Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

SKRIPSI

PUTRI SYAJARWATI 10810200032

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JANUARI 2013

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

PUTRI SYAJARWATI 10810200032

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JANUARI 2013 ii

iii

iv

HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh : Nama : Putri Syajarwati NIM : 108102000032 Program Studi : Farmasi Judul Skripsi : Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI Pembimbing I : Lina Elfita, M.Si, Apt

(

)

Pembimbing II: A. Zaenal Mustopa, M.Si

(

)

Penguji I

: Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt

(

)

Penguji II

: Puteri Amelia, M.Farm., Apt

(

)

Penguji III

: Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt

(

)

Ditetapkan di : Jakarta Tanggal : 22 Januari 2013

Mengetahui, Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Prof. Dr.(hc). dr. M. K. Tadjudin, Sp. And v

ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Putri Syajarwati : Farmasi : Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

Virus hepatitis C (HCV) merupakan penyebab penyakit hepatitis C yang mempunyai tingkat virulensi yang tinggi. Hingga saat ini belum ada vaksin dan obat untuk mencegah dan mengobati infeksi HCV. Terapi pengobatan saat ini adalah menggunakan pegylated interferon-α (IFN-α) dikombinasi dengan ribavirin, namun memiliki efektivitas yang rendah sekitar 40% – 50%. Upaya penemuan obat terhadap infeksi HCV diantaranya adalah dengan pencarian inhibitor terhadap enzim yang essensial untuk replikasi HCV, salah satunya adalah RNA helikase. Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan tanaman tropis yang banyak dibudidayakan di Indonesia dan dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol kulit buah manggis sebagai inhibitor RNA helikase HCV. Aktivitas inhibisi dihitung berdasarkan pelepasan fosfat anorganik dengan metode kolorimetri ATPase. Kulit buah manggis diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Ekstrak kasar kulit buah manggis dibuat seri pengenceran menggunakan metanol absolut dengan konsentrasi 100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, dan 391 ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi 3.125 ppm ekstrak yang memiliki aktivitas penghambatan tertinggi terdapat pada ekstrak metanol yaitu sebesar 71,57%. Sedangkan, ekstrak n-heksan memiliki aktivitas 41,79%, dan ekstrak etil asetat memiliki aktivitas terendah yaitu sebesar 39,07%. Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah manggis berpotensi sebagai inhibitor virus hepatitis C. Kata kunci : Kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.), Virus hepatitis C, Uji kolorimetri ATPase.

vi

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name Program Study Title

: Putri Syajarwati : Pharmacy : Activity Test of Mangosteen (Garcinia mangostana L.) Pericarp Extract as Inhibitor of Hepatitis C Virus RNA Helicase

Hepatitis C virus (HCV) is the cause of chronic hepatitis C disease that has a high level of virulence. To date, there is no prophylactic vaccine and medicine avalaible to prevent and treat HCV infection. The current treatment therapy is involves the administration of pegylated interferon-α (IFN-α) in combination with ribavirin, but it has a low effectiveness rate of about 40% - 50%. Infectious disease drug discovery efforts include the search HCV inhibitor to an enzyme essential for viral replication of HCV, in example RNA helicase. Mangosteen (Garcinia mangostana L.) is a tropical plant widely cultivated in Indonesia and has been used as traditional medicine. This study aims to examine the activity n-hexane, ethyl acetate, and methanol extracts of mangosteen pericarp as an inhibitor of HCV RNA helicase. Inhibitory activity was calculated based on the release of inorganic phosphate by the ATPase colorimetric assay. Pericarp of mangosteen was extracted using the n-hexane, ethyl acetate, and methanol. Crude extract dilution pericarp of mangosteen is made using absolute methanol with a concentration of 100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, and 391 ppm. The results indicated that the highest inhibitory activity at a concentration of 3.125 ppm was observed in methanol extracts, 71.57%. While n-hexane has activity 41.79%, and the lowest activity of the ethyl acetate extract is equal to 39.07%. These results indicate that pericarp of mangosteen extract has potential as inhibitor of the HCV.

Keywords: Mangosteen (Garcinia mangostana L.) pericarp, Hepatitis C Virus, ATPase Colorimetric Assay.

vii


KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur saya panjatkan kepada Allah SWT, Zat Yang Maha Kasih dan Maha Penyayang yang telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari masa kuliah sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada : (1) Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing I dan Bapak Apon Zaenal Mustopa, M.Si. selaku pembimbing II, yang memiliki andil besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala bantuan dan bimbingan ibu dan bapak mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya. (2) Bapak Prof. Dr. dr.(hc). M. K. Tadjudin, Sp.And selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta (3) Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta (4) Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. (5) Teman seperjuangan dalam penelitian Yuni, dan keluarga besar Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler LIPI, Ibu Rifqiyah, Pak Ridwan, Ibu Linda, Aksar, Kak Bobby, Kak Meita, Bia, Krishna, dan Hary, yang telah banyak membantu penulis dalam penelitian. viii


(6) Teman-teman Farmasi angkatan 2008 dan sahabat-sahabat tercinta Berty, Sekar, Sukma, dan Via yang berbagi suka, duka, keceriaan, dan semangat semasa kuliah hingga penyelesaian tugas akhir ini. (7) Adik-adik tersayang, Zaky, Hanna, Farih, yang tak henti memberikan dukungan dan semangat. (8) Kedua orang tua tercinta, Ayahanda H.Najmudin dan Ibunda Hj.Siti Maemunah yang tak pernah letih mencurahkan kasih sayangnya dalam setiap doa dan dukungan yang diberikan kepada penulis, untuk menyelesaikan tugas akhir ini semoga segala amalan dan jerih payah keduanya mendapat balasan yang jauh lebih baik disisi-Nya. Akhir kata, semoga Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, untuk itu saran dan kritik tetap penulis harapkan untuk menjadikan tulisan ini lebih baik. Penulis berharap semoga skripsi ini membawa manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan maupun sebagai tambahan informasi untuk memperkaya ilmu di kemudian hari.

Jakarta, Januari 2013 Penulis

ix


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama NIM Program Studi Fakultas Jenis karya

: Putri Syajarwati : 108102000032 : Farmasi : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan : Skripsi

demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul : UJI AKTIVITAS EKSTRAK KULIT BUAH MANGGIS (Garcinia mangostana L.) SEBAGAI INHIBITOR RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Pada Tanggal

: Jakarta : 22 Januari 2013

Yang menyatakan,

(Putri Syajarwati)

x


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... iv HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ v ABSTRAK ...................................................................................................... vi ABSRTACT .................................................................................................... vii KATA PENGANTAR .................................................................................... viii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............... x DAFTAR ISI ................................................................................................... xi DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xv DAFTAR ISTILAH ....................................................................................... xvi BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................. 1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 1.3 Hipotesis .................................................................................................. 1.4 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 1.5 Manfaat Penelitian ...................................................................................

1 1 2 2 3 3

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 2.1 Manggis.................................................................................................... 2.1.1 Klasifikasi ...................................................................................... 2.1.2 Nama Daerah ................................................................................. 2.1.3 Penyebaran Geografi...................................................................... 2.1.4 Deskripsi ........................................................................................ 2.1.5 Kandungan ..................................................................................... 2.1.6 Kegunaan ....................................................................................... 2.2 Ekstraksi ................................................................................................... 2.2.1 Metoda Ekstraksi ........................................................................... 2.2.2 Parameter Ekstrak .......................................................................... 2.3 Virus Hepatitis C...................................................................................... 2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C ............................................................. 2.5 Kolorimetri ATPase ................................................................................. 2.6 SDS-PAGE ..............................................................................................

4 4 4 4 4 5 6 6 7 7 9 9 12 15 15

BAB 3. METODOLOGI ................................................................................ 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................................. 3.2 Alat dan Bahan .........................................................................................

17 17 17

xi


3.2.1 Alat................................................................................................. 3.2.2 Bahan ............................................................................................. 3.3 Prosedur Penelitian .................................................................................. 3.3.1 Pengambilan Sampel................................................................... 3.3.2 Determinasi Sampel .................................................................... 3.3.3 Pembuatan Simplisia................................................................... 3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis .................................... 3.3.5 Penapisan Fitokimia .................................................................... 3.3.6 Penetapan Parameter Spesifik dan Non Spesifik ........................ 3.3.7 Produksi RNA Helikase HCV .................................................... 3.3.8 Konfirmasi Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ..................................................................... 3.3.9 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV .................................. 3.3.10 Uji Aktivitas Inhibisi terhadap RNA Helikase HCV ..................

17 17 18 18 18 18 18 19 20 21

BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 4.1 Determinasi Sampel ................................................................................. 4.2 Rendemen Ekstrak ................................................................................... 4.3 Penapisan Fitokimia ................................................................................. 4.4 Parameter Standar Ekstrak ....................................................................... 4.5 Produksi RNA Helikase Virus Hepatitis C .............................................. 4.6 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Garcinia mangostana L. terhadap RNA Helikase Virus Hepatitis C ............................................................

26 26 26 28 31 31

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 5.1 Kesimpulan. ........................................................................................... 5.2 Saran ...........................................................................................

40 40 40

DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... LAMPIRAN ....................................................................................................

41 45

xii

23 24 24

35


DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Inhibitor RNA Helikase HCV .......................................................... Tabel 4.1 Rendemen Ekstrak Kulit Buah Mangis ............................................ Tabel 4.2 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis................. Tabel 4.3 Parameter Standar Ekstrak ............................................................... Tabel 4.4 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV ..................................................................................

xiii

Halaman 14 27 28 31 36


DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Struktur Virus Hepatitis C ............................................................ Gambar 2.2 Peta Genomik RNA Helikase HCV ............................................. Gambar 2.3 Mekanisme Kerja RNA Helikase HCV ....................................... Gambar 4.1 SDS-PAGE RNA Helikase HCV ................................................. Gambar 4.2 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV .............................................................................

xiv

Halaman 10 13 13 34 37


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Lampiran 2. Lampiran 3. Lampiran 4. Lampiran 5. Lampiran 6. Lampiran 7. Lampiran 8. Lampiran 9. Lampiran 10. Lampiran 11. Lampiran 12. Lampiran 13. Lampiran 14. Lampiran 15. Lampiran 16. Lampiran 17. Lampiran 18.

