. 1999. Anti-obesity action of oolong tea. Int. J. of Obesity 23:98-105. Han LK et al. 2001. Anti-obesity effects in rodents of dietary teasaponin, a lipase inhibitor. Int J of Obesity 25:1459-1464. Han LK et al. 2005a. Anti-obesity effects of chikusetsusaponins isolated from Panax japonicus rhizomes. BioMed Central 5(9):1-10. Han LK et al. 2005b. Antiobesity action of Zingiber officinale Roscoe. [abstrak]. Yakugaku Zasshi 125(2):213-217. Han LK et al. 2006. Reduction of fat storage in mice fed a high-fat diet long term by treatment with saponins prepared from Kochia scoparia fruit. [artikel]. Phyt Res. Han LK et al. 2007. compounds isolated mandshurica on [abstrak]. J of 61(2):184-186.
Inhibitory effect of from fruit of Juglans pancreatic lipase. Natural Medicine.
Harborne JB. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Edisi ke-2. Padmawinata K, Soediro I, penerjemah. Bandung: ITB. Terjemahan dari: Phytochemical Methode. Heyne K. 1987a. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid ke-2. Jakarta: Yayasan Sarana Warna Jaya. Heyne K. 1987b. Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid ke-3. Jakarta: Yayasan Sarana Warna Jaya. Heysmfield SB et al. 1998. Garcinia cambogia (hydrocitric acid) as a potensial antyobesity agent. JAMA 280(8):15961600. Iswantini D, Darusman LK, Gunawan E, Nurulita Y. 2003a. Identifikasi senyawa bioaktif daun jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) sebagai pelangsing
dengan menggunakan metode enzimatis. Gakuryoku 9(2):138-142. Iswantini D, Darusman K, Febriany S. 2003b. Pengaruh ekstrak tunggal dan gabungan dari bangle terhadap aktivitas enzim lipase dalam kajian sebagai pelangsing. Prosiding Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXIV; Bogor, 19-20 September 2003. Pusat Studi Biofarmaka LP-Institut Pertanian Bogor; 2003. hlm 276-282. Jang DS et al. 2008. A new pancreatic inhibitoe isolated from the roots of Actinidia arguta. Arc Parm Res 31(5):666-670. Jansen PCM. 1992. Plant Resourches SoutEast Asia No 2: Edible fruits and nuts. EWM Verheij dan PE Coronel, editor. Bogor: Prosea. Hal 175-177. Kurk M, Vital O, penemu; Fay, Sharpe, Fagan, Minnich and McKee, LLP. 6 Agust 2002. Herbal weight loss suplement. United States Patents No. 6428806. Mackeen MM. 1988. Bioassay-guided isolation and identification of bioactive compounds from Garcinia atroviridis (Asam gelugor). [Tesis]. Abstrak. [terhubung berkala]. http:www.znaturforsch.com. [22 Nov 2008]. Marchant E, Kreeb L, Kopp B. 2003. Quantification of the flavonoid glycocides in Passiflora incarnata by capillary electrophoresis. Planta Med 69:452-456. Martatilofa E. 2008. Daya inhibisi ekstrak bangle, jati belanda, kemuning, dan formula biolangsing terhadap lipase pankreas [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia. FMIPA, IPB. Merkeen HM, Beecher GR. 2000. Liquid chromatographic method for the separation and quantification of prominent flavonoid aglycones. J chromatogr A 897:177-184. Meyer B et al. 1982. Brine shrimp: A convent general bioassay for active plant constituents. Planta Medica 45:31-34. Moreno DA et al. 2003. Inhibitory effects of grape seed extract on lipases. Nutrition 19(10):876-879.
