UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTURAKTIVITAS ANTI-TUBERKULOSIS SENYAWA AMIDASI ETIL P-METOKSISINAMAT DENGAN PENDEKATAN HANSCH DAN PENAMBATAN MOLEKULER PADA ENZIM Inh A

SKRIPSI

WAHIDIN SALEH NIM: 1111102000072

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JUNI 2015

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

STUDI HUBUNGAN KUANTITATIF STRUKTURAKTIVITAS ANTI-TUBERKULOSIS SENYAWA AMIDASI ETIL P-METOKSISINAMAT DENGAN PENDEKATAN HANSCH DAN PENAMBATAN MOLEKULER PADA ENZIM Inh A

SKRIPSI Diajukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S. Far)

WAHIDIN SALEH NIM: 1111102000072

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA JUNI 2015 ii

iii

iv

v

ABSTRAK

Nama

: Wahidin Saleh

Program Studi: Farmasi Judul

: Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis Senyawa Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan Hansch dan Penambatan Molekuler pada Enzim Inh A

Telah dilakukan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa amidasi etil pmetoksisinamat dengan Metode Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) Hansch dan penambatan molekuler pada Enzim Inh A. HKSA di analisa dengan regresi multilinier menggunakan program SPSS. Penambatan molekuler di analisa dengan program autodockvina dan divisualisasi dengan program Pymol dan Ligplot. Hasil persamaan HKSA terbaik adalah Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity). Hasil penambatan molekuler, menunjukkan senyawa ((2E)-N,N-dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-enamide) memiliki nilai ΔGbind terendah (-9,4 kcal/mol) dan hasil dari HKSA memiliki nilai MIC prediksi terkecil (0,008 μM). Hal ini menunjukkan bahwa senyawa tersebut diprediksikan memiliki aktivitas anti-tuberkulosis yang potensial dibandingkan oleh EPMS. Kata kunci: Anti-tuberkulosis, Hansch, penambatan molekul

vi

UIN Syarif HIdayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name

: Wahidin Saleh

Program Study

: Pharmacy

Title

: Quantitative Structure-Activity Relationship study of amidation derivate of Ethyl p-methoxycinnamate on its Antituberculosis using Hansch analysis and molecular docking at Inh A enzyme.

The anti-tuberculosis activity of amidation derivatives ethyl p-methoxycinnamate has been determined by using Quantitative Structure-Activity Relationship (QSAR) Hansch’s method and molecular docking at Inh A enzyme. QSAR was analyzed by multilinier regression using SPSS. Molecular docking was analyzed by autodockvina program and visualized by Pymol dan Ligplot program. The best QSAR equation is Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energy HOMO) 2.812(Energy LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity). Results of molecular docking, indicated that ((2E)-N,Ndibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2-enamide) compound has the lowest ΔGbind value (-9.4 kcal / mol) and the result of QSAR has the smallest MIC predictive value (0,008 μM). It’s suggested that this compound have potential antituberculosis activity compared by EPMC. Key Word: Anti-tuberculosis, Hansch, Molecular docking

vii


KATA PENGANTAR Alhamdulillah, puji dan syukur kehadirat Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, serta shalawat dan salam selalu tercurah kepada junjungan kita, Nabi Muhamad SAW karena dengan segala rahmat dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penulisan skripsi dengan judul “Studi Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Anti-tuberkulosis Senyawa Amidasi Etil p-metoksisinamat dengan Pendekatan Hansch dan Penambatan Molekuler pada Enzim Inh A”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada : 1. Kedua orang tua bapak dan ibu tercinta, Bapak Mamat dan Ibu Tri Larasati yang telah memberikan kasih sayangnya, doa, semangat, dukungan moril maupun materi, tiada yang bisa penulis balas atas semua pemberiannya, hanya ucapan terimakasih ini yang bisa penulis sampaikan. 2. Bapak Supandi, M.Si.,Apt sebagai pembimbing I dan Ibu Ismiarni Komala, M.Sc.,Ph.D.,Apt sebagai pembimbing II yang telah memberikan ilmu, nasihat, waktu, tenaga, dan pikirannya selama penelitian dan penulisan skripsi ini. 3. Bapak Professor Dr. Dede Rosyada, MA selaku rektor UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 4. Bapak Dr. H. Arif Sumantri, SKM.,M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 5. Bapak Yardi.,Ph.D., Apt, selaku Kepala Program Studi Farmasi dan Ibu Nelly Suryani., Ph.D., Apt selaku sekertaris Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

viii


6. Ibu Dr. Hj. Delina Hasan, M. Kes., Apt selaku pembimbing akademik yang telah memberikan arahan selama masa perkuliahan 7. Bapak dan Ibu dosen staf pengajar yang telah memberikan ilmu pengetahuan yang banyak dalam menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 8. Bapak Andrianopsyah Mas Jaya Putra M.Sc dan Kak Fikri yang turut membantu dan menambahkan ilmu tentang penelitian ini. 9. Teman-teman seperjuangan “Docking Team”: Eko, Cacad, Haidar, Mazaya, dan Wahyu yang telah memberikan waktu dan pikiran untuk saling sharing permasalahan dan ilmu tentang penelitian ini. 10. Teman satu kontrakan dan bermain: Ali, Rijal, Mozer, Andis, Rais, Galih, Ari, Akas, dll. 11. Teman belajar selama kuliah: Reza, Echa, Aziz, Fio, Achi, Nicky, Ayu, Henny, Ichob, Wina, Gina, Merri, dll. 12. Teman-teman Farmasi 2011, khususnya untuk kelas C atas kebersamaan dan memori selama menempuh ilmu dikampus ini. 13. Para staf dan karyawan program studi farmasi, staf laboran, ka Eris, ka Tiwi, ka Lisna, Ka liken, Mba Rani, dan Ka Rahmadi yang banyak membantu selama penelitian dan praktikum semester sebelumnya. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa Farmasi, Masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan. Ciputat,

Juni 2015

Penulis

ix


x


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii HALAMAN PERNYATAAN ORISIONALITAS ............................................ iii HALAMAN PERSETUJUAN PEBIMBING .................................................... iv HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .............................................................. v ABSTRAK ............................................................................................................ vi ABSTRACT ......................................................................................................... vii KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.......................... x DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv DAFTAR ISTILAH ........................................................................................... xvi BAB 1 PENDAHULUAN ..................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ..................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah................................................................................ 4 1.3 Tujuan Penelitian ................................................................................. 4 1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................... 4 BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................ 5 2.1 Etil p-Metoksisinamat ........................................................................ 5 2.2 Reaksi Amidasi .................................................................................. 6 2.3 Tuberkulosis ....................................................................................... 8 2.4 Pengobatan Tuberkulosis ................................................................... 9 2.5 Isoniazid ........................................................................................... 10 2.6 Asam Amino, Protein, dan Enzim.................................................... 12 2.7 Enzim Inh A .................................................................................... 17 2.8 Jenis Ikatan ....................................................................................... 18 2.9 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas Biologis (HKSA) pendekatan Hansch ............................................................................ 18 2.9.1 Parameter hidrofobik ...................................................... 20 2.9.2 Parameter elektronik ...................................................... 21 2.9.3 Parameter sterik .............................................................. 22 2.9.4 Analisis statistik HKSA Hansch .................................... 23 2.9.5 Kriteria Statistik ............................................................. 24 2.10 Penambatan molekuler (Molecular Docking) .................................. 25 2.11 Pemograman HKSA dan Penambatan Molekuler ............................ 27 2.11.1 Hyperchem ..................................................................... 27 2.11.2 Protein Data Bank .......................................................... 27 2.11.3 Discovery Studio 4.0 Visualizer .................................... 28 2.11.4 Marvin Sketch ................................................................ 28 2.11.5 Autodock ........................................................................ 28 2.11.6 Autodock Vina ............................................................... 29 2.11.7 Pymol ............................................................................. 30 2.11.8 Ligplot ............................................................................ 30

xi


BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN ............................................................ 31 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian............................................................ 31 3.2 Alat .................................................................................................... 31 3.2.1 Perangkat Keras ............................................................. 31 3.2.2 Perangkat Lunak............................................................. 31 3.3 Bahan ................................................................................................. 32 3.3.1 Struktur molekul tiga dimensi Enzim Inh A Mycobacterium tuberculosis .......................................... 32 3.3.2 Struktur tiga dimensi Ligan senyawa Amidasi Etil pmetoksisinamat............................................................... 32 3.3.3 Data Anti-tuberculosis beberapa Senyawa beserta strukturnya ..................................................................... 32 3.4 Cara Kerja .......................................................................................... 32 3.4.1 HKSA pendekatan Hansch ............................................. 32 3.4.1.1 Pemilihan data sets ........................................... 32 3.4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets .................... 33 3.4.1.3 Membangun persamaan HKSA ........................ 33 3.4.1.4 Perhitungan deskriptor test sets ........................ 33 3.4.1.5 Validasi persamaan HKSA ............................... 34 3.4.1.6 Prediksi aktivitas sample sets ........................... 34 3.4.2 Penambatan Molekul ...................................................... 34 3.4.2.1 Penyiapan dan optimasi enzim Inh A ............... 34 3.4.2.2 Penyiapan dan optimasi ligan (Senyawa uji) .... 35 3.4.2.3 Penambatan molekul dengan autodock vina .... 35 3.4.2.4 Analisa dan visualisasi hasil penambatan molekul ............................................................. 36 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 37 4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch .......... 37 4.1.1 Pemilihan data sets ........................................................ 37 4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets ................................. 40 4.1.3 Membangun dan Validasi persamaan HKSA ................ 42 4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets ......................................... 46 4.2 Penambatan molekul.......................................................................... 51 4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A .... 51 4.2.2 Penyiapan dan optimasi ligan (senyawa uji) .................. 52 4.2.3 Penambatan molekul dengan Autodock vina ................. 56 4.2.4 Analisa dan Visualisasi penambatan molekul ................ 57 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 63 5.1 Kesimpulan ........................................................................................ 63 5.2 Saran .................................................................................................. 63 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 64 LAMPIRAN ................................................................................................... 68

xii


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 2.1 Struktur Etil p-metoksisinamat............................................................ 5 Gambar 2.2 Contoh Penamaan amida ..................................................................... 7 Gambar 2.3 Contoh Struktur amida yang penting .................................................. 7 Gambar 2.4 Reaksi Sintesis Amida......................................................................... 7 Gambar 2.5 Struktur Isoniazid .............................................................................. 11 Gambar 2.6 Mekanisme kerja Isoniazid................................................................ 12 Gambar 2.7 Struktur umum Asam Amino ............................................................ 13 Gambar 2.8 Koefisien Partisi dan Distribusi senyawa terion dan tak terion ........ 21 Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log (1/MIC) eksperimen dan Log (1/MIC) prediksi .............................................................................. 46 Gambar 4.2 Perbandingan Struktur EPMS, EPHS, Amida_9, dan Amida_11 ..... 50 Gambar 4.3 Visualisasi interaksi Makromolekul dan Ligan (Isoniazid dan 3 senyawa uji dengan ∆Gbind terendah ................................................ 60

xiii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel 2.1 Asam Amino ......................................................................................... 13 Tabel 2.2 Pengelompokan Asam Amino .............................................................. 15 Tabel 2.3 Penggolongan Enzim ............................................................................ 16 Tabel 4.1 Data sets yang digunakan ..................................................................... 37 Tabel 4.2 Data Training sets ................................................................................. 39 Tabel 4.3 Data test sets.......................................................................................... 39 Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training sets............................................... 41 Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA ............................................................ 42 Tabel 4.6 Model Persamaan .................................................................................. 43 Tabel 4.7 Data Nilai PRESS ................................................................................. 44 Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set ..................................................... 45 Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set ........................... 45 Tabel 4.10 Data sample sets .................................................................................. 47 Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets ................................................................ 48 Tabel 4.12 Data aktivitas prediksi sample sets menggunakan persamaan HKSA 2 ........................................................................................................... 49 Tabel 4.13 Senyawa ligan yang akan di-docking .................................................. 53 Tabel 4.14 Hasil penambatan molekuler ............................................................... 58 Tabel 4.15 Perbanding ∆Gbind dan MIC prediksi .................................................. 61

xiv


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Alur Penelitian .................................................................................. 68 Lampiran 2. Prosedur Kerja HKSA ...................................................................... 70 Lampiran 3. Prosedur Kerja Penambatan Molekuler ............................................ 77 Lampiran 4. Hasil penambatan molekul dan visualisasinya ................................. 81

xv


DAFTAR ISTILAH Enzim Inh A

Enoyl acyl carrier protein reductase

EPHS

Etil p-hidroksisinamat

EPMS

Etil p-metoksisinamat

HKSA

Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktifitas

HOMO

Highest Occupied Moleculer Orbital

INH

Isoniazid

LUMO

Lowest Unoccupied Molecular Orbital

MIC

Minimum Inhibitor Concentration

NADH

Nicotinamide Adenin Dinucleotide

PDB

Protein Data Bank

PRESS

Predicted Residual Sums of Squares

RMSD

Root Mean Square Deviation

SE

Standard Error

ΔGbind

Energi bebas Gibss

xvi


BAB 1 PENDAHULUAN 1.1

Latar Belakang Tuberkulosis adalah suatu penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri basil tahan asam Mycobacterium tuberculosis serta bertahan dalam tubuh manusia selama bertahun-tahun, ditularkan melalui droplet yang mengandung basil tersebut (airborne disease). Sebagian besar kuman TB menyerang paru, tetapi dapat juga mengenai organ tubuh lainnya (Depkes RI, 2011). Genus Mycobacterium mempunyai karakteristik unik karena dinding selnya kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat. Asam mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium. Dalam jaringan tubuh kuman Mycobacterium tuberculosis dapat mengalami fase dorman (tertidur lama) selama beberapa tahun (Poeloengan et al., 2007; Depkes RI, 2002). Diperkirakan sekitar sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis. Pada tahun 2013, 6,1 juta kasus TB telah dilaporkan pada WHO. Dari jumlah tersebut, 5,7 juta merupakan pasien dengan diagnosa baru dan 0,4 juta lainnya telah menjalani pengobatan. Pada tahun 2009, Indonesia merupakan negara dengan pasien TB terbanyak ke-5 di dunia setelah India, Cina, Afrika Selatan dan Nigeria. Diperkirakan jumlah pasien TB di Indonesia sekitar 5,8% dari total jumlah pasien TB didunia. (Depkes RI, 2011; WHO, 2014).

1

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2

Obat yang umum dipakai pada pengobatan tuberkulosis adalah Isoniazid,

Etambutol,

Rifampisin,

Pirazinamid,

dan

Streptomisin.

Kelompok obat ini disebut sebagai obat primer. Isoniazid adalah obat TB yang paling poten dalam hal membunuh bakteri dibandingkan dengan rifampisin dan streptomisin (Depkes RI, 2005). Isoniazid bekerja dengan menghambat biosintesis asam mikolat yang merupakan unsur penting dinding sel mikobakterium. Beberapa hipotesis

diajukan

berkaitan

dengan

mekanisme

kerja

isoniazid,

diantaranya adalah efek pada lemak, biosintesis asam nukleat dan glikolisis. (Goodman and Gilman, 2005; Katzung, B., 2004). Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein reductase dari Mycobacterium tuberculosis, merupakan salah satu enzim penting yang terlibat dalam jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis. Adanya isoniazid yang berikatan dengan kofaktor Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH) membentuk INH-NAD akan menghambat aktivitas enzimatik Inh A, sehingga akan mengganggu biosintesis asam mikolat yang merupakan unsur utama dari dinding sel mikobakterium (He et al, 2007). Etil p-metoksisinamat (EPMS) yang merupakan salah satu zat kimia dari rimpang kencur (Kaempferia galanga), telah dilaporkan tidak hanya memiliki aktivitas analgesik-anti inflamasi seperti NSAID yang menghambat siklooksigenase, tetapi juga menghambat proliferasi sel tumor dalam spesimen epidermis tikus, selain itu juga memiliki aktivitas biologis

terhadap

penghambatan

pertumbuhan

Mycobacterium

tuberculosis dan Candida albicans (Dash et al., 2014). Hasil dari penelitian Lakhsmanan et al., (2011), Etil p-metoksisinamat diprediksikan memiliki sifat anti-tuberkulosis dengan mekanisme yang mirip dengan isoniazid, yaitu berpengaruh terhadap proses biosintesis asam mikolat.


