AKTIVITAS EKSTRAK DAN NANOPARTIKEL EKSTRAK KULIT KAYU MAHONI SEBAGAI INHIBITOR ENZIM HMG-KOA REDUKTASE
LUSIANAWATI
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
ABSTRAK LUSIANAWATI. Aktivitas Ekstrak dan Nanopartikel Ekstrak Kulit Kayu Mahoni sebagai Inhibitor Enzim HMG-KoA Reduktase. Dibimbing oleh SYAMSUL FALAH dan POPI ASRI KURNIATIN. Kulit kayu mahoni merupakan limbah industri kayu. Kulit kayu mahoni berpotensi sebagai penurun kadar kolesterol darah pada tikus hiperkolesterolemia. Penurunan kadar kolesterol diduga melalui penghambatan enzim HMG-KoA reduktase. Penelitian ini bertujuan membandingkan aktivitas penghambatan enzim HMG-KoA reduktase oleh ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni. Penelitian terdiri atas empat tahap yaitu ekstraksi kulit kayu mahoni dengan pelarut akuades, pembuatan nanopartikel dengan metode gelasi ionik, uji potensi hayati dengan brine shrimp lethality test (BSLT), dan pengujian penghambatan HMG-KoA reduktase dengan metode spektrofotometri. Rendemen ekstrak sebesar 9% dan nanopartikel ekstrak sebesar 53%. Uji potensi hayati ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni menunjukkan nilai LC50 masing-masing sebesar 1255 ppm dan 1567 ppm. Daya hambat terhadap enzim HMG-KoA reduktase tertinggi oleh ekstrak 150 ppm sebesar 26% dan nanopartikel ekstrak 300 ppm sebesar 16% sedangkan kontrol positif (pravastatin) sebesar 21%. Ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni mampu berperan sebagai inhibitor enzim HMG-KoA reduktase. Kata kunci: kulit kayu mahoni; ekstrak; nanopartikel; HMG-KoA reduktase
ABSTRACT LUSIANAWATI. Extract and Nanoparticle Extract of Mahogany Bark Activity as an HMG-CoA Reductase Enzyme Inhibitor. Supervised by SYAMSUL FALAH and POPI ASRI KURNIATIN. Mahogany bark is wood industrial waste. Mahogany bark potency as lowering blood cholesterol levels in hypercholesterolemic rats. Decreasing cholesterol levels alleged by inhibit HMG-CoA reductase enzyme. This research was designed to compare the inhibition of HMG-CoA reductase enzyme from extracts and nanoparticle extracts of mahogany bark. This research consist of four stages that begin from extraction of mahogany bark with aquades solution, production nanoparticles using ionic gelation method, biological activities or cytotoxicity using brine shrimp lethality test (BSLT), and measuring inhibition of HMG-CoA reductases by spectrophotometric method. Mahogany bark extract has yield 9% and nanoparticle extracts has yield 53.31%. Biological assay of extracts and nanoparticle extracts showed LC50 value of 1255 ppm and 1567 ppm, respectively. The highest percentage inhibition of HMG-CoA reductase enzyme value from extracts 150 ppm and nanoparticle extracts 300 ppm are 26% and 16%, whereas the inhibiton by positive control (pravastatin) is 21%. Extracts and nanoparticle extracts of mahogany bark capable of acting as an inhibitor of the HMG-CoA reductase enzyme. Keywords: mahogany bark; extracts; nanoparticles; HMG-CoA reductase
AKTIVITAS EKSTRAK DAN NANOPARTIKEL EKSTRAK KULIT KAYU MAHONI SEBAGAI INHIBITOR ENZIM HMG-KOA REDUKTASE
LUSIANAWATI
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013
Judul Skripsi : Aktivitas Ekstrak dan Nanopartikel Ekstrak Kulit Kayu Mahoni sebagai Inhibitor Enzim HMG-KoA Reduktase Nama : Lusianawati NIM : G84080028
Disetujui Komisi Pembimbing
Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si Ketua
Popi Asri Kurniatin, S.Si, Apt, M.Si Anggota
Diketahui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc Ketua Departemen Biokimia
Tanggal Lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan kemudahan dalam penyusunan karya ilmiah ini sebagai salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar sarjana sains di Departemen Biokimia. Karya ilmiah ini berjudul Aktivitas Ekstrak dan Nanopartikel Ekstrak Kulit Kayu Mahoni sebagai Inhibitor Enzim HMG-KoA Reduktase. Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April hingga September 2012 di Laboratorium Biokimia Departemen Biokimia Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini didanai oleh Program Penelitian Strategis Unggulan IPB atas nama Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si. dkk pada tahun 2012. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si dan Popi Asri Kurniatin, S.Si, Apt, M.Si yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan kepada penulis selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Pak Nana, Pak Yadi, Bu Tini, Bu Meri, dan Bu Tuti yang telah banyak membantu dalam teknis pelaksanaan penelitian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada orangtua atas segala doa dan dukungannya. Ucapan terima kasih juga penulis berikan kepada Aros, Rian, Faris, Yoan, Dita, Aji, Nina, Nur, Anis, Kenyar, Elvita, Shelly, Didit, dan Banda atas bantuannya dalam penelitian ini. Semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi yang memerlukannya.
Bogor, Januari 2013
Lusianawati
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 Februari 1991 dari ayah Juddy Widjaja dan ibu Elly Liana Widjaja. Tahun 2008, penulis lulus dari Sekolah Menengah Atas Negeri 3 Bogor dan pada tahun yang sama diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Penulis diterima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam sebagai Mayor dan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian sebagai Minor. Selama mengikuti kegiatan perkuliahan, penulis aktif di Himpunan Profesi Community of Research and Education in Biochemistry (Creb’s) sebagai anggota Divisi CIC (Communication and Information Center) periode 2010/2011. Penulis juga aktif dalam berbagai kepanitiaan seperti panitia Save Our Earth 2010, Masa Perkenalan Mahasiswa Departemen Biokimia 2010, Pesta Sains Nasional 2010, dan kepanitiaan lainnya. Penulis pernah menjadi asisten praktikum mata kuliah Kimia Dasar tahun ajaran 2010/2011 untuk mahasiswa Tingkat Persiapan Bersama (TPB), Pengantar Penelitian Biokimia tahun ajaran 2011/2012 untuk mahasiswa Departemen Biokimia, dan Biokimia Umum tahun ajaran 2011/2012 untuk mahasiswa Departemen Biologi dan Fakultas Kedokteran Hewan. Selama mengikuti kegiatan perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik lapangan di Laboratorium Biokimia Mikroba, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) dengan judul Aktivitas β-Galaktosidase Klebsiella spp. Hasil Pengendapan Amonium Sulfat pada Proses Hidrolisis Laktosa.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ............................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... ix PENDAHULUAN ..............................................................................................
1
TINJAUAN PUSTAKA Mahoni (Swietenia macrophylla King) ....................................................... Nanopartikel ................................................................................................ Kitosan ......................................................................................................... Uji Potensi Hayati terhadap Larva Udang (Artemia salina Leach) ............. Hiperkolesterolemia..................................................................................... Obat-obatan Penurun Kolesterol ................................................................. Enzim HMG-KoA reduktase .......................................................................
1 2 3 4 4 4 5
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ............................................................................................ Metode .........................................................................................................
6 6
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak Kulit Kayu Mahoni ......................................................................... Nanopartikel Ekstrak Kulit Kayu Mahoni ................................................... Potensi Hayati Ekstrak Kulit Kayu Mahoni dengan BSLT ......................... Daya Hambat HMG-KoA Reduktase ..........................................................
7 8 9 9
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ...................................................................................................... 11 Saran ............................................................................................................ 11 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 11 LAMPIRAN ........................................................................................................ 15
DAFTAR TABEL 1
Halaman Nilai LC50 ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni ................. 9
2
Penghambatan enzim HMGR pada t = 1.33 menit ...................................... 11
DAFTAR GAMBAR 1
Halaman Pohon mahoni (Swietenia macrophylla King)............................................. 2
2
Struktur kimia kitosan .................................................................................
3
3
Reaksi katalisis enzim HMG-KoA reduktase ..............................................
6
4
Ekstrak air kulit kayu mahoni ......................................................................
8
5
Nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni ......................................................
8
6
Kurva penghambatan enzim HMGR ........................................................... 11
DAFTAR LAMPIRAN 1
Halaman Tahapan penelitian ....................................................................................... 16
2
Ekstraksi serbuk kulit kayu mahoni dengan air ........................................... 17
3
Pembuatan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni .................................... 17
4
Uji aktivitas penghambatan enzim HMG-KoA reduktase ........................... 18
5
Pembuatan larutan untuk uji penghambatan HMG-KoA reduktase ............ 19
6
Rendemen hasil ekstraksi kulit kayu mahoni .............................................. 19
7
Rendemen nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni hasil pengeringan semprot ........................................................................................................ 19
8
Uji potensi hayati dengan BSLT ................................................................. 20
9
Absorbansi NADPH sisa terhadap waktu oleh inhibisi pravastatin ............ 21
10 Absorbansi NADPH sisa terhadap waktu oleh inhibisi ekstrak kulit kayu mahoni ......................................................................................................... 22 11 Absorbansi NADPH sisa terhadap waktu oleh inhibisi nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni............................................................................ 23 12 Kurva absorbansi NADPH sisa terhadap waktu .......................................... 24 13 Penentuan kecepatan awal reaksi (v0) .......................................................... 25 14 Penghambatan ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni terhadap enzim HMGR ................................................................................ 26
PENDAHULUAN Pesatnya pembangunan menyebabkan banyak perubahan dalam kehidupan masyarakat seperti perubahan pola hidup, kesehatan, dan pola makan yang tidak seimbang. Diet yang tidak seimbang dan berlebihan dapat meningkatkan resiko terjadinya penyakit kardiovaskular seperti penyakit jantung koroner (PJK). Penyakit kardiovaskular menjadi penyebab utama kematian sekitar 30% penduduk di negara berkembang. Sekitar 17.3 juta orang meninggal akibat penyakit kardiovaskular pada tahun 2008, 7.3 juta diantaranya disebabkan oleh PJK (WHO 2008). Penyakit kardiovaskular berhubungan dengan tingginya kadar kolesterol total di dalam darah atau lebih dikenal dengan hiperkolesterolemia (Herliana & Sitanggang 2009). Penurunan konsentrasi kolesterol dalam darah dapat dilakukan dengan mengatur pola makan dan olahraga. Selain itu, pengobatan dalam dunia medis dapat dilakukan dengan konsumsi obat sintetik penurun kolesterol, seperti mevinolin, fluvastatin, lovastatin, pravastatin, simvastatin, dan atorvastatin. Aktivitas penurunan kadar kolesterol dari obat-obat sintetik tersebut diketahui dapat menghambat biosintesis kolesterol endogen (Murray et al. 2009). Penggunaan obat-obat sintetik penurun kolesterol ternyata belum tentu terbebas dari efek samping yang merugikan. Efek samping yang telah dilaporkan dari penggunaan obat sintetik penurun kolesterol antara lain meningkatkan tekanan darah dan menyebabkan mual (Herliana & Sitanggang 2009). Oleh karena itu, banyak penderita hiperkolesterolemia beralih ke pengobatan tradisional yang menggunakan bahan-bahan alami. Salah satu bahan alami yang dapat dimanfaatkan sebagai bahan obat penurun kolesterol darah adalah kulit kayu mahoni. Kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King) mengandung senyawa aktif berupa katekin, epikatekin, dan swietermakrofilanin (Falah et al. 2008). Mustika (2010) menyatakan ekstrak air kulit kayu mahoni dengan dosis 21 mg/kg BB dapat mencegah kenaikan kadar kolesterol darah pada tikus putih sebesar 35.8%. Menurut Lavenia (2010), ekstrak air kulit kayu mahoni dapat menurunkan konsentrasi lipid peroksida pada tikus sebesar 26.86%. Ferdiansyah (2012) menyatakan ekstrak air kulit kayu mahoni 300 mg/kg BB dapat menurunkan kolesterol darah pada tikus hiperkolesterolemia.
