UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI PENAMBATAN MOLEKUL SENYAWA – SENYAWA FLAVONOID DARI BUAH MENGKUDU (Morinda citrifolia L) PADA PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTOR - GAMMA (PPARγ)

SKRIPSI

M. AWALUDDIN FIKRY 1110102000034

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JULI 2014

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI PENAMBATAN MOLEKUL SENYAWA – SENYAWA FLAVONOID DARI BUAH MENGKUDU (Morinda citrifolia L) PADA PEROXISOME PROLIFERATOR-ACTIVATED RECEPTOR - GAMMA (PPARγ)

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

M. AWALUDDIN FIKRY 1110102000034

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JULI 2014

i

ii

iii

iv

ABSTRAK

Nama : M. Awaluddin Fikry Program Studi : Farmasi Judul : Studi Penambatan Molekul Senyawa – Senyawa Flavonoid Dari Buah Mengkudu (Morinda Citrifolia L) Pada Peroxisome Proliferator-Activated Receptor - Gamma (PPARγ) Diabetes mellitus (DM) merupakan penyakit kronik yang muncul baik itu ketika pankreas tidak mampu memproduksi cukup insulin ataupun ketika tubuh tidak dapat menggunakan insulin yang diproduksi secara efektif. Mengkudu (Morinda citrifolia L) telah banyak digunakan oleh masyarakat sebagai pencegahan serta pengobatan penyakit diabetes dan juga sebagai suplemen kesehatan. Di dalamnya terkandung senyawa-senyawa flavonoid yang dapat berperan sebagai obat antidiabetik. Salah satu reseptor yang berperan dalam pengobatan diabetes adalah Peroxisome Proliferator - Activated Receptor Gamma (PPARγ) yang bertanggungjawab terhadap sensitisasi insulin dalam jaringan adiposa. Dalam penelitian ini, interaksi antara senyawa – senyawa flavonoid dalam buah mengkudu sebagai ligan, dengan PPARγ diamati menggunakan perangkat lunak Autodock Vina, yang merupakan suatu program yang dapat menambatkan molekul ligan pada makromolekul reseptor. Kemudian divisualisasikan menggunakan Autodocktools dan Pymol. Dalam penelitian ini, rosiglitazon yang sudah diketahui sebagai ligan untuk PPARγ digunakan sebagai standar. Hasilnya menunjukkan bahwa senyawa - senyawa flavonoid tersebut menunjukkan hasil energi ikatan dengan rentang antara -8,1 kkal/mol sampai -8,5 kkal/mol. Ketika dibandingkan dengan rosiglitazon ( -8.9 kkal/mol ), nilai energi flavonoid memang lebih kecil, tetapi dengan rentang yang tidak terlalu jauh. Hal ini menunjukkan bahwa potensi senyawa flavonoid sebagai antidiabetik mendekati rosiglitazon. Kata kunci : diabetes, Morinda citrifolia, PPARγ, penambatan molekul, Autodock Vina

v

ABSTRACT

Name : M. Awaluddin Fikry Program Study: Pharmacy Title : Molecular Docking Studies of Flavonoids of Noni Fruit (Morinda citrifolia L) to Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma (PPARγ) Diabetes is a chronic disease that occurs either when the pancreas does not produce enough insulin or when the body cannot effectively use the insulin it produces. Morinda citrifolia has been used by many people as the prevention and treatment of diabetes as well as health supplements. It contains flavonoids which can act as an antidiabetic agent . One of the receptors that play a role in the treatment of diabetes is peroxisome proliferator-activated receptor - gamma (PPARγ) which responsible for insulin sensitization in adipose tissue. In this study, the interaction beetween flavonoids in noni fruit as ligands, and PPARγ is investigated by using the Autodock Vina software, which is a program that allows docking of molecular ligand to receptor macromolecules. In this perspective, flavonoids such as quercetin, kaempferol, nicotifloroside, narcissoside, and rutin were selected. Rosiglitazone, a known ligand for PPARγ was used as the standard. The result revealed that all the selected flavonoids showed binding energy ranging between -8,1 kcal/mol to -8,5 kcal/mol while compared with the standard (-8.9 kcal/mol). However, when compared with rosiglitazone, the value of the binding energy of flavonoids was smaller, but the range is not too far. This suggests that the potential of the flavonoid compounds approach rosiglitazone. Keywords : diabetes, Morinda citrifolia, PPARγ, molecular docking, Autodock Vina

vi

KATA PENGANTAR/UCAPAN TERIMA KASIH

Puji syukur kehadirat Allah SWT., karena atas berkat dan rahmat-Nya proses penelitian hingga penulisan skripsi ini dapat berjalan. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada : (1) Bapak Supandi, M.Si, Apt., selaku pembimbing pertama dan Bapak Andrianopsyah Mas Jaya Putra, M.Sc., selaku pembimbing kedua, yang memiliki andil besar dalam proses penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala bantuan dan bimbingan bapak mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya. (2) Bapak Prof. (hc) dr. MK. Tadjuddin, Sp. And., selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. (3) Bapak Drs. Umar Mansyur, M.Sc., Apt., selaku ketua Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. (4) Ibu Ofa Suzanti Betha, M.Si., Apt., selaku penasehat akademik yang telah membimbing penulis selama masa perkuliahan. (5) Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan bimbingan dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta. (6) Kepada kedua orang tua, Ibunda Ety Karyati dan Ayahanda Ahmad Fatahillah, atas cinta, kasih sayang, dan dukungannya serta do’a yang selalu teriring selama penyusunan skripsi ini. Dan juga kepada adik – adik serta saudara –

vii

saudaraku yang telah banyak menghibur dan memberikan semangat sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. (7) Sahabat Paviliun, Arsyadanie, Arum, Fahrur, Chandra, dan Denny yang telah banyak membantu penulis dalam suka dan duka. Dwikky, Rendy, Atras, Hafit, dan Erwin yang sering menghibur penulis. Serta tim Kimia Medisinal, Ivo, Hadi dan Mirza yang menjadi tempat sharing dan bertukar ilmu selama pengerjaan skripsi ini berlangsung. (8) Rekan – rekan seperjuangan mahasiswa Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta angkatan 2010. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini masih jauh dari kesempurnaan, karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran dari pembaca yang bersifat membangun dan dapat memacu penulis untuk berkarya lebih baik di masa yang akan datang. Akhir kata, saya berharap Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis khususnya, dan dapat memberikan kontribusi ilmu pengetahuan bagi semua pihak.

Ciputat, Juli 2014 Penulis

viii

DAFTAR ISI

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ................................................ i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................ ii HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................... iii HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ........................ iv ABSTRAK.......................................................................................................... v ABSTRACT ...................................................................................................... vi KATA PENGANTAR/UCAPAN TERIMA KASIH ...................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... x DAFTAR TABEL ............................................................................................. xi DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xii BAB 1 PENDAHULUAN .................................................................................. 1 1.1

Latar Belakang....................................................................................... 1

1.2

Rumusan Masalah.................................................................................. 3

1.3

Hipotesis ................................................................................................ 4

1.4

Tujuan dan Sasaran Penelitian ............................................................... 4

1.5

Manfaat Penelitian ................................................................................. 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................ 5 2.1

Diabetes Mellitus ................................................................................... 5

2.2

Antidiabetik Oral Golongan Tiazolidindion ........................................... 6

2.3

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ) .......... 7

2.4

Mengkudu (Morinda citrifolia L) ........................................................... 9

2.4.1

Deskripsi Tanaman ......................................................................... 9

2.4.2

Penggunaan Tradisional ................................................................ 10

2.4.3

Kandungan Senyawa..................................................................... 10

2.5

Flavonoid............................................................................................. 11

2.6

Protein dan Asam Amino ..................................................................... 14

2.7

Interaksi Ikatan .................................................................................... 17

2.7.1.

Ikatan Ion ..................................................................................... 17

2.7.2.

Ikatan Hidrogen ............................................................................ 17

2.7.3.

Interaksi Van Der Waals ............................................................... 18

2.7.4.

Interaksi Dipol-Dipol .................................................................... 18

viii

2.7.5.

Ikatan Kovalen ............................................................................. 18

2.8

Penambatan Molekul (Molecular Docking) .......................................... 19

2.9

Protein Data Bank ................................................................................ 21

2.10 PubChem ............................................................................................. 21 2.11 Open Babel .......................................................................................... 22 2.12 Discovery Studio 3.5 Visualizer ........................................................... 22 2.13 Autodock ............................................................................................. 22 2.14 Autodock Vina..................................................................................... 23 2.15 Pymol .................................................................................................. 23 ALUR PENELITIAN ...................................................................................... 24 BAB 3 METODE PENELITIAN.................................................................... 25 3.1

Tempat dan Waktu Penelitian .............................................................. 25

3.2

Alat...................................................................................................... 25

3.2.1

Perangkat Keras ............................................................................ 25

3.2.2

Perangkat Lunak ........................................................................... 25

3.3

Bahan .................................................................................................. 25

3.3.1

Struktur Tiga Dimensi PPAR-γ ..................................................... 25

3.3.2

Struktur Tiga Dimensi Ligan......................................................... 26

3.4

Cara Kerja ........................................................................................... 26

3.4.1

Penyiapan Struktur Molekul PPAR-γ ............................................ 26

3.4.2

Penyiapan Struktur Ligan.............................................................. 26

3.4.3

Penambatan Molekul dengan Autodock Vina ................................ 27

3.4.4

Analisis dan Visualisasi Penambatan Molekul .............................. 27

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................. 28 4.1

Penyiapan Makromolekul Protein ........................................................ 28

4.2

Penyiapan Ligan .................................................................................. 29

4.3

Penambatan Molekul dengan Autodock Vina ....................................... 31

4.4

Analisa dan Visualisasi Hasil ............................................................... 32

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 42 5.1

Kesimpulan.......................................................................................... 42

5.2

Saran ................................................................................................... 42