Hasil Determinasi Garcinia mangostana L.............................. Alur Penelitian .......................................................................... Skema Kerja Penyiapan Ekstrak Kulit Buah Manggis ............. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase HCV ................. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ......................................................... Skema Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV ........... Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA helikase HCV .................................... Komposisi larutan-larutan yang digunakan dalam SDS-PAGE ............................................................................... Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan ...... Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis .............. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis. .............. Perhitungan Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis .......... Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase HCV ....................................... Perhitungan Persentase Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase HCV ........................ Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) ......................................... Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ................ Grafik Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV ........................... Gambar Alat Penelitian ............................................................

xv

Halaman 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 57 59 60 61 62 63 64


DAFTAR ISTILAH

APS ATP IPTG IV HCV LB MOPS OD SDS-PAGE TEMED W

: Ammonium Per Sulfat : Adenosin Trifosfat : Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase : Inner volum : Hepatitis C Virus : Media Luria - Bertani : 4-asam morfolinopropana sulfonat : Optical Density : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis : N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin : Washing

xvi


BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Virus hepatitis C (HCV) menginfeksi lebih dari 170 juta orang di seluruh dunia. HCV mengakibatkan peradangan hati, sirosis hati, dan kanker hati (hepatocellular carcinoma) (Lee et al, 2010). Pasien yang menderita hepatitis C akut dapat berkembang menjadi infeksi kronis. Hal ini yang menyebabkan kematian ratusan ribu penderita setiap tahun (Kawo et al, 2012). Menurut data Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, pada tahun 2010 jumlah penderita hepatitis C di Indonesia cukup tinggi sekitar 30 juta jiwa (Kemenkes RI, 2010). Hingga saat ini belum ada vaksin dan obat untuk mencegah dan mengobati infeksi HCV. Terapi pengobatan saat ini untuk hepatitis C kronis adalah pegylated interferon-α (IFN-α) dikombinasi dengan nukleosida analog ribavirin. Akan tetapi terapi ini memiliki tingkat efektivitas sekitar 40% – 50% terhadap infeksi HCV. Kombinasi ini memiliki efek samping seperti flu, anemia, dan depresi, yang sering menyebabkan penghentian terapi. Dengan demikian, diperlukan penelitian untuk menemukan agen baru dengan indeks terapi tinggi dan efek samping minimal untuk mengobati infeksi HCV kronis (Lee et al, 2010, Ravikumar et al, 2011). Upaya penemuan obat penyakit infeksi HCV diantaranya adalah dengan pencarian inhibitor terhadap enzim yang essensial untuk replikasi virus HCV salah satunya adalah RNA helikase. RNA helikase berperan dalam pembukaan untai ganda RNA. RNA helikase memiliki tiga aktivitas yaitu, aktivitas ikatan RNA (RNA binding), pengikatan ATPase (RNA-stimulated ATPase), dan pembukaan rantai RNA. Proses pembukaan untai ganda RNA virus sebagai materi genetik apabila tidak dilakukan, maka proses translasi informasi genetik tidak dapat berjalan, sehingga siklus hidup HCV terhenti. Hal ini menujukkan bahwa dengan penghambatan enzim RNA helikase HCV, maka dapat dikembangkan potensi penemuan obat anti HCV (Utama et al, 2000). 1


2

Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi saat ini menjadikan obat herbal cukup menjadi perhatian untuk dikembangkan menjadi bagian dari pengobatan formal di Indonesia (Wasito, 2011). Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan tanaman tropis yang memiliki aktivitas biologis yang menarik dengan aplikasi terapi yang potensial. Manggis banyak dibudidayakan di hutan hujan tropis seperti Indonesia, yang secara tradisional digunakan untuk pengobatan sakit perut, diare, astringent, disentri, infeksi luka, nanah, maag kronis, keputihan dan gonore (kencing nanah) (Moongkarndi et al, 2003). Spesies Garcinia dikenal kaya metabolit sekunder, seperti santon. Santon ditemukan dalam kulit buah, buah utuh, kulit kayu, dan daun manggis (Chaverri et al, 2008). Pada kulit buah manggis terdapat senyawa tanin, santon, isoflavon, flavon, dan senyawa bioaktif lainnya (Yu et al, 2006). Senyawa bioaktif yang terkandung dalam ekstrak kulit buah manggis telah diteliti memiliki aktivitas sebagai anti oksidan, anti tumor, anti inflamasi, anti alergi, anti bakteri, anti fungi, anti virus, dan anti malaria (Chaverri et al, 2008). Sedangkan penelitian terdahulu mengenai anti virus yaitu ekstrak etanol sampel Garcinia mangostana L. memiliki potensi sebagai inhibitor HIV-1 protease (Chen et al, 1996) dan inhibitor HIV-1 reverse transkriptase (Chin et al, 2008). Berdasarkan hal tersebut, maka penelitian ini dilakukan untuk menguji aktivitas ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

1.2 Rumusan Masalah Belum diketahui apakah ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) memiliki aktivitas sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

1.3 Hipotesis Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) mampu berperan sebagai inhibitor enzim RNA helikase virus hepatitis C. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3

1.4 Tujuan Penelitian Mengetahui aktivitas ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.

1.5 Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai pemanfaatan bahan alam, khususnya kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai inbitor RNA helikase virus hepatitis C.


BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2. 1. Manggis (Garcinia mangostana L.) 2.1.1 Klasifikasi Tanaman Menurut United States Departement of Agricultural, klasifikasi dari Manggis (Garcinia mangostana L. ) adalah sebagai berikut : Kingdom

: Plantae

Sub Kingdom

: Tracheobionta

Super Divisi

: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Sub Kelas

: Dilleniidae

Ordo

: Theales

Famili

: Clusiaceae

Genus

: Garcinia

Spesies

: Garcinia mangostana L.

2.1.2 Nama Daerah Manggis dalam bahasa Belanda disebut

manggistan, Perancis

mangoustan, sedangkan dalam bahasa Inggris adalah mangosteen. Di Indonesia sendiri di Aceh dikenal dengan nama manggoita, Batak dikenal dengan nama manggisto, manggus, atau manggusta, di Jawa manggis, di Sunda disebut manggu, dan secara keseluruhan di Indonesia dikenal dengan nama manggis (Heyne, 1987).

2.1.3 Penyebaran Geografi Manggis tersebar di Asia Tenggara, yaitu dari Indonesia ke Timur sampai Nugini dan Kepulauan Mindanao (Filipina), dan ke Utara melalui Semenajung Malaysia ke bagian selatan Thailand, Myanmar, Vietnam, dan 4


5

Kamboja. Hanya dalam 2 abad terakhir tanaman ini tersebar ke negara-negara tropis lainnya, termasuk Sri Lanka, India Selatan, Amerika Tengah, Brazil, dan Australia (Verheij, 1997). Di Indonesia, ditanam diseluruh Nusantara, di Jawa dapat ditemukan hampir semua desa di bawah ketinggian 1500 m diatas permukaan laut (Heyne, 1987).

2.1.4 Deskripsi Manggis merupakan pohon yang bersifat dioesis, tingginya 6 - 25 m, berbatang lurus, bercabang-cabang simetris, membentuk tajuk piramid beraturan, sesuai dengan model arsitektur Attims. Semua bagian tanaman mengeluarkan getah kuning jika dilukai. Daunnya berhadapan, dengan tangkainya yang memeluk pucuk, sehingga pasangan teratas menutupi kuncup terminalnya, lembaran daun berbentuk lonjong atau jorong, berukuran (15-25) cm x (17-13) cm, menjangat dan tebal, pinggirannya rata, bagian ujungnya loncos (cuspidate), lembaran sebelah bawah berwarna hijau-kuning, dengan urat tengah yang hijau muda, menonjol pada kedua belah daun, dan memiliki banyak samping yang menonjol dan berjarak sama. Bunga-bunganya menyendiri atau tidak berpasang-pasangan, berada di ujung ranting, bergagang pendek dan tebal, berdiameter kira-kira 5,5 cm; daun kelopak 4 helai, tersusun dalam 2 pasang; daun mahkota 4 helai juga, tebal dan berdaging, berwarna hijau-kuning, dengan pinggiran kemerah-merahan; benang sari semu biasanya banyak, berseri 1 – 2, panjangnya kira-kira 0,5 cm; bakal buah tak bertangkai, berbentuk agak bulat, beruang 4 – 8. Buahnya bertipe buah buni yang bulat dan berkulit licin, berdiameter 4 – 7 cm, sewaktu matang berubah menjadi lembayung tua, dengan daun kelopak yang tetap menempel dan tetap dihiasi oleh cuping kepala putik; daging buah tebalnya kira-kira 0,9 cm, berwarna lembayung; 0 – 3 ruang berisi biji yang berkembang sempurna, terbungkus oleh aril yang berwarna putih (Verheij, 1997).


6

2.1.5 Kandungan Kulit buah manggis kaya akan pektin, dan juga berisi tanin, katekin, rosin, dan zat warna hitam (Verheij, 1997). Yu et al, 2007 menyebutkan bahwa kulit buah manggis mengandung senyawa tanin, santon, isoflavon, flavon, dan senyawa bioaktif lainnya, sedangkan dalam penelitian Pasaribu et al, 2012 dilaporkan bahwa ekstrak etanol kulit buah manggis mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid. Metabolit sekunder khas yang melipah pada kulit buah manggis adalah santon (Yu et al, 2007). Menurut Chaverri et al, 2008 pada manggis terdapat konstituen utama santon seperti αmangostin,

β-mangostin,

γ-mangostin,

gartanine,

garcinone

E,

8-

deoxygartanine. Sedangkan pada penelitian lain juga disebutkan bahwa konstituens

utama

yang

diperoleh

dari

kulit

buah

manggis

adalah

tetrahydroxanthone, garcimangosxanthone (Zhang et al, 2010).

2.1.6 Kegunaan Kulit Buah Manggis memiliki banyak kegunaan, yaitu sebagai astringen, berupa obat dalam bentuk seduhan ataupun dikeringkan dan digerus menjadi serbuk. Sebagai obat luar antara lain injeksi annal pencuci perut. Obat seduhan digunakan untuk mengobati diare, disentri kronis, peradangan saluran kemih kronis, pendarahan usus, dan sebagai obat cacing. Penggunaan luar untuk wasir, terhadap borok, terhadap tonsil bengkak, tumor rongga mulut dan kerongkongan, pembentukan ludah berlebihan, beser putih (flour albus) dan sebagainya (Heyne, 1987). Sedangkan berdasarkan penelitian, santon yang merupakan kandungan utama kulit buah manggis, dilaporkan memiliki aktivitas sebagai anti oksidan, anti inflamasi, anti kanker ( kanker payudara, kanker hati, kanker darah, dan kanker paru-paru), anti tumor, anti alergi, anti bakteri, anti fungi, anti virus, dan anti malaria (Zhang et al, 2010, Wang et al, 2011, Chaverri et al, 2008).


7

2.2 Ekstraksi 2.2.1 Metoda Ekstraksi Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif suatu simplisia dengan menggunakan pelarut tertentu. Pemikiran metode ekstraksi senyawa bukan atom dipergunakan oleh beberapa faktor, yaitu sifat jaringan tanaman, sifat kandungan zat aktif serta kelarutan dalam pelarut yang digunakan. Prinsip ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam senyawa non polar. Secara umum ekstraksi dilakukan secara berturut-turut mulai dengan pelarut non polar (n-heksan) lalu pelarut yang kepolarannya menengah (diklor metan atau etil asetat) kemudian pelarut yang bersifat polar (metanol atau etanol) (Chaudri, 2001). Prosedur Ekstraksi : (Tiwari et al, 2011) 1. Plant tissue homogenization (Homogenisasi Jaringan Tumbuhan) Homogenisasi Jaringan Tumbuhan menggunakan pelarut telah banyak digunakan dalam penelitian. Simplisia kering maupun basah, dihaluskan menjadi serbuk, sejumlah tertentu pelarut dimasukkan dan dikocok selam 510 menit atau didiamkan hingga 24 jam kemudian ekstrak disaring dan filtratnya dikeringkan dalam vakum. 2. Exhautive extraction Merupakan

metoda

umum

yang

lain

ekstraksi

berturut-turut

menggunakan peningkatan polaritas pelarut, dari pelarut yang tidak polar (heksan) menjadi pelarut polar (metanol). Untuk memastikan berbagai macam polaritas senyawa dapat diekstraksi. Beberapa penelitian menggunakan ekstraksi soxlet dari simplisia kering menggunakan pelarut organik. Metoda ini tidak dapat digunakan pada senyawa termolabil, karena pemanasan yang berkepanjangan dapat menyebabkan degradasi senyawa. 3. Ekstrasi soxlet Ekstraksi soxlet hanya digunakan pada senyawa yang memiliki kelarutan tertentu dan adanya pengotor yang larut dalam suatu pelarut. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

8

Apabila senyawa yang diinginkan memiliki kelarutan kelarutan yang tinggi dalam pelarut maka dapat menggunakan filtrasi sederhana dengan memisahkan senyawa dari pengotor yang tidak larut. Metode ini tidak dapat digunakan pada senyawa termolabil, karena pemanasan yang berkepanjangan dapat menyebabkan degradasi senyawa. 4. Maserasi Serbuk simplisia diberi pelarut dalam wadah tertutup dan dilakukan pengadukan hingga senyawa terekstrak dalam pelarut. Metode ini sesuai digunakan untuk senyawa termolabil. 5. Dekok Metode ini digunakan untuk senyawa yang larut dalam air dan stabil dalam pemanasan. Simplisia direbus dalam air selama 15 menit. 6. Infus Simplisia dimaserasi dengan waktu singkat menggunakan air dingin atau mendidih. 7. Digesti Digesti merupakan jenis maserasi yang menggunakan suhu hangat selama proses ekstraksi. 8. Perkolasi Prosedur ini paling sering digunakan mengekstraksi senyawa aktif dalam simplisia. Pelarut ditambahkan untuk membasahi simplisia dan didiamkan selama 4 jam dalam perkolator yang tertutup. Sejumlah tertentu pelarut ditambahkan kembali hingga simplisia terendam dalam perkolator dan didiamkan selama 24 jam , selanjutnya perkolator dibuka dan cairan dibiarkan menetes perlahan. 9. Sonikasi Prosedur ini menggunakan gelombang ultrasonik dengan frekuensi antara 20-2000 kHz, hal ini menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding


9

sel. Kelemahan dari prosedur ini adalah terjadinya efek yang merusak senyawa aktif dari simplisia dengan pembentukan radikal bebas.

