UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA SKRIPSI HESTY PRISKA APRINA NIM :

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Analisis Komposisi Asam Amino Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Pada Marshmallow Menggunakan Teknik Kombinasi HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan PCA (Principal Component Analysis)

SKRIPSI

HESTY PRISKA APRINA NIM : 108102000009

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA DESEMBER 2012

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

Analisis Komposisi Asam Amino Gelatin Sapi dan Gelatin Babi Pada Marshmallow Menggunakan Teknik Kombinasi HPLC (High Performance Liquid Chromatography) dan PCA (Principal Component Analysis)

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi

HESTY PRISKA APRINA NIM : 108102000009

FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI JAKARTA DESEMBER 2012

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar

Nama

: Hesty Priska Aprina

NIM

: 108102000009

Tanda Tangan : Tanggal

: 28 Desember 2012

ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Hesty Priska Aprina : Farmasi :Analisis komposisi asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada marshmallow menggunakan teknik kombinasi HPLC dan PCA

Gelatin sering digunakan secara luas dalam industri farmasi dan industri makanan. Dalam industri makanan, gelatin dapat digunakan dalam produk marshmallow yang berfungsi sebagai pembentuk gel dan penstabil. Mengkonsumsi produk yang berasal dari derivat babi tidak diperbolehkan bagi umat muslim. Untuk mengetahui perbedaan profil asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada marshmallow digunakan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Teknik ini cepat dan dapat dipercaya untuk menganalisis asam amino pada gelatin dengan menggunakan detektor fluoresen. Sampel disiapkan dengan menghidrolisis marshmallow dengan HCl dan dilakukan derivatisasi dengan Aminokuinolil-N-hidroksisuksini-midil karbamat (AQC). Asam amino glisin, prolin dan arginin pada gelatin babi memiliki kadar yang lebih tinggi daripada gelatin sapi. Teknik yang digunakan untuk mendeteksi dan mengklasifikasikan antara produk marshmallow yang berasal dari gelatin sapi dan gelatin babi adalah dengan menggunakan analisis komponen utama (PCA) berdasarkan profil asam amino gelatin. Berdasarkan analisis komponen utama didapatkan bahwa teknik ini mampu membedakan komposisi asam amino gelatin babi dan gelatin sapi dalam marshmallow yang dibuat dari gelatin standar dan sampel uji.

Kata kunci : gelatin sapi, gelatin babi, AQC, asam amino, analisis komponen utama (PCA)

ABSTRACT

Nama Program Studi Judul

: Hesty Priska Aprina : Farmasi : Analysis of Amino Acid Composition of Bovine Gelatin and Porcine Gelatin in Marshmallow Using a Combination of HPLC and PCA technique

Gelatin is widely used in the pharmaceutical industry and food industry. In food industry, gelatin can be used in a marshmallow product that serves as a gelling agent and stabilizer. Consume products derived from porcine derivatives prohibited for Muslims. To determine differences in the amino acid profile of bovine gelatin and porcine gelatin in marshmallows used High Performance Liquid Chromatography. This technique is fast and reliable for analysis of amino acids in gelatin using a fluorescent detector. Samples prepared to hydrolyze marshmallow with HCl and derivatization with Aminokuinolil- N- hidroksisuksini- midil carbamate (AQC). The amino acid glycine, proline and arginine in porcine gelatin had higher than bovine gelatin. The technique used to detect and classify between marshmallow products derived from bovine gelatin and porcine gelatin is to use principal component analysis (PCA) based on the amino acid profile of gelatin. Based on principal component analysis found that this technique was able to distinguish the amino acid composition of porcine gelatin and bovine gelatin in marshmallows are made from gelatin standards and test samples.

Keywords: bovine gelatin, porcine gelatin, AQC, amino acids, principal component analysis (PCA)

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa, karena atas berkat dan rahmatnya saya dapat menyelesaikan penulisan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan dalam rangka untuk memenuhi tugas akhir sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Program Studi Farmasi UIN Syarif Hidayatullah, Jakarta. Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, dari masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi ini sangatlah sulit bagi saya untuk menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada : 1. Bapak Prof. DR. (hc) dr. M.K Tadjudin Sp.And, selaku Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. 2. Bapak.Drs.Umar Mansur selaku Ketua Jurusan Program Studi Farmasi 3. Ibu Zilhadia, M.Si, Apt selaku pembimbing I yang telah memberikan ilmu dan bimbingan selama penulisan skripsi ini. 4. Ibu Nurmeilis, M.Si, Apt, selaku pembimbing II yang telah memberikan masukan dan kemudahan selama penelitian dan penulisan skripsi ini. 5. Ibu Eka Putri, M.Si, Apt selaku dosen pembimbing akademik yang telah membimbing dan memberikan pengarahan kepada saya selama masa perkuliahan. 6. Bapak dan Ibu dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi FKIK UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

7. Teman teman zulfa, mega A, megawati, eva, inda dan nana yang telah membantu selama penelitian. 8. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut membantu menyelesaikan skripsi ini. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena itu kritik dan saran yang bersifat membangun sangat penulis harapkan guna tercapainya kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akademis, khususnya bagi mahasiswa farmasi, masyarakat pada umumnya dan bagi dunia ilmu pengetahuan.

Jakarta, November 2012

Penulis

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama

: Hesty Priska Aprina

NIM

: 108102000009

Program studi

: Farmasi

Fakultas

: Kedokteran dan Ilmu Kesehatan

Jenis karya

: Skripsi

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi / karya ilmiah saya, dengan judul :

ANALISIS KOMPOSISI ASAM AMINO GELATIN SAPI DAN GELATIN BABI PADA MARSHMALLOW MENGGUNAKAN TEKNIK KOMBINASI HPLC DAN PCA Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta. Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.