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 43 LAMPIRAN ..................................................................................................... 46

ix

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Struktur obat-obat tiazolidindion ...................................................... 6 Gambar 2.2. Mekanisme Kerja PPAR Gamma ..................................................... 8 Gambar 2.3. Tanaman Mengkudu ...................................................................... 10 Gambar 2.4. Struktur umum flavonoid ............................................................... 12 Gambar 2.5. Pembagian flavonoid ..................................................................... 12 Gambar 2.6. Senyawa flavonoid buah mengkudu ............................................... 13 Gambar 2.7. Hidrofobik, asam amino alifatik ..................................................... 15 Gambar 2.8. Hidrofobik, asam amino aromatik .................................................. 15 Gambar 2.9. Polar, asam amino bermuatan ........................................................ 16 Gambar 2.10. Polar, asam amino tak bermuatan ................................................. 16 Gambar 2.11. Konsep dasar penambatan molekul .............................................. 19 Gambar 2.12. Filosofi Komputasi……………………………………………….20 Gambar 2.13. Config file vina …………………………………………………...27 Gambar 4.1. Visualisasi interaksi ligan dengan residu…………………………. 37

x

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1 Daftar ligan yang ditambatkan (Pubchem) …………………………… 30 Tabel 4.2 Nilai ΔGbind dan Interaksi ligan dengan residu protein (autodocktools)…………………………………………………………………. 34 Tabel 4.3 Makna warna pada gambar Autodocktools dan Pymol……………… 39 Tabel 4.4 Radius Van der waals………………………………………………… 39 Tabel 4.5 Lipinski’s Rule of Five dari ligan yang didocking …………………… 41

xi

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Struktur 3D Makromolekul Protein PPAR-γ…...……………….… 47 Lampiran 2. Prosedur Kerja Molecular Docking dengan Autodock Vina ...……. 48 Lampiran 3. Data hasil docking Autodock Vina ………………………………... 63

xii

1

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Diabetes mellitus (DM) merupakan penyakit kronik yang muncul baik itu ketika pankreas tidak mampu memproduksi cukup insulin ataupun ketika tubuh tidak dapat menggunakan insulin yang diproduksi secara efektif. Insulin adalah suatu hormon yang mengatur gula darah. Hiperkalemia atau peningkatan gula darah, adalah efek umum dari diabetes yang tidak terkontrol dan lambat laun akan menyebabkan kerusakan sistem tubuh yang serius, terutama pada saraf dan pembuluh darah (WHO, 2013). Data dari WHO pada tahun 2013 menunjukkan bahwa 347 juta orang di seluruh dunia menderita diabetes. Indonesia merupakan Negara ke-7 dengan jumlah penderita diabetes terbanyak di dunia. Di posisi teratas, ada Cina (98,4 juta jiwa), India (65,1 juta jiwa), dan Amerika (24,4 juta jiwa). Sekitar 7,6 juta penduduk Indonesia menderita diabetes, sementara 12,6 juta orang lainnya dalam kondisi prediabetes. Pada tahun 2030, diperkirakan populasi penderita diabetes di Indonesia mencapai angka 11,8 juta, dengan persentase pertumbuhan 6 % per tahun yang jauh melebihi pertumbuhan penduduk Indonesia secara keseluruhan (Novo Nordisk, 2013). Reseptor inti dari kelompok Peroxisome Proliferator-Activated Receptors (PPARs) merupakan salah satu yang berperan dalam pengaturan diferensiasi adiposit, pada lipid dan homeostasis glukosa. PPARγ berperan dalam proses sensitisasi insulin, dan digunakan sebagai target terapi diabetes mellitus tipe 2. Obat antidiabetes golongan tiazolidindion bekerja dengan terikat pada PPARγ, sehingga meningkatkan perangsangan insulin oleh reseptor Glukosa transporter 4 (GLUT4) dan sintesis glikogen yang menyebabkan peningkatan sinyal insulin dan sensitifitas insulin (Coman & Socaciu, 2012). Pengobatan diabetes mellitus tipe 2 biasanya dimulai dengan diet dan olah raga yang teratur. Namun, pada akhirnya pasien tetap saja

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2

memerlukan farmakoterapi,

seperti obat

antidiabetik oral dan/atau

penginjeksian insulin. Obat – obat antidiabetik oral ini digolongkan menjadi beberapa golongan berdasarkan mekanisme kerjanya, yaitu sulfonil urea, biguanid, tiazolidindion (TZD), penghambat α-glukosidase, dan penghambat glucagon-like peptide-1 (GLP-1). Namun, obat-obat tersebut dapat mengakibatkan efek samping yang serius bagi penggunanya, seperti hipoglikemia,

toksisitas

hati,

peningkatan

berat

badan,

physconia

(pembesaran perut), dan asidosis laktat. Untuk mengatasi permasalahan itu, maka pengobatan menggunakan herbal pun menjadi pilihan bagi pasien, dikarenakan minimnya efek samping yang didapat. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa beberapa produk alami secara efisien dan aman dapat mengurangi kadar glukosa darah pada pasien DM (Lee, et al., 2012). Morinda citrifolia, atau yang biasa disebut buah mengkudu / pace / noni, telah banyak digunakan oleh masyarakat sebagai pencegahan serta pengobatan penyakit diabetes dan juga sebagai suplemen kesehatan. Beberapa penelitian sebelumnya menyatakan bahwa Morinda citrifolia mengandung sekitar 200 senyawa kimia yang teridentifikasi dan terisolasi dari berbagai bagian tanaman ini. Salah satunya adalah senyawa golongan flavonoid yang terdapat pada bagian buah, bunga, dan daunnya (Singh, 2012). Hasil penelitian Kustarini et al (2012) menyatakan bahwa ekstrak etanol Morinda citrifolia dapat menurunkan kadar gula darah karena aktivitas antioksidan yang dimilikinya yang mengandung flavonoid. Vessal et al (2003) melaporkan bahwa quercetin yang merupakan golongan flavonoid, dapat meregenerasi pankreas dan mungkin meningkatkan pelepasan insulin pada tikus diabetes yang diinduksi streptozotosin. Dalam studi lain, HIF dan Howell (1985) melaporkan bahwa quersetin merangsang pelepasan insulin dan peningkatan uptake Ca2 + dari sel yang terisolasi yang menunjukkan bahwa flavonoid dapat digunakan pada diabetes tipe 2 (Tapas 2008; Kumar 2011). Sementara itu, Shen & Lu (2013) meneliti senyawa flavonoid yang terdapat pada Citrus sp. dengan metode molecular docking (penambatan molekul), dan menghasilkan pernyataan bahwa senyawa flavonoid tersebut memiliki hasil docking yang baik terhadap beberapa protein target yang


3

berhubungan dengan diabetes. Diantaranya adalah Peroxisome ProliferatorActivated Receptor – Gamma (PPARγ) yang bertanggung jawab dalam sensitisasi insulin pada jaringan adiposa. Mekanisme interaksi antara PPARγ dan senyawa golongan flavonoid ini dapat diteliti dengan metode penambatan molekul (molecular docking) karena dapat lebih efisien dibandingkan dengan in vitro dan in vivo. Metode penambatan molekul adalah sistem komputasi pada skrining biologi. Tujuannya adalah untuk mencari nilai, peringkat, atau menyaring seperangkat struktur data menggunakan satu atau lebih prosedur komputasi. Metode ini digunakan untuk membantu menentukan senyawa yang akan ditapis ataupun membantu proses sintesis (Leach et al., 2006). Pada penelitian ini akan dilakukan penambatan molekul senyawa – senyawa flavonoid dari buah mengkudu (Morinda citrifolia), yaitu quersetin, kaempferol, rutin, nikotiflorin, dan narkisin flavonol sebagai ligan untuk PPARγ sebagai rangkaian pencarian kandidat obat antidiabetes dengan rosiglitazon sebagai kontrol positifnya. Metode penambatan molekul dipilih karena waktu penelitian yang lebih cepat dan biaya yang relatif murah. Penambatan molekul yang dilakukan pada penelitian ini adalah structured based virtual screening karena struktur tiga dimensi dari protein target yaitu PPARγ tersedia pada bank data protein. Penambatan molekul pada penelitian ini menggunakan perangkat lunak Autodock Vina serta Pymol sebagai perangkat visualisasi. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan gambaran interaksi antara senyawa golongan flavonoid dengan PPARγ.

1.2

Rumusan Masalah Apakah senyawa – senyawa flavonoid dari buah mengkudu (Morinda citrifolia) yaitu quersetin, kaempferol, rutin, nikotiflorin, dan narkisin flavonol memiliki interaksi yang baik terhadap PPAR-γ ?


4

1.3

Hipotesis Senyawa – senyawa flavonoid dari buah mengkudu (Morinda citrifolia) yaitu quersetin, kaempferol, rutin, nikotiflorin, dan narkisin flavonol memiliki interaksi yang baik jika ditambatkan pada PPAR-γ. Hal ini didasarkan pada penelitan – penelitian sebelumnya tentang uji antidiabetes senyawa flavonoid.

1.4

Tujuan dan Sasaran Penelitian 1) Membuktikan bahwa senyawa – senyawa flavonoid dari buah mengkudu (Morinda citrifolia) memiliki interaksi yang baik terhadap PPAR-γ. 2) Mendapatkan model interaksi penambatan molekul ligan senyawa – senyawa flavonoid dari buah mengkudu (Morinda citrifolia) pada PPARγ. 3) Mendapatkan data ramalan aktifitas senyawa – senyawa flavonoid dari buah mengkudu (Morinda citrifolia).

1.5

Manfaat Penelitian 1) Membantu perancangan obat antidiabetes baru.


5

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1

Diabetes Mellitus Diabetes mellitus (DM) merupakan penyakit kronik yang muncul baik itu ketika pankreas tidak mampu memproduksi cukup insulin ataupun ketika tubuh tidak dapat menggunakan insulin yang diproduksi secara efektif. Insulin adalah suatu hormon yang mengatur gula darah. Hiperkalemia atau peningkatan gula darah, adalah efek umum dari diabetes yang tidak terkontrol dan lambat laun akan menyebabkan kerusakan sistem tubuh yang serius, terutama pada saraf dan pembuluh darah (WHO, 2013). Diabetes mellitus adalah kelompok kelainan metabolisme yang dicirikan dengan hiperglikemia dan abnormalitas pada metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein. Hal ini menyebabkan gangguan pada sekresi insulin, sensitifitas insulin, atau pun keduanya. Keadaan ini juga dapat menyebabkan komplikasi kronik mikrovaskular, makrovaskular, dan neuropatik (Schwinghammer,2009). Kadar glukosa puasa pada pasien diabetes adalah > 126 mg/dl atau postprandial > 200 mg/dl atau glukosa sewaktu > 200 mg/dl (Suherman, 2009). Berdasarkan penyebabnya, Diabetes Melitus dibagi menjadi 4 klasifikasi utama, yaitu : a. Tipe I : Diabetes melitus tergantung insulin (insulin dependent mellitus [IDDM]), yakni penyakit hiperglikemia akibat ketiadaan absolut insulin. Diabetes jenis ini timbul bila pancreas kehilangan kemampuannya untuk menghasilkan insulin. Individu pengidap penyakit ini harus mendapat insulin pengganti (Corwin, 2009). b. Tipe II : Diabetes melitus tidak tergantung insulin (non insulin dependent mellitus [NIDDM]). Pada tipe ini, pancreas masih berfungsi, tetapi menunjukkan defisiensi relatif, sehingga tubuh kehilangan kemampuan untuk memanfaatkan insulin secara efektif (Corwin, 2009).


6

c. Tipe III : Diabetes melitus yang berhubungan dengan keadaan atau sindrom lainnya, seperti penyakit pankreas dan kelainan genetik pada kerja insulin (Corwin, 2009). d. Tipe IV : Diabetes melitus gestasional (gestational diabetes melitus [GDM]), adalah diabetes yang terjadi pada wanita hamil yang sebelumnya tidak mengidap diabetes (Corwin, 2009).

2.2

Antidiabetik Oral Golongan Tiazolidindion Tiazolidindion (TZD) adalah golongan obat yang mensensitisasi insulin yang merupakan agonis untuk reseptor nuklir Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ). TZD yang pertama, troglitazon (Rezulin©), telah disetujui untuk digunakan di Amerika Serikat pada tahun 1997, segera diikuti oleh pioglitazon (Actos©) dan rosiglitazon (Avandia©). Mekanisme yang tepat dimana TZD bertindak belum jelas digambarkan, namun data menunjukkan bahwa TZD meningkatkan sensitivitas insulin oleh efek langsung dan tidak langsung pada jaringan adiposa dan otot. Troglitazon telah dihapus dari pasar pada tahun 2000 karena hepatotoksisitas, tetapi pioglitazon dan rosiglitazon tetap dipasarkan (DiStefano J.K & Watanabe R. M, 2010).