18
Muzakki MH. 2006. Pencirian produk pemisahan asam hidroksisitrat dri buah gelugur (Garcinia atroviridis) [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia FMIPA, IPB. Nobre CP, Raffin FN, Moura TF. 2005. Standardization of extracts from Momordica charantia L. (Cucurbitaceae) by total flavonoids content determination. Acta Farm Bonaerense 24(4): 562-566. Oluyemi KA et al. 2007. Effect of crude ethanolic extract of Garcinia cambogia on the reproductive system of male wistar rats (Rattus novergicus). African Journal of Biotechnology 6(10):1236-1238. Padikkala J, Achuthan CR. 1997. Hipolipidemic effect of Alpinia galanga (Rasna) and Kaemferia galanga (Kachoori). Indian J of Chemical Biochemistry 12(1):55-58. Pushpangadan P et al., penemu; Council of Scientific and Industrial Research. 24 Jan 2006. Synergistic composition for treating hiperlipidemia. United States Patents No. 6989165. Rahardjo SS, Ngatijan, Pramono S. 2005 Influence of etanol extract of jati belanda leaves (Guazuma ulmifolia Lamk.) on lipase enzyme activity of Rattus norvegicus serum. Inovasi. 4(17):48-53. Rahayu WP, Fardiaz S, Darusman LK. 2000. Kajian aktivitas dan produksi komponen antimikroba dari rimpang lengkuas (Alpinia galanga). Di dalam: Laporan Akhir Penelitian HIBAH Bersaing VII Perguruan Tinggi Tahun Anggaran 19982000. Rittirut W, Siripatana C. 2007. Diffusion properties of Garcinia fruit Acids (Garcinia atroviridis). Walailak J Sci & Tech 4(2):187-202. Santoso A. 2001. Down regulation of mammary lipoprotein lipase activity by ribonucleid acid and protein synthesis inhibitors. Anales Bogorienses 8:31-36. Satouchi K et al. 1998. Lipoxygenase-1 from soybeen seed inhibiting the activity of pancreatic lipase. JSBA 62(8):1498-1503. Shin JE, Han MJ, Kim DH. 2003. 3methylethergalangin isolated from Alpinia officinarum inhibits pancreatic lipase. J Biol Pharm 26(6):854-857.
Silitonga RF. 2008. Daya inhibisi ekstrak daun jati belanda dan bangle terhadap aktivitas lipase pankreas sebagai antiobesitas [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia. FMIPA, IPB. Syamsudin, Rita MD, Simotiyan H. 2004. Efek Ekstrak Daun Asam Gelugur (Garcinia atroviridis Griff Tanders) terhadap Plasmodium berghei pada Mencit. [abstrak]. Majalah Farmasi Airlangga 4(3). Tze J, Wong F. 1975. Kinetics of Enzyme Mechanisms. New York: Academic Press Inc. Umar F. 2008. Optimasi kadar flavonoid total daun jati belanda [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia. FMIPA, IPB. Wirakusumah LH. 2005. Fraksinasi dan karakterisasi senyawa aktif flavonoid dari ekstrak kasar metanol rimpang bangle (Zingiber cassumar Roxb.) [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia. FMIPA, IPB. Wahyuningrum A. 2006. Penentuan flavonoid total tempuyung (Sonchus arvensis L.) secara cepat dengan teknik spektroskopi IR dan kemometrik [skripsi]. Bogor: Jurusan Kimia. FMIPA, IPB. Xu BJ, Han LK, Zheng YN, Lee JH, Sung CK. 2005. In vitro inhibitory effect of triterpenoidal saponins from Platycodi radix on pancreatic lipase. Arch Pharm Res 28(2):180-185. Yamamoto M et al. 2000. Anti-obesity effects of lipase inhibitor CT-II, an extract from edible herbs, Nomame Herba, on rats fed a high-fat diet. Int J of Obesity 24:758-764. Yoshizumi K et al.. 2006. Lupane type saponins from leaves of Acanthopanax sessiliflorus and their inhibitory activity on pancreatic lipase. J Agric Food Chem 54:335-341. Yatcilla M, Krumhar K, Thompson J, penemu; Herbalife International, Inc. 12 Feb 2008. herbal supplement to support weight loss. US Patent No. 7329419.