2.2.2 Parameter Ekstrak 1. Susut pengeringan Susut pengeringan adalah pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada temperatur 105°C selama 30 menit atau sampai berat konstan yang dinyatakan sebagai nilai persen (%). Tujuannya untuk memberikan batasan maksimal (rentang) tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Nilai untuk susut pengeringan jika tidak dinyatakan lain adalah kurang dari 10% (Depkes RI, 2000). 2. Kadar Abu Untuk penentuan kadar abu, bahan dipanaskan pada temperatur dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera dalam monografi (Depkes RI, 2000).

2.3 Virus Hepatitis C Hepatitis merupakan penyebab peradangan hati. Hepatitis dapat disebabkan oleh virus hepatotropik (hepatotropic virus), yang terutama mempengaruhi sel-sel hati, mekanisme autoimun, atau gangguan sistemik lainnya. Virus hepatotropik meliputi virus hepatitis A (HAV), virus hepatitis B (HBV), hepatitis B terkait virus delta (HDV), virus hepatitis C (HCV), dan hepatitis E virus (HEV). Meskipun semua virus tersebut menyebabkan hepatitis akut, namun berbeda dalam modus penularan dan masa inkubasi; mekanisme, derajat, dan kronisitas kerusakan hati; dan kemampuan untuk masuk ke keadaan karier (Porth, 2009). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

10

HCV adalah penyebab paling umum dari hepatitis kronis, sirosis, dan kanker hepatoseluler di dunia. Sekitar 3,9 juta orang Amerika memiliki antibodi terhadap HCV, dan 70% dari orang-orang ini memiliki bukti infeksi kronis yang ditentukan oleh adanya DNA dalam serum darah. Sebelum tahun 1990, penularan HCV tejadi melalui transfusi darah, hubungan seksual, dapat juga ditularkan melalui jarum suntik, sedangkan penularan dari ibu ke janinnya terjadi sekitar 4,6% - 10% (Porth, 2009). HCV adalah virus RNA beruntai tunggal yang memiliki sifat mirip dengan Flavivirus, sebuah genus dari keluarga Flaviviridae seperti demam kuning dan virus ensefalitis St Louis. Genom ini berisi reading frame tunggal terbuka yang menyandikan poliprotein dari sekitar 3000 asam amino. Virus ini secara genetik tidak stabil, yang menyebabkan beberapa genotip dan sub tipe. Keanekaragaman

genotip

berperan

pada

patogenisitas

virus,

yang

memungkinkan terjadinya kesulitan dalam pengembangkan obat dan penemuan vaksin ( Porth, 2009).

Gambar 2. 1. Struktur virus hepatitis C (HCV) (Solga et al, 2007)


11

Masa inkubasi untuk infeksi HCV berkisar 2 - 26 minggu (rata-rata, 6 sampai 12 minggu). Anak-anak dan orang dewasa yang terinfeksi biasanya tidak menunjukkan gejala (60% sampai 70%) atau memiliki gejala yang tidak spesifik ditandai dengan kelelahan, malaise, anoreksia, dan penurunan berat badan. Jaundice (penyakit kuning) jarang terjadi, dan hanya 25% sampai 39% orang dewasa memiliki gejala ini. Gejala ini biasanya berlangsung selama 2 sampai 12 minggu. Gagal hati fulminan jarang terjadi dan hanya beberapa kasus telah dilaporkan. Sebagian kecil dari orang-orang yang baru terinfeksi HCV akan sembuh dari infeksi, tetapi sebagian besar (60% sampai 85%) terus berkembang menjadi hepatitis kronis (Porth, 2009). Pengobatan pada penderita hepatitis C kronis adalah kombinasi pegylated interferon (alfa-2b atau alfa-2a) ditambah ribavirin (Porth, 2009). Ribavirin adalah analog guanin yang di fosforilasi dalam sel oleh enzim sel penjamu. Meskipun mekanisme kerjanya belum sepenuhnya jelas, ribavirin tampaknya menggangu sintesis guanin trifosfat, menghambat capping mRNA (RNA perantara) virus, dan menghambat polimerase RNA. Ribavirin trifosfat menghambat replikasi sejumlah besar virus DNA dan RNA, termasuk influenza A dan B, parainfluenza, respiratoty syncytial virus, paramiksovirus, HCV, dan HIV-1 (Katzung, 2010). Pengobatan dengan pegylated interferon dan ribavirin memerlukan biaya yang besar, dan memiliki efek samping, gejala seperti flu merupakan gejala yang umum terjadi. Efek samping yang lebih serius, yang meliputi gejala kejiwaan (depresi), disfungsi tiroid, dan depresi sumsum tulang. Transplantasi hati adalah pilihan pengobatan untuk penyakit hati stadium akhir akibat virus hepatitis. Meskipun terkadang terjadi infeksi baru, penyakit ini tampaknya berkembang lebih lambat (Porth, 2009).


12

2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C Helikase merupakan protein pertama kali ditemukan pada Escherichia coli pada tahun 1976. Selanjutnya RNA dan DNA helikase dengan fungsi yang beragam telah ditemukan di semua organisme. Helikase dapat mengikat dan menghidrolisis untai komplemeter dari untai ganda asam nukleat, atau mengkatalisis homolog DNA rekombinan. Fungsi helikase juga diperlukan untuk replikasi, dan rekombinasi genom. Demikian pula, fungsi helikase memfasilitasi proses metabolisme RNA seperti transkripsi, biogenesis ribosom, translasi, penyambungan RNA (RNA splicing), tranportasi RNA (RNA transport), dan degradasi RNA (RNA degradation) (Patel and Donmez, 2006). Virus hepatitis C adalah virus RNA beruntai tunggal yang diklasifikasikan ke dalam genus Hepacivirus, famili Flaviviridae. HCV memiliki genom 9,6 kb yang menyandikan poliprotein tunggal. HCV terdiri dari empat protein struktural (C, E1, E2, dan p7) dan enam protein nonstruktural (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A dan NS5B) (Lee et al., 2010). Protein non struktural tersebut berfungsi dalam reaksi enzimatis yang berperan dalam replikasi virus. NS1 berinteraksi dengan NS4 dibutuhkan untuk replikase RNA. NS2A bersifat hidrofobik berfungsi dalam perakitan virion (partikel virus baru) dan pelepasan partikel virus. NS2B membentuk kompleks dengan NS3 berperan sebagai kofaktor bagi serin protease dari NS3. Protein NS3 mengkodekan RNA helikase yang berperan dalam replikase virus. NS5A merupakan daerah yang sensitif terhadap interferon, sedangkan NS5B berperan dalam aktivitas RNA-dependent RNA polimerase (RdRp) (Tellinghuisen et al, 2007).


13

5’

C

Protein Struktural

E1

E2

P7

Protein Nonstruktural

NS2

NS3

NS4A

Protein transmembran

Nukleokapsid Pelindung Glikoprotein

NS4B

3’

NS5A

Kofaktor

Metalloprotease Serin protease RNA helikase

NS5B

RNA Polimerase Protein resisten IFN

Gambar 2.2. Peta genomik RNA helikase HCV (Tellinghuisen et al, 2007)

Gambar 2.4. Mekanisme kerja RNA helikase HCV (Utama et al, 2005)


14

Mekanisme kerja RNA helikase HCV secara umum adalah pertamatama helikase akan berikatan pada ujung 3’ RNA utas ganda. Tahap kedua, ATP akan berikatan pada sisi aktif RNA helikase dan dihidrolisis pada gugus fosfat terluar menghasilkan ADP dan fosfat anorganik (Pi). Pada proses hidrolisis ATP ini mengeluarkan energi yang cukup besar dan digunakan untuk memisahkan RNA utas ganda menjadi utas tunggal. Pemisahan RNA utas ganda dilakukan dengan pemutusan ikatan hidrogen yang mengikat kedua utas tersebut. Pembukaan ikatan utas ganda tersebut sangat berperan dalam replikasi dan kelangsungan hidup HCV, apabila tidak berlangsung maka siklus hidup HCV terhenti (Utama et al, 2005). RNA helikase HCV saat ini menjadi target obat yang essensial untuk infeksi virus hepatitis C. Oleh karena itu terjadi pengembangan riset dalam mencari agen yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase. Berikut tabel riset mengenai agen yang digunakan sebagai inhibitor RNA helikase HCV.

Tabel 2.1. Inhibitor RNA helikase HCV No Inhibitor

Persen

Pustaka

Inhibisi 1

Protein kapang endofit CgKTm SF

89,45%

Paturohman, 2011

2

Ekstrak metanol buah tanaman

76,705 %

Kusumawati, 2011

mangrove Avicennia marina (Forsk) Vierb. 3

Mikroalga BTM 11

81,205 %

Putri, 2011a

4

Bakteriosin asam laktat S34

64,20 %

Putri, 2011b.

5

Ekstrak rimpang temulawak

73,60 %

Setianingsih, 2011

(Curcuma zanthorrhiza Roxb.)


15

2.5 Kolorimetri ATPase Uji kolometrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang tidak menyerap cahaya. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi yang berwarna seperti malachite green dan amonium molibdat. Uji ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP menjadi ADP dan P, yang dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Prinsip uji kolorimetrik adalah perubahan warna yang muncul karena suatu zat warna tidak berwarna ditambah dengan pereaksi sehingga produknya berwarna (Utama et al, 2000).

2.6 SDS - PAGE SDS-PAGE (Sodium dedocyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) adalah suatu teknik yang banyak digunakan dalam biokimia, forensik, genetika, dan biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas elektroforesis (fungsi dari panjang rantai polipeptida atau bobot molekul). Sampel elektroforesis gel SDS memiliki muatan identik per satuan massa akibat pengikatan sampel dengan SDS dan di fraksinasi berdasarkan ukuran (Deyl, 1983). Prinsip elektroforesis gel SDS poliakrilamid adalah protein yang akan dianalisis dicampur dengan SDS yang merupakan sebuah deterjen anionik. Soodium dodesil sulfat mendenaturasi struktur tersier, sekunder dan ikatan nonsulfida. Elektroforesis gel SDS poliakrilamid menerapkan muatan negatif untuk setiap protein dalam proporsi dengan massanya. Pemanasan sampel pada suhu kurang lebih 60°C memecah molekul dan membantu SDS untuk mengikat sampel. Penanda berupa pewarna dapat ditambahkan ke dalam larutan protein untuk memungkinkan eksperimen dalam melihat migrasi protein melalui gel selama elektroforesis dijalankan. Pewarna berukuran lebih kecil dibandingkan ukuran protein (Laemmeli, 1970)


16

Medan Listrik listrik diterapkan di seluruh gel, menyebabkan protein bermuatan negatif bermigrasi di gel menuju anoda. Setiap protein akan bergerak secara berbeda melalui matriks gel. Protein pendek akan lebih mudah melalui pori-pori pada gel, sedangkan yang lebih besar akan memiliki sulit melalui pori. Setelah mencapai waktu yang ditentukan, protein akan bermigrasi berdasarkan ukuran. Protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauah di bawah gel, sedangkan yang lebih besar akan lebih dekat ke titik asal. Oleh karena itu, protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekulnya. Glikoprotein tertentu berperilaku sebaliknya pada gel SDS. Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam yaitu Comassie Brilliant Blue biasanya dapat mendeteksi pita protein dengna konsentrasi 50 mg protein. Pewarnaan perak (Silver Staining) meningkatkan sensitivitas pewarnaan biasanya 50 kali. Banyak variabel yang dapat mempengaruhi intensitas warna. Setiap protein memiliki karakteristik pewarnaan sendiri (Hempelmann, 1984).


BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pharmacy Drug and Research (PDR), Laboratorium Pharmacy Natural Analyzing (PNA), dan Laboratorium Pharmacy Medicinal Chemitry (PMC) Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium

Bakteriologi

dan

Virologi

Molekuler,

Pusat

Penelitian

Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor, pada bulan Juni sampai dengan September 2012.

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator (Eyela), autoklaf tipe vertikal (mode TA – 630), ultrasentrifus (Sorvall RC - 26 plus), microplate reader (Multiscan EX Thermo), microtiter plate (Polycarp), pipet mikro (Gilson), Laminar Air Flow (ESCO), sonikator (LabSonic), shaker incubator (N-Biotek), freezer -20°C (Sansio), SDS-PAGE [ATTO], hot plate magnetic stirrer (Cimarec), timbangan analitik (Acis), tabung 1,5 mL (Eppendorf), tabung 50 mL (Falcon), spatula, erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur (Duran), corong (Duran), dan kertas saring.

3.2.2

Bahan Kulit buah manggis, n-heksan teknis, etil asetat teknis, metanol teknis, bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS - RNA helikase HCV rekombinan (koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), akuades, media Luria-Bertani (LB), ampisilin, IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase) 0,3 M, dapar B (Tris HCl 10 mM pH 8,5, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%), resin TALON, 17


18

dapar elusi (imidazola 400 mM dalam bufer B), Tris-HCl 1,5 M pH 8,8, akrilamid 30%, sodium dedosil sulfat (SDS) 10%, TEMED, amonium persulfat (APS) 10%, comassie blue, loading dye, adenosin trifosfat (ATP) 0,1 mM, 4asam morfolinopropana sulfonat (MOPS) 0.1 mM, MgCl2 1 mM, larutan malachite green, polivinil alkohol 2,3%, amonium molibdat, natrium sitrat, dan metanol absolut.

3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Pengambilan Sampel Buah manggis (Garcinia mangostana L.) diperoleh dari Kecamatan Wanayasa, Kabupaten Purwakarta, Provinsi Jawa Barat. Adapun bagian yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah (pericarp) manggis. 3.3.2 Determinasi Sampel Determinasi buah manggis (Garcinia mangostana L.) dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong.

3.3.3 Pembuatan Simplisia Buah manggis (Garcinia mangostana L.) sebanyak 5 kg disortir dan dibersihkan dari kotoran yang melekat dengan air mengalir, lalu ditiriskan agar terbebas dari sisa air cucian. Kemudian bagian kulit buahnya (pericarp), dirajang tipis, dan diangin-anginkan di udara terbuka hingga kering. Simplisia yang sudah kering kemudian digiling dan diayak untuk mendapatkan serbuk halus, lalu simplisia disimpan pada wadah yang kering dan tertutup rapat.

3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) dimaserasi dengan 5 x 800 mL n-heksan teknis yang telah didestilasi, selama 3 hari. Hasil maserasi disaring dan filtrat yang diperoleh UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

19

dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu lebih kurang 45°C, sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan. Ampas n-heksan yang diperoleh diuapkan di udara terbuka hingga kering, kemudian dilakukan kembali maserasi berturutturut dengan pelarut etil asetat dan metanol. Kemudian filtrat diuapkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan metanol yang kemudian ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat simplisia awal (Materia Medika, 1989). Rendemen =

( )

( )

x 100%

3.3.5 Penapisan Fitokimia 1. Identifikasi Alkaloid Ekstrak ditambahkan dengan 5 mL ammonia 30%, digerus dalam mortir, lalu tambahkan 20 mL kloroform dan digerus kembali dengan kuat, campuran tersebut disaring dengan kertas saring, filtrat berupa larutan organik di ambil (sebagai larutan A), sebagian dari larutan A (10 mL) diekstraksi dengan 10 mL larutan HCl 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambil larutan bagian atasnya (larutan B). Larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring dan disemprot atau ditetesi dengan pereaksi Draggendorff, terbentuk warna merah ataupun jingga pada kertas saring menunjukan adanya senyawa alkaloid. Larutan B dibagi dalam 2 tabung reaksi, ditambahkan masing-masing pereaksi Dragendrorff dan Mayer, terbentuk endapan merah bata dengan pereaksi Dragendrorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukan adanya senyawa golongan alkaloid (Farnsworth, 1966). 2. Identifikasi Flavonoid Ekstrak ditambahkan 100 mL air panas, kemudian dididihkan selama 5 menit dan disaring dengan kertas saring. Sebanyak 5 mL filtrat yang didapat ditambahkan serbuk atau lempeng magnesium dan 1 mL HCl pekat serta 5 mL amil alkohol, kemudian dikocok dengan kuat, dibiarkan hingga memisah.


20

Terbentuknya warna dalam larutan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Farnsworth, 1966). 3. Identifikasi Saponin Ekstrak ditambahkan 10 mL akuades dalam tabung reaksi. Kemudian diguncang selama 1 - 2 menit. Adanya saponin diindikasikan oleh terbentuknya buih setinggi 1 cm yang stabil selama 30 menit (El Kamali et al, 2010). 4. Identifikasi Tanin Ekstrak dilarutkan dalam 20 mL akuades. Filtrat sebanyak 2 mL ditambahkan 3 tetes FeCl3 10%. Terbentuknya warna biru kehitaman atau hijau kehitaman mengindikasikan adanya tanin. Cara yang lain adalah 2 mL filtrat ditambahkan 1 mL larutan brom, apabila terdapat endapan maka positif mengandung tanin (Adegboye et al, 2008). 5. Identifikasi Steroid Ekstrak dilarutkan dalam 3 mL CHCl3 kemudian disaring. H2SO4 ditambahkan ke dalam filtrat. Terbentuknya cincin coklat kemerahan menandakan positif adanya steroid (Magadula and Tewtrakul, 2010). 6. Identifikasi Kumarin Ekstrak dilarutkan dalam air panas. Setelah dingin, larutan dibagi ke dalam dua tabung reaksi yaitu tabung 1 sebagai blanko dan tabung 2 ditambah 0,5 mL NH3 10%. Adanya pijaran yang kuat dibawah sinar UV menunjukkan adanya kumarin dan turunannya (Indrayani et al, 2006).

3.3.6 Penetapan Parameter Spesifik dan Non Spesifik Ekstrak Kulit Buah Garcinia mangostana L. 1. Pemeriksaan organoleptik Pemeriksaan organoleptik dilakukan menggunakan pancaindra untuk mendeskripsikan bentuk, warna, dan bau dari ekstrak kulit buah manggis.


21

2. Susut Pengeringan Ekstrak kulit buah manggis ditimbang dengan seksama sebanyak 1 gram dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105°C selama 30 menit dan telah ditara. Ekstrak diratakan dalam botol timbang dengan menggoyang-goyangkan botol, hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm, kemudian dimasukkan ke dalam oven, dibuka tutupnya. Pengeringan dilakukan pada suhu penetapan 105°C hingga diperoleh bobot tetap lalu ditimbang. Sebelum setiap pengeringan, botol dibiarkan dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar (Depkes RI, 2000). 3. Kadar Abu Ekstrak ditimbang seksama sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, lalu ekstrak diratakan. Dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, lalu ditimbang. Jika arang tidak dapat hilang, ditambahkan air panas, disaring dengan menggunakan kertas saring bebas abu. Dipijarkan sisa abu dan kertas saring dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan, dipijarkan hingga bobot tetap lalu ditimbang. Ditimbang kadar abu terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 2000).

3.3.7 Produksi RNA helikase virus hepatitis C (HCV) (Utama et al, 2000) Media LB (Luria –Bertani) dibuat dengan volume 10 mL dan 400 mL (lampiran 9a). Perkultur dibuat dalam media LB sebanyak 10 mL. Media LB diberi ampisilin (100 µg/mL) sebanyak 10 µL dan dihomogenkan. Lalu diinokulasikan bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase rekombinan, kemudian diinkubasi dalam shaker incubator pada temperatur 37 °C dengan kecepatan 200 rpm selama semalam. Hasil prekultur diinokulasikan ke dalam 400 mL medium LB yang telah diberi ampisilin (100 µg/mL) sebanyak 410 µl, kemudian diinkubasi dalam UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

22

shaker incubator pada temperatur 37 °C dengan kecepatan 150 rpm, selama 30 menit atau hingga OD600 (optical density) mencapai ± 0,3. Selanjutnya ditambahkan 0,3 M IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase), kemudian diinkubasi dalam shaker incubator pada temperatur 37°C dengan kecepatan 150 rpm selama 3 jam atau hingga OD600 mencapai ± 1. Hasil kultur disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 4.000 rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensi dengan sisa medium LB cair, kemudian disentrifugasi kembali. Pelet yang terbentuk disimpan dalam temperatur -20°C. Pelet hasil sentrifugasi selanjutnya dikeringbekukan (freeze-thawing) sebanyak tiga kali. Pelet diresuspensi dengan dapar B kemudian disonikasi sebanyak 3 kali pengulangan dengan amplitudo 40; siklus 0,5; selama 15 detik, dengan interval waktu 1 menit. Suspensi sel disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang diperoleh kemudian dipurifikasi dengan kromatografi afinitas. Supernatan ditambahkan dengan 300 µL resin TALON (resin ekuilibrasi), kemudian diinkubasi pada rotator cold room (4°C) selama 3 jam, kemudian disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 7 menit. Supernatan yang terbentuk diambil sebagai inner volume (IV) disimpan pada temperatur 4°C untuk SDS-PAGE. Pelet diresuspensi dengan 10 mL larutan dapar B dan disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebagai washing 1. Pelet yang terbentuk kemudian diresuspensi kembali dengan 10 mL larutan dapar B dan disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebagai washing 2. Hasil washing 1 (W1) dan washing 2 (W2) kemudian disimpan pada temperatur 4°C dan digunakan pada SDSPAGE. Pelet kemudian dielusi untuk melepaskan enzim yang terikat pada resin dengan menambahkan 150 µL larutan dapar elusi dan diinkubasi pada rotator UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

23

cold room (4°C) selama satu malam. Kemudian disentrifugasi pada temperatur 4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh diambil sebagai elusi 1 (E1) sedangkan pelet ditambahkan 75 µL larutan dapar elusi kembali, kemudian diinkubasi pada rotator cold room (4°C) selama 1 jam. Kemudian disentrifugasi kembali pada temperatur 4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh diambil sebagai elusi 2 (E2).

3.3.8 Konfirmasi kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan SDS – PAGE Plat kaca yang digunakan terdiri dari short plate & spacer plate dibersihkan dengan alkohol 70%. Short plate ditempatkan di depan kaca spacer plate dan diberi casting frame pada bagian tengah dengan dikunci dengan menggunakan casting stand. Selanjutnya dibuat larutan gel separating (lampiran 8a). Larutan tersebut dimasukan di antara celah short plate & spacer plate sampai dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan akuades. Kemudian ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 20 menit. Selanjutnya larutan gel stacking dibuat sesuai prosedur (lampiran 8b). Akuades pada gel separating dibuang dan diisikan dengan larutan stacking, kemudian dipasang comb, ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 20 menit. Gel dipindahkan dari casting frame dengan cara menekan cams pada casting frame. Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap dalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber dimasukan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution (Dapar Elektroforesis SDS 1X pH 8.3). Masing-masing sampel yang diperoleh pada produksi RNA helikase HCV (inner volum, whasing, dan elusi enzim) diambil 4 µl lalu dicampur dengan 2 µl loading dye (lampiran 8c). Campuran didenaturasi di water bath pada suhu 95˚ C selama 15 menit. Marker protein (BIORAD®) sebanyak 4 µl/gel dimasukan ke dalam well. Masing-masing sampel yang sudah dicampur UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

24

dengan loading dye, dimasukan ke dalam well sebanyak 5 µl/well.