Gambar 2.1. Struktur obat-obat tiazolidindion (DiStefano J.K & Watanabe R. M, 2010)


7

TZD bekerja dengan mengikat PPAR-γ, yang terutama terletak pada sel-sel lemak dan sel-sel pembuluh darah. TZD meningkatkan sensitivitas insulin pada otot, hati, dan jaringan lemak secara tidak langsung. TZD menyebabkan preadiposit untuk berdiferensiasi menjadi sel-sel lemak matang pada penyimpanan lemak subkutan. Sel-sel lemak kecil lebih sensitif terhadap insulin dan lebih mampu menyimpan asam - asam lemak bebas. Hasilnya adalah fluks asam - asam lemak bebas keluar dari plasma, lemak viseral, dan hati menjadi lemak subkutan, jaringan penyimpanan yang kurang resistensi terhadap insulin. Lemak yang dihasilkan dari otot intraseluler yang berkontribusi terhadap resistensi insulin

juga menurun. TZD juga

mempengaruhi adipokin, (misalnya, angiotensinogen, jaringan necrosis factor - α, interleukin - 6, penghambat aktifator plasminogen-1), yang secara positif dapat mempengaruhi sensitivitas insulin, fungsi endotel, dan peradangan. Dari catatan khusus, adiponektin berkurang pada obesitas dan / atau diabetes tetapi meningkat dengan terapi TZD, yang meningkatkan fungsi endotel, sensitivitas insulin, dan memiliki efek antiinflamasi yang kuat (DiPiro et al, 2008).

2.3

Peroxisome Proliferator-Activated Receptor – Gamma (PPAR-γ) Peroxisome proliferator – activated receptors (PPARs) termasuk ke dalam kelompok reseptor inti (nuclear receptor), yang didefinisikan sebagai faktor transkripsi yang diaktifkan oleh ligan (beberapa asam lemak dan/atau metabolit lipidnya). PPAR memiliki peran dalam mengontrol metabolisme lipid dan lipoprotein, homeostasis glukosa, serta diferensiasi sel. Akhir-akhir ini ditemukan bahwa PPAR juga mengganggu perkembangan proses tumor, mengontrol respon inflamasi, dan penyakit-penyakit terkait (Habor, 2010). Ada tiga tipe PPAR, yaitu alfa (α), beta (β), gamma (γ), yang dikodekan pada berbagai jenis gen dan mempunya jaringan distribusi yang berbeda-beda. Diaktifkan oleh ligan yang berkonsolidasi dengan PPARs membentuk heterodimer dengan bantuan reseptor 9-cis RXR asam retinoat dan memperbaiki elemen respon spesifik pada tingkat promotor gen target. Elemen respon ini pada umumnya dibentuk melalui pengulangan langsung


8

heksametrik yang muncul (dikenal sebagai reseptor inti, yang dibedakan oleh nukleotida) (Habor, 2010). PPARs membentuk heterodimer dengan reseptor retinoid X (RXR) yang meningkatkan ikatan DNA dan kemudian mengatur transkripsi DNA dengan mengikat urutan nukleotida yang ditentukan (unsur respon proliferator Peroksisom, PPRE) di daerah promotor gen target. Beberapa kofaktor (koaktifator atau korepresor) memediasi kemampuan reseptor inti untuk merangsang atau menekan proses transkripsi. Ketika jenis mutan dari PPAR terikat dengan RXR, korepresor membentuk kompleks yang menempel pada heterodimer tersebut. Kemudian, faktor transkripsi basal (BTF) tidak terikat. Ketika jenis normal PPAR terikat dengan RXR, koaktifator membentuk kompleks yang menempel pada heterodimer tersebut. Setelah itu, BTF tersebut terikat dan banyak fungsi yang dijalankan (Sohn et al, 2010).

Gambar 2.2. Mekanisme Kerja PPAR Gamma

Beberapa asam lemak mampu mengikat dan mengaktifasi PPARs. Asam linoleat merupakan salah satu diantara banyaknya aktifator dan dapat mengaktifasi 3 tipe PPARs. Hal ini telah dibuktikan bahwa eikosanoid dan prostaglandin (PG) tertentu dari seri A, D, J merupakan aktivator PPARs (Habor, 2010).


9

Golongan tiazolidindion (TZD) merupakan ligan bagi PPAR-γ yang menyebabkan aktifitas transkripsi dapat terstimulasi, sehingga dapat disimpulkan bahwa PPAR-γ terlibat dalam mekanisme resistensi insulin. Hasil riset secara jelas menunjukkan bahwa molekul golongan turunan TZD (troglitazon, pioglitazon, rosiglitazon), mampu memperbaiki resistensi insulin in vivo secara signifikan. Ada hipotesis yang mengatakan bahwa aktifasi PPAR-γ

melibatkan diferensiasi adiposit dan penyimpanan asam lemak

dalam jaringan adiposa (mengurangi sirkulan lipid, yang menyebabkan otot lebih sensitif terhadap insulin) (Habor A, 2010). PPAR-γ yang aktif yang bekerja pada jaringan adiposa dan makrofag memicu diferensiasi sel lemak dan mengatur penyimpanan asam lemak dan metabolisme glukosa dengan mempengaruhi gen terkait. Oleh karena itu, PPAR-γ merupakan target obat utama untuk pengobatan diabetes mellitus tipe 2. Meskipun beberapa molekul alami seperti eikosanoids dan asam lemak tak jenuh ganda yang mampu mengaktifkan reseptor ini, ligan buatan memiliki lebih banyak potensi sebagai agonis dari PPAR (Sohn et al, 2010).

2.4

Mengkudu (Morinda citrifolia L)

2.4.1 Deskripsi Tanaman Mengkudu (Morinda citrifolia L) termasuk dalam famili Rubiaceae. Genus Morinda terdiri dari sekitar 80 spesies yang semuanya tumbuh di zona iklim tropis. Mengkudu adalah sejenis pohon cemara atau semak dengan tinggi 3 sampai 6 m, dengan bentuk oval cerah hijau dan daunnya berurat yang panjangnya 10 sampai 30 cm. Bunga – bunga tubularnya berwarna putih. Buah ini memiliki bentuk bulat telur yang bagian permukaannya berbentuk poligonal. Panjangnya bisa mencapai 12 cm. Buah yang belum matang keras dan berwarna hijau terang. Setelah matang, buah menjadi sangat lembut dan berubah menjadi bening kekuning-kuningan atau putih (Potterat, 2007).


10

Gambar 2.3.Tanaman Mengkudu (http://id.wikipedia.org/wiki/Mengkudu)

2.4.2 Penggunaan Tradisional Jus buah mengkudu sangat diminati dalam pengobatan alternatif untuk berbagai jenis penyakit seperti arthritis, diabetes, tekanan darah tinggi, nyeri otot, kesulitan menstruasi, sakit kepala, penyakit jantung, AIDS, kanker, ulkus lambung, keseleo, depresi mental, kepikunan, pencernaan yang buruk, aterosklerosis, masalah pembuluh darah, dan kecanduan narkoba. Beberapa penelitian melaporkan bahwa mengkudu memiliki beberapa aktifitas biologis yaitu, antibakteri, antifungal, antiviral, antihelmintik, antioksidan, hepatoprotektif, antiobesitas dan hipoglikemik, antidiabetes,

analgesik,

ansiolitik,

antiinflamasi,

penyembuh luka,

hipotensif, kardiovaskular, imunomodulator, antikanker, dan antituberkular (Pawlus & Kinghorn 2007; Singh 2012; Lee et al 2012; WANG et al 2002) (Mian-Ying, et al., 2002).

2.4.3 Kandungan Senyawa Beberapa penelitian sebelumnya menyatakan bahwa Morinda citrifolia mengandung sekitar 200 senyawa kimia yang teridentifikasi dan terisolasi dari berbagai bagian tanaman ini. Chunhieng (2003) melaporkan, buah ini mengandung 90% air, serat makanan, dan protein. Kadar protein buah sangat tinggi yaitu 11,3%, dan asam amino utamanya adalah asam aspartat, asam glutamat dan isoleusin. Dilaporkan bahwa 8,4 % dari jus mengkudu mengandung mineral, potasium, belerang, kalsium, fosfor dan


11

selenium. Baru-baru ini, kandungan polisakarida buah telah diteliti menggunakan analisis keterkaitan monosakarida dan glikosil. Bui et al (2006) menyatakan bahwa monosakarida yang paling banyak ditemukan adalah arabinosa (Araf), galaktosa (Galp), asam galakturonat (GalAp) dan rhamnose (Rhap). Sementara itu, Morton (1992), Shovic dan Whistler (2001) melaporkan adanya vitamin dalam buah terutama asam askorbat (24158 mg/100 g bahan kering) dan juga berdasarkan laporan Dixon et al (1999) buah ini mengandung provitamin A (Sigh, 2012). Bowie dan Cooke (1962) menjelaskan beberapa kelas metabolit pada berbagai bagian tanaman yang berbeda, termasuk asam lemak, alkohol dan fenol, antrakuinon, glikosida antrakuinon, karotenoid, ester, flavonoid, iridoid, keton, lakton, lignan, nukleosida, triterpenoid, sterol dan beberapa senyawa minor.(Sigh, 2012). Beberapa penelitian melaporkan bahwa Morinda citrifolia L yang dikenal dengan mengkudu banyak digunakan oleh masyarakat sebagai bahan obat alami. Ekstrak etanol Morinda citrifolia L mengandung flavonoid yang berfungsi sebagai antioksidan yang mampu menahan laju absorbsi glukosa darah dari saluran cerna menuju pembuluh darah sehingga mampu menahan laju peningkatan kadar glukosa darah. Dengan mencegah peningkatan kadar glukosa darah karena diharapkan dapat mencegah peningkatan radikal bebas, sehingga diharapkan pemberian ekstrak etanol Morinda citrifolia L dapat membantu melindungi sel dari kerusakan akibat paparan radikal bebas (Kustarini et al , 2012).

2.5

Flavonoid Flavonoid merupakan bioaktif polifenol yang memiliki berat molekul rendah yang berperan penting dalam fotosintesis sel. Flavonoid merupakan metabolit sekunder yang ditandai dengan inti flavan dan kerangka karbon C6-C3-C6. Ciri struktur dasar dari flavonoid adalah inti 2-fenil-benzoγ-pyrane yang terdiri dari dua cincin benzena (A dan B) yang dihubungkan melalui cincin pyran heterosiklik (Kumar, 2011).


12

Gambar 2.4. Struktur umum flavonoid

Perbedeaan flavonoid terletak pada susunan hidroksil, metoksi dan gugus samping glikosidik dan dalam hubungannya antara cincin A dan B. pembagian flavonoid berdasarkan variasi susunan pada cincin C. Menurut struktur molekulnya, flavanoid dibagi menjadi delapan kelas (Kumar, 2011):

Gambar 2.5. Pembagian flavonoid

Pada tumbuhan, flavonoid sering muncul sebagai O-glikosida atau C-glikosida. O-glikosida memiliki substituen gula terikat-OH dari aglikon, biasanya pada posisi 3 atau 7, sedangkan, C-glikosida memiliki kelompok gula terikat pada karbon aglikon biasanya pada posisi 6 atau 8 (Kumar, 2011).


13

Flavonoid telah dilaporkan memiliki berbagai aktifitas biologis, yaitu antiinflamasi, antibakteri, antivirus, anti alergi, antitumor sitotoksik, pengobatan penyakit neurodegeneratif, dan vasodilator. Selain itu flavonoid diketahui

dapat

menghambat

peroksidasi

lipid,

agregasi

platelet,

permeabilitas dan kerapuhan kapiler, siklooksigenase dan aktivitas enzim lipooksigenase. Efek tersebut digunakan sebagai antioksidan, anti radikal bebas, kelator kation divalen. Flavonoid juga dilaporkan dapat menghambat berbagai enzim

seperti,

hidrolase,

hialouronidase,

fosfatise alkali,

arilsulfatase, cAMP fosfodiesterase, lipase, α-glucosidase, dan kinase (Kumar, 2011). Senyawa flavonoid diantaranya terkandung dalam buah mengkudu (Morinda citrifolia). Ada beberapa senyawa flavonoid yang terkandung di dalamnya yaitu, kaempferol, narsisosid, nikotiflorosid, quersetin, dan rutin (Pawlus & Kinghorn,2007).