LAMPIRAN
20
Lampiran 1 Bagan alir penelitian Buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur
Persiapan contoh pencucian perajangan pengeringan penggilingan Serbuk contoh
Penetapan kadar air
Ekstraksi air dan etanol
Ekstrak air dan etanol
Uji fitokimia
Uji toksisitas dengan larva udang
Uji inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas
Uji flavonoid total ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi (berdasarkan hasil uji fitokimia)
21
Lampiran 2 Bagan alir ekstraksi air Serbuk contoh
Maserasi dengan air (1:8) 24 jam disaring Filtrat dipekatkan Ekstrak air
Lampiran 3 Bagan alir ekstraksi etanol Serbuk contoh
Maserasi dengan atanol 70% (1:8) 24 jam disaring Filtrat dipekatkan
Ekstrak etanol
22
Lampiran 4 Bagan alir penentuan nilai LC50 ekstrak dengan menggunakan larva udang air laut + telur udang (ditetaskan 48 jam)
0,1000 g ekstrak Dilarutkan dengan air laut
Ditera dengan air laut hingga 25 mL
Ekstrak 4000 ppm
1
10 ekor larva udang + 1500 µl air laut + 500 µl larutan ekstrak
(1000 ppm, triplo)
2
10 ekor larva udang + 1950 µl air laut + 50 µl larutan ekstrak
(100 ppm, triplo)
3
10 ekor larva udang + 1995 µl air laut + 5 µl larutan ekstrak
(10 ppm, triplo)
4
10 ekor larva udang + 2000 µl air laut
(kontrol, triplo) 1
2
3
4 Dibiarkan 24 jam
Jumlah larva udang yang mati dihitung
Analisis menggunakan Probit Analysis Methode
Nilai LC50 ekstrak
23
Lampiran 5 Bagan alir uji in vitro inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas • ekstrak contoh • 15 µL minyak wijen • 10 µL albumin 10% (b/v) • µL lipase pankreas murni Ditera dengan buffer fosfat pH 8 hingga 1 mL
inkubasi 45 menit, T=40○C + kloroform 3 mL dikocok disentrifusa selama 5 menit 1,0 mL lapisan kloroform + 4 mL kloroform-heptana (1:1) dikocok + 2,5 mL pereaksi tembaga dikocok selama 3 menit disentrifusa selama 10 menit 3,0 mL lapisan kloroform + 0,25 mL larutan Na-dietilditiokarbamat Larutan berwarna kuning serapan diukur pada λ = 435 nm Aktivitas hidrolitik lipase dan daya inhibisi ekstrak
Lampiran 6 Prosedur pembuatan pereaksi tembaga (250 mL) Sebanyak 71,25 g NaCl dilarutkan dalam 150 mL akuades, kemudian ditempatkan pada labu takar 250 mL. Setelah itu, ke dalam larutan NaCl ditambahkan 6,04 g Cu(NO3)2.3H2O dan 21,25 g trietanolamin, lalu diaduk hingga larut. Selanjutnya ditambahkan 0,7125 mL asam asetat glasial dan ditera dengan akuades.
24
Lampiran 7 Bagan alir penentuan kadar flavonoid total ekstrak dengan daya inhibisi tertinggi ditimbang setara dengan 200 mg serbuk sistem hidrolisis (refluks) 30 menit • 1,0 mL larutan HMT 0,5% b/v • 20 mL aseton • 2 mL HCl 25% filtrat
residu + 20 mL aseton
labu takar 100 mL
dihidrolisis filtrat
tera dengan aseton ekstrak 20 mL ekstrak + 20 mL akuades + 15 mL etil asetat ekstraksi dalam corong pisah ditampung dalam labu takar 50 mL ditera dengan etil asetat fraksi etil asetat 10 mL fraksi etil asetat pada labu takar 25 mL + 1 mL AlCl3 2% (b/v) ditera dengan asam asetat glasial 5% (v/v) larutan flavonoid contoh Standar kuersetin 0; 0,5; 2,5; 5,0; 7,5; 10 ppm Fotometri pada λ = 370,8 nm