Dibuat di Pada tanggal

: Jakarta : 28 Desember 2012

Yang menyatakan,

(Hesty Priska Aprina)

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMANJUDUL...............................................................................................ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS................................................iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ....................... .........................iv HALAMAN PENGESAHAN ....................................................... ........................v ABSTRAK .................................................................................. ..........................vi ABSTRACT ............................................................................... ..........................vii KATA PENGANTAR .............................................................. ..........................viii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ..... .................x DAFTAR ISI .................................................................................... .....................xi DAFTAR TABEL ......................................................................... ......................xii DAFTAR GAMBAR ................................................................. .........................xiii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................ ..........................xiv BAB I

PENDAHULUAN ............................................................ .....................1 1.1 Latar Belakang .......................................................... ........................1 1.2 Rumusan Masalah............................................................ .................3 1.3 Tujuan Penelitian ......................................................... .....................3 1.4 Manfaat Penelitian ...................................................... .....................3

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA .................................................. .....................4 2.1 Gelatin ...................................................................... ........................4 2.1.1 Pengertian Gelatin ....................................... ......................4 2.1.2 Tipe Gelatin .................................................. ....................6 2.1.3 Komposisi gelatin ............................................. .................6 2.2 Protein .............................................................................. .................7 2.3 Kolagen .......................................................................... ...................8 2.4 Marshmallow .................................................................... ................8 2.5 Asam Amino .................................................................... .................9 2.5.1 Pembagian asam amino .................................. .................10 2.5.2Analisis Asam Amino ...................................... .................11 2.6 Analisis asam amino dengan HPLC .............................. .................12 2.6.1 HPLC .............................................................. .................13

2.6.2 Analisis komponen utama (PCA) .................. .................16 BAB III METODOLOGI PENELITIAN ........................................ .................17 3.1 Lokasi dan waktu penelitian .................................... .......................17 3.2 Alat dan Bahan ....................................................... ........................17 3.2.1 Alat .................................................................... ....................17 3.2.2 Bahan ..................................................... ................................17 3.3 Prosedur kerja ................................................. ................................18 3.3.1 Pengumpulan produk marshmallow uji coba . .................18 3.3.2 Pembuatan marshmallow .......................... .......................18 3.3.3 Ekstraksi asam amino ............................... .......................18 3.4 Analisis data ............................................................ .......................19 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................... .................20 4.1 Penyiapan sampel .................................................... .......................20 4.1.1 Hidrolisis gelatin....................................... .......................20 4.1.2 Derivatisasi asam amino ........................... .......................21 4.2 Analisis asam amino ................................................ .......................23 4.3 Analisis AA dalam gelatin dan dalam marshmalow .......................27 4.4 Analisis PCA dari gelatin dan sampel marshmallow ......................28 4.5 Analisis sampel marshmallow uji coba ................... .......................35 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ....................................... .......................37 5.1 Kesimpulan .............................................................. .......................37 5.1 Saran ........................................................................ .......................37 DAFTAR REFERENSI

.................................................... .......................38

DAFTAR TABEL

Tabel . ........................................................................................................Halaman 2.1. Komposisi asam amino gelatin kulit sapi dan kulit babi ................................. . 5 2.2. Daftar rantai samping asam amino ................................................................... . 9 4.1. Hasil analisis asam amino gelatin dan marshmallow....................................... . 27

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1 Struktur asam amino dalam bentuk ion Zwitter ..................................... . 10 Gambar 2 Diagram alat dan komponen KCKT....................................................... . 15 Gambar 3 Reaksi derivatisasi asam amino oleh AQC ............................................ . 22 Gambar 4 Profil standar asam amino ...................................................................... . 23 Gambar 5 Profil asam amino standar gelatin sapi ................................................... . 24 Gambar 6 Profil asam amino standar gelatin babi .................................................. . 24 Gambar 7 Profil asam amino marshmallow sapi .................................................... . 25 Gambar 8 Profil asam amino marshmallow babi .................................................... . 25 Gambar 9 Profil asam amino sampel uji 1 .............................................................. . 26 Gambar 10 Profil asam amino sampel uji 2 ............................................................ . 26 Gambar 11 Worksheet PCA .................................................................................... . 29 Gambar 12 Window session hasil proses PCA ....................................................... . 30 Gambar 13 Scree plot PCA ..................................................................................... . 31 Gambar 14 Score plot PCA ..................................................................................... . 31 Gambar 15 Kurva biplot.......................................................................................... . 33 Gambar 16 Kurva loading plot ................................................................................ . 35 Gambar 17 Score plot PCA ..................................................................................... . 37

DAFTAR ISTILAH

PCA

: Principal Component Analysis

AQC

: Aminokuinolil-N-Hidroksisuksini-midilkarbamat

AABA

: α Aminobutyric Acid

BSG

: Bovine Skin Gelatin

PSG

: Porcine Skin Gelatin

HPLC

: High Performance Liquid Chromatography

FTIR

: Fourier Transform Infra Red

ELISA

: Enzyme Linked Immunosorbent assay

BAB I PENDAHULUAN

1.1

Latar Belakang Makanan

adalah

kebutuhan

dasar

bagi

kehidupan

manusia

(Fadzlillah et al., 2011). Islam sebagai agama yang syamil sangat memperhatikan faktor makanan. Hal ini tertulis didalam alqur’an surat AlBaqarah:168 yang memerintahkan manusia untuk memakan makanan yang halal dan toyib, karena itu sudah menjadi kewajiban seorang muslim untuk mengkonsumsi dan menggunakan produk yang halal (Mursydi, 2012). Nemati et al (2004) telah berhasil melakukan pembedaan gelatin babi dan gelatin sapi dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor fluorosens, dan dikombinasikan dengan teknik kemometrik analisis komponen utama. Principal component analysis (PCA) adalah teknik proyeksi data yang sangat membantu dalam klasifikasi suatu objek (Miller and Miller, 2005). Berdasarkan studi literatur, belum pernah dilaporkan penelitian mengenai analisis perbedaan gelatin sapi dan gelatin babi dalam marshmallow berdasarkan komposisi asam amino. Pada penelitian ini analisis asam amino gelatin sapi dan babi dalam marshmallow dilakukan menggunakan HPLC dengan detektor fluorosens, lalu profil asam amino yang diperoleh dianalisis dengan PCA. Derivat babi adalah salah satu alternatif yang sering digunakan dalam produk makanan, sehingga menjadikan produk makanan menjadi tidak halal jika dikonsumsi oleh umat muslim. Hal ini dikarenakan derivat babi memiliki harga yang jauh lebih rendah jika dibandingkan dengan sumber halal yang berasal dari sapi dan domba (Rohman, 2012). Diantara sekian banyak produk yang beredar yang rentan akan kehalalannya adalah produk berbasis gelatin. Gelatin adalah struktur ireversibel dari protein yang berasal dari kolagen dari tulang, kulit dan jaringan ikat hewan seperti babi, sapi, domba, unggas dan ikan.