Quersetin

Kaempferol

Nikotiflorin

Narkisin flavonol

Rutin Gambar 2.6. Senyawa flavonoid buah mengkudu (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pccompound) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

14

Hasil penelitian Kustarini et al (2012) menyatakan bahwa ekstrak etanol Morinda citrifolia dapat menurunkan kadar gula darah karena aktivitas antioksidan yang dimilikinya yang mengandung flavonoid. Flavonoid, terutama quersetin, dilaporkan memiliki aktivitas antidiabetes. Vessal et al (2003) melaporkan bahwa quercetin dapat meregenerasi pankreas dan mungkin meningkatkan pelepasan insulin pada tikus diabetes yang diinduksi streptozotosin. Dalam studi lain, HIF dan Howell (1985) melaporkan bahwa quersetin merangsang pelepasan insulin dan peningkatan uptake Ca2 + dari sel yang terisolasi yang menunjukkan bahwa flavonoid dapat digunakan pada diabetes tipe 2 (Tapas 2008; Kumar 2011).

2.6

Protein dan Asam Amino Asam amino merupakan suatu susunan protein. Protein dari semua spesies, dari bakteri sampai manusia, terdiri dari kumpulan dari 20 asam amino standar yang sama. Sembilan belas di antaranya adalah asam α-amino dengan gugus amino primer (-NH3+) dan asam karboksilat (karboksil; -COOH) yang terikat pada atom karbon pusat, yang disebut atom α-karbon (Cα) karena berdekatan dengan gugus karboksil dan juga terikat pada atom Cα yaitu atom hidrogen dan variabel rantai samping atau gugus 'R'. Namanama asam amino sering disingkat menjadi tiga huruf atau satu huruf. Contoh: prolin disingkat Pro atau P (Hames & Hooper, 2005). Ada 20 asam amino standar yang hanya berbeda dalam struktur rantai samping atau gugus 'R'. Asam amino tersebut dapat dibagi menjadi kelompok-kelompok kecil berdasarkan kesamaan dalam sifat-sifat rantai sampingnya. (Hammes & Hopper, 2005).


15

Gambar 2.7. Hidrofobik, asam amino alifatik

Gambar 2.8. Hidrofobik, asam amino aromatik


16

Gambar 2.9. Polar, asam amino bermuatan

Gambar 2.10. Polar, asam amino tak bermuatan

Urutan linear asam amino yang bergabung melalui ikatan peptida disebut struktur primer protein. Posisi ikatan kovalen disulfida antara residu sistein juga termasuk dalam struktur primer. Gabungan antara dua struktur primer membentuk struktur protein sekunder. Struktur sekunder protein ini mengacu pada lipatan teratur daerah dari rantai polipeptida. Dua jenis struktur sekunder adalah α-helix dan β-pleated sheet. α-helix berbentuk silinder, rangkaian heliks asam amino seperti batang dalam rantai polipeptida yang ditahan oleh ikatan hidrogen yang sejajar dengan sumbu helix. Dalam βpleated sheet, ikatan hidrogen terbentuk antara bagian yang berdekatan dari polipeptida yang baik berjalan di arah yang sama (β-pleated sheet paralel) atau

dalam

arah

yang

berlawanan

(β-pleated

sheet

antiparalel).


17

β- membalikkan arah rantai polipeptida dan seringkali ditemukan terhubung dengan ujung β-pleated sheet antiparalel (Hames & Hooper, 2005). Struktur tersier protein mengacu pada susunan tiga dimensi dari semua asam amino dalam rantai polipeptida. Struktur ini aktif secara biologis, konformasi asli ini diikat oleh beberapa ikatan nonkovalen. Jika protein terdiri dari lebih dari satu rantai polipeptida dikatakan memiliki struktur kuaterner. Hal ini mengacu pada tata ruang dari subunit polipeptida dan sifat interaksi di antara mereka (Hames & Hooper, 2005).

2.7

Interaksi Ikatan Ada beberapa bentuk ikatan yang berperan. Biasanya dalam bentuk interaksi ikatan intermolekular seperti ikatan ion, ikatan hidrogen, ikatan van der waals, dan ikatan dipol – dipol. Beberapa obat juga membentuk ikatan kovalen terhadap targetnya (Patrick, 2001).

2.7.1. Ikatan Ion Ikatan ion terbentuk antara gugus – gugus yang memiliki muatan yang berlawanan dan sangat penting untuk beberapa interaksi ikatan obattarget. Beberapa pengantar pesan kimia alami tubuh berinteraksi melalui ikatan ion (Patrick, 2001).

2.7.2. Ikatan Hidrogen Ikatan ini terlibat dalam interaksi antara dua molekul, yang salah satunya bertindak sebagai donor dan yang lainnya sebagai akseptor. Hidrogen donor mengandung gugus fungsi yang mempunyai proton yang terikat pada atom elektronegatif. Atom elektronegatif memiliki bagian yang lebih besar dari elektron dalam ikatan hidrogen, sehingga membuat hidrogen sedikit bermuatan positif dan elektrofilik. Hidrogen akseptor mengandung elektronegatif atom seperti oksigen atau nitrogen. Ikatan hidrogen lebih lemah dari ikatan ion. (Patrick, 2001).


18

2.7.3. Interaksi Van Der Waals Interaksi van der waals adalah interaksi lemah yang muncul diantara gugus – gugus hidrofobik seperti cincin aromatik dan gugus alkil. Interaksi ini muncul disebabkan adanya fluktuasi acak dalam densitas elektron sehingga membentuk daerah sementara yang kaya elektron atau sedikit elektron. Daerah kaya elektron pada satu molekul akan menarik daerah yang elektronnya sedikit pada molekul lain. Interaksi ini lebih lemah dari ikatan ion dan ikatan hidrogen dan melibatkan molekul hidrogen netral (Patrick, 2001). 2.7.4. Interaksi Dipol-Dipol Momen dipol penting dalam orientasi molekul ketika berinteraksi dengan situs ikatan. Obat mempunyai momen dipol yang kemungkinan untuk menyelaraskan dengan momen dipol lokal pada situs ikatan sehingga momen dipol sejajar dan dalam arah yang berlawanan. Momen dipol yang salah berorientasi bisa juga mengakibatkan penurunan aktivitas (Patrick, 2001).

2.7.5. Ikatan Kovalen Kebanyakan obat berinteraksi dengan targetnya menggunakan ikatan intermolekular. Namun, beberapa obat membentuk ikatan kovalen terhadap targetnya. Obat-obat yang mengandung gugus alkil halida dapat bertindak sebagai elektrofilik dan bereaksi dengan residu asam amino nukleofilik, seperti serin dan sistein, pada situs ikatan target, yang menyebabkan hubungan ireversibel antara obat dan target. Beberapa penghambat enzim dirancang untuk bekerja sebagai substrat dan untuk menjalani reaksi katalis enzim. Hal ini menyebabkan pembentukan hubungan kovalen antara obat dan enzim (Patrick, 2001).


19

2.8

Penambatan Molekul (Molecular Docking) Dalam bidang pemodelan molekul, docking adalah metode untuk memprediksi orientasi yang lebih diutamakan dari suatu molekul ketika terikat satu sama lain untuk membentuk kompleks yang stabil. Informasi tentang oreintasi ini dapat digunakan untuk memprediksi kekuatan hubungan atau afinitas ikatan antara dua molekul yang digunakan misalnya fungsi penilaian. Hubungan antara molekul biologis yang relevan seperti protein, asam nukleat, karbohidrat, dan lipid memainkan peran sentral dalam transduksi sinyal. Selanjutnya, orientasi relatif dari dua pasangan yang berinteraksi dapat mempengaruhi jenis sinyal yang dihasilkan. Oleh karena itu docking berguna untuk memprediksi baik kekuatan dan jenis sinyal yang dihasilkan. Docking sering digunakan untuk memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitas molekul kecil. Maka docking memainkan peran penting dalam desain obat secara rasional (Mukesh & Rakesh, 2011)

Gambar 2.11. Konsep dasar penambatan molekul (Mukesh, 2011)

Fokus

Penambatan

molekul

untuk

mensimulasikan

secara

komputasi proses pengenalan molekul. Tujuan dari Penambatan molekul adalah untuk mencapai konformasi yang optimal untuk kedua protein dan ligan serta orientasi relatif antara protein dan ligan sehingga energi bebas dari sistem secara keseluruhan diminimalkan. Proses komputasi mencari ligan


20

yang cocok baik secara geometris dan energi ke situs pengikatan protein ini disebut penambatan molekul. Penambatan molekul membantu dalam mempelajari obat / ligan atau interaksi reseptor / protein dengan mengidentifikasi situs aktif yang cocok pada protein, mendapatkan geometri terbaik dari ligan - kompleks reseptor, dan menghitung energi interaksi dari ligan yang berbeda untuk merancang ligan yang lebih efektif (Mukesh, 2011). Uji In Vitro

Senyawa

Aktivitas

(Lab. Basah) Pemodelan (Pendekatan)

Validasi

Komputasi

Struktur

Ramalan Aktivitas (ΔGbind)

(Lab. Kering) Gambar 2.12. Filosofi Komputasi

Untuk melakukan skrining penambatan, syarat pertama adalah struktur protein yang dikehendaki. Biasanya struktur telah ditentukan dengan menggunakan teknik biofisik seperti kristalografi sinar-x, atau spektroskopi NMR. Struktur protein dan basis data ligan yang potensial ini berfungsi sebagai input untuk program docking. Keberhasilan program docking tergantung pada dua komponen: pencarian algoritma dan fungsi scoring (Mukesh, 2011). Fungsi

scoring

dapat

memprediksi

afinitas

ikatan

antara

makromolekul dengan ligan. Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi bebas Gibbs. Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil dari pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007).


21

Berdasarkan interaksi yang terjadi, terdapat beberapa jenis molecular docking, yaitu:

2.9

1.

Docking protein / ligan kecil

2.

Docking protein / peptida

3.

Docking protein / protein

4.

Docking protein / nukleotida (Mukesh, 2011).

Protein Data Bank Protein Data Bank (PDB; http://www.rcsb.org/pdb/) adalah sebuah dokumen atau kumpulan data eksperimental struktur tiga dimensi dari makromolekul biologis, yang sekarang berjumlah lebih dari 32.500 (Berman, et al., 2000), termasuk protein dan asam nukleat. Molekul – molekul tersebut adalah molekul yang ditemukan di semua organisme termasuk bakteri, ragi, tanaman, lalat, hewan lain, dan manusia. Informasi ini dapat digunakan untuk membantu menyimpulkan peran struktur dalam kesehatan manusia dan penyakit, dan dalam pengembangan obat. Struktur yang terdapat dalam arsip ini mulai dari protein kecil dan potongan-potongan DNA sampai molekul kompleks seperti ribosom (RCSB, 2014).