Ekstrak kulit kayu mahoni diduga berkhasiat sebagai pencegah kenaikan kolesterol darah dengan menghambat HMGKoA reduktase yang merupakan enzim kunci biosintesis kolesterol. Kemampuan kulit kayu mahoni sebagai inhibitor HMG-KoA reduktase diduga dapat ditingkatkan dengan bantuan teknologi nanopartikel tersalut kitosan. Ukuran nanopartikel yang kecil menyebabkan kelarutan lebih tinggi karena luas permukaannya meningkat sehingga penyebaran zat aktif ke dalam darah lebih mudah dan kemampuan penyerapan ke dalam sel target semakin besar (Mohanraj & Chen 2006). Penelitian untuk membandingkan aktivitas penghambatan enzim HMG-KoA reduktase dari ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni perlu dilakukan. Penelitian ini bertujuan membandingkan aktivitas penghambatan enzim HMG-KoA reduktase dari ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni. Hipotesis penelitian ini adalah nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni memiliki aktivitas penghambatan yang lebih tinggi dibandingkan ekstraknya. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan alternatif sediaan obat penurun kolesterol yang berasal dari bahan alam sehingga dapat bermanfaat dalam bidang kesehatan dan farmasi serta menambah daya guna kulit kayu mahoni sebagai antihiperkolesterolemia.
TINJAUAN PUSTAKA Mahoni (Swietenia macrophylla King) Mahoni berdaun lebar atau Swietenia macrophylla King merupakan tanaman tropis yang berasal dari Amerika. Habitat tumbuh tanaman ini tersebar dari Amerika Tengah sampai Amerika Selatan, sedangkan daerah penanaman terbesar berada di Asia Selatan, Asia Tenggara, dan Pasifik. Swietenia macrophylla King tergolong dalam famili Meliaceae dan subfamili Swietenoideae (Krisnawati et al. 2011). Mahoni berdaun lebar dapat tumbuh hingga mencapai tinggi 40-60 meter dan lingkar batang 3-4 meter. Daun mahoni yang masih muda berwarna merah dan berwarna hijau gelap setelah tua, bertandan, tulang daun menyirip, dan tepian daun rata. Batangnya kokoh, berbentuk bulat, banyak cabang, dan bergetah. Bunganya majemuk, berukuran kecil, dan berwarna putih. Tanaman ini memiliki kulit kayu berwarna abu-abu dan halus ketika masih muda kemudian menjadi
2
berwarna coklat tua dengan kulit yang menggembung dan mengelupas. Buah mahoni berwarna coklat dan berisi 35-45 biji. Biji mahoni berwarna coklat, lonjong, dan padat (Joker & Schmidt 2000). Penampakan pohon mahoni ditunjukkan pada Gambar 1. Mahoni dapat tumbuh dengan baik di daerah tropis seperti Indonesia. Sejak 20 tahun terakhir, mahoni mulai dibudidayakan di Indonesia karena kayunya memiliki nilai ekonomis yang cukup tinggi. Kayu mahoni memiliki kualitas kayu yang keras dan kuat. Mahoni sering dijadikan bahan baku pada industri kayu seperti meubel, papan, pembuatan perabot kayu, bingkai, hiasan interior, dan ukiran (Suhesti et al. 2007). Mahoni telah banyak digunakan sebagai bahan obat tradisional untuk menyembuhkan berbagai penyakit. Sebagai contoh, masyarakat India telah menggunakan biji mahoni sebagai antidiare. Biji mahoni memiliki aktivitas antiinflamasi, antimutagen, dan antitumor (Goh & Habsah 2011), antibakteri dan antifungi (Murningsih et al. 2005). Ekstrak metanol biji mahoni memiliki efek hipoglikemia dan hipolipidemia (Maiti et al. 2008). Ekstrak etil asetat biji mahoni berkhasiat sebagai antikanker (Goh & Habsah 2011). Ekstrak metanol daun mahoni memiliki aktivitas antifungi, antibakteri, dan antioksidan dengan senyawa aktif seperti tanin, total fenolik, dan total flavonoid (Tan et al. 2009). Bagian lain dari mahoni yang telah diketahui memiliki khasiat untuk menyembuhkan berbagai penyakit adalah kulit kayunya. Kulit kayu mahoni memiliki aktivitas anti-HIV, antimikrob, antimalaria, antitumor dan berguna dalam pengobatan hipertensi. Pengujian in vitro ekstrak kulit mahoni menunjukkan aktivitas antimikrob dan antifungi (Dewanjee et al. 2007). Ekstrak air kulit kayu mahoni dapat menurunkan tingkat peroksidasi lipid (Lavenia 2010; Siburian 2011; Nasution 2011), mencegah kenaikan kadar kolesterol darah dengan dosis 21 mg/kgBB (Mustika 2010), dan menurunkan kolesterol darah dengan dosis 300 mg/kg BB (Ferdiansyah 2012). Kulit kayu mahoni menjadi limbah yang berpotensi sebagai bahan obat alami karena didukung oleh senyawa-senyawa aktif yang terkandung di dalamnya. Menurut Ningsih (2010), ekstrak kulit kayu mahoni mengandung senyawa tanin, terpenoid, saponin, alkaloid, dan flavonoid. Kulit kayu mahoni mengandung katekin, epikatekin, dan swietemakrofilanin (Falah et al. 2008).
Daun Batang
Kulit kayu
Gambar 1 Pohon mahoni macrophylla King)
(Swietenia
Nanopartikel Nanopartikel didefinisikan sebagai partikel yang berbentuk padat dengan ukuran sekitar 1–1000 nm. Pembuatan teknologi nanopartikel ini sangat bergantung pada metode preparasi yang dilakukan, baik dalam bentuk nanosphere atau nanokapsul. Nanopartikel berperan dalam sistem pengantaran obat sebagai pembawa (carrier) dengan cara melarutkan, menjebak, atau menempelkan obat di dalam matriksnya. Ukuran partikel dan karakteristik permukaan nanopartikel dapat dimanipulasi sesuai dengan target pengobatan. Penggunaan nanopartikel juga dapat memperluas permukaan obat sehingga meningkatkan kelarutan obat dalam sistem pengantaran obat. Sistem nanopartikel dapat diterapkan untuk berbagai sasaran pengobatan. Nanopartikel dapat masuk ke dalam sistem peredaran darah dan dibawa oleh darah menuju target pengobatan (Mohanraj & Chen 2006). Penelitian nanopartikel sedang berkembang pesat karena dapat diaplikasikan secara luas dalam bidang pertanian, industri, pangan, biomedis, dan farmasi. Penggunaan nanopartikel memiliki banyak keuntungan dalam meningkatkan akurasi obat pada target dan mengendalikan pelepasan senyawa aktif seperti obat. Pengendalian pelepasan obat dilakukan agar penggunaan obat lebih efisien, memperkecil efek samping, dan mengurangi frekuensi penggunaan obat. Senyawa aktif dapat terletak di dalam kapsul atau tersebar di permukaan kapsul (Mozafari et al. 2006). Nanopartikel dapat dibuat dengan dispersi polimer, polimerisasi monomer, dan gelasi ionik. Dispersi polimer merupakan teknik umum yang digunakan untuk membuat nanopartikel biodegradabel dari PLA (polylactic acid), PLG (poly-D,Lglycolide), PLGA
3
(poly-D,L-lactide-co-glycolide), dan PCA (poly-cyanoacrylate). Teknik dispersi polimer ini dapat digunakan dalam berbagai cara, antara lain metode evaporasi pelarut dan metode difusi pelarut. Polimer dan obat masing-masing dilarutkan dalam pelarut organik. Campuran larutan polimer dan obat tersebut kemudian diemulsifikasi dalam larutan yang mengandung surfaktan untuk membentuk emulsi minyak dalam air (o/w). Setelah emulsi yang terbentuk stabil, pelarut kemudian diuapkan. Metode polimerisasi monomer dilakukan untuk membentuk nanopartikel dalam larutan berair. Suspensi nanopartikel selanjutnya dipisahkan dari penstabil dan surfaktan yang digunakan dengan ultrasentrifugasi dan partikel disuspensikan kembali dalam medium yang isotonis (Mohanraj & Chen 2006). Metode yang umum digunakan dalam pembuatan nanopartikel adalah gelasi ionik. Gelasi ionik merupakan pembentukan gel karena adanya ikatan silang ionik antara rantai-rantai polimer. Salah satu contoh metode gelasi ionik adalah mencampurkan polimer kitosan dengan polianion sodium tripolifosfat yang menghasilkan interaksi antara muatan positif pada gugus amino kitosan dengan muatan negatif tripolifosfat. Tripolifosfat dianggap sebagai zat pengikat silang yang paling baik digunakan dalam pembuatan nanopartikel (Mohanraj & Chen 2006). Menurut Suptijah et al. (2011), pengecilan ukuran polimer dengan metode gelasi ionik dapat dilakukan dengan menggunakan alat pengaduk magnetik, homogenizer, atau ultrasonikator. Penggunaan pengaduk magnetik dalam pembuatan nanopartikel didasarkan pada teori kinetik molekul yaitu molekul dapat bertumbukan satu dengan lainnya. Molekul kitosan dapat bertumbukan satu sama lain akibat putaran yang disebakan oleh adanya hubungan antara dua magnet. Semakin besar intensitas kecepatan putaran dari pengaduk magnetik maka tumbukan antara molekul kitosan lebih sering terjadi sehingga partikel yang dihasilkan menjadi semakin kecil. Penyebaran energi juga cenderung lebih merata sehingga ukuran partikelnya cenderung lebih homogen (Suptijah et al. 2011). Karakterisasi nanopartikel umumnya dilakukan dengan teknik mikroskop elektron [TEM, SEM], difraksi sinar X [XRD], mikroskop atomic [AFM], spektroskopi infra merah (FTIR), spektroskopi UV-Vis, dan analisis ukuran partikel (PSA) (Poole & Owens 2003).