3

Berdasarkan penelitian tersebut, peneliti tertarik untuk melakukan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa hasil modifikasi struktur dari reaksi amidasi senyawa EPMS sebagai senyawa penuntunnya (lead compound), yang telah diketahui memilki aktivitas anti-tuberkulosis. Salah satu cara untuk memberikan informasi aktivitas biologis suatu senyawa adalah dengan menggunakan metode hubungan kuantitatif struktur-aktivitas (HKSA). HKSA merupakan bagian penting rancangan obat dalam usaha mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar. Selain itu dengan menggunakan model HKSA, akan lebih banyak menghemat biaya atau lebih ekonomis, karena untuk mendapatkan obat baru dengan aktifitas yang dikehendaki, faktor coba-coba ditekan sekecil mungkin sehingga jalur sintesis menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008). Selain dengan pendekatan HKSA antara senyawa turunan amidasi EPMS dengan senyawa turunan asam sinamat yang memiliki aktivitas anti-tuberkulosis, diketahui juga penentuan aktivitas bisa menggunakan metode penambatan molekuler (molecular docking). Senyawa amidasi EPMS akan digunakan sebagai ligan yang akan diprediksi hasil penambatannya dengan suatu makromolekul, yaitu enzim Inh A yang terdapat di M. tuberculosis, kemudian divisualisasi interaksi liganmakromolekul dengan menggunakan program Pymol dan LigPlot. Hasil dari penelitian ini, diharapkan akan mendapatkan senyawa amidasi EPMS yang memiliki prediksi aktivitas yang baik untuk pengobatan antituberkulosis dengan metode HKSA Hansch dan penambatan molekul pada enzim Inh A. Sehingga, senyawa tersebut pada penelitian selanjutnya dapat disintesis dan diuji secara in-vitro dan in-vivo terhadap aktivitas antituberkulosisnya.


4

1.2

Rumusan Masalah Apakah senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat memiliki aktivitas anti-tuberkulosis dengan menggunakan metode hubungan kuantitatif struktur-aktivitas pendekatan Hansch dan melalui penambatan molekuler pada enzim Inh A?

1.3

Tujuan Penelitian a.

Memperoleh hubungan kuantitatif struktur-aktivitas anti-tuberkulosis senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dengan pendekatan Hansch.

b.

Melihat interaksi senyawa amidasi etil p-metoksisinamat dengan enzim Inh A dalam penghambatan pembentukan asam mikolat Mycobacetrium tuberculosis.

1.4

Manfaat Penelitian a. Memberikan informasi acuan senyawa amidasi etil p-metoksisinamat yang akan disintesis dan diujikan secara in-vitro untuk aktivitas antituberkulosis. b. Membantu dalam memberi informasi pada pembuatan obat antituberkulosis baru.


BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1

Etil p-metoksisinamat Senyawa etil p-metoksisinamat termasuk dalam golongan senyawa ester yang mengandung cincin benzena dan gugus metoksi yang bersifat nonpolar dan juga gugus karbonil yang mengikat etil yang bersifat sedikit polar sehingga dalam ekstraksinya dapat menggunakan pelarut-pelarut yang mempunyai variasi kepolaran yaitu etanol, etil asetat, metanol, air dan heksana, termasuk turunan asam sinamat, dimana asam sinamat adalah turunan senyawa phenil propanoad. Senyawa-senyawa yang termasuk turunan sinamat adalah para hidroksi sinamat, 3,4-dihidroksisinamat, dan 3,4,5 trimetoksisinamat (Barus, 2009).

Gambar 2.1 Struktur Etil p-metoksisinamat (Barus, 2009)

Tanaman kencur memang mengandung senyawa tabir surya yaitu etil p-metoksisinamat, yang telah dibuktikan kebenarannya oleh pengalaman nenek moyang kita. Etil p-metoksisinamat (EPMS) adalah salah satu senyawa hasil isolasi rimpang kencur yang merupakan bahan dasar senyawa tabir surya yaitu pelindung kulit dari sengatan sinar matahari. (Barus, 2009). Umar et al, (2014) menyatakan bahwa

Etil p-metoksisinamat memilki potensi anti-

inflamasi

menghambat

dengan

sitokin

proinflamasi

dan

angiogenesis, sehingga menghambat fungsi utama dari sel endotel. Dengan demikian, etil p-metoksisinamat bisa menjadi agen terapi yang menjanjikan untuk pengobatan penyakit inflamasi dan gangguan yang berkaitan dengan angiogenesis. 5


6

Sebagai antimikroba, Etil p-metoksisinamat diisolasi dari ekstrak Kampheria galanga memiliki aktivitas yang cukup terhadap Mycobacterium tuberculosis dan Candida albicans. (Kanjanapothi et al., 2004; Techaprasan et al., 2010). Baru-baru ini, Etil pmetoksisinamat dengan uji microtiter resazurin telah terbukti menghambat isolat klinis pasien multidrug resistant (MDR) dari Mycobacterium tuberculosis dengan konsentrasi hambat minimum (MIC) dari 0,242-0,485 mM. (Lakshmanan et al., 2011). Aktivitas larvasida Etil p-metoksisinamat telah ditunjukkan oleh Kim et al., (2008), sekitar (LC50 = 12,3-20,7 mg/L) terhadap A. aegypti, O. togoi dan C. pipens pallens. Namun, etil-sinamat dan 3-Carene memiliki aktivitas larvasida yang lebih (LC50 = 24,1 dan 21,6 mg/L masing-masing) terhadap C. pipens pallens tapi kurang aktivitas (LC50=40-60 mg/L) terhadap A. aegypti dan O. togio.

2.2

Reaksi Amidasi Proses amidasi adalah suatu reaksi penambahan gugus aktif amin dengan pengantian atom nitrogen pada gugus karbonil dengan struktur R–CO–NR′R″. Amin merupakan senyawa organik dan memiliki gugus fungsional yang mengandung atom Nitrogen. Amin adalah turunan ammonia dengan salah satu atom hidrogen diganti dengan alkil atau aril (David, 2007). Amida adalah suatu senyawa yang mempunyai suatu nitrogen trivalent yang terikat pada gugus karbonil. Suatu amida diberi nama dari nama asam kaboksilat induknya, dengan mengubah imbuhan asam …-oat (atau -at) menjadi –amida. Amida di sintesa dari derivat asam karboksilat dan ammonia atau amina yang sesuai (Fessenden, 1999).


7

a.

b. Gambar 2.2 Contoh Penamaan amida (Fessenden, 1999) a. IUPAC: etanamida

b. IUPAC: butanamida

Trivial: asetamida

Trivial: butiramida

Berikut ini beberapa amida yang penting, gugus amidanya dilingkari:

a.

b.

c.

Gambar 2.3 Contoh Struktur amida yang penting (Fessenden, 1999): a. nikotinimida b. kafeina c. LSD

Amida disintesis dari derivat asam karboksilat dan amonia atau amina yang sesuai (Fessenden, 1999). Contoh reaksi pembuatan amida adalah seperti di bawah ini:

Gambar 2.4 Reaksi Sintesis Amida (Fessenden, 1999) UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

8

2.3

Tuberkulosis Tuberkulosis atau TB adalah penyakit bakteri menular yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, yang paling sering menyerang paru-paru. Hal ini ditularkan dari orang ke orang melalui droplet dari tenggorokan dan paru-paru orang dengan penyakit pernapasan aktif. Pada orang yang sehat, infeksi Mycobacterium tuberculosis sering tidak menimbulkan gejala, karena sistem kekebalan tubuh seseorang bertindak sebagai "wall off" bakteri. Gejala TB aktif paru seperti batuk, kadang-kadang dengan sputum atau darah, nyeri dada, kelemahan, penurunan berat badan, demam dan berkeringat di malam hari. Tuberkulosis bisa diobati dengan program antibiotik enam bulan (WHO, 2015). Tuberkulosis (TB) adalah penyakit infeksius, yang terutama menyerang penyakit parenkim paru (Brunner et al., 2002). Diperkirakan sekitar sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi oleh Mycobacterium tuberkulosis. Pada tahun 1995, diperkirakan ada 9 juta pasien TB baru dan 3 juta kematian akibat TB diseluruh dunia. Diperkirakan 95% kasus TB dan 98% kematian akibat TB didunia, terjadi pada negara-negara berkembang. Demikian juga, kematian wanita akibat TB lebih banyak dari pada kematian karena kehamilan, persalinan dan nifas. Pada tahun 2013, 6,1 juta kasus TB telah dilaporkan pada WHO, dari jumlah tersebut, 5,7 juta merupakan pasien dengan diagnosis baru dan 0,4 juta lainnya telah menjalani pengobatan. Pada tahun 2009, Indonesia merupakan negara dengan pasien TB terbanyak ke-5 di dunia setelah India, Cina, Afrika Selatan dan.Nigeria. Diperkirakan jumlah pasien TB di Indonesia sekitar 5,8% dari total jumlah pasien TB didunia. Diperkirakan, setiap tahun ada 429.730 kasus baru dan kematian 62.246 orang. Insidensi kasus TB BTA positif sekitar 102 per 100.000 penduduk. (Depkes RI 2011; WHO 2014).


9

Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri aerob obligat yang pertumbuhannya di bantu oleh tekanan CO2 5-10 %, tetapi di hambat oleh pH di bawah 6,5 dan asam lemak rantai panjang. Basil tuberkel tumbuh hanya pada suhu 35-37ºC, yang sesuai dengan kemampuannya menginfeksi organ dalam terutama paru. Genus Mycobacterium mempunyai karakteristik unik karena dinding selnya kaya akan lipid, dan lapisan tebal peptidoglikan yang mengandung arabinogalaktan, lipoarabinomanan dan asam mikolat. Asam mikolat tidak biasa dijumpai pada bakteri dan hanya dijumpai pada dinding sel Mycobacterium dan Corynebacterium. Bersifat tahan asam sehingga dikenal juga sebagai Basil Tahan Asam (BTA). Bakteri ini pertama kali ditemukan oleh Robert Koch pada tanggal 24 Maret 1882, sehingga untuk mengenang jasanya bakteri tersebut diberi nama basil Koch (Poeloengan et al., 2007). Mycobacterium tuberculosis ini berbentuk batang, berukuran panjang 1-4 mikron dan tebal 0,3-0,6 mikron, mempunyai sifat khusus yaitu tahan terhadap asam pada pewarnaan. Oleh karena itu disebut pula sebagai Basil Tahan Asam (BTA). Secara khas kuman membentuk granula dalam paru menimbulkan nekrosis atau kerusakan jaringan. Kuman TB cepat mati dengan sinar matahari langsung, tetapi dapat bertahan hidup beberapa jam di tempat gelap dan lembab. Dalam jaringan tubuh dapat mengalami fase dorman selama bertahun-tahun (Suarni, 2009; Depkes RI, 2002).

2.4

Pengobatan Tuberkulosis Pengobatan TB bertujuan untuk menyembuhkan pasien, mencegah kematian, mencegah kekambuhan, memutuskan rantai penularan dan mencegah terjadinya resistensi kuman terhadap Obat Anti Tuberkulosis (OAT) (Depkes RI, 2011). Pengobatan terhadap TB dimulai sejak 1940-an dengan streptomisin. Obat anti tuberkulosis pada saat ini digolongkan menjadi 2 kelompok, yaitu lini pertama dan lini kedua.


10

Kelompok

lini

pertama,

yaitu

isoniazid,

rifampisin,

etambutol, streptomisin, dan pirazinamid. Secara umum kelompok lini pertama ini efektifitasnya tinggi, toksisitas dapat ditolerir. Kelompok lini kedua, adalah antibiotika golongan fluorokuinolon, sikloserin, etionamid, amikasin, kanamisin, kapreomisin, dan para aminosalisilat (Niemann, S. dan Gerdes, S.R., 2003). Pengobatan tuberkulosis dilakukan dengan prinsip-prinsip sebagai berikut: a. Obat anti TB (OAT) harus diberikan dalam bentuk kombinasi beberapa jenis obat, dalam jumlah cukup dan dosis tepat sesuai dengan kategori pengobatan. Jangan gunakan OAT tunggal (monoterapi). Pemakaian OATKombinasi

Dosis

Tetap

(OAT-KDT)

lebih

menguntungkan dan sangat dianjurkan. b. Untuk menjamin kepatuhan pasien menelan obat, dilakukan pengawasan langsung (DOT = Directly Observed Treatment) oleh seorang Pengawas Menelan Obat (PMO). c. Pengobatan TB diberikan dalam 2 tahap, yaitu tahap intensif dan lanjutan.

2.5

Isoniazid Isoniazid (Hydrazide Penisilamin, INH) telah digunakan sebagai anti-tuberkulosis yang paling umum sejak pengakuan tentang aktivitas klinisnya pada tahun 1952 (Robitzek et al., 1952). Terdiri dari cincin piridin dan gugus hydrazide, INH adalah analog nikotinamid, secara struktural terkait dengan obat anti-TB Etionamid dan pirazinamid (Kolyva et al., 2012).


11

Gambar 2.5 Struktur Isoniazid (Kolyva et al., 2012)

Isoniazid adalah turunan hidrazida dan merupakan obat utama dalam pengobatan penyakit tuberkulosis. Sering digunakan dalam bentuk kombinasi. Penggunaan pada pasien dewasa secara umumnya adalah 300 mg per hari melalui oral pada keadaan lambung kosong. Sedangkan pada pasien anak-anak bervariasi, yakni: 5 mg/kg per hari (WHO), 10 mg/kg per hari di Inggris dan 10 mg/kg hingga 15 mg/kg per hari di Amerika Serikat (USA), dengan semuanya mencantumkan batas maksimum 300 mg per hari (Sweetman, 1999). INH merupakan obat anti tuberkulosis yang bersifat pro-drug dimana obat ini akan dirubah menjadi metabolit aktifnya didalam sel supaya menjadi substansi yang toksik untuk sel mikobakterial. INH yang telah aktif ini nantinya akan mempengaruhi sintesis asam mikolat. Asam mikolat ini merupakan salah satu komponen penting untuk pembentuk dinding sel (Nofriyanda, 2010). Setelah masuk ke dalam sel mikobakterium, INH dirubah menjadi bentuk aktifnya oleh enzim katalase–peroksidase (Kat G) dimana enzim ini dikode oleh gen katG. INH yang telah aktif ini akan bereaksi dengan Nicotinamide Adenine Dinucleotide ( NADH ) yang merupakan suatu kofaktor yang terikat pada enzim Inh A. INH aktif dengan NADH ini akan membentuk suatu ikatan kovalen INH– NAD. Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase merupakan suatu enzim yang berperan dalam proses katalisis tahap awal sintesis asam mikolat dimana enzim ini di kode oleh gen InhA.


12

Kepekaan

terhadap

INH

yang

disebabkan

karena

penggabungan INH–NAD akan menghambat aktivitas enzimatik InhA dan akan menghambat sintesis asam mikolat yang merupakan salah satu bahan utama sebagai pembentuk dinding sel (Nofriyanda, 2010).