Sumber produksi gelatin dunia adalah 46 % berasal dari kulit babi, 29.4 % kulit sapi, 23.1 % berasal dari tulang dan 1.5 % berasal dari sumber lain (Karim and Rajeev, 2009). Pada tahun 2011 produksi gelatin dunia mencapai 300.000 ton dan diperkirakan akan meningkat hingga 360.000 ton pada tahun 2015 (Yetim, 2011). Berdasarkan data ini dapat dilihat bahwa penggunaan bagian tubuh babi sebagai sumber gelatin merupakan hal yang harus diwaspadai. Gelatin banyak digunakan karena gelatin memiliki karakteristik yang unik. Dalam industri makanan gelatin digunakan untuk pembuatan es krim, yogurt, keju, jelly, coklat, kue, permen, mentega, produk daging, makanan hewan dan marshmallow (Sahilah et al., 2012). Pada penelitian ini akan dilakukan analisis komposisi asam amino pada marshmallow. Marshmallow merupakan makanan ringan sejenis permen yang mempunyai tekstur yang begitu lembut seperti busa, ringan, kenyal dan memiliki rasa yang manis dan aroma tertentu. Marshmallow ini sangat banyak dijual dipasaran dengan bentuk dan warna yang beraneka ragam (Sartika, 2009). Umumnya marshmallow merupakan produk yang sangat disukai anak anak dan remaja (Trilaksani, 2009). Menurut Nhari et al (2012) untuk menganalisis perbedaan gelatin babi dan gelatin sapi pada produk makanan dapat dilakukan dengan menggunakan FTIR (Fourier Transform Infra Red), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent assay) dan HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Sedangkan menurut penelitian yang dilakukan oleh Rohman (2012) metode analisis yang lebih akurat untuk mendeteksi kehalalan pada makanan adalah dengan menggunakan FTIR dan HPLC. Pada penelitian ini analisa dilakukan dengan menggunakan HPLC. HPLC

merupakan

instrumen

yang

banyak

digunakan

untuk

menganalisis asam amino dan ditunjang dengan peralatan yang baik dan modern, menggunakan kolom yang sangat efisien dan dibawah tekanan yang besar, sehingga analisis asam amino dapat dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat dan teliti (Rediatning et al., 1987).

1.1

Rumusan Masalah Bagaimanakah perbedaan komposisi asam amino gelatin sapi dan gelatin babi dalam marshmallow menggunakan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) yang dikombinasikan dengan teknik principal component analysis (PCA) ?

1.2

Tujuan Penelitian. Mengetahui perbedaan profil asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada marshmallow.

1.3

Manfaat Penelitian Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi tentang komposisi asam amino gelatin sapi dan gelatin babi pada produk marshmallow.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1

Gelatin

2.1.1

Pengertian gelatin Gelatin adalah protein yang berasal dari hidrolisis kolagen yang

berasal dari jaringan ikat dan tulang vertebrata. Karena bentuknya seperti gel dan dapat digunakan sebagai stabilizer, gelatin umumnya digunakan sebagai bahan pengikat dalam berbagai macam produk makanan seperti marshmallow, permen dan daging. Dalam industri farmasi, gelatin digunakan untuk membuat kapsul keras, kapsul lunak, tablet, granulasi, suplemen makanan dan lapisan pelindung untuk obat-obatan (Cai hui et al., 2011). Istilah gelatin mulai populer sekitar tahun 1700 dan berasal dari bahasa latin ‘gelatus’ yang berarti kuat atau kokoh. Secara fisik gelatin berbentuk padat, kering, tidak berasa dan transparan. Ada tiga sifat yang paling menonjol pada gelatin yaitu: kemampuan untuk membentuk gel, kekenyalan dan kekuatan lapisan tinggi. Gelatin merupakan polimer tinggi alami yang memiliki berat molekular dari 20.000 sampai 70.000. Gelatin ini dipersiapkan dari bahan yang mengandung kolagen termasuk kulit, tulang dan tendon dengan pemecahan hidrolisis melalui pendidihan dengan air atau dengan menggunakan uap panas yang tinggi. (Perwitasari, 2008). Gelatin ini praktis tidak berbau, tidak larut dalam aseton, kloroform, etanol (95%), eter, dan metanol. Sifatnya yang larut dalam gliserin, asam, dan basa. Walaupun di dalam asam kuat atau basa kuat dapat menyebabkan pengendapan. Gelatin tidak larut dalam air dingin, tetapi hanya akan mengembang. Perendaman dalam air dingin menjadikan gelatin lunak dan berangsur-angsur menyerap air 5 sampai 10 kali bobot air. Gelatin larut dalam air panas. Setelah pendinginan sampai 35-40° C, gelatin akan membentuk gel. Pada suhu 40°C akan berbentuk sol (Singh et al., 2002). Dalam industri makanan, gelatin merupakan suatu polimer yang larut air sehingga digunakan sebagai bahan untuk meningkatkan elastisitas, konsistensi dan stabilitas suatu produk makanan (Tavakolivour, 2011). Gelatin terutama mengandung asam amino glisin sebesar 33% , prolin 22% dan

hidroksiprolin 22 %. Gelatin komersial terdiri dari 84–90% protein, 8-12% air dan 2-4 % adalah garam mineral. Mayoritas bahan baku untuk pembuatan gelatin berasal dari kulit babi, walaupun gelatin juga bisa dihasilkan dari kulit dan tulang domba. Semua bahan yang digunakan dalam produksi gelatin berasal dari rumah pemotongan hewan. Gelatin berasal dari kolagen yang telah dihidrolisis ( Wolinsky, 2004 ). Tabel 2.1 Komposisi asam amino gelatin kulit sapi dan kuilt babi (Nhari et al, 2011). Asam amino

Non polar hidrofobik Alanin Valin Leusin Isoleusin Fenilalanin Metionin Prolin Total Polar tidak bermuatan Glisin Serin Threonin Tirosin Total Asam polar Asam aspartat Asam glutamat Total Basa polar Lisin Arginin Histidin Total

BSG (residu per 1000 total residu asam amino )

PSG (residu per 1000 total residu asam amino )

33 10 12 7 10 4 63 139

80 26 29 12 27 10 151 335

108 15 10 2 135

239 35 26 7 307

17 34 51

41 83 124

11 47 Tidak terdeteksi 58

27 111 Tidakterdeteksi 138

Komposisi asam amino mempengaruhi sifat fisika dan kimia gelatin. Analisis asam amino gelatin menunjukkan bahwa struktur molekul gelatin memiliki

perbedaan

yang

terlihat

pada

kandungan

asam

amino

(Nhari et al., 2011). Gelatin memiliki kadar asam amino yang rendah pada metionin, sistein dan tirosin. Hal ini disebabkan karena ketiga asam amino ini mengalami kerusakan karena hidrolisis pada proses pembuatan gelatin (Hafidz et al., 2011). Perbedaan komposisi asam amino pada gelatin kulit sapi dan kulit babi ditunjukkan oleh tabel 1. Dari tabel 1 dapat dilihat bahwa komposisi asam amino dinyatakan sebagai residu per 1000 residu asam amino. Bovine skin gelatin (BSG) dan Porcine skin gelatin (PSG) keduanya memiliki kandungan glisin, prolin dan arginin dalam jumlah yang tinggi. PSG mengandung jumlah asam amino glisin, prolin dan arginin yang lebih tinggi dibandingkan dengan BSG. Kedua gelatin memiliki jumlah tirosin yang rendah dan histidin tidak terdeteksi pada keduanya (Nhari et al., 2011).