Kitosan Kitosan merupakan polimer alami yang didapatkan dari proses penghilangan gugus asetil (deasetilasi) kitin. Kitosan memiliki rantai polisakarida β(1→4)-2-amino-2-deoksiDglukosa dengan rumus kimia (C6H11NO4)n (Gambar 2). Bobot molekul kitosan berkisar antara 38000-20000000 Dalton dengan derajat deasetilasi antara 66% - 95% (Agnihotri et al. 2004). Kedua karakteristik kitosan ini berperan penting untuk sifat fisikokimia dan efek biologisnya. Sifat fisikokimia kitosan meliputi ukuran partikel, warna, kelarutan, derajat deasetilasi, nilai pH, kristalinitas, kadar abu, dan kadar air. Derajat deasetilasi menunjukkan banyaknya gugus amino bebas dalam polisakarida. Gugus asetil (NHCOCH3) dari rantai molekular kitin diubah menjadi gugus amina lengkap (-NH2) pada proses deasetilasi kitin (Li et al. 2008). Kitosan bersifat tidak larut dalam air, namun kitosan mampu larut dalam asam dengan konsentrasi 1-3%. Kitosan bersifat polikationik dalam suasana asam karena adanya protonasi gugus amino dari rantai polimer. Kitosan juga bersifat biokompatibel, biodegradable, tidak bereaksi secara kimia dengan senyawa aktif yang dibawa, dan tidak toksik (Agnihotri et al. 2004). Kitosan memiliki sifat antibakteri, antitumor, koagulan, dan mampu berperan sebagai adsorben logam berat seperti merkuri. Kitosan juga mampu berperan sebagai antikolesterol dengan menurunkan kolesterol LDL dan meningkatkan HDL (Aranaz et al. 2009). Kitosan banyak digunakan dalam teknologi pengantaran obat. Penggunaan kitosan dapat meningkatkan efisiensi obat tanpa menimbulkan efek samping pada tubuh. Kitosan berperan sebagai matriks dalam sistem pengantaran obat dengan membentuk gel dalam suasana asam. Gel kitosan merupakan jejaring polimer kitosan yang dapat menampung sejumlah air di dalam strukturnya dan mengembang tanpa melarut di dalamnya (Wang et al. 2004). Gel kitosan dapat terbentuk karena adanya tautan silang ionik antara polimer kitosan dengan suatu counter-ion seperti TPP (Ko et al. 2003).
Gambar 2 Struktur kimia kitosan (Aranaz et al. 2009)
4
Uji Potensi Hayati terhadap Larva Udang (Artemia salina Leach) Uji potensi hayati atau bioaktivitas dilakukan untuk mengamati aktivitas farmakologi suatu senyawa. Metode brine shrimp lethality test (BSLT) umumnya digunakan untuk mengetahui potensi hayati suatu senyawa. Uji ini dilakukan dengan mengamati tingkat kematian larva A. salina Leach. Tingkat kematian (mortalitas) yang diperoleh kemudian diolah dengan analisis probit untuk menentukan LC50 (lethal concentration 50%). LC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan kematian populasi larva A. salina Leach sebesar 50% dari populasi total. Suatu senyawa dikatakan berpotensi bioaktif bila memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm. Uji potensi hayati merupakan pengujian awal suatu ekstrak sebelum dilakukan uji toksisitas akut atau uji aktivitas lainnya. Hasil uji ini dapat digunakan untuk menentukan batas atau kisaran konsentrasi ekstrak (Meyer et al. 1982). Artemia salina Leach tergolong kelompok udang (Crustaceae) dari filum Arthropoda. A. salina Leach hidup sebagai zooplankton di perairan yang berkadar garam tinggi. Keunggulan penggunaan A. salina Leach adalah sifatnya yang peka terhadap ekstrak, waktu siklus hidup yang lebih cepat, mudah dibiakkan, dan murah. Kepekaan A. salina Leach terhadap ekstrak disebabkan oleh keadaan membran kulitnya yang sangat tipis sehingga memungkinkan terjadinya difusi zat dari lingkungan yang dapat mempengaruhi metabolisme dalam tubuhnya (Meyer et al. 1982). Kelebihan metode BSLT antara lain biaya relatif murah, sederhana, cepat, praktis, dan memiliki spektrum aktivitas farmakologi yang luas. Selain itu, jumlah sampel yang digunakan relatif sedikit dan tidak memerlukan serum hewan. Hasil uji berkorelasi baik dengan beberapa metode uji sitotoksik (Meyer et al. 1982). Hiperkolesterolemia Kolesterol merupakan senyawa penyusun membran sel hewan. Kebutuhan kolesterol sehari-hari umumnya dapat terpenuhi oleh tubuh melalui sintesis di dalam tubuh (endogen). Biosintesis kolesterol pada tubuh berlangsung di dalam usus, kulit, dan terutama dalam hati (sekitar 50%), selebihnya kolesterol diambil dari bahan makanan (eksogen) (Koolman & Roehm 2005). Kolesterol eksogen akan dialirkan melalui darah. Bila kolesterol dihidrolisis lebih lanjut
maka akan menjadi asam empedu dan garamgaramnya (dalam hati) dan menjadi hormon steroid (dalam kelenjar endokrin) (Marks et al. 2000). Hiperkolesterolemia adalah kondisi saat konsentrasi kolesterol di dalam darah melebihi batas normal. Seseorang dikatakan mengalami hiperkolesterolemia apabila memiliki total kolesterol plasma (TPC) melebihi 240 mg/dL. Sementara itu, TPC normal manusia adalah kurang dari 200 mg/dL. Diet tinggi kolesterol dan lemak jenuh dapat menekan pembentukan reseptor Low Density Lipoprotein (LDL), sehingga meningkatkan jumlah kolesterol yang beredar di dalam darah, keadaan ini dapat memicu terjadinya hiperkolesterolemia. Selain itu, hiperkolesterolemia juga dapat terjadi karena beberapa faktor, seperti bobot badan, usia, kurang olahraga, stres emosional, gangguan metabolisme, pola makan, dan kelainan genetik (Marks et al. 2000). Sintesis kolesterol berlangsung hampir pada seluruh jaringan hewan, tetapi pada hewan mamalia aktivitas biosintesis kolesterol yang tertinggi terjadi pada organ hati, kelenjar adrenal, ovarium, dan testis (Valenzuela et al. 2003). Prekursor yang digunakan oleh hati untuk mensintesis kolesterol adalah asetil Koenzim-A (asetil KoA) yang merupakan hasil metabolisme karbohidrat, protein, atau lemak (Koolman & Roehm 2005). Biosintesis kolesterol dapat dibagi menjadi lima tahap. Tahap pertama merupakan sintesis mevalonat dari asetil KoA. Pada tahap ini, pembentukan mevalonat dikatalisis dari 3hidroksi-3-metilglutaril-KoA (HMG-KoA) dengan bantuan enzim HMG-KoA reduktase. Tahapan kedua adalah pembentukan unit isoprenoid dari mevalonat dengan cara menghilangkan CO2. Tahapan ketiga adalah kondensasi enam unit isoprenoid membentuk skualena. Tahapan keempat adalah siklisasi skualena menghasilkan senyawa steroid induk yaitu lanosterol. Tahapan terakhir adalah pembentukan kolesterol dari lanosterol (Murray et al. 2009). Obat-obatan Penurun Kolesterol Banyak obat-obatan penurun kolesterol yang dijual secara komersil. Obat-obatan yang biasa digunakan untuk menurunkan kadar kolesterol dibagi menjadi empat golongan yaitu resin pengikat empedu (sequestrans), asam nikotinat (niasin), asam fibrat, dan statin. Sequestrans bekerja dengan mengikat asam empedu sehingga tetap berada di dalam usus dan tidak terjadi proses resirkularisasi ke hati. Akibatnya, penggunaan kolesterol di hati
5
sebagai bahan baku getah empedu meningkat sehingga cadangan kolesterol di hati menurun. Contohnya adalah kolesteriamin dan kolestipol. Niasin bekerja dengan menghambat pembentukan lipoprotein yaitu mengurangi kecepatan pembentukan VLDL dan meningkatkan HDL (Murray et al. 2009). Asam fibrat bekerja dengan cara meningkatkan aktivitas lipoprotein lipase sehingga menghambat produksi VLDL di hati dan meningkatkan aktivitas reseptor LDL. Contohnya adalah simfibrat, gemfibrosil, fenofibrat, flofibrat, bezafibrat, dan sifofibrat. Obat golongan statin bekerja sebagai inhibitor kompetitif dari enzim HMG-KoA reduktase. Bila jumlah obat ini cukup besar untuk berikatan dengan HMG-KoA reduktase maka asam mevalonat tidak akan terbentuk sehingga terjadi penurunan kolesterol intrasel. Obat ini juga dapat menghambat sintesis VLDL di hati sehingga produksi kolesterol LDL menurun dan meningkatkan jumlah reseptor LDL. Contohnya adalah fluvastatin, lovastatin, pravastatin, simvastatin, dan atorvastatin. Pemberian obat penurun kolesterol secara rutin kepada penderita hiperkolesterolemia dapat menurunkan kadar kolesterol darah hingga 30% (Murray et al. 2009). Selain obat-obatan komersil, masyarakat Indonesia sering menggunakan bahan alami penurun kolesterol. Ekstrak air kulit kayu mahoni dengan dosis 300 mg/kg BB mampu menurunkan kolesterol darah pada tikus (Ferdiansyah 2012). Kenaikan kadar kolesterol darah pada tikus dapat dicegah dengan pemberian ekstrak air kulit kayu mahoni sebesar 21 mg/kgBB (Mustika 2010). Ariyani (2010) menyatakan bahwa ekstrak seduhan teh herbal lempuyang gajah mampu menurunkan kolesterol darah tikus sebesar 51.70%. Jamur shitake (Lentinus edodes) dan jamur shimeji juga diketahui memiliki aktivitas antikolesterol (Cohen et al. 2002). Leontowicz et al. (2002) menyatakan bahwa apel Israel (Malus sylvestris) memiliki efek hipokolesterolemia lebih baik dibandingkan buah pear dan peach. Selain itu, kacang Velvet (Mucuna pruriens L.) (Ratnawati & Wahyu 2012), bawang putih (Hernawan & Ahmad 2003), dan jati belanda (Wahyudi 2009), juga berperan sebagai bahan alami penurun kolesterol darah. Enzim HMG-KoA reduktase Enzim merupakan katalis biologis yang mampu mengubah substrat menjadi produk dengan menurunkan energi aktivasi dari reaksi tersebut sehingga reaksi berjalan lebih cepat
(Nelson & Cox 2008). Enzim HMG-KoA reduktase (EC 1.1.1.88) memiliki nama sistematik 3-hidroksi-3-metilglutaril-KoA reduktase. Enzim ini berperan dalam mengkatalisis reduksi HMG-KoA menjadi koenzim A (KoA) dan mevalonat. Reaksi katalisis enzim HMG-KoA reduktase (HMGR) ditunjukkan pada Gambar 3. Terdapat tiga tahapan reaksi katalsisis enzim HMGR. Tahap pertama, HMG-KoA direduksi menjadi mevaldil-KoA dengan bantuan NADPH. NADPH kemudian akan teroksidasi menjadi NADP+. Pada tahap kedua, terjadi pembentukan mevaldehid dengan melepas satu molekul KoA-SH dari mevaldil-KoA. Pada tahap ketiga, mevaldehid akan direduksi menjadi mevalonat dengan bantuan NADPH. NADPH akan teroksidasi kembali menjadi NADP+. Secara keseluruhan, reaksi katalisis enzim HMGR membutuhkan dua molekul NADPH untuk mereduksi HMG-KoA menjadi produknya yaitu mevalonat (Silverman et al. 2004). Inhibisi terhadap enzim HMGR menyebabkan penurunan kolesterol intrasel. Obat golongan statin seperti pravastatin biasa digunakan untuk menghambat aktivitas enzim ini. Obat golongan statin bekerja sebagai inhibitor kompetitif (Guerrrero et al. 2002). Inhibitor kompetitif merupakan penghambat yang mampu bersaing dengan substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim sehingga mengalami perubahan nilai Km (Nelson & Cox 2008). Bila konsentrasi obat golongan statin lebih tinggi dibandingkan substrat HMG-KoA, maka enzim HMGR akan cenderung berikatan dengan obat golongan statin sehingga produk akhir yang terbentuk yaitu mevalonat akan berkurang (Guerrrero et al. 2002). Pengujian aktivitas penghambatan terhadap enzim HMGR dilakukan secara in vitro dengan menggunakan metode spektrofotometri. Pengujian ini membutuhkan HMG-KoA sebagai substrat dan NADPH sebagai koenzim. Banyaknya NADPH sisa diukur setiap 20 detik. NADPH merupakan nikotinamida dalam keadaan tereduksi. NADPH menjadi indikator karena mudah menyerap sinar ultraviolet dan mudah teroksidasi dalam kondisi asam maupun basa. Jumlah NADPH sisa menjadi lebih banyak bila ada inhibitor. Semakin besar kemampuan inhibitor untuk menghambat aktivitas enzim HMGR, maka konsumsi NADPH akan lebih sedikit atau jumlah NADPH sisa lebih banyak dibandingkan tanpa penambahan inhibitor (Perchellet et al. 2009).
