UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI JINTAN HITAM (Nigella sativa L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C

SKRIPSI

FAKHRUL UMAM NIM.109102000049

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA SEPTEMBER 2013

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C SKRIPSI Diajukan Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Far)

FAKHRUL UMAM NIM.109102000049

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA SEPTEMBER 2013

ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

Nama

: Fakhrul Umam

NIM

: 109102000049

Tanda Tangan

:

Tanggal

: 27 September 2013

iii

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING

Nama

: Fakhrul Umam

NIM

: 109102000049

Program Studi

: Farmasi

Judul Skripsi

: Uji

Aktivitas

Inhibisi

Fraksi-Fraksi

Hasil

Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Disetujui Oleh : Pembimbing I

Pembimbing II

Lina Elfita, M.Si.,Apt. NIP. 197312122011012002

Rifqiyah Nur Umami, M.S. NIP. 198205182006042003

Mengetahui, Ketua Program Studi Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Drs. Umar Mansur, M.Sc.,Apt.

iv


HALAMAN PENGESAHAN

Skripsi ini diajukan oleh : Nama

: Fakhrul Umam

NIM

: 109102000049

Program Studi

: Farmasi

Judul Skripsi

: Uji

Aktivitas

Inhibisi

Fraksi-Fraksi

Hasil

Kolom

Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

DEWAN PENGUJI

Pembimbing I

: Lina Elfita, M.Si.,Apt.

(

)

Pembimbing II

: Rifqiyah Nur Umami, M.S.

(

)

Penguji I

: Ofa Suzanti Betha, M.Si.,Apt.

(

)

Penguji II

: Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D., Apt. (

)

Ditetapkan di : Jakarta Tanggal

: 27 September 2013

v


ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Fakhrul Umam : Farmasi : Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi-Fraksi Hasil Kolom Kromatografi dari Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C

Hepatitis C termasuk penyakit hati kronis yang menyerang organ hati yang disebabkan oleh infeksi dari virus hepatitis C (HCV) yang merupakan golongan keluarga Flaviviridae. Hingga saat ini belum ditemukan obat yang efektif untuk penanggulangan penyakit hepatitis C ini. Sebagai salah satu pendekatan adalah mencari senyawa yang merupakan inhibitor dari enzim esensial untuk replikasi virus tersebut. Enzim RNA helikase adalah salah satu diantaranya.. Enzim RNA helikase berfungsi melepaskan untai ganda RNA menjadi untai tunggal, dimana proses ini sangat penting dalam proses replikasi HCV sehingga dapat menjadi target yang potensial untuk pengembangan obat anti-HCV. Jintan hitam (Nigella sativa L.) telah lama digunakan sebagai obat herbal untuk meningkatkan kesehatan dan melawan penyakit. Menurut data pustaka jintan hitam dapat berperan sebagai antimikroba, antiparasit, antikanker, antiinflamasi, immunomodulator dan antioksidan. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas inhibisi fraksi-fraksi kolom kromatografi dari ekstrak n-heksana biji jintan hitam terhadap RNA Helikase HCV. Eluen yang digunakan pada kolom kromatografi ini adalah n-heksana:etil asetat (100:0 - 0:100). Uji aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam terhadap enzim RNA helikase HCV dilakukan dengan menggunakan metode kolorimetri ATPase. Hasil dari fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam dibuat dalam konsentrasi 10.000 ppm. Aktivitas inhibisi tertinggi ditunjukkan oleh fraksi kesepuluh yaitu 77,170% dengan aktivitas RNA helikase sebesar 53,5938 pmol fosfat/ ml/ menit/ pmol protein. Kata Kunci : Ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.), kolom kromatografi, RNA helikase HCV

vi


ABSTRACT

Name Program Study Title

: Fakhrul Umam : Pharmacy : Inhibition Activity Test of Fractions Result Column Chromatography of Black Cumin (Nigella sativa L.) Seed Extract to Hepatitis C Virus RNA Helicase

Hepatitis C is a chronic liver disease attacks the liver caused by infection of hepatitis C virus (HCV) that is a member of the Flaviviridae family. To date there is no effective drug for prevention of hepatitis C disease. As an approach is looking for compound that can be an inhibitor from the essential enzymes for the replication of the virus. RNA helicase enzyme is one of them. RNA helicase enzyme has a function to release the RNA double-stranded into a single strand in which this process is very important for the HCV replication process that can be a potential target for the development of anti-HCV drug. Black cumin (Nigella sativa L.) has been used as an herbal to promote health and against disease. According to the literature, black cumin can works as antimicrobial, antiparasitic, anticancer, antiinflammatory, antioxidant and immunomodulator. This study aims to know the inhibitor activity of column chromatographic fractions of n-hexane black cumin seeds extract toward HCV RNA helicase. The used eluent in the chromatography column is n-hexane-ethyl acetate (100:0 - 0:100). Inhibitory activity test of black cumin seed extract to HCV RNA helicase is calculated by using colorimetric ATPase method. The results of column chromatography fractions of black cumin seed extract are made in concentration of 11,111 ppm. The highest inhibitory activity is shown by the tenth fraction which is 77.170% and the activity of RNA helicase is 53.5938 pmol phosphate / ml / min / pmol protein. Keywords :

Extracts of black cumin seeds (Nigella sativa L.), column chromatography, HCV RNA helicase

vii


KATA PENGANTAR

Segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT karena atas segala rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk menyelesaikan pendidikan guna memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta Penulis menyadari bahwa tanpa dukungan dan bimbingan dari berbagai pihak, sangatlah sulit bagi penulis untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : (1)

Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing I dan Ibu Rifqiyah Nur Umami, M.S. selaku pembimbing II, yang memiliki peranan besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini. Semoga segala bantuan dan bimbingan ibu mendapat imbalan yang lebih baik dari Allah SWT.

(2)

Bapak Apon Zaenal Mustopa, M.Si. selaku Kepala Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI beserta staf

(Ibu Linda Sukmarini, M.Eng, Bapak Muhamad Ridwan,

S.Far,) atas bantuannya dan penggunaan segala fasilitas di laboratorium selama penelitian. (3)

Bapak Prof. Dr. dr.(hc). M. K. Tadjudin, Sp.And selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(4)

Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

(5)

Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah banyak memberikan bantuan dan bimbingan selama saya menempuh pendidikan di Program viii


Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. (6)

Kedua orang tua tercinta, Ayahanda Syamsuddin Ali dan Ibunda Nazlah yang selalu mendoakan dan memberikan dukungan kepada penulis untuk menyelesaikan tugas akhir ini.

(7)

Teman seperjuangan selama kuliah dan penelitian Yunita Sari.

(8)

Keluarga besar Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler LIPI, Kak Meita, Kak Hana, Mas Aris, Kang Ace, Kak Yuni, Kak Putri, Kak Ike, Kak Aksar, Kak Bugie, Uud, yang telah banyak membantu penulis dalam penelitian.

(9)

Teman-teman Farmasi angkatan 2009 khususnya teman EDTA-C, dan teman-teman CSSMORA yang sudah banyak membantu dalam berbagi informasi dan pengetahuan serta memberikan dukungan semasa kuliah hingga penyelesaian tugas akhir ini. Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT berkenan membalas segala

kebaikan semua pihak yang telah membantu. Penulis berharap semoga skripsi ini membawa manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan.

Jakarta, September 2013 Penulis

ix


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini : Nama

: Fakhrul Umam

NIM

: 109102000049

Program Studi

: Farmasi

Fakultas

: Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis karya

: Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul : UJI AKTIVITAS INHIBISI FRAKSI-FRAKSI HASIL KOLOM KROMATOGRAFI DARI EKSTRAK BIJI JINTAN HITAM (Nigella sativa L.) TERHADAP ENZIM RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C Untuk dipublikasikan atau ditampilkan diinternet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universita Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan pubikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Di buat di

: Jakarta

Pada Tanggal : 27 September 2013

Yang menyatakan

( Fakhrul Umam ) x


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ........................................... HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ ABSTRAK ...................................................................................................... ABSTRACT .................................................................................................... KATA PENGANTAR .................................................................................... HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIK ...................................... DAFTAR ISI ................................................................................................... DAFTAR TABEL .......................................................................................... DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. DAFTAR ISTILAH .......................................................................................

ii iii iv v vi vii viii

BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................. 1.1 LatarBelakang ..................................................................................... 1.2 Batasan dan Rumusan Masalah ........................................................... 1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................. 1.4 Manfaat Penelitian ...............................................................................

1 1 3 3 4

BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 2.1 Botani .................................................................................................. 2.1.1 Klasifikasi Tanaman ...................................................................... 2.1.2 Deskripsi Tanaman ........................................................................ 2.1.3 Ekologi dan Penyebaran ................................................................ 2.1.4 Khasiatdan Kegunaan .................................................................... 2.1.5 Kandungan Kimia .......................................................................... 2.2 Ekstra dan Ekstraksi ............................................................................ 2.3 Virus Hepatitis C ................................................................................. 2.4 RNA Helikase...................................................................................... 2.5 SDS PAGE .......................................................................................... 2.6 Kolorimetri ATPase ............................................................................ 2.7 Kromatografi ....................................................................................... 2.8 Kromatografi Kolom ...........................................................................

5 5 5 6 6 6 7 7 7 8 10 11 12 12

BAB 3. METODE PENELITIAN ................................................................. 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ............................................................. 3.2 Alat dan Bahan .................................................................................... 3.3 Tahapan Penelitian .............................................................................. 3.3.1 Persiapan Simplisia ..................................................................... 3.3.2 Determinasi Biji Jintan Hitam ....................................................

14 14 14 15 15 15

xi

x xi xiii xiv xv xvi


3.3.3 Pembuatan Ekstrak N-heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ................................................................................................ 3.3.4 Rendemen Total Ekstrak N-Heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ..................................................................................... 3.3.5 Skrinning Fitokimia .................................................................... 3.3.6 Parameter Standar ....................................................................... 3.3.7 Pemisahan Senyawa dengan Kolom kromatografi ..................... 3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase HCV ......................................... 3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ................................................................................. 3.3.10 Uji Aktivitas ATPase RNA Helikase HCV ................................. 3.3.11 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA Helikase HCV ............................................................................. 3.3.12 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ................................ BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 4.1 Determinasi Biji Jintan Hitam .............................................................. 4.2 Rendemen Ekstrak ................................................................................ 4.3 Penapisan Fitokimia ............................................................................. 4.4 Parameter Standar................................................................................. 4.5 Pemisahan Senyawa Inhibitor dengan Kolom Kromatografi ............... 4.6 Produksi Enzim RNA Helikase HCV .................................................. 4.6.1 Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV ............................................ 4.6.2 Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV .......................................... 4.7 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE ........ 4.8 Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV ............................. 4.9 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV .........................................