25
Lampiran 8 Penentuan kadar air Kadar air asam gelugur Bobot cawan Bobot cawan + kosong (g) contoh (g) 19,8685 22,9149 19,0184 22,0287 23,9589 26,9966
Bobot contoh basah (g) 3,0464 3,0103 3,0377
Bobot contoh kering (g) 22,3549 21,4687 26,4141 Rerata
Kadar air (%) 18,4 18,6 19,2 18,7
Kadar air lengkuas Bobot cawan Bobot cawan + kosong (g) contoh (g) 27,2390 29,2443 34,5572 36,5686 24,6942 26,7002
Bobot contoh basah (g) 2,0053 2,0114 2,0060
Bobot contoh kering (g) 29,0480 36,3759 26,5115 Rerata
Kadar air (%) 9,79 9,58 9,41 9,59
Kadar air kencur Bobot cawan Bobot cawan + kosong (g) contoh (g) 30,2507 32,2531 34,5716 36,5724 28,6343 30,6352
Bobot contoh basah (g) 2,0024 2,0008 2,0009
Bobot contoh kering (g) 32,0797 36,4007 30,4642 Rerata
Kadar air (%) 8,66 8,58 8,55 8,60
Perhitungan: Kadar air (%) =
Bobot sampel basah − bobot sampel kering Bobot sampel basah
× 100%
26
Lampiran 9 Rendemen berbagai ekstrak contoh dan perhitungan
Contoh Asam gelugur Lengkuas Kencur
Ekstrak
Bobot awal (g)
Bobot ekstrak (g)
Rendemen (%)
Air
100,0570
19,2366
23,7
Etanol
100,0174
21,3037
26,2
Air
100,0086
9,1294
10,1
Etanol
100,0134
19,0875
21,1
Air
100,0129
4,3682
4,78
Etanol
100,0251
6,9090
7,56
Perhitungan:
bobot ekstrak (g) × 100% × faktor koreksi bobot contoh (g) bobot ekstrak (g) 100 ⎛ ⎞ × 100% × ⎜ = ⎟ bobot contoh (g) 100 − kadar air ⎝ ⎠
Rendemen ekstrak =
Contoh perhitungan (ekstrak air asam gelugur ): Rendemen ekstrak =
=
bobot ekstrak (g) 100 ⎛ ⎞ × 100% × ⎜ ⎟ bobot contoh (g) ⎝ 100 − kadar air ⎠ 19,2366 g × 100% × 100, 0570 g
= 23,7 %
⎛ 100 ⎞ ⎜ ⎟ ⎝ 100 − 18,7 ⎠
27
Lampiran 10 Aktivitas ekstrak terhadap larva A. Salina setelah 24 jam
Contoh
Ekstrak
Blanko Asam
Air
gelugur
Etanol
Lengkuas
Air
Etanol
Kencur
Air
Etanol
Jumlah larva udang yang mati
Konsentrasi (ppm)
Ulangan 1
Ulangan 2
Ulangan 3
0
0
0
0
10
0
0
0
100
3
3
2
1000
10
10
10
10
2
2
4
100 1000
4 10
5 10
5 10
10
0
0
0
100
3
3
3
1000
9
9
8
10
1
1
2
100
1
1
3
1000
3
4
3
10
0
0
0
100
2
1
1
1000
5
4
3
10
1
1
2
100
9
10
10
1000
10
10
10
28
Lampiran 11 Data dan perhitungan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Contoh
Ekstrak
Kontrol (-) Asam gelugur
Air
Etanol
Lengkuas
Air
Etanol
Kencur
Air
Etanol
Kontrol (+)
Konsentrasi (ppm)
Absorbans 1
2
3
Rerata
Aktivitas enzim
Daya inhibisi
(µmol/L.menit)
(%)
4
0
1,548
1,587
1,573
1,569
4,82 × 10
100 150 200 250 300 100 150 200 250 300
0,819 0,993 1,255 1,175 1,190 1,051 0,123 1,130 0,758 0,812
1,055 0,979 1,255 1,389 1,167 0,849 0,265 1,063 0,673 1,161
0,889 0,765 1,260 1,313 0,923 0,854 0,257 1,370 1,075 1,278
0,921 0,912 1,257 1,292 1,093 0,918 0,215 1,188 0,835 1,084
2,83 × 104 2,80 × 104 3,86 × 104 3,97 × 104 3,36 × 104 2,82 × 104 6,60 × 103 3,35 × 104 2,57 × 104 3,33 × 104
41,3 41,9 19,9 17,6 30,3 41,5 86,3 24,3 46,7 30,9
100 150 200 250 300 100 150 200 250 300
1,210 1,102 1,367 1,156 1,345 0,633 1,425 0,473 1,851 1,580
1,221 0,920 1,437 1,154 1,181 0,845 1,090 0,768 1,602 1,839