6
Gambar 3 Reaksi katalisis enzim HMG-KoA reduktase (Silverman et al. 2004)
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan didanai oleh Program Penelitian Strategis Unggulan IPB atas nama Dr. Syamsul Falah S.Hut., M.Si. pada tahun 2012. Kulit kayu mahoni yang digunakan berasal dari daerah Sumedang, Jawa Barat. Kulit kayu mahoni yang digunakan diambil dari pohon yang berumur sekitar 30-35 tahun. Bahan-bahan yang digunakan untuk uji potensi hayati dan penghambatan HMG-KoA reduktase adalah akuades, kertas saring, kitosan, asam asetat, sodium tripolyphosphate (STPP), Tween 80, kista larva Artemia salina Leach, air laut, dan kit assay HMG-KoA reduktase. Kit assay HMG-KoA reduktase dari Sigma Aldrich dengan nomor katalog CS1090 terdiri atas bufer assay 1x, NADPH, HMG-KoA, HMG-KoA reduktase (HMGR), pravastatin, dan akuabides. Alat-alat yang digunakan antara lain mesin giling Wiley Mill, labu Erlenmeyer, gelas piala, pengaduk magnetik, stirer, pipet Mohr, pipet tetes, bulp, pengering semprot (spray dryer), neraca analitik, aerator, lampu, tabung reaksi, tabung vial, kaca pembesar, pipet mikro, tip, microplate, dan microplate reader BIO-RAD Model 680 XR. Metode Ekstraksi Kulit Kayu Mahoni Ekstraksi kulit kayu mahoni dilakukan dengan metode rebusan dengan air. Metode ekstraksi ini mengikuti metode yang
dilakukan oleh Mardisadora (2010). Serbuk kulit kayu mahoni yang telah digiling dengan mesin Wiley Mill sampai berbentuk serbuk berukuran 60 mesh ditimbang sebanyak 500 g dan ditambahkan air dengan perbandingan 1:10 (1 gram serbuk dalam 10 mL air). Kulit kayu mahoni kemudian direbus pada suhu 100ºC selama 2 jam. Ekstrak yang diperoleh disaring dan diuapkan filtratnya dengan evaporator pada suhu 60ºC hingga diperoleh ekstrak kasar kering. Pembuatan Nanopartikel Ekstrak Kulit Kayu Mahoni Pembuatan nanopartikel dilakukan dengan metode gelasi ionik dengan perlakuan pengecilan ukuran menggunakan pengaduk magnetik. Metode pembuatan nanopartikel ini mengikuti metode yang dilakukan oleh Hermanus (2012). Sebanyak 4 g kitosan dilarutkan 400 mL asam asetat 1% sehingga diperoleh konsentrasi kitosan 1% (b/v). Larutan diaduk dengan pengaduk magnetik pada kecepatan 1000 rpm selama 60 menit. Sebanyak 200 µL Tween 80 0.1% ditambahkan sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama 30 menit pada kecepatan 1000 rpm. Setelah itu, ditambahkan 200 mL STPP 1.5% dengan pipet tetes sambil diaduk menggunakan pengaduk magnetik. Setelah diaduk selama 30 menit, sebanyak 4 mL ekstrak 5% ditambahkan ke dalam larutan sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama 15 menit pada kecepatan 1000 rpm. Larutan dikeringkan dengan pengering semprot dengan suhu inlet 140ºC dan suhu outlet 80ºC hingga diperoleh dalam bentuk serbuk.
7
Uji Potensi Hayati dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) (Meyer et al. 1982) Kista Artemia salina Leach sebanyak 50 mg dimasukkan ke dalam wadah yang berisi air laut yang sudah disaring dan dilengkapi aerator. Kista dibiarkan selama 48 jam di bawah pencahayaan lampu agar menetas sempurna. Setelah menetas, sebanyak 10 ekor larva A. salina Leach dimasukkan ke dalam vial dan ditepatkan volumenya dengan air laut hingga 1 mL. Larutan ekstrak ditambahkan sebanyak 1 mL sehingga konsentrasi akhirnya menjadi 0, 50, 100, 500, 1000, 1500, dan 2500 ppm. Setelah 24 jam, jumlah larva A. salina Leach yang mati dihitung. Nilai konsentrasi letal 50% (LC50) ditentukan dengan kurva regresi linier antara konsentrasi ekstrak dan persen kematian larva A. salina Leach. Penentuan Aktivitas Penghambatan HMGKoA Reduktase (Perchellet et al. 2009) Pengujian aktivitas penghambatan enzim HMG-KoA reduktase (HMGR) merujuk pada kit assay HMGR dari Sigma Aldrich dengan nomor katalog CS1090. Pengukuran dilakukan dengan menggunakan microplate reader. Sumur berisi blanko, kontrol, kontrol positif (pravastatin), dan sampel. Sampel terdiri atas ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni, masing-masing dengan konsentrasi 50, 75, 100, 150, dan 300 ppm. Blanko terdiri atas 184 µL bufer assay 1x, 4 µL NADPH, dan 12 µL HMG-KoA. Kontrol terdiri atas 182 µL bufer assay 1x, 4 µL NADPH, 12 µL HMG-KoA, dan 2 µL HMGR. Kontrol positif terdiri atas 181 µL bufer assay 1x, 1 µL pravastatin, 4 µL NADPH, 12 µL HMG-KoA, dan 2 µL HMGR. Sampel terdiri atas 181 µL bufer assay 1x, 1 µL sampel, 4 µL NADPH, 12 µL HMG-KoA, dan 2 µL HMGR. Microplate digoyang selama 10 detik dan diinkubasi pada suhu 37ºC. Hasil reaksi diukur tiap 20 detik selama 10 menit pada panjang gelombang 340 nm. Aktivitas spesifik dihitung setelah ditentukan kecepatan awal reaksi dengan rumus: Aktivitas spesifik =
(
)
Keterangan: Asampel = absorbansi sampel V total = volume total reaksi (mL) 12.44 = ε atau koefisien ekstingsi NADPH pada 340 nm (mM-1 cm-1) V enzim = volume enzim yang digunakan dalam assay (mL)
[enzim] = konsentrasi enzim (0.6 mg/mL) LP = light path (0.55 cm) Setelah aktivitas spesifik diketahui, persen penghambatan ekstrak dan nanopartikel ekstrak terhadap aktivitas enzim HMGR dapat dihitung dengan rumus: % Penghambatan =
x 100%
Keterangan: S = aktivitas spesifik sampel (unit/mgP) C = aktivitas spesifik kontrol (unit/mgP)
HASIL DAN PEMBAHASAN Ekstrak Kulit Kayu Mahoni Kulit kayu mahoni yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari daerah Sumedang, Jawa Barat dengan umur tanaman sekitar 3035 tahun. Kulit kayu mahoni yang telah dikeringkan dengan oven pada suhu 50 ºC kemudian digiling hingga diperoleh serbuk berukuran 60 mesh. Menurut Handa et al. (2008), semakin kecil ukuran bahan, maka semakin luas kontak antara bahan dengan pelarutnya sehingga ekstraksi menjadi semakin efektif. Ekstraksi bertujuan mengambil zat aktif yang terkandung dalam suatu bahan dengan bantuan pelarut tertentu. Ekstraksi kulit kayu mahoni dilakukan dengan metode perebusan menggunakan pelarut air yang diacu pada penelitian Mardisadora (2010). Metode perebusan ini dipilih karena lebih mudah dan sederhana. Selain itu, perebusan serbuk kulit kayu mahoni dilakukan untuk menghindari kerusakan ekstrak dari mikroba. Pemilihan pelarut air juga didasarkan pada kebiasaan masyarakat Indonesia yang sering mengonsumsi obat tradisional dengan melarutkannya dalam air panas. Selain itu, air merupakan pelarut yang sifatnya polar sehingga mampu melarutkan senyawa polar yang terkandung dalam suatu bahan. Senyawa polar yang ingin diekstrak dari kulit kayu mahoni diduga berupa senyawa-senyawa fenolik. Hasil rebusan disaring dan diuapkan pelarutnya dengan rotary vaccum evaporator pada suhu 60 ºC hingga diperoleh ekstrak kulit kayu mahoni dalam bentuk serbuk (Gambar 4). Ekstraksi serbuk kulit kayu mahoni sebanyak 475.65 gram dengan lima kali ulangan menghasilkan ekstrak sebanyak 44.67 gram dengan nilai rendemen 9.39%
8
(Lampiran 6). Nilai rendemen pada penelitian ini lebih besar dibandingkan penelitian yang dilakukan Mardisadora (2010) sebesar 6.44%. Tingginya nilai rendemen ini menunjukkan bahwa senyawa aktif yang diperoleh lebih banyak. Perbedaan nilai rendemen dapat dipengaruhi oleh umur tanaman dan lingkungan tumbuhnya tanaman (Nurcholis 2008). Semakin tua umur tanaman maka metabolit sekunder yang terkandung semakin banyak. Kulit kayu mahoni yang digunakan Mardisadora (2010) berasal dari pohon mahoni yang berumur 20-25 tahun sedangkan pada penelitian ini digunakan kulit kayu mahoni dari pohon yang berumur 30-35 tahun.