Gambar 2.6 Mekanisme kerja Isoniazid

2.6

Asam amino, protein, dan enzim Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus karboksil (−COOH) dan satu atau lebih gugus amino (−NH2) yang salah satunya terletak pada atom C tepat disebelah gugus karboksil (atom C alfa). Asam-asam amino bergabung melalui ikatan peptida yaitu ikatan antara gugus karboksil dari asam amino dengan gugus amino dari asam amino yang disampingnya (Sudarmadji, 1989). Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform. Sifat asam amino ini berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan sifat amina. Asam karboksilat alifatik maupun aromatik yang terdiri atas beberapa atom karbon umumnya kurang larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik. Demikian amina pula umumnya tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik (Poejiadi, 1994). UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

13

Gambar 2.7 Struktur umum Asam Amino (Sumardjo, 2008)

Ada dua struktur kimia asam amino, yaitu struktur yang tidak bermuatan dan struktur ion pada pH fisiologis. Gugus karboksil bersifat sebagai sebagai donor proton; gugus amino bersifat sebagai akseptor proton; dan gugus R yang dikenal sebagai rantai samping atau rantai cabang mempunyai sifat yang khas (Sumardjo, 2008). Di alam, terdapat sekitar 300 jenis asam amino. Namun ternyata hanya 20 asam amino yang secara alami merupakan bahan pembangun protein. Asam amino pembangun atu penyusun protein adalah alfa asam amino, yaitu asam amino yang gugus anionnya terikat pada atom karbon alfa (Sumardjo, 2008). Tabel 2.1 Asam Amino (Sumardjo, 2008)


14


15

Rantai samping atau rantai cabang asam-asam amino mempunyai sifat yang khas. Berdasarkan sifat yang khas tersebut, asam-asam amino diklasifikasikan menjadi tiga kelompok: asam amino yang bersifat basa yaitu asam amino dengan rantai samping mengandung gugus anion atau lingkar heterosiklik berupa hetero atom nitrogen; asam amino yang bersifat asam, yaitu asam amino dengan rantai samping mengandung gugus karboksil; dan asam amino netral, yaitu asam amino dengan rantai samping selain yang telah disebutkan (Sumardjo, 2008). Tabel 2.2 Pengelompokan Asam Amino (Sumardjo, 2008)

Protein merupakan makrobiomolekul asam-asam alfa amino dengan susunan yang kompleks dan berat molekulnya sekitar 5000 sampai beberapa juta. Struktur tiga dimensi protein tersebut dapat dijelaskan

dengan

mempelajari

tingkat

organisasinya,

yaitu

menyangkut struktur primer, sekunder, tersier, dan quartener. Struktur primer protein adalah jumlah, jenis, serta urutan asam amino yang membentuk rantai polipeptida. struktur primer menentukan sifat dasar berbagai macam protein. Struktur sekunder adalah struktur yang berikatan kovalen dan berikatan hydrogen dari polipeptida dalam molekul protein dan dapat berbentuk spiral (αheliks) atau lembaran (zig-zag).


16

Struktur tersier terbentuk karena terjadi pelipatan rantai polipetida sehingga membentuk protein globular. Struktur kuartener protein dibentuk oleh dua atau lebih rantai polipeptida saling dihubungkan oleh ikatan elektrostatik dan ikatan hidrogren. Dalam struktur kuartener protein yang kompleks, gaya van der walls di antara atom-atom yang berdekatan kemungkinan ikut berperan (Sumardjo, 2008). Enzim merupakan senyawa protein yang dapat mengkatalisis seluruh reaksi kimia dalam sistem biologis. Semua enzim murni yang telah diamati sampai saat ini adalah protein. Aktivitas katalitiknya bergantung kepada integritas strukturnya sebagai protein. Enzim dapat mempercepat reaksi biologis, dari reaksi yang sederhana, sampai ke reaksi yang sangat rumit. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terjadinya reaksi. Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim substrat yang bersifat sementara dan lalu terurai membentuk enzim bebas dan produknya (Lehninger, 1995). Penggolongan enzim secara internasional telah dilakukan secara sistematis. Sistem ini menempatkan semua enzim ke dalam enam kelas utama, masing-masing dengan sub kelas, berdasarkan atas jenis reaksi yang dikatalisa. Tabel 2.3 Penggolongan Enzim


17

2.7

Enzim Inh A Inh A atau enoyl acyl carrier protein reductase dari Mycobacterium tuberculosis, merupakan salah satu enzim penting yang terlibat dalam jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis. Dependent-NADH enoil-ACP reduktase dikodekan oleh gen Inha Mycobacterium yang telah diketahui sebagai target molekul utama dari frontline obat anti tuberkulosis isoniazid (INH). Penelitian terbaru menunjukkan bahwa Inh A juga sebagai secondline target untuk obat antitubercular etionamid (ETA). Inh A mengkatalisis pengurangan rantai panjang trans-2-enoil-ACP di jalur biosintesis asam lemak tipe II dari M. tuberculosis. Penghambatan Inh A mengganggu biosintesis asam mikolat yang merupakan unsur utama dari dinding sel mikobakteri. Sebagai pro-drug, INH pertamatama harus diaktifkan oleh mikobakteri katalase-peroksidase katG ke dalam bentuk aktif radikal asilnya. Produk adisi yang dihasilkan dari ikatan kovalen INH diaktifkan dengan Inh A kosubstrat NADH, atau produk oksidasi NAD+, berfungsi sebagai Inh A inhibitor yang ampuh. (He et al., 2007). Gen katG berfungsi dalam mengkode enzim catalaseperoxidase (Kat G). Enzim ini berperan dalam merubah INH menjadi metabolit aktifnya supaya INH bisa berikatan dengan NADH membentuk ikatan INH-NAD. Terjadinya mutasi pada gen katG akan menyebabkan hilangnya aktivitas enzim catalaseperoxidase sehingga INH yang masuk ke dalam sel tidak dapat dirubah menjadi bentuk aktifnya. INH yang tidak dalam bentuk aktifnya tidak dapat mengganggu aktivitas enzim enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase. INH yang telah aktif ini akan bereaksi dengan Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NADH) yang merupakan suatu kofaktor yang terikat pada enzim Inh A. INH aktif dengan NADH ini akan membentuk suatu ikatan kovalen INH–NAD.


18

Enzim Inh A atau enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase merupakan suatu enzim yang berperan dalam proses katalisis tahap awal sintesis asam mikolat dimana enzim ini di kode oleh gen inhA. Kepekaan terhadap INH yang disebabkan karena penggabungan INH–NAD akan menghambat aktivitas enzimatik InhA dan akan menghambat sintesis asam mikolat yang merupakan salah satu bahan utama sebagai pembentuk dinding sel. Setelah terjadi perubahan INH menjadi bentuk aktifnya, maka INH ini akan bekerja pada target utamanya yaitu mengganggu Inh A atau enzim enoyl acyl carrier protein (ACP) reductase melalui adanya ikatan kovalen INH-NAD. Dengan adanya ikatan ini maka terjadi hambatan aktivitas enzimatik Inh A sehingga mengganggu sintesis asam mikolat. (Nofriyanda, 2010).

2.8

Jenis Ikatan Ada beberapa bentuk ikatan yang berperan dalam interaksi ligan-makromolekul. Biasanya dalam bentuk interaksi ikatan intermolekular seperti ikatan ion, ikatan hidrogen, ikatan van der waals, dan ikatan dipol–dipol. Beberapa obat juga membentuk ikatan kovalen terhadap targetnya (Patrick, 2001). Selain ikatan tersebut, terdapat ikatan hidrofob yang merupakan salah satu

kekuatan

penting pada proses penggabungan daerah non polar molekul obat dengan daerah non polar reseptor biologis (Siswandono, 2008)

2.9

Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) pendekatan Hansch Pendekatan hubungan struktur dan aktivitas biologis mulai berkembang pesat setelah tahun 1960-an, dengan dipelopori oleh Corwin Hansch dan kawan-kawan, yang menghubungkan struktur kimia dan aktivitas biologis obat melalui sifat-sifat kimia fisika umum seperti kelarutan dalam lemak, derajat ionisasi, atau ukuran molekul (Siswandono, 2008).


19

Analisis Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) merupakan salah satu aplikasi dari kimia komputasi dan juga bagian yang dipelajari dalam bidang kimia medisinal. Dengan metoda analisis HKSA, senyawa yang akan disintesis dapat didesain terlebih dahulu berdasarkan hubungan antara sifat-sifat kimia serta fisik molekul

dengan aktivitas

biologisnya, dengan menggunakan

hubungan tersebut, aktivitas teoritik suatu senyawa baru dapat diprediksi, dan dengan demikian fokus riset dapat dipersempit, biaya dan waktu pun dapat dihemat. Saat ini telah dikenal tiga metoda analisis HKSA yakni metoda HKSA Free-Wilson, metoda Hansch dan metoda HKSA tiga dimensi (Kubinyi, 1993). Hansch

(1963),

mengemukakan

suatu

konsep

bahwa

hubungan struktur kimia dengan aktivitas biologis (log 1/C) suatu turunan senyawa dapat dinyatakan secara kuantitatif melalui parameter-parameter

sifat

kimia-fisika

dari

substituent

yaitu

parameter hidrofobik (π), elektronik (σ) dan sterik (Es). Model pendekatan ini disebut juga dengan model hubungan energi bebas linier (linier free energy relationship = LFER) atau pendeakatan ekstra termodinamika. Pendekatan ini menggunakan dasar persamaan Hammet yang didapat dari kecepatan hidrolisis turunan asam benzoat (Siswandono, 2008). Proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan kimia, kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia. Dalam hubungan struktur dan aktivitas, ketiga parameter tersebut dilibatkan, terutama parameter eketronik dan sterik. Pendekatan hubungan struktur aktivitas melalui parameter sifat kimia fisika oleh Hansch dinyatakan melalui persamaan regresi linier dibawah ini: =

+d


20



C : Kadar untuk respons biologis baku



: Sumbangan sifat-sifat lipofilk, elektronik, dan sterik dari gugus-gugus terhadap sifat-sifat senyawa induk yang berhubungan dengan aktivitas biologis



a, b, c, dan d : Bilangan yang didapat dari perhitungan analisis regresi linier (Siswandono, 2008).

2.9.1

Parameter hidrofobik Parameter hidrofobik (lipofilik) yang sering digunakan dalam HKSA antara lain adalah logaritma koefisien partisi (log P), tetapan π Hansch, tetapan fragmentasi f RekkerMannhold dan tetapan kromatografi Rm (Siswandono, 2008). Koefisien partisi oktanol/air yang dinyatakan dalam log P merupakan

standar

kuantitas

hidrofobik/hidrofilik

suatu

untuk

menentukan

molekul.

sifat

Parameter

hidrofobik/hidrofilik adalah sifat yang sangat penting dalam aplikasi biomedis (Katritzky et al., 1996). Koefisien partisi atau log P dapat diartikan sebagai perbandingan konsetrasi suatu senyawa dalam oktanol dan air. Selain log P terdapat juga parameter hidrofobik yang sering digunakan, yaitu koefisien distribusi atau Log D. Koefisien distribusi adalah perbandingan konsentrasi dari seluruh jenis senyawa dalam oktanol dan air. Berdasarkan reaksi disosiasi asam-basa, konsep koefisien partisi digunakan untuk senyawa bersifat kationik, anionic, dan netral (ChemAxon, 2014)


21

Gambar 2.8 Koefisien Partisi dan Distribusi senyawa terion dan tak terion (ChemAxon, 2014)

2.9.2

Parameter Elektronik Ada tiga jenis sifat elektronik yang digunakan dalam HKSA model LFER Hansch, yaitu: a. Pengaruh berbagai substituent terhadap reaktivitas bagian molekul yang tidak mengalami perubahan. Penetapannya

menggunakan

perhitungan

orbital

molekul, contoh : tetapan σ Hammet b. Sifat elektronik yang berkaitan dengan tetapan ionisasi (pKa) dan berhubungan bentuk terionkan dan tak terionkan dari suatu senyawa pada pH tertentu. Penetapannya menggunakan persamaan HandersonHasselbach. c. Sifat oksidasi-reduksi atau reaktivitas senyawa. Penetapannya menggunakan perhitungan mekanika kuantum dari energi orbital (Siswandono, 2008). Energi HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital) dan energi LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital) merupakan deskriptor yang sangat populer dalam kimia kuantum. Orbital-orbital ini memainkan peran yang sangat penting dalam menentukan berbagai reaksi kimia dan dalam penentuan celah pita elektronik.


22

Energi HOMO berhubungan langsung dengan potensial ionisasi dan sifat kerentanan molekul dalam penyerangan terhadap elektrofil (Katritzky et al, 1996). Sedangkan energi LUMO berhubungan langsung dengan afinitas elektron dan sifat kerentanan molekul dalam penyerangan terhadap nukleofil. Selisih antara energi HOMO dan LUMO (celah HOMO-LUMO) penting dalam penentuan ukuran stabilitas molekul. Molekul dengan celah HOMO-LUMO yang besar berarti molekul tersebut memiliki stabilitas yang tinggi, sehingga memiliki reaktivitas yang rendah dalam reaksireaksi kimia. Celah ini juga digunakan pada perkiraan energi eksitasi terendah molekul (Katritzky et al., 1996).

2.9.3

Parameter sterik Tetapan sterik substituent dapat diukur berdasarkan sifat meruah gugus-gugus dan efek gugus pada kontak obat dengan sisi reseptor yang berdekatan (Siswandono, 2008). Parameter sterik yang sering digunakan para kimiawan dalam setiap kasus adalah indeks topologi untuk melakukan evaluasi terhadap toksisitas dan untuk memprediksi aktivitas biologi. Hal ini karena indeks topologi menawarkan cara yang mudah dalam pengukuran cabang molekul, bentuk, ukuran, siklisitas, simetri, sentrisitas, dan kompleksitas (Devillers, 1997). Indeks topologi menjelaskan bahwa suatu struktur kimia, disebut sebagai grafik kimia, yaitu suatu model kimia yang digunakan untuk menjelaskan sifat interaksi antara obyekobyek kimia (atom, ikatan, gugusan atom, molekul, pasangan molekul, dan sebagainya). Salah satu jenis indeks topologi yang ada adalah indeks harary, Indeks Harary yang dinyatakan dengan H diturunkan dari hubungan timbal balik (resiprokal) matriks jarak dan dari sejumlah sifat-sifat yang menarik.


23

Indeks ini berdasarkan pada dugaan para kimiawan bahwa situs-situs yang terletak berjauhan dalam suatu struktur seharusnya memiliki pengaruh yang lebih kecil antara satu dengan lainnya daripada situs-situs yang letaknya berdekatan (Fatimah, 2008). Indeks Randic atau indeks konektivitas molekular Randic sangat mirip dengan indeks Zagreb, namun lebih dapat diterima dan digunakan secara luas. Secara matematis dituliskan pada persamaan:

Sesuai dengan definisi yang diberikan, maka semakin rapat grafik, maka akan semakin rendah harga χ (Fatimah, 2008). Selain itu descriptor parameter sterik yang biasa digunakan adalah Refraksi molar (molar refraction = MR) Refraksi molar dihitung melalui persamaan Lorenz-Lorenz sebagai berikut: MR= (n2-1) x BM / (n2-1) x d n : indeks refraksi d : kerapatan (density) (Siswandono, 2008).

2.9.4

Analisis statistik HKSA Hansch Perhitungan statistic yang sering digunakan dalam hubungan struktur dan aktivitas melalui parameter-parameter kimia fisika adalah analisa regresi linier dan non linier. Untuk mengetahui hubungan kuantitatif antara struktur kimia dan aktivitas biologis melalui parameter kimia fisika, dapat dilakukan perhitungan statistic dengan bantuan computer, menggunakan program MICROSAT, ABSTAT, QSAR, STATGRAPHIC, STATISTICA, SIGMASTAT, SPSS, atau program statistic lainnya (Siswandono, 2008).


