UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI PENAMBATAN MOLEKUL SENYAWA-SENYAWA AMIDASI ETIL PARA METOKISINAMAT PADA PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTOR-GAMMA (PPARγ)

SKRIPSI

FITRIA APRIANI

1111102000071

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JULI 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI PENAMBATAN MOLEKUL SENYAWA-SENYAWA AMIDASI ETIL PARA METOKISINAMAT PADA PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTOR-GAMMA (PPARγ)

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

FITRIA APRIANI

1111102000071

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JULI 2015

i

ii

iii

ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Fitria Apriani : Farmasi : Studi Penambatan Molekul Senyawa-Senyawa Amidasi Etil Para Metoksisinamat Pada Peroxisome ProliferatorActivated Receptor- Gamma (PPARγ)

Ikatan amida pada turunan asam sinamat terbukti menjadikan lebih tahan terhadap hidrolisis dan dapat menurunkan konsentrasi glukosa plasma pada tikus setelah diinduksi dengan streptozosin. Salah satu reseptor yang berperan dalam pengobatan diabetes adalah Peroxisome Proliferator-Activated Receptor - Gamma (PPARγ) yang bertanggung jawab terhadap sensitisasi insulin dalam jaringan adiposa. Penelitian ini bertujuan menganalisa interaksi senyawa amidasi etil pmetoksisinamat (EPMS) dengan PPARγ. Metode penelitian dengan penambatan molekul atau secara in silico dipilih karena waktu penelitian yang lebih singkat dan biaya yang lebih murah dibandingkan dengan metode in vitro maupun in vivo. Perangkat lunak yang digunakan yaitu Autodock Vina yang merupakan suatu program yang dapat menambatkan molekul ligan pada makromolekul reseptor. Kemudian divisualisasikan menggunakan Autodock Tools, LigPlus dan PyMOL serta dilakukan analisa Lipinski’s Rule of Five. Rosiglitazon sebagai antidiabetes yang memiliki aktivitas terhadap PPARγ digunakan sebagai standar. Hasilnya menunjukkan bahwa afinitas senyawa-senyawa amidasi etil p-metoksisinamat semakin baik pada penambahan amina dengan alkil rantai panjang, siklik dan aril dengan rentang energi ikatan antara -6,2 kkal/mol sampai -9,3 kkal/mol. Sedangkan energi ikatan rosiglitazon sebesar -8,9 kkal/mol. Senyawa pmethoxycinnamoyil tryptamine memiliki afinitas terbaik dengan nilai energi ikatan -9,3 kkal/mol, sehingga berpotensi sebagai antidiabetes.

Kata kunci : Amidasi EPMS, PPARγ, penambatan molekul.

iv

ABSTRACT

Name Major Title

: Fitria Apriani : Pharmacy : Molecular Docking Study Of Amidation Ethyl P-Methoxycinnamate Compounds to Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma (PPARγ)

Amide bond in cinnamic acid derivatives proved to make it more resistant to hydrolysis and can decrease the plasma glucose concentration in rats after induced by streptozosin. One receptor that plays a role in the treatment of diabetes is Peroxisome Proliferator Activated Receptor-Gamma (PPARγ) which is responsible for the sensitization of insulin in adipose tissue. This study aims to analyze the interaction of amidation compound ethyl p-methoxycinnamate (EPMS) with PPARγ. Methods of research with a molecular docking or in silico been shorter research time and costs cheaper than the method of in vitro and in vivo. The software used is Autodock Vina which is a program that allows docking of molecular ligand to receptor macromolecules. Then visualized using Autodock Tools, LigPlus and PyMOL, as well as analysis Lipinski's Rule of Five. Rosiglitazone as antidiabetic PPARγ activity to be used as a standard. The result showed that the affinity of the compounds amidation ethyl p-methoxycinnamate getting better on the addition of amines with a long chain alkyl, cyclic and aryl with the bond energy range between -6.2 kcal / mol to -9.3 kcal / mol. Whereas rosiglitazone bond energy of -8.9 kcal / mol. P-methoxycinnamoyil tryptamine compounds having the best affinity with the bond energy value -9.3 kcal / mol, potentially as an antidiabetic.

Keywords : Amidation EPMS, PPARγ, molecular docking.

v

KATA PENGANTAR Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur kehadirat Allah SWT., atas segala rahmat, karunia, dan hidayah-Nya yang telah dilimpahkan kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan judul “Studi Penambatan Senyawa-Senyawa Amidasi Etil Para Metoksisinamat Sebagai Antidiabetes”. Shalawat serta salam semoga selalu tercurah kepada junjungan Nabi Muhammad SAW., dan para sahabat serta pengikutnya. Dalam penyelesaian penelitian dan penulisan skripsi ini penulis banyak menerima bantuan maupun dukungan dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini dengan segala kerendahan hati, penulis ingin memberikan penghargaan yang setinggi-tingginya dan menyampaikan terima kasih yang tulus kepada : 1. Bapak Drs. Arif Sumantri, M.Kes., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan 2. Bapak Yardi, Ph.D., Apt., selaku Kepala Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan 3. Bapak Supandi, M.Si., Apt., dan Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt., sebagai dosen pembimbing I dan II yang dengan kesabarannya telah memberikan waktu, ilmu, arahan dan bimbingannya selama penelitian dan penulisan skripsi ini 4. Ibu Dr. Dra. H. Delina Hasan, M.Kes., Apt., selaku penasehat akademik yang telah membimbing penulis selama masa perkuliahan. 5. Ayahanda tercinta Nang Supriadi dan Ibunda Ida Rosidah yang senantiasa selalu memberikan doa, kasih sayang, dan dukungan baik moral maupun materi kepada penulis selama ini 6. Kakak Nadzifah Yuliani senantiasa memberikan dukungan dan motivasi kepada penulis. 7. Bapak dan Ibu Dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan hingga penulis dapat menyelesaikan studi di Program Studi Farmasi

vi

Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. 8. Teman seperjuangan penulis Eko Wahyudi, Fathiyah atas kebersamaan, motivasi dan bantuan selama penelitian hingga terselesaikannya skripsi ini. 9. Sahabat-sahabat Fio Noviany, Brasti Eka Pratiwi, Astri Dwi Zahrina, Sry Wardiyah, Hurhafiza, Maharani Pratiwi, Rianisa Karunia Dewi, dan Wina Oktaviyani yang tak pernah bosan memberikan dukungan, masukan, dan semangat bagi penulis dalam penyelesaian skripsi ini. 10. Teman-teman Farmasi Angkatan 2011 atas segala kebersamaanya, semangat, dan bantuan selama dibangku perkuliahan hingga selesai pengerjaan skripsi ini. 11. Dan kepada semua pihak yang telah membantu selama penelitian dan penulisan skripsi baik secara langsung maupun tidak langsung yang tidak bisa penulis sebutkan satu per satu.

Semoga segala bantuan yang telah diberikan kepada penulis mendapatkan balasan dari Allah SWT. Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna. Untuk itu penulis mengaharapkan masukan berupa kritik dan saran yang membangun demi kesempurnaan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Jakarta, Juli 2015

Penulis

vii

viii

DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ........................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .........................................ii HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................iii ABSTRAK .............................................................................................................. iv

ABSTRACT ..................................................................................................v KATA PENGANTAR ................................................................................. vi HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ILMIAH .......................... viii DAFTAR ISI ................................................................................................ ix DAFTAR TABEL ...................................................................................... xii DAFTAR GAMBAR ................................................................................. xiii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xiv DAFTAR ISTILAH ................................................................................... xv BAB 1 PENDAHULUAN ........................................................................... 1 1.1. Latar Belakang .......................................................................... 1 1.2. Rumusan Masalah .................................................................... 3 1.3. Tujuan Penelitian ...................................................................... 3 1.4. Manfaat Penelitian .................................................................... 3 1.5. Hipotesis ................................................................................. 4 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA .................................................................. 5 2.1. Diabetes Mellitus ...................................................................... 5 2.2. Antidiabetik Oral Golongan Tiazolidindion ............................. 6 2.3. Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ) .................................................. 7 2.4. Etil Para Metosksisinamat ........................................................ 9 2.5. Ester ........................................................................................ 10 2.6. Amida dan Sintesis Amida ..................................................... 11 2.7. Protein dan Asam Amino ...................................................... 12 2.8. Interaksi Ikatan ...................................................................... 15 ix

2.8.1. Ikatan Ion ..................................................................... 15 2.8.2. Ikatan Hidrogen ........................................................... 16 2.8.3. IkatanVan der Waals ................................................... 16 2.8.4. Ikatan Dipol-Dipol ....................................................... 16 2.8.5. Ikatan Kovalen ............................................................ 16 2.9. Penambatan Molekul (Molecular Docking) .......................... 17 2.10. Lipinski’s Rule of Five ........................................................... 19 2.11. MarvinSketch ......................................................................... 20 2.12. Protein Data Bank.................................................................. 20 2.13. PubChem .............................................................................. 21 2.14. Discovery Studio 3.5 Visualizer............................................. 21 2.15. Autodock ................................................................................ 22 2.16. Autodock Vina........................................................................ 22 2.17. Pymol ..................................................................................... 22 BAB 3 METODE PENELITIAN ............................................................. 23 3.1. Waktu Dan Tempat Penelitian ............................................... 23 3.2. Alat ........................................................................................ 23 3.2.1 Perangkat Lunak ............................................................ 23 3.2.2 Perangkat Keras ............................................................. 23 3.3 Bahan .................................................................................... 23 3.3.2. Struktur Tiga Dimensi PPAR-γ.................................... 23 3.3.2. Struktur Tiga Dimensi Ligan ....................................... 24 3.4. Prosedur Kerja ...................................................................... 24 3.4.1. Penyiapan Struktur PPAR-γ ........................................ 24 3.4.2. Penyiapan Struktur Ligan ............................................. 25 3.4. Penambatan Dengan Autodock Vina ..................................... 25 3.4. Analisa Dan Visualisasi Penambatan Molekul ..................... 25 3.4. Analisa Lipinski’s Rule of Five .............................................. 26 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ..................................................... 27 4.1. Penyiapan Struktur PPAR-γ .................................................. 27 4.2. Penyiapan Struktur Ligan ........................................................ 29 3.4. Penambatan Dengan Autodock Vina ..................................... 32 3.4. Analisa Dan Visualisasi Penambatan Molekul ..................... 33 3.4. Analisa Lipinski’s Rule of Five .............................................. 47

x

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................... 51 5.1. Kesimpulan ............................................................................. 51 5.2. Saran ........................................................................................ 51 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................ 52 LAMPIRAN ............................................................................................... 56

xi

DAFTAR TABEL Halaman Tabel 4.1. Daftar ligan yang ditambatkan .................................................... 30 Tabel 4.2. Nilai ΔGbind ligan ...................................................................... 35 Tabel 4.3. Ikatan ligan dengan residu protein .............................................. 44 Tabel 4.5. Interaksi ligan dengan protein ..................................................... 45 Tabel 4.6. Keterangan warna pada gambar Autodock Tools, LigPlus, dan PyMOL ................................................................... 47 Tabel 4.7. Data Lipinski’s Rule of Five ........................................................ 48

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman Gambar 2.1. Struktur obat-obat tiazolidindion ............................................ 6 Gambar 2.2. Struktur dan cara regulasi gen PPAR Gamma ........................ 8 Gambar 2.3. Struktur umum senyawa etil para metoksisinamat................ 10 Gambar 2.4. Struktur umum senyawa ester ............................................... 10 Gambar 2.5. Reaksi pembuatan amida....................................................... 11 Gambar 2.6. Struktur CAPA dan CAPE .................................................... 12 Gambar 2.7. Struktur caffamide ................................................................ 12 Gambar 2.8. Hidrofobik, asam amino alifatik ........................................... 13 Gambar 2.9. Hidrofobik, asam amino aromatik ......................................... 13 Gambar 2.10. Polar, asam amino bermuatan ............................................... 14 Gambar 2.11. Polar, asam amino tidak bermuatan ...................................... 14 Gambar 2.12. Konsep dasar penambatan molekul ....................................... 18 Gambar 4.1. Struktur 2PRG ....................................................................... 28 Gambar 4.2. Visualisasi interaksi rosiglitazon dengan molekul reseptor (PPARγ) ........................................ 39 Gambar 4.3. Visualisasi interaksi p-methoxycinnamoyl tryptamine dengan molekul reseptor (PPARγ) ....................................... 40

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman Lampiran 1. Alur Penelitian ....................................................................... 57 Lampiran 2. Prosedur kerja penambatan molekul dengan Autodock Vina ........................................................... 58 Lampiran 3. Data hasil docking Autodock Vina ......................................... 82 Lampiran 4. Visualisai ligan dan molekul reseptor (PPARγ) .................... 87

xiv

DAFTAR ISTILAH

AMP

: Adenosin Mono Phosphat

AMPK

: AMP-activated protein kinase

ATP

: Adenosine Triphosphate

CAPA

: Caffeic Acid Phenethyl Amide

CAPE

: Caffeic Acid Phenethyl Ester

DM

: Diabetes Mellitus

EPMS

: Etil para metoksisinamat/ Ethyl para Methoxycinnamate

GLUT4

: Reseptor Glukosa Transporter 4

Grid Box

: Kotak pencarian tempat ikatan ligan dengan reseptor

Kkal/mol

: Kilo kalori per mol

KATP

: ATP-sensitive potassium

Molar Refractivity

: Pengukuran total polarizabilitas satu mol senyawa tergantung temperatur, indeks refraksi, dan tekanan

Molecular Docking : Penambatan Molekul pdb

: Protein Data Bank

PPAR-γ

: Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma

RMSD

: Root Mean Square Deviation

TZD

: Tiazolidindion

ΔGbind

: Energi yang dibutuhkan ligan untuk berinteraksi (ikatan) dengan reseptor pada binding site

xv

1

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Diabetes Mellitus (DM) merupakan salah satu kelompok penyakit metabolik yang ditandai oleh hiperglikemia (kadar gula darah meningkat) karena gangguan sekresi insulin, kerja insulin, atau keduanya (ADA, 2014).