0,951 1,169 1,404 1,001 1,143 0,945 1,087 0,820 1,407 1,813
1,127 1,064 1,403 1,104 1,223 0,808 1,201 0,687 1,620 1,744
3,46 × 104 3,27 × 104 4,31 × 104 3,39 × 104 3,76 × 104 2,48 × 104 3,69 × 104 2,11 × 104 4,98 × 104 5,36 × 104
28,2 32,2 10,6 29,7 22,0 48,5 23,4 56,2 -3,3 -11,2
100 150 200 250 300 100 150 200 250 300
1,086 1,602 1,341 1,053 1,374 1,319 1,616 1,460 1,188 1,132
1,410 1,565 1,407 0,953 1,073 1,160 1,750 1,218 1,318 0,779
1,012 1,757 1,253 1,010 0,957 1,125 1,593 1,313 0,970 1,025
1,169 1,641 1,334 1,005 1,135 1,201 1,653 1,330 1,159 0,979
3,59 × 104 5,04 × 104 4,10 × 104 3,09 × 104 3,48 × 104 3,69 × 104 5,08 × 104 4,09 × 104 3,56 × 104 3,01 × 104
25,5 -4,6 14,9 35,9 27,8 23,4 -5,4 15,1 26,1 37,6
100 150 200 250 300
1,397 1,821 2,009 1,900 1,757
1,413 1,783 1,951 2,036 1,818
1,399 1,959 1,987 1,876 1,577
1,403 1,854 1,982 1,937 1,717
4,31 × 104 5,70 × 104 6,09 × 104 5,95 × 104 5,27 × 104
10,6 -18,3 -26,3 -23,4 -9,3
0,0
29
Lanjutan Lampiran 11 Perhitungan aktivitas enzim lipase Aktivitas enzim lipase pankreas (µmol/l,menit) =
volume zat pengekstra k A 1 1 × μmol standar × × × B volume enzim (L) volume zat yang diukur waktu(meni t)
Keterangan: A = absorbans sampel B = absorbans standar (asam oleat) = 0,041 µmol standar = jumlah standar oleat yang digunakan (4,25 µmol) Bobot standar = 0,0155 g [standar] =
3 0,0155 g 10 3 mL 10 mg × × = 1,24 × 103 ppm 1g 1L 1,25 mL
[standar] setelah pengenceran ke dalam 1,00 mL V1M1 = V2M2 1,24 × 103 ppm × 97,0 µL = 1,00 mL × M2 M2 = 1,20 × 103 ppm
1L 1 mol 10 6 μmol 1g 1,20 × 10 3 mg × 1mL × 3 × × × 1 mol 1L 10 mL 282,4614 g 10 3 mg = 4,25 µmol
µmol standar =
Volume enzim = 100 µL = 100 µL ×
1μL = 1,00 × 10-4 L 6 10 L
Volume zat pengekstrak = volume kloroform-heptana (1:1) = 4,0 mL Volume zat yang diukur = 3,0 mL Waktu = waktu inkubasi = 45 menit Perhitungan daya inhibisi ekstrak terhadap aktivitas lipase pankreas Daya inhibisi =
Aktivitas enzim blanko - Aktivitas enzim ekstrak × 100% Aktivitas enzim blanko
30
Lampiran 12 Perhitungan statistik ekstrak buah asam gelugur, rimpang lengkuas, dan kencur a. Ekstrak air Daya inhibisi (%) ekstrak air asam gelugur dan lengkuas terhadap aktivitas lipase pankreas Ekstrak air Ulangan ∑Yj Asam Gelugur Lengkuas Kencur 1
36,8
29,8
33,0
99,6
2
37,6
41,4
39,3
118,3
3
51,3
25,6
35,9
112,8
∑Yi
125,7
96,8
108,2
330,7
Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak air terhadap aktivitas xantin oksidase Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel Perlakuan 2 141,27 70,64 1,478 5,143 Galat 6 286,69 47,78 Total 8 427,96 H0 : μ1 = μ2 = μ3 (semua perlakuan memberikan daya inhibisi yang sama terhadap aktivitas lipase pankreas) H1 : μi ≠ μj (paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan daya inhibisi yang berbeda terhadap aktivitas lipase pankreas) 2 (330,7) 2 = 12151,39 FK = Y.. = (3 × 3) p⋅r
JKP =
Σ Yi
2
r
− FK =
⎛ 125,7 2 + 96,8 2 + 108,2 2 ⎜⎜ 3 ⎝
⎞ ⎟⎟ – 12151,39 = 141,27 ⎠
JKT = ΣΣ Yij2 – FK = (36,82 + … + 35,92) – 12151,39 = 427,96 JKG = JKT – JKP = 416 – 138,67 = 286,69