24

Analisa regresi linier bila dilihat dari jumlah variabel bebas yang digunakan, terbagi menjadi dua yaitu analisa regresi linier tunggal yang menggunakan satu variabel bebas dan analisa regresi multi linier (Multilinier Regresion) yang menggunakan lebih dari satu variabel bebas. Perhitungan regresi linier digunakan untuk mencari hubungan antara aktivitas biologis dengan satu parameter kimia fisika atau lebih. Salah satu contoh bentuk persamaan untuk regresi multilinier yang menggunakan dua dan tiga parameter adalah sebagai berikut: Y = aX1+ bX2 + c Y= aX1 + bX2 + cX3 + d X1, X2, X3 : parameter-parameter kimia fisika 1, 2, dan 3 (Siswandono, 2008).

2.9.5

Kriteria Statistik Keabsahan persamaan yang diperoleh dan arti perbedaan parameter yang digunakan dalam hubungan struktur-aktivitas model Hansch, dapat dilihat dengan beberapa kriteria statistik, seperti r, r2, F, t dan s. arti kriteria statistik: a) Nilai

r

(koefisien

kolerasi)

menunjukkan

tingkat

hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan percobaan dengan data hasil perhitungan berdasarkan persamaan yang diperoleh dari analisi regresi. Koefisien korelasi adalah angka bervariasi mulai dari 0 sampai 1. Semakin tinggi nilai koefisien kolerasi maka semakin baik hubungannya. b) Nilai r2 menunjukkan berapa % aktivitas biologis yang dapat dijelaskan hubungannya dengan parameter sifat fisika-kimia yang digunakan.


25

c) Nilai

F

menunjukkan

kemaknaan

hubungan

bila

dibandingkan dengan tabel F. Makin besar nilai F makin besar derajat kemaknaan hubungan. Nilai F adalah indikator bilangan untuk menunjukkan bahwa hubungan yang dinyatakan oleh persamaan yang didapat, adalah benar atau merupakan kejadian kebetulan. Semakin tinggi nilai F semakin kecil kemungkinan hubungan tersebut adalah karena kebetulan. d) Nilai t menunjukkan perbedaan koefisien regresi a, b, c, dan d dari persamaan regresi bila dibandingkan dengan tabel t e) Nilai s (simpangan baku) menunjukkan nilai variasi kesalahan dalam percobaan.

2.10

Penambatan molekuler (Molecular Docking) Molecular docking atau penambatan molekuler adalah prosedur komputasional yang digunakan untuk memprediksikan ikatan non kovalen makromolekul, lebih sering, sebuah molekul besar (reseptor) dan sebuah molekul kecil (ligan) secara efisien, dimulai dari struktur-struktur yang tidak saling berikatan, struktur yang ditemukan dari simulasi dinamika molekul, homology modeling, dll. Tujuan dari molecular docking adalah untuk memprediksikan konformasi ikatan dan afinitas pengikatan (Yanuar, 2012). Dalam bidang pemodelan molekul, docking adalah metode untuk memprediksi orientasi yang lebih diutamakan dari suatu molekul ketika terikat satu sama lain untuk membentuk kompleks yang stabil.


26

Informasi tentang oreintasi ini dapat digunakan untuk memprediksi kekuatan hubungan atau afinitas ikatan antara dua molekul yang digunakan misalnya fungsi penilaian. Hubungan antara molekul biologis yang relevan seperti protein, asam nukleat, karbohidrat, dan lipid memainkan peran sentral dalam transduksi sinyal. Selanjutnya, orientasi relatif dari dua pasangan yang berinteraksi dapat mempengaruhi jenis sinyal yang dihasilkan. Oleh karena itu docking berguna untuk memprediksi baik kekuatan dan jenis sinyal yang dihasilkan. Docking sering digunakan untuk memprediksi orientasi ikatan kandidat obat bermolekul kecil terhadap target proteinnya untuk memprediksi afinitas dan aktivitas molekul kecil. Maka docking memainkan peran penting dalam desain obat secara rasional (Mukesh & Rakesh, 2011). Prediksi pengikatan molekul kecil pada protein penting karena data tersebut digunakan untuk screening database virtual molekul mirip obat untuk menemukan senyawa penuntun untuk mengembangkan obat selanjutnya. Docking juga dapat digunakan untuk mencoba memprediksi konformasi ikatan dari pengikat yang diketahui, ketika percobaan seluruh struktur tidak tersedia (Yanuar, 2012). Untuk melakukan skrining penambatan, syarat pertama adalah struktur protein yang dikehendaki. Biasanya struktur telah ditentukan dengan menggunakan teknik biofisik seperti kristalografi sinar-x, atau spektroskopi NMR. Struktur protein dan basis data ligan yang potensial ini berfungsi sebagai input untuk program docking. Keberhasilan program docking tergantung pada dua komponen: pencarian algoritma dan fungsi scoring (Mukesh, 2011). Fungsi scoring dapat memprediksi afinitas ikatan antara makromolekul dengan ligan. Identifikasi ini didasarkan pada beberapa teori seperti teori energi bebas Gibbs.


27

Nilai energi bebas Gibbs yang kecil menunjukkan bahwa konformasi yang terbentuk adalah stabil, sedangkan nilai energi bebas Gibbs yang besar menunjukkan tidak stabilnya kompleks yang terbentuk. Sedangkan penggunaan algoritma berperan dalam penentuan konformasi (docking pose) yang paling stabil dari pembentukan kompleks (Funkhouser, 2007).

2.11

Pemograman HKSA dan Penambatan Molekuler 2.11.1 Hyperchem Program HyperChem, merupakan program kimia aplikasi 32 bit, yang dikembangkan oleh HyperCube Inc. HyperChem merupakan program yang handal dari pemodelan molekul yang telah diakui mudah digunakan, fleksibel dan berkualitas. Dengan menggunakan

visualisasi

dan

animasi

tiga

dimensi

hasil

perhitungan kimia kuantum, mekanika dan dinamika molekular, menjadikan

HyperChem

terasa

sangat

mudah

digunakan

dibandingkan dengan program kimia kuantum yang lain. Program Kimia menyediakan fasilitas pembuatan model tiga dimensi (3D), perhitungan

mekanika

molekular

dan

mekanika

kuantum

(semiempiris dan ab initio). Disamping itu tersedia pula database dan program simulasi Monte Carlo dan molecular dynamics (MD) (Pranowo, 2009).

2.11.2 Protein Data Bank Protein data bank (PDB; http://www.pdb.org) merupakan kumpulan arsip tunggal mengenai data structural makromolekul biologi dari seluruh dunia. Penentuan struktur molekul protein yang terdapat berkas PDB diperoleh dengan menggunakan data eksperimen. Data eksperimen ini berasal dari kristalografi sinar x atau spektroskopi Nuclear Magnetic Resonance (NMR).


28

Kemudian dilakukan proses dengan program komputer untuk membuat molekul yang paling sesuai dengan data eksperimen (Berman et al, 2000). PDB merupakan tempat penampungan data struktur 3D dari protein dan asam nukleat. Situs PDB dapat diakses pada alamat http://www.pdb.org oleh seluruh pengguna internet seluruh dunia secara gratis (Yanuar, 2012).

2.11.3 Discovery Studio 4.0 Visualizer Discovery Studio Visualizer adalah penampil gratis yang dapat digunakan untuk membuka, mengedit data serta alat untuk melakukan analisis data yang dihasilkan oleh perangkat lunak lain. Perangkat ini dirancang untuk memberikan gambaran yang interaktif untuk melihat dan mengedit struktur molekul, urutan, data refleksi X-ray, script, dan data lainnya.Aplikasi ini dapat digunakan pada Windows dan Linux dan terintegrasi dengan desktop yang menyediakan akses ke fitur sistem operasi standar seperti sistem berkas, clipboard, dan percetakan (Accelrys Enterprise Platform, 2005).

2.11.4 MarvinSketch MarvinSketch merupakan aplikasi mendesain gambar struktur yang

didirikan

oleh

ChemAxon,

perangkat

lunak

yang

dikembangkan untuk bioteknologi dan farmasetikal industry. MarvinSketch adalah perangkat chemical drawing berbasis Java yang memungkinkan membuat dan mengedit molekul dalam berbagai format file (DBM et al., 2014).

2.11.5 Autodock Autodock merupakan sebuah perangkat lunak yang dibangun untuk melakukan suatu prosedur dalam rangka memprediksi interaksi sebuah molekul kecil dari suatu senyawa dengan molekul target.


29

Hal yang menyebabkan tercetusnya pembuatan software ini adalah karena adanya permasalahan dalam merancang suatu senyawa bioaktif, khususnya dalam hal perancangan obat dengan bantuan komputer (Computer Aided Drug Design). Program ini bertujuan sebagai alat yang dapat digunakan pada computer untuk membantu proses pembentukan interaksi yang akurat (Yanuar, 2012). Setiap proses docking dengan AutoDock membutuhkan paling sedikit empat input file, yaitu: PDBQT file untuk ligan; PDBQT file untuk makromolekul atau reseptor; grid parameter file (GPF) untuk perhitungan oleh AutoGrid; dan docking parameter file (DPF) untuk perhitungan oleh AutoDock (Yanuar, 2012).

2.11.6 Autodock Vina AutoDock Vina adalah salah satu perangkat lunak yang tepat dan dapat diandalkan yang tersedia untuk penemuan obat, penambatan molekul dan skrining virtual yang dirancang dan diterapkan oleh Dr. Oleg Trott. Vina menawarkan fungsi yang beragam, tingkat kinerja tinggi dan meningkatkan akurasi untuk mempermudah penggunaan. Perangkat lunak ini dapat dioperasikan dengan bantuan AutoDockTools (ADT) atau instruksi command line. Untuk hasil input dan output vina, file type yang digunakan dalah struktur molekul PDBQT seperti yang digunakan pada software Autodock. Untuk pengaplaksiannya, hanya diperlukan struktur molekul yang akan di docking dan spesifikasi binding site (Yanuar, 2012).


30

2.11.7 Pymol Pymol adalah program visualisasi molekuler yang diciptakan oleh Warren Lyford DeLano. Pymol memberikan kualitas gambar tiga dimensi yang baik dari molekul kecil dan makromolekul seperti protein. Pymol merupakan salah satu program visualisasi yang digunakan untuk memahami suatu struktur biologi dan dapat menampilkan gambar tiga dimensi yang berkualitas dan mampu menyajikan tampilan struktur dalam beberapa warna dari suatu molekul kecil maupun makromolekul seperti protein. Visualisasi sangatlah penting untuk lebih memahami dan mendalami struktur suatu molekul (DeLano & Bromberg, 2004).

2.11.8 LigPlot Program

Ligplot

secara

otomatis

menghasilkan

skema

gambaran 2-D dari interaksi kompleks protein-ligan dari input file standar Protein Data Bank. Hasil Output yang diberikan berupa warna, atau hitam-putih, file PostScript memberikan representasi sederhana dan informatif tentang interaksi antarmolekul dan kekuatan

interaksinya,

termasuk

ikatan

hidrogen,

interaksi

hidrofobik dan aksesibilitas atom. Program ini sepenuhnya secara umum digunakan untuk ligan apapun dan juga dapat digunakan untuk menunjukkan jenis interaksi protein dan asam nukleat (Wallace et al., 1994).


BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1.

Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan (FKIK) Universita Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Serpong selama bulan Maret hingga Juni 2015.

3.2.

Alat 3.2.1. Perangkat Keras Notebook Asus (X44C series) dengan spesifikasi Intel® celeron® CPU (B800 @ 1.50GHz (2 CPUS), ~1.50 GHz), RAM (Random Access Memory) 2.00 gigabyte, dan Graphic Card (Intel® HD Graphics Family) 784 MB. Notebook terhubung dengan AC/DC adapter dan terkoneksi internet.

3.2.2. Perangkat Lunak Sistem operasi menggunakan Windows 7 Ultimate 64 bit, Autodock Tools, Discovery Studio 3.5 Visualizer (Accelrys Enterprise Platform), Open Babel 2.3.2, Autodock Vina, Pymol (De

Lano

Scitientific

LLC),

Marvin

Sketch

5.5.1.0

(http://www.chemaxon.com), LigPlot, HyperchemTM trial for Windows, Protein Data Bank (http://www.rcsb.org/pdb), SPSS 16.0 for windows, Microsoft Excel 2007.

31


32

3.3.

Bahan 3.3.1. Struktur molekul tiga dimensi enzim Inh A Mycobacterium tuberculosis Struktur tiga dimensi enzim Inh A diunduh dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb. Makromolekul protein yang dipilih adalah enzim Inh A pada Mycobacterium tuberculosis yang didapat dari metode X-ray Diffraction dengan resolusi 2,70 Å. Identitas makromolekul tersebut adalah 1ENY dengan format .pdb.

3.3.2. Struktur tiga dimensi ligan senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat. Ligan yang digunakan adalah ligan dari senyawa amidasi etil p-metoksisinamat (EPMS) yang dibuat dengan Marvin Sketch dengan format .mol untuk perhitungan deskriptor dan format .pdb untuk proses docking.

3.3.3

Data anti-tuberculosis beberapa senyawa beserta strukturnya Data anti-tuberkulosis beberapa senyawa di ambil dari referensi dan jurnal penelitian, kemudian digunakan sebagai training sets dan test sets untuk membangun persamaan HKSA. Data aktivitas anti-tuberkulosis yang didapat adalah nilai Minimum Inhibitor Concentration (MIC) dan strukturnya dalam format .mol.

3.4.

Cara Kerja

3.4.1. HKSA pendekatan Hansch 3.4.1.1 Pemilihan Data Sets Pemilihan Senyawa Data sets anti-tuberkulosis yang digunakan melalui pencarian literatur kemudian dibagi menjadi 2 kelompok yaitu senyawa training sets dan test sets. Senyawa training sets digunakan untuk membangun persamaan HKSA. Sedangkan senyawa test sets digunakan untuk memvalidasi persamaan HKSA yang telah dibuat.


33

3.4.1.2 Pemilihan deskriptor training sets Data

deskriptor

yang

digunakan

mewakili

parameter

hidrofobik, elektronik, dan sterik. Untuk parameter hidrofobik digunakan

nilai

Log

D

dengan

menggunakan

aplikasi

Marvinsketch. Parameter elektronik yang digunakan adalah energi HOMO, energi LUMO, dan Momen dipol dengan menggunakan aplikasi

Hyperchem,

perhitungan

menggunakan

metode

semiempiris AM1. Sedangkan parameter sterik yang digunakan adalah Harary index, Randic index, dan Molar refractivity dengan aplikasi Hyperchem dan Marvinsketch. Training sets yang telah dipilih kemudian dihitung tiap deskriptornya untuk membangun persamaan HKSA.

3.4.1.3 Membangun persamaan HKSA Persamaan HKSA dibuat melalui perhitungan statistik analisis regresi multilinier dengan program SPSS. Analisa regresi multilinier dilakukan dengan metode backward, yaitu dengan memasukkan semua variabel bebas (data deskriptor) yang digunakan. Kemudian dicoba penghilangan satu-persatu dalam satu waktu. Persamaan HKSA tersebut merupakan hubungan parameter sifat fisika-kimia yang merupakan variable bebas pada metode Hansch dengan aktivitas anti-tuberkulosis (log 1/MIC) sebagai variable terikat.

3.4.1.4 Perhitungan deskriptor test sets Test set yang telah dipilih dihitung nilai descriptor log D, Energi HOMO, energi LUMO, Momen dipol, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity menggunakan aplikasi Hyperchem dan MarvinSketch.