Keadaan Hiperglikemia kronis dari diabetes berhubungan dengan gangguan fungsi dan kegagalan berbagai organ, terutama mata, ginjal, saraf, jantung, dan pembuluh darah (ADA, 2014). Data dari WHO pada tahun 2013 menunjukkan bahwa 347 juta orang di seluruh dunia menderita diabetes. Indonesia merupakan Negara ke7 dengan jumlah penderita diabetes terbanyak di dunia. Sekitar 7,6 juta penduduk Indonesia menderita diabetes, sementara 12,6 juta orang lainnya dalam kondisi prediabetes. Pada tahun 2030, diperkirakan populasi penderita diabetes di Indonesia mencapai angka 11,8 juta, dengan persentase pertumbuhan 6 % per tahun yang jauh melebihi pertumbuhan penduduk Indonesia secara keseluruhan (Novo Nordisk, 2013). Pengobatan farmakoterapi untuk diabetes terdiri dari obat antidiabetik oral dan/atau insulin. Obat-obat antidiabetik oral ini terdiri dari beberapa golongan berdasarkan mekanisme kerjanya, yaitu sulfonilurea (meningkatkan sekresi insulin), biguanid (mengurangi glukoneogenesis hepatik, meningkatkan sensitifitas insulin), tiazolidindion (meningkatkan sensitivitas insulin), penghambat α-glukosidase, dan penghambat glucagonlike peptide-1 (GLP-1). Namun, penggunaan antidiabetes oral terbatas karena efek samping yang merugikan termasuk reaksi hematologikal, kutan dan gastrointestinal, koma, hipoglikemik, gangguan fungsi hati dan ginjal (Alarcon, et al., 2000). Untuk mengatasi permasalahan itu, diperlukan adanya

penelitian untuk menemukan senyawa obat baru yang memiliki efek antidiabetes dengan efek samping yang lebih ringan dan efektivitas yang jauh lebih baik.

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2

Salah satu kondisi yang terjadi pada diabetes mellitus yaitu sensitivitas insulin yang terganggu. Hal ini terjadi pada diabetes mellitus tipe 2. Reseptor yang berperan terhadap sensitisasi insulin ini yaitu PPARγ. Antidiabetes dengan

mekanisme kerja

berikatan pada

Peroxisome

Proliferator Activated Receptor Gamma (PPARγ) diantarnyada adalah tiazolidindion (rosiglitazon dan pioglitazon). Tiazolidindion bekerja pada reseptor tersebut menyebabkan terjadinya peningkatan perangsangan insulin oleh reseptor glukosa transporter 4 (GLUT4) dan sintesis glikogen yang menyebabkan peningkatan sinyal insulin dan sensitifitas insulin (Coman & Socaciu, 2012). Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu senyawa yang diperoleh dari rimpang kencur (Kaemferia galanga L.), dan telah dilaporkan

memiliki

beberapa

manfaat

diantaranya

yaitu

sebagai

antiinflamasi, antimikroba, antituberkulosis, antikanker, dan antidibaetes. Chowdhury et al (2014) melaporkan bahwa ekstrak kencur dengan dosis

200 mg/kg BB yang diduga mengandung senyawa etil p-metoksisinamat dapat menghambat peningkatan kadar glukosa pada tikus setelah diinduksi dengan streptozosin. Beberapa senyawa turunan asam sinamat yaitu caffeic acid phenethyl amide (CAPA) yang berasal dari caffeic acid phenethyl ester (CAPE), serta caffeamide memiliki ikatan amida dengan aktivitas sebagai antidiabetes. CAPA dapat menurunkan kadar glukosa plasma pada dosis oral 0,5 mg/kg dan caffeamide pada dosis 40 mg/kg untuk tikus. Adanya ikatan amida pada CAPA menjadikan lebih tahan terhadap hidrolisis, menurunkan konsentrasi glukosa plasma dan efek terhadap dilatasi pada tikus normal dan diabetes, selain itu ditemukan lebih stabil dalam plasma dibandingkan CAPE secara in vivo (Yang, 2012). CAPA

dilaporkan

memiliki aktivitas menghambat KATP channels dan meningkatkan GLUT4 (glucose trasporter 4), sementara Caffeamide dilaporkan memiliki aktivitas dalam

forforilasi

AMPK

(AMP-activated

protein

kinase)

dan

mneningkatkan GLUT4 (glucose trasporter 4) di hati dan otot (Kuo, 2014). KATP channels berhubungan dalam seksresi insulin, sedangkan AMPK


3

berperan dan GLUT4 berkaitan dengan PPARγ dalam sensitisasi insulin. Selain itu telah dilaporkan pula bahwa asam sinamat dan Klorogenat dapat meningkatkan ekspresi PPARγ (Prabhakar, 2011). Oleh karena itu pada penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efektivitas antidiabetes etil pmetoksisisnamat yang dimodifikasi secara amidasi dengan target PPARγ. Pada penelitian ini menggunakan senyawa pembanding yaitu Rosiglitazon yang merupakan antidiabetes golongan tiazolidindion yang memiliki aktivitas terhadap PPARγ. Selain itu, Rosiglitazon juga memiliki kemiripan struktur karena adanya kemiripan struktur dengan senyawa amidasi etil pmetoksisinamat. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui interaksi antara PPARγ dan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat yang dapat ditentukan dengan metode penambatan molekul (molecular docking) atau secara in silico. Metode ini dipilih karena membutuhkan waktu penelitian yang lebih singkat dan biaya yang lebih murah dibandingkan dengan metode in vitro maupun in vivo. Sintesis tradisional dari senyawa obat baru mengunakan kombinasi kimiawi dan screening merupakan proses yang membutuhkan biaya besar dan waktu yang lama, sedangkan screening database molekul dari senyawa model dapat dijadikan metode alternatif dalam desain obat baru (Ekins et al., 2007).

1.2 Rumusan Masalah Apakah senyawa-senyawa amidasi etil p-metoksisinamat memiliki interaksi yang baik terhadap Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma (PPAR-γ) ?

1.3

Tujuan dan Sasaran Penelitian Menganalisa interaksi penambatan molekul senyawa-senyawa amidasi etil p-metoksisinamat

pada Peroxisome Proliferator Activated Receptor

Gamma (PPAR-γ).


4

1.4

Manfaat Penelitian Memberikan data perbandingan interaksi senyawa amidasi etil pmetoksisinamat

terhadap Peroxisome Proliferator Activated Receptor

Gamma (PPAR-γ) untuk membantu dalam perancangan obat antidiabetes baru.


5

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Diabetes Mellitus Diabetes Mellitus (DM) merupakan salah satu kelompok penyakit metabolik yang ditandai oleh hiperglikemia (kadar gula darah meningkat) karena gangguan sekresi insulin, kerja insulin, atau keduanya (ADA, 2014). Fungsi insulin adalah untuk mengatur kadar normal glukosa darah (Wilcox, 2005). Keadaan Hiperglikemia kronis dari diabetes berhubungan dengan kerusakan jangka panjang, gangguan fungsi dan kegagalan berbagai organ, terutama mata, ginjal, saraf, jantung, dan pembuluh darah (ADA, 2014). Keadaan ini

juga

dapat

menyebabkan komplikasi

kronik

mikrovaskular, makrovaskular, dan neuropatik (Schwinghammer,2009). Kadar glukosa puasa pada pasien diabetes adalah > 126 mg/dl atau postprandial > 200 mg/dl atau glukosa sewaktu > 200 mg/dl (Suherman, 2009). Menurut American Diabetes Association (ADA,2014), klasifikasi diabetes meliputi empat kelas klinis : a. Diabetes Mellitus tipe 1 Hasil dari kehancuran sel β pankreas, biasanya menyebabkan defisiensi insulin yang absolut. b. Diabetes Mellitus tipe 2 Hasil dari gangguan sekresi insulin yang progresif menjadi latar belakang terjadinya resistensi insulin. c. Diabetes tipe spesifik lain Misalnya : gangguan genetik pada fungsi sel β, gangguan genetik pada kerja insulin, penyakit eksokrin pankreas (seperti cystic fibrosis), dan yang dipicu oleh obat atau bahan kimia (seperti dalam pengobatan HIV/AIDS atau setelah transplantasi organ).


6

d. Gestational Diabetes Diabetes melitus gestasional (gestational diabetes melitus [GDM]), adalah diabetes yang terjadi pada wanita hamil yang sebelumnya tidak mengidap diabetes (Corwin, 2009).

2.2

Antidiabetik Oral Golongan Tiazolidindion Tiazolidindion (TZD) adalah golongan obat yang mensensitisasi insulin yang merupakan agonis untuk reseptor nuklir Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ). TZD yang pertama, troglitazon (Rezulin©), telah disetujui untuk digunakan di Amerika Serikat pada tahun 1997, segera diikuti oleh pioglitazon (Actos©) dan rosiglitazon (Avandia©). Mekanisme yang tepat dimana TZD bertindak belum jelas digambarkan, namun data menunjukkan bahwa TZD meningkatkan sensitivitas insulin oleh efek langsung dan tidak langsung pada jaringan adiposa dan otot. Troglitazon telah dihapus dari pasar pada tahun 2000 karena hepatotoksisitas, tetapi pioglitazon dan rosiglitazon tetap dipasarkan (DiStefano J.K & Watanabe R. M, 2010).

Gambar 2.1. Struktur obat-obat tiazolidindion (DiStefano J.K & Watanabe R. M, 2010) TZD bekerja dengan mengikat PPAR-γ, yang terutama terletak pada sel-sel lemak dan sel-sel pembuluh darah. TZD meningkatkan ekspresi


7

dari gen yang memetabolisme glukosa, menghasilkan sensitivitas insulin pada otot, hati, dan jaringan lemak secara tidak langsung. TZD menyebabkan preadiposit untuk berdiferensiasi menjadi sel-sel lemak matang pada penyimpanan lemak subkutan. Sel-sel lemak kecil lebih sensitif terhad ap insulin dan lebih mampu menyimpan asam - asam lemak bebas. Hasilnya adalah fluks asam-asam lemak bebas keluar dari plasma, lemak viseral, dan hati menjadi lemak subkutan, jaringan penyimpanan yang kurang resistensi terhadap insulin. Lemak yang dihasilkan dari otot intraseluler yang berkontribusi terhadap resistensi insulin juga menurun. TZD juga mempengaruhi adipokin, (misalnya, angiotensinogen, jaringan necrosis factor - α, interleukin - 6, penghambat aktifator plasminogen-1), yang secara positif dapat mempengaruhi sensitivitas insulin, fungsi endotel, dan peradangan. Dari catatan khusus, adiponektin berkurang pada obesitas dan / atau diabetes tetapi meningkat dengan terapi TZD, yang meningkatkan fungsi endotel, sensitivitas insulin, dan memiliki efek antiinflamasi yang kuat (DiPiro et al, 2008).

2.3

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ) Peroxisome proliferator – activated receptors (PPARs) termasuk ke dalam kelompok reseptor inti (nuclear receptor), yang didefinisikan sebagai faktor transkripsi yang diaktifkan oleh ligan (beberapa asam lemak dan/atau metabolit lipidnya). PPAR memiliki peran dalam mengontrol metabolisme lipid dan lipoprotein, homeostasis glukosa, serta diferensiasi sel.

Akhir-akhir

ini

ditemukan

bahwa

PPAR

juga

mengganggu

perkembangan proses tumor, mengontrol respon inflamasi, dan penyakitpenyakit terkait (Habor, 2010). Reseptor inti dari kelompok Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) merupakan salah satu yang berperan dalam pengaturan diferensiasi adiposit, pada lipid dan homeostasis glukosa. PPARγ berperan dalam

proses sensitisasi insulin, dan digunakan sebagai target terapi

diabetes mellitus tipe 2. Tiazolidindion bekerja pada reseptor tersebut


8

menyebabkan terjadinya peningkatan perangsangan insulin oleh reseptor Glukosa transporter 4 (GLUT4) dan sintesis glikogen yang menyebabkan peningkatan sinyal insulin dan sensitifitas insulin (Coman & Socaciu, 2012). Ada tiga tipe PPAR, yaitu alfa (α), beta (β), gamma (γ), yang dikodekan pada berbagai jenis gen dan mempunya jaringan distribusi yang berbeda-beda. Diaktifkan oleh ligan yang berkonsolidasi dengan PPARs membentuk heterodimer dengan bantuan reseptor 9-cis RXR asam retinoat dan memperbaiki elemen respon spesifik pada tingkat promotor gen target. Elemen respon ini pada umumnya dibentuk melalui pengulangan langsung heksametrik yang muncul (dikenal sebagai reseptor inti, yang dibedakan oleh nukleotida) (Habor, 2010). PPARs membentuk heterodimer dengan reseptor retinoid X (RXR) yang meningkatkan ikatan DNA dan kemudian mengatur transkripsi DNA dengan mengikat urutan nukleotida yang ditentukan (unsur respon proliferator Peroksisom, PPRE) di daerah promotor gen target. Beberapa kofaktor (koaktifator atau korepresor) memediasi kemampuan reseptor inti untuk merangsang atau menekan proses transkripsi. Ketika jenis mutan dari PPAR terikat dengan

RXR, korepresor membentuk kompleks yang

menempel pada heterodimer tersebut. Kemudian, faktor transkripsi basal (BTF) tidak terikat. Ketika jenis normal PPAR terikat dengan RXR, koaktifator membentuk kompleks yang menempel pada heterodimer tersebut. Setelah itu, BTF tersebut terikat dan banyak fungsi yang dijalankan (Sohn et al, 2010).