141,27 = 70,64 2 dbp 286,69 JKG = = 47,78 KTG = 6 dbg KTP F hitung = = 70,64 = 1,478 KTG 47,78
KTP =
JKP
=
F0,05(2,6) = 5,143 Fhitung < Ftabel Æ Kesimpulan : Terima H0 (berarti ekstrak air asam gelugur, lengkuas, dan kencur memberikan pengaruh daya inhibisi yang tidak berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas) b. Ekstrak etanol (1 faktor daya inhibisi tertinggi) Daya inhibisi (%) ekstrak etanol terhadap aktivitas lipase pankreas Ekstrak etanol Ulangan ∑Yj Asam Gelugur Lengkuas Kencur 1
92,1
69,5
26,9
188,5
2
82,9
50,4
49,8
183,1
3
83,4
47,1
33,8
164,3
∑Yi
258,4
167,0
110,5
535,9
31
Lanjutan Lampiran 12 Analisis sidik ragam daya inhibisi ekstrak etanol terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel Perlakuan 2 3713,4 1856,7 17,910 5,143 Galat 6 622,02 103,67 Total 8 4335,42 Fhitung > Ftabel Æ Kesimpulan : Tolak H0 (berarti ekstrak etanol asam gelugur, lengkuas, dan kencur memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas) c. Uji statistika daya inhibisi maksimum dari ekstrak asam gelugur, lengkuas, dan kencur terhadap kontrol negatif dan positif Perlakuan: I : tanpa penambahan ekstrak (kontrol negatif) II : penambahan ekstrak etanol buah asam gelugur 150 ppm III : penambahan ekstrak etanol lengkuas 200 ppm IV : penambahan ekstrak etanol kencur 300 ppm V : penambahan Xenical® 100 ppm (kontrol positif) Daya inhibisi (%) sample terhadap aktivitas lipase pankreas Perlakuan Ulangan I II III IV V 1
ΣYj
0,00
92,1
69,5
26,9
9,9
198,4
2
0,00
82,9
50,4
49,8
8,8
191,9
3
0,00
83,4
47,1
33,8
9,7
174,0
ΣYi
0,00
258,4
167,0
110,5
28,4
564,3
µ
0,00
86,1
55,7
36,8
9,5
188,2
Analisis sidik ragam daya inhibisi sampel terhadap aktivitas lipase pankreas Sumber keragaman db JK KT F-hitung F-tabel Perlakuan 4 14663,15 3665,79 58,868 3,478 Galat 10 622,71 62,271 Total 14 15285,86 H0 : μ1 = μ2 = μ3 = μ4 = µ5 (semua perlakuan memberikan daya inhibisi yang sama terhadap aktivitas lipase pankreas) H1 : μi ≠ μj (paling sedikit ada satu pasang perlakuan yang memberikan daya inhibisi yang berbeda terhadap aktivitas lipase pankreas) 2 2 FK = Y.. = (564,3) = 21228,97 (5 × 3) p⋅r F hitung =
KTP KTG
= 3665,79 = 58,868 62,271
F0,05(4,10) = 3,478 Fhitung > Ftabel Æ Kesimpulan : Tolak H0 (berarti perlakuan memberikan pengaruh daya inhibisi yang berbeda nyata terhadap aktivitas lipase pankreas)
32
Lanjutan Lampiran 12 Untuk melihat perlakuan mana yang memberikan pengaruh yang berbeda, dilakukan uji Duncan. Uji Duncan Rp = r0,05 (p,dbg)
KTG
r Tolak Ho jika |ýi - ýj| > Rp R2 = 3,15 × 4,94 = 15,57 R3 = 3,30 × 4,94 = 16,30 R4 = 3,37 × 4,94 = 16,65 R5 = 3,43 × 4,94 = 16,94 Urutan perlakuan: ý1 = 0 (kontrol negatif) ý2 = 10,6 (kontrol positif) ý3 = 37,6 (etanol kencur) ý4 = 56,2 (etanol lengkuas) ý5 = 86,3 (etanol asam gelugur)