34

3.4.1.5 Validasi persamaan HKSA Setelah membangun persamaan multilinier regression metode backward akan didapatkan beberapa model persamaan. Kemudian diuji validitasnya dengan menghitung nilai r2, Fhit/Ftabel, Standar Error, dan predicted residual sums of squares (PRESS). Persamaan yang diterima harus memenuhi syarat: 1. nilai r2 dari 0,8 hingga 1 2. nilai Fhit/Ftabel > 1 3. nilai SE dan PRESS terkecil atau mendekati 0 Kemudian dihitung nilai Root Mean Standar Deviation (RMSD) dengan membandingkan nilai Log (1/MIC) eksperimen pada data test sets dengan Log (1/MIC) prediksi test sets dari hasil model persamaan yang dibuat. Model persamaan yang diterima bila nilai RMSD terkecil atau mendekati 0.

3.4.1.6 Prediksi aktivitas sample sets Senyawa amidasi etil p-metoksisinamat pada format .mol dihitung nilai deskriptor dengan model persamaan yang telah memenuhi syarat. Nilai deskriptor yang didapat kemudian di masukkan kedalam persaman HKSA untuk mendapatkan prediksi aktivitas anti-tuberkulosis (Log 1/MIC) yang baik.

3.4.2. Penambatan Molekuler 3.4.2.1 Penyiapan dan Optimasi Enzim Inh A Makromolekul enzim InhA diunduh dari Bank Data Protein melalui situs http://www.rcsb.org/pdb/. Identitas molekul pada situs tersebut adalah 1ENY dalam format .pdb. Makromolekul protein kemudian dilakukan proses pemisahan molekul air dan ligan atau residu non standar. Proses ini dilakukan dengan menggunakan software Discovery Studio 3.5 Visualizer. Hasil makromolekul yang telah dipisahkan disimpan pada dalam format .pdb.


35

Selanjutnya,

dilakukan

proses

optimasi

makromolekul

menggunakan software Autodock Tool. Buka software Autodock tool  klik file  read molecul  pilih makromolekul dengan format .pdb. Optimasi meliputi penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter untuk menentukan lokasi penambatan molekul ligan. Hasil optimasi makromolekul disimpan dalam format .pdbqt.

3.4.2.2 Penyiapan dan Optimasi Ligan (senyawa uji) Ligan yang digunakan sebagai pembanding adalah Isoniazid yang

dapat

diunggah

melalui

PubChem

(http://PubChem.ncbi.blm.nih.gov). Sedangkan senyawa amidasi Etil p-metoksisinamat yang akan diujikan

dibuat struktur tiga

dimensinya dengan software Marvinsketch dan disimpan dalam format .mol, kemudian dikonversi menjadi .pdb dengan program open babel. Optimasi struktur ligan yang telah dibuat dengan menggunakan software Autodock Tools. Dengan cara: Buka ligan yang telah dibuat (ligand → input → open). Kemudian, optimasi pengaturan number of active torsion. Simpan ligan hasil optimasi (ligand → output → save as pdbqt →save) dalam format .pdbqt.

3.4.2.3 Penambatan Molekul dengan Autodock Vina Langkah

awal

yang dilakukan

adalah

mengkopi

atau

menyimpan data Ligan dan Protein format .pdbqt yang telah dioptimasi kedalam folder Vina. Kemudian buat pengaturan konfigurasi file vina pada notepad dan disimpan dengan format conf.txt. Selanjutnya, jalankan software Vina melalui Command prompt.


36

3.4.2.4 Analisis dan Visualisasi Penambatan Molekul Hasil kalkulasi penambatan dilihat pada output dalam format out.pdbqt. Pemilihan hasil penambatan dengan memilih ligan yang memilki nilai energi bebas Gibbs (∆Gbind) terendah. Data nilai energi ikatan setiap ligan dapat dilihat pada output hasil penambatan ‘log.txt’. Visualisasi posisi setiap ligan pada makromolekul dan asam amino yang terikat pada ligan dengan menggunakan program Pymol dan Ligplot. Pymol digunakan untuk melihat kecocokan situs tambat pada makromolekul dengan ligan. Pymol akan menvisualisasi secara 3 dimensi, sedangkan ligplot secara 2 dimensi. Makromolekul yang sebelumnya telah dioptimasi dengan format .pdbqt dan data hasil penambatan output.pdbqt, dibuka menggunakan wordpad. Data dari output.pdbqt disalin kedalam data makromolekul, kemudian disimpan dalam format .pdb dan dilihat interaksi asam amino dan ligannya menggunakan program Ligplot secara dua dimensi.


BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas pendekatan Hansch 4.1.1 Pemilihan data sets Data sets yang digunakan adalah senyawa turunan asam sinamat yang memiliki kemiripan dengan senyawa amidasi EPMS dan mempunyai aktivitasi anti-tuberkulosis. Data senyawa turunan sinamat yang digunakan adalah hasil percobaan secara in-vitro yang dilakukan oleh Guzman et al, (2014) terhadap penghambatan pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv atau konsentrasi hambat minimum (MIC). Data senyawa yang digunakan adalah sebanyak 14, kemudian dibagi menjadi 2 bagian, yaitu 9 senyawa sebagai training sets dan 5 senyawa sebagai test sets.

Tabel 4.1 Data sets yang digunakan

No.

Nama Senyawa dan Struktur

Kode

MIC

Senyawa

(μM)

S1

485

S2

270

S3

312

ethyl p-methoxycinnamate 1

Cinamic acid 2

3,4-methylenedioxycinnamic acid

3

37


38

3-Coumaric acid 4

S4

366

S6

258

S7

86.1

S8

66.8

S9

172

S10

81.2

S12

112

2-O-prenylcoumaric acid

5

4-O-prenylcoumaric acid 6

4-O-geranylcoumaric acid 7

Methyl 3-O-Prenylcoumarate 8

Methyl 4-O-Prenylcoumarate 9

Methyl 2-Coumarate 10


39

Caffeic aldehyde 11

S13

154

S14

122

S15

224

S16

127

2-Coumaric acid

12

Methyl 4-Coumarate 13

3-O-prenylcoumaric acid 14

Catatan: Untuk mempermudahkan input data, nama senyawa selanjutnya akan digantikan oleh kode senyawa Tabel 4.2 Data Training sets

Tabel 4.3 Data test sets

No.

Kode Senyawa

MIC

No.

Kode Senyawa

MIC

1

S1

485

1

S4

366

2

S2

270

2

S3

312

3

S6

258

3

S16

172

4

S15

224

4

S14

122

5

S9

172

5

S7

86.1

6

S13

154

7

S12

112

8

S10

81.2

9

S8

66.8


40

4.1.2 Pemilihan deskriptor Training sets Deskriptor yang digunakan merupakan hasil dari perhitungan logika matematika yang mengubah informasi yang dikodekan dalam suatu molekul kemudian direpresentasikan kedalam angka-angka yang berguna bagi penelitian berikutnya, baik sebagai pengetahuan tentang molekul tersebut maupun sebagai model untuk mempresiksi molekul lain (Todeschini, 2009). Sehingga hasil dari deskriptor tersebut dapat mewakili parameter hidrofobik, elektronik, dan sterik pada HKSA model Hansch. Hal ini dikarenakan proses distribusi, penembusan membran biologis sangat dipengaruhi oleh sifat kelarutan obat dalam lemak/air, suasana pH dan derajat ionisasi (pKa) sehingga dalam HKSA, parameter yang sering digunakan adalah parameter hidrofobik dan elektronik.Sedangkan untuk proses interaksi obat-reseptor sangat dipengaruhi oleh ikatan kimia, kerapatan elektron, ukuran molekul, dan efek sterokimia, sehingga dalam HKSA, ketiga parameter tersebut ikut dilibatkan, terutama parameter elektronik dan sterik (Siswandono, 2008). Deskriptor yang digunakan untuk mewakili parameter hidrofobik adalah nilai Log D dengan menggunakan program Marvin sketch, Struktur training sets yang telah dibuat dalam aplikasi Marvin sketch kemudian pilih clean 3D, setelah itu pilih tools  partitioning  logD, untuk mendapatkan nilai logD. Untuk deskriptor elektronik yang digunakan adalah nilai energi HOMO (Highest Occupied Molecular Orbital), energi LUMO (Lowest Unoccupied Molecular Orbital), dan momen dipol menggunakan aplikasi Hyperchem. Setelah struktur training sets dibuat, kemudian pilih Build  add H and model build. Sebelum dilakukan perhitungan deskriptor, dilakukan optimasi struktur dengan metode semiempiris AM1 dan optimasi geometri. Pemilihan metode semiempiris AM1, karena metode tersebut sering digunakan dan merupakan metode semiempiris standar untuk perhitungan senyawa organik (Bultink et al., 2004).


41

Proses optimasi struktur berfungsi untuk mendapatkan struktur yang stabil ketika dilakukan perhitungan parameter elektroniknya, sehingga hasil perhitungan deskriptor yang didapat sesuai dengan sifatfisika kimia senyawa yang sebenarnya. Proses perhitungan deskriptor energi HOMO dan LUMO dengan cara, pilih Compute kemudian pilih Orbitals. Sedangkan untuk momen dipol, pilih Compute  Single Point

 Properties. Kemudian, pemilihan deskriptor yang mewakili parameter sterik adalah Molar refractivity, Harary Index, dan Randic Index. Pehitungan molar refractivity menggunakan aplikasi Hyperchem dengan cara, pilih Compute  QSAR Properties  Refractivity  klik Compute. Sedangkan untuk Harary Index dan Randic Index menggunakan aplikasi MarvinSketch. Setelah struktur dibuat dan telah di-clean 3D, pilih tools GeometryTopological analysispilih Harary Index dan Randic IndexOk. Semua data kemudian dikumpulkan pada program SPSS dan Microsoft Excel, yang nantinya digunakan untuk membangun persamaan HKSA. Selanjutnya, aktivitas senyawa yaitu nilai MIC diubah menjadi Log (1/MIC) sebagai variabel tak bebas dan 7 data deskriptor sebagai variabel bebas. Tabel 4.4 Data nilai setiap deskriptor training set No

Kode Senyawa

1

S1

2

S2

3

S6

4

S15

5

S9

6

S13

7

S12

8

S10

9

S8

Log (1/MIC) -2.686 -2.431 -2.412 -2.350 -2.236 -2.188 -2.049 -1.91 -1.825

logD

Energi HOMO

Energi LUMO

Momen dipol

Harary index

Randic index

Molar refractivity

2.71

-8.943

-0.639

2.346

39.412

12.815

63.09

-0.665

-9.471

-0.793

2.679

25.102

8.734

47.2

0.183

-9.394

-0.615

2.02

47.893

14.695

72.69

2.207

-9.059

-0.731

3.731

32.25

10.419

53.57

0.237

-9.215

-0.784

4.055

47.233

14.695

72.69

1.36

-8.974

-0.847

5.397

29.204

9.272

49.48

2.205

-9.304

-0.72

1.099

32.639

10.419

53.57

3.719

-8.922

-0.642

3.029

50.65

15.842

77.46

1.845

-8.97

-0.71

3.959

66.316

20.222

96.49


42

4.1.3 Membangun dan validasi Persamaan HKSA Persamaan HKSA yang dibuat dengan

cara analisa regresi

multiliner dengan metode backward dibantu oleh program SPSS. Pemilihan analisa regresi multilinier dikarenakan dalam pembuatan persamaan, parameter-parameter sifat fisika-kimia yaitu data deskriptor yang digunakan lebih dari satu. Sembilan data akitivitas (Log 1/MIC) senyawa training sets dengan masing-masing memiliki 7 data deskriptor di input pada program SPSS. Kemudian dilakukan analisa statistic regresi multiliner metode backward dengan cara, pilih analyze

RegressionLinier pilih dependent variabel adalah aktivitas senyawa (Log 1/MIC) dan independent variabel adalah 7 deskriptor yang digunakanubah method menjadi backwardOk. Hasil yang didapat dari program SPSS adalah 3 model persamaan HKSA dengan nilai r, r2, Fhitung, SE (Standar Error), dan Deskriptor yang digunakan. Data tersebut dapat dilihat pada tabel 4.5. Model persamaan yang diterima dalam penelitian HKSA adalah yang memiliki nilai r diantara 0,9 hingga 1, nilai r2 antara 0,8 hingga 1, nilai standar error (SE) < 1 atau mendekati 0, dan nilai Fhitung lebih kecil dari Ftabel atau Fhit/Ftab>1. Nilai r (koefisien kolerasi) menunjukkan tingkat hubungan antara data aktivitas biologis pengamatan percobaan dengan data hasil perhitungan berdasarkan persamaan yang diperoleh dari analisa regresi. Sedangkan nilai r2 menunjukkan persentase aktivitas biologis yang dapat dijelaskan hubungannya dengan sifat fisika kimia yang digunakan (Siswandono, 2008; Rifai. et al., 2014). Tabel 4.5 Hasil analisa persamaan HKSA Model 1

2

3

Deskriptor yang digunakan Log D, energi HOMO, energi LUMO, Momen dipol, Harary Index, Randic Index, Molar refractivity Log D, energi HOMO, energi LUMO, Harary Index, Randic Index, Molar refractivity Log D, energi HOMO, energi LUMO , Randic Index, Molar refractivity

r 0.994

r2 0.988

SE 0.083

Fhit 12.218

Ftab 237

Fhit/Ftab 0.052

0.992

0.985

0.0679

21.179

19.33

1.096

0.988

0.976

0.0684

24.906

9.01

2.764


43

Tabel 4.6 Model Persamaan

Model

Bentuk Persamaan

1

log(1/MIC) = -14.130+0.251(logD)-0.693(EH)-3.027(EL)-0.068(MD)+0.044(HI)1.364(RI)+0.294(MR)

2

log(1/MIC) = -18.7+0.298(logD)-1.22(EH)-2.812(EL)+0.034(HI)-1.106(RI)+0.243(MR)

log(1/MIC) = -19.106+0.302(logD)-1.226(EH)-2.828(EL)-1.083(RI)+0.265(MR) 3 Keterangan: EH = energi HOMO, EL = energi LUMO, MD = momen dipole, HI = Harary Index, RI = Randic Index, MR = Molar refractivity

Dari hasil analisa yang didapat, model persamaan yang memenuhi syarat adalah persamaan model 2 dan 3. Karena pada persamaan model 1, nilai Fhit/Ftab kurang dari 1 yaitu 0,052. Hal ini dikarenakan nilai F menunjukkan kemungkinan persamaan tersebut adalah suatu hubungan yang bermakna diantara hasil-hasil yang didapat. Jika nilai F perhitungan data percobaan lebih besar dari nilai F tabel maka hasilhasil percobaan mempunyai hubungan yang besar pada tingkat probabilitas yang diberikan (Siswandono, 2008). Setelah dilakukan validasi pada data output SPSS dilakukan uji PRESS (prediction sum of squares) dengan menggunakan data aktivitas senyawa training sets berdasarkan eksperimen (Log 1/MIC eksperimen) dan data aktivitas senyawa training sets dengan menggunakan model persamaan yang terpilih ( Log 1/MIC prediksi), yaitu model 2 dan 3. Perhitungan nilai PRESS dengan menggunakan rumus: Σ{(log 1/MIC eksperimen) – (Log 1/MIC prediksi)}2


44

Tabel 4.7 Data Nilai PRESS

Kode Log(1/MIC) Senyawa eksperimen S1 -2.686 S2 -2.431 S6 -2.412 S15 -2.350 S9 -2.236 S13 -2.188 S12 -2.049 S10 -1.910 S8 -1.825 Nilai PRESS

Log(1/MIC) prediksi Model 2 Model 3 -2.688 -2.676 -2.450 -2.404 -2.416 -2.446 -2.344 -2.354 -2.166 -2.172 -2.203 -2.227 -2.064 -2.085 -1.878 -1.859 -1.874 -1.874 0.009 0.014

Dari tabel 4.7 diketahui nilai PRESS yang terkecil atau mendekati 0 adalah model 2 yaitu 0,009. Nilai PRESS yang kecil menandakan aktivitas prediksi dari suatu persamaan HKSA mendekati aktivitas eksperimen. Untuk memvalidasi lagi model persamaan yang terpilih, maka dilakukan uji diluar data senyawa pembuat persamaan HKSA yaitu pada data test sets. Sebanyak 5 data tes sets yang digunakan dihitung data deskriptor terpilih dari persamaan model 2 dan 3, yaitu; Log D, energi HOMO, energi LUMO, Harary Index, Randic Index, dan Molar refractivity. Setelah semua data deskriptor terkumpul, maka dilakukan perhitungan aktivitas yaitu nilai Log 1/MIC prediksi senyawa tes set menggunakan persamaan model 2 dan 3 untuk mendapat nilai RMSD (root mean square deviation) terkecil, dengan membandingkannya pada Log 1/MIC eksperimen senyawa tes set. Perhitungan RMSD dengan rumus:

n = jumlah senyawa test sets yang digunakan


45

Tabel 4.8 Data deskriptor terpilih pada test set Kode Senyawa

log(1/MIC)

logD

Energi HOMO

Energi LUMO

Harary Index

Randic Index

Molar Refractivity

S4

-2.563

-1.322

-9.323

-0.889

28.921

9.272

48.8

S3

-2.494

-1.77

-9.086

-0.947

38.024

10.103

52.79

S16

-2.236

-0.19

-9.172

-0.816

47.233

14.695

72.69

S14

-2.086

-1.309

-9.316

-0.942

29.136

9.272

48.8

S7

-1.935

0.186

-8.973

-0.713

46.751

14.695

72.69

Tabel 4.9 Nilai RMSD Model persamaan 2 dan 3 pada test set Kode Log(1/MIC) Senyawa eksperimen S4 -2.563 S3 -2.494 S16 -2.236 S14 -2.086 S7 -1.935 Nilai RMSD

Log(1/MIC) prediksi Model 2 Model 3 -2.633 -2.671 -2.533 -2.775 -2.255 -2.263 -2.481 -2.526 -2.692 -2.684 0.384 0.411

Dari hasil RMSD dapat diketahui bahwa model persamaan dengan nilai RMSD kecil adalah model persamaan 2, hal ini sesuai dengan hasil uji PRESS, dimana model persamaan 2 memiliki nilai PRESS terkecil. Sehingga dapat disimpulkan dari hasil validasi model persamaan, persamaan 2 telah memenuhi syarat pemodelan persamaan HKSA.