Gambar 2.2. Struktur dan cara regulasi gen PPAR Gamma (Savage, 2005)


9

Beberapa asam lemak mampu mengikat dan mengaktifasi PPARs. Asam linoleat merupakan salah satu diantara banyaknya aktifator dan dapat mengaktifasi 3 tipe PPARs. Hal ini telah dibuktikan bahwa eikosanoid dan prostaglandin (PG) tertentu dari seri A, D, J merupakan aktivator PPARs (Habor, 2010). Golongan tiazolidindion (TZD) merupakan ligan bagi PPAR-γ yang menyebabkan aktifitas transkripsi dapat terstimulasi, sehingga dapat disimpulkan bahwa PPAR-γ terlibat dalam mekanisme resistensi insulin. Hasil riset secara jelas menunjukkan bahwa molekul golongan turunan TZD (troglitazon, pioglitazon, rosiglitazon), mampu memperbaiki resistensi insulin in vivo secara signifikan. Ada hipotesis yang mengatakan bahwa aktifasi PPAR-γ melibatkan diferensiasi adiposit dan penyimpanan asam lemak

dalam

jaringan

adiposa

(mengurangi

sirkulan

lipid,

yang

menyebabkan otot lebih sensitif terhadap insulin) (Habor, 2010). PPAR-γ yang aktif yang bekerja pada jaringan adiposa dan makrofag memicu diferensiasi sel lemak dan mengatur penyimpanan asam lemak dan metabolisme glukosa dengan mempengaruhi gen terkait. Oleh karena itu, PPAR-γ merupakan target obat utama untuk pengobatan diabetes mellitus tipe 2. Meskipun beberapa molekul alami seperti eikosanoids dan asam lemak tak jenuh ganda yang mampu mengaktifkan reseptor ini, ligan buatan memiliki lebih banyak potensi sebagai agonis dari PPAR (Sohn et al, 2010).

2.4

Etil Para Metoksisinamat Etil p-metoksisinamat (EPMS) merupakan salah satu senyawa yang diperoleh dari rimpang kencur (Kaemferia galanga L.), termasuk dalam golongan senyawa ester yang mengandung senyawa benzena dan senyawa metoksi yang bersifat non polar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar (Firdausi, 2009). EPMS telah dilaporkan mempunyai anti-tuberkolosis, nematisidal, penolak nyamuk, larvasidal, antineoplastic dan potensi anti microbial (Umar et al, 2014).


10

Chowdhury et al (2014) melaporkan bahwa ekstrak kencur dosis 200 mg/kg

BB yang diduga mengandung EPMS diberikan pada tikus dapat menghambat

peningkatan

kadar

glukosa

setelah

diinduksi

dengan

streptozosin.

Gambar 2.3. Struktur umum senyawa etil para metoksisinamat

2.5

Ester Ester adalah suatu senyawa organik yang terbentuk melalui pergantian satu (atau lebih) atom hidrogen pada gugus karboksil dengan suatu gugus organik. Kebanyakan ester tersebar luas pada semua senyawa alam. Sebagai contoh, metil butanoat ditemukan pada minyak nanas dan isopentil asetat merupakan senyawa pokok minyak pisang (McMurry, 2008). Penamaan ester terdiri dari dua kata, kata pertama adalah nama gugus alkil yang terikat pada oksigen ester sedangkan kata kedua berasal dari nama asam karboksilatnya, dengan membuang kata asam (Inggris: -ic acid menjadi –ate). IUPAC

: Asam propanoat

Trivial

: Asam propionat

Gambar 2.4. Struktur umum senyawa ester


11

2.6

Amida dan Sintesis Amida Suatu amida ialah suatu senyawa yang mempunyai nitrogen trivalent yang terikat pada suatu gugus karbonil. Suatu amida diberi nama dari asam karboksilat induknya, dengan mengubah imbuhan asam -oat (atau –at) menjadi –amida. Amida disintesis dari derivat asam karboksilat dan amonia atau amina yang sesuai. Reaksi pembentukan sebagai berikut:

Asil Klorida

R’2NH

O R’2NH

RCNR’2

Anhidrida asam R’2NH Ester

Gambar 2.5. Reaksi pembuatan amida (Fessenden & Fessenden, 1999) Senyawa sinamida telah banyak disintesa, dan kemudian dilakukan uji kanker, yaitu 2-metil sinamida yang diisolasi dari Streptomyces griseoliteus, menunjukkan efek anti-invasif atau antimetastatik yag signifikan (Welch, 1993). Hubungan struktur hasil mofidikasi etil pmetoksisinamat terhadap antiinflamasi menujukkan pergantian gugus fungsi ester

menjadi

amida

dapat

meningkatkan

aktivitas

antiinflamasi

(Hardiansyah, 2014). Beberapa senyawa turunan asam sinamat lain yaitu caffeic acid phenethyl amide (CAPA) yang berasal dari caffeic acid phenethyl ester (CAPE), serta caffeamide memiliki ikatan amida yang dengan aktivitas sebagai antidiabetes. Adanya ikatan amida pada CAPA


12

menjadikan lebih tahan terhadap hidrolisis, menurunkan konsentrasi glukosa plasma dan efek terhadap dilatasi pada tikus normal dan diabetes, selain itu ditemukan lebih stabil dalam plasma dibandingkan CAPE secara in vivo (Yang,

2012).

Caffeamide

dilaporkan

memiliki

aktivitas

dalam

meningkatkan GLUT4 (glucose trasporter 4) di hati dan otot (Kuo, 2014).

Gambar 2.6. Struktur CAPA dan CAPE (Yi-Jin Ho et al, 2013)

Gambar 2.7. Struktur caffeamide (Kuo, 2014)

2.7

Protein dan Asam Amino Asam amino merupakan suatu susunan protein. Protein dari semua spesies, dari bakteri sampai manusia, terdiri dari kumpulan dari 20 asam amino standar yang sama. Sembilan belas di antaranya adalah asam α-amino dengan gugus amino primer (-NH3+) dan asam karboksilat (karboksil; -COOH) yang terikat pada atom karbon pusat, yang disebut atom α-karbon (Cα) karena berdekatan dengan gugus karboksil dan juga terikat pada atom Cα yaitu atom hidrogen dan variabel rantai samping atau gugus 'R'. Namanama asam amino sering disingkat menjadi tiga huruf atau satu huruf. Contoh: prolin disingkat Pro atau P (Hames & Hooper, 2005).


13

Ada 20 asam amino standar yang hanya berbeda dalam struktur rantai samping atau gugus 'R'. Asam amino tersebut dapat dibagi menjadi kelompok-kelompok kecil berdasarkan kesamaan dalam sifat-sifat rantai sampingnya.

Gambar 2.8. Hidrofobik, asam amino alifatik (Hammes & Hopper, 2005)

Gambar 2.9. Hidrofobik, asam amino aromatik (Hammes & Hopper, 2005) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

14

Gambar 2.10. Polar, asam amino bermuatan (Hammes & Hopper, 2005)

Gambar 2.11. Polar, asam amino tak bermuatan (Hammes & Hopper, 2005)


15

Urutan linear asam amino yang bergabung melalui ikatan peptida disebut struktur primer protein. Posisi ikatan kovalen disulfida antara residu sistein juga termasuk dalam struktur primer. Gabungan antara dua struktur primer membentuk struktur protein sekunder. Struktur sekunder protein ini mengacu pada lipatan teratur daerah dari rantai polipeptida. Dua jenis struktur sekunder adalah α-helix dan β-pleated sheet. α-helix berbentuk silinder, rangkaian heliks asam amino seperti batang dalam rantai polipeptida yang ditahan oleh ikatan hidrogen yang sejajar dengan sumbu helix. Dalam β-pleated sheet, ikatan hidrogen terbentuk antara bagian yang berdekatan dari polipeptida yang baik berjalan di arah yang sama (β-pleated sheet paralel) atau dalam arah yang berlawanan (β-pleated sheet antiparalel). β- membalikkan arah rantai polipeptida dan seringkali ditemukan terhubung dengan ujung β-pleated sheet antiparalel (Hames & Hooper, 2005). Struktur tersier protein mengacu pada susunan tiga dimensi dari semua asam amino dalam rantai polipeptida. Struktur ini aktif secara biologis, konformasi asli ini diikat oleh beberapa ikatan nonkovalen. Jika protein terdiri dari lebih dari satu rantai polipeptida dikatakan memiliki struktur kuaterner. Hal ini mengacu pada tata ruang dari subunit polipeptida dan sifat interaksi di antara mereka (Hames & Hooper, 2005).

2.8

Interaksi Ikatan Ada beberapa bentuk ikatan yang berperan. Biasanya dalam bentuk interaksi ikatan intermolekular seperti ikatan ion, ikatan hidrogen, ikatan van der waals, dan ikatan dipol-dipol. Beberapa obat juga membentuk ikatan kovalen terhadap targetnya (Patrick, 2001).

2.8.1

Ikatan Ion Ikatan ion terbentuk antara gugus – gugus yang memiliki muatan yang berlawanan dan sangat penting untuk beberapa interaksi ikatan obattarget. Beberapa pengantar pesan kimia alami tubuh berinteraksi melalui ikatan ion (Patrick, 2001).


16

2.8.2

Ikatan Hidrogen Ikatan ini terlibat dalam interaksi antara dua molekul, yang salah satunya bertindak sebagai donor dan yang lainnya sebagai akseptor. Hidrogen donor mengandung gugus fungsi yang mempunyai proton yang terikat pada atom elektronegatif. Atom elektronegatif memiliki bagian yang lebih besar dari elektron dalam ikatan hidrogen, sehingga membuat hidrogen sedikit bermuatan positif dan elektrofilik. Hidrogen akseptor mengandung elektronegatif atom seperti oksigen atau nitrogen. Ikatan hidrogen lebih lemah dari ikatan ion. (Patrick, 2001).

2.8.3

Interaksi Van Der Waals Interaksi van der waals adalah interaksi lemah yang muncul diantara gugus – gugus hidrofobik seperti cincin aromatik dan gugus alkil. Interaksi ini muncul disebabkan adanya fluktuasi acak dalam densitas elektron sehingga membentuk daerah sementara yang kaya elektron atau sedikit elektron. Daerah kaya elektron pada satu molekul akan menarik daerah yang elektronnya sedikit pada molekul lain. Interaksi ini lebih lemah dari ikatan ion dan ikatan hidrogen dan melibatkan molekul hidrogen netral (Patrick, 2001).

2.8.4

Interaksi Dipol-Dipol Momen dipol penting dalam orientasi molekul ketika berinteraksi dengan situs ikatan. Obat mempunyai momen dipol yang kemungkinan untuk menyelaraskan dengan momen dipol lokal pada situs ikatan sehingga momen dipol sejajar dan dalam arah yang berlawanan. Momen dipol yang salah berorientasi bisa juga mengakibatkan penurunan aktivitas (Patrick, 2001).


17

2.8.5

Ikatan Kovalen Kebanyakan obat berinteraksi dengan targetnya menggunakan ikatan intermolekular. Namun, beberapa obat membentuk ikatan kovalen terhadap targetnya. Obat-obat yang mengandung gugus alkil halida dapat bertindak sebagai elektrofilik dan bereaksi dengan residu asam amino nukleofilik, seperti serin dan sistein, pada situs ikatan target, yang menyebabkan hubungan ireversibel antara obat dan target. Beberapa penghambat enzim dirancang untuk bekerja sebagai substrat dan untuk menjalani reaksi katalis enzim. Hal ini menyebabkan pembentukan hubungan kovalen antara obat dan enzim (Patrick, 2001).

2.9

Penambatan Molekul (Molecular Docking) Dalam bidang pemodelan molekul, docking adalah metode untuk memprediksi orientasi yang lebih diutamakan dari suatu molekul ketika terikat satu sama lain untuk membentuk kompleks yang stabil. Informasi tentang oreintasi ini dapat digunakan untuk memprediksi kekuatan hubungan atau afinitas ikatan antara dua molekul yang digunakan misalnya fungsi penilaian. Hubungan antara molekul biologis yang relevan seperti protein, asam nukleat, karbohidrat, dan lipid memainkan peran sentral dalam transduksi sinyal. Selanjutnya, orientasi relatif dari dua pasangan yang berinteraksi dapat mempengaruhi jenis sinyal yang dihasilkan. Oleh karena itu docking berguna untuk memprediksi baik kekuatan dan jenis sinyal yang dihasilkan. Docking sering digunakan untuk memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitas molekul kecil. Maka docking memainkan peran penting dalam desain obat secara rasional (Mukesh & Rakesh, 2011)


18

Gambar 2.12. Konsep dasar penambatan molekul (Mukesh, 2011)

Fokus Penambatan molekul untuk mensimulasikan secara komputasi proses pengenalan molekul. Tujuan dari Penambatan molekul adalah untuk mencapai konformasi yang optimal untuk kedua protein dan ligan serta orientasi relatif antara protein dan ligan sehingga energi bebas dari sistem secara keseluruhan diminimalkan. Proses komputasi mencari ligan yang cocok baik secara geometris dan energi ke situs pengikatan protein ini disebut penambatan molekul. Penambatan molekul membantu dalam mempelajari obat / ligan atau interaksi reseptor / protein dengan mengidentifikasi situs aktif yang cocok pada protein, mendapatkan geometri terbaik dari ligan - kompleks reseptor, dan menghitung energi interaksi dari ligan yang berbeda untuk merancang ligan yang lebih efektif (Mukesh, 2011). Untuk melakukan skrining penambatan, syarat pertama adalah struktur protein yang dikehendaki. Biasanya struktur telah ditentukan dengan menggunakan teknik biofisik seperti kristalografi sinar-x, atau spektroskopi NMR. Struktur protein dan basis data ligan yang potensial ini berfungsi sebagai input untuk program docking. Keberhasilan program


19

docking tergantung pada dua komponen: pencarian algoritma dan fungsi scoring (Mukesh, 2011). Fungsi scoring untuk menghitung afinitas kompleks ligan-protein reseptor yang terbentuk dan untuk mengurutkan peringkat senyawa (Reddy et al, 2007). Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi bebas Gibbs. Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil dari pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007). Gugus – gugus fungsional ligan akan berinteraksi dengan residu – residu asam amino protein reseptor sehingga membentuk ikatan intermolekular. Kekuatan ikatan inilah yang dihitung dan diperingkatkan (ranking) dengan Scoring function. Berdasarkan interaksi yang terjadi, terdapat beberapa jenis molecular docking, yaitu: 1. Docking protein / ligan kecil 2. Docking protein / peptida 3. Docking protein / protein 4. Docking protein / nukleotida (Mukesh, 2011).

