17
HASIL DAN PEMBAHASAN Persiapan dan Ekstraksi Sampel Sebanyak 5 kg buah segar tanaman andaliman asal Medan diperoleh dari Pasar Senen, Jakarta. Hasil identifikasi yang dilakukan oleh Pusat Penelitian Biologi LIPI, Bogor, menunjukkan buah tanaman andaliman yang digunakan dalam penelitian ini termasuk dalam jenis Zanthoxylum acanthopodium DC, suku Rutaceae (Lampiran 2). Secara berturut-turut besarnya kadar air, dan kadar abu buah andaliman adalah 9,59 % dan 28,42 %. Berdasarkan hasil ekstraksi dengan menggunakan pelarut n-heksana etilasetat, metanol, dan air diperoleh ekstrak pekat dengan urutan nilai rendemen masing-masing sebesar 1,79 %; 2,57 % ;4,22 %; dan 4,90 % (Lampiran 3). Dari nilai rendemen yang diperoleh menunjukkan, pelarut air dapat mengekstraksi komponen lebih banyak dibanding pelarut yang lain, hal ini dimungkinkan karena pelarut air bersifat lebih polar, sehingga semua komponen yang belum terekstrak oleh pelarut n-heksana, etilasetat, dan metanol akan terekstraksi oleh air. Uji Aktivitas dan Pemilihan Ekstrak Terbaik Buah Andaliman Parameter utama yang digunakan dalam pemilihan ekstrak terbaik adalah nilai IC50 dari hasil uji aktivitas antioksidan, dan inhibitor enzim α-glukosidase. Uji fitokimia merupakan uji kualitatif yang digunakan untuk mengetahui kandungan senyawa metabolit sekunder dalam suatu sampel (bahan). Uji ini dilakukan terhadap serbuk kering, ekstrak kasar, dan fraksi dari hasil proses fraksinasi buah andaliman. Dari hasil uji aktivitas, diperoleh ekstrak metanol memiliki aktivitas yang paling baik sebagai antioksidan dan inhibitor αglukosidase, karena memiliki IC50 yang lebih rendah dibanding ekstrak yang lain (Tabel 2). Hasil uji fitokimia memperlihatkan, bahwa senyawa aktif yang memiliki aktivitas paling tinggi seperti yang terdapat di dalam ekstrak metanol adalah senyawa flavonoid, hal ini ditunjukkan dengan warna merah yang lebih tajam pada lapisan amil alkoholnya (Tabel 1).
18
Tabel 1 Hasil uji fitokimia ekstrak kasar buah andaliman Ekstrak
Senyawa n-heksana
etilasetat
metanol
air
+
++
+++
++
Saponin
+
+
+
Tanin
+
+
+
Flavonoid
Alkaloid
+
+
+
++
terpenoid
+
+
+
+
Steroid
+
+
+
+
Keterangan:
+ : mengandung komponen : tidak mengandung komponen
Hal ini juga berarti bahwa ekstrak metanol didominasi oleh senyawa flavonoid. Namun, nilai rendemen, dan total fenol ekstrak metanol lebih rendah dibanding ekstrak air, berarti bahwa nilai rendemen dan nilai total fenol tidak memberikan pengaruh yang signifikan terhadap aktivitas suatu bahan. Tabel 2 Uji total fenol, dan IC50 aktivitas ekstrak kasar andaliman Rendemen (%)
Total fenol (mg asam galat/100 g ekstrak)
n-Heksana
1,79
38,75
Etilasetat
2,57
Metanol Air
Ekstrak
IC50 (ppm) DPPH
ABTS
Inhibitor αglukosidase
184,91
895,04
52,83
5574
4,22
375,54
390,92
30,04
323
4,90
460,91
71,61
Kontrol positif Troloks
10,17
Akarbosa Tanda (
25,67 0,54
): Tidak aktif: IC50 melebihi konsentrasi maksimum sampel: antioksidan (800 ppm), inhibitor α-glukosidase (10.000 ppm)
19
Rendemen adalah persentasi bobot produk akhir dibandingkan terhadap bobot awal, dalam hal ini rendemen merupakan kadar komponen yang terekstraksi (terbawa oleh pelarut) sesuai dengan tingkat kepolaran di dalam serbuk buah andaliman yang dinyatakan dengan persen. Total fenol adalah
banyaknya