46

Log (1/MIC) eksperimen 0 -3

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0 -0.5 -1 -1.5

R² = 0.9843

-2

Log (1/MIC) prediksi

-2.5 -3 Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) - 1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(MolarRefractivity) (r = 0.992; r2 = 0.98; SE = 0.0679; Fhit/Ftab = 1.096) Gambar 4.1 Grafik korelasi perbandingan Log (1/MIC) eksperimen dan Log (1/MIC) prediksi dengan model persamaan HKSA 2 pada 9 senyawa training sets.

Dari persamaan diatas dapat dilihat bahwa semakin besar nilai deskriptor log D, Harary index, dan Molar refractivity akan meningkatkan aktivitas anti tuberkulosis. Sedangkan semakin kecil nilai deskriptor energi HOMO, energi LUMO, dan Randic Index akan meningkatkan aktivitas anti tuberculosis. Hal ini dikarenakan koefisien pada setiap deskriptor mempengaruhi nilai aktivitas suatu senyawa.

4.1.4 Prediksi aktivitas sample sets Sampel yang digunakan yaitu 11 senyawa amidasi EPMS dan EPHS (etil p-hidroksisinamat) dibuat bentuk strukturnya dan dihitung nilai deskriptor terpilih pada persamaan HKSA kedua. Senyawa yang diujikan merupakan senyawa yang dimungkinkan dapat disintesis, sehingga nantinya dapat dilakukan uji in-vitro aktivitas antituberkulosis pada senyawa tersebut.


47

Sebelum

melakukan

proses

perhitungan

deskriptor

pada

Hyperchem maupun Marvinsketch, dilakukan optimasi yang sama seperti perhitungan deskriptor pada training sets dan test sets, yaitu menggunakan metode semiempirik AM1 pada Hyperchem dan dilakukan clean 3D pada marvin sketch. Setelah semua data deskriptor di

dapat,

dengan menggunakan Microsoft excel

semua data

direkapitulasi dan dilakukan perhitungan MIC prediksi senyawa sampel. Tabel 4.10 Data sample sets No.

Kode Senyawa

Nama IUPAC

Struktur

1

Amida_1

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2enamide

2

Amida_2

(2E)-N-hydroxy-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide

3

Amida_3

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-methylprop2-enamide

4

Amida_4

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N,Ndimethylprop-2-enamide

5

Amida_5

(2E)-N-(hydroxymethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide

6

Amida_6

(2E)-N,N-bis(hydroxymethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide


48

7

Amida_7

(2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide

8

Amida_8

(2E)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide

9

Amida_9

(2E)-N-benzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop2-enamide

10

Amida_10

ethyl (2E)-3-(4-aminophenyl)prop-2enoate

11

Amida_11

(2E)-N,N-dibenzyl-3-(4methoxyphenyl)prop-2-enamide

12

EPHS

ethyl (2E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2enoate

Catatan: Untuk mempermudah analisa data, nama senyawa IUPAC diganti dengan kode senyawa Tabel 4.11 Data deskriptor sample sets No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kode Senyawa Amida_1 Amida_2 Amida_3 Amida_4 Amida_5 Amida_6 Amida_7 Amida_8 Amida_9 Amida_10 Amida_11 EPHS

Log D 1.171 1.165 1.395 1.619 0.815 0.459 0.705 0.239 3.12 2.043 5.068 2.564

Energi HOMO -8.866 -9.01 -8.842 -8.862 -8.942 -9.022 -8.862 -8.891 -8.874 -8.527 -8.673 -9.039

Energi LUMO -0.484 -0.737 -0.468 -0.505 -0.544 -0.546 -0.491 -0.472 -0.279 -0.528 -0.204 -0.698

Harary Index 32.302 35.874 35.874 39.946 39.412 47.938 42.951 56.083 60.358 35.697 97.07 35.697

Randic Index 10.791 11.329 12.003 13.214 12.563 14.335 13.813 16.835 16.678 12.041 22.565 11.669

Molar Refractivity 55.4 56.87 60.29 65.19 61.39 67.39 66.58 77.77 89.04 60.27 122.69 58.32


49

Tabel 4.12 Data aktivitas prediksi sample sets menggunakan persamaan HKSA 2

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Kode Senyawa Amida_11 Amida_9 EPHS Amida_2 Amida_4 Amida_1 Amida_3 Amida_5 Amida_10 Amida_6 Amida_7 Amida_8

log(1/MIC) 2.122 -0.916 -2.466 -2.779 -3.401 -3.548 -3.586 -3.655 -3.662 -3.870 -3.935 -4.269

MIC prediksi (μM) 0.008 8.249 292.434 601.082 2518.767 3530.954 3856.257 4519.205 4587.203 7410.952 8619.499 18581.125

Keterangan: MIC EPMS = 485 μM

Dari tabel diatas dapat dilihat 3 senyawa yang memiliki nilai MIC terkecil bila dibandingkan dengan EPMS, yaitu Amida_11, Amida_9, dan EPHS. Prediksi aktivitas pada senyawa amida_11 adalah 0,008 μM, amida_9 adalah 8,249 μM, dan EPHS adalah 292,434 μM. Bila dilihat dari data deskriptor yang berpengaruh terhadap aktivitas, pada amida_11 terdapat deskriptor yang memiliki nilai yang besar yaitu Log D, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity. Hal ini berbanding lurus dengan persamaan yang digunakan, semakin besar deskriptor Log D, Harary index, dan Molar refractivity, aktivitas semakin besar (MIC kecil).Walaupun nilai randic index senyawa amida_11 besar yang seharusnya kecil, hal ini tidak terlalu berpengaruh dan juga untuk nilai deskrptor lainnya tidak terlalu berbeda nilainya dengan deskriptor senyawa lain. Pada amida_9 sama seperti dengan senyawa amida_11 deskriptor yang memiliki nilai terbesar adalah Log D, Harary index, Randic index, dan Molar refractivity.


50

Untuk senyawa EPHS (etil p-hidroksi sinamat), peneliti mencoba melihat pengaruh modifikasi pada gugus metoksi pada cincin benzene EPMS, yaitu menggantinya dengan gugus hidroksi pada posisi para. Terlihat bahwa hal ini mempengaruhi nilai energi HOMO dan energi LUMO yang lebih kecil dari senyawa lainnya. Sedangkan untuk deskriptor lainnya, nilainya tidak terlalu berbeda dengan deskriptor senyawa lain. Tetapi peningkatan aktivitas pada EPHS tidak terlalu jauh dengan MIC EPMS, sehingga perubahan gugus metoksi menjadi hidroksi tidak terlalu berpengaruh pada aktivitas anti-tuberkulosis.

EPMS

EPHS

Amida_9

Amida_11

Gambar 4.2 Perbandingan Struktur EPMS, EPHS, Amida_9, dan Amida_11

Penelitian yang dilakukan oleh De et al., (2011), tentang desain, sintesis, dan uji aktivitas anti-tuberkulosis senyawa turuan asam sinamat baru, menyatakan bahwa gugus samping pada posisi para cincin benzene asam sinamat berperan penting terhadap sifat lipofilitas senyawanya. Sedangkan gugus samping karbonil asam sinamat, yang pada penelitian ini digantikan oleh gugus amina, merupakan gugus mirip obat (drug-like molecule) yang berperan penting dalam aktivitas anti tuberkulosisnya. Berdasarkan hal itu, pada amida_9 dan amida_11 memiliki aktivitas yang baik kemungkinan karena adanya gugus benzilamin dan dibenzilamin yang memiliki kemiripin dengan struktur isoniazid.


51

4.2 Penambatan molekuler 4.2.1 Penyiapan dan optimasi makromolekul enzim Inh A Dalam proses penambatan molekul, hal yang harus disiapkan adalah makromolekul dan ligan yang akan ditambatkan, kemudian dilakukan optimasi terhadap makromolekul dan ligan tersebut. Penyiapan makromolekul pada penelitian ini adalah dengan cara mengunduh makromolekul enzim Inh A dalam 3D pada Protein Data Bank (http://www.rcsb.org). Enzim Inh A yang di unduh dengan format .pdb adalah makromolekul dengan kode 1ENY dan merupakan enzim Inh A pada Mycobacterium tuberculosis yang diperoleh dari kristalografi sinar X dengan resolusi 2,20 Å. Pemilihan kode 1ENY mengacu pada penelitian sebelumnya yang telah dilakukan oleh Cohen et a.,(2011), tentang penambatan molekul pada enzim Inh A. Enzim Inh A yang telah diunduh kemudian dilakukan optimasi makromolekul. Optimasi bertujuan untuk menghilangkan molekul non standar dan menargetkan ruang tambat ligan pada makromolekul. Molekul non standar seperti ligan dan molekul air yang ikut terunduh dihilangkan dengan menggunakan program Discovery studio, dengan cara, Pilih ScriptSelectionSelect water molecul dan ligandelete. Dengan menghilangkan molekul air dan ligan, makromolekul nantinya akan tepat menambat pada senyawa uji (ligan sampel). Enzim Inh A yang telah teroptimasi dengan menggunakan program Discovery studio kemudian di simpan dalam format .pdb. Optimasi kedua yang dilakukan adalah penambahan atom hidrogen dan penentuan grid box parameter menggunakan program Autodock tools. Penambahan atom hidrogen penting untuk interaksi ligan dan reseptor. Atom hidrogen yang diperhitungkan adalah yang bersifat polar, karena atom ini terlibat dalam ikatan hidrogen (Yanuar, 2012). Proses penambahan atom hidrogen adalah, pilih EditHydrogenAddOk. Setelah dilakukan penambahan atom hidrogen, dilakukan optimasi grid box parameter. Optimasi grid box parameter berfungsi untuk membuat peta tiga dimensi interaksi protein dengan setiap jenis atom yang terdapat pada ligan (Yanuar, 2012).


52

Peta tiga dimensi tersebut merupakan ruang tambat antara makromolekul dan ligan. Penentuan grid box parameter bisa melalui pencarian literatur atau melihat ruang tambat ligan yang berasal dari makromolekul itu sendiri. Pada penelitian ini grid box parameter mengikuti penelitian yang dilakukan oleh Cohen et al., (2011). Pengaturan pada grid box meliputi center_x, center_y, center_z, untuk mengatur letak parameter box pada makromolekul. Kemudian size_x, size_y, size_z, dan spacing (angstrom), untuk menentukan ukuran grid box sebagai ruang tambat ligan tersebut. Hasil pengaturan grid box yang diperoleh adalah center_x = -3.609, center_y = 37.853 center_z = 18.312, size_x = 37, size_y = 22, size_z = 22, dan spacing (angstrom) = 0,375. Cara pengaturan grid box adalah dengan

pilih

Gridgrid

boxatur

grid

box

parameter

yang

adafileclose saving current. Setelah semua optimasi selesai, makromolekul tersebut di simpan dalam format .pdbqt, untuk selanjutnya akan dilakukan proses penambatan molekul dengan program autodock vina.

4.2.3 Penyiapan dan optimasi ligan (senyawa uji) Ligan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 12 senyawa amidasi etil p-metoksi sinamat dengan kontrol positifnya adalah isoniazid. Senyawa yang digunakan dianggap sebagai bukan pro-drug, sehingga tidak berikatan dengan NADH untuk berinteraksi dengan enzim Inh A. Hal ini dikarenakan belum diketahui secara langsung bagaimana proses senyawa amidasi EPMS berinteraksi dengan enzim Inh A. Sedangkan telah diketahui, suatu senyawa yang berinteraksi dengan enzim Inh A tidak selalu berikatan dengan NADH.


53

Tabel 4.13 Senyawa ligan yang akan di-docking

No.

Nama Senyawa (IUPAC)

Kode Senyawa

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

1

Amida_1

(2E)-N-hydroxy-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

2

Amida_2

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N-methylprop-2-enamide 3

Amida_3

(2E)-3-(4-methoxyphenyl)-N,N-dimethylprop-2-enamide

4

Amida_4

(2E)-N-(hydroxymethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

5

Amida_5


54

(2E)-N,N-bis(hydroxymethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2enamide 6

Amida_6

(2E)-N-(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide 7

Amida_7

(2E)-N,N-bis(2-hydroxyethyl)-3-(4-methoxyphenyl)prop-2enamide

8

Amida_8

(2E)-N-benzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

9

Amida_9

ethyl (2E)-3-(4-aminophenyl)prop-2-enoate

10

Amida_10


55

(2E)-N,N-dibenzyl-3-(4-methoxyphenyl)prop-2-enamide

11

amida_11

ethyl (2E)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate

12

EPHS

Isoniazid

13

INH

Senyawa tersebut dibuat dengan menggunakan aplikasi Marvin sketch, setelah proses pembuatan selesai, struktur yang dibuat kemudian dilakukan clean 3D, dengan cara, pilih structurepilih cleaning method fine with hydrogenizeclean in 3D. Struktur kemudian disimpan dalam format .mol. Untuk bisa dilakukan optimasi ligan dengan

menggunakan

program

autodocktools,

maka

dilakukan

perubahan format .mol menjadi .pdb dengan menggunakan program open babel. Struktur dengan format .pdb kemudian dioptimasi number of active torsion-nya. Proses ini berfungsi untuk menentukan ikatan-ikatan aktif pada ligan yang dapat diputar selama proses docking berlangsung. Proses pengoptimasian dengan cara, pilih ligandtorsion treeset number of torsiondismiss. Kemudian di simpan dalam format .pdbqt, dengan cara pilih ligandoutputsave as pdbqt.