2.10

Lipinski’s Rule of Five Lipinski’s Rule of Five juga dikenal sebagai Pfizer's Rule of five atau Rule of five (RO5) adalah aturan praktis untuk mengevaluasi obat atau menentukan apakah senyawa kimia dengan aktivitas farmakologi atau biologi tertentu memiliki sifat yang akan membuatnya menjadi obat yang aktif diberikan secara oral pada manusia. Aturan ini menjelaskan sifat molekul penting bagi farmakokinetik obat dalam tubuh manusia, termasuk penyerapan, distribusi, metabolisme, dan ekskresi (Lipinski, 2001 & Lipinski et al, 2004). Maka dari itu, apabila diinginkan dalam merancang obat yang aktif secara oral harus memenuhi ‘Lipinski’s Rule of Five’ yaitu:


20

-

Berat molekul kurang dari 500,

-

Memiliki tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor,

-

Memiliki tidak lebih dari 10 gugus hidrogen akseptor,

-

Nilai logP tidak lebih dari 5.

-

Molar refractivity sebaiknya diantara 40-130 (Lipinski, 2001 & Lipinski et al, 2004).

2.11

MarvinSketch MarvinSketch adalah komponen editing query, struktur, dan reaksi dari Java teknologi perangkat lunak ChemAxon.Pengguna MarvinSketch dapat dengan cepat digunakan untuk membuat dan mengedit struktur, reaksi

atau

pertanyaan

dan

menghitung

struktur

terkait

data

(chemaxon.com). MarvinSketch tersedia sebagai standalone aplication untuk pengguna akhir, Java Applet untuk aplikasi berbasis web dan JawaBean untuk pengembang alat kimia. Seperti semua perangkat lunak ChemAxon, MarvinSketch portabel dan dapat dijalankan dalam semua sistem operasi utama dan termasuk Java dan .NET integration (chemaxon.com). MarvinSketch memiliki sistem pengerjaan intuitif dan banyak pilihan pengeditan. Struktur file dari berbagai format file yang didukung dan template memungkinkan pengguna untuk menambahkan struktur sendiri, atau menggunakan perpustakaan template yang disediakan untuk menyederhanakan

struktur,

reaksi

dan

permintaan

menggambar

(chemaxon.com).

2.12

Protein Data Bank Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb/) adalah sebuah dokumen atau kumpulan data eksperimental struktur tiga dimensi dari makromolekul biologis, yang sekarang berjumlah lebih dari 32.500 (Berman, et al., 2000), termasuk protein dan asam nukleat. Molekul –


21

molekul tersebut adalah molekul yang ditemukan di semua organisme termasuk bakteri, ragi, tanaman, lalat, hewan lain, dan manusia. Informasi ini dapat digunakan untuk membantu menyimpulkan peran struktur dalam kesehatan manusia dan penyakit, dan dalam pengembangan obat. Struktur yang terdapat dalam arsip ini mulai dari protein kecil dan potonganpotongan DNA sampai molekul kompleks seperti ribosom (RCSB, 2014).

2.13

PubChem PubChem

(http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov)

adalah

gudang

informasi molekuler untuk umum, sebuah karya ilmiah dari Institut Kesehatan Nasional Amerika (US National Institutes of Health / NIH). Basis data PubChem memiliki lebih dari 27 juta catatan struktur kimia khusus dari senyawa yang berasal dari hampir 70 juta senyawa endapan, dan berisi lebih dari 449.000 catatan bioassay dengan lebih dari ribuan biokimia in vitro dan skrining berbasis sel, dengan menargetkan lebih dari 7000 protein dan gen yang terhubung dengan lebih dari 1,8 juta senyawa (Xie, 2010). Pada situs PubChem ini dapat diunduh struktur kimia dari suatu senyawa secara gratis yang dibutuhkan dalam studi penambatan molekul.

2.14

Discovery Studio 3.5 Visualizer Discovery Studio Visualizer adalah penampil gratis yang dapat digunakan untuk membuka, mengedit data serta alat untuk melakukan analisis data yang dihasilkan oleh perangkat lunak lain. Perangkat ini dirancang untuk memberikan gambaran yang interaktif untuk melihat dan mengedit struktur molekul, urutan, data refleksi X-ray, script, dan data lainnya. Aplikasi ini dapat digunakan pada Windows dan Linux dan terintegrasi dengan desktop yang menyediakan akses ke fitur sistem operasi standar seperti sistem berkas, clipboard, dan percetakan (Accelrys Enterprise Platform, 2005).


22

2.15

Autodock Autodock merupakan program penambatan molekuler yang efektif yang secara cepat dan akurat dapat memprediksi konformasi dan energi dari suatu ikatan antara ligan dan target makromolekul. Autodock terdiri dari dua program utama, yaitu Autodock dan Autodock grid. Autodock untuk melakukan penambatan molekuler ligan dan protein target dengan set grid yang telah terdeskripsi. Pendeskripsian ini dilakukan sebelumnya

dengan

Autogrid.

Untuk

memungkinkan

pencarian

konformasi, Autodock membutuhkan ruang pencarian dalam sistem koordinat dimana posisi ligan dianggap akan terikat (Morris, et al., 2009).

2.16

Autodock Vina AutoDock Vina adalah salah satu perangkat lunak yang tepat dan dapat diandalkan yang tersedia untuk penemuan obat, penambatan molekul dan skrining virtual yang dirancang dan diterapkan oleh Dr. Oleg Trott. Vina menawarkan fungsi yang beragam, tingkat kinerja tinggi dan meningkatkan akurasi untuk mempermudah penggunaan. Perangkat lunak ini dapat dioperasikan dengan bantuan AutoDockTools (ADT) atau instruksi command line (Sandeep et al, 2011).

2.17

PyMOL PyMOL merupakan salah satu program visualisasi yang digunakan untuk memahami suatu struktur biologi dan dapat menampilkan gambar tiga dimensi yang berkualitas dan mampu menyajikan tampilan struktur dalam beberapa warna dari suatu molekul kecil maupun makromolekul seperti protein. Visualisasi sangatlah penting untuk lebih memahami dan mendalami struktur suatu molekul. Perangkat lunak ini dikomersilkan oleh DeLano Scientific LLC (DeLano & Bromberg, 2004).


23

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah bulan April sampai Juni 2015.

3.2

Alat

3.2.1 Perangkat Keras Notebook Sony VAIO (E series E Series SVE11125CVP) dengan spesifikasi Processors AMD E2 1800 APU with Radeon™ HD Graphic @1,7 Ghz ( 2 CPU ), dan RAM (Random Access Memory) 2 gigabyte. Notebook, AC Adapter VGP-AC19V57 dan terkoneksi internet. 3.2.2

Perangkat Lunak Sistem Operasi Windows 8.1 Enterprise 64 bit, Paket Autodock Tools yang terdiri dari Python 2.5.2 dan MGLTools 1.5.6 (Scripps Research Institute), Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys Enterprise Platform), Autodock Vina, PyMOL (DeLano Scientific LLC.), Protein Data

Bank

(http://www.rcsb.org/pdb/),

(http://www.chemaxon.com),

Advanced

Marvin Chemistry

Sketch

5.5.1.0

Development

(ACD/Labs) dan LigPlus.

3.3 3.3.1

Bahan Struktur Tiga Dimensi PPAR-γ Struktur tiga dimensi PPAR-γ diunduh dari Bank Data Protein dengan situs http://www.rcsb.org/pdb/. Makromolekul protein yang dipilih


24

adalah PPAR-γ pada manusia yang didapat dari metode kristalografi Xray dengan resolusi 2,30 Å yang tertambat dengan rosiglitazon. Identitas makromolekul tersebut adalah 2PRG berformat .pdb, data makromolekul diunduh dalam format format text (gz).

3.3.2

Struktur Tiga Dimensi Ligan Struktur tiga dimensi ligan yang digunakan adalah rosiglitazon diunduh dari http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf dan senyawa-senyawa modifikasi secara amidasi dari etil p-metoksisinamat yang dibuat dengan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com) dengan format .pdb.

3.4 3.4.1

Prosedur Kerja Penyiapan Struktur Molekul Reseptor (PPAR-γ) 1. Pengunduhan makromolekul Pengunduhan makromolekul PPAR-γ dari Bank Data Protein dengan situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul tersebut yaitu 2PRG. Data makromolekul diunduh dalam format text (gz). 2. Pemisahan Makromolekul Air dan Ligan Makromolekul protein dipisahkan dari pelarut dan ligan atau residu non standar. Pemisahan makromolekul dari molekul yang tidak diperlukan dilakukan dengan menggunakan program Discovery Studio 3.5 Visualizer. Hasil pemisahan tersebut akan digunakan untuk penambatan. Hasil pemisahan disimpan dalam format .pdb. 3. Optimasi Molekul Optimasi makromolekul dilakukan dengan menggunakan Autodock Tool dan buka makromolekul yang disimpan dalam format .pdb (file → read molecule → .pdb). Optimasi tersebut meliputi : penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter. Pengaturan grid box (grid → grid box) yang meliputi ukuran (size x, y, z), kordinat


25

(center x, y, z) dan, besarnya ukuran (amstrong) dan simpan (file → close saving current). Hasil ini disimpan dalam format .pdbqt.

3.4.2

Penyiapan Struktur Ligan 1. Pengunduhan dan pembuatan ligan Ligan yang digunakan adalah rosiglitazon sebagai pembanding dan ligan

uji

dibuat

dengan

(http://www.chemaxon.com)

dengan

Marvin format

Sketch .pdb,

5.5.1.0 dan

ligan

Rosiglitazon diunduh dari situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov sebagai pembanding senyawa amidasi dengan format .sdf. Format ligan rosiglitazon tersebut diubah menjadi .pdb menggunakan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com). 2. Optimasi Ligan Struktur ligan yang telah dibuat, kemudian dioptimasi dengan menggunakan Autodock Tools. Kemudian, buka ligan yang telah dibuat (ligand → input → open), setelah itu simpan dalam bentuk .pdbqt (ligand → output → save as pdbqt →save.

3.4.3

Penambatan Molekul dengan Autodock Vina Ligan dan protein yang telah tersimpan dalam format .pdbqt dicopy ke dalam folder Vina. Kemudian konfigurasi file vina diketik pada notepad, disimpan dengan nama ‘conf.txt’. Vina dijalankan melalui Command prompt.

3.4.4

Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekul 1. Hasil docking Hasil kalkulasi docking dilihat pada output dalam format notepad. Hasil docking dilakukan dengan memilih ligan yang memiliki energi ikatan yang paling rendah, nilai ikatan dapat dilihat di ‘log.txt’.


26

2. Visualisasi interaksi makromolekul dan ligan dengan menggunakan: a. Ligplus Makromolekul dan output dalam bentuk .pdbqt dibuka dengan menggunakan wordpad. Kopi isi dalam output.pdbqt dan tambahkan ke dalam makromolekul dan simpan dalam format .pdbqt. masukan file tersebut (output makromolekul dan ligan) kemudian dibuka menggunakan ligplus. Visualisi interaksi makromolekul dan ligan dengan menggunakan LigPlus untuk melihat interaksi dan ikatan ligan pada asam amino dalam bentuk dua dimensi. b. Autodock Tools Hasil docking ligan berupa out.pdbqt dan makromolekul dibuka menggunakan

Autodock

Tools,

kemudian

dilihat

interaksi

makromolekul dengan ligan secara tiga dimensi. c. PyMOL Makromolekul dan output dalam bentuk .pdbqt dibuka secera bersamaan menggunakan PyMOL. PyMOL digunakan untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan situs tambatnya.

3.4.5

Analisa Lipinski’s Rule of Five Lipinski’s Rule of Five ditentukan dalam merancang obat yang aktif secara oral. Kriteria Lipinski’s Rule of Five terdiri dari berat molekul (kurang dari 500), log P (tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor (tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor), jumlah hidrogen donor (tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor), jumlah akseptor donor, berat molekul, dan molar refarctivity (sebaiknya diantara 40-130). Aturan tersebut dilihat pada ligan dengan menggunakan MarvinSketch dan Advanced Chemistry Development (ACD/Labs).