2.1.2

Tipe gelatin Gelatin dapat diklasifikasikan berdasarkan proses perendamannya

yakni gelatin tipe A dan tipe B. Gelatin tipe A (asam) adalah gelatin yang biasanya secara khusus diproduksi dari kulit babi dan proses perendamannya menggunakan larutan asam. Gelatin yang diperoleh setelah melalui proses asam akan mempunyai titik isoeletrik antara pH 6 dan 9. Gelatin tipe B merupakan gelatin yang diproduksi dari kulit sapi, kambing dan kerbau atau dari tulang binatang binatang yang sudah dihilangkan mineralnya (demineralised bones). Gelatin tipe B ini mempunyai titik isoelektrik antara pH 4,7 hingga 5 (Jaswir, 2007).

2.1.3

Komposisi Gelatin Gelatin sangat kaya dengan asam amino glisin (Gly) (hampir sepertiga

dari total asam amino), prolin (Pro) dan 4-hidroksiprolin (4Hyd). Struktur gelatin

yang

umum

adalah:-Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Glu-4Hyd-Gly-Pro-.

Kandungan 4Hyd berpengaruh terhadap kekuatan gel gelatin, makin tinggi asam amino ini, kekuatan gel juga lebih baik. Meskipun diturunkan dari protein hewani, gelatin tergolong sebagai protein dengan nilai biologis yang rendah dan sering juga dianggap protein tidak lengkap. Hal ini disebabkan

karena tidak adanya triptophan (Trp) yang merupakan salah satu asam amino esensial, serta rendah dalam sistein (Cys) dan tirosin (Tyr) (Jaswir, 2007).

2.2

Protein Protein berasal dari kata proteos yang berarti pertama atau utama. Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau manusia. Oleh karena sel itu merupakan pembentuk tubuh kita, maka protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh (Podjiadi,1994). Protein merupakan salah satu kelompok bahan makronutrien. Tidak seperti bahan makronutrien lain (karbohidrat dan lemak), protein lebih berperan dalam pembentukan biomolekul daripada sebagai sumber energi. Meskipun demikian, bila organisme sedang kekurangan energi, maka protein ini juga dapat digunakan sebagai sumber energi. Protein merupakan polimer dengan asam asam amino sebagai monomer. Dua asam amino berikatan melalui ikatan peptida dengan melepas satu molekul air. Protein merupakan polipeptida yang pada bagian tengah adalah rantai panjag dengan salah satu ujungnya adalah gugus karboksilat dan ujung yang lainnya adalah gugus amina (Rohman, 2007). Protein dapat diperoleh dari makanan yang berasal dari hewan atau tumbuhan. Protein yang berasal dari hewan disebut protein hewani, sedangkan yang berasal dari tumbuhan disebut protein nabati. Tumbuhan membentuk protein dari CO2 , H2O dan senyawa nitrogen. Hewan yang makan tumbuhan mengubah protein nabati menjadi protein hewani. Disamping digunakan untuk pembentukan sel sel tubuh, protein juga dapat digunakan sebagai sumber energi apabila tubuh kita kekurangan karbohidrat dan lemak. Komposisi rata rata unsur kimia yang terdapat dalam protein adalah karbon 50%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%, belerang 0 – 3 % dan fosfor 0 – 3 %. Protein mempunyai molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim , protein akan menghasilkan asam asam amino. Ada 20 jenis asam amino yang terdapat dalam molekul protein. Asam asam amino ini terikat satu dengan lain oleh

ikatan peptida. Protein mudah dipengaruhi oleh suhu tinggi, pH dan pelarut organik (Poedjiadi, 1994).

2.3

Kolagen Kolagen merupakan komponen protein utama yang berlimpah didalam tubuh hewan, lebih dari sepertiga protein pada hewan adalah kolagen. Kolagen dapat ditemukan pada ruas ruas tulang belakang, jaringan kulit, otot dan diseluruh membran dasar pada tulang (Perwitasari, 2008). Diantara protein hewani, kolagen merupakan yang terbanyak dengan jumlah 25 % dari total protein. Kolagen membentuk serat serat yang tidak larut yang terdapat sebagai protein struktural disegala tempat dalam organisme ,baik di dalam matriks maupun di dalam jaringan ikat (Koolman, 2001). Kolagen dapat ditemukan pada struktur alveolar dan diantara jaringan paru. Struktur molekular kolagen ini mempunyai karakteristik yang sangat baik. Molekul kolagen mempunyai tiga bentuk rantai polipeptida (rantai α ) yang terbentuk dari triple helix. Selama kolagen berada pada rantai α ,residu dari glisin, prolin dan hidroksiprolin muncul sebagai triplet dari gly –pro – x ( dimana x biasanya adalah hidroksiprolin ). Struktur ini akan terus terjadi perulangan selama berada dalam rantai polipeptida ( Gilberga, 2004 ).

2.4

Marshmallow Marshmallow merupakan makanan ringan sejenis permen yang bertekstur seperti busa yang lembut, ringan, kenyal dalam berbagai bentuk, aroma, rasa dan warna. Marshmallow bila dimakan meleleh di dalam mulut karena merupakan hasil dari campuran gula atau sirup jagung, putih telur, gelatin dan bahan perasa yang dikocok hingga mengembang. Selama ini bahan utama marshmallow yang banyak digunakan berasal dari gelatin sapi atau babi. Gelatin dipandang memiliki kelebihan jika dibandingkan dengan gum dan karagenan karena gelatin ternyata memiliki kekenyalan yang khas (Sartika, 2009).

2.5

Asam amino Asam amino ialah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino yang terdapat sebagai komponen protein mempunyai gugus – NH2 pada atom karbon α dari posisi gugus –COOH ( Podjiadi, 1994 ). Asam amino dapat ditemukan pada keadaan bebas atau sebagai rantai linear pada peptida dan protein. Pada tabel 2 terdapat data rantai samping asam amino: Tabel 2.2. Daftar rantai samping asam amino (Bailey, 1990). Asam Amino

Asam Amino

Rantai Samping

Rantai Samping

Asam aspartat

—CH2—COOH

Tirosin

—CH2—

Serin

—CH2—OH

Lisin

—(CH2)4—H2N

Glutamat

—(CH2)2—COOH

Metionin

—(CH2)2— SCH3

Valin

—CH2(CH3)2

Fenilalanin

—CH2—

—H

Glisin

—OH

N —CH2— NH

Histidin

NH —(CH2)3NH—C

Arginin

—CH(CH3)—C2H5 NH2

Treonin Alanin

—CHOH—CH3 —CH3

+

Isoleusin Leusin Sistein

—CH2—CH(CH3)2 —CH2—SH

Bila suatu protein dihidrolisis dengan asam, alkali atau enzim maka akan dihasilkan campuran asam asam amino. Asam amino terdiri dari sebuah gugus amino, sebuah gugus karboksil , atom hidrogen , dan gugus R yang terikat pada sebuah atom C yang dikenal sebagai karbon alpha (Cα), serta gugus R merupakan rantai cabang. Asam amino dalam kondisi netral berada dalam bentuk ion dipolar atau disebut juga ion zwitter. Pada asam amino yang dipolar , gugus amino mendapat tambahan sebuash proton dan gugus karboksil terdisosiasi.