56

4.2.4 Penambatan molekul dengan Autodockvina Setelah data makromolekul dan ligan selesai di optimasi dan di ubah format file menjadi .pdbqt. Kedua data tersebut kemudian di pindahkan ke dalam folder vina yang terdapat pada local disc (C:). Dalam folder vina kemudian juga ditambahkan file konfigurasi menggunakan notepad, proses konfigurasi dapat dilihat pada lampiran 3. Data konfigurasi pada notepad, meliputi reseptor yang merupakan makromolekul yang digunakan yaitu 1ENY.pdbqt dan ligan yang merupakan senyawa uji dengan format .pdbqt. Selanjutnya data out.pdbqt merupakan hasil dari visualisasi docking ligan pada makromolekul dan log.txt merupakan nilai energi bebas (ΔGbind) yang akan keluar setelah proses docking selesai. Dan terakhir adalah data center_x, center_y, center_z, size_x, size_y, dan size_z yang merupakan grid box parameter yang sudah diatur sebelumnya. File konfigurasi ini disimpan dengan nama ‘conf.txt.’ Setelah semua data yang ada difolder vina sudah lengkap, yaitu 1ENY.pdbqt, Ligand.pdbqt, dan conf.txt, maka proses docking dapat dimulai. Proses docking dijalankan dengan program Command Prompt. Melalui Command Prompt, masuk kedalam folder vina kemudian dilakukan perintah dengan mengetik: Vina --config conf.txt --log log.txt Proses docking pada penelitian ini berjalan selama 2-5 menit, kecepatan dari proses docking dipengaruhi oleh spesifikasi computer dan bentuk ligan yang ditambatkan. Semakin tinggi spesifikasi atau semakin sederhana bentuk ligan, maka semakin cepat proses docking berlangsung. Setelah proses docking selesai, akan muncul data baru pada folder vina, yaitu log.txt dan out.pdbqt. Data log.txt memberikan hasil nilai afinitas/energi bebas (ΔGbind) dan RMSD dari hasil docking. Sedangkan data out.pdbqt merupakan bentuk hasil konformasi ligan dengan ruang tambatnya pada makromolekul. Data tersebut dapat divisualisasi dengan program autodock tools, Pymol, dan Ligplot, untuk dilihat interaksi ligan dengan asam amino pada makromolekul.


57

4.2.5 Analisa dan Visualisasi Penambatan Molekuler Hasil yang didapat dari proses penambatan molekuler adalah nilai ΔGbind dan RMSD, serta visualisasi interaksi ligan dengan asam amino pada enzim Inh A. Nilai ΔGbind merupakan energi konformasi hasil docking antara ligan dan makromolekul, energi konformasi tersebut merupakan kontribusi dari ikatan van der waal, hidrofobik, ikatan hidrogen dari atom-atom netral, ikatan hidrogen atom-atom bermuatan, dan jumlah ikatan berotasi (Adelin et al., 2013). Sedangkan RMSD (root mean square deviation), merupakan nilai validasi dari hasil ΔGbind, semakin kecil nilai RMSD maka konformasi yang terbentuk semakin baik, sehingga nilai RMSD yang diambil adalah mendekati atau sama dengan 0. Interaksi ligan dan asam-asam amino pada enzim Inh A yang terlihat melalui progam ligplot adalah adanya ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik secara 2 dimensi, sedangkan pada program Pymol visualisasi yang terlihat adalah tempat penambatan ligan pada makromolekulnya yang disebut dengan binding pocket secara 3 dimensi. Proses visualisasi pada Ligplot adalah dengan cara membuka file ligan hasil docking dan makromolekul dengan format .pdb, dengan cara, filepdb filecari file yang akan divisualisasiOkRun. Kemudian, visualisasi pada pymol dengan cara membuka file ligan out.pdbqt dan makromolekul (1ENY.pdbqt). Prosesnya dengan cara pilih openpilih file out.pbqt dan 1ENY.pdbqtok, dan untuk melihat daerah binding pocket ligan dengan makromolekul dengan cara allactionpresetligand sitepilih tampilan yang diinginkan (misalkan, solid better)klik kiri. Hasil visualisasi dengan program Ligplot dan Pymol dapat dilihat pada Lampiran 4.


58

Tabel 4.14 Hasil Penambatan molekuler Struktur

∆Gbind

Ikatan Hidrogen

Amida_11

-9.4

Gly96

Amida_9

-8.4

Thr39

Amida_2 Amida_7 Amida_5

-7.2 -7.1 -6.9

Thr39, Gly14 Gly14, Ala22, Ser94 Ile21, Ala22, ser94

Amida_3

-6.7

Thr39

Amida_1

-6.6

Thr39, Gly14

Amida_4

-6.6

Thr39

Amida_8

-6.5

Gly14, Ala22, Ser94

Amida_6

-6.4

Amida_10 EPHS Isoniazid

Jenis asam amino Ikatan Hidrofobik Thr39, Val65, Gly14, Ala198, Ser13, Leu63, Ile95, Asp42, Ile15, Phe41, Ile47, Ile16 Leu63, Gly14, Ser13, Ile95, Val65, Phe97, Gly96, Asp42, Ile15, Ile16, Phe41, Met130 Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122 Phe41, Val65, Gly96, Ile16, Ser20, Ile21, Ile95, Asp64 Asp64, Ile95, Gly96, Ile16, Ser20, Gly14, Phe41 Leu63, Val65, Phe41, Phe97, Gly96, Ile95, Ser13, Gly14, Met130 Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122 Ser13, Gly14, Leu63, Phe41, Ile16, Ile95, Val65, Met130 Ile95, Ile122, Gly96, Ile16, Ser20, Thr196, Ile21, Phe41, Val65

-6.1

Gly14, Ala22, Ser94, Ile21, Gly96 Thr39

Ile95, Leu63, Phe41, Phe97, Gly14, Val65

-6.1 -6

Thr39 Thr39, Gly14

Gly14, Phe41, Phe97, Val65, Ile95, Leu63 Ile22, Ser13, Gly40, Ile95, Leu63, Phe41, Val65

Ile16, Phe41, Ile95, Ser20, Ile15, Asp42

Dari tabel 4.14 nilai ∆Gbind tiga senyawa terkecil adalah senyawa dengan kode Amida_11, Amida_9, dan Amida_2, dengan nilai energi -9,4 kcal/mol, -8,4 kcal/mol, dan -7,2 kcal/mol. Nilai ∆Gbind kecil menandakan bahwa konformasi yang terbentuk antara ligan dengan makromolekul merupakan kompleks yang stabil. Selain itu, bisa dilihat bahwa isoniazid yang merupakan kontrol positif pada docking memilki nilai ∆Gbind besar yaitu -6, hal ini membuktikan bahwa isoniazid memang harus berikatan dengan NADH untuk membentuk konformasi yang stabil dengan enzim Inh A.


59

Senyawa

Visualisasi Ligplot

Visualisasi Pymol

INH

Amida_11

Amida_9


60

Amida_2

Keterangan:

C=hitam,

O=Merah,

N=biru, ikatan hidrogen=garis hijau,

Keterangan: C=hijau, O=merah, N=biru, H=putih, P=jingga

dan ikatan hidrofobik= garis merah menyerupai alis

Gambar 4.3 Visualisasi interaksi Makromolekul dan Ligan (Isoniazid dan 3 senyawa uji dengan ∆Gbind terendah)

Dilihat dari residu asam amino yang berinteraksi, isoniazid berikatan hidrogen dengan Thr39 dan Gly14, sedangkan untuk yang berikatan hidrofobik adalah dengan asam amino Ile22, Ser13, Gly40, Ile95, Leu63, Phe41, Val65. Selanjutnya pada 3 senyawa dengan ∆Gbind terendah. Amida_11 dan Amida_9 memilki jumlah residu asam amino yang sama yaitu 13 asam amino dan lebih banyak dari amida_2. Amida_11 berikatan hidrogen dengan Gly96, dan berikatan hidrofobik dengan Thr39, Val65, Gly14, Ala198, Ser13, Leu63, Ile95, Asp42, Ile15, Phe41, Ile47, Ile16. Amida_9 berikatan hidrogen dengan Thr39, dan berikatan hidrofobik dengan Leu63, Gly14, Ser13, Ile95, Val65, Phe97, Gly96, Asp42, Ile15, Ile16, Phe41, Met130. Sedangkan pada Amida_2 hanya berikatan dengan 8 asam amino, yaitu Thr39 dan Gly14 yang berikatan hidrogen, serta Phe97, Phe41, Ser13,Ile95, Leu63, Ile122 yang berikatan hidrofobik.


61

Ikatan hidrogen merupakan ikatan antara atom H yang mempunyai muatan positif parsial dengan atom lain yang bersifat elektronegatifan dan mempunyai sepasang oktet lengkap, seperti O, N, dan F. Adanya ikatan hidrogen dapat mempengaruhi sifat fisika kimia obat, sehingga berperan penting terhadap aktivitas biologis obat. Sedangkan ikatan hidrofobik adalah ikatan yang menggambungkan daerah non polar molekul obat dengan daerah non polar pada reseptor biologis (Siswando, 2008). Oleh karena itu, ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik mempengaruhi kestabilan konformasi yang terjadi antara ligan dan makromolekul. Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Eghdami, et al (2015) tentang target ikatan isoniazid dengan enzim Inh A, menyatakan bahwa situs aktivitas enzim Inh A, dicirikan dengan adanya 5 asam amino, yaitu G1y14, Thr39, Phe41, Leu63 and Ile95. Berdasarkan hal tersebut, Senyawa dengan nilai ∆Gbind terendah yaitu amida_11 telah tepat menambat pada binding pocket enzim Inh A untuk memberikan aktivitas anti-tuberkulosis. Tabel 4.15 Perbanding ∆Gbind dan MIC prediksi

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Struktur Amida_11 Amida_9 Amida_2 Amida_7 Amida_5 Amida_3 Amida_1 Amida_4 Amida_8 Amida_6 Amida_10 EPHS

Penambatan molekuler ∆Gbind (Kcal/mol) -9.4 -8.4 -7.2 -7.1 -6.9 -6.7 -6.6 -6.6 -6.5 -6.4 -6.1 -6.1

HKSA MIC prediksi (μM) 0.008 8.249 601.082 8619.5 4519.21 3856.26 3530.95 2518.77 18581.1 7410.95 4587.2 292.434


62

Dari tabel 4.15 terlihat bahwa senyawa dengan kode amida_11 selain memiliki nilai ∆Gbind terendah (-9,4 Kcal/mol), juga memiliki MIC prediksi terkecil yaitu 0,008 μM. Diketahui bahwa MIC Isoniazid yang merupakan pengobatan lini pertama tuberkulosis adalah 0,03–0,06 μg/ml (Zhang et al, 2005), bila dikonversikan dalam satuan molar yaitu membagi dengan berat molekulnya (137,14 g/mol) (Depkes, 1995), maka didapat MIC isoniazid adalah 0,219-0,438 μM. Berdasarkan hal tersebut, nilai MIC prediksi amida_11 memiliki aktivitas sekitar 100 kali lebih baik dari isoniazid. Walaupun MIC prediksi amida_11 lebih kecil dari isoniazid, nilai tersebut hanya didapat dari perhitungan aktivitas senyawa yang dibandingkan dengan sifat fisika-kimianya, sehingga perlu dilakukan uji selanjutnya, seperti uji in-vitro senyawa dengan kode amida_11 pada Mycobacterium tuberculosis langsung. Karena tujuan dari penggunaan model HKSA adalah proses awal dalam rancangan obat dalam usaha mendapatkan suatu obat baru dengan aktivitas yang lebih besar, keselektifan yang lebih tinggi, toksisitas atau efek samping sekecil mungkin dan kenyamanan yang lebih besar, dengan biaya yang lebih ekonomis, waktu yang lebih singkat, dan dapat menekan faktor cobacoba sekecil mungkin dalam sintesis kandidat senyawa uji, sehingga jalur sintesis menjadi lebih pendek (Siswandono, 2008).


BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan a.

Hasil analisa hubungan kuantitatif struktur-aktivitas (HKSA) pendekatan Hansch, deskriptor yang mempengaruhi aktivitas anti-tuberkulosis adalah LogD, energi HOMO, energi LUMO, Randic Index, Harary Index, dan Molar refractitvity. Dengan persamaan: Log(1/MIC) = -18.7 + 0.298(logD) -1.22(Energi HOMO) - 2.812(Energi LUMO) + 0.034(Harary Index) - 1.106(Randic Index) + 0.243(Molar Refractivity).

b. Hasil penambatan molekuler dan persamaan HKSA, senyawa dengan kode amida_11 yaitu ((2E)-N,N-dibenzyl-3-(4- methoxyphenyl)prop-2enamide) memiliki nilai ΔGbind terendah yaitu, -9,4 dengan MIC prediksi 0,008 μM.

5.2 Saran

Hasil data aktivitas anti-tuberkulosis (MIC) yang didapat merupakan nilai prediksi yang dilihat dari sifat fisika-kimia senyawa dan penambatan molekuler pada enzim Inh A Mycobacterium tuberculosis. Sehingga dibutuhkan pengujian lebih lanjut seperti uji in-vitro dan in-vivo terhadap senyawa Amidasi EPMS dengan aktivitas anti-tuberkulosis terbaik.

63


DAFTAR PUSTAKA Accelrys Enterprise Platform. (2005). Introduction to the Discovery Studio Visualizer. San Diego, California, U.S.A: Accelrys Software Inc Adelin, et al (2013). Penambatan molekuler kurkumin dan analognya pada enzim Siklooksigenase-2. Jurnal Medika Veterinaria. Vol. 7, No. 1, Februari 2013 Barus, rosbiana. (2009).

Amidasi Etil p-metoksisinamat yang diisolasi dari

Kencur (Kaempheria Galanga, Linn),USU Repository Bultink, P., Winter, H. D., Langenaeker, W. dan Tollenaere, J. P., 2004, Computational Medicinal Chemistry for Drug Discovery, Marcel Dekker, Inc., New York Chemaxon, (2014) Log P and Log D Calculation. ChemAxon docs. https://docs.chemaxon.com/display/CALCPLUGS/LogP+and+logD+calcu lations Cohen et al. (2011). Effect of the explicit flexibility of the InhA enzyme from Mycobacterium tuberculosis in molecular docking simulations. BMC Genomic. Ouro Preto, Brazil Darmin Sumardjo. 2008. Pengantar Kimia. Jakarta: EGC. Dash, Pritesh Ranjan , et al. (2014). In vivo cytotoxic and In vitro antibacterial activities of Kaempferia galangal.

Journal of Pharmacognosy and

Phytochemistry 2014; 3 (1): 172-177 DBM, Virupakshaiah, et al. In Silico Designing of Methicillin Antibiotic Analog for The Treatment of Staphylococcus aureus. Journal of Advanced Bioinformatics Applications and Research ISSN 0976-2604.Online ISSN 2278–6007 Vol 5, Issue1, 2014, pp33-36 De, et al (2011). Design, Synthesis, and Biological Evaluation of New Cinnamic Derivatives as Antituberculosis Agents. Journal of medicinal chemistry. France DeLano, W. L., & Bromberg, S. (2004). PyMOL User's Guide. San Carlos, California, U.S.A: DeLano Scientific LLC. Departemen Kesehatan Republik Indonesia (1995), Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. 64


65

Depkes RI. (2005). Pharmaceutical Care untuk Penyakit Tuberkulosis. Direktorat Bina Farmasi Kominitas dan Klinik: Jakarta. Depkes RI. (2011). Pedoman Nasional Pengendalian Tuberkulosis, Edisi 2 Cetakan Tahun 2011: Jakarta. Eghdami, et al (2015). Investigation of Physicochemical Properties of Isoniazid and

its

Target

Protein-Ligand

Docking.