27

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Penyiapan Struktur Molekul Reseptor (PPAR-γ) Pada tahap ini, struktur makromolekul yang digunakan diunduh dari Protein Data Bank dengan situs http://www.rcsb.org/. Identitas protein yang dipilih adalah 2PRG yang merupakan struktur Peroxisome Proliferator-Activeted Receptor-Gamma (PPAR-γ) pada manusia (Homo sapiens) yang diperoleh dari difraksi sinar-X dengan resolusi 2,3 Å. Struktur ini diunduh dengan memilih tipe file yaitu PDB File (text) dengan format .pdb. Struktur makromolekul PPAR-γ yang diperoleh tersebut telah terikat dengan ligan Rosiglitazon dan molekul air. Bentuk ini merupakan sisa hasil pengkristalan sebelumnya. Ligan dan molekul air dapat mengganggu proses penambatan. Pada dasarnya dengan adanya molekul air akan memediasi interaksi ligan dengan reseptor, sehingga hasil docking yang didapat semakin baik. Tetapi proses penambatan akan berlangsung lebih kompleks karena variabel persamaan-persamaan matematika docking yang perlu diselesaikan menjadi lebih banyak yang menyebabkan waktu penambatan semakin lama (Cole, Nissink, & Taylor, 2005). Selain itu, ligan yang terikat pada sisi aktif dapat menghalangi ligan lain untuk berikatan, sedangkan adanya molekul air dapat mengganggu ikatan proses penambatan yaitu kemungkinan terikatnya ligan dengan molekul air melalui ikatan hidrogen (Aditya, 2012). Struktur ini kemudian dipisahkan dari residu non standar tersebut dengan cara menghilangkannya dengan menggunakan perangkat lunak Discovery Studio, sehingga dihasilkan struktur molekul yang siap melalui tahap selanjutnya. Struktur hasil pemisahan ini disimpan dengan format .pdb. Tahap

optimasi

pada

Autodock

Tools

dilakukan

untuk

memperbaiki kekurangan yang ada dari data protein yang diunduh dan agar


28

makromolekul tersebut dapat menyesuaikan dengan lingkungan komputasi sehingga

dapat

di-docking.

Pengoptimasian

yang

dilakukan

yaitu

penambahan atom hidrogen (protonasi) yang bertujuan untuk menyesuaikan suasana docking agar mendekati suasana pada pH sitoplasma sel (pH~7) (Drie, 2005), karena PPAR-γ termasuk reseptor inti (nuclear receptor) (Habor, 2010). Penambahan atom hidrogen yang dimaksud adalah memunculkan atom hidrogen yang ada pada struktur sehingga terlihat secara tiga dimensi yang berperan dalam interaksi dengan ligan. Atom hidrogen yang diperhitungkan adalah yang bersifat polar, karena atom ini terlibat dalam ikatan hidrogen (Yanuar, 2012). Atom hidrogen non polar tidak disertakan dalam perhitungan interaksi ligan reseptor pada penambatan molekuler sehingga perlu digabung dengan atom pengikatnya (Yanuar, 2012). Oleh karena itu dipilih pengaturan ‘Merge Non-Polar’. Pada makromolekul juga dilakukan perbaikan muatan dengan menambahankan muatan gasteiger untuk menyesuaikan dengan lingkungan docking sehingga dapat dilakukan perhitungan dengan benar (Huey, Morris, & Forli, 2012). Selain itu diperlukan pengaturan grid box untuk menentukan ruang tambat ligan yang akan di-docking. Ruang tambat ligan ditentukan dengan merujuk kepada penelitian terdahulu berdasarkan ligan yang sudah tertambat dengan makromolekul protein pada saat diunduh, yaitu dalam hal ini rosiglitazon. Pengaturan pada grid box yang digunakan meliputi center_x = 52.734, center_y = -3.774, center_z = 34.258, size_x = 28, size_y = 28, size_z = 28, dan spacing (angstrom) = 1 (Lampiran 2) (Fikry, 2014). File makromolekul maka disimpan dalam format .pdbqt.

Gambar 4.1. Struktur 2PRG (www.rcsb.org)


29

4.2

Penyiapan Struktur Ligan Ligan Rosiglitazon yang digunakan diunduh dari Pubchem dengan situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf dan dipilih struktur 3D dan diubah menjadi .pdb menggunakan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com), sementara itu ligan uji yaitu ligan etil p metoksisinamat, caffeamide dan ligan amidasi etil p-metoksisinamat, dibuat dengan Marvin Sketch 5.5.1.0 (http://www.chemaxon.com) dengan format .pdb dalam bentuk 3D dengan tipe fine with hydrogenize. Daftar ligan yang ditambatkan terdapat pada Tabel 4.1. Ligan yang digunakan untuk penambatan molekul pada PPARγ terdiri dari beberapa bagian. Rosiglitazon digunakan sebagai senyawa pembanding.

Caffeamide merupakan senyawa

turunan asam sinamat

dengan ikatan amida yang yang telah dilakukan uji antidiabetes sebelumnya secara in vivo. Senyawa uji yang digunakan adalah senyawa amidasi etil pmetoksisinamat dan etil p-metoksisinamat. Selain itu, digunakan senyawa uji berupa modifikasi

pada cincin aromatik dari ligan amidasi etil p-

metoksisinamat yang memiliki afinitas terbaik. Pada pengoimasian ligan dilakukan penambahan muatan gasteiger dengan menggunakan Autodock Tools. Muatan gasteiger ini secara otomatis akan ditambahkan pada ligan ketika dibuka dengan Autodock Tools. Selain itu pada ligan juga secara otomatis dilakukan merge non polar sehingga hanya atom hidrogen polar yang muncul. Semua file ligan maka disimpan dalam format .pdbqt.


30

Tabel 4.1. Daftar ligan yang ditambatkan Ligan Senyawa pembanding

Nama Ligan Rosiglitazon

Senyawa turunan asam sinamat lain Caffeamide

Senyawa etil p-metoksisinamat dan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat Ethyl p-methoxycinnamate

P-methoxycinnamoylamine

P-methoxycinnamoyl methylamine

P-methoxycinnamoyl ethylamine

P-methoxycinnamoyl diaminomethanal


31

P-methoxycinnamoyl N-ethanolamine

P-methoxycinnamoyl N,N-ethanolamine

P-methoxycinnamoyl piperidine

P-methoxycinnamoyl cyclohexylamine

P-methoxycinnamoyl phenylamine

P-methoxycinnamoyl dopamine

P-methoxycinnamoyl phenylethylamine

P-methoxycinnamoyl Tryptamine


32

Senyawa modifikasi pada cincin aromatik p-methoxycinnamoyl triptamine Cinnamoyl tryptamine

P-hydroxycinnamoyl Tryptamine

4.3

Penambatan Molekul dengan Autodock Vina Setelah penyiapan protein dan ligan yang akan di-docking selesai, maka dapat dilakukan penambatan molekul dengan Autodock Vina. Hal pertama kali dilakukan pada tahap ini adalah menyalin file protein dan ligan berformat .pdbqt ke dalam folder vina pada Local Disk (C:). Kemudian dibuat konfigurasi vina yang diketik pada notepad (Lampiran 2) dan disimpan dengan nama ‘conf.txt’ dalam folder vina. Konfigurasi vina terdiri dari penulisan nama reseptor dan ligan, output, dan gribox. Penulisn nama reseptor dan ligan pada notepad harus sama dengan nama file pada folder vina. Output ‘out’ merupakan hasil dari proses docking tersebut dibuat dengan nama ‘out.pdbqt.’ Sedangkan center_x, center_y, center_z, size_x, size_y, dan size_z adalah grid box parameter yang sudah diatur sebelumnya pada protein reseptor. Setelah pengaturan file konfigurasi notepad selesai, maka proses docking dengan vina dapat dijalankan. Vina dijalankan melalui perintah Command prompt. Dalam Command prompt, masuk ke dalam Local Disk (C:) dengan perintah ‘cd..’ , dilanjutkan dengan perintah ‘cd vina’ untuk masuk ke dalam folder vina. Kemudiann proses docking dapat dijalankan perintah sebagai berikut: Vina - -config conf.txt - -log log.txt


33

Waktu yang digunakan selama proses docking ini dipengaruhi oleh spesifikasi komputer yang digunakan dan juga ligan yang ditambatkan. Tetapi hal ini tidak terlalu mempengaruhi keakuratan hasil yang diperoleh. Proses penambatan molekul dengan Autodock Vina dapat meningkatkan akurasi dari prediksi mode ikatan bila dibandingkan dengan Autodock 4. Selain itu, vina dapat mengambil keuntungan dari multiple CPU atau CPU core dalam sistem komputer untuk memperpendek waktu running secara signifikan (Trott & Olson, 2010). Untuk input dan output-nya, vina menggunakan format file struktur molekul yang sama dengan Autodock yaitu pdbqt. File pdbqt. Setelah proses docking selesai, maka muncul 2 file baru dalam folder vina, yaitu ‘log.txt’ dan ‘out.pdbqt’. ‘log.txt’ berisikan nilai afinitas ikatan dan root mean square deviation (RMSD) dari hasil docking. Sedangkan ‘out.pdbqt’ merupakan konformasi dari ligan-ligan yang di-docking-kan. Hasil ini dibuka dengan Autodocktools, LigPlus dan Pymol untuk melihat posisi dan orientasi dari ligan pada protein dan juga asam amino-asam amino yang terikat pada ligan serta jarak ikatan ligan dengan asam amino.

4.4 Analisa dan Visualisai Hasil Hasil penambatan molekul pada penelitian ini meliputi nilai energi bebas (ΔGbind) dan Root Mean Square Deviation (RMSD), serta interaksi ligan dengan residu

pada makromolekul protein. Konformasi masing-

masing ligan hasil docking diperingkatkan berdasarkan nilai ΔGbind dari yang terkecil sampai yang terbesar. ΔGbind

merupakan energi yang

dibutuhkan ligan untuk berinteraksi (ikatan) dengan reseptor pada binding site. Semakin kecil harga ΔGbind maka semakin stabil ikatan ligan dengan reseptor. Setiap ligan yang ditambatkan pada makromolekul protein, maka menghasilkan konformasi ligan berdasarkan peringkat nilai ΔGbind dari terendah dengan hasil yang paling baik. Dasar yang digunakan untuk memberikan penilaian adalah nilai RMSD. Dari ke-9 peringkat konformasi yang dihasilkan, maka dipilihlah


34

peringkat teratas yang memiliki nilai ΔGbind dengan RMSD 0, karena merupakan konformasi terbaik dari penambatan masing-masing ligan. Selain itu, nilai RMSD dikatakan baik jika < 2 Å. Dengan penyimpangan yang semakin besar, semakin besar kesalahan pada prediksi interaksi ligan dengan protein (Brooijmans, 2009). RMSD merupakan nilai penyimpangan antara satu konformasi ligan tambat dengan ligan x-ray. RMSD digunakan untuk menentukan apakah prediksi modus ikatan tersebut berhasil dan penting untuk validasi program docking. Batas atas RMSD (u.b.) menyatakan kecocokan antara suatu atom pada salah satu konformasi dengan dengan atom yang sama pada konformasi lainnya dan batas bawah RMSD (i.b.) menyatakan kecocokan antara suatu atom pada salah satu konformasi dengan atom dari unsur sejenis pada konformasi lainnya (Nauli, 2014). ΔGbind dengan RMSD terendah masing-masing ligan dikumpulkan dalam Tabel 4.2. Dari data hasil docking diperoleh nilai ΔGbind amidasi etil p-metoksisinamat dengan rentang -6,2 kkal/mol sampai -9,3 kkal/mol. Sedangkan rosiglitazon sebagai pembanding menunjukkan nilai ΔGbind 8,9 kkal/mol. P-methoxycinnamoyil tryptamine menghasilkan nilai terbaik dari senyawa amidasi etil p-metoksisinamat lainnya dan rosiglitazon. Hal ini menunjukkan bahwa P-methoxycinnamoyil tryptamine dengan ΔGbind -9,3 kkal/mol lebih potensial sebagai antidiabetes dibandingkan Rosiglitazon. Dari hasil senyawa etil p-metoksisinamat sebagai antidiabetes terhadap PPAR-γ memiliki ΔGbind sebesar -6,2 kkal/mol. Hal ini berarti nilai energi ikatan pada PPAR-γ kurang baik dibandingkan senyawa pembanding Rosiglitazon dengan ΔGbind sebesar -8,9 kkal/mol, sehingga modifikasi dilakukan untuk mendapatkan hasil yang lebih baik. Dari hasil tersebut dapat diketahui bahwa adanya gugus amida dibandingkan dengan ester, dapat menunjukkan nilai ΔGbind lebih kecil dan lebih baik sebagai antidabetes pada PPAR-γ. Sehingga senyawa amidasi etil p-metoksisinamat berpotensi memiliki efek antidiabetes yang jauh lebih baik.