senyawa fenolik yang terdapat dalam suatu ekstrak. Senyawa-senyawa fenolik memiliki aktivitas antioksidan karena kemampuannya mendonorkan atom hidrogen dari gugus hidroksilnya kepada senyawa radikal. Senyawa fenol tumbuhan
dapat
menimbulkan
gangguan
besar
karena
kemampuannya
membentuk kompleks dengan protein dengan cepat sekali melalui ikatan hidrogen (Harborne 1987). Senyawa fenol terbagi atas 3 kelompok, yaitu (1). golongan fenol sederhana (Vanilin, gingerol, shogaol, gualakol, dan eugenol); (2). Asam fenol (p-kresol, 3-etilfenol, hidrokuinon, dan asam galat); dan (3) flavonoid (antosianin, flavonon, flavonol dan tanin) (Parhusip 2006). Berdasarkan nilai total fenol dan rendemen serta nilai IC50 dapat disimpulkan, ekstrak air yang memiliki rendemen dan total fenol yang lebih tinggi, tetapi aktivitasnya lebih rendah dibanding dengan ekstrak metanol. Hal ini disebabkan karena ekstrak metanol lebih banyak mengandung senyawa flavonoid yang aktif sebagai antioksidan dan inhibitor enzim α-glukosidase. Pencarian Eluen Terbaik Berdasarkan analisis KLT dengan eluen tunggal, kloroform dan metanol menunjukkan keterpisahan yang bagus, hal ini berdasarkan keterpisahan dan jumlah spot yang terbentuk lebih banyak (Gambar 6). Untuk mengetahui keterpisahannya, dilakukan analisis pencarian eluen KLT dengan menggunakan perbandingan antara kloroform dan metanol pada 1:1; 2:1; 3:1; 6:1; dan 9:1. Dari hasil analisis yang diperoleh menggunakan KLT GF254, menunjukkan bahwa kloroform dan metanol dengan nisbah (9:1) dan (2:1) memberikan hasil yang baik, yaitu jumlah spot paling banyak dan pola spot yang baik. Namun, berdasarkan keterpisahan (jarak) antara spot yang satu dengan yang lainnya, perbandingan (9:1) lebih baik dibanding (2:1), karena jarak spot hampir sama dengan spot yang lain seperti terlihat pada Gambar 7.
20
Gambar 6 Profil spot pencarian eluen terbaik dengan pelarut tunggal dari kiri ke kanan: n-heksana, diklorometana, klorofom, etilasetat, aseton, etanol dan metanol. Noda pemisahan dideteksi di bawah lampu UV 254 dan 366 nm. Eluen terbaik yang diperoleh selanjutnya akan digunakan untuk analisis KLT fraksi hasil dari fraksinasi dengan kromatografi kolom.
Gambar 7 Profil spot pencarian eluen terbaik dengan perbandingan kloroformmetanol, dengan urutan perbandingan dari kiri ke kanan (1:1); (2:1); (3:1); (6:1); dan (9:1). Fraksinasi Ekstrak Teraktif Fraksinasi dilakukan terhadap ekstrak metanol sebagai ekstrak yang paling aktif. Pemisahan dilakukan dalam kolom dengan metode step gradient (peningkatan kepolaran), hal ini bertujuan untuk mempercepat pemisahan semua komponen yang terkandung dalam ekstrak. Sebanyak 8,61 g ekstrak metanol
21
dimasukkan secara perlahan ke dalam kolom untuk 4 kali ulangan. Elusi dimulai dengan pelarut n-heksana, kemudian dilanjutkan dengan perbandingan n-heksan dan etilasetat pada perbandingan 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9 dan etilasetat 100%, dengan cara yang sama dilanjutkan dengan perbandingan etilasetat dan metanol dan diakhiri perbandingan metanol dan air. Hasil pemisahan ekstrak ditampung sebanyak 5.0 ml dalam setiap tabung reaksi dan dimonitor melalui kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan eluen terbaik yang dicari sebelumnya (klorofom-metanol = 9:1). Berdasarkan pemisahan yang dilakukan diperoleh 358 tabung.