Gambar 1.Struktur asam amino dalam bentuk ion Zwitter (Copeland,1994 )

Derajat ionisasi dari asam amino sangat dipengaruhi oleh pH. Pada pH yang rendah misalnya pada pH 1, gugus karboksilnya tidak terdisosiasi , sedang gugus aminonya menjadi ion. Pada pH yang tinggi misalnya pada pH 11, karboksilnya terdisosiasi sedang gugus aminonya tidak ( Winarno, 1997 ). Asam amino yang ada pada gelatin adalah semua asam amino kecuali tryptophan. Dan memiliki kandungan asam amino yang rendah seperti metionin, cystine dan tyrosin karena asam amino ini telah terdegradasi ketika dihidrolisis. Kandungan asam amino dan urutan (sequence) dalam gelatin berbeda dari satu sumber dengan sumber yang lain, tetapi selalu terdiri dari glysin, proline dan hydroxiproline dalam jumlah yang besar (Hafidz ,et al).

2.5.1

Pembagian Asam Amino Pembagian asam amino ini didasarkan pada struktur kimia dari rantai

samping dan polaritas asam amino.Yang termasuk asam amino alifatik ( kelas I) adalah glisin, alanin, valin, leusin dan isoleusin.Rantai samping asam amino tersebut tidak mengandung hetero – atom (N, O, atau S) dan tidak mempunyai struktur cincin.Yang menonjol jelas dari rantai samping asam amino ini adalah sifat non polarnya.Yang juga bersifat non polar adalah asam amino yang mengandung sulfur yaitu sistein dan metionin ( kelas II ). Asam amino aromatik ( kelas III) mengandung struktur cincin yang distabilkan secara mesomerik pada rantai samping. Pada kelompok kelas III ini hanya fenilalain yang jelas mempunyai sifat non polar.Tirosin dan triptofan cukup polar dan histidin mempunyai sifat sangat polar. Asam amino yang netral (kelas IV ) mengandung gugus hidroksil yaitu serin dan treonin. Atau mengandung gugus asam karbonat amida yaitu asparagin dan glutamin. Gugus karboksil dari rantai samping asam amino yang bersifat asam ,seperti asam

aspartat dan asam glutamat ( kelas V ) pada nilai pH fisiologik hampir seluruhnya terionisasi. Juga rantai samping dari asam amino yang bersifat basa seperti lisin dan arginin ( kelas VI ) pada pH netral seluruhnya terprotonisasi. Asam amino yang sifat basanya sangat kuat dan karena itu menjadi sangat polar adalah arginin dengan gugus guanidinnya. Suatu pengecualian terdapat pada prolin yang dikelompokan dalam kelas VII. Rantai samping dari asam amino ini bersama sama dengan atom C α dan gugus α-amino membentuk suatu cincin segi lima (Koolman dan Heinrich, 1995 ).

2.5.2

Analisis Asam Amino Analisis asam amino merupakan metode penentuan komposisi asam

amino atau kandungan protein dan peptida. Untuk mengidentifikasi adanya asam amino, terlebih dahulu kita perlu menghidrolisis ikatan amin dengan sempurna untuk memperoleh asam amino dalam keadaan bebas, kemudian kita memisahkan, mengidentifikasi dan menghitungnya. Hidrolisis dapat dilakukan pada kondisi asam dan basa yang kuat, atau menggunakan enzim spesifik untuk memperoleh asam amino (Bailey ,1990 ). Pada hidrolisis asam unsur yang diperlukan adalah HCl 6M, suhu 1100 C dan waktu 24 jam. Reaksinya biasanya dilakukan ditabung kaca yang tertutup. Sementara itu pada hidrolisis basa, ikatan amida dapat diputus dengan perlakuan terhadap peptida menggunakan NaOH 2M pada 1000C. Hidrolisis basa menghasilkan destruksi arginin, sistein, serin dan treonin. Selain itu adapula hidrolisis enzim. Peristiwa ini terjadi didalam tubuh. Untuk menghancurkan makanan, perut memiliki enzim dengan kadar tertentu yang dapat dikatalisasi untuk memotong ikatan peptida yang dikenal sebagai peptidase. Aminopeptidase bekerja cepat dan efisien dalam hidrolisis ikatan peptida sekaligus memotong suatu residu asam amino mulai dari ujung N. Tahap selanjutnya, yaitu pemisahan. Pemisahan yang umum dilakukan adalah dengan cara kromatografi. Diantara teknik kromatografi yang dapat dilakukan untuk pemisahan yaitu kromatografi penukar ion, kromatografi kertas, dan kromatografi cair kinerja tinggi ( Bailey ,1990 ).

Kromatografi penukar ion umumnya sangat efisien dalam memisahkan campuran asam amino. Metode ini menggunakan kolom penukar ion secara paralel dengan metode deteksi ninhidrin yang hasilnya reprodusibel sehingga teknik ini sangat banyak digunakan dalam pemisahan dan analisis campuran asam amino. Kromatografi kertas digunakan dalam pemisahan asam amino berdasarkan fakta bahwa gugus selulosa kertas memiliki afinitas kuat terhadap molekul air ,yang terbentuk oleh ikatan hidrogen dengan gugus OH pada rantai polisakarida. Jika asam amino tidak dapat dipisahkan dengan sempurna dengan kromatografi kertas sederhana,maka kromatogram dua dimensi dapat dicoba. HPLC tidak umum digunakan pada pemisahan asam amino.Akan tetapi ,pemisahan asam amino dengan HPLC fase balik juga cukup efisien asalkan beberapa asam amino dibuat turunannya. Bahkan apabila derivat yang dipilih menjadi kromofor kuat pada daerah UV, analisis dengan HPLC menjadi cepat efisien dan sensitif ( Bailey ,1990 ).