35

Tabel 4.2. Nilai ΔGbind ligan Rumus molekul Ligan

ΔGbind

Nama Ligan

(kkal/mol) Senyawa pembanding Rosiglitazon

-8.9

Senyawa turunan asam sinamat lain Caffeamide

-7,7

Senyawa EPMS dan senyawa amidasi EPMS Ethyl p-methoxycinnamate

-6.2


-6.2


-6.5


-6.6


36

P-methoxycinnamoyl N,N-ethanolamine

-6.6

P-methoxycinnamoyl Ethanolamine

-6.9


-7.5


-7.7


-8.0

P-methoxycinnamoyl phenylamine

-8.3

P-methoxycinnamoyl phenylethylamine

-8.5


37


-8.7

P-methoxycinnamoyl Tryptamine

-9.3

Senyawa modifikasi pada cincin aromatik p-methoxycinnamoyl tryptamine Cinnamoyl tryptamine

-9.1

P-hydroxycinnamoyl Tryptamine

-9.2

Dari hasil docking pada ligan amidasi etil p-metoksisinamat menunjukkan bahwa modifikasi struktur yang dilakukan pada gugus etil pmetoksisinamat menjadi turunan amida dapat meningkatkan afinitas ikatan dengan reseptor PPARγ sebagai antidiabetes. Ketika gugus ester OC2H5 pada ethyl p-methoxycinnamate digantikan dengan NH2 seperti pada pmethoxycinnamoylamine, ΔGbind yang dihasilkan adalah sama yaitu . Sementara itu, pada hasil yang lain diperoleh bahwa semakin panjang rantai alkil pada amina yang ditambahkan, maka semakin kecil nilai ΔGbind yang berarti ligan semakin stabil ketika ditambatkan dengan PPARγ. Begitupun ketika gugus alkil digantikan dengan siklik dan aril, nilai ΔGbind yang dihasilkan semakin kecil. Caffeamide

dibandingkan dengan senyawa amidasi EPMS yang

memiliki gugus amina sama yaitu p-methoxycinnamoyl piperidine


38

menunjukkan ΔGbind yang sama pula. Hal ini menandakan bahwa adanya 2 gugus OH pada benzen dari caffeamide memiliki pengaruh yang sama dengan gugus OCH3 pada gugus benzen dari p-methoxycinnamoyl piperidine. Setelah diperoleh afinitas ligan yang paling baik yaitu pmethoxycinnamoyl triptamine, selanjutnya dilakukan penghilangan gugus CH3 dan OCH3 pada cincin aromatiknya. Hasil yang diperoleh bahwa dengan penghilangan gugus metil dan metoksi pada cincin aromatik dapat meningkatkan nilai ΔGbind. Walaupun nilai ΔGbind tidak terjadi perubahan yang signifikan, tetapi kestabilan afinitas ligan menjadi berkurang. Hal ini menandakan bahwa

keberadaan O dan CH3

pada cincin aromatik

mempengaruhi afinitas ligan amidasi etil p-metoksisinamat sebagai antidiabetes. Sehingga apabila gugus tersebut hilang, maka dapat menurunkan energi ikatannya. Selain itu, diperhatikan juga interaksi yang terjadi antara ligan dengan residu-residu makromolekul reseptor. Identifikasi interaksi tersbut dilihat menggunakan program Autodock Tools (3D) dan LigPlus (2D). Interaksi yang terjadi berupa ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan interaksi elektrostatik (Arwansyah, 2014). Tetapi pada software yang digunakan hanya dapat mendeteksi ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik. Sementara PyMOL (3D) digunakan untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan makromolekul protein. Visualisasi tersebut ditunjukkan pada Gambar 4.2 dan Gambar 4.3.


39

Gambar 4.2 .Visualisasi interaksi rosiglitazon dengan molekul protein (PPARγ) Autodock Tools (Kiri), LigPlus(Kanan), dan PyMOL Bawah)


40

Gambar 4.3 Visualisasi interaksi p-methoxycinnamoyl triptamine dengan molekul protein (PPARγ) Autodock Tools (Kiri), PyMOL (Kanan), dan LigPlus (Bawah)


41

Pada Tabel 4.3 tercantum ikatan hidrogen yang terjadi pada ligan dengan

residu

makroolekul

methoxycinnamoylamine,

reseptor.

Ikatan

hidrogen

methoxycinnamoyl

methoxycinnamoyl

ethylamine,

methoxycinnamoyl

phenylamine

P-

methylamine,

methoxycinnamoyl ,

pada

methoxycinnamoyl

ethanolamine, dopamine,

methoxycinnamoyl diaminomethanal, p-methoxycinnamoyl tryptamine, dan hydroxycinnamoyl tryptamine terhadap reseptor PPARγ terjadi pada terjadi pada residu Ser289. Ligan-ligan tersebut memiliki ikatan hidrogen yang sama dengan senyawa pembanding yaitu Rosiglitazon pada Ser289. Pada caffeamide,

ethyl

p-methoxycinnamate,

diethanolamine, dan p-methoxycinnamoyl

p-methoxycinnamoyl

piperidine memiliki ikatan

hidrogen dengan Arg288. Beberpa ligan juga memiliki lebih dari satu ikatan hidrogen. Selain ikatan yang telah disebutkan sebelumnya, ikatan lain yang terjadi yaitu pada caffeamide dengan Ser342, p-methoxycinnamoyl ethanolamin dengan Tyr327, Tyr473, His449;

p-methoxycinnamoyl

diethanolamine dengan Ile326; p-methoxycinnamoyl phenylamine dengan Cys285; dan p-methoxycinnamoyl dopamine Tyr473, His323. Selain itu, terdapat ligan yang tidak memiliki ikatan hidrogen yaitu methoxycinnamoyl cyclohexylamine, p-methoxycinnamoyl phenylethylamine, dan p-cinnamoyl tryptamine Pada ligan yang memiliki ikatan hidrogen lebih dari satu, tidak menjamin memiliki kestabilan yang lebih besar. Hal ini dikarenakan pada ligan yang memiliki ikatan hidrogen lebih dari satu, hanya pmethoxycinnamoyl phenylamine dan p-methoxycinnamoyl dopamine yang memiliki ΔGbind yang mendekati nilai Rosiglitazon. Sementara itu pada liga yang berikatan hidrogen dengan serin, ΔGbind yang dihasilkan berbedabeda, dan yang memiliki nilai paling baik yaitu p-methoxycinnamoyl tryptamine dengan ΔGbind paling kecil dari semua ligan uji dan pembanding. Hal ini kemungkinan dikarenakan ikatan hidrogen yang terjadi adalah sama seperti pada Rosiglitazon yaitu Ser289. Selain itu pmethoxycinnamoyl

tryptamine memiliki banyaknya residu asam amino


42

yang hampir sama dengan Rosiglitazon. Residu asam amino yang berada disekitar ligan. Selain adanya hubungan antara ikatan hidrogen dengan nilai ΔGbind, masih banyak faktor yang mempengaruhinya. Adanya ligan yang tidak memiliki ikatan hidrogen yaitu methoxycinnamoyl cyclohexylamine, pmethoxycinnamoyl phenylethylamine, dan p-hydroxycinnamoyl tryptamine kemungkinan lebih memiliki interaksi lain yang lebih dominan yang mencakup interaksi elektrostatik, interaksi hidrofobik

yang juga

berkontribusi pada harga energi ikatan (ΔG) dari ligan-reseptor selain ikatan hidrogen. Residu ionik memberikan kontribusi terbesar dalam penentuan nilai ΔGbind, kemudian residu polar, aromatik, hidrofobik, secara berurutan (Schneider, Baringhaus, & Kubinyi, 2008). Arginin merupakan asam amino ionik yang memiliki sifat hidrofilik tinggi jika dibandingkan dengan residu polar, aromatik dan hidrofobik. Sifat hidrofilik pada residu tersebut menyebabkan tingkat kestabilan interaksi antara ligan dan reseptor lebih baik. Tetapi pada hasil percobaan ligan dengan ikatan hidrogen pada arginin, memiliki ΔGbind yang lebih besar dibandingkan dengan Rosigltazon sebagai pembanding. Hal ini kemungkinan dikarenakan pengaruh adanya jenis interaksi dengan residu lain yang lebih sedikit pada caffeamide,

ethyl

p-methoxycinnamate,

diethanolamine, dan p-methoxycinnamoyl

p-methoxycinnamoyl

piperidine. Keberadaan dan

interaksinya dengan residu ionik yang lebih banyak yaitu 2-3 dan jenis residu lain pada p-methoxycinnamoyl phenylamine, p-methoxycinnamoyl phenylethylamine, p-methoxycinnamoyl tryptamine, hydroxycinnamoyl

dopamine, p-methoxycinnamoyl

tryptamine, cinnamoyl

tryptamine dapat

berpengaruh terhadap nilai afinitas yang lebih baik dibandingkan ligan yang lain. Dari Gambar 4.2 dan Gambar 4.3 bagian PyMOL dapat dilihat bagaimana ligan berinteraksi dengan situs ikatnya, dan penempatan ligan pada ruang ruang kosong makromolekul reseptor dan dilihat bagaimana perbedaan pada setiap ligan (Lampiran 4). Semakin panjang rantai alkil


43

pada amina yang ditambahkan pada ligan uji, maka semakin kecil nilai ΔGbind yang berarti ligan semakin stabil ketika ditambatkan dengan PPARγ. Begitupun ketika gugus alkil digantikan dengan siklik dan aril, nilai ΔGbind yang dihasilkan semakin kecil. Hal ini dipengaruhi penambahan subtituen atau gugus fungsi memungkinkannya untuk mengisi ruang kosong tersebut, sehingga ligan menyocokkan dirinya dengan situs ikat dengan lebih sesuai. Dapat diketahui bahwa ligan dengan ukuran molekul (sterik) yang sesuai dan dapat mengisi banyak bagian situs aktif makromolekul protein dan berinteraksi dengan lebih baik. Seperti pada penambahan gugus alkil, ligan menempati ruang kosong dengan

asam

amino hidrofobik (Patrick, 2001). Hal ini terlihat dengan lebih banyaknya residu asam amino hdirofobik

contohnya pada p-methoxycinnamoyl

phenylethylamine dibandingkan pada p-methoxycinnamoyl Phenylamine. Hal ini yang membuat penambatan p-methoxycinnamoyl Phenylethylamin lebih stabil dibandingkan dengan p-methoxycinnamoyl Phenylamine. Hasil yang serupa juga telihat pada p-methoxycinnamoyl cyclohexylamine dengan p-methoxycinnamoyl Piperidine, p-methoxycinnamoylamine dengan pmethoxycinnamoyl methylamine dan p-methoxycinnamoyl methylamine dengan p-methoxycinnamoyl ethylamine. Begitupun pada ligan dengan sifat yang lebih polar atau lainnya akan menempati ruang kosong dengan asam amino yang bersifat sama. Banyak faktor yang mempengaruhi afinitas yang terjadi antara ligan uji dengan makromolekul reseptor (PPARγ). Nilai akhir scoring function ΔGbind

dari sistem Autodock Vina berupa energi ikatan yang didapat

merupakan kontribusi sifat sterik berupa ΔGgauss (istilah dispersi yang berhubungan dengan geometri dan formasi) dan ΔGrepulsion (berhubungan dengan pose pada kontak internal yang buruk), ΔGHbond (berhubungan dengan ikatan hidrogen), ΔGhydrophobic (berhubungan dengan interaksi hidrofobik), dan ΔGtors (berhubungan dengan kemampuan memutar dari ligan) (Trott and Olson, 2010). Dengan demikian penentuan afinitas berdasarkan nilai terendah energi bebas ikatan (ΔG) lebih diutamakan


44

karena tidak hanya berkaitan dengan jumlah ikatan hidrogen, atau jenis residu yang berinteraksi dengan ligan.

Tabel 4.3. Ikatan ligan dengan residu protein Ligan

Rosiglitazon Caffeamide

Jumlah ikatan hidrogen 1 2

Jarak ikatan (Ǻ )

Asam amino yang berikatan

Gugus senyawa yang berikatan (ligan- asam amino)

Ser289 Arg288 Ser342 Arg288

N-O O-N O-N O-N

Ethyl p-methoxycinnamate P-methoxycinnamoyl amine P-methoxycinnamoyl methylamine P-methoxycinnamoyl ethylamine P-methoxycinnamoyl ethanolamin

1

3.11 2.93 3.01 2.89

1

3.05

Met329

N-O

1

2.84

Ser289

N-O

1

2.84

Ser289

N-O

4

P-methoxycinnamoyl diethanolamine

4

P-methoxycinnamoyl diaminomethanal P-methoxycinnamoyl piperidine P-methoxycinnamoyl cyclohexylamine P-methoxycinnamoyl phenylamine P-methoxycinnamoyl phenylethylamine P-methoxycinnamoyl dopamine

1

2.85 3.00 3.01 3.12 2.92 2.96 3.05 3.13 2.91

Ser289 Tyr327 Tyr473 His449 Arg288 Arg288 Ile326 Arg288 Ser289

N-O O-O O-O O-N O-N O-N O-O O-N N-O

1

3.21

Arg288

O-N

-

-

-

-

2

2.84 3.24 -

Ser289 Cys285 -

N-O N-O -

P-methoxycinnamoyl tryptamine P-ydroxycinnamoyl tryptamine Cinnamoyl tryptamine

1

3.03 3.06 3.09 2.94

Tyr473 Ser289 His323 Ser289

O-O O-O O-N N-O

1

2.93

Ser289

N-O

-

-

-

-

3


45

Tabel 4.4. Interaksi ligan dengan protein Ligan Ionik Rosiglitazon

Arg288, His449

Caffeamide

Arg288

Ethyl p-methoxycinnamate

Arg288, Glu295

P-methoxycinnamoyl amine

Arg288


Arg288, Glu295


Arg288, Glu295

P-methoxycinnamoyl ethanolamine

Arg288, His449


Arg288, Glu295, Glu343

P-methoxycinnamoyl diaminomethanal P-methoxycinnamoyl piperidine

Arg288


Arg288

P-methoxycinnamoyl phenylamine P-methoxycinnamoyl phenylethylamine

Arg288, His449 Arg288, Glu295, His449 Arg288,

P-methoxycinnamoyl

Arg288

Residu asam amino < 5Ǻ Polar Hidrofobik Hidrofobik Aromatik Alifatik Gln286 Tyr327, Tyr473 Ala292, Cys285, Ser289 Phe226, Phe363 Ile326, Leu228, Leu330, Leu333, Met329 Gln295, Ala292, Ile326, Gln343 Ile341, Leu330, Ser342 Leu333, Met329 Ser289 Phe226 Ala292, Cys285, Ile326, Leu228, Leu330, Met329 Ser289 Ala292, Cys285, Ile326, Leu228, Leu330, Leu333, Met329 Ser289 Ala292, Cys285, Ile326, Leu330, Leu333, Met329 Ser289, Ala292, Cys285, Gln286 Ile326, Leu228, Leu330, Leu333 Ser289, Tyr327, Tyr473 Ala292, Cys285, Gln286 Ile326, Leu228, Leu330 Ala292, Cys285, Ile326, Leu330, Leu333, Leu340, Met329 Ser289, Ala292, Cys285, Gln286 Ile326, Leu330 Ser289 Phe226 Cys285, Ile326, Leu228, Leu330, Leu333, Met329, Prolin227 Ser289 Tyr327, Phe226, Ala292, Cys285, Phe363, Ile326, Leu228, Leu330, Leu333, Met329, Pro227 Ser289, Tyr327, Tyr473, Cys285, Leu330, Gln286 Phe282 Ala292, Ile326 Gln286, Tyr327, Tyr473, Ala292, Cys285, Ser289 Phe226, Phe282, Ile326, Leu330, Phe363 Leu333, Met329 Ser289, Tyr327, Tyr473, Ala292, Cys285,