Gambar 4 Ekstrak air kulit kayu mahoni Nanopartikel Ekstrak Kulit Kayu Mahoni Pembuatan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni dilakukan dengan metode gelasi ionik dengan perlakuan pengecilan ukuran menggunakan pengaduk magnetik. Semakin besar kecepatan putaran dari pengaduk magnetik maka semakin banyak tumbukan yang terjadi antara molekul kitosan sehingga ukuran partikel yang dihasilkan semakin kecil (Suptijah et al. 2011). Penggunaan pengaduk magnetik dalam pembuatan nanopartikel mempengaruhi pendistribusian ukuran partikel yang lebih merata. Rendemen nanopartikel yang dihasilkan juga lebih banyak yaitu 53.31% (Lampiran 7). Menurut Rachmania (2011), rendemen nanopartikel yang dihasilkan dengan penggunaan pengaduk magnetik lebih besar daripada ultrasonikator dan homogenizer. Rendemen yang besar memungkinkan untuk produksi dalam skala industri. Pemilihan metode pembuatan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni juga didasarkan pada metode terbaik dari hasil penelitian Hermanus (2012) dengan komposisi larutan kitosan 1% dan STPP 1.5%. Berdasarkan hasil analisis ukuran partikel (particle size analyzer atau PSA) yang dilakukan Hermanus (2012), ukuran nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni adalah 101.11 nm dengan sebaran ukuran partikel berkisar antara 40.75-338.93 nm.
Sementara itu, hasil mikroskop elektron payaran (scanning electron microscope atau SEM) yang dilakukan Hermanus (2012) menunjukkan morfologi permukaan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni yang tidak rata dan tidak berbentuk bulat sehingga dari gambaran morfologi tersebut belum terlihat apakah ekstrak berada dalam keadaan tersalut atau menempel pada permukaan matriks kitosan. Pembuatan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni menggunakan kitosan yang dilarutkan dalam asam, STPP 1.5%, dan Tween 80 0.1%. Kitosan digunakan karena sifatnya non toksik sehingga dapat berperan sebagai pengantar obat yang mampu meningkatkan efisiensi obat tanpa menimbulkan efek samping pada tubuh. STPP berperan membentuk ikatan silang ionik sehingga mampu memperkuat matriks nanopartikel (Ko et al. 2003). Partikel kitosan semakin kuat dan sulit terpecah menjadi bagian yang lebih kecil bila digunakan STPP berlebihan. Tween 80 merupakan surfaktan non ionik dan bersifat non toksik. Surfaktan dapat menurunkan tegangan permukaan antara lapisan larutan bahan dan kitosan sehingga bahan akan menyaluti permukaan matriks kitosan atau berada pada inti matriks (Latifah 2010). Menurut Mohanraj & Chen (2006), penambahan bahan obat setelah terbentuknya polimer dapat memperbesar kemungkinan terjerapnya obat dalam matriks kitosan. Sampel hasil pengaduk magnetik dikeringkan dengan pengering semprot. Pengeringan semprot menggunakan panas untuk menguapkan air ketika larutan sampel disemprotkan (Patel et al. 2009). Suhu pada awal penyemprotan sebesar 140 ºC (inlet) dan suhu saat sampel keluar dari tabung penguap sebesar 80 ºC (outlet). Suhu inlet di bawah 140 ºC menyebabkan sampel tidak bisa kering sempurna sehingga menempel pada dinding tabung pengering semprot (Zuidam & Nedovic 2010). Nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni hasil pengeringan semprot memiliki bentuk butiran atau granul yang halus dan kering (Gambar 5).
Gambar 5 Nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni
9
Potensi Hayati Ekstrak Kulit Kayu Mahoni dengan BSLT Uji potensi hayati menggunakan metode brine shrimp lethality test (BSLT) terhadap larva Artemia salina Leach dilakukan sebagai uji pendahuluan untuk mengetahui efek farmakologi suatu senyawa. Hasil uji potensi hayati berupa nilai konsentrasi letal 50% (LC50) yang akan digunakan dalam penentuan batas konsentrasi ekstrak pada uji penghambatan enzim HMG-KoA reduktase (HMGR). LC50 merupakan konsentrasi yang menyebabkan kematian populasi larva A. salina Leach sebesar 50% dari populasi total (Meyer et al. 1982). Nilai LC50 ditentukan dari kurva regresi linear yaitu hubungan antara konsentrasi ekstrak terhadap persentase kematian larva A. salina Leach (Lampiran 8). Persentase kematian larva A. salina Leach pada kontrol sebesar 0% menunjukkan bahwa pelarut berupa air laut yang digunakan tidak menyebabkan kematian larva A. salina Leach sehingga kualitas lingkungan tempat hidupnya dinilai baik. Kematian larva A. salina Leach mulai terjadi setelah penambahan ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni dengan konsentrasi di atas 500 ppm. Nilai LC50 menggunakan metode BSLT dari ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni ditunjukkan pada Tabel 1. Ekstrak air kulit kayu mahoni memiliki nilai LC50 sebesar 1254.97 ppm sedangkan nanopartikelnya sebesar 1567.00 ppm. Kedua sampel dikatakan memiliki efek farmakologis yang rendah dilihat dari nilai LC50-nya. Suatu senyawa dapat dikatakan memiliki efek farmakologis yang tinggi apabila memiliki nilai LC50 kurang dari 1000 ppm (Meyer et al. 1982). Tabel 1 Nilai LC50 ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni Sampel LC50 (ppm) Ekstrak air 1254.97 Nanopartikel ekstrak 1567.00 Daya Hambat HMG-KoA Reduktase Uji penghambatan HMG-KoA reduktase (HMGR) oleh ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni dilakukan dengan metode spektrofotometri menggunakan microplate reader. Pengujian aktivitas penghambatan enzim HMGR merujuk pada kit assay enzim HMGR dari Sigma Aldrich dengan nomor katalog CS1090. Konsentrasi
ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni yang digunakan pada pengujian terhadap aktivitas penghambatan enzim HMGR secara in vitro adalah konsentrasi yang berada di bawah nilai LC50. Konsentrasi yang digunakan dalam pengujian sebesar 50, 75, 100, 150, dan 300 ppm untuk ekstrak (Lampiran 10) dan nanopartikel ekstrak (Lampiran 11). Pengujian juga dilakukan terhadap kontrol (tanpa inhibitor) dan kontrol positif (dengan penambahan pravastatin). Pravastatin merupakan obat sintetik yang biasa digunakan sebagai obat penurun kolesterol. Pravastatin memiliki struktur kimia mirip dengan substrat HMG-KoA dan bekerja dengan menghambat aktivitas enzim HMGR secara kompetitif (Singhvi et al. 1990). HMG-KoA berperan sebagai substrat dalam reaksi enzim sedangkan NADPH berperan sebagai koenzim. Prinsip uji penghambatan HMGR berdasarkan proses reduksi HMG-KoA menjadi mevalonat dan KoASH dengan bantuan NADPH yang akan teroksidasi menjadi NADP+. NADPH sisa pada assay enzim diukur dengan metode spektrofotometri pada panjang gelombang 340 nm. Nilai absorbansi dibaca tiap 20 detik selama 10 menit untuk melihat adanya aktivitas enzim HMGR yang ditandai dengan penurunan absorbansi NADPH sisa tiap detiknya. Bila terdapat inhibitor, jumlah NADPH yang tersisa lebih banyak dibandingkan kontrol sehingga nilai absorbansi yang terbaca akan lebih tinggi daripada kontrol. Penurunan nilai absorbansi NADPH pada kontrol yang tidak berisi inhibitor (Lampiran 12) menunjukkan bahwa enzim HMGR aktif bekerja untuk mereduksi HMG-KoA menjadi mevalonat sehingga membutuhkan NADPH. Akibatnya, NADPH yang tersisa akan semakin berkurang. Penurunan nilai absorbansi NADPH sisa juga terlihat pada kontrol positif yaitu pravastatin (Lampiran 12). Namun, nilai absorbansinya lebih tinggi dibandingkan kontrol. Hal ini memperlihatkan adanya peran pravastatin sebagai inhibitor enzim HMGR. Adanya inhibitor yaitu pravastatin menyebabkan terjadinya penghambatan aktivitas enzim HMGR sehingga jumlah NADPH sisa yang terukur lebih banyak daripada kontrol. Sama halnya dengan pravastatin, penurunan absorbansi NADPH sisa juga terjadi pada assay yang diberi tambahan ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni (Lampiran 12) dengan berbagai variasi konsentrasi. Hal ini menunjukkan bahwa kedua sampel juga
10
berperan sebagai inhibitor enzim HMGR. Kemampuan penghambatan keduanya dibuktikan lebih jelas setelah persen penghambatannya dihitung. Pengukuran aktivitas penghambatan enzim HMGR dilakukan dengan menentukan kecepatan awal reaksi (vo) dari kurva kontrol (tanpa inhibitor). Kecepatan awal reaksi (vo) ditentukan berdasarkan laju linear maksimum pada kurva yang menghubungkan antara waktu dan nilai absorbansi. Waktu terjadinya laju linear maksimum pada reaksi enzim (to) adalah 1.33 menit yang ditunjukkan dalam Lampiran 13. Setelah to diketahui, aktivitas spesifik kemudian dihitung. Aktivitas spesifik pada reaksi enzim HMGR didefinisikan sebagai jumlah mikromol NADPH sisa per menit per milligram protein pada suhu 37 ºC. Semakin tinggi aktivitas spesifik menunjukkan bahwa daya hambat terhadap enzim HMGR semakin tinggi. Hasil perhitungan aktivitas spesifik ditunjukkan pada Tabel 2. Aktivitas spesifik pada kontrol (tanpa inhibitor) adalah 10.94 unit/mgP, sedangkan pravastatin sebesar 13.22 unit/mgP. Adanya penambahan inhibitor menyebabkan nilai aktivitas spesifik lebih tinggi karena jumlah NADPH sisa lebih banyak. Nilai aktivitas spesifik tertinggi dimiliki oleh ekstrak 150 ppm sebesar 13.76 unit/mgP, sedangkan nanopartikel ekstrak 300 ppm sebesar 12.75 unit/mgP. Aktivitas spesifik pada nanopartikel ekstrak lebih rendah dibandingkan ekstrak pada konsentrasi yang sama dan pravastatin. Hal ini menunjukkan sedikitnya jumlah NADPH sisa pada nanopartikel ekstrak. Setelah aktivitas spesifik diketahui, persentase penghambatan enzim HMGR oleh sampel dapat dihitung dengan membandingkannnya terhadap kontrol. Daya hambat ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni dengan kelima konsentrasi (Gambar 6) memperlihatkan bahwa keduanya berpotensi sebagai inhibitor aktivitas enzim HMGR karena mampu menghambat aktivitas enzim HMGR. Pravastatin yang digunakan sebagai kontrol positif menunjukkan adanya aktivitas penghambatan enzim HMGR dengan daya hambat sebesar 20.78% (Tabel 2). Daya hambat oleh ekstrak 50, 75, 100, 150, dan 300 ppm berturut-turut sebesar 4.92%, 10.93%, 17.03%, 25.71%, dan 23.29%. Daya hambat oleh nanopartikel ekstrak 50, 75, 100, 150, dan 300 ppm berturut-turut sebesar 4.01%, 8.85%, 13.77%, 12.44%, dan 16.53%. Berdasarkan Gambar 6, dapat dilihat daya hambat maksimum terhadap
aktivitas enzim HMGR dimiliki oleh ekstrak 150 ppm sebesar 25.71%, sedangkan daya hambat maksimum enzim HMGR oleh nanopartikel ekstrak sebesar 16.53% dengan konsentrasi nanopartikel ekstrak 300 ppm. Bila daya hambat kedua sampel dibandingkan, maka dapat dilihat bahwa ekstrak kulit kayu mahoni lebih berpotensi sebagai inhibitor HMGR daripada nanopartikelnya. Hal ini disebabkan kemampuan ekstrak kulit kayu mahoni dalam menghambat aktivitas enzim HMGR cenderung lebih besar dengan konsentrasi ekstrak yang lebih kecil daripada nanopartikelnya. Rendahnya daya hambat nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni dapat disebabkan oleh rendahnya kandungan ekstrak dalam nanopartikel. Kandungan ekstrak pada nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni 300 ppm hanya sebesar 0.0156 gram sehingga terdapat kemungkinan kitosan yang lebih berperan sebagai inhibitor enzim HMGR. Pengukuran daya hambat enzim HMGR pada penelitian ini tidak menggunakan nanokitosan sehingga tidak bisa dibandingkan dengan hasil penghambatan enzim HMGR oleh nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni. Rendahnya aktivitas penghambatan enzim HMGR oleh nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni kemungkinan dapat disebabkan oleh pelepasan zat aktif yang kurang maksimal. Hal ini didukung oleh hasil pengujian SEM terhadap nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni yang dilakukan Hermanus (2012) dengan morfologi yang tidak rata dan tidak berbentuk bulat sehingga belum dapat diketahui tipe penyalutan ekstrak dalam matriks kitosan. Pelepasan zat aktif berhubungan dengan penyalutan zat aktif dalam nanopartikel. Menurut Tiyaboonchai & Ritthidej (2003), terdapat dua tipe penyalutan zat aktif yaitu nanokapsul dan nanosphere. Nanokapsul merupakan penyalutan zat aktif yang terjebak dalam matriks kapsul yaitu kitosan. Ada kemungkinan tidak semua zat aktif keluar dari matriks kitosan ketika dikondisikan dalam assay. Nanosphere merupakan penyalutan zat aktif sehingga zat aktif menempel di permukaan matriks. Kondisi ini membuat zat aktif mudah lepas bila dikondisikan dalam assay. Namun, adapula kemungkinan hanya sebagian ekstrak yang menempel di permukaan matriks dalam pembuatan nanopartikel sehingga pelepasan zat aktif kurang optimal. Namun, dalam penelitian ini belum diketahui apakah ekstrak terjebak atau menempel pada permukaan kitosan.