Gel

dielektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Gel diangkat lalu direndam dalam Commasie Blue G-250 Staining Solution (lampiran 8d) selama 1 jam sambil digoyang-goyang di atas rocker. Gel dibilas dengan Commasie Blue G250 Destaining Solution (lampiran 8e) ± 20 menit, dilakukan dua kali. Gel dibilas dengan H2O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4°C.

3.3.9 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C (Utama et al, 2000) Uji aktivitas enzim RNA helikase dilakukan dengan metoda ATPase kolorimetri. Sebanyak 50 µL campuran reaksi yang mengandung 5 µL dapar MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV, dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well. Campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 45 menit. Sekitar 10 menit sebelum masa inkubasi selesai dibuat larutan pewarna yang terdiri dari 0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1 (lampiran 9d). Setelah masa inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well sebanyak 100 µL setiap sumur, kemudian di inkubasi selama 5 menit. Setelah masa inkubasi selesai, pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 25 µL Na sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan referensi 405 nm.

3.3.10 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA helikase HCV (Utama et al, 2000) Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase dilakukan dengan menggunakan ATPase kolorimetri. Sebelum dilakukan pengukuran absorbansi, terlebih dahulu ekstrak kulit buah manggis pada fase n-heksan, etil asetat, dan metanol masing-masing dilarutkan menggunakan metanol absolut dengan beberapa konsentrasi yaitu 100.000 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

25

ppm, 50.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 781 ppm, 391 ppm. Pada pengukuran absorbansi enzim RNA helikase ini dilakukan dengan menambahkan 5 µL ekstrak kulit buah manggis dengan berbagai konsentrasi pada setiap sumur dalam campuran reaksi. Volum akhir reaksi adalah 50 µL yang terdiri dari 45 µL campuran reaksi (5 µL dapar MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV). Reaksi kemudian dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 45 menit. Sekitar 10 menit sebelum masa inkubasi selesai dibuat larutan pewarna yang terdiri dari 0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah masa inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well sebanyak 100 µL setiap sumur, kemudian di inkubasi selama 5 menit. Setelah masa inkubasi selesai, pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 25 µL Na sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menghitung presentasi inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV. Perhitungan persen penghambatan sampel ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase dilakukan berdasarkan perhitungan :

% inhibisi =

–

x 100 %

Dimana : A = serapan enzim RNA helikase tanpa adanya senyawa inhibitor I = serapan enzim RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor.


BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Sampel Determinasi buah manggis dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong. Hasil determinasi menyatakan bahwa sampel buah manggis yang diperoleh dari Kecamatan Wanayasa, Kabupaten Purwakarta, Provinsi Jawa Barat, merupakan spesies Garcinia mangostana, famili Clusiaceae, keterangan hasil determinasi dapat dilihat pada lampiran 1.

4.2 Rendemen Ekstrak Ekstraksi yang digunakan adalah dengan cara maserasi. Ekstraksi dengan cara maserasi digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan. Keuntungan dari teknik ini adalah peralatan yang digunakan sederhana, sedangkan kerugiannya adalah pengerjaanya lama, pelarut yang digunakan banyak, serta proses penyarian yang kurang sempurna. Maserasi terhadap kulit buah manggis dilakukan dengan cara bertingkat dari pelarut non polar hingga polar, yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol. Hal ini bertujuan untuk menarik senyawa-senyawa yang bersifat non polar hingga polar yang terdapat pada kulit buah manggis. Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit buat manggis diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan teknis sebanyak 5 x 800 mL, masing -masing selama 3 hari. Hasil maserasi disaring dan filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu lebih kurang 45°C, sehingga diperoleh ekstrak kental n-heksan. Terhadap ampas n-heksan kemudian dilakukan kembali maserasi berturut-turut dengan pelarut etil asetat dan metanol. Kemudian filtrat diuapkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan metanol (Materia Medika, 1989). 26


27

Tabel 4.1 Hasil rendemen ekstrak kulit buah manggis Ekstrak

Bobot ekstrak kering

Rendemen

n-heksan

5,20 gram

1,06 %

Etil asetat

47,40 gram

9,67 %

Metanol

42,18 gram

8,61 %

Rendemen yang diperoleh dari proses ekstraksi terlihat pada tabel 4.1. Hasil perhitungan rendemen menunjukkan bahwa pelarut etil asetat memiliki nilai persentase rendemen tertinggi dibanding pelarut n-heksan dan metanol, dimana pelarut n-heksan memiliki nilai rendemen yang paling rendah. Berat ekstrak kering yang diperoleh menunjukkan bahwa pelarut yang digunakan mampu melarutkan bahan alami terseleksi dari padatannya. Dari hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa pelarut etil asetat lebih banyak melarutkan senyawa atau zat yang mempunyai potensi bioaktif. Prinsip pelarutan yang dipakai pada metode ini adalah like dissolve like, dimana prinsipnya adalah pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut non polar akan melarutkan senyawa non polar sesuai dengan pernyataan Melki (2003). Sehingga dapat dikatakan bahwa kulit buah manggis memiliki senyawa semi polar dan senyawa polar yang lebih banyak dibandingkan senyawa non polar. Pelarut yang digunakan bersifat volatil, sehingga pada saat filtrasi (penyaringan) diduga terdapat bagian pelarut yang menguap yang menyebabkan perbedaan jumlah rendemen yang dihasilkan. Faktor-faktor lain yang berpengaruh terhadap proses ekstraksi adalah lama ekstraksi, suhu, dan jenis pelarut yang digunakan (Ismet, 2007).


28

4.3 Penapisan Fitokimia Penapisan fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak kulit buah Garcinia mangostana bertujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak pada masing-masing pelarut. Menurut Pasaribu et al, 2012, dilaporkan bahwa ekstrak etanol kulit buah manggis mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid. Hasil identifikasi yang telah dilakukan memperlihatkan perbedaaan pada setiap pelarut yang digunakan. Hal ini diduga dikarenakan pelarut yang digunakan berbeda tingkat kepolarannya, sehingga berbeda pula senyawa yang terekstrak. Sesuai pernyataan Ismet (2007) yang menyatakan bahwa salah satu faktor yang mempengaruhi ekstraksi adalah jenis pelarut yang digunakan. Hasil penapisan fitokimia pada masing-masing ekstrak dapat dilihat pada tabel 4.2.

Tabel 4.2 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis Ekstrak

n-heksan

Etil asetat

Metanol

Alkaloid

+

+

+

Flavonoid

+

+

+

Steroid

+

+

-

Tanin

-

-

+

Saponin

-

-

+

Kumarin

-

+

+

Identifikasi senyawa alkaloid memberikan hasil positif pada ketiga ekstrak. Hasil ini ditunjukkan dengan adanya endapan merah bata pada masingmasing

ekstrak

dengan

penambahan

pereaksi

Dragendorff,

dan

juga

menghasilkan endapan putih ketika bereaksi dengan Mayer. Alkaloid merupakan golongan zat tumbuhan sekunder terbesar. Alkaloid mencakup senyawa yang bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen. Alkaloid sering beracun bagi manusia dan banyak memiliki aktivitas fisiologi sehingga secara UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

29

luas digunakan dalam bidang pengobatan sebagai anti mikroba, anti diare, dan antelmintik (obat cacing) (Harborne, 1987, Tiwari, 2011). Pada identifikasi senyawa flavonoid diperoleh hasil yang positif pada ketiga ekstrak. Uji flavonoid positif ditandai dengan terbentuknya warna pada lapisan amil alkohol. Pada ekstrak n-heksan dan etil asetat terbentuk warna kekuningan, sedangkan pada ekstrak metanol terbentuk warna jingga pada lapisan amil alkohol. Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol (Harborne, 1987). Flavonoid memiliki aktivitas anti mikroba dan anti diare, golongan senyawa ini dapat larut dalam etanol, metanol, dan aseton (Tiwari, 2011). Steroid merupakan tripterpen yang kerangka dasarnya sistem cincin siklopentana perhidropenantrena (Harborne, 1987). Secara farmakologi steroid memiliki aktivitas sebagai anti diare (Tiwari, 2011). Hasil identifikasi steroid terdapat pada ekstrak n-heksan dan etil asetat, ditandai dengan terbentuknya cincin coklat kemerahan pada sampel dalam kloroform yang ditambahkan asam sulfat. Sedangkan pada ekstrak metanol menunjukkan hasil yang negatif karena tidak terbentuk cincin merah. Menurut

Tiwari, 2011, senyawa golongan

steroid/triterpenoid dapat larut dalam air, etanol, metanol, kloroform, dan eter. Namun hasil identifikasi menunjukkan ekstrak metanol tidak terdapat steroid, hal ini dapat dikarenakan steroid/triterpenoid terkandung dalam jumlah yang sedikit, sehingga hanya terekstrak oleh n-heksan dan etil asetat. Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae terdapat khusus dalam jaringan kayu. Menurut batasannya, tanin dapat bereaksi dengan proteina membentuk kopolimer yang tak larut dalam air (Harborne, 1987). Hasil identifikasi tanin menunjukkan hasil positif pada ekstrak metanol, dengan terbentuknya warna biru kehitaman pada ekstrak yang diberi FeCl3. Sedangkan pada n-heksan dan etil asetat menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini sesuai dengan pernyataan Tiwari, 2011 yang menyebutkan bahwa tanin


30

merupakan golongan senyawa yang dapat larut dalam air dan metanol, sehingga pada penelitian ini tanin hanya terdapat pada ekstrak metanol. Saponin merupakan senyawa yang bersifat seperti sabun, serta dapat dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis sel darah (Harborne, 1987). Identifikasi senyawa saponin positif pada ekstrak metanol. Ekstrak metanol yang ditambahkan akuades kemudian dikocok selama 1 menit, memperlihatkan hasil yang positif yang ditandai dengan terbentuknya busa yang stabil. Tiwari, 2011 yang menyebutkan bahwa saponin merupakan golongan senyawa yang dapat larut dalam air dan metanol, sehingga pada penelitian ini tanin hanya terdapat pada ekstrak metanol. Saponin memiliki efek farmakologi sebagai anti diare, anti kanker, dan antelmintik (obat cacing). Kumarin merupakan senyawa fenol, yang memiliki aktivitas farmakologi sebagai antivirus dengan berinteraksi dengan DNA eukariot (Tiwari, 2011). Identifikasi kumarin menujukkan hasil positif pada ekstrak kulit buah manggis pada fase etil asetat dan metanol. Sampel yang berpendar berwarna kebiruan yang diamati pada sinar UV menunjukkan ekstrak etil asetat dan metanol mengandung kumarin.