15 16 16 18 18 19 21 22 22 23 24 24 24 25 26 26 27 27 28 29 31 33

BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 35 5.1 Kesimpulan ............................................................................................ 35 5.2 Saran ...................................................................................................... 35 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 36 LAMPIRAN .................................................................................................... 39

xii


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 4.1 Penapisan Fitokimia Ekstrak Biji Jintan Hitam .................................. 25 Tabel 4.2 Parameter Standar Ekstrak .................................................................. 26

xiii


DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.3 Gambar 4.4

Halaman Biji jintan hitam (Nigella sativa L.) ............................................... 5 Mekanisme kerja enzim RNA helikase ......................................... 9 Hasil SDS-PAGE RNA Helikase HCV ......................................... 30 Diagram Inhibisi Fraksi Kromatografi Kolom Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA Helikase HCV ........... 32 KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ............................................................ 33 Diagram Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C ...... 34

xiv


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Hasil Determinasi Biji jintan hitam (Nigella sativa L.) .............. 40 Lampiran 2. Alur Penelitian ............................................................................. 41 Lampiran 3. Skema Kerja Persiapan Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ................................................................................................ 42 Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase HCV .................... 43 Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV dengan SDS - PAGE ................................................................... 44 Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV ............. 45 Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA helikase ................................................................ 46 Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE ..................................................................................................... 47 Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang Digunakan ........ 48 Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Biji Jintan Hitam ...................... 49 Lampiran 11. Perhitungan Parameter Standar Ekstrak Biji Jintan Hitam.......... 50 Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Enzim ................................................. 51 Lampiran 13. Contoh perhitungan Pembuatan Larutan Pewarna Malachite Green ..................................................................................................... 52 Lampiran 14. Contoh Perhitungan Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativaL.) terhadap RNA Helikase HCV ............. 53 Lampiran 15. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ........................................................................ 54 Lampiran 16. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) ........................................... 55 Lampiran 17. Contoh Perhitungan Persen Inhibisi Hasil Fraksi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA helikase HCV .. 58 Lampiran 18. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) ............................................ 59 Lampiran 19. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ................... 60 Lampiran 20. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan Senyawa Inhibitor Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) .................................................................................................. 61 Lampiran 21. Gambar Alat Penelitian ............................................................... 63

xv


DAFTAR ISTILAH APS ATP IPTG IV S W E HCV LB MOPS OD SDS-PAGE TEMED

: Ammonium Per Sulfat : Adenosin Trifosfat : Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase : Inner volum : Supernatan : Washing : Elution : Hepatitis C Virus : Media Luria - Bertani : 4-asam morfolinopropana sulfonat : Optical Density : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis : N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin

xvi


BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Penyakit hepatitis merupakan penyakit hati yang disebabkan oleh lima tipe virus hepatitis yaitu hepatitis A, B, C, D dan E dan dapat menjadi penyebab utama sirosis dan kanker hati. Indonesia menempati peringkat ketiga penderita hepatitis terbanyak di dunia setelah India dan China. Penderita hepatitis B dan C di Indonesia diperkirakan mencapai 30 juta orang. Badan Kesehatan Dunia (WHO) memperkirakan sebanyak 3-4 orang juta terinfeksi dengan virus hepatitis C setiap tahun. Sekitar 150 juta orang terinfeksi secara kronis dan beresiko menjadi sirosis hati atau kanker hati. Lebih dari 350.000 orang meninggal akibat penyakit hepatitis C setiap tahun (http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/). Hepatitis C termasuk penyakit hati kronis yang menyerang organ hati yang disebabkan oleh infeksi dari virus hepatitis C (HCV) yang merupakan

golongan keluarga Flaviviridae.

HCV merupakan virus

beramplop RNA yang memiliki diameter sekitar 50 nm. HCV bekerja dengan cara masuk ke dalam sel hati, menggunakan mesin genetik di dalam sel untuk menduplikasi materi genetiknya, kemudian menginfeksi sel lainnya (WHO, 2002). Virus ini dapat menyebar melalui penggunaan jarum suntik, transfusi darah, hubungan seksual, dan hemodialisis (Sy & Jamal, 2006). HCV mengalami perkembangan secara klinis selama 7 hingga 8 minggu setelah paparan virus tersebut. Namun biasanya penderita tidak menunjukkan gejala atau hanya gejala ringan. Gejala tersebut timbul setelah menjadi kronis dan dalam waktu yang sangat lama. Infeksi HCV sangat sulit untuk dideteksi. Interval antara infeksi hingga fase kronis yang menimbulkan fibrosis dan sirosis dapat meningkat setelah tiga puluh tahun (Lauer & Walker, 2001). Hingga saat ini belum ditemukan obat yang efektif untuk penanggulangan penyakit hepatitis C ini. Sebagai salah satu pendekatan adalah mencari senyawa yang merupakan inhibitor dari enzim esensial untuk 1


2

replikasi virus tersebut. Enzim RNA helikase adalah salah satu diantaranya. RNA helikase mempunyai tiga aktivitas yaitu aktivitas pengikatan RNA (RNA binding), ATPase dan RNA helikase. Aktivitas RNA helikase berfungsi melepaskan untai ganda RNA menjadi untai tunggal, dimana proses ini sangat penting dalam proses replikasi HCV. Oleh karena itu, RNA helikase merupakan target yang potensial untuk pengembangan obat antiHCV karena inhibisi RNA helikase dapat dilakukan melalui salah satu dari tiga aktivitas tersebut (Elfita et al, 2009). Pengobatan yang berpusat pada tanaman herbal sudah sejak lama dilakukan, dan penelitian terhadap herbal tersebut semakin berkembang akhir-akhir ini. Hal ini dikarenakan bahan herbal terbukti lebih sedikit menghasilkan efek samping jika dibandingkan dengan obat sintetis. Salah satu bahan herbal yang sering digunakan adalah biji jintan hitam (Nigella sativa L.). Selama berabad-abad biji jintan hitam telah digunakan sebagai obat herbal untuk meningkatkan kesehatan dan melawan penyakit terutama di Timur Tengah dan Asia Tenggara (Gilani et al, 2004). Di zaman Rasulullah SAW, biji jintan hitam ini sudah digunakan dalam berbagai pengobatan. Sebagaimana yang pernah disabdakan oleh nabi:

ََِ‫ِإ َ َفِي َاْحَ ِ َالسوْداء‬:ُ‫عنْ َأَبِي َهريْر َ َأَنه َس ِع َرسولُ َاهِ َص َى َاهُ َع َيْهِ َوس َم َيقُول‬ َ‫َواْحَ َُالسوْداءَُالشونِيز ُرواهَإبنَماجه‬، ْ‫َوالسا َاْ َمو‬.ِ ‫ِشفَاءٌَمِنَْكُلَِداءٍَإِاََالسا‬ Dari Abu Hurairah bahwa dia mendengar Rasulullah saw bersabda: "Sesungguhnya di dalam al-Habbah as-Sauda’ itu ada kesembuhan (obat) bagi setiap penyakit kecuali as-Sam". Dan as-Sam itu adalah kematian dan alHabbah as-Sauda’ itu adalah as-Syuniz (nama lain dari al-Habbah asSauda’/jintan hitam) (H.R. Ibnu Majah) (Al-Albani, 1996). Banyak penelitian yang telah dilakukan sebelumnya terhadap jintan hitam dan menunjukkan beberapa aktivitas seperti antimikroba, antiparasit, antikanker, antiinflamasi, immunomodulator, analgesik dan antioksidan (Gali et al, 2006). Namun hanya sedikit penelitian yang dilakukan untuk mendeteksi aktivitasnya sebagai antivirus. Penelitian yang UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

3

telah dilakukan sebelumnya (Ayuni, 2012) menunjukkan bahwa ekstrak jintan hitam dalam fraksi n-heksana mempunyai aktivitas sebagai inhibitor RNA helikase dari HCV. Penelitian ini sedikit banyak memberikan gambaran bahwa jintan hitam (Nigella sativa L.) dapat berpotensi sebagai kandidat senyawa baru dalam menghambat kerja HCV. Merujuk dari penelitian tersebut maka peneliti bermaksud untuk melakukan pemisahan tahap awal senyawa bioaktif sebagai inhibitor RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) dengan menggunakan kolom kromatografi. 1.2 Batasan dan Rumusan Masalah 1.2.1 Batasan Penelitian Batasan penelitian yang dilakukan meliputi pemisahan tahap awal senyawa inhibitor RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) dengan menggunakan kolom kromatografi. 1.2.2 Rumusan Masalah Penelitian tentang tanaman herbal untuk mengobati penyakit hepatitis C masih gencar dilakukan, hingga diperoleh suatu senyawa murni yang mampu menghambat enzim RNA helikase HCV secara efektif. Untuk memperoleh suatu senyawa yang murni dari senyawa kompleks yang terdapat pada ekstrak tanaman herbal cukup sulit, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut. Oleh karena itu perumusan masalah dalam penelitian ini adalah apakah pada fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) memiliki aktivitas sebagai senyawa inhibitor RNA helikase HCV dan pada fraksi berapakah yang mempunyai aktivitas inhibisi tertinggi. 1.3 Tujuan Penelitian Mengetahui

aktivitas

inhibisi

hasil

fraksi-fraksi

kolom

kromatografi dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) terhadap enzim RNA helikase HCV.


4

1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1

Manfaat penelitian secara teoritik Penelitian ini diharapkan mampu menambah ilmu pengetahuan serta wawasan dalam memisahkan senyawa yang berasal dari jintan hitam (Nigella sativa L.) yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV.

1.4.2

Manfaat penelitian secara metodologik Mengetahui cara pemisahan tahap awal ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) yang berpotensi sebagai inhibitor RNA helikase HCV.

1.4.3

Manfaat penelitian secara aplikatif Penelitian ini diharapkan dapat menjadi acuan bagi penelitian selanjutnya mengenai potensi yang terkandung dalam biji jintan hitam (Nigella sativa L.) sebagai senyawa obat baru dalam pengobatan penyakit hepatitis C.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Botani Tinjauan botani meliputi klasifikasi tanaman, deskripsi, ekologi, khasiat dan kegunaan serta kandungan kimia biji jintan hitam (Nigella sativa L). 2.1.1 Klasifikasi Tanaman Klasifikasi tanaman jintan hitam adalah sebagai berikut (United State Departement of Agriculture, 2012): Kingdom

: Plantae

Subkingdom

: Tracheobionta

Superdivision

: Spermatophyta

Division

: Magnoliophyta

Class

: Magnoliopsida

Subclass

: Magnoliidae

Ordo

: Ranunculales

Family

: Ranunculaceae

Genus

: Nigella L.

Species

: Nigella sativa L.

Gambar 2.1 Biji jintan hitam (Nigella sativa L.) Sumber : dokumen pribadi

5


6

2.1.2 Deskripsi Tanaman Jintan hitam merupakan tanaman herba tahunan dan berbatang tegak. Batang biasanya berusuk dan berbulu kasar, rapat atau jarang-jarang dan disertai dengan adanya bulu-bulu yang berkelenjar. Bentuk daun lanset berbentuk garis panjang 1,5 cm sampai 2 cm, ujung meruncing, terdapat tiga tulang daun yang berbulu. Daun bagian bawah bertangkai dan bagian atas duduk. Daun pembalut bunga kecil. Kelopak bunga 5, bundar telur, ujungnya agak meruncing hingga tumpul, pangkal mengecil membentuk sudut yang pendek dan besar. Mahkota pada umumnya 8, agak memanjang berbentuk bunga dua, bibir bagian atas pendek, lanset, ujung memanjang berbentuk benang, ujung bibir bunga bagian bawah tumpul. Benang sari banyak dan gundul. Kepala sari jorong dan sedikit tajam, berwarna kuning. Buah bulat telur atau agak bulat. Biji hitam, jorong berbentuk sudut tiga tak beraturan dan sedikit berbentuk kerucut, panjang 3 mm dan berkelenjar (Depkes RI, 1979). 2.1.3 Ekologi dan Penyebaran Jintan hitam tumbuh dari daerah Levant ke arah timur Samudera Indonesia sebagai gulma semusim (Depkes RI, 1979). 2.1.4 Khasiat dan kegunaan Biji jintan hitam sudah lama digunakan dalam pengobatan tradisional, seperti diuretik, diaforetik, penyakit hati, antihipertensi, memperbaiki proses pencernaan, antidiare, stimulan nafsu makan, analgesik, antibakteri dan antihelmintik. Selain itu jintan juga dilaporkan mampu mengobati sakit kepala, migrain, keracunan merkuri dan leprosi (Gillani et al, 2004). Kajian lain menyebutkan bahwa jintan hitam juga dapat berfungsi sebagai

immunostimulan,

antihistamin,

antikanker,

hypoglycemic,

choleretic, dan antiparasit (Al-Ali et al, 2008). Jintan hitam juga dapat berperan sebagai antimikroba, antiparasit, antikanker, antiinflamasi, immunomodulator dan antioksidan (Gali et al, 2006).