Biological

Forum–An

International Journal 7(1): 1248-1255(2015). Fatimah, Nur Fitri. (2008). Aplikasi Metode MLR dan PCR pada Analisis Hubungan Kuantitatif Struktutr dan Aktivitas Antitoksoplasma Senyawa Turunan Kuinolon Berdasarkan Deskriptor Teoritik. Jurusan Kimia FMIPA UGM: Yogyakarta. Fessenden, R. J., Fessenden, J. S. (1999), Kimia Organik, Jilid 1, Edisi ketiga, Penerbit Erlangga, Jakarta. Funkhouser, T. (2007). Protein-Ligand Docking Methods. Princeton, New Jersey, U.S.A: Princeton University. Goodman and Gilman. (2005). Dasar Farmakologi Terapi Edisi 10. Jakarta: EGC Gusmita, W., Mustafa, D., & Emdeniz. (2013). Studi Toksisitas Nitro Anilin Berdasarkan Hubungan Kuantitatif Struktur-Aktivitas (HKSA) Toksis Amina Aromatik. Jurnal Kimia Unand (ISSN No. 2303-3401), Volume 2 Nomor 1, Maret 2011. Guzman, et al, (2014). 2-Hydroxy-substituted cinnamic acids and acetanilides are selective growth inhibitors of Mycobacterium tuberculosis. Med. Chem. Commun., 2014, 5, 47. Pranowo, Harno D. 2009. Peran Kimia Komputasi dalam Desain Molekul Obat. Yogyakarta : Universitas Gadjah Mada. He, xin, et al. (2007). Inhibition of the Mycobacterium tuberculosis enoyl acyl carrier protein reductase InhA by arylamides. Bioorg. Med. Chem. 15 (2007) 6649–6658. Katritzky, A.R., Karelson, M., dan Lobanov, V.S., 1996, Quantum-Chemical Descriptors in QSAR/QSPR Studies, J. Am. Chem. Soc. 96, 3, 1027 -1044.


66

Katzung, Bertram G. (2004) Farmakologi Dasar dan Klinik edisi 4. Alih bahasa : Staf Dosen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Sriwijaya. Jakarta : EGC. Kolyva, A.S., Karakousis, P.C. (2012). Old and New TB Drugs: Mechanisms of Action and Resistance . USA: Johns Hopkins University Center for Tuberculosis Research Baltimore, M.D., Kubinyi, H. (1993). QSAR: Hancsh Analysis and Related Approaches, VCH Verlaggesellschaft, Wienhem. Lakshmanan et al, (2011). Ethyl pmethoxycinnamate isolated from a traditional anti-tuberculosis medicinal herb inhibits drug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis in vitro. Fitoterapia. In Press, Corrected Proof. Mukesh, B., & Rakesh, K. (2011). Molecular Docking : A Review. IJRAP. Nofriyanda. (2010). Analisis Molekuler Pada Proses Resistensi Mikrobakterium tuberculosis terhadap Obat-Obat Anti Tuberkulosis. Bagian Pulmonologi dan Ilmu Kedokteran Respirasi FK UNAND dan RS.DR.M.DJAMIL PADANG. Patrick, G. (2001). Instant Notes in Medicinal Chemistry. Oxford: BIOS Scientific Publisher. Poeloengan, M, I. Komala and S.M. Noor ( 2007). Bahaya dan Penanganan Tuberculosis.Lokakarya Nasional Zoonosis . Balai Penelitian Veteriner Bogor. Rifai, et al. (2014). Kajian HKSA Senyawa Turunan Deoksibenzoin terhadap Aktivitas Antioksidan Menggunakan Analisis Regresi Multilinier. Indo. J. Chem. Sci. 3 (3) (2014) Indonesian Journal of Chemical Science. Robitzek, E. H. and I. J. Selikoff (1952). "Hydrazine derivatives of isonicotinic acid (rimifon marsilid) in the treatment of active progressive caseouspneumonic tuberculosis; a preliminary report." Am Rev Tuberc 65(4): 402-428. Siswandono, (2008). Kimia Medisinal edisi 2 cetakan 2 jilid 1. Surabaya: Airlangga University Press.


67

Techaprasan J, Klinbunga S, Ngamriabsakul C, Jenjittikul T (2010). Genetic variation of Kaempferia (Zingiberaceae) in Thailand based on chloroplast DNA (psbA-trnH and petA-psbJ) sequences. Genet. Mol. Res., 9: 19571973. Todeschini et al.,(2009) Molecular descriptor for Cheminformatics. Volume I & II. Wiley-VCH Umar, et al. (2011) Phytochemistry and medicinal properties of Kaempferia galanga L. (Zingiberaceae) extracts African Journal of Pharmacy and Pharmacology Vol. 5(14), pp. 1638-1647, 15 October, 2011. WHO,2015,

Health

Topics

Tuberculosis

http://www.who.int/topics/tuberculosis/en/. Yanuar, Arry. 2012. Penambatan molekular: Praktek dan Aplikasi Virtual Screening. Depok: Fakultas Farmasi UI. Zhang, Y.et al. ( 2005 ). Mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. In Tuberculosis and the Tubercle Bacillus, 2nd edn, pp. 115– 140. Edited by S. T. Cole and others. Washington, DC: American Society for Microbiology.


LAMPIRAN Lampiran 1. Alur Penelitian 1.1 Hubungan Kuantitatif Struktur Aktivitas Model Pendekatan Hansch Pencarian literatur data anti-tb (MIC) turunan asam sinamat beserta strukturnya (Data sets)

Training sets

Pemilihan dan Perhitungan deskriptor

Membangun persamaan HKSA

Struktur senyawa amidasi EPMS

Test sets



Validasi Persamaan HKSA

Persamaan HKSA

Prediksi aktivitas anti-tb senyawa amidasi Etil p-Metoksisinamat

68


69

1.2 Penambatan Molekul Penyiapan struktur molekul enzim InhA, dengan v mengunduh struktur dari Bank Data Protein (http://www.rcsb.org/pdb/).

Penyiapan struktur ligan. Ligan yang digunakan adalah struktur senyawa amidasi EPMS. Struktur 3D dibuat dengan program MarvinSketch, simpan dalam format .pdb

Output berupa file 1ENY.pdb

Pemisahan dari pelarut dan ligan atau residu non standar dengan Discovery Studio 4.0 Visualizer. Output berupa file ligan.pdb

Pemisahan dari pelarut dan ligan atau residu non standar dengan Discovery Studio 4.0 Visualizer.

Output berupa file 1ENY.pdb

Pengoptimasian dengan Autodock Tools, yaitu pengaturan number of active torsion.

Pengoptimasian dengan Autodock Tools yang meliputi : penambahan atom hidrogen dan pengaturan grid box parameter.

Output berupa file ligan.pdbqt

Output berupa file 1ENY.pdbqt

Penambatan molekul dengan program autodock vina

Analisis hasil pada nilai log.txt dan visualisasi hasil pada out.pdbqt dengan program Pymol serta Ligplot

Output berupa nilai: 1.

Pose: Posisi dan Orientasi Ligan terhadap Asam Amino Protein 2. ΔGbind


70

Lampiran 2 Prosedur Kerja HKSA 2.1 Pembuatan struktur pada marvin sketch

Setelah struktur dibuat, kemudian dilakukan clean 3D dengan cara: pilih structureclaening methodfine with HydrogenizeClean in 3D

2.2 Perhitungan deskriptor Log D

Proses perhitungan dengan pilih toolspartitioningLogDklik kiri. Akan didapat hasil seperti gambar diatas, kemudian pilih nilai Log D pada pH 7,4 2.3 perhitungan deskriptor Harary dan Randic index

Pilih toolsGeometryTopology Analysisklik kiriOk. Akan muncul hasil nilai Randic dan Harary index (lingkaran merah) seperti pada gambar diatas


71

2.4 Pembuatan struktur pada Hyperchem

Struktur yang telah dibuat kemudian ditambahkan atom hidrogen dengan cara: buildadd H & model buildklik kiri

2.5 Optimasi struktur pada Hyperchem

optimasi dengan cara pilih setupsemiempiricalklik kirikemudian pilih AM1Ok

2.6 Perhitungan deskriptor energi HOMO dan LUMO

Pilih computeGeometry Optimizationklik kiriPilih pada semiempirical optimization “Polak Ribere” Ok


72

Setelah optimasi selesai pilih computeOrbitalsklik kiripilih energi HOMO dan LUMO

2.7 Perhitungan deskriptor momen dipole

Pilih computesingle pointproperties akan didapat tampilan diataspilih momen dipoleok

2.8 Perhitungan deskriptor Molar refractivity

Pilih computeQSAR propertiesPilih RefractivityComputeAkan didapat nilai Molar refractivity


73

2.9 Rekapitulasi Data Deskriptor Training dan Test sets pada Microsoft excel

2.10 Membangun persamaan HKSA

Setelah semua data training set telah di input ke dalam program SPSS, kemudian pilih analyzeRegressionLinierakan muncul tampilan pada gambar disamping. Masukkan data dependent variabel: Log(1/MIC) dan Independent variabel:7 data deskriptorganti method: BackwardOk


74

2.11 Hasil Validasi HKSA pada SPSS Variables Entered/Removed

b

Variables Model 1

Entered

Variables Removed

Method

Molar_Refractivit y, MomenDipole, LogD, E_LUMO,

. Enter

E_HOMO, Harary_Index, a

Randix_Index 2

Backward (criterion: Probability of F-to-remove >=

. MomenDipole

3

.100). Backward (criterion: Probability of F-to-remove >=

. Harary_Index

.100).

a. Tolerance = .000 limits reached. b. Dependent Variable: Log(1/MIC) Model Summary

Model

R

Adjusted R

Std. Error of the

Square

Estimate

R Square

1

.994

a

.988

.908

.083051

2

.992

b

.985

.938

.067998

3

.988

c

.976

.937

.068409

a. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, MomenDipole, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Harary_Index, Randix_Index b. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Harary_Index, Randix_Index c. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Randix_Index


75

d

ANOVA Model 1

2

3

Sum of Squares

df

Mean Square

Fhitung

Regression

.590

7

.084

Residual

.007

1

.007

Total

.597

8

Regression

.588

6

.098

Residual

.009

2

.005

Total

.597

8

Regression

.583

5

.117

Residual

.014

3

.005

Total

.597

8

Sig.

12.218

.217

a

21.179

.046

b

24.906

.012

c

a. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, MomenDipole, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Harary_Index, Randix_Index b. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Harary_Index, Randix_Index c. Predictors: (Constant), Molar_Refractivity, LogD, E_LUMO, E_HOMO, Randix_Index d. Dependent Variable: Log(1/MIC)

Coefficients

a

Standardized Unstandardized Coefficients Model 1

B (Constant)

Coefficients

Std. Error

Beta

-14.130

8.466

.251

.094

E_HOMO

-.693

E_LUMO

t

Sig.

-1.669

.344

1.278

2.677

.228

.955

-.535

-.726

.600

-3.027

.793

-.871

-3.817

.163

MomenDipole

-.068

.116

-.320

-.584

.664

Harary_Index

.044

.044

2.104

.992

.503

Randix_Index

-1.364

.569

-18.640

-2.398

.252

.294

.122

17.387

2.400

.251

LogD

Molar_Refractivity


76

2

(Constant)

-18.700

2.637

-7.092

.019

.298

.039

1.518

7.655

.017

E_HOMO

-1.220

.253

-.943

-4.832

.040

E_LUMO

-2.812

.575

-.809

-4.890

.039

Harary_Index

.034

.034

1.637

1.018

.416

Randix_Index

-1.106

.292

-15.108

-3.781

.063

.243

.070

14.353

3.475

.074

-19.106

2.622

-7.286

.005

.302

.039

1.543

7.789

.004

E_HOMO

-1.226

.254

-.947

-4.824

.017

E_LUMO

-2.828

.578

-.814

-4.889

.016

Randix_Index

-1.083

.293

-14.804

-3.693

.034

0.265

.067

15.681

3.978

.028

LogD

Molar_Refractivity 3

(Constant) LogD

Molar_Refractivity

2.12 Nilai Ftabel

Nilai Ftabel model persamaan 1 (lingkaran merah), nilai Ftabel model persamaan 2 (lingkaran biru), dan nilai Ftabel model persamaan 3 (lingkaran hijau)


77

2.13 Perhitungan Log(1/MIC)prediksi dengan Microsoft Excel

Pada cell K3, ketik persamaan HKSA yang sudah tervalidasi (persamaan HKSA 2) seperti pada lingkaran warna merahUbah deskriptor yang digunakan sesuai letak cellnyakemudian enterdrag kebawah cell K3 untuk melihat data Log(1/MIC)prediksi senyawa lain

Lampiran 3. Prosedur Penambatan Molekuler 3.1 Penyiapan Makromolekul Enzim Inh

Enzim Inh A di unduh dari situs http://www.rcsb.org/pdb/, dengan kode 1ENY. Data enzim yang di dunduh adalah dalam bentuk 3D dengan format .pdb.


78

3.2 Proses penghilangan molekul non standar pada Makromolekul dengan Discovery studio

Pilih scriptselectionSelect water molecule dan Select ligandeletesave as 1ENY.pdb

3.3 Optimasi penambahan atom hidrogen pada makromolekul dengan Autodock tools

Pilih editHydrogenAddall hydrogenOk

3.4 Optimasi Grid Box parameter makromolekul

Pilih GridMacromolecule Choose pilih 1ENYselect moleculeSave as 1ENY.pdbqt


79

Kemudian atur grid option sesuai pada gambar di sampingpilih fileClose saving current

3.5 Konversi format ligan (sampel uji) menjadi .pdb dengan Open Babel

Pada ‘input format’ pilih ‘…’ kemudian dipilih ligan yang akan digunakan. Pada ‘output format’, pilih ‘…’ kemudian pilih destinasi tempat menyimpan. Pastikan format dalam bentuk .pdb. Klik ‘Convert’

3.6 Optimasi number of active torsion pada ligan dengan program Autodock tools

pilih ligandinputopenpilih ligan yang akan dioptimasiTorsion treeSet number of torsionpilih fewest atomsdismisssave as .pdbqt


80

3.7 Penambatan molekul dengan Autodock vina

Proses penambatan molekul dimulai dengan menyalin data ligan.pdbqt dan makromolekul 1ENY.pdbqt yang telah di optimasi pada folder vina di Local Disc (C:). Kemudian ditambah data config file (conf.txt) dengan notepad, pengaturan conf.txt sesuai pengaturan gridbox parameter

3.8 Proses penambatan dengan menggunakan Command prompt

Masuk kedalam folder vina cd “C:\vina” enterketik: vina -–config conf.txt -–log log.txtenter.

3.9 Hasil penambatan molekuler

Akan muncul file baru log.txt dan out.pdbqt. Log.txt merupakan hasil nilai ∆Gbind dan out.pdbqt visualisasi hasil docking ligan dengan makromolekul


81

Lampiran 4. Hasil penambatan molekul dan visualisasinya 1. Isoniazid Ligplot

2. Amida_11 Ligplot

3. Amida_9 Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

Pymol

Nilai RMSD

Pymol

Nilai RMSD


82

4. Amida_2 Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

5. Amida_7 Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

Pymol

Nilai RMSD

6. Amida_5 Ligplot


83

7. Amida_3 Ligplot

8. Amida_1 Ligplot

9. Amida_4 Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

Pymol

Pymol

Nilai RMSD


84

10. Amida_8 Ligplot

11. Amida_6 Ligplot

12. Amida_10 Ligplot

Pymol

Pymol

Pymol

Nilai RMSD

Nilai RMSD

Nilai RMSD


85

13. EPHS Ligplot

Pymol

Nilai RMSD

Keterangan: C=hitam, O=Merah, Keterangan: C=hijau, O=merah, N=biru,

ikatan

hidrogen=garis N=biru, H=putih, P=jingga

hijau, dan ikatan hidrofobik= garis merah menyerupai alis


UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Recommend Documents