2.10 PubChem PubChem

(http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov)

adalah

gudang

informasi molekuler untuk umum, sebuah karya ilmiah dari Institut Kesehatan Nasional Amerika (US National Institutes of Health / NIH). Basis data PubChem memiliki lebih dari 27 juta catatan struktur kimia khusus dari senyawa yang berasal dari hampir 70 juta senyawa endapan, dan berisi lebih dari 449.000 catatan bioassay dengan lebih dari ribuan biokimia in vitro dan skrining berbasis sel, dengan menargetkan lebih dari 7000 protein dan gen yang terhubung dengan lebih dari 1,8 juta senyawa (Xie, 2010). Pada situs PubChem ini dapat diunduh struktur kimia dari suatu senyawa secara gratis yang dibutuhkan dalam studi penambatan molekul.


22

2.11 Open Babel Open Babel adalah perangkat lunak untuk mengubah beberapa format berkas kimia. Selain itu, perangkat ini menyediakan berbagai fungsi berguna yaitu pencarian konformer dan penggambaran 2D, penapisan, konversi batch, dan pencarian substruktur dan kemiripan. Open Babel mendukung 111 format berkas kimia, yang dapat membaca 82 format dan menulis

85

format.

Perangkat

ini

tersedia

secara

gratis

dari

http://openbabel.org (O’Boyle, et al., 2011).

2.12 Discovery Studio 3.5 Visualizer Discovery Studio Visualizer adalah penampil gratis yang dapat digunakan untuk membuka, mengedit data serta alat untuk melakukan analisis data yang dihasilkan oleh perangkat lunak lain. Perangkat ini dirancang untuk memberikan gambaran yang interaktif untuk melihat dan mengedit struktur molekul, urutan, data refleksi X-ray, script, dan data lainnya.Aplikasi ini dapat digunakan pada Windows dan Linux dan terintegrasi dengan desktop yang menyediakan akses ke fitur sistem operasi standar seperti sistem berkas, clipboard, dan percetakan (Accelrys Enterprise Platform, 2005).

2.13 Autodock Autodock merupakan program penambatan molekuler yang efektif yang secara cepat dan akurat dapat memprediksi konformasi dan energi dari suatu ikatan antara ligan dan target makromolekul. Autodock terdiri dari dua program utama, yaitu Autodock dan Autodock grid. Autodock untuk melakukan penambatan molekuler ligan dan protein target dengan set grid yang telah terdeskripsi. Pendeskripsian ini dilakukan sebelumnya dengan Autogrid.

Untuk

memungkinkan

pencarian

konformasi,

Autodock

membutuhkan ruang pencarian dalam sistem koordinat dimana posisi ligan dianggap akan terikat (Morris, et al., 2009).


23

2.14 Autodock Vina AutoDock Vina adalah salah satu perangkat lunak yang tepat dan dapat diandalkan yang tersedia untuk penemuan obat, penambatan molekul dan skrining virtual yang dirancang dan diterapkan oleh Dr. Oleg Trott. Vina menawarkan fungsi yang beragam, tingkat kinerja tinggi dan meningkatkan akurasi untuk mempermudah penggunaan. Perangkat lunak ini dapat dioperasikan dengan bantuan AutoDockTools (ADT) atau instruksi command line (Sandeep, Nagasree, Hanisha, Murali, & Kumar, 2011).

2.15 Pymol Pymol merupakan salah satu program visualisasi yang digunakan untuk memahami suatu struktur biologi dan dapat menampilkan gambar tiga dimensi yang berkualitas dan mampu menyajikan tampilan struktur dalam beberapa warna dari suatu molekul kecil maupun makromolekul seperti protein. Visualisasi sangatlah penting untuk lebih memahami dan mendalami struktur suatu molekul. Perangkat lunak ini dikomersilkan oleh DeLano Scientific LLC (DeLano & Bromberg, 2004).


24

ALUR PENELITIAN

Penyiapan Struktur Molekul PPAR-γ

Penyiapan Struktur Ligan

Pengunduhan struktur dari Bank Data Protein (http://www.rcsb.org/pdb/).

Pengunduhan struktur ligan dari PubChem (http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov)

Output : 2PRG.pdb

Output : Ligan.sdf

Pemisahan dari pelarut dan ligan atau residu non standar dengan Discovery Studio 3.5 Visualizer.

Pengonversian format dengan Open Babel

Output : 2PRG.pdb

Output : Ligan.pdb

Pengoptimasian dengan Autodock Tools yang meliputi : penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter.

Pengoptimasian dengan Autodock Tools, yaitu pengaturan number of active torsion.

Output : 2PRG.pdbqt

Output : Ligan.pdbqt

Penambatan Molekul dengan Autodock Vina

Analisis dan Visualisasi Penambatan Molekul

Output: 1. Pose : Posisi & Orientasi 2. ΔGbind


25

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilaksanakan di Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah dan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong selama bulan Maret hingga Mei 2014.

3.2

Alat

3.2.1 Perangkat Keras Notebook Asus (A42JC series) dengan spesifikasi Intel® Core™ i5 CPU (M460 @2.53Ghz), RAM (Random Access Memory) 4 gigabyte, dan Graphic Card (NVIDIA Optimus Ge Force 310M) 1 gigabyte. Notebook terhubung dengan AC/DC Adapter dan terkoneksi internet.

3.2.2 Perangkat Lunak Sistem Operasi Windows 7 Ultimate 64 bit, Paket Autodock Tools yang terdiri dari Python 2.5.2 dan MGLTools 1.5.6 (Scripps Research Institute), Open Babel 2.3.2, Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys Enterprise Platform), Autodock Vina, Pymol (DeLano Scientific LLC.), Protein

Data

Bank

(http://www.rcsb.org/pdb/),

dan

PubChem

(http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov).

3.3

Bahan

3.3.1 Struktur Tiga Dimensi PPAR-γ Struktur tiga dimensi PPAR-γ diunduh dari Bank Data Protein dengan situs http://www.rcsb.org/pdb/. Makromolekul protein yang dipilih adalah PPAR-γ pada manusia yang didapat dari metode kristalografi X-ray dengan


26

resolusi 2,30 Å yang tertambat dengan rosiglitazon. Identitas makromolekul

tersebut adalah 2PRG berformat .pdb. 3.3.2 Struktur Tiga Dimensi Ligan Struktur tiga dimensi ligan yang digunakan adalah rosiglitazon dan senyawa – senyawa flavonoid dari Morinda citrifolia, yaitu kaempferol, narkisin flavonol, nikotiflorin, quersetin, dan rutin yang diunduh dari situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf.

3.4

Cara Kerja

3.4.1 Penyiapan Struktur Molekul PPAR-γ Pengunduhan makromolekul PPAR-γ dari Bank Data Protein dengan situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul tersebut yaitu 2PRG. Data makromolekul diunduh dalam format .pdb. Makromolekul protein dipisahkan dari pelarut dan ligan atau residu non standar. Pemisahan makromolekul dari molekul yang tidak diperlukan dilakukan dengan menggunakan program Discovery Studio 3.5 Visualizer. Hasil pemisahan tersebut akan digunakan untuk penambatan. Hasil pemisahan disimpan dalam format .pdb. Molekul PPAR-γ yang telah dipisahkan dari residu dioptimasi dengan Autodock Tools. Optimasi tersebut meliputi : penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter. Hasil ini disimpan dalam format .pdbqt.

3.4.2 Penyiapan Struktur Ligan Ligan yang digunakan adalah rosiglitazon sebagai pembanding dan senyawa – senyawa flavonoid dari Morinda citrifolia, yaitu kaempferol, narkisin flavonol, nikotiflorin, quersetin, dan rutin yang diunduh dari situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf. Format ligan-ligan tersebut dirubah menjadi .pdb dengan menggunakan Open Babel.


27

Struktur ligan yang telah dibuat dioptimasi dengan Autodock Tools. Optimasi tersebut berupa pengaturan number of active torsion. Hasil ini disimpan dalam format .pdbqt.

3.4.3 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina Ligan dan protein yang telah tersimpan dalam format .pdbqt dicopy ke dalam folder Vina. Kemudian konfigurasi file vina diketik pada notepad, disimpan dengan nama ‘conf.txt’. Vina dijalankan melalui Command prompt.

Gambar 2.13. Konfigurasi file vina

3.4.4 Analisis dan Visualisasi Penambatan Molekul Hasil kalkulasi docking dilihat pada output dalam format notepad. Penentuan konformasi ligan hasil docking dilakukan dengan memilih konformasi ligan yang memiliki energi ikatan yang paling rendah (pose terbaik). Posisi dan orientasi ligan tesebut pada makromolekul, serta asam – asam amino yang terikat pada ligan divisualisasikan dengan perangkat lunak Autodocktools dan Pymol untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan situs tambatnya.


28

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

Penyiapan Makromolekul Protein Langkah awal sebelum melakukan proses penambatan molekul adalah penyiapan struktur makromolekul protein dan ligan yang akan digunakan. Pada tahap ini, struktur makromolekul yang digunakan diunduh dari Protein Data Bank dengan situs http://www.rcsb.org/. Identitas protein yang dipilih adalah 2PRG yang merupakan struktur Peroxisome ProliferatorActiveted Receptor-Gamma (PPAR-γ) pada manusia (Homo sapiens) yang diperoleh dari difraksi sinar-X dengan resolusi 2,3 Å. Makromolekul ini terikat dengan ligan yaitu rosiglitazon. Struktur ini diunduh dengan format .pdb (Lampiran 1). Setelah diunduh, maka didapatkan struktur makromolekul PPAR-γ yang terikat dengan ligan dan molekul air. Ligan dan molekul air ini harus dihilangkan dari makromolekul protein karena dapat mengganggu proses penambatan. Pada dasarnya dengan adanya molekul air akan memediasi interaksi ligan dengan reseptor, sehingga hasil docking yang didapat semakin baik. Tetapi proses penambatan akan berlangsung lebih kompleks karena variabel persamaan-persamaan matematika docking yang perlu diselesaikan menjadi lebih banyak yang menyebabkan waktu penambatan semakin lama (Cole, Nissink, & Taylor, 2005). Dengan begitu, perlu adanya kompromi antara akurasi dan kecepatan, dimana jika ingin prosesnya berjalan lebih cepat, maka akurasinya diturunkan hingga 70 % sudah cukup mewakili hasil docking yang didapat. Begitu juga dengan adanya ligan yang terikat pada sisi aktif makromolekul akan menghalangi interaksi ligan yang akan ditambatkan. Struktur ini kemudian dipisahkan dari residu non standar tersebut dengan cara menghilangkannya dengan menggunakan perangkat lunak Discovery Studio, sehingga dihasilkan struktur molekul yang siap melalui tahap selanjutnya. Struktur hasil pemisahan ini disimpan dengan format .pdb.


29

Makromolekul

tersebut

kemudian

dioptimasi

dengan

Autodocktools. Pengoptimasian ini dilakukan agar makromolekul tersebut dapat menyeseuaikan dengan lingkungan komputasi sehingga

dapat

di-docking. Pengoptimasian yang dilakukan yaitu penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter. Penambahan

atom

hidrogen

(protonasi)

bertujuan

untuk

menyesuaikan suasana docking agar mendekati suasana pada pH sitoplasma sel (pH~7) (Drie, 2005), karena PPAR-γ termasuk reseptor inti (nuclear receptor) (Habor, 2010). Sedangkan pengaturan grid box untuk menentukan ruang tambat ligan yang akan di-docking. Ruang tambat ligan ditentukan dengan merujuk kepada ligan yang sudah tertambat dengan makromolekul protein pada saat diunduh, yaitu dalam hal ini rosiglitazon. Pengaturan pada grid box meliputi center_x, center_y, center_z, untuk mengatur letak parameter box pada makromolekul protein, kemudian size_x, size_y, size_z, dan spacing (angstrom) untuk menentukan besar kecilnya grid box untuk ruang penambatan ligan tersebut. Hasil pengaturan yang diperoleh yaitu center_x = 52.734, center_y = -3.774, center_z = 34.258, size_x = 28, size_y = 28, size_z = 28, dan spacing (angstrom) = 1 (Lampiran 2). Setelah semua proses pengoptimasian makromolekul selesai, maka file ini disimpan dalam format .pdbqt. Format ini berarti bahwa file pdb tersebut sudah diberikan muatan gasteiger untuk menyesuaikan dengan lingkungan docking sehingga dapat dilakukan perhitungan dengan benar (Huey, Morris, & Forli, 2012).