7

2.1.5 Kandungan Kimia Biji jintan

hitam mengandung minyak atsiri (0,5-1,6%), asam

lemak (35,6-41,6%), protein (22,7%) yang meliputi asam amino meliputi albumin, globulin, lisin, leusin, isoleusin, valin, glisin, alanin, fenilalanin, arginin, asparagin, sistin, asam glutamat, asam aspartat, prolin, serin, treonin, triptopan dan triosin. Biji jintan hitam juga mengandung berbagai mineral seperti Fe, Na, Cu, Zn, P, Ca dan vitamin (asam askorbat, tiamin, niasin, piridoksin dan asam folat). Asam lemak yang terkandung dalam biji jintan hitam antara lain asam palmitat, asam linoleat, asam oleat, asam dehidrostearat. Kandungan aktif dalam biji jintan hitam biasanya berada dalam minyak atsiri seperti carvone, α-pipene, d-limoene, dan p-cymene, thymoquinon, thymohydroquinon, dithymoquinon, thymol dan nigellone (Gillani et al, 2004). 2.2 Ekstraksi dan Ekstrak Ekstraksi suatu tanaman obat adalah pemisahan secara kimia atau fisika suatu bahan padat atau bahan cair dari suatu padatan, yaitu tanaman obat (Depkes RI, 2000). Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes RI, 1995). Maserasi adalah proses ekstraksi simplisia dengan menggunakan pelarut beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan. Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. 2.3 Hepatitis C HCV termasuk golongan Flaviviridae dan merupakan satu-satunya anggota dari genus Hepacivirus. Infeksi HCV adalah penyebab utama dari hepatitis kronis, sirosis hati, dan karsinoma hepatoseluler (Brass et al, 2006). HCV menyerang sel hati atau limfosit B. Virus ini menyebabkan penyakit hepatitis C yang dalam jangka panjang mengakibatkan peradangan hati, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

8

sirosis, dan kanker hati. Penyakit ini sulit dideteksi karena gejala yang ditimbulkan mirip dengan penyakit yang lain, seperti mual, nafsu makan berkurang, mudah lelah, timbul kekuningan (mata, kulit), dan urin berwarna gelap. Umumnya penyakit ini terdeteksi apabila sudah mencapai tingkat kronis, sekitar 30-80% infeksi (Sy & Jamal, 2006). Genom HCV terdiri dari open reading frame (ORF) tunggal yang mengkodekan poliprotein tunggal. Poliprotein tersebut merupakan prekusor bagi 3000 jenis asam amino. Poliprotein ini akan diubah menjadi sekitar 10 jenis protein yang berbeda dan terbagi dalam dua kelompok besar protein virus, yaitu protein struktural (protein inti, E1, E2, dan p7) dan protein nonstruktural (NS) (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, dan NS5B) (Lauer & Walker, 2001). Replikasi virus bersifat kuat dan dapat diperkirakan lebih dari sepuluh milyar partikel virion diproduksi perhari bahkan pada fase kronis dari infeksi. HCV mengkode poliprotein tunggal yang terdiri atas 3011 asam amino dan memproses menjadi 10 protein struktural dan regulator. Komponen struktural terdiri atas inti dan dua protein amplop. Selain inti dari virus terdapat juga dua daerah dari protein amplop E2 didesain sebagai daerah hipervariabel 1 dan 2 yang memiliki laju yang tinggi terhadap mutasi dan dipercaya sebagai hasil dari tekanan selektif oleh antibodi spesifik terhadap virus (Lauer & Walker, 2001). 2.4 RNA Helikase Helikase adalah enzim yang berperan dalam membuka untai ganda nukleotida (DNA atau RNA) menjadi untai tunggal. RNA helikase merupakan enzim yang membuka ikatan dupleks RNA menjadi untai tunggal. (Kadare & Haenni, 1997). Fungsi dasar enzim helikase untuk membuka utas ganda DNA atau RNA melalui coupling hidrolisis NTP dengan translokasi sepanjang satu utas DNA atau RNA. Seluruh helikase virus memiliki aktivitas NTP/ATPase yang tergantung pada keberadaan NTP dan kation divalen berupa Mg2+. Produk hidrolisis NTP pada helikase adalah NDP/ADP dan Pi (Fan et al, 2008). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

9

Enzim helikase diperlukan untuk proses replikasi genom organisme tersebut. Enzim helikase dapat dibagi menjadi DNA helikase dan RNA helikase, sesuai dengan genom yang dimiliki organisme tersebut. HCV yang merupakan virus RNA memiliki RNA helikase. Helikase bekerja secara katalitik memisahkan untai ganda DNA atau RNA menggunakan energi yang dihasilkan dari hidrolisis nukleosida trifosfat dan merupakan target pencarian obat karena dibutuhkan dalam replikasi virus (Utama et al, 2000).

Gambar 2.2 Mekanisme kerja enzim RNA helikase Sumber Utama et al, 2000

Aktivitas NTP/ATP helikase secara umum distimulasikan oleh keberadaan asam nukleat untai tunggal. Hal ini memungkinkan enzim berikatan dengan untai RNA dengan energi yang dihasilkan dari hidrolisis ATP untuk memisahkan ikatan hidrogen pasangan basa dari struktur dupleks (Utama et al, 2000).


10

Ikatan asam nukleat dapat menginduksikan formasi protein yang terkarakterisasi dengan pengembangan situs aktif dari domain NTP/ATPase dari NTP/ATP. Aktivitas NTP/ATPase tidak dapat distimulasi pada kadar garam tinggi. Hal ini disebabkan kondisi kekuatan ionik kuat asam nukleat tidak dapat terikat dengan enzim dan enzim membentuk konformasi untuk pelepasan untaian. Mekanisme kerja enzim RNA atau DNA helikase adalah pertama-tama helikase akan mengikat untai RNA atau DNA utas ganda pada ujung 3’, selanjutnya ATP akan berikatan pada suatu sisi aktif dari RNA atau DNA helikase tersebut. Gugus ATP akan dihidrolisis oleh enzim RNA atau DNA helikase menjadi ADP dan fosfat inorganik. Proses hidrolisis ini akan terlepas energi yang kemudian digunakan oleh enzim RNA atau DNA helikase untuk menguraikan utas ganda RNA atau DNA menjadi utas tunggal RNA atau DNA (Utama et al, 2000). 2.5 SDS PAGE Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan yang memisahkan analit berdasarkan kemampuan bergerak dalam medium konduksi yang biasanya berupa larutan bufer dan akan memberikan respons setelah ditambahkan medan listrik (Harvey, 2000). Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (SDS PAGE) adalah metode pemisahan protein dalam sampel untuk dianalisa dan menentukan berat molekulnya. Protein-protein akan terdenaturasi dan melepas monomernya karena pemanasan yang ditunjukkan dengan adanya agen-agen pereduksi (2-merkaptoetanol atau ditiotheitol) dan surfaktan bermuatan negatif. Elektroforesis gel Sodium Dodesil Sulfat (SDS) poliakrilamid adalah teknik yang sering digunakan dalam bidang biokimia, forensik, genetika, dan biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas elektroforesis (fungsi dari panjang rantai polipeptida atau molekul). Sampel elektroforesis gel SDS tersebut dipisahkan berdasarkan ukuran berat molekul (Gam & Latiff, 2005). Polimerisasi dapat terjadi dengan cepat pada suhu kamar dengan adanya katalis dan inisiator. Katalis dan inisiator yang umum digunakan ialah UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

11

N,N’,N’,N’–tetrametilenadiamina (TEMED) dan amonium persulfat (APS) sebagai sumber radikal bebas yang akan menginisiasi pembentukan polimer (Caprette, 2005). Medan listrik diterapkan di seluruh gel yang menyebabkan protein bermuatan negatif bermigrasi menuju anoda. Setiap protein akan bergerak berbeda melalui matriks gel. Protein yang berbobot molekul kecil akan lebih mudah melalui pori-pori pada gel, sedangkan protein yang berbobot molekul lebih besar akan memiliki lebih banyak kesulitan untuk melewati pori-pori tersebut. Setelah waktu yang telah ditentukan protein akan bermigrasi berdasarkan ukuran; protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauh di bawah gel, sedangkan yang lebih besar akan tetap lebih dekat ke titik asal. Protein dapat dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekul (Gam & Latiff, 2005). Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam yaitu Coomassie Brilliant Blue atau pewarna perak. Pewarna Coomassie Brilliant Blue biasanya dapat mendeteksi sebuah band hingga 50 µg protein. Pewarnaan perak meningkatkan sensitivitas pewarnaan sampai 50 kali. Banyak variabel yang dapat mempengaruhi intensitas warna. Setiap protein memiliki karakteristik pewarnaan sendiri (Jovanovic et al, 2007). 2.6 Kolorimetri ATPase Uji kolorimetrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang tidak menyerap cahaya. Adapun pereaksi yang digunakan adalah pereaksi yang bewarna seperti malakit hijau dan amonium molibdat. Uji ATPase dilakukan dengan mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP menjadi ADP dan P, yang dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Prinsip uji kolorimetrik adalah perubahan warna yang terjadi dari suatu zat yang tidak bewarna dengan suatu pereaksi warna (Utama et al, 2000).


12

2.7 Kromatografi Kromatografi adalah cara pemisahan zat yang berkhasiat dan zat lain yang ada dalam sediaan, dengan jalan penyarian berfraksi, atau penyerapan, atau penukaran ion pada zat padat berpori, menggunakan cairan atau gas yang mengalir. Zat yang diperoleh dapat digunakan untuk percobaan identifikasi atau

penetapan

kadar.

Kromatografi

yang

sering

digunakan

ialah

kromatografi kolom, kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi gas. Sebagai bahan penyerap selain kertas, digunakan juga zat penyerap berpori misalnya aluminium oksida yang diaktifkan, asam silikat, atau silika gel, kiselgur dan harsa sintetik (Depkes RI, 1979). 2.7.1 Kromatografi Kolom Kromatografi kolom merupakan salah satu metode kromatografi yang dapat digunakan untuk fraksinasi ini merupakan cara yang terbaik untuk pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Campuran yang akan dipisahkan pada kromatografi kolom adalah berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan tabung plastik. Pelarut eluen dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan (Rouessac & Rouessac, 2007). Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya gravitasi atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut (Gritter et al, 1991). Zat penyerap (misalnya aluminium oksida yang telah diaktifkan, silika gel, kiselgur terkalsinasi, dan kiselgur kromatografi murni) dalam keadaan kering atau setelah dicampur dengan sejumlah cairan, dimampatkan kedalam tabung kaca atau tabung kwarsa dengan ukuran tertentu dan mempunyai lubang pengalir keluar dengan ukuran tertentu. Sejumlah sediaan yang diperiksa dilarutkan dalam sedikit pelarut ditambahkan pada puncak kolom dan dibiarkan mengalir kedalam zat penyerap. Zat berkhasiat diserap dari larutan oleh bahan penyerap secara sempurna berupa pita sempit pada puncak kolom. Dengan mengalirkan pelarut lebih lanjut, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

13

dengan atau tanpa tekanan udara, masing-masing zat bergerak turun dengan kecepatan khas hingga terjadi pemisahan dalam kolom yang disebut kromatogram. Kecepatan bergerak zat dipengaruhi beberapa faktor misalnya daya serap zat penyerap, sifat pelarut, dan suhu dari sistem kromatografi (Depkes RI, 1979).


BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1

Waktu dan Tempat Penelitian

3.1.1 Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan pada bulan Maret 2013 sampai bulan September 2013. 3.1.2 Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia, laboratorium Kimia Obat Jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor dan Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong Bogor. 3.2

Alat dan Bahan

3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah erlenmeyer, batang pengaduk, gelas ukur, kertas saring, kapas, lumpang alu, tabung reaksi, corong, cawan penguap, timbangan analitik, alat penggiling simplisia, inkubator goyang, vortex, tube 50 ml, erlenmeyer, 96-well microtiter, pipet mikro, neraca analitik, peralatan gelas, microplate reader Multiscan EX, vial, Laminar Air Flow (LAF), lemari pendingin, sonikator, autoklaf, kolom kromatografi, erlenmeyer, gelas beaker, lempeng KLT, chamber. 3.2.2 Bahan Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah biji jintan hitam (Nigella sativa L.). Biji jintan hitam ini diperoleh dari PT Lantabura, Depok. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut nheksana, aquadest, natrium hidroksida, dragendroff’s, mayer’s, asam hidroklorit, ferri klorida, asam sulfat, kloroform, pereaksi LiebermannBuchard (2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes H2SO4 pekat), bakteri 14


15

Escerichia coli BL21 (DE3) pLysS yang membawa gen NS3 RNA helikase HCV dalam plasmid pET21b (koleksi Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), media Luria Bertani (LB), aquades, ampisilin, IPTG (isopropil β-Dthiogalaktopiranoside), buffer B (10 mM Tris HCl pH 8.5, 100 mM NaCl, dan 0,25% Tween 20), resin Talon, dan buffer elusi (400 mM imidazole dalam buffer B), 0.1 mM ATP (Adenosin trifosfat), 0.1 mM MOPS (asam 4-morfolinopropana sulfonat), 1 mM MgCl2, larutan hijau malachite, 2.3 % polivinil alkohol, amonium molibdat, natrium sitrat,

sukrosa, TEMED,

akrilamid, amonium persulfat, coomassie brilliant blue, marker protein 250 kDa BIORAD®, silika gel, etil asetat, kapas dan alumunium foil. 3.3 Tahapan Penelitian 3.3.1 Persiapan Simplisia Biji jintan hitam diperoleh dari PT Lantabura Depok. Selanjutnya dilakukan proses penggilingan dan pengayakan menggunakan ayakan 40 mesh untuk diperoleh serbuk halus simplisia biji jintan hitam. 3.3.2 Determinasi Biji Jintan Hitam Proses determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat Penelitian Biologi LIPI Cibinong, Bogor. 3.3.3 Pembuatan Ekstrak N-heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 300 g dan dimasukkan kedalam erlenmeyer. Lalu dimaserasi dengan menggunakan pelarut nheksana sebanyak 900 ml. Proses maserasi didiamkan selama 24 jam, sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung di dalam erlenmeyer lain dengan cara disaring menggunakan kertas saring. Kemudian serbuk simplisia tadi dimaserasi kembali dengan pelarut nheksana dan didiamkan selama 24 jam sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung kembali dengan cara disaring menggunakan kertas saring. Serbuk simplisia tadi dimaserasi kembali dengan pelarut n-heksana dan didiamkan selama 24 jam sambil sesekali dilakukan pengadukan. Setelah 24 jam maserat ditampung UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

16

kembali dengan cara disaring dengan menggunakan kertas saring. Seluruh hasil penampungan maserasi dikumpulkan untuk dilakukan pemekatan ekstrak dengan menggunakan rotary evaporator suhu 45⁰C hingga diperoleh ekstrak kental n-heksana biji jintan hitam (Nigella sativa L.). 3.3.4 Rendemen Total Ekstrak N-Heksana Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) Rendemen ekstrak n-heksana biji jintan hitam total dihitung dengan membandingkan berat awal serbuk simplisia dengan berat akhir ekstrak nheksana biji jintan hitam total yang diperoleh. % Rendemen =

3.3.5 Penapisan Fitokimia Penapisan fitokimia dilakukan untuk mengetahui golongan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak n-heksana biji jintan hitam (Nigella sativa L.). a. Alkaloid Ekstrak dilarutkan dalam pelarut asam hidroklorit dan kemudian disaring. Dilakukan uji pada beberapa pereaksi (Tiwari et al, 2011): 1. Uji Mayer: filtrat ditambahkan dengan pereaksi Mayer (kalium merkuri iodida). Maka akan terbentuk endapan berwarna kuning yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid. 2. Uji Dragendroff: filtrat ditambahkan pereaksi Dragendroff (larutan potassium iodida). Maka akan membentuk endapan merah yang menunjukkan adanya senyawa alkaloid. b. Saponin Ekstrak sebanyak 0,5 mg dikocok dalam 2 ml aquades. Jika terbentuk busa yang cukup lama sekitar 10 menit, menunjukkan adanya senyawa saponin (Tiwari et al, 2011).


17

c. Fenol Ekstrak ditambahkan 3-4 tetes larutan ferri klorida. Jika terbentuk warna hitam kebiru-biruan menunjukkan adanya senyawa fenol (Tiwari et al, 2011). d. Tannin Ekstrak sebanyak 0,5 gram dididihkan dalam 10 ml aquadest dalam tabung reaksi, lalu disaring. Kemudian kedalam filtrat ditambahkan beberapa tetes ferri klorida 0,1 %. Terbentuk warna hijau kecoklatan atau biru kehitaman menunjukkan keberadaan tannin (Ayoola, G.A. et al., 2008). e. Flavonoid Larutan ammonia sebanyak 5 ml ditambahkan kedalam filtrat air dari ekstrak, lalu ditambahkan 1 ml asam sulfat. Terbentuk warna kuning menunjukkan adanya flavonoid (Ayoola, G.A. et al, 2008). f. Triterpenoid dan Steroid Ekstrak sebanyak 0,15 gram dicampurkan ke dalam 2 ml asam asetat anhidrat (CH3CO)2O, kemudian ditambahkan 2 ml H2SO4 1N. Adanya cincin kecoklatan atau violet pada perbatasan dua pelarut menunjukkan adanya triterpenoid sedangkan munculnya warna hijau kebiruan menunjukkan adanya steroid (Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006). g. Terpenoid Ekstrak sebanyak 5 gram dimasukkan ke dalam 2 ml kloroform, kemudian ditambahkan H2SO4 sebanyak 3 ml. Adanya warna coklat kemerahan menunjukkan adanya terpenoid (Ayoola et al, 2008). h. Minyak atsiri Ekstrak kental yang berbau enak ditambahkan etanol, selanjutnya larutan alkoholik tersebut diuapkan kembali sampai kering. Jika residu tetap berbau enak, menunjukkan ekstrak positif mengandung minyak atsiri (Indrayani, Soetjipto & Sihasale, 2006) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

18

3.3.6 Parameter Standar a. Susut Pengeringan Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g dan dimasukkan kedalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya telah dipanaskan pada suhu 105⁰C selama 30 menit dan ditara. Sebelum ditimbang ekstrak diratakan dalam botol timbang, dengan cara menggoyangkan botol, hingga membentuk lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm. Jika berupa ekstrak kental diratakan dengan batang pengaduk. Kemudian dimasukkan kedalam ruang pengering, buka tutupnya, keringkan pada suhu 105⁰C hingga bobot tetap. Sebelum setiap pengeringan, biarkan botol dalam keadaan tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar (Depkes RI, 2000). b. Kadar Abu Ekstrak ditimbang sebanyak 1 g dan dipanaskan pada temperatur 625⁰C dimana senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap sehingga hanya tersisa unsur mineral dan anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran tentang kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera dalam monografi (Depkes RI, 2000). 3.3.7 Pemisahan Senyawa dengan Kolom Kromatografi Pemisahan senyawa yang terkandung di dalam ekstrak kental biji jintan hitam (Nigella sativa L.) menggunakan kolom kromatografi. Kolom yang digunakan berdiameter 2,54 cm dan panjang 65 cm. Kolom dibersihkan dan disiapkan dengan memberi kapas pada ujung kolom untuk menahan silika gel agar tidak keluar, lalu dipasang tegak lurus pada statif. Kemudian silika gel ditimbang seberat 100 gram dan dilarutkan dengan pelarut organik nonpolar yaitu n-heksana, diaduk hingga terbentuk suspensi (Yazid, 2005). Selanjutnya silika dimasukkan kedalam kolom sambil diketukketuk agar silika dapat memadat didalam kolom. Pelarut dimasukkan ke UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

19

dalam kolom dan ditampung, lalu dimasukkan kembali ke dalam kolom. Proses ini dilakukan secara berulang-ulang hingga silika gel menjadi padat. Ekstrak kental biji jintan hitam seberat 4 gram dilarutkan ke dalam pelarut n-heksana sebanyak 4 ml. Kemudian dimasukkan secara hati-hati kedalam kolom pada bagian atas dengan cara dialirkan melalui dinding kolom. Pemisahan ekstrak kental biji jintan hitam dengan menggunakan elusi pelarut bergradien n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 100:00:100 Eluat ini kemudian ditampung di dalam vial. Masing-masing fraksi elusi diuji aktivitas inhibisi RNA helikase HCV dengan menggunakan uji ATPase kolorimetri. 3.3.8 Produksi Enzim RNA Helikase HCV Produksi enzim RNA helikase HCV diawali dengan pembuatan media terlebih dahulu. Media yang dibuat adalah LB (Luria Bertani) cair untuk Escherichia coli BL21 (DE3)pLysS. Media LB ini dibuat sebanyak 10 ml untuk prekultur dan 400 ml untuk kultur. Pembuatan media LB dengan cara mencampurkan Tryptone:NaCl:Yeast ekstrak (2:2:1). Selanjutnya media ini disterilisasi pada suhu 121⁰C selama 15 menit. Tahap pertama dalam purifikasi RNA helikase HCV adalah prekultur, yaitu media LB cair 10 ml diberi ampisilin 100 µg/ml dan dimasukkan ke dalamnya bakteri E.coli BL21 (DE3)pLysS yang membawa gen RNA helikase. Lalu diinkubasi dalam inkubator goyang dengan suhu 37⁰C, kecepatan 150 rpm dan dibiarkan semalam. Tahap

selanjutnya

adalah

kultur,

yaitu

hasil

prekultur

diinolukasikan kedalam media LB 400 ml yang sebelumnya telah diberi ampisilin 100 µg/ml dan diinkubasi dalam inkubator goyang suhu 37⁰C, 150 rpm selama satu jam. Setelahnya ditambahkan IPTG (isopropil β-Dtiogalakto-piranoside) 0,3 mM dan diinkubasi kembali selama 3 jam pada suhu 37⁰C dan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya hasil kultur dipindahkan dalam tube 50 ml, divortex terlebih dahulu kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

20

selama 10 menit untuk mendapatkan pelet. Supernatan dibuang dan pelet yang diperoleh disimpan pada suhu -20⁰C. Untuk tahap berikutnya, terlebih dahulu dibuat larutan buffer B yang terdiri dari campuran TrisHCl 10 mM pH 8,5, Tween 20 0.25% dan NaCl 100 mM. Selanjutnya dibuat buffer elusi dengan cara mencampurkan imidazol 400 mM kedalam buffer B. Pelet yang diperoleh dilakukan pengeringbekuan sebanyak tiga kali. Kemudian dilanjutkan dengan sonikasi (pemecahan sel dengan menggunakan sonikator dengan amplitudo 40 cycle 0,5 selama 15 detik) dilakukan tiga kali dengan interval 1 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 7000 rpm selama 2 menit. Supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tube 50 ml, sedangkan pelet disimpan pada suhu 20⁰C untuk pengujian SDS PAGE. Supernatan tersebut ditambahkan resin TALON 200 µl dan diletakkan pada rotary cold room selama 3 jam. Setelahnya, supernatan disentrifugasi selama 7 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan (inner volume) yang diperoleh dipindahkan untuk pengujian SDS PAGE, sedangkan pelet ditambahkan buffer B sebanyak 10 ml dan diaduk secara perlahan. Kemudian disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh dipindahkan (washing 1) dan peletnya ditambahkan buffer B sebanyak 10 ml, lalu disentrifugasi kembali selama 3 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan yang diperoleh (washing 2) dipisahkan dari peletnya. Pelet ini dimasukkan ke dalam tube 1,5 ml dan disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Kemudian ditambahkan 400 µl buffer elusi dan diletakkan pada rotary cold room selama satu malam. Kemudian pelet tersebut disentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan (E1/Elution 1) yang diperoleh dipindahkan, sedangkan endapannya dicuci dengan 100 µl larutan buffer elusi dan disentrifugasi kembali selama 1 menit dengan kecepatan 3500 rpm. Supernatan (E2/Elution 2) dan resin yang diperoleh dipisahkan dan disimpan pada suhu 4⁰C. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