46

dopamine

Glu295, His323, His449 Arg288, Glu295, His449

Gln286

Phe226, Phe363

Ser289, Gln286

Tyr327, Tyr473, Phe226, Phe363

P-hydroxycinnamoyl tryptamine

Arg288, His449

Ser289, Gln286

Tyr327, Tyr473, Phe226, Phe282

Cinnamoyl tryptamine

Arg288, Glu295, His449, Lys367

Ser289

Tyr327, Phe226, Phe363

P-methoxycinnamoyl triptamine

Ile326, Leu469, Met364 Ala292, Ile326, Leu333, Met329 Ala292, Ile326, Leu333, Ala292, Leu330, Met329,

Leu330, Met329 Cys285, Leu330,

Cys285, Leu330, Met329 Ile326, Leu333, Met364

Pada Gambar 4.2 dan Gambar 4.3 bagian kiri (Autodock Tools) terlihat interaksi ligan dengan residu makromolekul protein. Pada bagian bawah (LigPlus) memperlihatkan interaksi beserta jarak ikatan dengan residu makromolekul yang dijelaskan pada Tabel 4.3 dan Tabel 4.4. Bagian kanan (PyMOL) memvisualisasikan kecocokan bentuk dan volume antara ligan dengan situs tambatnya pada makromolekul reseptor. Kesesuaian antara dua permukaan sama dengan deskripsi pencocokan bentuk dan volume yang dapat membantu menemukan pose komplementer docking target dan molekul ligan (Mukesh & Rakesh, 2011). Kecocokan bentuk dan volume ligan dengan makromolekul pada pymol dapat dilihat dari warna – warna pada ligan dan makromolekul protein yang menunjukkan bahwa kecenderung untuk berada atau berhadapan dengan warna yang sama. Atom pada ligan dan reseptor pada Gambar 4.2 dan Gambar 4.3 yang diolah dengan Autodock Tools, LigPlus dan PyMOL dibedakan berdasarkan warna yang dimiliki masing-masing. Pengaturan warna dibuat sesuai keinginan penggunanya. Keterangan warna tersebut dijelaskan pada Tabel 4.5.


47

Tabel 4.5. Keterangan warna pada gambar Autodocktools, LigPlus, dan Pymol Nama Atom Karbon

Autodocktools Abu - abu (alifatik)

LigPlus

Pymol

Hitam

Biru muda

Hijau (aromatik) Hidrogen

Putih

-

Putih

Nitrogen

Biru

Biru

Biru

Oksigen

Merah

Merah

Merah

Sulfur

Kuning

Kuning

Oranye

4.5 Analisa Lipinski’s Rule of Five Penelitian penambatan molekul ini bertujuan sebagai perancangan suatu molekul obat untuk menemukan senyawa obat baru yang dapat berinteraksi secara efektif terhadap reseptor target agar dapat menimbulkan aktivitas biologi. Lipinski’s Rule of Five juga dikenal sebagai Pfizer's Rule of five atau Rule of five (RO5) adalah aturan praktis untuk mengevaluasi obat atau menentukan apakah senyawa kimia dengan aktivitas farmakologi atau biologi tertentu memiliki sifat yang akan membuatnya menjadi obat yang aktif diberikan secara oral pada manusia. Aturan ini menjelaskan sifat molekul penting bagi farmakokinetik obat dalam tubuh manusia, termasuk penyerapan mereka, distribusi, metabolisme, dan ekskresi (Lipinski, 2001 & Lipinski et al, 2004). Maka dari itu, apabila diinginkan dalam merancang obat yang aktif secara oral harus memenuhi ‘Lipinski’s Rule of Five’ yaitu : 1. Berat molekul kurang dari 500, 2. Memiliki tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor, 3. Memiliki tidak lebih dari 10 gugus hidrogen akseptor, 4. Nilai logP tidak lebih dari 5, 5. Molar refractivity sebaiknya diantara 40-130 (Lipinski, 2001 & Lipinski et al, 2004).


48

Berdasarkan aturan tersebut, maka etil p-metoksisinamat dan 10 senyawa amidasi etil p-metoksisinamat yang di docking tersebut diteliti untuk mengetahui memenuhi syarat atau tidaknya sesuai dengan Rule of Five menggunakan perangkat lunak Marvinsketch dan Advanced Chemistry Development (ACD/Labs). Dari hasil skrining Lipinski’s rule of five Ligan etil-p-metoksisinamat dan ligan amidasi etil p-metoksisinamat sebagai senyawa uji tersebut pada Tabel 4.6 menunjukkan bahwa semua senyawa amidasi etil p-metoksisinamat memenuhi lima kriteria Rule of Five, sehingga kemungkinan aktif secara klinik bila diberikan secara oral karena absorbsinya yang baik. Tabel 4.6. Data Lipinski’s Rule of Five ligan Ligan

Berat

Log P

molekul

H-

H-

Molar

Donor

Akseptor

Refractivity (cm3)

Rosiglitazon

357.427

3.08

1

5

98.06 ± 0.3


206.23776

2.71

-

2

59.86 ± 0.3

Caffeamide

247.28968

2.02

2

3

70.42 ± 0.3


177.19984

1.17

1

2

52.38 ± 0.3

P-methoxycinnamoyl

191.22642

1.40

1

2

57.07 ± 0.3

205.253

1.75

1

2

61.71 ± 0.3

221.2524

0.71

2

3

63.24 ± 0.3

N,N- 265.30496

0.24

2

4

74.17 ± 0.3

220.22458

0.83

2

3

60.64 ± 0.3

methylamine P-methoxycinnamoyl Ethylamine P-methoxycinnamoyl ethanolamine P-methoxycinnamoyl diethanolamine P-methoxycinnamoyl diaminomethanal


49

P-methoxycinnamoyl

245.31686

2.47

-

2

73.33 ± 0.3

259.34344

3.19

1

2

76.40 ± 0.4

253.2958

3.41

1

2

78± 0.3

281.34896

3.41

1

2

86.19 ± 0.3

313.34776

2.80

3

4

89.96 ± 0.3

320.385

3.51

2

2

98.47 ± 0.3

306.35842

3.36

3

2

93.67 ± 0.3

290.35902

3.66

2

1

91.79 ± 0.3

Piperidine P-methoxycinnamoyl cyclohexylamine P-methoxycinnamoyl phenylamin P-methoxycinnamol Phenylethylamine P-methoxycinnamoyl dopamine P-methoxycinnamoyl tryptamine P-hydorxycinnamoyl tryptamine Cinnamoyl tryptamine

Data yang diperoleh dari penambatan molekul berupa prediksi konformasi ikatan berupa posisi dan jenis ikatan serta afinitas ikatan berdasarkan energi ikatan.

Tetapi nilai afinitas ini belum tentu merepresentasikan aktivitas yang akan terjadi. Sehingga perlu dilakukan validasi lebih lanjut secara eksperimental, baik itu dengan uji in vitro sebelum dilakukan in vivo. Meskipun demikian, docking memiliki peran penting sebagai langkah awal dalam pengembangan dan perancangan obat baru karena memiliki keuntungan tersendiri dibandingkan pendekatan in vivo maupun in vitro. Keuntungan tersebut antara lain adalah waktu penelitian yang lebih sedikit dan biaya yang jauh lebih murah. Selain itu, prediksi ini dinilai penting bagi perkembangan senyawa-senyawa yang diduga memiliki aktivitas biologis untuk dijadikan senyawa penuntun bagi perkembangan obat selanjutnya (Trott & Olson, 2009). Dengan begitu kita dapat memperkirakan senyawa mana yang memiliki afinitas baik dan layak untuk dikembangkan. Hal ini juga mendorong peningkatan teknologi untuk mengidentifikasi kecocokan antara senyawa dan target yang memiliki dampak farmakologis, sehingga semakin


50

meningkat dalam hal pengembangan dan penemuan obat baru secara rasional (Brooijmans, 2009).


51

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1

Kesimpulan Pada penelitian ini telah dibuktikan bahwa senyawa hasil amidasi etil p-metoksisinamat memiliki afinitas lebih baik terhadap Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma (PPAR-γ) esternya.

Hasil

metoksisinamat

penambatan sebagai

senyawa-senyawa

antidibetes

dengan

dibandingkan bentuk amidasi

konformasi

etil

p-

terbaiknya

menunjukkan nilai ΔGbind diantara rentang -6,2 kkal/mol sampai -9,3 kkal/mol. Sedangkan rosiglitazon sebagai kontrol positif menunjukkan nilai ΔGbind -8,9 kkal/mol. Senyawa p-methoxycinnamoyil tryptamine memiliki afinitas terbaik dengan nilai ΔGbind -9.3 kkal/mol, sehingga berpotensi sebagai antidiabetes.

5.2

Saran 1. Dapat dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan perangkat lunak lain seperti DOCK, FlexX, ICM, GLIDE, SLIDE, LigandFIT, dan Surflex, dan lain-lain untuk mengetahui perbandingan hasil antara perangkat lunak tersebut. 2. Perlu dilakukan uji in vitro dan in vivo untuk mengetahui aktivitas antidiabetes senyawa-senyawa amidasi etil p-metoksisinamat tersebut.


52

DAFTAR PUSTAKA

Accelrys Enterprise Platform. 2005. Introduction to the Discovery Studio Visualizer. San Diego, California, U.S.A: Accelrys Software Inc. Alarcon, F.J., et al. 2000. Hypoglycemic Effect of Extracts And Fractions From Psacalium decompositum in Healthy And Alloxan Diabetic Mice. J. Ethnopharmacol. 72(2): 21-27. American Diabetes Association. 2014. Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus. Diabetes Care. 37: Supplement 1. Arwansyah., Laksmi Ambarsari & Tony I. Sumaryadi. 2014 Simulasi Docking Senyawa Kurkumin dan Analognya Sebagai Inhibitor Reseptor Adrogen pada Kanker Prostat. Current Biochemistry. Volume 1 (1): 11-19. Berman, H. M., et al. 2000. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Research Are Provided Here Courtesy of Oxford University Press. 28(1): 235–242. Coman, Cristina., & Carmen Socaciu. 2012. Docking of Phytochemicals to the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma. Bulletin UASVM Agriculture. 69(2): 236-242. Cole, J. C., J. W. Nissink, & O. Taylor. 2005. Protein–Ligand Docking and Virtual Screening with GOLD. In J. Alvarez, & B. Shoichet, Virtual Screening in Drug Discovery. Boca Raton: CRC Press. Corwin, J. 2009. Buku Saku Patofisiologi (3 ed.). Jakarta: EGC. Chowdhury, Mohammad Zubair, et al. 2014. Phytochemical and Pharmacological Investigations of Rhizome Extracts of Kaempferia Galanga. IJP. Vol. 1: 185192. DeLano, W. L., & S. Bromberg.

2004. PyMOL User's Guide. San Carlos,

California. U.S.A: DeLano Scientific LLC. DiPiro, J. T., et al. 2008. Pharmacotherapy A Pathophysiologic Approach (7 ed.). New York: The McGraw-Hill Companies, Inc. DiStefano, J. K., & Watanabe, R. M. 2010. Pharmacogenetics of Anti-Diabetes Drugs. Pharmaceuticals (Basel) 3:2610–46.