4.2

Penyiapan Ligan Ligan yang akan digunakan diunduh dari Pubchem dengan situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf dan dipilih struktur 3D. Ligan – ligan yang digunakan pada penelitian ini adalah senyawa – senyawa flavonoid dari buah mengkudu yaitu quersetin, rutin, kaempferol, nikotiflorin, narkisin flavonol, serta rosiglitazon sebagai kontrol positifnya (Tabel 4.1). Kemudian format ligan - ligan tersebut dirubah menjadi .pdb


30

dengan menggunakan Open Babel agar dapat dibaca dengan Autodock untuk selanjutnya dilakukan pengoptimasian. Tabel 4.1 Daftar ligan yang ditambatkan (Pubchem) Ligan

Compound ID

IUPAC Name

Rosiglitazone

CID 77999

5-[[4-[2-[methyl(pyridin-2-yl)amino] ethoxy]phenyl]methyl]-1,3-thiazolidine2,4-dione

Quercetin

CID 5280343

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy chromen-4-one

Rutin

CID 5280805

Kaempferol

CID 5280863

Nicotiflorin

CID 5318767

Narcissin

CID 5481663

2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxy-3[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6[[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2yl]oxychromen-4-one 3,5,7-trihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl) chromen-4-one 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-3[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6[[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-trihydroxy-6methyloxan-2-yl]oxymethyl]oxan-2yl]oxychromen-4-one 5,7-dihydroxy-2-(4-hydroxy-3methoxyphenyl)-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)3,4,5-trihydroxy-6-[[(2R,3R,4R,5R,6S)3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2yl]oxymethyl]oxan-2-yl]oxychromen-4one

flavonol

Dalam pengoptimasian ligan, dilakukan penambahan muatan gasteiger dan pengaturan number of active torsion dengan menggunakan Autodocktools. Muatan gasteiger ini secara otomatis akan ditambahkan pada ligan ketika dibuka dengan Autodocktools. Sama halnya dengan protonasi pada makromolekul protein, penambahan muatan gasteiger adalah penambahan atom hidrogen pada ligan. Kemudian torsi aktifnya diatur. Hal ini untuk menentukan ikatan - ikatan aktif yang dapat diputar selama proses docking berlangsung, sehingga dapat mengurangi kinerja dan juga waktu


31

yang diperlukan (Huey, Morris, & Forli, 2012). Torsi aktif tersebut hanya ada pada molekul yang memiliki ikatan sigma saja. Semakin banyak ikatan sigma pada molekul, maka semakin banyak torsi aktifnya sehingga perlu dibatasi. Pada penelitian ini number of

active torsion yang dipilih adalah 6,

berdasarkan pada standar yang biasa digunakan dalam pengaturan torsi aktif. Ligan hasil pengoptimasian ini disimpan dalam format .pdbqt.

4.3

Penambatan Molekul dengan Autodock Vina Setelah langkah penyiapan protein dan ligan yang akan di-docking selesai, maka bisa dilanjutkan ke langkah selanjutnya, yaitu penambatan molekul dengan Autodock Vina. Yang pertama kali dilakukan pada tahap ini adalah menyalin file protein dan ligan berformat .pdbqt ke dalam folder vina. Kemudian file konfigurasi vina diketik pada notepad (Lampiran 2). Pada ‘receptor’ menunjukkan protein reseptor yang digunakan pada proses docking. Begitupun dengan ‘ligand.’ Perlu diperhatikan bahwa nama reseptor dan ligan pada notepad tersebut harus sama dengan nama file pada folder vina. ‘out’ merupakan hasil dari proses docking tersebut dibuat dengan nama ‘out.pdbqt.’ sedangkan center_x, center_y, center_z, size_x, size_y, dan size_z adalah grid box parameter yang sudah diatur sebelumnya. File konfigurasi ini disimpan dengan nama ‘conf.txt.’ Setelah pengaturan file konfigurasi notepad selesai, maka proses docking dengan vina bisa dijalankan. Vina dijalankan melalui perintah Command prompt. Dalam Command prompt, masuk ke dalam berkas vina, kemudian dijalankan perintah sebagai berikut.

Vina - -config conf.txt - -log log.txt

Proses docking dengan vina berlangsung selama 5 – 20 menit pada sekali running. Waktu yang digunakan selama proses docking ini dipengaruhi oleh spesifikasi komputer yang digunakan dan juga ligan yang ditambatkan.


32

Semakin tinggi spesifikasinya, maka semakin cepat prosesnya berlangsung. Tetapi hal ini tidak terlalu mempengaruhi keakuratan hasil yang diperoleh. Proses penambatan molekul dengan Autodock Vina dapat meningkatkan akurasi dari prediksi mode ikatan bila dibandingkan dengan Autodock 4. Ditambah lagi, vina dapat mengambil keuntungan dari multiple CPU atau CPU core dalam sistem komputer untuk memperpendek waktu running secara signifikan (Trott & Olson, 2010). Untuk input dan output-nya, vina menggunakan format file struktur molekul yang sama dengan Autodock yaitu pdbqt. File pdbqt tersebut dapat diperoleh dan dilihat menggunakan MGLTools (Autodocktools). File lain seperti parameter Autodock dan Autogrid (GPF,DPF) dan file grid map tidak dibutuhkan dalam vina, karena vina menghitung grid map-nya sendiri dengan cepat dan otomatis (Trott & Olson, 2010). Setelah proses docking selesai, maka akan muncul 2 file baru dalam folder vina, yaitu ‘log.txt’ dan ‘out.pdbqt’. ‘log.txt’ berisikan nilai afinitas ikatan dan root mean square deviation (RMSD) dari hasil docking. Sedangkan ‘out.pdbqt’ merupakan konformasi dari ligan-ligan yang didocking-kan. Hasil ini dibuka dengan Autodocktools dan Pymol untuk melihat posisi dan orientasi dari ligan pada protein dan juga asam amino – asam amino yang terikat pada ligan.

4.4

Analisa dan Visualisasi Hasil Analisa hasil penambatan molekul pada penelitian ini meliputi nilai ΔGbind dan Root Mean Square Deviation (RMSD), serta interaksi ligan dengan residu protein. Konformasi masing-masing ligan hasil docking diperingkatkan berdasarkan nilai ΔGbind dari yang terkecil sampai yang terbesar. Nilai ΔGbind yang kecil menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai ΔGbind yang besar menunjukkan kurang stabilnya kompleks yang terbentuk. Dari 6 ligan yang ditambatkan pada makromolekul protein, masingmasingnya akan menghasilkan 9 konformasi ligan yang diperingkatkan


33

berdasarkan nilai ΔGbind terbaik (terendah) (Lampiran 3). Dari ke – 9 konformasi tersebut, maka dipilihlah peringkat teratas yang memiliki nilai ΔGbind dan RMSD terendah. Maka didapatlah hasilnya dari masing-masing ligan seperti pada Tabel 4.2. Dari data hasil docking diperoleh nilai ikatan energi flavonoid dengan rentang -8,1 kkal/mol sampai -8,5 kkal/mol. Rutin menghasilkan nilai terbaik dari flavonoid lainnya. Namun bila dibandingkan dengan rosiglitazon, nilai ikatan energi flavonoid masih lebih kecil, tetapi mendekati rosiglitazon. Ini menunjukkan bahwa senyawa flavonoid memiliki potensi sebagai antidiabetik. RMSD merupakan nilai yang digunakan untuk menentukan apakah prediksi modus ikatan tersebut berhasil dan penting untuk validasi program docking. Nilai RMSD dikatakan baik jika < 2 Å. Dengan penyimpangan yang semakin besar, semakin besar kesalahan pada prediksi interaksi ligan dengan protein (Brooijmans, 2009). RMSD merupakan nilai penyimpangan antara satu konformasi ligan dengan pembandingnya. Nilai RMSD yang diperoleh dari penambatan masing-masing ligan pada konformasi terbaik adalah 0. Hal ini dikarenakan vina membandingkan nilai masing-masing konformasi dengan nilai konformasi terbaiknya. Sehingga konformasi pertama pada masing-masing ligan membandingkan nilai konformasi dengan dirinya sendiri sebagai konformasi terbaik. Selain melihat nilai ΔGbind , dilihat juga interaksi yang terjadi antara ligan dengan residu – residu makromolekul protein. Identifikasi interaksi ini menggunakan program Autodocktools untuk melihat interaksi ligan dengan residu protein dan Pymol untuk melihat kecocokan bentuk dan volume antara ligan dan makromolekul protein. Visualisasi interaksi ligan dengan residu dapat dilihat pada Gambar 4.1. Pada Gambar 4.1 bagian kiri mengilustrasikan interaksi yang terjadi antara ligan dengan asam amino – asam amino pada makromolekul protein. Gambar tersebut menunjukkan bahwa rosiglitazon memiliki interaksi dengan 9 residu protein yaitu LEU330, TYR327, ILE326, HIS449, ALA292, ARG288, SER289, CYS285, dan GLN286. Sementara flavonoid berinteraksi


34

dengan lebih banyak residu protein kecuali quersetin dan kaempferol yang jumlah interaksi residunya lebih sedikit dari rosiglitazon. Interaksi senyawa – senyawa flavonoid dengan residu dapat dilihat pada Tabel 4.2. Tabel 4.2 Nilai ΔGbind dan Interaksi ligan dengan residu protein (autodocktools)

Ligan

ΔGbind (kkal/mol)

Jenis Residu Ionik

Polar

Aromatik

Gln286, Ser289

Tyr327

Rosiglitazon

-8,9

Arg288, His449,

Rutin

-8,5

Arg288, Glu291, Glu343,

Ser289, Ser342

Phe363

Nikotiflorin

-8,4

Arg288, Glu295, Glu343

Ser342

Phe226

-8,3

Arg280, Arg288

Ser289, Ser342

Tyr327, Phe363

Quersetin

-8,1

Arg288

-

-

Kaempferol

-8,1

Arg288

-

-

Narkisin flavonol

Hidrofobik Cys285, Ala292, Ile326, Leu330 Cys285, Leu330, Leu333, Cys285, Ala292, Ile326 Leu330, Leu333 Cys285, Ile326, Leu330, Leu333, Val339, Ile341, Met345, Met364 Ile326, Leu333, Ile341 Cys285, Ala292, Ile326, Met329, Leu330, Leu333


35

(a)

(b)

Keterangan : visualisasi interaksi ligan dengan residu (kiri) dan kesesuaian bentuk/Complementarity shape ligan dengan situs tambat (kanan) (a) Rosiglitazon (b) Rutin


36

(c)

(d)

Keterangan : visualisasi interaksi ligan dengan residu (kiri) dan kesesuaian bentuk/Complementarity shape ligan dengan situs tambat (kanan). (c) Nicotiflorin (d) Narcissin Flavonol


37

(e)

(f) Keterangan : visualisasi interaksi ligan dengan residu (kiri) dan kesesuaian bentuk/shape Complementarity ligan dengan situs tambat (kanan) (e) Quercetin (f) Kaempferol

Gambar 4.1 Visualisasi interaksi ligan dengan residu (Sumber : Olahan penulis dengan Autodocktools (kiri) dan Pymol(kanan))


38

Pada Tabel 4.2 menunjukkan residu – residu protein yang berinteraksi dengan ligan. Pada tabel tersebut, residu protein dikelompokkan ke dalam 5 jenis berdasarkan struktur asam aminonya, yaitu ionik, polar, aromatik, dan hidrofobik.