31

4.4 Parameter Standar Ekstrak Parameter standar yang diidentifikasi dari kulit buah manggis dapat dilihat dari tabel 4.3. Tabel 4.3 Parameter Standar Ekstrak Jenis Karakteristik

Ekstrak

Ekstrak

Ekstrak

Menurut literatur

n-heksan

etil asetat metanol

Ekstrak

Ekstrak

Ekstrak

kental

kental

kental

Kuning

Kuning

Coklat

a.Susut pengeringan 0,5%

2,1%

9,3%

max10% (DepkesRI,2000)

0,4%

0,7%

2,2%

-

Parameter Spesifik : a.Organoleptik - Bentuk

-Warna

Parameter Non spesifik :

b. Kadar abu

4.5 Produksi RNA Helikase Virus Hepatitis C Produksi denganRNA helikase HCV dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan enzim RNA helikase yang murni yang digunakan sebagai komponen dalam penentuan aktivitas inhibisi terhadap aktivitas ATPase. Ekspresi RNA helikase dilakukan dengan cara mengultur bakteri Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase HCV. Tahapannya dimulai dengan pre kultur yang dilakukan dalam medium cair Luria-Bertani (LB) yang merupakan

media yang sesuai dengan bakteri

Escherichia coli, karena

mengandung zat kompleks (tripton, yeast extract, dan natrium klorida) untuk pertumbuhan bakteri. Media LB terlebih dahulu diberikan ampisilin yang berfungsi sebagai selection marker terhadap pertumbuhan E. coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang juga mengandung gen resisten UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

32

ampisilin, sehingga hanya bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang membawa gen RNA helikase HCV saja yang dapat tumbuh. Prekultur diinkubasi dalam inkubator goyang pada temperatur 37°C dengan kecepatan 200 rpm selama semalam, kondisi ini merupakan kondisi optimum untuk pertumbuhan bakteri (Pelzar & Chan,1986). Tahap berikutnya merupakan pemindahan kultur pada medium LB yang lebih besar, medium yang telah diberi ampisilin kemudian ditambahkan pre kultur dan diinkubasi kembali pada temperatur 37°C dengan kecepatan 200 rpm hingga nilai OD600 (optical density) mencapai 0,3 atau pada saat bakteri mencapai fasa logaritmik, fase ini merupakan fasa awal dimana bakteri Escherichia coli tumbuh.

Pada

fasa

ini,

kultur

ditambahkan

IPTG

(Isopropyl-β-D-

Thiogalaktopiranosidase) sebagai penginduksi untuk menghasilkan ekspresi berlebih pada kultur, sehingga dihasilkan jumlah enzim RNA helikase yang lebih besar hingga fase awal stasioner dimana nilai OD600 mencapai 1 (Utama et al, 2000). Bakteri E. coli dipanen dengan cara sentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 4.000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan sel E. coli dengan media LB. Setelah disentrifugasi sel E. coli akan mengendap sebagai pelet, sedangkan medium LB akan terpisah menjadi supernatan. Pelet yang terbentuk kemudian disimpan dalam freezer dengan temperatur -20°C untuk menjaga stabilitas RNA helikase HCV yang terekspresi secara intraseluler dalam pelet. RNA helikase yang terkandung dalam pelet harus dipurifikasi terlebih dahulu sebelum menjadi target analisis. Untuk memurnikannya sel pelet dipecahkan dengan cara mekanik, yaitu dengan cara freeze-thaw dan sonikasi. Freeze-thaw atau pengeringbekuan dilakukan menempatkan sel pada temperatur -20°C dan suhu ruang secara bergantian, masing-masing selama 20 menit sebanyak tiga kali pengulangan. Freeze-thaw menyebabkan terbentuknya kristal es pada sel pelet sehingga akan melunakkan dinding sel bakteri yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

33

mempermudah dalam pelisisan sel. Tahap selanjutnya merupakan sonikasi yang dilakukan menggunakan sonikator. Proses sonikasi akan merusak organel sel namun tidak merusak integritas (kemampuan) fungsionalnya. Pada tahap sonikasi, enzim RNA helikase HCV disuspensikan terlebih dahulu dengan dapar B (10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20). Tris HCl berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA helikase sehingga stabilitasnya terjaga, natrium klorida berperan untuk menghilangkan kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik dengan RNA helikase (Vanz et al, 2008). Sedangkan tween 20 merupakan detergen non-ionik yang dapat menghancurkan lipid bipolar pada membran sel. Rusaknya lipid bipolar akan menyebabkan disosiasi membran sel dengan bagian hidrofobik dari RNA helikase yang sebelumnya menempel pada lipid bipolar tersebut (Sigma aldrich, 2008). Enzim selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi afinitas (metal affinity). Metode ini didasarkan pada pengikatan spesifik logam Co2+ yang dimiliki resin TALON dengan label 6xHis-tag yang terdapat pada ujung RNA helikase. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan metabolit intraseluler lainnya melalui sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular. Pelet ditambahkan dapar elusi (imidazol dalam dapar B) ditambahkan untuk menghilangkan protein selain enzim RNA helikase. Imidazol yang terdapat dalam dapar elusi ini memutuskan ikatan antara RNA helikase dengan resin TALON. Imidazol berperan sebagai analog residu His yang terdapat pada enzim yang telah diikat oleh logam Co2+. Sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit digunakan untuk memisahkan imidazol dengan enzim yang telah murni. Penggunaan kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan enzim dan mencegah penurunan aktivitasnya (Sambrook & Russel, 2001).


34

Kemurnian enzim RNA helikase HCV dapat dikonfirmasi dengan menggunakan SDS-PAGE, berdasarkan protein target yang dituju. Elektroforesis dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi 8%. Hasil SDS-PAGE pada gambar 4.1 menunjukkan pita protein tunggal dengan bobot 54 kDa. sehingga dapat dikatakan bahwa RNA helikase telah berhasil dipurifikasi dan sesuai dengan hasil seperti yang dilaporkan Utama et al, 2000 yang menyatakan bahwa bobot molekul RNA helikase adalah sebesar 54 kDa. Pada lajur pertama berupa marker BIORAD® yang digunakan. Inner volum (IV) merupakan supernatan hasil sentrifugasi pada proses pemecahan sel yang belum dimurnikan dengan resin TALON sehingga banyak mengandung metabolit interseluler yang menyebabkan penumpukan pita protein. Washing 1 dan washing 2 merupakan hasil pencucian binding resin TALON tidak terdapat pita protein, karena supernatan hanya terdapat dapar B. 250 kDa 150 kDa

100 kDa 75 kDa

54 kDa 50 kDa

M

E1

E2

IV

W1 W2

Gambar 4.1. SDS – PAGE RNA helikase HCV Keterangan : M = Marker, E1 = Elusi 1, E2 = Elusi 2, IV = Inner Volum, W1 = washing 1, W2 = washing 2


35

4.6 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis Terhadap RNA Helikase Virus Hepatitis C Aktivitas ekstrak kulit buah Garcinia mangostana terhadap RNA helikase virus hepatitis C dilakukan dengan metoda Kolorimetri ATPase. Ekstrak pada masing-masing pelarut hasil maserasi yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol, dibuat seri pengenceran menggunakan metanol absolut

dengan konsentrasi

100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, 391 ppm, kemudian diuji dengan metoda ATPase. Uji kolorimetri ATPase digunakan untuk menguji enzim yang aktivitasnya bergantung pada adanya ATP sebagai sumber energi, yang melibatkan pengukuran serapan senyawa organik yang dilepaskan ATP oleh enzim RNA helikase. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas

yang

terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik). Pengujian

ekstrak

kulit

buah

manggis

yang

telah

diencerkan

menggunakan larutan master mix yang terdiri dari air suling, MOPS, MgCl2, dan ATP. Air suling berfungsi sebagai pelarut, MOPS (asam 4-morfolinopropana sulfonat) berperan sebagai dapar dalam larutan master mix. MgCl2 yang digunakan berfungsi sebagai kofaktor RNA helikase, dan ATP merupakan substrat atau donor energi yang berperan dalam pengujian ATPase kolorimetri (Utama et al, 2000). Larutan pewarna diberikan untuk memvisualisasi reaksi pada pengujian. Larutan perwarna malachite green yang terdiri dari ammonium molibdat akan berikatan dengan fosfat anorganik yang terhidrolisis menghasilkan kompleks fosfomolibdat dan malachite green. Warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi fosfat anorganik yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase dan ATP. Semakin banyak fosfat anorganik yang bereaksi dengan larutan pewarna semakin keruh warna yang dihasilkan (Chan et al, 1986).


36

Pengukuran absorbansi dilakukan menggunakan microplate reader Multiscan EX. Absorbansi diukur pada dua panjang gelombang, yaitu panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 optimum untuk penyerapan warna kebiruan, sedangkan panjang gelombang 405 nm optimum untuk penyerapan warna kekuningan. Warna kebiruan merupakan kompleks yang dihasilkan larutan pewarna dan fosfat organik yang terbentuk dari hidrolisis ATP, sedangkan warna kekuningan terbentuk dari larutan pewarna yang tidak berikatan dengan fosfat anorganik. Kedua panjang gelombang ini digunakan agar perhitungan reaksi antara RNA helikase dengan ATP lebih akurat. Perhitungan konsentrasi fosfat anorganik yang terinhibisi oleh sampel menggunakan perbandingan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986). Reaksi enzimatis yang terbentuk dihentikan dengan penambahan Na sitrat. Penambahan Na sitrat bertujuan untuk mencegah terbentuknya reaksi enzimatis yang berlebihan.

Tabel 4. 4. Aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV Konsentrasi % inhibisi % inhibisi % inhibisi (ppm)

Ekstrak nheksan

Ekstrak etil asetat

Ekstrak metanol

3.125

41.79

39.07

71.57

1.562

33.98

27.26

68.70

781

20.73

20.78

58.75

391

10.45

15.58

22.17


37

80 70 60 50

n-heksan

40

etil asetat

30

metanol

20 10 0 3.125 ppm 1.562 ppm

781 ppm

391 ppm

Gambar 4.2. Aktivitas ktivitas inhibisi ekst ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis dalam pelarut metanol absolut digunakan beberapa konsentrasi. Konsentrasi yang diuji dimulai dari konsentrasi 100.000 ppm ppm,, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, hing hingga ga 391 ppm. Hasil yang terlihat bahwa pada konsentrasi 100.000 ppm hingga 6.250 ppm tidak menghasilkan nilai absorbansi, dikarenakan terlalu larutan uji terlalu pekat. Sehingga konsentrasi yang digunakan adalah pada 3.125 ppm hingga 391 ppm. Hasil uji aktivitas ivitas inhi inhibisi bisi ekstrak kulit buah manggis dapat dilihat pada tabel 4.4. Pada tabel dapat dilihat bahwa ekstrak kulit buah manggis ((Garcinia Garcinia mangostana L.) mampu menghambat RNA helikase virus hepatitis C secara in vitro menggunakan uji kolometri ATPase. Ku Kulit lit buah manggis memiliki aktivitas inhibisi yang berbeda pada ketiga ekstrak ekstrak. Pada konsentrasi 3.125 ppm ekstrak nheksan memiliki persentasi inhibisi sebesar 41,79%, sedangkan etil asetat dan metanol memiliki persentasi inhibisi sebesar 39,07% dan 71,57 71,57%. Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada lampiran 17. Dalam grafik tersebut terlihat aktivitas enzim yang tidak ditambahkan inhibitor adalah pada uji aktivitas ekstrak n-heksan adalah 565,9 pmol fosfat/mL/menit/pmol UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

38

protein sedangkan setelah ditambahkan ekstrak n-heksan 3.125 ppm aktivitas enzim menjadi 305,9 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein. Sedangkan pada uji aktivitas ekstrak etil asetat dan metanol, aktivitas enzimnya adalah 575,3 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein, dan setelah ditambahkan ekstrak etil asetat dan metanol

aktivitas

enzim

berkurang

menjadi

325,7

dan

137,2

pmol

fosfat/mL/menit/pmol protein. Hal ini menunjukkan bahwa jika pada enzim ditambahkan inhibitor, maka enzim akan mengalami penurunan aktivitas. Nilai aktivitas enzim ini berbanding terbalik dengan nilai persentasi inhibisi, semakin tinggi persen inhibisi oleh ekstrak yang digunakan, maka akan semakin rendah aktivitas enzim, begitu pula sebaliknya, semakin rendah persen inhibisi oleh ektrak yang digunakan, maka semakin tinggi aktivitas enzimnya. Hal ini dikarenakan dengan semakin tinggi persen inhibisi, maka fosfat yang dihambat semakin besar sehingga aktivitas enzim akan pengalami penurunan. Kulit buah manggis dikenal kaya metabolit sekunder, seperti santon. Santon merupakan senyawa yang memiiliki aktivitas antioksidan ditemukan dalam kulit buah manggis (Chaverri et al, 2008, Yu et al, 2007). Santon merupakan senyawa polar (Zarena et al, 2011), sehingga diduga terkandung dalam ekstrak metanol. Dalam penelitian ini, santon diperkirakan memiliki aktivitas sebagai antivirus yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C. Penelitian Chen et al, 1996 meunjukkan bahwa ekstrak etanol dari Garcinia mangostana L. memiliki potensi dalam menghambat HIV-1 protease. Dalam penelitian ini dinyatakan bahwa hasil purifikasi ekstrak Garcinia mangostana L. diperoleh dua senyawa aktif. Senyawa aktif tersebut dianalisis dan diperoleh mangostin yang memiliki IC50 5,12 +/- 0,41 microM dan gammamagostin dengan IC50= 4,81 +/- 0,32 microM. Selain itu, penelitian lain juga menyatakan ekstrak Garcinia mangostana L. berpotensi sebagai HIV-1 reverse transkriptase, meskipun tidak signifikan (Chin et al, 2008). Selain antivirus, Garcinia mangostana L. juga memiliki aktivitas sebagai penghambat kanker UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