2.6

Analisis Asam Amino dengan HPLC Salah satu analisis asam amino adalah dengan kromatografi partisi cair cair atau sering disebut dengan metode HPLC. Metode ini akhir akhir ini banyak juga digunakan dalam analisis asam amino. Metode ini telah ditunjang oleh peralatan yang baik dan modern, menggunakan kolom yang efisien dibawah tekanan besar sehingga dilakukan dalam waktu yang singkat dan memberikan hasil yang tepat. Untuk mendeteksi asam amino, dapat menggunakan detektor UV, sinar tampak, dan floresensi. Dalam hal ini asam amino harus diderivatisasi terlebih dahulu supaya dapat membentuk derivat yang dapat menyerap cahaya UV, tampak atau fluoresensi (Rediatning, 1978 ). Penggunaan alat HPLC ini dipilih karena alat ini kerjanya lebih cepat dan merupakan alat yang dapat diandalkan dalam pemisahan dan analisis kuantitatif pada makanan. Alat ini juga merupakan alat yang telah dikembangkan untuk mendeteksi adanya derivat babi dalam produk makanan (Rohman, 2012).

2.6.1

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) / HPLC Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisahan

berdasarkan cuplikan antara fase yang bergerak dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam dapat berupa zat cair atau zat padat. Kromatografi ini ditemukan oleh Tswett pada tahun 1903 (Johnson dan Stevenson, 1991). HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan metode pilihan untuk analisis asam asam amino karena merupakan metode yang serba guna, mempunyai kapasitas yang tinggi, dan dapat dipercaya. Karena kebanyakan asam amino tidak mempunyai serapan baik didaerah ultraviolet atau didaerah visibel, maka asam asam amino tidak dapat dideteksi dengan menggunakan detektor spektrofotometer

UV- Vis yang

merupakan detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC. Beberapa usaha telah dilakukan untuk mengembangkan prosedur prosedur derivatisasi yang membuat asam amino lebih mudah dideteksi. Suatu pereaksi penderivat harus mempunyai syarat syarat sebagai berikut : a) Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri. b) Proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin. c) Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi ( Abdul Rohman, 2007 ).

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi, polimer, dan industri makanan (Sudjadi, 2007). High Performance Liquid Chromatography adalah jenis yang khusus dari kromatografi kolom. Metode ini menggunakan cairan dengan tekanan tinggi sebagai fase gerak ( Gottfried, 1988).

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa senyawa tertentu seperti asam asam amino,asam asam nukleat,protein protein dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa aktif obat, proses hasil samping proses sintetis, memonitor sampel sampel yang berasal dari lingkungan, memurnikan suatu senyawa dalam suatu campuran (Sudjadi, 2007). Kromatografi merupakan teknik yang mana solut atau zat zat terlarut terpisah oleh perbedaan kecepatan elusi, dikarenakan solut solut ini melewati suatu kolom kromatografi. Pemisahan solut solut ini diatur oleh distribusi solut oleh fase gerak dan fase diam. Fase gerak haruslah mempunyai sifat yang murni, tidak bereaksi dengan kemasan, sesuai dengan detektor, dapat melarutkan cuplikan, mempunyai viskositas yang rendah, memungkinkan memperoleh

kembali

cuplikan

dan

harganya

cukup

terjangkau.

(Johnson dan Stevenson, 1991). Penggunaan kromatografi cair secara sukses terhadap suatu masalah yang dihadapi membutuhkan penggabungan secara tepat dari berbagai macam kondisi operasional seperti jenis kolom, fase gerak, diameter kolom, kecepatan alir fase gerak, suhu kolom dan ukuran sampel. Untuk tujuan memilih kombinasi kondisi kromatografi yang terbaik, maka dibutuhkan pemahaman yang mendasar tentang berbagai macam faktor yang mempengaruhi pemisahan pada kromatografi cair. Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas delapan komponen pokok yaitu: wadah fase gerak, sistem penghantaran fase gerak, alat untuk memasukan sampel,kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, tabung penghubung dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

Gambar2. Diagram alat dan komponen HPLC (Sumber : Wiley, Practical User Guide )

Dari diagram alat diatas akan dijelaskan secara singkat komponen komponen High Performance Liquid Chromatography: 1. Pompa

:Fase gerak dalam HPLC sudah tentu zat cair dan untuk

menggerakkannya melalui kolom diperlukan adanya pompa. 2. Injektor

:Cuplikan harus dimasukkan kedalam pangkal kolom

diusahakan agar sedikit mungkin terjadi gangguan pada kemasan kolom. 3. Kolom

:Kolom merupakan jantung kromatograf. Keberhasilan

analisis bergantung pada pilihan kolom dan kondisi kerja yang tepat. 4. Detektor

:Detektor diperlukan untuk mengindera adanya komponen

cuplikan didalam eluen kolom dan mengukur jumlahnya. Detektor yang baik sangat peka, tidak banyak berbunyi, rentang tanggapan linearnya lebar dan menanggapi semua jenis senyawa (Johnson dan Stevenson, 1991). Keuntungan metode High Performance Liquid Chromatography adalah : 1. Waktu analisis cepat 2. Mempunyai daya pisah yang baik dan Kolom dapat digunakan kembali 3. Peka dan Mudah memperoleh kembali cuplikan 4. Ideal untuk molekul besar dan ion ( Johnson dan Stevenson, 1991).

2.6.2 Analisis Komponen Utama ( PCA) Principal component analysis (PCA) merupakan teknik yang diketahui paling baik untuk analisis multivariat. Teknik ini pertama kali diperkenalkan oleh Pearson pada tahun 1901 dan dikembangkan secara luas oleh Hotelling pada tahun 1933. Principal component analysis (PCA) adalah suatu teknik untuk mengurangi dimensi dari sekumpulan data yang terdiri dari sebagian besar variabel yang saling berhubungan (Jolliffe, 2002). Principal component analysis digunakan untuk mengekstrak informasi penting dari suatu data dan menampilkan informasi tersebut sebagai variabel baru yang disebut principal component (komponen utama). Principal component tersebut didapatkan sebagai kombinasi linear dari variabel asal. Nilai dari variabel baru tersebut disebut factor scores (Abdi dan Wiliams,2010). PCA dapat digunakan untuk menggambarkan hubungan suatu data untuk mengevaluasi hubungan antara variabel dan mengekstrak faktor yang dapat menyebabkan variasi pada variabel tertentu (Hilman et al., 2007). Hasil dari analisis principal component analysis adalah eigenvalue, variansi data dan PC loading (Stathis dan Myronidis, 2009). Teknik PCA ini telah diakui secara universal didalam ilmu kemometrik (Widyaninggar dan Rohman, 2012). Prinsip metoda PCA adalah melakukan pengurangan terhadap variabel variabel yang mempunyai korelasi, sehingga teknik PCA menjadi tidak bermanfaat apabila antar variabel tidak terdapat korelasi ( Miller and Miller, 2005). Analisis komponen utama (PCA) digunakan dalam proses parameter puncak

untuk

mendapatkan

komponen

utama

dan

melakukan

pengklasifikasian. PCA adalah suatu metode yang tidak disupervisi. Dalam analisis komponen utama terdapat komponen utama (PC1) dan komponen kedua (PC2).