Residu ionik memberikan kontribusi terbesar

dalam penentuan nilai ΔGbind, kemudian residu polar, aromatik, hidrofobik, secara berurutan (Schneider, Baringhaus, & Kubinyi, 2008). Interaksi ionik merupakan interaksi intermolekular yang memiliki ikatan yang lebih kuat dari ikatan hidrogen (polar). Dan ikatan hidrogen lebih kuat dari interaksi van der waals (aromatik dan hidrofobik) (Patrick, 2001). Dari interaksi terhadap residu tersebut dapat dihubungkan dengan nilai ΔGbind yang diperoleh. Pada rutin dan nikotiflorin yang berinteraksi dengan 3 residu ionik memiliki nilai ΔGbind terbaik dari flavonoid yang lainnya, yaitu -8,5 dan -8,4 kkal/mol. Sementara 3 flavonoid lainnya, narkisin flavonol yang berinteraksi dengan 2 residu ionik, serta quersetin dan kaempferol yang berinteraksi dengan 1 residu ionik. Begitupun dengan jenis residu lainnya, mempengaruhi nilai ΔGbind yang dihasilkan. Pada Gambar 4.1 bagian kanan memvisualisasikan kecocokan bentuk dan volume antara ligan dengan situs tambatnya pada makromolekul reseptor. Dalam hal ini, permukaan molekul reseptor digambarkan dengan permukaan pelarut dan permukaan molekul ligan dideskripsi sebagai pencocokan permukaannya. Kesesuaian antara dua permukaan sama dengan deskripsi pencocokan bentuk dan volume yang dapat membantu menemukan pose komplementer docking target dan molekul ligan (Mukesh & Rakesh, 2011). Setiap warna pada gambar, baik itu pada ligan maupun residu protein, mewakili atom - atom tertentu. Warna – warna tersebut dapat diatur sesuai keinginan penggunanya. Pada gambar 4.1 yang diolah dengan Autodocktools dan Pymol, penulis mengaturnya seperti pada Tabel 4.3.


39

Tabel 4.3 Makna warna pada gambar Autodocktools dan Pymol Nama Atom

Warna Autodocktools

Pymol

Abu - abu (alifatik)

Karbon

Hijau

Hijau (aromatik)

Hidrogen

Putih

Putih

Nitrogen

Biru

Biru

Oksigen

Merah

Merah

Sulfur

Kuning

Oranye

Dari Gambar 4.1 bagian kanan dapat diperhatikan warna – warna pada ligan dan makromolekul protein yang menunjukkan bahwa mereka cenderung untuk berada / berhadapan dengan warna yang sama. Warna merah pada ligan berhadapan / berada di daerah warna merah pada makromolekul protein, warna hijau berada pada daerah hijau, biru pada biru, dan seterusnya. Sedangkan ukuran diameter lingkaran masing - masing atom pada ligan merupakan

radius

van

der

waals-nya.

Interaksi

van

der

waals

menggambarkan tolakan atau tarik antara atom yang tidak secara langsung terikat. Interaksi van der waals dapat diartikan sebagai bagian non-polar dari interaksi yang tidak berhubungan dengan energi elektrostatik yang disebabkan muatan atom (Jensen, 2007). Masing – masing atom memiliki radius berbeda beda yang dapat dilihat pada Tabel 4.4. Tabel 4.4 Radius Van der waals (Batsanov, 2001) Atom

Radius (Å)

Karbon

1,7

Hidrogen

1,2

Nitrogen

1,5

Oksigen

1,4

Sulfur

1,85


40

Dari gambar ini dapat dilihat bagaimana ligan berinteraksi dengan situs ikatnya, dan kemudian dapat diteliti apakah ada ruang kosong yang belum terisi oleh ligan. Ketika sudah dapat diidentifikasi ruang kosong tersebut, memungkinkan untuk merancang analog ligan dengan penambahan subtituen atau gugus fungsi yang memungkinkannya untuk mengisi ruang kosong tersebut, sehingga ligan menyocokkan dirinya dengan situs ikat dengan lebih sesuai. Selain itu, dengan mengidentifikasi residu - residu asam amino yang terdapat pada ruang kosong tersebut, dapat ditentukan subtituen apa yang dapat ditambahkan pada ligan agar dihasilkan interaksi yang lebih baik. Contohnya, jika ruang kosong tersebut terdapat asam amino hidrofobik, maka dapat ditambahkan subtituen alkil pada ligan (Patrick, 2001). Perancangan molekul obat bertujuan untuk menemukan ligan yang dapat berinteraksi secara efektif terhadap reseptor target. Tetapi belum berarti bahwa senyawa tersebut akan aktif jika diberikan secara oral. Dalam perjalanannya menuju target, obat akan mengalami beberapa peristiwa yang disebut farmakokinetik, yang meliputi absorbsi, distribusi, metabolisme, dan ekskresi (ADME). Perlu dipertimbangkan farmakokinetiknya dalam perancangan obat baru. Karena pada dasarnya interaksi obat dengan reseptor tidak akan terjadi jika obat tidak mencapai targetnya. Maka dari itu, untuk merancang obat yang aktif secara oral harus memenuhi ‘Lipinski’s Rule of Five’ yaitu : 

Berat molekul kurang dari 500,



Memiliki tidak lebih dari 5 gugus hidrogen donor,



Memiliki tidak lebih dari 10 gugus hidrogen akseptor,



Nilai logP tidak lebih dari 5 (Patrick, 2001). Berdasarkan aturan tersebut, maka lima senyawa flavonoid dan

rosiglitazon yang telah didocking diteliti menggunakan perangkat lunak Marvinsketch untuk

mengetahui

apakah senyawa-senyawa

tersebut

memenuhi Rule of Five, sehingga didapatkan hasil seperti pada Tabel 4.5. Pada tabel tersebut menunjukkan bahwa dari lima senyawa flavonoid, hanya quersetin dan kaempferol saja yang memenuhi empat kriteria Rule of Five,


41

sedangkan tiga yang lainnya tidak. Ini berarti bahwa hanya kuersetin dan kaemperol yang mungkin aktif secara klinis bila diberikan secara oral. Tabel 4.5 Lipinski’s Rule of Five dari ligan yang didocking Ligan

Berat molekul

Log P

H-Donor

H-Akseptor

Rosiglitazon

357.427

2,15

1

5

Rutin

610.5175

-0,87

10

16

Nikotiflorin

594.5181

-0,57

9

15

Narkissin Flavonol Quersetin

624.5441

-0,72

9

16

302.2357

2,16

5

7

Kaempferol

286.2363

2,46

4

6

Docking digunakan untuk memprediksi ikatan ligan terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitasnya. Data yang diperoleh dari docking berupa nilai afinitas kompleks reseptor dengan ligan. Nilai afinitas ini belum tentu merepresentasikan aktivitas yang akan terjadi. Sehingga perlu dilakukan validasi lebih lanjut secara eksperimental, baik itu dengan uji in vitro dan in vivo. Meskipun demikian, docking memiliki peran penting sebagai langkah awal dalam pengembangan dan perancangan obat baru, terutama dalam skrining dan pemodelan senyawa bioaktif. Sehingga mengurangi waktu dan biaya dalam penelitiannya. Hal ini juga mendorong peningkatan teknologi untuk mengidentifikasi kecocokan antara senyawa dan target yang memiliki dampak farmakologis. Dengan meningkatnya sumber daya komputasi dan perkembangan ilmu pengetahuan tentang afinitas dan efikasi obat, peran docking akan semakin meningkat dalam pengembangan dan penemuan obat baru secara rasional (Brooijmans, 2009).


42

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN

5.1

Kesimpulan Hasil penambatan senyawa – senyawa flavonoid dari buah mengkudu (Morinda citrifolia L) yaitu quersetin, kaempferol, rutin, nikotiflorin, dan narkisin flavonol, pada Peroxisome Proliferator-Activated Receptor - Gamma (PPAR-γ) dengan konformasi terbaiknya menunjukkan nilai ΔGbind diantara rentang -8,1 kkal/mol sampai -8,5 kkal/mol, dengan senyawa rutin yang memiliki nilai terbaik. Sedangkan rosiglitazon sebagai kontrol positif menunjukkan nilai ΔGbind = -8,9 kkal/mol. Meskipun nilai ΔGbind yang diperoleh senyawa – senyawa flavonoid tersebut lebih kecil, tetapi mendekati nilai rosiglitazon. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa flavonoid tersebut cukup potensial untuk dijadikan sebagai antidiabetik.

5.2

Saran 1.

Hasil ini merupakan ramalan aktivitas biologis karena didapat dari simulasi pemodelan terkomputerisasi. Sehingga perlu dilakukan uji in vitro dan in vivo untuk mengetahui aktivitas senyawa – senyawa tersebut.

2.

Dapat dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan perangkat lunak lain seperti DOCK, GOLD, FRED, PLANT, LigandScout, MOE, Hyperchem, dan lain – lain untuk mengetahui perbandingan hasil antara perangkat lunak tersebut.

3.

Dapat dilakukan penelitian dengan menggunakan ligan lain yang ditambatkan pada PPAR-γ ataupun senyawa flavonoid yang ditambatkan dengan reseptor lain yang berperan dalam pengobatan diabetes untuk mengetahui perbandingan hasilnya sehingga didapat pengobatan yang terbaik.


43

DAFTAR PUSTAKA

Accelrys Enterprise Platform. (2005). Introduction to the Discovery Studio Visualizer. San Diego, California, U.S.A: Accelrys Software Inc. Batsanov, S. S. (2001). Van der Waals Radii of Elements. INORGANIC MATERIALS. Baxevanis, A. D., & Ouellette, B. F. (2001). BIOINFORMATICS: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins (Second ed.). USA & Canada: Wiley-Interscience. Berman, H. M., Westbrook, J., Feng, Z., Gilliland, G., Bhat, T. N., Weissig, H., . . . Bourne, P. E. (2000). The Protein Data Bank. Oxford University Press. Cole, J. C., Nissink, J. W., & Taylor, O. (2005). Protein–Ligand Docking and Virtual Screening with GOLD. In J. Alvarez, & B. Shoichet, Virtual Screening in Drug Discovery (p. 398). Boca Raton: CRC Press. Coman, C., & Socaciu, C. (2012). Docking of Phytochemicals to the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-Gamma. Bulletin UASVM Agriculture. Corwin, J. (2009). Buku Saku Patofisiologi (3 ed.). (E. K. Yudha, Ed., & N. B. Subekti, Trans.) Jakarta: EGC. DeLano, W. L., & Bromberg, S. (2004). PyMOL User's Guide. San Carlos, California, U.S.A: DeLano Scientific LLC. DiPiro, J. T., Talbert, R. L., Yee, G. C., Matzke, G. R., Wells, B. G., & Posey, L. M. (2008). Pharmacotherapy A Pathophysiologic Approach (7 ed.). New York: The McGraw-Hill Companies, Inc. DiStefano, J. K., & Watanabe, R. M. (2010). Pharmacogenetics of Anti-Diabetes Drugs. Pharmaceuticals. Drie, J. H. (2005). Pharmacophore-Based Virtual Screening: A Practical Perspective. In J. Alvarez, & B. Shoichet, Virtual Screening in Drug Discovery (p. 169). Boca Raton: CRC Press. Funkhouser, T. (2007). Protein-Ligand Docking Methods. Princeton, New Jersey, U.S.A: Princeton University. Habor,

A. (2010). PEROXISOME RECEPTORS. FARMACIA.

PROLIFERATOR

ACTIVATED

Hames, D., & Hooper, N. (2005). Biochemistry (3 ed.). Leeds, UK: Taylor & Francis Group.