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
(F)
Gambar 8 Profil KLT 6 fraksi (A-F) hasil fraksinasi kromatografi kolom dengan eluen step gradien. Penggabungan dilakukan berdasarkan nilai Rf pada KLT dan kesamaan pola spot dari setiap tabung (Lampiran 6), dari hasil penggabungan diperoleh enam fraksi (A-F). Kemudian setelah semua
fraksi (A-F) diuapkan hingga pekat
diperoleh urutan nilai rendemen masing-masing sebesar 6,15; 12,27; 5,49; 27,04; 7,47; dan 10.21 % (b/b) (Lampiran 7). Pemilihan fraksi terbaik hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom Berdasarkan uji aktivitas, fraksi C dan E memiliki aktivitas paling baik sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan. Pemilihan fraksi terbaik berdasarkan
22
nilai IC50 (Tabel 3). Semakin kecil nilai IC50, aktivitasnya semakin baik. Dari hasil uji fitokimia flavonoid (Tabel 4), menunjukkan fraksi C dan E memiliki warna jingga yang lebih tajam
pada lapisan amil alkoholnya. Hal ini
menunjukkan, bahwa fraksi C dan E didominasi oleh senyawa flavonoid, sehingga dapat disimplukan, bahwa senyawa utama yang berpotensi sebagai antioksidan maupun sebagai inhibitor α-glukosidase seperti yang terdapat fraksi C dan E adalah senyawa flavonoid, tentu hal ini pengaruh dari peranan atom hidrogen. Tabel 3 Data IC50 aktivitas fraksi hasil fraksinasi dengan kromatografi kolom Fraksi
IC50 (ppm)
Rendemen (%) DPPH
A
6,13
B
12,27
C
5,49
D
ABTS
Inhibitor αglukosidase 81,00
527,32
117,00
720,39
498,86
16,00
27,04
601,17
710,64
39,00
E
7,47
444,77
181,79
27,00
F
10,21
1687,88
906,58
10,17
25,67
Kontrol positif Troloks Akarbosa Keterangan: (
Atom
0,54 ): IC50 melebihi konsentrasi maksimum: 800 ppm untuk antioksidan 2600 ppm untuk inhibitor α-glukosidase.
hidrogen
pada
gugus
hidroksil
senyawa
flavonoid
dapat
disumbangkan untuk kestabilan radikal bebas, dan atom hidrogen juga dengan cepat sekali mampu membentuk kompleks dengan protein pada enzim melalui ikatan hideogen, akibatnya, sering terjadi hambatan terhadap kerja suatu enzim. Berdasarkan uji fitokimia, fraksi D yang memiliki rendemen terbanyak lebih didominasi oleh senyawa alkaloid dan terpenoid yang ditunjukkan dengan adanya endapan berwarna coklat pekat saat penambahan pereaksi Wagner dan warna hijau setelah penambahan pereaksi Lieberman-Buchard.
23
Tabel 4 Uji fitokimia dan IC50 aktivitas ekstrak fraksi hasil kromatografi kolom Fraksi
Parameter A
B
C
D
E
F
+
++
+++
++
+++
++
Alkaloid
++
+
+
+++
+
+
Steroid
+
++
Terpenoid
+
+
++
+++
Flavonoid Saponin Tanin
Keterangan: (
): tidak terdeteksi
Fraksinasi Fraksi Terbaik Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif Fraksi C dan E merupakan fraksi teraktif sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan lebih lanjut dimurnikan dengan KLTP. Pemisahan dengan KLTP menggunakan perbandingan pelarut kloroform : metanol (9:1) untuk fraksi C dan klorofom-metanol-heksana (3:1:1) untuk fraksi E sebagai eluen terbaiknya yang sudah dicari sebelumnya. Alasan perbedaan eluen terbaik yang digunakan adalah karena fraksi E memiliki satu spot pada saat dimonitor dengan pelat KLT sehingga diduga adanya penumpukan senyawa.
(A)
(B)
Gambar 9 Profil pola spot fraksi hasil KLTP fraksi C dan E berturut-turut dari kiri ke kanan fraksi (a). FC1- FC10 dan (b). FE1- FE8 (Visualisasi spot: UV 254 nm)
24
Pemisahan ini menggunakan adsorben silika gel. Berdasarkan pemisahan yang dilakukan, untuk fraksi C diperoleh 10 fraksi (FC1-FC10) dan untuk fraksi E diperoleh 8 fraksi (FE1-FE2). Spot yang terbentuk dideteksi dengan sinar UV pada panjang gelombang 254 nm dan 366 nm. Nilai Rf ke-10 fraksi dari fraksi E (C1-C10) dan 8 fraksi dari fraksi E (E1-E2) dapat dilihat pada Lampiran 9. Pemilihan Fraksi Terbaik Hasil Fraksinasi Dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) Dari hasil uji aktivitas terhadap fraksi hasil fraksinasi dengan KLTP menunjukkan bahwa Fraksi C2 dan E2 adalah fraksi yang memberikan sifat inhibisi yang paling baik sebagai inhibitor α-glukosidase dan antioksidan, karena kedua fraksi memiliki nilai IC50 yang lebih rendah (Tabel 5). Tabel 5 Nilai IC50 aktivitas untuk fraksi hasil fraksinasi dengan kromatograpi lapis tipis preparatif (KLTP) Fraksi C