21

3.3.9 Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE 8% Enzim RNA helikase dianalisa kemurniannya menggunakan metode SDS-PAGE. Plat kaca yang terdiri atas short plate dan spacer plate dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%. Short plate ditempatkan pada bagian depan kaca spacer yang sebelumnya diberi casting frame pada bagian tengah dan dikunci menggunakan casting stand. Selanjutnya dibuat larutan separating gel yang terdiri dari 1,5 Tris pH 8.8, 30% Akrilamid, 10% Amonium persulfat dan TEMED. Larutan tersebut dimasukkan diantara celah short plate dan spacer plate sampai terisi dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan aquades hingga penuh dan ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 30 menit. Setelah terbentuk separating gel, larutan gel stacking dibuat sesuai dengan bahan-bahan yang terdiri dari 0,5 Tris pH 6.8, 30% Akrilamid, 10% Amonium persulfat dan TEMED. Sebelum larutan gel stacking dimasukkan, aquades pada gel separating dibuang. Kemudian larutan gel stacking dimasukkan sampai batas atas kaca, lalu comb dipasangkan dan ditunggu selama ± 30 menit hingga gel memadat. Gel dipindahkan dari casting frame, gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly dengan posisi short plate menghadap kedalam, lalu ditempatkan ke dalam clamping frame, dan ditutup kedua camp levers pada clamping frame. Lower inner chamber dimasukkan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan working solution (buffer elektroforesis SDS 1x pH 8,3). Masing-masing sampel yang akan diuji dengan SDS PAGE 8% yaitu pelet, supernatan, inner volume, washing 1, washing 2, elution 1, elution 2 dan resin diambil 4 µl dan ditambahkan loading dye 10 µl, kemudian didenaturasi dengan cara dipanaskan di dalam waterbath pada suhu 90⁰C selama 15 menit. Sampel tersebut dimasukkan ke dalam well sebanyak 5 µl. Kemudian gel dielektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Kemudian gel diangkat dan direndam dalam larutan staining comassie blue G-250 selama 1 jam sambil digoyang diatas rocker. Gel dibilas dengan larutan Commassie Blue G-250 Destaining ± 30 menit


22

dengan 2 kali pengulangan. Setelahnya dibilas dengan aquades hingga bau asam hilang (Utama et al, 2000). 3.3.10 Uji Aktivitas ATPase RNA Helikase HCV Pengujian aktivitas ATPase RNA helikase HCV ini berdasarkan metode ATPase kolorimetri. Enzim RNA helikase dibuat pengencerannya terlebih dahulu yaitu

5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x. Pengenceran yang

dilakukan menggunakan MOPS 10 mM. Kemudian pembuatan larutan master mix yang terdiri dari ddH2O, MOPS 0.1 M, MgCl2 0.1 mM, dan ATP 0.1 mM. Selanjutnya dilakukan pengujian dengan cara mengisi tiap microtiter plate 96-well dengan 5 µl pengenceran enzim dan 45 µl master mix. Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquades dan 45 µl master mix. Pengujian ini dilakukan secara triplo. Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan larutan pewarna yang terdiri dari 0.081 % malachite green, H2O, 5.7 % amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 % polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah selesai masa inkubasi, larutan pewarna dimasukkan ke dalam masing-masing well sebanyak 100 µl dan diinkubasi kembali selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan Na sitrat sebanyak 25 µl untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Asorbansi hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm (Utama et al, 2000). 3.3.11 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA Helikase HCV Pengujian aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) terhadap enzim RNA Helikase dilakukan berdasarkan metode ATPase kolorimetri (Utama et al, 2000). Ekstrak biji jintan hitam dimasukkan sebanyak 5 µl ke dalam setiap well, lalu ditambahkan 45 µl larutan master mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim. Blanko dibuat dengan komposisi 5 µl aquades dan 45 µl larutan master mix. Untuk kontrol aktivitas enzim berupa campuran larutan master mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim, sedangkan kontrol negatif UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

23

berupa campuran 5 µl metanol dan 45 µl campuran master mix yang sudah ditambahkan dengan pengenceran enzim. Semua pengujian dilakukan secara triplo. Campuran reaksi tersebut diinkubasi selama 45 menit pada suhu ruang. Hasil reaksi divisualisasikan dengan penambahan larutan pewarna yang terdiri dari 0.081 % malachite green, H2O, 5.7 % amonium molibdat dalam HCl 6 M dan 2.3 % polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah selesai masa inkubasi, larutan pewarna dimasukkan ke dalam masing-masing well sebanyak 100 µl dan diinkubasi kembali selama 5 menit pada suhu ruang. Kemudian ditambahkan Na sitrat sebanyak 25 µl untuk menghentikan reaksi pewarnaan. Absorbansi diukur pada panjang gelombang 405 nm dan 620 nm menggunakan microplate reader (Utama et al, 2000). Nilai absorbansi yang diperoleh akan digunakan untuk menghitung persentase aktivitas inhibisi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L) terhadap RNA Helikase HCV. Persentase inhibisi ekstrak biji jintan hitam terhadap RNA helikase dapat dihitung dengan rumus : % Inhibisi =

x 100%

Keterangan : A = absorbansi enzim RNA helikase tanpa penambahan sampel. I = absorbansi enzim RNA helikase dengan penambahan sampel 3.3.12 Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV Fraksi-fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi yang telah diuji aktivitas inhibisi terhadap enzim RNA helikase HCV, kemudian dihitung aktivitas RNA helikase dengan menghitung kadar fosfat yang dilepaskan. Fosfat tersebut terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat bebas). Perhitungan aktivitas RNA helikase dilakukan dengan memasukkan nilai absorbansi λ 620nm–405nm ke dalam persamaan kurva standar fosfat (Lampiran 18).


BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1

Determinasi Biji Jintan Hitam Determinasi dilakukan untuk mengidentifikasi sampel yang digunakan dalam penelitian ini. Determinasi dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong. Hasil determinasi menyatakan bahwa sampel merupakan jenis Nigella sativa L dari suku Ranuculaceae (Lampiran 1).

4.2

Rendemen Ekstrak Ekstraksi biji jintan hitam ini dilakukan dengan metode maserasi. Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruang (Depkes, 2000). Metode maserasi ini biasanya digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan (Tiwari, P et al, 2011). Prinsip ekstraksi dengan metode maserasi didasarkan pada kelarutan komponen didalam pelarutnya. Kelarutan suatu komponen tergantung pada derajat kepolarannya. Hukum “like dissolved like” menyatakan bahwa senyawa yang bersifat polar hanya dapat larut dalam pelarut polar dan semipolar, begitupun sebaliknya senyawa yang bersifat nonpolar hanya dapat larut dalam pelarut nonpolar dan semipolar (Yuliani, 2010) Simplisia serbuk biji jintan hitam sebanyak 300 gram dimaserasi dengan menggunakan pelarut n-heksana yang bersifat non polar. Hal ini bertujuan agar senyawa-senyawa yang bersifat non polar yang terkandung di dalamnya dapat tertarik oleh pelarut n-heksana tersebut. Proses maserasi ini dilakukan selama 3 x 24 jam. Hasil maserasi disaring dan diperoleh filtrat yang kemudian dikentalkan dengan rotary evaporator pada suhu 40⁰C hingga diperoleh ekstrak kental. Prinsip penggunaan rotary evaporator adalah pemekatan filtrat dengan penguapan pada tekanan rendah dan temperatur sesuai dengan pelarutnya. Pelarut pada sampel akan teruapkan dan melewati kondensor sehingga berubah kembali menjadi larutan dan 24


25

tertampung pada receiving part sedangkan untuk ekstrak jintan hitam terbentuk pada evaporation part. Pemekatan dihentikan ketika pelarut tidak menetes pada receiving part dengan asumsi bahwa sudah tidak ada pelarut yang terkandung didalam sampel (Yuliani, 2010). Rendemen ekstrak yang diperoleh yaitu sebesar 20,54%. Nilai rendemen memperlihatkan bahwa ekstrak yang diperoleh dengan metode maserasi menggunakan pelarut nheksana cukup banyak. Hal ini dapat dijelaskan dengan adanya kemungkinan bahwa biji jintan hitam didominasi oleh senyawa-senyawa non polar. 4.3

Penapisan Fitokimia Tujuan dilakukannya penapisan fitokimia ini adalah mengetahui golongan metabolit sekunder yang terdapat didalam ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) yang diekstraksi dengan n-heksana. Tabel 4.1 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Biji Jintan Hitam Metabolit sekunder

Hasil

Alkaloid

-

Flavonoid

-

Saponin

-

Tannin

-

Fenol

-

Terpenoid

+

Triterpenoid

+

Minyak Atsiri

+

Hasil uji fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak biji jintan hitam dalam n-heksana positif mengandung metabolit terpenoid, triterpenoid dan minyak atsiri. Golongan terpenoid teridentifikasi dengan terbentuknya lapisan berwarna kuning setelah penambahan kloroform dan asam sulfat pekat. Golongan triterpenoid ditunjukkan dengan terbentuknya cincin UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

26

kecoklatan pada perbatasan dua pelarut. Sedangkan kandungan minyak atsiri ditandai dengan residu yang tetap beraroma khas. 4.4

Parameter Standar. Parameter standar yang dilakukan terhadap ekstrak kental biji jintan hitam dapat dilihat pada tabel 4.2 Tabel 4.2 Parameter Standar Ekstrak Parameter

Ekstrak

Susut pengeringan

2,639 %

Kadar abu

0,297 %

Pemeriksaan kadar abu dilakukan dengan memanaskan bahan pada temperatur dimana senyawa organik dan turunannya akan terdekstruksi dan menguap, sehingga yang tertinggal hanya unsur mineral dan anorganik. Tujuan penetapan kadar abu adalah untuk memberikan gambaran kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal pada proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Batas kadar abu total jintan hitam yang diperbolehkan yaitu tidak lebih dari 8,00% seperti yang telah dijelaskan dalam Materi Medika jilid III. Dari tabel diatas maka diketahui bahwa ekstrak kental jintan hitam masuk dalam persyaratan yang dianjurkan. Sementara, nilai pada susut pengeringan menyatakan jumlah maksimal senyawa yang mudah menguap atau hilang pada proses pengeringan. 4.5

Pemisahan Senyawa Inhibitor Dengan Kromatografi Kolom Kromatografi kolom digunakan sebagai pemisahan tahap awal terhadap senyawa yang terkandung dalam ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.). Kromatografi kolom bekerja sama seperti kromatografi lapis tipis dimana molekul senyawa yang terikat lemah dengan fase diamnya akan keluar lebih dahulu dibandingkan dengan senyawa yang terikat kuat dengan fase diamnya. Kromatografi kolom dalam penelitian ini menggunakan fase diam silika gel F254 (Merck). Sedangkan eluen yang digunakan sebagai fase UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

27

geraknya adalah eluen bergradien, yaitu n-heksana:etil asetat dengan berbagai perbandingan (100:0–0:100). Sampel ekstrak biji jintan hitam yang dimasukkan ke dalam kolom sebanyak 4 ml dengan konsentrasi 1 g/ml, lalu dilanjutkan dengan memasukkan eluen n-heksana:etil asetat tersebut. Senyawa yang keluar ditampung sebanyak 4 ml untuk masing masing fraksi. Seluruh fraksi yang diperoleh kemudian diuapkan dan dilarutkan kembali dengan metanol absolut sehingga konsntrasinya menjadi 100.000 ppm. Fraksi-fraksi ini kemudian diuji aktivitas inhibisinya terhadap enzim RNA helikase HCV dengan metode uji kolorimetri ATPase. 4.6 4.6.1