53

Drie, J. H. 2005. Pharmacophore-Based Virtual Screening: A Practical Perspective. In J. Alvarez, & B. Shoichet, Virtual Screening in Drug Discovery. Boca Raton: CRC Press. Ekins, S., J. Mestres, & B. Testa. 2007. In silico Pharmacology for Drug Discovery: Application to Targets and Beyond. British Journal of Pharmacology Review. 152:21-37. Fessenden & Fessenden. 1999. Kimia Organik Ed. 3. Jakarta: Erlangga. Fikry, M. Awaludin. 2014. Studi Penambatan Molekul Senyawa-Senyawa Flavonoid Dari Buah Mengkudu (Morinda Citrifolia L) Pada Peroxisome Proliferator-Activated Receptor - Gamma (PPARγ). Skripsi, Program Studi Farmasi, Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, UIN Syarif Hidyatullah Jakarta. Jakarta. Firdausi, Nur Indah. 2009. Isolasi Senyawa Etil Para Metoksi Sinamat (EPMS) Dari Rimpang Kencur Sebagai Bahan Tabir Surya Pada Industri Kosmetik. Skripsi, Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri Malang. Malang. Funkhouser, T. 2007. Protein-Ligand Docking Methods. Princeton, New Jersey, U.S.A: Princeton University. Glowacki, E.D., M.I. Vladu, S. Bauer. 2013. Hydrogenbonds in Molecular Solidsfrom Biological Systems to Organic Electronics. J. Mater. Chem.B. 1: 37423753. Habor, A. 2010. Peroxisome Proliferator Activated Receptors. Farmacia. Hames, D., & N. Hooper. 2005. Biochemistry (3 ed.). Leeds, UK: Taylor & Francis Group. Hendrayana, S., et al. 1994. Kimia Analitik Instrumen. Semarang: IKIP Semarang Press. https://www.chemaxon.com/brochures/MarvinSketch.pdf Kuo, Yueh-Hsiung. 2014. Caffeamide 36-13 Regulates the Antidiabetic and Hypolipidemic Signs of High-Fat-Fed Mice on Glucose Transporter 4, AMPK Phosphorylation, and Regulated Hepatic Glucose Production. Hindawi Publishing Corporation. 2014: 1-12.


54

Lipinski, C.A. et al. 2001. Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Depelopment Settings. Advanced Drug Delivery Reviews. 46 (1-3): 3-26. Lipinski, C. A. 2004. Drug Discovery Today: Technologie. 1 (4): 337-341. Morris, G. M., et al. 2009. AutoDock Version 4.2: Automated Docking of Flexible Ligands to Flexible Receptors. La Jolla, California, U.S.A: The Scripps Research Institute. Mukesh, B., & K. Rakesh. 2011. Molecular Docking: A Review. Int J Res Ayurv Pharm. 2 (6) : 1746-1751. Nauli, Tigor. 2014. Penentuan Sisi Aktif Selulase Aspergillus Niger dengan Docking Ligan. JKTI. 16 (2): 94-100. Nordisk, Novo. 2013. Where Economics and Health Meet: Changing Diabetes in Indonesia. In N. Nordisk, The Blueprint for Change Programme (p. 3). Indonesia: Novo Nordisk. Patrick, G. 2001. Instant Notes in Medicinal Chemistry. Oxford: BIOS Scientific Publisher. Prabhakar, Pranav Kumar & Mukesh Doble. 2011. Interaction Of Cinnamic Acid Derivatives With Commercial Hypoglycemic Drugs on 2-Deoxyglucose Uptake In 3T3-L1 Adipocytes. American Chemical Society, Journal of Agricultural and Food Chemistry. 59: 9835-9844. RCSB. 2014. About the PDB Archive and the RCSB PDB. Retrieved from Protein Data

Bank:

http://www.rcsb.org/pdb/static.do?p=general_information/about_pdb/index.ht ml. Rifai, Eko Aditya.

2012. Penapisan In Silico Antmalaria Dari Basis Data

Tanaman Obat Indonesia Terhadap Targe Plasmepsin. Skripsi, Program Studi Farmasi,

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas

Indonesia. Depok. Sandeep, G., et al. 2011. AUDocker LE: A GUI for virtual screening with Autodock Vina. BMC Research Notes. 4:445. Schneider, G., K.H. Baringhaus, & H. Kubinyi. 2008. Molecular Design: Concepts and Applications. USA: Wiley-VCH.


55

Trott, O. & A.J. Olson. 2009. Software News And Update Autodock Vina: Improving the Speed and Accuracy of Docking with A New Scoring Function,

Eificient

Optimization,

and

Multithreading.

Jornal

of

Computational Chemistry. 31: 455-46. Trott, O., & A.J. Olson. 2010. Autodock Vina: Improving The Speed and Accuracy Of Docking With A New Scoring Function, Efficient Optimization and Multithreading. Jornal of Computational Chemistry. 31(2): 455–461 Umar et al, 2014. Ethyl-p-methoxycinnamate Isolated From Kaempferia galanga Inhibits Inflamation by Suppressing Interleukin-1, Tumor Necrosis Factor-α, and Angiogenesis by Blocking Endothelial Functions. Clinics. 69 (2): 134 – 144 Welch, D.R., D.E. Harper, & K.H.Yohem 1993. U-77, 863: A Novel cinnamide Issolated From Streptomyces Griseoluteus That Inhibit Cancer Invasion And Metastatis. Clin. Exp. Metastatis. 11: 201-212. WHO.

2013.

Diabetes.

Retrieved

from

WHO:

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/en/ Wilcox, Gisela. 2005. Insulin and Insulin Resistance. Clin Biochem Rev. May. 26 (2): 19–39. Xie, X.-Q. 2010. Exploiting PubChem for Virtual Screening. NIH Public Access. 5(12): 1205–1220. Yang, J. et al.2012. Stability Of Caffeic Acid Phenethyl Amide (CAPA) In Rat Plasma. Biomed Chromatogr. 26:594–598. Yannuar, Arry. 2012. Penambatan Molekular Praktek dan Aplikasi Pada Virtual Screening. Depok: Fakultas Farmasi Universitas Indonesia.

.


56

LAMPIRAN


57

Lampiran 1. Alur penelitian

Penyiapan Struktur Molekul PPAR-γ

Pengunduhan struktur dari Bank Data Protein (http://www.rcsb.org/pdb/).

Penyiapan Struktur Ligan Rosiglitazon

Penyiapan Struktur Ligan Amidasi EPMS

Pengunduhan struktur ligan Rosiglitazon dari PubChem (http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov)

Output : 2PRG.pdb

Dibuat menggunakan MarvinSketch

Output : Ligan.sdf

Pemisahan dari pelarut dan ligan atau residu non standar dengan Discovery Studio 3.5 Visualizer Output : 2PRG.pdb

Pengoptimasian dengan Autodock Tools yang meliputi : penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter Output : 2PRG.pdbqt

Pengoperasian format menggunakan MarvinSketch

Output : Ligan.pdb

Pengoptimasian dengan Autodock Tools

Output : Ligan.pdbqt

Simpan dalam satu folder Vina dan buat file konfigurasi file dengan notepad, beri nama conf.txt Penambatan molekul dengan Atodock Vina Analisis dan Visualisasi Penambatan Molekul

Analisis Lipinski’s ule of Five Penambatan Molekul

Analisa interaksi dan ikatan ligan pada asam amino molekul dalam bentuk dua dimensi menggunakan LigPlus dan tiga dimensi menggunakan Autodock Tools

Analisa visualisasi melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan situs tambatnya menggunakan PyMOL


58

Lampiran 2. Prosedur kerja penambatan molekul dengan Autodock Vina a. Penyiapan Protein 1. Pengunduhan makromolekul PPAR-γ dari Bank Data Protein dengan situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul tersebut yaitu 2PRG. Data makromolekul diunduh dalam format .pdb.

2. Pemisahan makromolekul protein dari pelarut dan ligan atau residu non standar dengan discovery studio. Disimpan dalam format .pdb


59

Pilih ‘Scripts  Selection  Select water molecule  delete ’

Pilih ‘Scripts  Selection  Select ligands  delete’ Save as ‘2PRG.pdb’


60

3. Pengoptimasian dengan Autodock Tools. Optimasi tersebut meliputi : a) Penambahan atom hidrogen

Pilih ‘ Read Molecule’, pilih makromolekul yang akan digunakan.

Pilih ‘Edit  Hydrogens  add’


61

Diatur sesuai konfigurasi diatas, kemudian klik ‘Ok’

Pilih ‘Edit  Hydrogens  Merge Non Polar’


62

Pilih ‘Edit  Charge  Compute Gasteiger’

Kemudian akan muncul keteranagan di atas, lalu Klik ‘Ok’


63

Pilih ‘Grid  Macromolecule  Choose 2PRG  Select Molecule’

Pilih ‘2PRG  Select Molecule’


64

Kemudian akan muncul keteranagan di atas, lalu Klik ‘Ok’

Save as ‘2PRG.pdbqt’


65

b) Pengaturan grid box parameter.

Pilih ‘Grid  Grid Box’

Diatur parameter grid box sesuai pada gambar, kemudian pilih ‘File  close saving current’


66

b. Penyiapan Ligan 1. Pembuatan dan Perolehan Ligan - Ligan Uji

Pembuatan Struktur

Pilih ‘structure  Clean 3D  Clean Method  Fine with Hydrogenize’


67

Pilih ‘structure  Clean 3D  Clean in 3D’

Save as ‘Ligan.pdb’


68

-

Ligan Pembanding 1) Pengunduhan struktur ligan dari situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf. dipilih struktur 3D.


69

2) Format

ligan-ligan

tersebut

dirubah

menjadi

.pdb

dengan

menggunakan MarvinSketch

2. Struktur ligan yang telah dibuat dioptimasi dengan Autodock Tools

Pilih ‘Ligand Input Open pilih ligan yang dipakai Open’


70

Akan muncul peringatan seperti pada gambar, klik ‘Ok’

Pilih ‘Ligand  Output  Save as PDBQT  Save’


71

c. Kriteria Lipinski Rule’s of Five 1. Log P

Pilih ‘Calculation Partitioning Log p’

2. H Donor dan H Akseptor

Pilih ‘Calculation  Other  H Bond Donor/ Acceptor’


72

3. Berat Molekul

Pilih ‘Tools  Calculate  Formula Weight’


73

4. Molar Refractivity

Pilih ‘Tools  Calculate  Molar Refractivity’


74

d. Penambatan Molekul dengan Autodock Vina 1.

Ligan dan protein yang telah tersimpan dalam format .pdbqt dicopy ke dalam folder Vina.

File – file yang harus ada di folder vina : 2PRG.pdbqt; conf.txt; ligand.pdbqt; vina.exe; vina_licence.rtf; vina_split.exe

2. Kemudian config file vina diketik pada notepad, disimpan dengan nama conf.

Config file disesuaikan dengan pengaturan grid box sebelumnya.


75

3. Vina dijalankan melalui Command prompt.

Ketik perintah ‘cd .. (Enter)  cd .. (Enter)  cd vina (Enter)  vina –config conf.txt –log log.txt’ tekan ‘Enter’

e. Analisis dan visualisasi

1. Hasil kalkulasi docking dilihat pada output dalam format notepad

File yang berada dalam folder vina setelah proses docking, muncul 2 folder baru : log.txt dan out.pdbqt


76

File ‘log.txt’ bila dibuka dengan wordpad

2. Kemudian dilihat posisi dan orientasi ligan tesebut pada makromolekul, serta asam – asam amino yang terikat pada ligan dengan perangkat lunak Autodock tools, LigPlus dan PyMOL. a) Melihat interaksi ligan menggunakan Autodock Tools

Pilih ‘Analyze  Docking  Open Autodock vina result’, kemudian pilih ‘out.pdbqt’ dalam folder vina, klik ‘open  single molecule with multiple conformation  Ok


77

Pilih ‘Analyze  Macromolecule  Open’, kemudian pilih ‘2PRG.pdbqt’ dalam folder vina, klik ‘Open’

Pilih ‘Analyze  Docking  Show interactions’


78

Atur tampilan sesuai keinginan, klik ‘save image’

b) Melihat interaksi ligan menggunakan LigPlus

Pilih ‘ Open  PDB File  Browse , kemudian pilih 2PRG.pdbqt yang telah digabung dengan Out.pdbqt ligan’


79

Klik ‘Run’ pada tampilan tersebut

Visualisasi 2D interaksi Ligan dengan 2PRG

Keterangan Simbol pada LigPlus


80

c) Melihat kecocokan bentuk dan volume menggunakan PyMOL.

File ‘out.pdbqt’ dan ‘2PRG.pdbqt’ dibuka dengan Pymol pilih ‘action (pada ‘ all’) preset  ligand sites  transparent (better)’ atur posisi tampilan sesuai keinginan

Pilih ‘show (pada ‘Out.pdbqt’)  as  spheres’


81

Diatur pewarnaan ligan dan reseptor sesuai keinginan (pengaturan ligan dan reseptor harus sama) Pilih ‘Color  by element  CHNOS…’

komponen lain yang tidak diperlukan bisa disembunyikan, pilih ‘Hide (pada ‘2PRG’)  lines/sticks/ribbon/cartoon’


82

Lampiran 3. Data hasil docking Autodock Vina

Rosiglitazon





83


P-methoxycinnamoyl ethanolamine




84



P-methoxycinnamoyl Phenylethylamine

P-methoxycinnamoyl Phenylamine


85


P-hydroxycinnamoyl tryptamine

P-methoxycinnamoyl tryptamine

Cinnamoyl tryptamine


86

Caffeamide


87

Lampiran 4. Visualisai ligan dan molekul reseptor (PPARγ) Autodock Tools (Kiri), PyMOL (Kanan), dan LigPlus (Bawah)

a) Rosiglitazon


88

b) Caffeamide


89

c) Ethyl p-methoxycinnamate


90

d) P-methoxycinnamoylamine


91

e) P-methoxycinnamoyl methylamine


92

f) P-methoxycinnamoyl ethylamine


93

g) P-methoxycinnamoyl ethanolamine


94

h) P-methoxycinnamoyl diethanolamine


95

i) P-methoxycinnamoyl diaminomethanal


96

j) P-methoxycinnamoyl piperidine


97

k) P-methoxycinnamoyl cyclohexylamine


98

l) P-methoxycinnamoyl phenylamine


99

m) P-methoxycinnamoyl phenylethylamine


100

n) P-methoxycinnamoyl dopamine


101

o) P-methoxycinnamoyl tryptamine


102

p) P-hydroxycinnamoyl tryptamine


103

q) Cinnamoyl tryptamine


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Recommend Documents