39

payudara, anti tumor , anti inflamasi seperti yang dijabarkan oleh Chaverri et al, 2008. Hasil penelitian sebelumnya memberikan gambaran

Garcinia

mangostana memiliki potensi besar sebagai anti virus. Dalam mekanismenya sebagai inhibitor RNA helikase, terdapat dua kemungkinan yang terjadi : (1) inhibitor menempel pada RNA helikase tidak pada sisi aktifnya, namun terjadi perubahan konformasi bentuk enzim yang mengakibatkan

berkurangnya

interaksi

enzim

dengan

substrat

(Borowski et al. 2008). (2) inhibitor berikatan pada sisi aktif enzim (RNA binding-site) sehingga ATP tidak dapat berikatan dengan enzim yang menyebabkan enzim tidak memiliki cukup energi untuk membuka untai ganda RNA (Yamashita et al. 2012).


BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan 1. Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) memiliki potensi sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C. 2. Aktivitas penghambatan yang tertinggi pada konsentrasi 3.125 ppm terdapat pada ekstrak metanol, yaitu sebesar 71,57%. n-heksan memiliki aktivitas 41,79%, sedangkan aktivitas terendah pada ekstrak etil asetat yaitu sebesar 39,07%. 5.2 Saran 1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemurnian ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) sehingga dapat diketahui senyawa aktif yang berkhasiat menghambat aktivitas virus hepatitis C. 2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dari ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) untuk mengetahui aktivitas penghambatan terhadap virus hepatitis C secara in vivo.

40


DAFTAR PUSTAKA

Adegboye, M. F., Akinpelu, D. A., Okoh, A. I. (2008). The Bioactive and Phytochemical properties of Garcinia kola (Heckel) Seed Extract on Some Pathogens. African Journal of Biotechnology Vol. 7 (21) : 3934-3938. Borowski P et al. (2008). Viral NS3 helicase activity is inhibited by peptides reproducing the Arg-rich concerved motif of the enzyme (motif VI). Biochemical Pharmacology 76: 28-38 Chaudri R.D. (2001). Herbal Drugs Industry. Easther Publisher G-59, Greater Kailash. New Delhi India: 373-387. Chaverri, J. P., Rodriguez, N. M., Ibarra, M. O., Rojas, J. M.,. (2008). Medicinal properties of mangosteen (Garcinia mangostana). Food Chem Toxicol 46 : 3227 – 3229. Chan, K. M., Delfert D., Junger K. D. (1986). A direct colorimetric assay for Ca2+ stimulated ATPase activity. Analytical Biochemistry157: 375-380. Chen, S.X., Wan, M., Loh B. M., (1996). Active constituents againts HIV-1 protease for Garcinia mangostana. Planta medica 62 : 381 – 382. Chin, Y. W., and Kinghorn, A. D. (2008). Structural Characterization, Biological Effect, and Synthetic Studies on Xanthones from Mangosteen (Garcinia mangostana) A Popular Botanical Dietary Suplement. Mini Rev Org Chem 5(4): 355–364 Departemen Kesehatan RI. (1989). Materia Medika Indonesia jilid I. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta Departemen Kesehatan RI. (2000). Parameter Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta. Deyl, Z. (1983). Electrophoresis : A survey of techniques and application. New York : Elsevier. El-Kamali, H. H., El-Amir, M. Y. (2010). Antibacterial and phytochemical Screening of Ethanolic Extracts Obtained from Selected Sudenese Medical Plants. Research Journal of Biological Sciences 2(2) : 143-146. Farnsworth, N. R. (1969). Biological and phytocemical screening of plants. Journal Pharmaceutical Science.

41


42

Harborne, J.B. (1987). Metode fitokimia : penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Bandung : ITB Hempelmann, E., Schuulze, M., Gotze, O. (1984). Free SH-groups are important for the polychromatic staining of proteins with silver nitrat. Neuhof V (ed) Electrophoresis 84 Verlag Chemie Weinheim 1984 : 328-330. Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Jakarta : Yayasan Sarana Wana Jaya. Indrayani L., Soetjipto H., Sihasale L. (2006). Skrining Fitokimia dan Uji Toksisitas Ekstrak Daun Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) terhadap Larva Udang Artemia salina Leach [skripsi]. Berk Penel Hayati : 12 (57-61) Ismet, M. S., Soedhama, D., Aktani, U. (2007). Penapisan Senyawa Bioaktif Spons Aaptos aaptos dan Petrosia sp. dari Lokasi yang Berbeda. Prosiding Konferensi Sains Kelautan dan Perikanan Indonesia I : IPB Dramaga Katzung, Bertram G. (2010). Farmakologi Dasar & Klinik ed 10. Jakarta : EGC Kawo, A.H. et al. (2012). Sero Prevalence Study of Hepatitis C Virus Infection Among Blood Donors Attending Selected Blood Banks in some Local Government Areas in Kano, Nigeria. Journal of public Health and Epidemiology vol 4(6) : 178 183. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. (2010). Menkes Meluncurkan program pendataan penyakit hepatitis C tahap II. http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release. Diakses tanggal 13 Juni 2012. Kusumawati, I.S. (2011). Isolasi dan Identifikasi Pendahuluan Bahan Bioaktif sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Ekstrak Metanol Buah Tanaman Mangrove Avicennia marina (Forsk) Vierb [skripsi]. Depok : Universitas Pancasila. Laemmli, UK. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature 227 : 680-685. Lee, J.C. et al. (2011). Anti- hepatitis of Acacia confusa Extract Via Suppressing Cyclooxygenase - 2. Antiviral Research 89 : 35 - 42. Magadula, J., Tewtrakul,S. 2010. Anti – HIV – 1 Protease Activities of Crude extract of some Garcinia Species Growing in Tanzania. African Journal of Biotechnology Vol. 9 (12) : 1848-1852. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

43

Melki. (2010). Efektivitas ekstrak mangrove sebagai antibiotic pada penyakit vibrosis udang windu [tesis]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Moongkarndi, P. et al. 2004. Antiproliferation, Antioxidation and Induction of Apoptosis by Garcinia mangostana (mangosteen) on SKBR3 Human Breast Cancer Cell Line. Journal of Ethnopharmacology 90 : 161 – 166. Pasaribu, F., Sitorus, P., Bahri, S. (2012). Uji ekstrak etanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap penurunan kadar glukosa darah. Journal of Pharmaceutics and Pharmacology Vol 1 : 1-8 Patel, S. S. and Donmez, I. (2006). Mechanism of Helicases. The Journal of Biological Chemistry vol 281 No 27 pp : 18265 – 18268. Paturohman, M. (2011). Optimasi Pemurnian Protein Kapang Endofit CgKTm SF sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Pelczar, M.J. dan Chan E. C. S. (1988). Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Hadietomo et al., penerjemah. Jakarta : UI Press. Terjemahan dari: Element of Microbiology. Porth, C. M., Matfin, G. (2009). Pathophysiology : Concept of Altered Health States Eighth ed. Wolters Kluwer Health : Lippincott Williams & Wilkins. Putri, P. H. (2011a). Isolasi dan Pemurnian Bahan Aktif dari Mikroalga BTM 11 sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Putri, S. F. (2011b). Isolasi dan Purifikasi Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Bakteriosin Bskteri Asam Laktat [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Ravikumar, Y. S. et al. (2011). Inhibition of Hepatitis C Virus Replication by Herbal Extract : Phyllanthus amarus as Potent Natural Source. Virus Research 158 : 89–97. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: a laboratory manual. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2344 hlm. Setianingsih, D. (2011). Isolasi dan Identifikasi Awal Senyawa Aktif dari Ekstrak Rimpang Temulawak (Curcuma zanthorrhiza Roxb.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Depok : Universitas Pancasila. SIGMA-ALDRICH. (2008). Detergents and solubilization reagents. Biofiles 3(3): 136. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

44

Solga, S., Poordad, FF., Rai, R., Norwitz, L., Kalloo, A.N. (2007). Rational design of dual-functional aptamers that inhibit the protease and helicase activities of HCV NS3. J. Biochem. 137 : 339-347 Tellinghuisen T. L., Evans M.J., Hahn T., You S., dan Rice C.M. (2007). Studying hepatitis C virus: making the best of a bad virus. J. Virology 81(17): 8853-8867 Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H. (2011). Phytochemical screening and extraction : a review. International Pharmaceutica Sciencia Vol. 1 Issue 1 United State Departement of Agriculture. (2012). Plants profile Garcinia mangostana L. http://plants.usda.gov/java/nameSearch Diakses tanggal 23 Juli 2012. Utama A et al. (2005). Skrining inhibitor RNA helikase terhadap virus Japanese Encephalitis. Poster Program Kompetitif LIPI. Utama, A. et al. (2000). Identification and characterization of the RNA helicase activity of japanese enchepalitis virus NS3 protein. FEBS Letter 456:74-78 Verheij, E.M.W, dan Coronel, R.E. (1997). Sumber Daya Nabati Jilid 2. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Wang, J., Sanderson, B.J.S., Zhang, W. (2011). Cytotoxic effect of xanthone from pericarp of the tropical fruit mangosteen (Garcinia mangostana Linn.) on human melanoma cells. Food and Chemical Toxicology 49 : 2385 -2391. Wasito, Hendri. (2011). Obat Tradisional Kekayaan Alam Indonesia. Yogyakarta: Graha Ilmu. Yamashita, A et al. (2012). Inhibition of hepatitis C virus replication and viral helicase by ethyl acetate extract of the marine feather star Alloeocomatella polycladia. Marine Drugs 10: 744-761. Yu, L., Zhao, M., Yang, B., Zhao, Q., Jiang, Y. (2007). Phenolic from hull of Garcinia mangostana fruit and their antioxidant activities. Food Chemistry 104 : 176 - 181. Zang, Y., Song, Z., Hao, J., Qiu, S., Xu, Z. (2010). Two new prenylated xanthones and a new prenylated tetrahydroxanthone from pericarp of Garcinia mangostana. Fitoterapia 81 : 595 – 599. Zarena, A. S., Sachindra, N. M., Sankar, K. U. (). Optimisation of ethanol modified supercritical carbon dioxide on the extract yield and antioxidant activity from Garcinia mangostana L. Food Chemistry 130 : 203 – 208. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

45

Lampiran 1. Hasil Determinasi Garcinia mangostana L.