Produksi Enzim RNA Helikase HCV Ekspresi Enzim RNA Helikase HCV Tahap pertama dimulai dengan prekultur yang dilakukan dalam media cair Luria Bertani (LB) 10 ml. Media LB ini merupakan media yang cocok untuk pertumbuhan bakteri karena terdiri dari komponen yang kompleks yaitu tripton, ekstrak khamir, dan natrium klorida. Dalam tahap prekultur ini ditambahkan antibiotik ampisilin pada media LB yang berfungsi sebagai selection marker BL21(DE3)

pLysS-RNA

helikase

terhadap pertumbuhan E.coli HCV

rekombinan

yang

juga

mengandung gen resisten ampisilin. Oleh karena itu, dengan penambahan ampisilin ini diharapkan dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain sehingga hanya bakteri E.coli yang membawa gen RNA HCV tersebut yang dapat tumbuh. Media yang sudah dimasukkan bakteri E.coli tersebut dikultur dalam shaker incubator pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm selama satu malam (Pelzar & Chan, 1986). Tahap kedua adalah kultur bakteri E.coli BL21(DE3) pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yaitu dengan memindahkan hasil prekultur ke medium LB 400 ml yang sebelumnya telah ditambahkan ampisilin. Kemudian diinkubasi kembali pada suhu 37⁰C dengan kecepatan 150 rpm dan Isopropil β-D-thiogalaktopiranosida (IPTG) ditambahkan pada saat nilai OD600 (Optical Density) kultur sel E.coli mencapai 0,3, karena pada nilai tersebut kultur bakteri mencapai fase logaritmik. Fase ini merupakan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

28

fase awal dimana bakteri E.coli tumbuh. Penambahan IPTG tersebut bertujuan untuk menginduksi gen RNA helikase HCV agar terjadi ekspresi yang berlebih hingga fase awal stasioner dimana nilai OD600 mencapai 1 (Utama et al, 2000). Kemudian bakteri E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV tersebut dipanen dengan sentrifugasi bertingkat. Sentrifugasi bertingkat ini bertujuan untuk memisahkan E.coli dari media LB. Proses sentrifugasi dilakukan pada suhu 4⁰C dengan kecepatan 3500 rpm selama 10 menit. Bakteri E.coli akan mengendap sebagai pelet sedangkan media LB terpisah sebagai supernatan. Pelet yang telah terkumpulkan disimpan pada suhu 200C untuk menghindari kerusakan pada sel dan menjaga stabilitas enzim RNA Helikase HCV. 4.6.2

Purifikasi Enzim RNA Helikase HCV Purifikasi enzim RNA HCV bertujuan untuk memurnikan hasil ekspresi enzim RNA helikase HCV yang telah disisipkan dalam bakteri E. coli BL 21 (DE3) pLysS. Proses purifikasi ini diawali dengan pemecahan sel terlebih dahulu. Pemecahan sel dilakukan dengan dua tahap yaitu pengeringbekuan

(freeze

thawing)

dan

sonikasi.

Pengeringbekuan

dilakukan dengan menempatkan sel secara bergantian pada suhu -20⁰C dan suhu ruang, masing-masing selama 30 menit sebanyak tiga kali pengulangan. Pengeringbekuan menyebabkan pembentukan kristal es pada sel E.coli yang membawa gen RNA helikase HCV. Kristal es terbentuk akibat dilakukannya pengeringbekuan yang berulang terhadap cairan intraselular dan cairan ekstraselular. Proses inilah yang memudahkan pemecahan sel (Schwen & Melling, 1985). Pemecahan sel tahap kedua yaitu sonikasi yang bertujuan untuk memecah dinding sel. Metode sonikasi ini akan merusak organel dalam sel namun tidak merusak integritas (kemampuan) fungsionalnya. Sebelum dilakukan sonikasi, pelet HCV ditambahkan terlebih dahulu dengan dapar B (10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20). Tris HCl berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

29

helikase selama proses purifikasi. Tween 20 digunakan untuk merusak lipid bipolar pada membran sel. Natrium Klorida berperan untuk menghilangkan kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik dengan RNA helikase (Vanz et al, 2008). Setelah proses sonikasi, selanjutnya dilakukan sentrifugasi untuk mengambil supernatannya. Supernatan ini berupa metabolit intraseluler yang perlu dimurnikan. Proses pemurnian menggunakan resin TALON dan dibiarkan selama 3 jam didalam cold rotary room. Resin TALON bekerja dengan cara mengikat RNA helikase yang telah dilabel dengan 6xHis-Tag pada N terminalnya. Pengikatan ini dilakukan oleh logam Co2+ yang terdapat dalam resin TALON. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dari metabolit intraseluler lainnya dengan sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 7 menit. Resin yang telah berikatan dengan RNA helikase dicuci dengan menggunakan dapar B dengan maksud untuk menghilangkan protein non target. Pencucian selanjutnya menggunakan dapar elusi (imidazol dalam dapar B), dimana imidazol yang terdapat dalam dapar elusi ini akan memutus ikatan antara RNA helikase dengan resin TALON. Setiap proses pencucian dilanjutkan dengan sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan 3500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan resin dan supernatannya. Setiap hasil sentifugasi pada tahap pemurnian enzim dikoleksi untuk dianalisis

dengan menggunakan metode SDS-PAGE.

Penggunaan

kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan enzim dan mencegah penurunan aktivitasnya (Sambrook & Russel, 2001). 4.7

Uji Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV dengan SDS-PAGE Uji kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan menggunakan SDS PAGE. Adapun prinsip kerjanya adalah pemisahan berdasarkan migrasi protein pada media penyangga. Komposisi SDS PAGE adalah akrilamid, Tris HCL, H2O, tetramethylethylendiamine dan amonium persulfat. Akrilamid berguna sebagai pembentuk gel, Tris HCl berguna sebagai dapar atau pengatur keseimbangan pH. Amonium persulfat sebagai inisiator dalam UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

30

proses polimerasi akrilamid menjadi poliakrilamid, sedangkan tetramethylethylendiamine berguna sebagai katalisator reaksi polimerasi akrilamid menjadi akrilamid sedangkan H2O sebagai pencuci pada proses pembuatan gel akrilamid. Untuk pewarnaan hasil SDS-PAGE digunakan pereaksi warna commasie blue dan destain for commasie sebagai pembilasnya sehingga dapat menampakkan pita protein sesuai ukuranya.

120 kDa

85 kDa 54 kDa 50 kDa

37 kDa Pelet

S

W1 IV

M

E1

Gambar 4.1. Hasil SDS PAGE RNA helikase HCV (S: Supernatan, W1: Washing 1, IV: Inner Volume, M: Marker, E1: Elusi 1) Dari hasil SDS PAGE pada gambar 4.1 menunjukkan enzim RNA helikase HCV memiliki bobot molekul 54 kDa. Enzim RNA helikase yang dipurifikasi dapat dikatakan telah murni karena menunjukkan pita tunggal dan sesuai dengan marker (BIORAD®). Pada lajur pelet tidak terlihat adanya pita protein dikarenakan metabolit intraseluler telah berada dalam supernatan (S). Pada lajur inner volume (IV) dan supernatan (S) masih terlihat banyak pita protein dikarenakan masih banyak metabolit intraseluler yang belum termurnikan melalui tahap purifikasi. Lajur washing (W) yang merupakan hasil tahap pencucian dengan resin TALON tidak menunjukkan adanya pita protein yang berarti pada proses pencucian ini tidak terbawa protein RNA helikase. Namun hasil SDS PAGE ini yang belum terlalu bagus dikarenakan proses destaining commassie blue yang terlalu cepat


31

sehingga larutan commassie blue yang memberikan warna biru masih terlihat sangat pekat pada gel SDS PAGE. 4.8

Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap Enzim RNA Helikase HCV Uji aktivitas inhibisi fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam terhadap enzim RNA helikase HCV menggunakan metode kolorimetri ATPase. Uji kolorimetri ATPase memerlukan larutan master mix. Larutan ini terdiri dari air suling, asam 4-morfolinopropana sulfonat (MOPS), MgCl2, adenosin trifosfat (ATP) dan enzim RNA helikase yang telah diencerkan dengan aquades. MOPS berperan sebagai dapar dalam larutan master mix. Buffer ini bertujuan untuk menjaga stabilitas enzim. ATP yang ditambahkan berperan sebagai substrat pada pengujian ATPase kolorimetri. Mg2+ diperlukan sebagai kofaktor RNA helikase sehingga MgCl2 berfungsi sebagai donor kofaktor dalam master mix. (Utama et al, 2000). Pada saat pengujian kolorimetri ATPase, fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam yang sudah dilarutkan dalam metanol ditambahkan sebanyak 5 µl ke dalam satu well yang sudah terdapat 45 µl master mix. Sehingga konsentrasi fraksi yang diujikan menjadi 10.000 ppm. Uji kolorimetri ATPase ini melibatkan pengukuran serapan senyawa organik yang dilepaskan ATP oleh enzim RNA helikase. Aktivitas enzim RNA helikase bergantung pada ATP sebagai donor energi. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik). Pi bebas akan membentuk kompleks warna dengan pereaksi ammonium molibdat membentuk fosfomolibdat. Fosfomolibdat dapat bereaksi dengan enzim RNA helikase dan enzim akan mengendap dan menimbulkan kekeruhan. Polivinil alkohol akan melarutkan kembali enzim yang terendapkan sehingga tidak menimbulkan kekeruhan. Warna yang terbentuk sebanding dengan konsentrasi Pi yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase dan ATP (Chan et al, 1986). Na sitrat digunakan untuk menghentikan reaksi enzimatik yang mengakibatkan terjadinya warna yang berlebih. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

32

Selajutnya absorbansi diukur dengan menggunakan multiscan EX pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 nm adalah serapan optimum dari kompleks fosfomolibdat malachite green hasil reaksi larutan pewarna dengan fosfat bebas hasil hidrolisis ATP yang menghasilkan warna hijau kebiruan. Sedangkan warna kuning merupakan warna yang dihasilkan oleh larutan pewarna yang tidak berikatan dengan Pi. Penggunaan dua panjang gelombang bertujuan agar perhitungan reaksi antara enzim dengan

substrat lebih akurat. Perhitungan konsentrasi Pi

dihasilkan dengan membandingkan nilai absorbansi dari pembacaan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986).

Gambar 4.2 Diagram Inhibisi Fraksi Kromatografi Kolom Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA Helikase HCV

Dari diagram hasil uji kolorimetri ATPase menunjukkan fraksi kolom kromatografi dari ekstrak biji jintan hitam menunjukkan adanya aktivitas untuk menghambat enzim RNA helikase HCV. Fraksi tertinggi dalam menghambat RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam ditunjukkan oleh fraksi 10, 11 dan 12 yaitu dengan persen inhibisi masing-masing 77,170%, 76,381% dan 73,709%. Perbedaan aktivitas inhibisi diantara fraksi-fraksi tersebut tidak jauh dikarenakan masih berada pada gradien


33

yang sama yaitu dielusi dengan menggunakan eluen n-heksana:etil asetat 9:1. Terlihat adanya perbedaan dari hasil uji aktivitas inhibisi RNA helikase HCV dari fraksi kolom dengan ekstrak kental yang belum dipisahkan dimana persentase inhibisi ekstrak kental biji jintan hitam dengan konsentrasi yang sama yaitu 66,935% dengan konsentrasi 10.000 ppm (lampiran 15). Hasil fraksi kolom kromatografi memberikan aktivitas yang lebih tinggi, dikarenakan senyawa yang memberikan aktivitas pada ekstrak biji jintan hitam telah berhasil dipisahkan dari komponen senyawa lain. Sebaiknya untuk pengerjaan yang lebih efisien, tidak perlu dilakukan pengujian aktivitas inhibisi pada semua fraksi, namun terlebih dahulu melakukan uji kromatografi lapis tipis (KLT) terhadap fraksi-fraksi yang diperoleh. Kemudian fraksi yang memiliki spot yang sama digabung, lalu dilakukan uji aktivitas inhibisi enzim RNA helikase. Dari gambar 4.3 terlihat bahwa fraksi 10 hingga 17 menunjukkan spot yang sama, sehingga dapat digabung dalam pengujian aktivitas inhibisinya.