BAB III METODE PENELITIAN

3.1

Tempat Dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Saraswanti Indo Genetech, Bogor dan Laboratorium Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.Waktu pelaksanaan dari bulan September 2012 hingga November 2012.

3.2

Alat Dan Bahan

3.2.1. Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah 1 set perangkat High Performance Liquid Chromatography (Waters), lemari pendingin (refrigerator), oven, neraca analitik, alat homogenizer, hote plat, labu ukur, erlenmeyer, kaca arloji , tabung reaksi bertutup, mikro pipet beserta tip nya, spatula, gelas ukur, beaker glass, vortex, inkubator, pipet tetes, pinset, syringe filter, termometer, membran filter 0,45 µm ,vial, cawan porselen, batang pengaduk.

. 3.2.2. Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah: standar asam amino yaitu: asam L- aspartat, L- serin, asam L- glutamat, glisin, Lhistidin, L- arginin, L- treonin, L-alanin, L- prolin, L- sistein, L- tirosin, Lvalin, L- metionin, L- lisin, L- isoleusin, L- leusin, L- fenilalanin, triptofan, standar gelatin sapi (sigma aldrich), standar gelatin babi (sigma aldrich), internal standar AABA (alpha amino butiric acid), Accq-fluor borat, reagen fluor A, HCl, asetonitril grade HPLC, Sampel marshmallow, pati jagung, sukrosa, glukosa, dan pewarna makanan, aquabidest.

3.3

PROSEDUR KERJA

3.3.1. Pengumpulan produk marshmallow uji coba Sampel yang digunakan terdiri dari 2 sampel produk marshmallow uji coba

3.3.2. Pembuatan marshmallow dari gelatin babi dan gelatin sapi Ditimbang masing masing sebanyak 3.5 gram gelatin sapi dan gelatin babi. Gelatin

dibasahi dengan 15 ml air dan diaduk diatas

penangas listrik. Ditempat yang terpisah sukrosa sebanyak 5 gr, glukosa sebanyak 2 gr dan amilum sebanyak 0,25 gr dibasahi dengan 10 ml air dan diaduk diatas penangas ±7 menit. Kemudian pindahkan kedua adonan ke dalam alat homogenizer lalu dilakukan pengadukan dengan homogenizer hingga merata dan mengembang selama 15 menit. Lalu dilakukan penambahan flavour dan setelah itu dilakukan penuangan ke dalam wadah dan didiamkan selama 5 jam dalam refrigerator sampai menjadi marshmallow.

3.3.3. Ekstraksi asam amino dari produk marshmallow dengan hidrolisis menggunakan HCl 6N pada suhu 1100C selama 22 jam Sebanyak 0,1 gram sampel marshmallow dihidrolisis dengan menggunakan larutan HCl 6 N sebanyak 5 ml, vortex. Lalu dialiri Nitrogen dan di oven

pada suhu 1100C selama 22 jam. Setelah

dihidrolisis, campuran didinginkan pada suhu ruang. Pindahkan isi tabung reaksi bertutup ke dalam labu ukur 50 ml, tambahkan aquabides sampai tanda batas. Saring dengan filter 0,45µm. Pipet 500 µl filtrat lalu tambahkan 40 µl AABA (alpha aminobutyric acid) dan 460 µl aquabides. Pipet 10 µl larutan, tambahkan 70 µl AccQ Fluor borate, vortex. Tambahkan 20 µl reagen fluor A, vortex, diamkan selama 1 menit. Inkubasi selama 10 menit pada suhu 550C, lalu suntikkan pada HPLC. Dengan kondisi kromatografi menggunakan kolom C18, temperatur 370C, fase gerak asetonitril 60% dan 40 % air , detektor fluoresen, laju alir 1 ml/ menit dan volume penyuntikan 5µl.

3.4

Analisis data Analisis komposisi masing masing asam amino dalam sampel dapat dihitung dengan perhitungan :

Kadar asam amino dalam (mg / 100 gram) (Area komponen / area AABA)sampel x Cstd x BM x fp

x 100%

(Area komponen / area AABA)standar x 1000000 x gr x 1000

Dan untuk analisis komponen utama (PCA) dilakukan dengan perangkat lunak Minitab versi 15. Nilai persen tinggi puncak masing masing asam amino adalah variabel variabel yang akan dimasukkan ke dalam analisis data statistik dengan PCA.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyiapan sampel Dalam

penelitian

ini

sampel

disiapkan

dengan

membuat

marshmallow dari gelatin sapi standar dan gelatin babi standar. Marshmallow dibuat dengan menambahkan sukrosa, air, glukosa, amilum dan penambahan flavour pandan. Marshmallow yang dihasilkan berwarna hijau, kenyal, mempunyai rasa manis, dan meleleh di mulut saat dimakan. Menurut penelitian yang dilakukan oleh Nemati et al, analisa kandungan asam amino gelatin sapi dan gelatin babi dilakukan dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Sebelum dilakukan analisis asam amino menggunakan HPLC, sampel gelatin sapi standar, gelatin babi standar, dan sampel marshmallow dipersiapkan untuk dipreparasi terlebih dahulu sebelum di injeksikan kedalam HPLC dengan cara menghidrolisis gelatin menjadi asam amino – asam amino penyusunnya dan menderivatisasinya agar menghasilkan derivat yang mampu berfluoresensi.