11
Tabel 2 Penghambatan enzim HMGR pada t = 1.33 menit Sampel Kontrol (tanpa inhibitor) Pravastatin Ekstrak 50 ppm Ekstrak 75 ppm Ekstrak 100 ppm Ekstrak 150 ppm Ekstrak 300 ppm Nanopartikel ekstrak 50 ppm Nanopartikel ekstrak 75 ppm Nanopartikel ekstrak 100 ppm Nanopartikel ekstrak 150 ppm Nanopartikel ekstrak 300 ppm
Aktivitas spesifik (unit/mgP) 10.94 13.22 11.48 12.14 12.81 13.76 13.49 11.38 11.91 12.45 12.30 12.75
penelitian untuk mengetahui tipe penyalutan nanopartikel. Pengujian aktivitas penghambatan enzim HMG-KoA reduktase perlu dibandingkan dengan nanokitosan. Pengujian in vivo terhadap ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni perlu dilakukan untuk mengetahui bioavailabilitas nanopartikel dalam sistem peredaran darah.
30 %Penghambatan
% Penghambatan 0.00 20.78 4.92 10.93 17.03 25.71 23.29 4.01 8.85 13.77 12.44 16.53
25 20 15 10 5 0 0
50
100
150
200
250
300
Konsentrasi (ppm)
Gambar 6 Kurva penghambatan enzim HMGR oleh ekstrak kulit kayu mahoni nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Rendemen hasil ekstraksi kulit kayu mahoni dengan perebusan air panas sebesar 9.39%. Rendemen nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni dengan metode gelasi ionik dengan pengecilan ukuran menggunakan pengaduk magnetik sebesar 53.31%. Ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni memiliki efek farmakologis yang rendah dilihat dari nilai LC50 masing-masing sebesar 1254.97 ppm dan 1567.00 ppm. Ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni berpotensi sebagai inhibitor enzim HMG-KoA reduktase. Daya hambat maksimum terhadap aktivitas enzim HMG-KoA reduktase oleh ekstrak kulit kayu mahoni (25.71% pada 150 ppm) lebih baik daripada nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni (16.53% pada 300 ppm). Saran Perlu dilakukan perbandingan ekstrak kulit kayu mahoni dengan kitosan dalam pembuatan nanopartikel untuk mengetahui konsentrasi optimum ekstrak yang mampu terjerap dalam kitosan. Perlu dilakukan
DAFTAR PUSTAKA Agnihotri SA, Mallikarjuna NN, Aminabhavi TM. 2004. Review: recent advances on chitosan-based micro- and nanoparticles in drug delivery. J Controlled Release 100: 5-28. Aranaz I et al. 2009. Functional characterization of chitin and chitosan. Current Chem Bio 3: 203-230. Ariyani R. 2010. Potensi antihiperkolesterolemia ekstrak seduhan the herbal lempuyang gajah (Zingiber zerumbet L.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Cohen R, Persky L, Hadar Y. 2002. Biotechnological applications and potential of wood-degrading mushrooms of the genus Pleurotus. Appl Microbiol Biotechnol 58: 582-594. Dewanjee S et al. 2007. In vitro evaluation of antimicrobial activity of crude extract from plants Diospyros peregrine, Coccinia grandis and Swietenia macrophylla. Trop J Phar Res 6: 773-778. Falah S, Suzuki T, Katayama T. 2008. Chemical constituents from Swietenia macrophylla bark and their antioxidant activity. Pakistan J Biol Sci 11: 20072012.
12
Ferdiansyah. 2012. Potensi ekstrak kulit kayu mahoni sebagai penurun kolesterol darah pada tikus putih hiperkolesterolemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Goh BH, Habsah AK. 2011. In vitro cytotoxic potential of Swietenia macrophylla King seeds against human carcinoma cell lines. J Med Plants Res 5: 1395-1404. Guerrrero RH et al. 2002. Kinetic properties and inhibition of Trypanosoma cruzi 3hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase. FEBS Letters 510: 141-144. Handa SS, Suman PSK, Gennaro L, Dev DR. 2008. Extraction Technologies for Medicinal Plants and Aromatic Plants. Trieste: ICS UNIDO. Herliana E, Sitanggang M. 2009. Solusi Sehat Mengatasi Kolesterol Tinggi. Jakarta: Agro Media. Hermanus DKN. 2012. Sintesis dan karakterisasi nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King) sebagai bahan suplemen antihiperkolesterolemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Hernawan UE, Ahmad DS. 2003. Senyawa organosulfur bawang putih (Allium sativum L.) dan aktivitas biologinya [ulasan]. Biofarmasi 1: 65-76. Joker D, Schmidt L. 2000. Seed leaflet: Swietenia macrophylla King. [terhubung berkala]. http://www.sl.kvl.dk/upload/ swietenia_macrophylla_int.pdf. [16 Januari 2012]. Ko JA, Park HJ, Park YS, Hwang SJ, Park JB. 2003. Chitosan microparticle preparation for controlled drug release by response surface methodology. J Microencapsulation 20:791-797. Koolman J, Roehm KH. 2005. Color Atlas of Biochemistry. Ed ke-2. Stuttgart: Appl, Wemding. Krisnawati H, Kallio M, Kanninen M. 2011. Swietenia macrophylla King: Ecology, Silviculture, and Productivity. Bogor: Cifor Indonesia.
Latifah S. 2010. Stabilitas mikrokapsul ketoprofen dengan penyalut kitosan alginat [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Lavenia A. 2010. Potensi ekstrak kulit batang mahoni sebagai antioksidan pada tikus hiperurisemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Leontowicz H et al. 2002. Comparative content of some bioactive compound in apples, peaches, and pears and their influence on lipid and antioxidant capacity in rats. J Nutr Biochem 13: 603-610. Li J, Jun Ci, Lihong F. 2008. Effect of sonolysis on kinetics and physicochemical properties of treated chitosan. J Appl Polymer Sci 109: 2417-2425. Maiti A, Dewanjee S, Jana G, Mandal SC. 2008. Hypoglicemic effect of Swietenia macrophylla seeds against type II diabetes. Int J Green Pharm 2: 224-227. Mardisadora O. 2010. Identifikasi dan potensi antioksidan flavonoid kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King). Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Marks DB, Marks AD, Smith CM. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar: Suatu Pendekatan Klinis. Pendit Bu, penerjemah; Suyono J, Sadikin V, Mandera LI, editor. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Basic Medical Biochemistry: A clinical Approach. Meyer BN et al. 1982. Brine shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. Plant Med 45: 31-34. Mohanraj VJ, Chen Y. 2006. Nanoparticles-A review. J Pharm Res 5:561-573. Mozafari et al. 2006. Recent trends in the lipid-based nanoencapsulation of antioxidants and their role in foods. J Sci Food Agric 86: 2038–2045. Murningsih T et al. 2005. Evaluation of the inhibitory activities of the extracts of Indonesian traditional medicinal plants against Plasmodium falciparum and Babesia gibsoni. J Vet Med Sci 67: 829831.
13
Murray RK, Granner DK, Rodwel VW. 2009. Biokimia Harper. Ed ke-27. Wulandari N et al., penerjemah. Jakarta: EGC. Terjemahan dari: Harper’s Illustrated Biochemistry 27th Ed.
Ratnawati H, Wahyu W. 2011. Anticholesterol activity of Velvet bean (Mucuna pruriens L.) towards hypercholesterolemic rats. Sains Malaysiana 40: 317-321.
Mustika R. 2010. Khasiat ekstrak kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King.) sebagai pencegah hiperkolesterolemia pada tikus putih [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Siburian M. 2011. Aktivitas antioksidan superoksida dismutase pada hati tikus hiperkolesterolemia yang diberi ekstrak kulit mahoni (Swietenia macrophylla) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Nasution PH. 2011. Khasiat antioksidasi ekstrak kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King) terhadap peroksidasi lipid pada hati tikus hiperurisemia [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Nelson DL & Cox MM. 2008. Lehninger Principles of Biochemistry. New York: W.H. Freeman and Company. Ningsih F. 2010. Kandungan flavonoid kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King.) dan toksisitas akutnya terhadap mencit [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Nurcholis W. 2008. Profil senyawa penciri dan bioktivitas tanaman temulawak pada agrobiofisik berbeda. [Tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Patel RP, Patel MP, Suthar AM. 2009. Spray drying technology: an overview. Indian J Sci Tech 10: 44-47. Perchellet JH et al. 2009. Novel synthetic inhibitors of 3-hydroxy-3methylglutarylcoenzyme A (HMG-CoA) reductase activity that inhibit tumor cell proliferation and are structurally unrelated to existing statins. Int J Mol Med 24: 633– 643. Poole CPJR, Owens FJ. 2003. Introduction to Nanotechnology. New Jersey: John Wiley & Sons Inc. Rachmania D. 2011. Karakteristik nano kitosan cangkang udang vannamei (Litopenaeus vannamei) dengan metode gelasi ionik [skripsi]. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor.