Rendemen (%)
IC50 (ppm) Fraksi E Rendemen Inhibitor (%) α-glukosidase
IC50 (ppm) DPPH
ABTS
C1
5,44
80,65
E1
22,09
386,61 168,26
C2
6,31
34,72
E2
7,44
137,46
C3
2,32
E3
4,04
126,95
C4
7,47
E4
2,71
249,82
C5
4,63
E5
1,61
338,44
C6
3,99
E6
0,94
309,93
C7
3,59
E7
1,69
C8
2,12
E8
1,38
C9
0,39
C10
2,32
Kontrol positif Akarbosa
0,54
Troloks Keterangan: (
74,02
10,17 ): Tidak aktif
25,67
25
Secara keseluruhan nilai IC50 Ekstrak kasar dan fraksi buah andaliman lebih besar dibanding kontrol positif, berarti aktivitas kontrol positif masih lebih baik bila dibandingkan dengan ekstrak kasar dan fraksi buah andaliman. Hal ini dimungkinkan senyawa yang terdapat dalam sampel belum murni seperti halnya troloks dan akarbosa. Apabila hasil ini dibandingkan dengan tumbuhan lain seperti ekstrak etanol 70% daun sirih merah (IC50 = 85,82 ppm) dengan metode DPPH (Alfarabi 2010), buah andaliman memiliki nilai IC50 yang lebih besar, Berarti aktivitas antioksidan daun sirih merah lebih tinggi dari pada buah andaliman, namun untuk aktivitas inhibitor α-glukosidase, berdasarkan nilai IC50 ekstrak metanol, fraksi C dan fraksi C2 buah andaliman masing-masing sebesar: 322 ppm; 16 ppm; dan 34,72 ppm, tentu hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas inhibitor α-glukosidase ekstrak buah andaliman jauh lebih tinggi dibanding daun sirih merah yang memiliki inhibisi terbesar 39,62 % pada konsentrasi 1 % (10.000 ppm) dan inhibisi terkecil sebesar 1,26 % pada konsentrasi 0,1 % (1000 ppm). Identifikasi dan Pendugaan Senyawa Aktif Pendugaan senyawa aktif utama yang berpotensi sebagai antioksidan dan inhibitor α-glukosidase pada fraksi C2 dan E2 dilakukan berdasarkan data yang diperoleh dari hasil identifikasi dengan menggunakan spektrofotometer IR dan data
panjang
gelombang
maksimum
dari
hasil
identifikasi
dengan
spektrofotometer UV-Vis. Berdasarkan hasil analisis dengan Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) (Gambar 9) memperlihatkan masing-masing fraksi C2 dan E2 memiliki gugus fungsi OH, C=O, C-O, dan C-H alifatik, serta C-H aromatik. Gugus-gugus fungsi ini merupakan gugus fungsi yang khas atau yang umum ditemukan pada senyawa flavonoid, sehingga diduga senyawa aktif utama yang terdapat pada fraksi C2 dan E2 adalah senyawa flavonoid.
26
(A)
(B) Gambar 10 Spektrum inframerah (A) fraksi E2 dan (B) fraksi C2. Dugaan ini didukung oleh nilai panjang gelombang maksimum masingmasing fraksi C2 dan E2, yaitu 234 nm dan 226 nm (Tabel 6). Pada umumnya, panjang gelombang maksimum spektrum khas flavonoid utama berada pada rentang 230 – 280 nm (Markham 1988). Berdasarkan data panjang gelombang maksimum senyawa golongan flavonoid menurut literatur, bahwa fraksi C2 dan E2 secara berturut diduga termasuk pada senyawa flavonoid golongan auron dan flavanon (Markham 1988 dan Harborne 1987).
27
Tabel 6 Serapan infra merah gugus fungsi fraksi C2 dan E2 Bilangan gelombang (cm-1) C2
E2
3389,57
3372
2925,32
2959,45 2928,8
Literatur* (cm-1)
Gugus dugaan
3200-3500
uluran OH
2695-2900
renggang C-H alifatik
2339,85
2112,17
2100-2260
renggang C-H aromatik
1670,76
1604,83
1540-1800
ulur karbonil (C=O)
1455,90
1409,68
1418,56
1463,2
1300-1475
lentur C-H
1235,94
1104,6
1100-1300
uluran C-O
Sumber *): Silverstein et al. 1986 Tabel 7 Nilai panjang gelombang maksimum senyawa dalam fraksi C2 dan E2 Fraksi
λ Maks (nm)
Golongan flavonoid
Pengukuran
Literatur
C2
234
230 -270**
Auron**
E2
226
225*
Flavanon*
Sumber: * Markham (1988), ** Harborne (1987)