|ý1 – ý2| = 10,6 < R2 Æ Terima Ho* |ý1 – ý3| = 37,6 > R3 Æ Tolak Ho |ý1 – ý4| = 56,2 > R4 Æ Tolak Ho |ý1 – ý5| = 86,3 > R5 Æ Tolak Ho |ý2 – ý3| = 27,0 > R3 Æ Tolak Ho |ý2 – ý4| = 45,6 > R4 Æ Tolak Ho |ý2 – ý5| = 75,7 > R5 Æ Tolak Ho |ý3 – ý4| = 18,6 > R4 Æ Tolak Ho |ý3 – ý5| = 48,7 > R5 Æ Tolak Ho |ý4 – ý5| = 30,1 > R4 Æ Tolak Ho Keterangan: * = tidak berbeda nyata
Kesimpulan: perlakuan yang berbeda nyata terdapat pada interaksi antara 1 kontrol negatif dengan ekstrak etanol kencur 2 kontrol negatif dengan ekstrak etanol lengkuas 3 kontrol negatif dengan ekstrak etanol asam gelugur 4 kontrol positif dengan ekstrak etanol kencur 5 kontrol positif dengan ekstrak etanol lengkuas 6 kontrol positif dengan ekstrak etanol asam gelugur 7 ekstrak etanol kencur dengan ekstrak etanol lengkuas 8 ekstrak etanol kencur dengan ekstrak etanol asam gelugur 9 ekstrak etanol lengkuas dengan ekstrak etanol asam gelugur
33
Lampiran 13 Kurva estimasi berbagai ekstrak contoh dan kontrol positif Contoh Asam gelugur
Lengkuas
Kencur
Kontrol (+)
Ekstrak Air
Kurva Logaritma Linier Kuadratik Power Exponensial
Persamaan garis y = -18,36 ln(x) + 126,19 y = -0,0925 + 48,714 y = 0,0013x² - 0,5928x + 92,49 y = 654,31x--0,6002 y = 51,401e-0,003x
R² 0,4845 0,4088 0,6702 0,4181 0,3401
Etanol
Logaritma Linier Kuadratik Power Exponensial
y = -19,215ln(x) + 146,39 y = -0,1216x + 70,249 y = - 0,001x² + 0,2981x + 33,527 y = 340,34x-0,4018 y = 67,411e-0,0024x
0,1185 0,1576 0,1986 0,1314 0,1567
Air
Logaritma Linier Kuadratik Power Exponensial
y = --6,1578 ln(x) + 56,715 y = -0,0299x + 30,498 y = 0,0005x² - 0,229x + 47,925 y = 92,654x-0,2676 y = 28,837e-0,0012x
0,0954 0,0746 0,1471 0,0654 0,0407
Etanol
Logaritma Linier Kuadratik
y = -50,053 ln(x) + 284,41 y = -0,2925x + 81,245 y = - 0,0017x² + 0,369x + 23,361
0,5210 0,5912 0,6573
Air
Logaritma Linier Kuadratik
y = 13,183 ln(x) – 49,002 y = 0,09x + 1,9087 y = 0,0013x² - 0,4292x + 47,344
0,1344 0,2083 0,3599
Etanol
Logaritma Linier Kuadratik
y = 17,521 ln(x) - 72,219 y = 0,1195x - 4,5228 y = - 0,002x² - 0,6914x + 66,432
0,2256 0,3486 0,6997
Logaritma Linier Kuadratik
y = -21 ln(x) + 96,425 y = -0,09x + 4,6473 y = 0,0628x² - 1,1973x + 101,54
0,3756 0,2294 0,9881
34
Lampiran 14 Data dan perhitungan penentuan kadar flavonoid total Konsentrasi (ppm) 0,00 0,00 0,50 2,50 5,00 7,50 10,00 0,24 0,13
Larutan Blanko Standar 1 Standar 2 Standar 3 Standar 4 Standar 5 Standar 6 Ekstrak etanol lengkuas Ekstrak etanol kencur
Absorbans 0,000 0,003 0,055 0,334 0,557 0,863 1,048 0,050 0,038
1.2
y = 0.1064x + 0.0245 2
R = 0.9932
Absorbans
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
2
4
6
8
10
12
[Kuersetin] (ppm)
Kurva standar kuersetin. Perhitungan kadar flavonoid total Persamaan regresi linear
y = 0,0245 + 0,1064 x, R² = 99,32%
[Flavonoid] etanol lengkuas = 0,050 - 0,0245 = 0,24 ppm 0,1064 Kadar flavonoid total ekstrak etanol lengkuas =
0,24 mg 1L
× 25 mL ×
50 mL 10 mL
×
[Flavonoid] etanol kencur =
100 mL 20 mL
×
21,1% 38,20 mg
×
1L = 0,08 % 3 10 mL
0,038 - 0,0245 = 0,13 ppm 0,1064
Kadar flavonoid total ekstrak etanol kencur =
0,13 mg 1L
× 25 mL ×
50 mL 10 mL
×
100 mL 20 mL
×
7,56% 13,82 mg
×
1L = 0,04 % 3 10 mL