Silverman RB. 2004. Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action. Ed ke-2. Burlington: Elsevier Academic Pr. Singhvi SM, Pan HY, Morrison RA, Willard DA. 1990. Disposition of pravastatin sodium, a tissue-selective HMG-CoA reductase inhibitor, in healthy subjects. Br J Clin Pharmacol 29: 239-243. Suhesti TS, Kurniawan DW, Nuryanti. 2007. Penjaringan senyawa antikanker pada kulit kayu mahoni (Swietenia mahaghoni Jacq) dan uji aktivitasnya terhadap larva udang Artemia salina Leach. Jurnal Ilmiah Kesehatan Keperawatan 3: 155-162. Suptijah P, Agoes MJ, Desie R. 2011. Karakteristik nano kitosan cangkang udang vannamei (Litopenaeus vannamei) dengan metode gelasi ionik. Jurnal Pengolahan Hasil Perikanan Indonesia 14. Tan SK et al. 2009. Antimicrobial and antioxidant activities of Swietenia macrophylla leaf extracts. As J Food AgInd 2: 181-188. Tiyaboonchai W, Ritthidej GC. 2003. Development of indomethacin sustained release microcapsule using chitosancarboxymethyl cellulose complex coacervation. Songklanakarin J Sci Technol 25:245-254. Valenzuela A, Sanhueza J, Susana N. 2003. Cholesterol oxidation: health hazard and the role of antioxidants in prevention. Biol Res 36: 291-302. Wahyudi A. 2009. Metabolisme kolesterol hati: khasiat ramuan jati belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.) dalam mengatur konsentrasi kolesterol selular [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
14
Wang T, Turhan M, Gunasekaram S. 2004. Selected properties of pH-sensitive, biodegradable chitosan-poly(vinyl alcohol) hydrogel. Polym Int 53: 911-918. [WHO] World Health Organization. 2008. 2008-2013 Action Plan for the Global Strategy for the Prevention and Control of Noncommunicable Diseases. Geneva: WHO Publishing. Zuidam NJ, Nedovic V. 2010. Encapsulation Technologies for Active Food Ingredients and Food Processing. New York: Springer.
LAMPIRAN
16
Lampiran 1 Tahapan penelitian Kulit kayu mahoni (Swietenia macrophylla King)
Ekstraksi dengan metode rebusan air
Pembuatan nanopartikel ekstrak
Uji potensi hayati dengan BSLT
Uji penghambatan HMG-KoA reduktase
17
Lampiran 2 Ekstraksi serbuk kulit kayu mahoni dengan air Serbuk kulit kayu mahoni + air (1:10) Direbus pada suhu 100ºC selama 2 jam
Residu
Filtrat Diuapkan dengan pada suhu 60ºC
evaporator
Ekstrak air kulit kayu mahoni
Lampiran 3 Pembuatan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni 4 g kitosan + 400 mL asam asetat 1% Diaduk dengan pengaduk magnetik (1000 rpm, 60 menit)
+ 200 µL Tween 80 0.1% Diaduk dengan pengaduk magnetik (1000 rpm, 30 menit)
+ 200 mL STPP 1.5% Diaduk dengan pengaduk magnetik (1000 rpm, 30 menit)
+ 4 mL ekstrak 5% Diaduk dengan pengaduk magnetik (1000 rpm, 15 menit)
Dikeringkan dengan pengering semprot (suhu inlet 140ºC, suhu outlet 80ºC)
Serbuk nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni
18
Lampiran 4 Uji aktivitas penghambatan enzim HMG-KoA reduktase Blanko
Kontrol
Kontrol +
Sampel
184 µL bufer assay 1x
182 µL bufer assay 1x
181 µL bufer assay 1x
181 µL bufer assay 1x
+ 1 µL pravastatin
+ 1 µL sampel
+ 4 µL larutan NADPH
+ 12 µL substrat HMG-KoA
+ 2 µL enzim HMG-KoA reduktase
Digoyang 10 detik dan inkubasi pada suhu 37ºC
Diukur dengan microplate reader (λ = 340 nm) tiap 20 detik selama 10 menit
19
Lampiran 5 Pembuatan larutan untuk uji penghambatan HMG-KoA reduktase Larutan bufer assay 1x. Sebanyak 0.2 mL larutan bufer assay 5x diencerkan dengan penambahan 0.8 mL akuabides. Larutan bufer assay 5x terdiri atas 100 mM bufer kalium fosfat pH 7.4, 120 mM KCl, 1 mM EDTA, dan 5 mM DTT. Larutan NADPH. Sebanyak 25 mg NADPH dilarutkan dalam 1.5 mL bufer assay 1x. Lampiran 6 Rendemen hasil ekstraksi kulit kayu mahoni Sampel Ekstrak kulit kayu mahoni
Ulangan 1 2 3 4 5
Bobot serbuk (g) 475.65 475.65 475.65 475.65 475.65
Rata-rata
Bobot ekstrak (g) 40.06 52.45 42.52 39.19 49.15 44.67
Rendemen (%) 8.42 11.03 8.94 8.24 10.33 9.39
Contoh perhitungan: Kadar air serbuk kulit kayu mahoni = 4.87% Bobot serbuk setelah dikuranngi kadar air = 475.65 g 40 06 g bobot ekstrak 100 = 100 Rendemen (%) = bobot serbuk 475 65 g = 8.42 % Lampiran 7 Rendemen nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni hasil pengeringan semprot Sampel Kitosan+STPP +ekstrak kulit kayu mahoni
Rata-rata
Ulangan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Bobot awal (g) 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20 7.20
Bobot akhir (g) 3.49 3.49 4.06 3.25 4.49 4.40 3.28 4.11 3.71 3.70 4.09 3.89 4.01 3.75 3.86 3.83
Rendemen (%) 48.47 48.47 56.39 45.14 62.36 61.11 45.56 57.08 51.53 51.39 56.81 54.03 55.69 52.08 53.61 53.31
Contoh perhitungan: Bobot kitosan 1% dalam 400 mL asam asetat = 4 g Bobot STPP 1.5% dalam 200 mL akuades = 3 g Bobot ekstrak kulit kayu mahoni 5% dalam 4 mL akuades = 0.2 g bobot akhir 34 g Rendemen (%) = 100 = × 100% bobot awal 7 20 g = 48.47%
20
Lampiran 8 Uji potensi hayati dengan BSLT Sampel Ekstrak kulit kayu mahoni
Nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni
Konsentrasi (ppm) 0 50 100 500 1000 1500 2500 0 50 100 500 1000 1500 2500
1 0 0 0 2 4 9 8 0 0 0 2 4 6 9
Ulangan 2 0 0 0 1 6 9 9 0 0 0 1 5 6 8
3 0 0 0 1 6 4 9 0 0 0 0 2 4 6
Total kematian 0 0 0 4 16 22 25 0 0 0 3 11 16 23
% Kematian 0.0000 0.0000 0.0000 13.3333 53.3333 73.3333 86.6667 0.0000 0.0000 0.0000 10.0000 36.6667 53.3333 76.6667
Contoh perhitungan LC50: Persamaan linear : y = 0.039x + 1.056 50 = 0.039x + 1.056 x = 1254.97 ppm Jadi nilai LC50 ekstrak kulit kayu mahoni 1254.9743 ppm 100
y = 0.039x + 1.056 r = 0.9586
% Kematian
80 60 y = 0.0330x - 1.7110 r = 0.9894
40 20
Ekstrak Nanopartikel ekstrak
0 0
500
1000 1500 Konsentrasi (ppm)
2000
2500
LC50 (ppm) 1254.97
1567.00
21
Lampiran 9 Absorbansi NADPH sisa terhadap waktu oleh inhibisi pravastatin Waktu (detik) 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
Absorbansi Ulangan 1 0.633 0.628 0.617 0.600 0.595 0.589 0.581 0.571 0.564 0.556 0.550 0.543 0.538 0.533 0.529 0.526 0.525 0.521 0.517 0.511 0.507 0.504 0.500 0.497 0.495 0.490 0.487 0.485 0.481 0.478
Kontrol Ulangan 2 0.630 0.622 0.613 0.598 0.592 0.586 0.578 0.569 0.565 0.555 0.549 0.542 0.536 0.531 0.528 0.525 0.522 0.519 0.514 0.510 0.506 0.503 0.501 0.496 0.493 0.489 0.485 0.484 0.482 0.480
Rata-rata 0.632 0.625 0.615 0.599 0.594 0.588 0.580 0.570 0.565 0.556 0.550 0.543 0.537 0.532 0.529 0.526 0.524 0.520 0.516 0.511 0.507 0.504 0.501 0.497 0.494 0.490 0.486 0.485 0.482 0.479
Ulangan 1 0.058 0.026 0.003 0.005 0.006 0.010 0.012 0.018 0.018 0.019 0.023 0.024 0.027 0.030 0.036 0.040 0.052 0.056 0.060 0.065 0.069 0.075 0.079 0.083 0.089 0.096 0.102 0.107 0.111 0.117
Pravastatin Ulangan 2 0.055 0.025 0.004 0.010 0.011 0.015 0.020 0.022 0.024 0.024 0.027 0.027 0.031 0.037 0.045 0.049 0.051 0.053 0.055 0.061 0.065 0.079 0.088 0.089 0.097 0.102 0.104 0.108 0.110 0.114
Rata-rata 0.739 0.734 0.729 0.724 0.722 0.719 0.715 0.710 0.705 0.700 0.694 0.692 0.687 0.682 0.676 0.671 0.663 0.659 0.655 0.648 0.643 0.633 0.625 0.621 0.615 0.610 0.606 0.603 0.599 0.594
22
Lampiran 10 Absorbansi NADPH sisa terhadap waktu oleh inhibisi ekstrak air kulit kayu mahoni Waktu (detik)
Ratarata 0.663 0.642 0.637 0.629 0.616 0.609 0.602 0.596 0.591 0.585 0.579 0.574 0.569 0.563 0.558 0.553 0.550 0.545 0.541 0.537 0.533 0.529 0.526 0.522 0.517 0.513 0.510 0.507 0.503 0.499
Ulangan 1 0.737 0.733 0.729 0.726 0.724 0.721 0.719 0.712 0.708 0.702 0.696 0.693 0.689 0.685 0.680 0.675 0.662 0.657 0.652 0.646 0.641 0.635 0.629 0.624 0.619 0.613 0.607 0.603 0.598 0.592
75 ppm Ulangan 2 0.740 0.734 0.728 0.721 0.719 0.716 0.711 0.708 0.702 0.697 0.692 0.690 0.685 0.678 0.671 0.666 0.663 0.660 0.657 0.650 0.645 0.631 0.620 0.618 0.611 0.607 0.605 0.602 0.599 0.595