44

Hodgman, T. C., French, A., & Westhead, D. R. (2010). Instant Notes in Bioinformatics (Second ed.). UK: Taylor & Francis. Jensen, F. (2007). Introduction to Computational Chemistry (Second ed.). West Sussex , England: John Wiley & Sons Ltd. Kustarini, I., Dewi, S. S., & Pawitra, I. (2012). Efek Ekstrak Etanol Morinda Citrifolia L (Mengkudu). MEDIA MEDIKA Indonesia. Lee, S.-Y., Park, S.-L., Hwang, J.-T., Yi, S.-H., Young-DoNam, & Lim, S.-I. (2012). Antidiabetic Effect of Morinda citrifolia (Noni) Fermented by. Hindawi Publishing Corporation Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. Mian-Ying, W., West, B. J., Jensen, C. J., Nowicki, D., Chen, S., Palu, A., & Anderson, G. (2002). Morinda citrifolia (Noni): A literature review and recent advances in Noni research. Act a Pharmacolog ica Si nica. Morris, G. M., Goodsell, D. S., Pique, M. E., Lindstrom, W. “., Huey, R., Forli, S., . . . Olson, A. J. (2009). AutoDock Version 4.2: Automated Docking of Flexible Ligands to Flexible Receptors. La Jolla, California, U.S.A: The Scripps Research Institute. Mukesh, B., & Rakesh, K. (2011). Molecular Docking : A Review. IJRAP. Mukesh, B., & Rakesh, K. (2011). MOLECULAR DOCKING: A REVIEW. IJRAP. Novo Nordisk. (2013). Where Economics and Health Meet: Changing Diabetes in Indonesia. In N. Nordisk, The Blueprint for Change Programme (p. 3). Indonesia: Novo Nordisk. O’Boyle, N. M., Banck, M., James, C. A., Morley, C., Vandermeersch, T., & Hutchison, G. R. (2011). Open Babel: An open chemical toolbox. Journal of Cheminformatics. Patrick, G. (2001). Instant Notes in Medicinal Chemistry. Oxford: BIOS Scientific Publisher. Pawlus, A. D., & Kinghorn, A. D. (2007). Review of the ethnobotany, chemistry, biological activity and safety of the botanical dietary supplement Morinda citrifolia (noni). Journal of Pharmacy and Pharmacology. Putra, A. M. (2010). Virtual screening of Cytochrome P450 ligands: Challenges and considerations. Netherlands: Department of Chemistry & Pharmaceutical Sciences, Faculty of Sciences - Vrije Universiteit. RCSB. (2014, March 10). About the PDB Archive and the RCSB PDB. Retrieved from Protein Data Bank: http://www.rcsb.org/pdb/static.do?p=general_information/about_pdb/inde x.html


45

Sandeep, G., Nagasree, K. P., Hanisha, M., Murali, M., & Kumar, K. (2011). AUDocker LE: A GUI for virtual screening with AUTODOCK Vina. BMC Research Notes. Schneider, G., Baringhaus, K.-H., & Kubinyi, H. (2008). Molecular Design: Concepts and Applications. USA: Wiley-VCH. Shen, W., & Lu, Y.-H. (2013). Molecular docking of citrus flavonoids with some targets related to diabetes. A Journal of the Bangladesh Pharmacological Society (BDPS). Singh, D. R. (2012). Morinda citrifolia L. (Noni): A review of the scientific validation for its nutritional and therapeutic properties. Journal of Diabetes and Endocrinology Vol. 3. Suherman, S. K. (2009). Insulin dan Antidiabetik Oral. In Farmakologi dan Terapi (5th ed., p. 485). Jakarta: Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Trott, O., & Olson, A. J. (2010). Autodock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization and multithreading. National Institute of Health. WHO.

(2013, Oktober). Diabetes. Retrieved http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs312/en/

from

WHO:

Xie, X.-Q. (2010). Exploiting PubChem for Virtual Screening. NIH Public Access.


46

LAMPIRAN


47

Lampiran 1. Struktur 3D Makromolekul Protein PPAR-γ

Struktur 3D PPAR-γ dengan PDB ID 2PRG

(Sumber : www.rcsb.org)


48

Lampiran 2. Prosedur Kerja Molecular Docking dengan Autodock Vina a.

Penyiapan Protein 1.

Pengunduhan makromolekul PPAR-γ dari Bank Data Protein dengan situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul tersebut yaitu 2PRG. Data makromolekul diunduh dalam format .pdb.

2.

Pemisahan makromolekul protein dari pelarut dan ligan atau residu non standar dengan discovery studio. Disimpan dalam format .pdb


49

Pilih ‘Scripts  Selection  Select water molecule’ kemudian delete.

Pilih ‘Scripts  Selection  Select ligands’ kemudian delete.


50

Save as ‘2PRG.pdb’

3.

Pengoptimasian dengan Autodock Tools. Optimasi tersebut meliputi : a)

Penambahan atom hidrogen

Pilih ‘ Read Molecule’, pilih makromolekul yang akan digunakan.


51

Pilih ‘Edit  Hydrogens  add’

Diatur sesuai konfigurasi diatas, kemudian klik ‘Ok’


52

b) Pengaturan grid box parameter.

Pilih ‘Grid  Macromolecule  Choose  2PRG  Select Molecule’

Save as ‘2PRG.pdbqt’


53

Diatur parameter grid box sesuai pada gambar, kemudian pilih ‘File  close savng current’.

b.

Penyiapan ligan 1.

Pengunduhan struktur ligan dari situs http://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov dengan format .sdf. dipilih struktur 3D.


54

2.

Format ligan-ligan tersebut dirubah menjadi .pdb dengan menggunakan Open Babel.

Pada ‘input format’ pilih ‘…’ kemudian dipilih ligan yang akan digunakan Pada ‘output format’, pilih ‘…’ kemudian pilih destinasi tempat menyimpan. Pastikan format dalam bentuk .pdb. Klik ‘Convert’

3.

Struktur ligan yang telah dibuat dioptimasi dengan Autodock Tools. Optimasi tersebut berupa pengaturan number of active torsion.

Pilih ‘Ligand  Input  Open  pilih ligan yang dipakai  Open’


55

Akan muncul peringatan seperti pada gambar, klik ‘Ok’

Pilih ‘Ligand  Torsion Tree  Set Number of Torsion  masukan angka 6  Dismiss’


56

4.

Hasil ini disimpan dalam format .pdbqt.

Pilih ‘Ligand  Output  Save as PDBQT  Save’

c.

Penambatan Molekul dengan Autodock Vina 1.

Ligan dan protein yang telah tersimpan dalam format .pdbqt dicopy ke dalam folder Vina.

File – file yang harus ada di folder vina : 2PRG.pdbqt; conf.txt; ligand.pdbqt; vina.exe; vina_licence.rtf; vina_split.exe


57

2.

Kemudian config file vina diketik pada notepad, disimpan dengan nama conf.

Config file disesuaikan dengan pengaturan grid box sebelumnya.

3.

Vina dijalankan melalui Command prompt.

Ketik perintah ‘cd .. (Enter)  cd .. (Enter)  cd vina (Enter)  vina –config conf.txt –log log.txt’ tekan ‘Enter’


58

d.

Analisis dan visualisasi 1.

Hasil kalkulasi docking dilihat pada output dalam format notepad.

File yang berada dalam folder vina setelah proses docking, muncul 2 folder baru : log.txt dan out.pdbqt

File ‘log.txt’ bila dibuka dengan wordpad


59

2.

Kemudian dilihat posisi dan orientasi ligan tesebut pada makromolekul, serta asam – asam amino yang terikat pada ligan dengan perangkat lunak autodocktools dan Pymol. a)

Melihat interaksi ligan menggunakan autodocktools

Pilih ‘Analyze  Docking  Open Autodock vina result’, kemudian pilih ‘out.pdbqt’ dalam folder vina, klik ‘open  single molecule with multiple conformation Ok’

Pilih ‘Analyze  Macromolecule  Open’, kemudian pilih ‘2PRG.pdbqt’ dalam folder vina, klik ‘Open’


60

Pilih ‘Analyze  Docking  Show interactions’

Atur tampilan sesuai keinginan, klik ‘save image’


61

b) Melihat kecocokan bentuk dan volume menggunakan Pymol.

File ‘out.pdbqt’ dan ‘2PRG.pdbqt’ dibuka dengan Pymol pilih ‘action (pada ‘all’)  preset  ligand sites  transparent (better)’ atur posisi tampilan sesuai keinginan

Pilih ‘show (pada ‘Out.pdbqt’)  as  spheres’


62

Diatur pewarnaan ligan dan reseptor sesuai keinginan (pengaturan ligan dan reseptor harus sama) Pilih ‘Color  by element  CHNOS…’ komponen lain yang tidak diperlukan bisa disembunyikan, pilih ‘Hide (pada ‘2PRG’)  lines/sticks/ribbon/cartoon’


63

Lampiran 3. Data hasil docking Autodock Vina Rosiglitazon Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Affinity (kcal/mol) -8.9 -8.6 -8.5 -8.4 -8.3 -8.1 -8.0 -7.9 -7.9

Dist from rmsd l.b. 0.000 1.194 3.589 1.389 5.124 5.759 5.628 5.796 5.538

Best mode rmsd u.b. 0.000 1.810 10.158 2.067 9.587 9.643 9.777 9.587 9.248


Dist from rmsd l.b. 0.000 1.737 2.210 1.396 2.070 2.773 2.094 1.800 1.886

Best mode rmsd u.b. 0.000 2.308 8.889 2.105 5.347 8.788 5.655 5.006 9.002


Dist from rmsd l.b. 0.000 2.441 2.013 1.871 3.044 2.191 2.271 1.981 1.925

Best mode rmsd u.b. 0.000 8.771 3.355 5.574 5.877 5.321 5.823 2.829 8.157

Rutin Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Nikotiflorin Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9


64

Narkissin flavonol Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9


Dist from rmsd l.b. 0.000 1.815 3.050 2.423 2.366 2.324 1.609 2.681 3.099

Best mode rmsd u.b. 0.000 3.089 6.486 6.270 3.665 9.374 2.794 9.877 9.319


Dist from rmsd l.b. 0.000 2.828 3.220 4.226 1.771 2.610 1.774 1.937 1.781

Best mode rmsd u.b. 0.000 3.912 4.344 4.686 3.868 3.511 2.588 7.225 3.674


Dist from rmsd l.b. 0.000 1.800 2.923 2.376 2.948 2.351 2.709 2.306 2.938

Best mode rmsd u.b. 0.000 2.636 3.958 4.191 4.583 2.857 3.780 2.528 6.285

Quersetin Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Kaempferol Mode 1 2 3 4 5 6 7 8 9


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Recommend Documents