Gambar 4.3 KLT pada Fraksi Hasil Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

4.9

Perhitungan Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV Prinsip dari perhitungan aktivitas enzim RNA helikase HCV ini adalah dengan menghitung fosfat bebas yang terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan ADP dan Pi (fosfat anorganik). Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada gambar 4.5.


34

Gambar 4.4 Diagram Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C Aktivitas enzim RNA helikase sebelum penambahan senyawa inhibitor adalah 517,548 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein. Aktivitas inhibitor enzim RNA helikase HCV yang berada pada fraksi kesepuluh menunjukkan aktivitas enzim RNA helikase yang berkurang menjadi 53,5938 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein. Dari gambar diatas, menunjukkan bahwa terjadi penurunan aktivitas enzim RNA helikase setelah penambahan senyawa inhibitor. Aktivitas enzim RNA helikase ini berbanding terbalik dengan persentase inhibisi, dimana semakin tinggi persen inhibisi maka semakin rendah aktivitas enzim RNA helikase dan sebaliknya semakin rendah persen inhibisi maka semakin tinggi aktivitas enzim RNA helikase. Pada penelitian Kacem dan Meraihi (2006), telah melaporkan bahwa ekstrak minyak atsiri dari biji jintan hitam mampu menghambat enzim elastase neutrofil (HNE) yang dapat merusak jaringan elastin sehingga merusak saluran napas dan alveoli. Jumlah enzim elastase ini akan meningkat pada perokok. Konsentrasi inhibisi tertinggi dari ekstrak minyak atsiri jintan hitam tersebut dalam menghambat aktivitas enzim HNE adalah 5.8 mg/ml. Merujuk dari penelitian tersebut diketahui bahwa konsentrasi fraksi hasil kolom kromatografi yang digunakan pada uji aktivitas inhibisi RNA helikase ini masih tinggi yaitu 10.000 ppm, sehingga perlu dilakukan pengujian lebih lanjut dengan konsentrasi yang lebih rendah yang tetap mampu menghasilkan aktivitas inhibisi yang optimal. UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan 1.

Adanya aktivitas inhibisi terhadap enzim RNA helikase virus hepatitis C pada fraksi kolom kromatografi ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.).

2.

Aktivitas tertinggi dalam menghambat RNA helikase HCV dari ekstrak biji jintan hitam ditunjukkan oleh fraksi 10 yaitu dengan persen inhibisi 77,170% pada konsentrasi 10.000 ppm dan aktivitas enzim RNA helikase sebesar 53,5938 pmol fosfat/ml/menit/pmol protein

5.2

Saran 1.

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemisahan senyawa bioaktif dari ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) untuk mengetahui

senyawa yang lebih spesifik yang berpotensi sebagai

inhibitor RNA helikase HCV. 2.

Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan metode in vivo untuk mengetahui apakah ekstrak benar-benar mampu menghambat aktivitas dari RNA helikase HCV.

3.

Untuk penelitian yang menggunakan metode kromatografi kolom, sebaiknya fraksi yang diperoleh dilakukan uji kromatografi lapis tipis (KLT) terlebih dahulu agar pengerjaan yang dilakukan lebih efisien.

35


DAFTAR PUSTAKA Al-Albani, Muhammad Nashiruddin. 1996. Shahih Sunan Ibnu Majah. Jakarta: Pustaka Azzam Al-Ali, A., Abdul, A.A., Mohammad, A.R., dan Nisar, A.S. 2008.Oral and Intraperitoneal LD50 of Thymoquinone, An Active Principle of Nigella sativa, in Mice and Rats. Journal Ayub Medical College Abbottabad, Vol. 20 Ayoola, G.A et al.2008. Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Some Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern Nigeria. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, September 2008; 7 (3): 1019-1024 Brass V, Moradpour D, Blum HE. 2006. Molecular virology hepatitis C virus (HCV): 2006 update. International Journal of Medicine Science. 3:29-34 Caprette DR. 2005. Preparing SDS-Gels. Experimental Biosciences. Introductory Laboratory-Bios 211. Rice University Chan KM, Delfert D dan Junger KD. 1986. A direct Colorimetric Assay for Ca2+ Stimulated ATPase Activity. Anal Biochem 157:375 – 380 Departemen Kesehatan RI., 1979. Materia Medika Indonesia jilid III. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Departemen Kesehatan RI., 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan. Jakarta: Departemen Kesehatan RI. Elfita, L et al.. 2009. Purifikasi Inhibitor ATPase/RNA Helikase Virus Japanese Encephalitis dari Streptomyces Chartreusis. Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. VI, No. 2, 88 – 96 Fan L et al.. 2008. XPD helicase structures and activities: insight into the cancer and aging phenotypes from XPD mutations. Cell 133: 789-800

36


37

Gam LH and Latiff A. 2005. SDS-PAGE electrophoretic property of human chorionic gonadotropin (hCG) and its β-subunit. Int.J.Biol.Sci 1(3): 103109. Gilani, A.H.,Qaiser, J. dan Muhammad, A.U.K. 2004. A Review of Medicinal and Pharmacological activities of Nigella sativa. Pakistan Journal of Biological Science, Vol. 7 Gritter RJ, Bobbitt JM, and Schw AE. 1991. Pengantar Kromatografi, Edisi II. Diterjemahkan oleh Padmawinata K. Bandung : ITB Bandung. Hairany, Ainun. 2010. Pemurnian dan Karakterisasi Protein Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Streptomyces chartreusis 5-095 [Tesis]. Bogor: Institut Pertanian Bogor. Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. Ed ke-1. New York: McGraw Hill Heinrich et al. 2009. Farmakognosi dan Fitoterapi. Jakarta: EGC http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs164/en/ Indrayani L, Soetjipto H dan Sihasale L. 2006. Skrining Fitokimia dan Uji Toksisitas Ekstrak Daun Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) terhadap Larva Udang Artemia salina Leach. Berk Penel Hayati : 12 (57-61) Jovanovic S, Barac M, Macej O, Vucic T, and Lacnjevac C. 2007. SDS-PAGE analysis of soluble proteins in reconstituted milk expose to different heat treatments. Sensors 7: 371-383 Kacem, Rachid and Meraihi Zahia. 2006. Effects of essential oil extracted from Nigella sativa (L.) seeds and its main components on human neutrophil elastase activity. The pharmaceutical society of Japan: 301-305. Kadare G, Haenni A. 1997. Virus encoded RNA helicases. Journal of Virology 71: 2583-2590


38

Pelzar MJ dan Chan ECS. 1988. Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Hadietomo et al., penerjemah. Jakarta : UI Pr. Terjemahan dari: Element of Microbiology Rouessac, Francis and Annick Rouessac. 2007. Chemical Analysis Modern Instrumentation Methods and techniques Second Edition. England: WILEY. Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press New York. Sangi, Meiske S., Momuat, Lidya I, Kumaunang, Maureen. 2012. Uji Toksisitas Dan Skrining Fitokimia Tepung Gabah Pelepah Aren (Arenga Pinnata). Jurnal Ilmiah Sains Vol. 12 No. 2

Schwen MD dan Melling J. 1985. Handbook of Enzyme Biotechnology. Alan Wiseman, editor. West Sussex: Ellis Horword Ltd. Sy T, Jamal MM. 2006. Epidemiology of hepatitis C virus (HCV) infection. Int.J.Med.Sci 3:41-4. United State Departement of Agriculture. 2012. Plants Profile Nigella sativa L. http://plants.usda.gov/java/name Utama A et al.. 2000. Identification and characterization of the RNA helicase activity of Japaneese encephalitis virus NS3 protein. FEBS Lett 465: 74-78. Vanz,

et al. 2008 Human granulocyte colony stimulating factor (Hg-CSF): cloning, overexpresion, purificarion, and characterization. Microbial Cell Factories 7:13 – 15

WHO. 2002. Hepatitis C. Journal [serial on the Internet]. Available from:www.who.int/csr/disease/hepatitis/Hepc.pdf Yazid, Estien. 2005. Kimia Fisika untuk Paramedis. Yogyakarta: penerbit ANDI.


LAMPIRAN

39


40

Lampiran 1. Hasil Determinasi Biji jintan hitam (Nigella sativa L.)


41

Lampiran 2. Alur Penelitian

Determinasi biji jintan hitam (Nigella sativa L. ) Ekspresi dan purifikasi enzim RNA helikase HCV

Biji jintan hitam (Nigella sativa L.)

Simplisia serbuk kering

Maserasi dengan nheksana

Uji aktivitas RNA helikase dngan metode kolorimetri ATPase

Ekstrak n-heksana dipekatkan dengan rotary evaporator

Skrining fitokimia

Uji aktivitas inhibitor RNA helikase

Ektrak n-heksana kental

Pemisahan senyawa dengan kolom kromatografi

Perhitungan Aktivitas Enzim RNA Helikase


42

Lampiran 3. Skema Kerja Persiapan Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Dihaluskan dengan ayakan 40 mesh

Sortasi kering

Biji jintan hitam

Serbuk halus biji jintan hitam

Maserasi dengan nheksana (3 x 24 jam). Perbandingan serbuk simplisia : pelarut (1:3)

Hasil maserasi dikumpulkan

Dipekatkan dengan rotary evaporator

Ekstrak kental biji jintan hitam.


43

Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase HCV 10 ml E. coli rekombinan diinokulasi pada media LB yang ditambahkan

Freeze thaw 3x, ditambah 10 ml buffer B

Sonikasi (amplitudo 0.5, waktu 3x15 detik, interval 1 menit)

Shaker 150 rpm, 37⁰C, 1

0,3 M IPTG, shaker 150 rpm, 37⁰C, 3 jam

Sentrifus 5000 rpm, 10 menit, 4⁰C, pelet disimpan pada suhu 20⁰C

Sentrifus 3500 rpm, 10 menit (koleksi pelet)

Sentrifus 7000 rpm, 20 menit, 4⁰C

Pelet + Resin TALON, binding selama 3 jam di cold rotary room

Sentrifus 3500 rpm, 7 menit, 4⁰C. Pelet + 10 ml buffer B

Sentrifus 3500 rpm, 5 menit. Pelet + buffer elusi. Binding semalaman di cold rotary room

Konfirmasi kemurnian dgn SDS PAGE

RNA helikase HCV


44

Lampiran 5.

Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV dengan SDS - PAGE Sample + loading dye

Denaturasi pada suhu 95⁰C, 15 menit

Preparasi gel ( stacking dan separating)

Running SDS PAGE

Commasie blue staining

Destain for commasie blue

Hasil SDS PAGE di scan


45

Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV

Campuran master mix (5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl2 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV)

Inkubasi selama 45 menit dalam suhu ruang

Tambahkan larutan pewarna (0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)

Inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang

Tambahkan 25 µL Natrium Sitrat

Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm dengan menggunakan microplate reader


46

Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam terhadap RNA helikase Fraksi kolom kromatografi diuapkan, dilarutkan dengan metanol

Dibuat campuran master mix (5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl2 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase

Blanko: master mix + ddH2O Enzim: master mix + enzim Kontrol negatif: master mix + enzim + metanol Sampel : master mix + enzim + fraksi kolom

Inkubasi selama 45 menit pada suhu ruang

Tambahkan larutan pewarna (0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)

Inkubasi selama 5 menit dalam suhu ruang

Tambahkan 25 µL Natrium Sitrat

Pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm dengan menggunakan microplate reader


47

Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE Larutan-larutan

Larutan separating 8%

Komposisi  

H2O 7,25 mL



3,75 mL



10% Amonium Persulfat 0,05 mL



1,5 M Tris-Cl pH 8,8 containing 0.4% SDS

30% Akrilamid 4 mL

TEMED 0,015 mL

 H2O 3,05 mL

 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 containing 0.4% SDS 1,25 Larutan stacking 3,9%

mL

 30% Akrilamid 0,65 mL

 10% Amonium Persulfat 0,025 mL  TEMED 0,005 mL 

Dapar sampel SDS 2X (Loading Dye)

Commasie Blue G250 Staining Solution (500 mL) Commasie Blue G250 Destaining Solution (1000 mL)



4x Tris Cl/SDS pH 6,8 25 mL



SDS 4 g



Bromphenol blue 1 mg



45% H2O 225 mL



10% Asam asetat glacial 50 mL



50% H2O 500 mL

 

Gliserol 20 mL β- mercaptoethanol (2-ME) 2 mL



H2O sampai 100 mL



45% Metanol 225 mL



0,05% Commasie brilliant blue 250 mg



10% Asam asetat glacial 100 mL 40% Metanol 400 mL


48

Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang Digunakan Larutan, dapar, medium Media LB (LuriaBertani) cair

Dapar B Dapar Elusi Adenosin 5’ trifosfat (ATP) 0,1 M

Ampisilin 100 mg/mL

Malachite green 0,081% Polivinil alkohol 2,3% Ammonium molibdat 5,7% dalam HCl 6 N Natrium Sitrat 30%

Komposisi dan Cara Pembuatan Media LB dibuat sebanyak 10 mL untuk prekultur dan 400 mL untuk kultur. Media LB dibuat dengan cara melarutkan sejumlah 0,25 g dan 10 g masingmasing ke dalam 10 mL dan 400 mL akuades. Semua disterilisasi pada suhu 121o C selama 15 menit. Dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%. Dicampur menjadi satu dan diaduk hingga homogen. Sebanyak 0,2724 g imidazol dilarutkan dalam 10 mL dapar B kemudian dihomogenkan Sebanyak 0,3 g adenosine 5’ triphosphate disodium salt dilarutkan dalam nuclease free water sambil diukur pH 7,0. Sebanyak 500 µL dialikuot ke dalam 1,5 mL tabung mikrosentrifus. Disimpan pada 20°C. Amphicillin sodium salt sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 2 mL akuades kemudian dihomogenkan. Larutan disaring dengan filter 0,2 µm. Alikuot 1 mL ke dalam tabung 1,5 mL. Disimpan pada -20°C Sebanyak 0,081 malachite green oxalate salt dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring Sebanyak 2,3 g polivinil alkohol dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan dengan pemanasan Sebanyak 5,7 g ammonium molibdat tetrahidrat dilarutkan dalam HCl 6 N hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan Sebanyak 3 g citric acid trisodium salt dihydrate dilarutkan dalam akuades hingga mencapai 100 mL kemudian dihomogenkan


49

Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Biji Jintan Hitam

Rendemen

Ekstrak biji jintan hitam (Nigella sativa L.) Rendemen


50

Lampiran 11. Perhitungan Parameter Standar Ekstrak Biji Jintan Hitam x 100%

1. Susut pengeringan Berat sampel awal

Berat sampel akhir

1,023 g

0,996 g

Susut pengeringan

2. Kadar abu

Kadar abu

x 100%

Berat sampel awal

Berat sampel akhir

1,009 g

0,003 g

= 0,297%


51

Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Enzim Pengenceran enzim menggunakan larutan MOPS 10 mM, dengan perhitungan sebagai berikut: 5x pengenceran

= 1/5 x 40 µl

= 8 µl enzim + 32 µl MOPS 10 mM

10x pengenceran = 5/10 x 40 µl

= 20 µl (5x enzim) + 20 µl MOPS 10 mM







Pembuatan larutan Mastermix Dilakukan pengujian terhadap blanko, enzim dengan pengenceran 5x, 10x, 20x, 40x, dan 80x masing-masing dilakukan secara triplo sehingga dibutuhkan 18 well. Larutan mastermix dibuat untuk 20 well dengan komposisi : ddH2O

: 770 µl

MOPS 0,1 M

: 100 µl

MgCl2 0,1 mM

: 10 µl

ATP 0,1 mM

: 20 µl

Komposisi larutan pada masing-masing well Dilakukan sebanyak triplo Blanko

= 5 µl aquades + 45 µl mastermix

Enzim 5x

= 5 µl enzim 5x pengenceran + 45 µl mastermix

Enzim 10x


Enzim 20x


Enzim 40x


Enzim 80x



52

Lampiran 13. Contoh Perhitungan Pembuatan Larutan Pewarna Malachite Green Larutan pewarna yang digunakan pada uji aktivitas enzim RNA helikase adalah sebanyak 100 µl untuk tiap well. Sehingga dibuat larutan pewarna untuk 18 well dengan komposisi : ddH2O

:2

= 700 µl

0,081% Malachite green

:2

= 700 µl

2,3% Polivinyl alkohol

:1

= 350 µl

5,7% Amonium molibdat dalam 6N HCl

:1

= 350 µl


53

Lampiran 14. Contoh Perhitungan Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativaL.) terhadap RNA Helikase HCV

Rumus Perhitungan Pengenceran enzim yang akan digunakan pada uji ATPase :

Dan ditambahkan 147,75 µl aquabides


54

Lampiran 15. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kental Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Konsentrasi (ppm)

Persen inhibisi (%)

10000

66,93502

5000

60,38311

2000

57,07939

1000

48,27872

500

44,30871

200

42,61521

100

34,45308


55

Lampiran 16. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Kolom Kromatografi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) Absorbansi enzim

Enzim 40x

1,098

Fraksi

Absorbansi dengan sampel

% Inhibisi

Kontrol (-)

0,970

11,658

4

0,347

68,397

5

0,358

67,365

6

0,363

66,940

7

0,408

62,842

8

0,325

70,431

9

0,295

73,163

10

0,123

88,828

11

0,131

88,039

12

0,161

85,367

13

0,201

81,694

14

0,235

78,567

15

0,184

83,212

16

0,264

75,926

17

0,222

79,812

18

0,285

74,074

19

0,249

77,353

20

0,419

61,809

21

0,495

54,918

22

0,523

52,398

23

0,579

47,268

24

0,525

52,155

25

0,632

42,410

26

0,605

44,900

27

0,598

45,507

28

0,716

34,791

29

0,673

38,676


56

30

0,611

44,353

31

0,617

43,777

32

0,635

42,137

33

0,749

31,785

34

0,672

38,798

35

0,682

40,407

36

0,634

44,748

37

0,676

40,953

38

0,752

34,032

39

0,822

26,947

40

0,786

30,175

41

0,675

40,065

42

0,662

41,220

43

0,668

40,628

44

0,629

44,122

45

0,599

46,757

46

0,655

41,783

47

0,626

44,359

48

0,673

40,184

49

0,661

41,309

50

0,598

46,906

51

0,550

51,110

52

0,581

48,357

53

0,663

41,131

54

0,655

41,842

55

0,677

39,887

56

0,659

41,457

57

0,629

44,152

58

0,619

44,981

59

0,606

46,165

60

0,534

52,591


57

61

0,630

44,004

62

0,612

45,662

63

0,702

37,637

64

0,665

40,954

65

0,682

39,384

66

0,629

44,152

67

0,591

47,527


58

Lampiran 17. Contoh Perhitungan Persen Inhibisi Hasil Fraksi Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.) terhadap RNA helikase HCV

Rumus Perhitungan : % inhibisi

=

x 100

A = absorban enzim tanpa adanya senyawa inhibitor I = absorban enzim dengan adanya senyawa inhibitor.

Contoh perhitungan pada fraksi ke-10 :

Absorbansi aktivitas inhibisi – kontrol negatif = 88,828 % - 11,658 % = 77,171 %


59

Lampiran 18. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) Data : Konsentrasi K2HPO4 (mM) 0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Absorbasi 620 nm dengan referensi 405 nm 0.000 0.102 0.239 0.417 0.622 0.834 1.022

Grafik :

y = 1.020x + 0.010 R2 = 0.9989


60

Lampiran 19. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV Diketahui :

y = 1,020x + 0,010 (kurva standar dilihat di lampiran 18) Sampel didilusi 40x

Absorbansi enzim = 1,098 Masa inkubasi 45 menit 1 well terdapat 5 µL enzim RNA helikase Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/ µL 1 pmol = 0,05 Ditanya :

Aktivitas enzim RNA helikase

Jawab :

y = 1,020x + 0,010

1,098 = (1,020x) + 0,010 x = 1,0667 mM fosfat Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,0667 mM fosfat x 40 = 4,27 x 10-5 mol fosfat/mL Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit = = 9,48 x 10-7 mol fosfat/mL/menit

Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µL x 5 µL = 91,6 µg = 1832 pmol protein Aktivitas enzim RNA helikase = = 517,548 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein


61

Lampiran 20. Tabel Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV dengan Penambahan Senyawa Inhibitor Ekstrak Biji Jintan Hitam (Nigella sativa L.)

Ket

% inhibisi

Aktivitas RNA helikase

blanko enzim 40x

517,548

kontrol (-)

456,6599

fraksi 4

56,740

160,3066

fraksi 5

55,707

165,6977

fraksi 6

55,282

167,9176

fraksi 7

51,184

189,3235

fraksi 8

58,774

149,6829

fraksi 9

61,506

135,4122

fraksi 10

77,171

53,59398

fraksi 11

76,381

57,7166

fraksi 12

73,710

71,67011

fraksi 13

70,036

90,85617

fraksi 14

66,910

107,1881

fraksi 15

71,554

82,92805

fraksi 16

64,268

120,9831

fraksi 17

68,154

100,6871

fraksi 18

62,417

130,6554

fraksi 19

65,695

113,5306

fraksi 20

50,152

194,7146

fraksi 21

43,260

230,7083

fraksi 22

40,741

243,869

fraksi 23

35,610

270,6661

fraksi 24

40,498

245,1375

fraksi 25

30,753

296,0361

fraksi 26

33,242

283,034


62

fraksi 27

33,849

279,8627

fraksi 28

23,133

335,8353

fraksi 29

27,019

315,5393

fraksi 30

32,696

285,8881

fraksi 31

32,119

288,9008

fraksi 32

30,480

297,4632

fraksi 33

20,128

351,533

fraksi 34

27,140

314,9052

fraksi 35

28,749

319,6621

fraksi 36

33,090

296,9876

fraksi 37

29,296

316,8079

fraksi 38

22,374

352,9602

fraksi 39

15,289

386,4169

fraksi 40

18,517

369,1336

fraksi 41

28,408

316,1737

fraksi 42

29,562

309,9898

fraksi 43

28,970

313,161

fraksi 44

32,464

294,4506

fraksi 45

35,100

280,3386

fraksi 46

30,125

306,9771

fraksi 47

32,701

293,1821

fraksi 48

28,526

315,5394

fraksi 49

29,651

309,5141

fraksi 50

35,248

279,5458

fraksi 51

39,453

257,0299

fraksi 52

36,699

271,7762

fraksi 53

29,474

310,4654

fraksi 54

30,184

306,6599

fraksi 55

28,230

317,1251

fraksi 56

29,799

308,7213

fraksi 57

32,494

294,2921


63

fraksi 58

33,323

289,8523

fraksi 59

34,508

283,5098

fraksi 60

40,933

249,1017

fraksi 61

32,346

295,0849

fraksi 62

34,004

286,2054

fraksi 63

25,979

329,1758

fraksi 64

29,296

311,4168

fraksi 65

27,726

319,8206

fraksi 66

32,494

294,2921

fraksi 67

35,870

276,2159


64

Lampiran 21. Gambar Alat Penelitian

Shaker incubator

Mikropipet

Microplate reader

Laminar Air Flow

Sentrifuge

Neraca analitik

Vortex

Sonikator


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Recommend Documents