46

Lampiran 2. Alur Penelitian

Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit buah manggis

Ekspresi enzim RNA helikase virus hepatitis C

Maserasi bertingkat dengan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol

Purifikasi enzim RNA helikase virus hepatitis C

Ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan metanol

Pembuatan seri pengenceran ekstrak dengan metanol absolut

Enzim RNA helikase virus hepatitis C terpurifikasi

Skrining Fitokimia Ekstrak Uji aktivitas inhibisi ekstrak dengan kolorimetri ATPase

Uji aktivitas enzim RNA helikase virus hepatitis C

% inhibisi Analisis kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan SDS PAGE


47

Lampiran 3. Skema Kerja Penyiapan Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L) Buah manggis sebanyak 5 kg, dibersihkan dengan air mengalir

Dikumpulkan bagian kulit buah (perikarp) manggis

Dirajang dan diangin-anginkan di udara terbuka

Dihaluskan denga blender

Serbuk kulit buah manggis sebanyak 490 gram Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut n - heksan, masing- masing selama 3 hari Filtrasi Filtrat 1

Residu Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut etil asetat, masing-masing selama 3 hari

Evaporasi

Ekstrak n -heksan

Filtrasi Filtrat 2

Residu

Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut metanol, masing-masing selama 3 hari

Evaporasi

Ekstrak etil asetat

Filtrasi Filtrat 3

Residu

Evaporasi

Ekstrak etil asetat UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

48

Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C Kultur E.coli BL21(DE3)pLysS - RNA helikase rekombinan dalam media LB

Induksi IPTG

Koleksi pelet, disimpan pada suhu -20 °C

Freeze-thawing

Sonikasi

Fraksi terlarut

Afinitas kromatografi

Enzim RNA helikase terpurifikasi SDS PAGE Uji aktivitas enzim RNA helikase dengan kolorimetri ATPase


49

Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV dengan SDS - PAGE Sample + loading dye

Denaturasi

Preparasi gel ( stacking dan separating)

Running SDS PAGE

Commasie blue staining

Destain for commasie blue

Hasil SDS PAGE


50

Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV Campuran Reaksi (5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV)

Inkubasi selama 45 menit dalam suhu ruang

Tambahkan larutan pewarna (0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)


Tambahkan 25 µL Na Sitrat

Pengkuran pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm


51

Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA helikase HCV Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan metanol absolut dengan konsentrasi 100.000 ppm, 50.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 781 ppm, 391 ppm

Campuran Reaksi (5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV) ditambahkan dengan 5 µL ekstrak kulit buah manggis


Tambahkan larutan pewarna (0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)


Tambahkan 25 µL Na Sitrat

Pengkuran pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm


52

Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE Larutan-larutan A

B

Komposisi

Larutan separating

•

H2O 7,25 mL

8%

•

1,5 M Tris-Cl pH 8,8 containing 0.4% SDS 3,75 mL

•

30% Akrilamid 4 mL

•

10% Amonium Persulfat 0,05 mL

•

TEMED 0,015 mL

Larutan stacking

• H2O 3,05 mL

3,9%

• 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 containing 0.4% SDS 1,25 mL • 30% Akrilamid 0,65 mL • 10% Amonium Persulfat 0,025 mL • TEMED 0,005 mL

C

D

E

Dapar sampel SDS

•

4x Tris Cl/SDS pH 6,8 25 mL

2X (Loading Dye)

•

Gliserol 20 mL

•

SDS 4 g

•

β- mercaptoethanol (2-ME) 2 mL

•

Bromphenol blue 1 mg

•

H2O sampai 100 mL

Commasie Blue G-

•

45% H2O 225 mL

250 Staining

•

45% Metanol 225 mL

Solution (500 mL)

•

10% Asam asetat glacial 50 mL

•

0,05% Commasie brilliant blue 250 mg

Commasie Blue G-

•

50% H2O 500 mL

250 Destaining

•

10% Asam asetat glacial 100 mL

Solution (1000 mL)

•

40% Metanol 400 mL


53

Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan Larutan, dapar, medium

Komposisi dan Cara Pembuatan

A

Media LB (Luria-Bertani) cair

Media LB dibuat sebanyak 10 mL untuk prekultur dan 400 mL untuk kultur. Media LB dibuat dengan cara melarutkan sejumlah 0,25 g dan 10 g masing-masing ke dalam 10 mL dan 400 mL akuades. Semua disterilisasi pada suhu 121o C selama 15 menit.

B

Dapar B

Dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%. Dicampur menjadi satu dan diaduk hingga homogen.

C

Dapar Elusi

Sebanyak 0,2724 g imidazol dilarutkan dalam 10 mL dapar B kemudian dihomogenkan

D

Adenosin 5’ trifosfat (ATP) 0,1 M

Sebanyak 0,3 g adenosine 5’ triphosphate disodium salt dilarutkan dalam nuclease free water sambil diukur pH 7,0. Sebanyak 500 µL dialikuot ke dalam 1,5 mL tabung mikrosentrifus. Disimpan pada -20°C.

E

Ampisilin 100 mg/mL

Amphicillin sodium salt sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 2 mL akuades kemudian dihomogenkan. Larutan disaring dengan filter 0,2 µm. Alikuot 1 mL ke dalam tabung 1,5 mL. Disimpan pada -20°C

F

Malachite green 0,081%

Sebanyak 0,081 malachite green oxalate salt dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring

G

Sebanyak 2,3 g polivinil alkohol dilarutkan dalam Polivinil alkohol akuades hingga mencapai volume 100 mL kemudian 2,3% dihomogenkan dengan pemanasan

H

Ammonium molibdat 5,7% dalam HCl 6 N

Sebanyak 5,7 g ammonium molibdat tetrahidrat dilarutkan dalam HCl 6 N hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan

I

Natrium Sitrat 30%

Sebanyak 3 g citric acid trisodium salt dihydrate dilarutkan dalam akuades hingga mencapai 100 mL kemudian dihomogenkan


54

Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis

( )

Rendemen =

( )

X 100%

Ekstrak n-heksan kulit buah Manggis Rendemen =

,

X 100% = 1,061%

Ekstrak etil asetat kulit buah Manggis ,

Rendemen =

X 100% = 9,673%

Ekstrak metanol kulit buah Manggis Rendemen =

,

X 100% = 8,608%


55

Lampiran 11. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis 1. Susut pengeringan =

( )

( )

x 100%

Ekstrak

Berat sampel awal

Berat sampel akhir

n – heksan

1,0002

0,9952

Etil asetat

1,0003

0,9795

Metanol

1,0003

0,9073

Ekstrak n-heksan kulit buah Manggis ,

Susut pengeringan =

,

– ,

X 100% = 0,50%

Ekstrak etil asetat kulit buah Manggis ,

Susut pengeringan =

,

,

X 100% = 2,08%

Ekstrak metanol kulit buah Manggis Susut pengeringan =

,

,

,

X 100% = 9,30%


56

(Lanjutan) ( )

2. Kadar abu =

( )

x 100%

Ekstrak

Berat sampel awal

Berat sampel akhir

n – heksan

2,0004

0,008

Etil asetat

2,0432

0,0145

Metanol

2,0103

0,0437

Ekstrak n-heksan kulit buah Manggis Kadar abu =

,

,

X 100% = 0,39%

Ekstrak etil asetat kulit buah Manggis Kadar abu =

,

,

X 100% = 0,71%

Ekstrak metanol kulit buah Manggis Kadar abu =

,

,

X 100% = 2,17%


57

Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis Pembuatan larutan Ekstrak Kulit buah manggis dibuat larutan stock dengan melarutkan sejumlah ekstrak dengan metanol absolut. Larutan Stock yang dibuat adalah : Konsentrasi =

=

.

,

= 100.000 ppm

Larutan Stock yang diperoleh kemudian diencerkan menjadi beberapa pengenceran. Rumus Pengenceran : V1 x N1 = V2 x N2 Dimana,

V1 = volume yang diambil dari larutan stock N1 = konsentrasi larutan stock V2 = volume larutan yang akan dibuat N2 = konsentrasi larutan yang akan dibuat

Pengenceran 2x (50.000 ppm) V1 x N1 V1 x 100.000 ppm V1

= V2 x N2 = 1 mL x 50.000 ppm = 0,5

mL

Artinya 0,5 mL sampel dari larutan stock + 0,5 mL metanol Pengenceran 4x (25.000 ppm) V1 x 50.000 ppm V1

= 1 mL x 25.000 ppm = 0,5

mL

Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 2x + 0,5 mL metanol Pengenceran 8x (12.500 ppm) V1 x 25.000 ppm V1

= 1 mL x 12.500 ppm = 0,5

mL

Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 4x + 0,5 mL metanol


58

(Lanjutan) Pengenceran 16x (6.250 ppm) V1 x 12.500 ppm V1

= 1 mL x 6.250 ppm = 0,5

mL


= 1 mL x 3.125 ppm = 0,5

mL


= 1 mL x 1.562 ppm = 0,5

mL

Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 32x + 0,5 mL metanol Pengenceran 128x (761 ppm) V1 x 1.562 ppm V1

= 1 mL x 761 ppm = 0,5

mL

Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 64x + 0,5 mL metanol Pengenceran 256x (391 ppm) V1 x 761 ppm = 1 mL x 391 ppm V1

= 0,5

mL

Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 128x + 0,5 mL metanol


59

Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Ekstrak

Konsentrasi

(ppm)

Absorbansi

Absorbansi

tanpa

dengan

inhibitor

inhibitor

(enzim)

(enzim

%Inhibisi

+

inhibitor) n-heksan

Etil asetat

Metanol

Kontrol negatif

1.15

3.78

3.125

0.65

41.79

1.562

0.75

33.98

781

0.91

20.73

391

1.03

10.45

1.17

3.96

3.125

0.69

39.07

1.562

0.84

27.26

781

0.92

20.78

391

0.98

15.58

1.17

3.96

3.125

0.30

71.57

1.562

0.33

68.70

781

0.45

58.75

391

0.90

22.17

Kontrol negatif

Kontrol negatif

1.20

1.22

1.22


60

Lampiran 14. Perhitungan Persentase Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Cara Perhitungan : % inhibisi

–

=

x 100

A = absorban enzim tanpa adanya senyawa inhibitor I = absorban enzim dengan adanya senyawa inhibitor.

Contoh perhitungan pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 3.125 ppm : % inhibisi

=

.

.

– .

x 100

= 75,553307% Absorbansi aktivitas inhibisi dikurangi dengan kontrol negatif = 75,53307% - 3.963888 % = 71,569182%


61

Lampiran 15. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) Data : Konsentrasi K2HPO4 (mM)

Absorbasi 620 nm dengan referensi 405 nm

0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.000 0.102 0.239 0.417 0.622 0.834 1.022

Grafik : 1.2 Abs 620/405 nm

1 0.8 0.6 0.4

y = 1.020x + 0.010 R2 = 0.9989

0.2 0 0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

[K2HPO4] (mM)


62

Lampiran 16. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C Diketahui :

y = 1,020x + 0,010 (kurva standar dilihat di lampiran 14) Sampel didilusi 40x OD pada 620 nm = 1,21933 Masa inkubasi 45 menit 1 well terdapat 5 µL enzim RNA helikase Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/ µL 1 pmol = 0,05

Ditanya :

Aktivitas enzim RNA helikase

Jawab :

y = 1,020x + 0,010 1,21933 = (1,020x) + 0,010 x = 1,18562 mM fosfat

Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,18562 mM fosfat x 40 = 47,4248 x 10-6 mol fosfat/mL Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit =

,

x 10-6 mol fosfat/mL

= 1,05388 x 10-6 mol fosfat/mL/menit Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µL x 5 µL = 91,6 µg = 1832 pmol protein Aktivita enzim RNA helikase =

,

/

/

= 575,263 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein


63

Lampiran 17. Grafik Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV

Aktivitas Ezim (pmol fosfat/mL/menit/pmol protein)

Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV 700.0 600.0 500.0 400.0 n-heksan

300.0

etil asetat 200.0

metanol

100.0 0.0 3.125 ppm

1.562 ppm

781 ppm

391 ppm

enzim tanpa senyawa inhibitor

Konsentrasi Ekstrak Kulit Buah Manggis


64

Lampiran 18.. Gambar Alat Penelitian

Microplate reader

Ultrasentrifus

[Multiscan EX Thermo]

[Sorvall RC-26 plus]

Sonikator

SDS-PAGE

[LabSonic]

[Atto]


Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C

Recommend Documents