Ratarata 0.702 0.683 0.673 0.665 0.657 0.650 0.643 0.636 0.630 0.626 0.622 0.619 0.614 0.610 0.605 0.601 0.598 0.594 0.589 0.585 0.581 0.578 0.575 0.570 0.566 0.563 0.560 0.556 0.553 0.550
Absorbansi 100 ppm Ulangan Ulangan 1 2 0.732 0.728 0.720 0.718 0.714 0.710 0.703 0.699 0.690 0.686 0.678 0.675 0.671 0.670 0.666 0.667 0.661 0.663 0.658 0.656 0.651 0.652 0.645 0.646 0.640 0.638 0.632 0.633 0.627 0.629 0.623 0.624 0.620 0.621 0.615 0.616 0.611 0.612 0.606 0.607 0.602 0.604 0.597 0.600 0.594 0.594 0.590 0.591 0.586 0.584 0.584 0.582 0.578 0.579 0.573 0.575 0.570 0.573 0.567 0.569
Ratarata 0.730 0.719 0.712 0.701 0.688 0.677 0.671 0.667 0.662 0.657 0.652 0.646 0.639 0.633 0.628 0.624 0.621 0.616 0.612 0.607 0.603 0.599 0.594 0.591 0.585 0.583 0.579 0.574 0.572 0.568
Ulangan 1 0.783 0.767 0.763 0.756 0.746 0.735 0.726 0.721 0.715 0.706 0.699 0.690 0.682 0.675 0.667 0.660 0.652 0.645 0.639 0.632 0.626 0.619 0.614 0.608 0.601 0.596 0.590 0.584 0.579 0.573
150 ppm Ulangan 2 0.780 0.764 0.758 0.750 0.739 0.730 0.723 0.718 0.710 0.702 0.695 0.688 0.680 0.671 0.663 0.657 0.648 0.642 0.635 0.629 0.624 0.617 0.611 0.605 0.603 0.597 0.589 0.581 0.576 0.574
Ratarata 0.782 0.766 0.761 0.753 0.743 0.733 0.725 0.720 0.713 0.704 0.697 0.689 0.681 0.673 0.665 0.659 0.650 0.644 0.637 0.631 0.625 0.618 0.613 0.607 0.602 0.597 0.590 0.583 0.578 0.574
Ulangan 1 0.758 0.754 0.742 0.739 0.737 0.736 0.733 0.731 0.729 0.725 0.720 0.713 0.710 0.708 0.705 0.701 0.698 0.693 0.689 0.685 0.681 0.678 0.674 0.669 0.666 0.663 0.660 0.656 0.653 0.649
300 ppm Ulangan 2 0.755 0.751 0.744 0.738 0.736 0.736 0.734 0.729 0.725 0.721 0.716 0.710 0.708 0.706 0.704 0.699 0.695 0.690 0.686 0.682 0.678 0.675 0.670 0.666 0.661 0.657 0.658 0.654 0.651 0.648
Ratarata 0.757 0.753 0.743 0.739 0.737 0.736 0.734 0.730 0.727 0.723 0.718 0.712 0.709 0.707 0.705 0.700 0.697 0.692 0.688 0.684 0.680 0.677 0.672 0.668 0.664 0.660 0.659 0.655 0.652 0.649
22
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
Ulangan 1 0.665 0.643 0.638 0.630 0.617 0.610 0.603 0.597 0.592 0.586 0.580 0.575 0.569 0.563 0.558 0.554 0.550 0.545 0.541 0.537 0.533 0.528 0.525 0.520 0.516 0.513 0.509 0.506 0.502 0.498
50 ppm Ulangan 2 0.660 0.641 0.636 0.627 0.615 0.608 0.601 0.595 0.589 0.583 0.577 0.573 0.568 0.562 0.557 0.551 0.549 0.544 0.540 0.536 0.532 0.529 0.526 0.523 0.518 0.512 0.510 0.507 0.503 0.500
23
Lampiran 11 Absorbansi NADPH sisa terhadap waktu oleh inhibisi nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni Waktu (detik)
Ratarata 0.710 0.705 0.701 0.698 0.695 0.692 0.690 0.686 0.681 0.677 0.673 0.667 0.662 0.659 0.654 0.649 0.646 0.644 0.642 0.641 0.637 0.634 0.630 0.626 0.622 0.619 0.615 0.612 0.609 0.606
Ulangan 1 0.694 0.683 0.678 0.673 0.671 0.663 0.661 0.656 0.651 0.646 0.641 0.636 0.632 0.626 0.620 0.617 0.611 0.609 0.604 0.602 0.598 0.592 0.586 0.583 0.579 0.575 0.570 0.566 0.563 0.559
75 ppm Ulangan 2 0.693 0.685 0.679 0.674 0.670 0.664 0.659 0.655 0.648 0.643 0.639 0.634 0.630 0.627 0.621 0.618 0.612 0.606 0.600 0.598 0.595 0.589 0.584 0.580 0.577 0.573 0.569 0.565 0.560 0.557
Ratarata 0.694 0.684 0.679 0.674 0.671 0.664 0.660 0.656 0.650 0.645 0.640 0.635 0.631 0.627 0.621 0.618 0.612 0.608 0.602 0.600 0.597 0.591 0.585 0.582 0.578 0.574 0.570 0.566 0.562 0.558
Absorbansi 100 ppm Ulangan Ulangan 1 2 0.738 0.734 0.723 0.719 0.694 0.691 0.683 0.680 0.665 0.663 0.661 0.658 0.651 0.649 0.645 0.642 0.637 0.635 0.630 0.629 0.627 0.626 0.623 0.621 0.616 0.615 0.610 0.607 0.602 0.600 0.596 0.594 0.590 0.588 0.584 0.580 0.579 0.575 0.574 0.571 0.569 0.567 0.564 0.560 0.559 0.556 0.556 0.553 0.551 0.549 0.547 0.545 0.544 0.541 0.540 0.537 0.536 0.534 0.532 0.530
Ratarata 0.736 0.721 0.693 0.682 0.664 0.660 0.650 0.644 0.636 0.630 0.627 0.622 0.616 0.609 0.601 0.595 0.589 0.582 0.577 0.573 0.568 0.562 0.558 0.555 0.550 0.546 0.543 0.539 0.535 0.531
Ulangan 1 0.689 0.678 0.665 0.654 0.646 0.637 0.635 0.629 0.619 0.600 0.597 0.583 0.578 0.576 0.569 0.567 0.565 0.561 0.556 0.546 0.545 0.541 0.536 0.530 0.527 0.523 0.520 0.518 0.512 0.509
150 ppm Ulangan 2 0.685 0.675 0.662 0.650 0.642 0.636 0.631 0.623 0.610 0.598 0.595 0.582 0.577 0.574 0.570 0.566 0.563 0.558 0.550 0.547 0.544 0.539 0.532 0.528 0.525 0.521 0.518 0.515 0.513 0.506
Ratarata 0.687 0.677 0.664 0.652 0.644 0.637 0.633 0.626 0.615 0.599 0.596 0.583 0.578 0.575 0.570 0.567 0.564 0.560 0.553 0.547 0.545 0.540 0.534 0.529 0.526 0.522 0.519 0.517 0.513 0.508
Ulangan 1 0.656 0.647 0.640 0.625 0.622 0.616 0.611 0.607 0.596 0.588 0.584 0.575 0.567 0.566 0.564 0.561 0.552 0.547 0.543 0.532 0.527 0.519 0.515 0.509 0.507 0.504 0.500 0.495 0.491 0.487
300 ppm Ulangan 2 0.653 0.645 0.638 0.621 0.619 0.614 0.610 0.603 0.592 0.585 0.580 0.571 0.568 0.564 0.562 0.558 0.550 0.545 0.539 0.530 0.523 0.517 0.512 0.508 0.505 0.501 0.498 0.493 0.490 0.485
Ratarata 0.655 0.646 0.639 0.623 0.621 0.615 0.611 0.605 0.594 0.587 0.582 0.573 0.568 0.565 0.563 0.560 0.551 0.546 0.541 0.531 0.525 0.518 0.514 0.509 0.506 0.503 0.499 0.494 0.491 0.486
23
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600
Ulangan 1 0.712 0.706 0.702 0.700 0.697 0.694 0.692 0.688 0.683 0.678 0.674 0.668 0.663 0.659 0.655 0.650 0.646 0.643 0.642 0.641 0.638 0.635 0.631 0.627 0.623 0.620 0.615 0.612 0.609 0.607
50 ppm Ulangan 2 0.708 0.703 0.700 0.696 0.693 0.690 0.687 0.683 0.679 0.675 0.671 0.665 0.660 0.658 0.653 0.648 0.646 0.644 0.641 0.640 0.636 0.632 0.628 0.624 0.620 0.618 0.614 0.611 0.608 0.605
24
Lampiran 12 Kurva absorbansi NADPH sisa terhadap waktu
Absorbansi λ340
0.800
0.700
0.600
0.500
0.400 0
100
200
300
400
500
600
Waktu (detik)
Kurva absorbansi NADPH sisa terhadap waktu oleh inhibisi ekstrak kulit kayu mahoni Kontrol (tanpa inhibitor) Pravastatin 50 ppm 75 ppm 100 ppm 150 ppm 300 ppm
Absorbansi λ340
0.800
0.700
0.600
0.500
0.400 0
100
200
300
400
500
600
Waktu (detik)
Kurva absorbansi NADPH sisa terhadap waktu oleh inhibisi nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni Kontrol (tanpa inhibitor) Pravastatin 50 ppm 75 ppm 100 ppm 150 ppm 300 ppm
25
Lampiran 13 Penentuan kecepatan awal reaksi (v0)
Absorbansi kontrol (λ340)
0.650 0.600 0.550 0.500 0.450 0.400 0
100
200 300 400 Waktu (detik)
500
Kecepatan awal reaksi= 0.599/80detik = 0.450/menit t = 80 detik = 1.33 menit Aktivitas penghambatan enzim HMGR diukur pada detik ke-80
600
26
Lampiran 14 Penghambatan ekstrak dan nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni terhadap enzim HMGR Senyawa
Konsentrasi (ppm)
Kontrol Pravastatin Ekstrak kulit kayu mahoni
50 75 100 150 300
Nanopartikel ekstrak kulit kayu mahoni
50 75 100 150 300
A
A/t
0.600 0.598 0.726 0.721 0.630 0.627 0.667 0.662 0.703 0.699 0.756 0.750 0.739 0.738 0.625 0.621 0.654 0.650 0.683 0.680 0.673 0.674 0.700 0.696
0.450 0.449 0.545 0.541 0.525 0.523 0.556 0.552 0.586 0.583 0.630 0.625 0.616 0.615 0.521 0.518 0.545 0.542 0.569 0.567 0.561 0.562 0.583 0.580
Aktivitas spesifik (unit/mgP) 10.96 10.93 13.26 13.17 11.51 11.45 12.19 12.09 12.84 12.77 13.81 13.70 13.50 13.48 11.42 11.35 11.95 11.88 12.48 12.42 12.30 12.31 12.79 12.72
Rata-rata aktivitas spesifik (unit/mgP) 10.94
% Penghambatan 0.00
13.22
20.78
11.48
4.92
12.14
10.93
12.81
17.03
13.76
25.71
13.49
23.29
11.38
4.01
11.91
8.85
12.45
13.77
12.30
12.44
12.75
16.53
Keterangan: Kontrol = campuran enzim tanpa inhibitor V total = volume total reaksi (mL) 12.44 = ε atau koefisien ekstingsi NADPH pada 340 nm (mM-1 cm-1) V enzim = volume enzim yang digunakan dalam assay (mL) 0.6 = konsentrasi enzim dalam mg/mL LP = light path (0.55 cm) S = aktivitas spesifik sampel (unit/mgP) C = aktivitas spesifik kontrol (unit/mgP) Contoh perhitungan: t = 1.33 menit A/t
=
=
= 0.450/menit
Aktivitas spesifik (unit/mgP) = Aktivitas spesifik kontrol %Penghambatan =
(
)
=
= 10.96 unit/mgP x 100%
%Penghambatan ekstrak 50 ppm =
x 100% = 4.92%