4.1.1

Hidrolisis gelatin Hidrolisis dilakukan dengan menimbang sampel sebanyak 0,1 gram

kemudian dimasukan ke dalam tabung bertutup ulir lalu dihidrolisis menggunakan HCl 6N dengan konsentrasi 2%, kemudian dialiri sedikit gas nitrogen untuk mencegah terjadinya oksidasi pada sampel setelah itu dimasukkan ke dalam oven pada suhu 1100C selama 22 jam. Setelah dihidrolisis campuran didinginkan pada suhu ruang. Kemudian isi tabung dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml, kemudian ditambahkan aquabides sampai tanda batas sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,2%. Hasil dari proses hidrolisis akan menghasilkan asam amino dalam keadaan bebas. Hasil hidrolisis menghasilkan larutan hitam kecoklatan, sehingga tidak bisa langsung di injeksikan kedalam HPLC. Sebelum dilakukan injeksi kedalam alat HPLC hasil hidrolisis di filter terlebih dahulu dengan

menggunakan membran filter berpori 0,45 µm. Hal ini bertujuan untuk memisahkan asam amino dari komponen lain yang dapat mengganggu proses pada saat analisis dan menghilangkan zat yang dapat merusak kolom HPLC. Setelah proses filtrasi menggunakan membran filter 0,45 µm, larutan akan terlihat bening dan bersih. Setelah itu dipipet 500 µl filtrat lalu ditambahkan 40 µl AABA (alpha aminobutyric acid) dan 460 µl aquabides sehingga konsentrasi larutan menjadi 0,1%. Hidrolisis ini dilakukan untuk melepaskan asam amino - asam amino yang terdapat dalam gelatin, yaitu melalui pemotongan ikatan peptida asam amino penyusun gelatin. Selama proses hidrolisis ini, hubungan antara ikatan rantai polipeptida dari kolagen dengan ikatan rantai polipeptida yang lain akan menjadi terpisah. Hal ini disebabkan karena rusaknya struktur fibrosa dari kolagen (See et al., 2010). Asam

amino

yang

dilepaskan

selanjutnya

akan

dianalisis

berdasarkan profil asam amino gelatin yang akan menjadikan pedoman dalam pembedaan sumber gelatin. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh nemati et al., hidrolisis dilakukan dengan menggunakan HCl karena HCl dapat memecah ikatan peptida secara sempurna (Masuda dan Domae, 2011).

4.1.2

Derivatisasi asam amino Derivatisasi asam amino dilakukan dengan menambahkan 70 µl

AccQ fluor borat dan 20 µl reagen fluor A ke dalam 10 µl filtrat dengan konsentrasi 0,01%. Kemudian vortex dan diamkan selama 1 menit. Lalu inkubabasi pada suhu 550C selama 10 menit dan disuntikan pada HPLC. Asam amino adalah senyawa yang secara umum tidak memiliki gugus kromofor kecuali asam amino fenilalanin, tirosin dan triptofan. Oleh karena itu dalam penelitian ini perlu dilakukan proses derivatisasi asam amino yang bertujuan agar menghasilkan derivat

yang mampu

berfluoresensi sehingga pengukuran menjadi lebih selektif dan sensitif (Rohman dan Sumantri, 2007).

Reaksi

derivatisasi

harus

mempunyai

beberapa

persyaratan,

diantaranya adalah: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri , proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin dan produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi (Rohman dan Sumantri, 2007). Ada beberapa agen penderivat yang dapat digunakan untuk menderivatisasi asam amino sebelum dilakukan analisis dengan HPLC, antara lain adalah NBD- F (7-fluoro -4-nitrobenzo diazole), aminokuinolilN-hidroksisuksini-midil karbamat (AQC), FMOC- Cl ( 9-fluoronylmethylchloroformate dan penderivat

yang

o-ftalaldehid (Masuda dan Domae, 2011). Agen digunakan

dalam

penelitian

ini

adalah

AQC

(aminokuinolil-N-hidroksisuksini-midil karbamat). Pereaksi penderivat AQC ini telah disentesis dan telah digunakan secara sukses untuk pemisahan dan analisis kuantitatif asam amino dalam hidrolisat protein, baik dengan menggunakan detektor fluoresen atau detektor UV. Derivatisasi dengan AQC ini sangat cepat ( hanya beberapa detik) dan sederhana. Lebih lanjut, produk yang dihasilkan stabil dan adanya kelebihan AQC tidak mengganggu proses pemisahan (Rohman dan Sumantri, 2007). AQC ini merupakan agen penderivat yang paling stabil jika dibandingkan dengan agen penderivat lainnya. Agen penderivat AQC ini stabil selama 7 hari pada suhu ruang. Selain itu juga AQC dapat bereaksi dengan asam amino primer dan asam amino sekunder (Masuda dan Domae, 2011) sehingga paling cocok digunakan dalam proses derivatisasi.

Gambar 3. Reaksi derivatisasi asam amino oleh AQC ( Hou,2009).

4.2 Analisis asam amino Pada penelitian ini dilakukan analisis terhadap standar asam amino, analisis terhadap gelatin standar, analisis terhadap marshmallow yang dibuat dari gelatin standar dan analisis terhadap sampel uji pada konsentrasi 100 pmol. Hasil analisis asam amino tersebut dengan HPLC dapat dilihat pada kromatogram dibawah. Dari hasil profil standar asam amino (gambar 4) dapat dilihat bahwa ada 17 asam amino yang terdeteksi yaitu asam aspartat, serin, asam glutamat, glisin, histidin, arginin, treonin, alanin, prolin, tirosin, valin, metionin, lisin, isoleusin, leusin, fenilalanin dan triptofan.

Gambar 4. Profil standar asam amino Keterangan : 1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9 : prolin; 10: tirosin ; 11 : valin ; 12 : metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin; 17: triptopan

Gambar 5. Profil asam amino standar gelatin sapi 1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6: arginin; 7: treonin; 8 :alanin ; 9:prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 6. Profil asam amino standar gelatin babi 1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 7. Profil asam amino marshmallow sapi 1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 8. Profil asam amino marshmallow babi 1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 9. Profil asam amino sampel uji 1 1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

Gambar 10. Profil asam amino sampel uji 2 1: asam aspartat; 2: serin; 3: asam glutamat; 4: glisin ; 5: histidin; 6 : arginin; 7: treonin; 8 : alanin ; 9: prolin; 10: tirosin ; 11: valin ; 12: metionin; 13: lisin; 14: isoleusin; 15: leusin; 16: fenilalanin

4.3 Analisis

asam amino

dalam gelatin

standar,

dalam sampel

marshmallow yang dibuat dari gelatin standar dan sampel uji 1. Analisis komposisi asam amino Tabel 4.1 Hasil analisis kadar asam amino gelatin standar, marshmallow yang di buat dari gelatin standar dan sampel uji.

Kadar asam amino dalam % b/b Asam Amino

Asam aspartat Serin Asam glutamat Glisin Histidin Arginin Treonin Alanin Prolin Sistein Tirosin Valin Metionin Lisin HCl Isoleusin Leusin Fenilalanin Triptofan

Gelatin Gelatin sapi babi 4.471 3.017 7.344 20.493 1.552 9.319 1.934 6.187 9.542 0.201 0.474 2.361 0.856 2.647 1.616 2.879 2.276 -

5.258 3.213 8.219 21.944 1.642 11.448 2.360 6.659 10.274 0.461 0.925 2.635 0.648 2.771 1.347 2.900 3.229 -

Marshmall ow gelatin sapi 0.496 0.487 0.948 3.211 0.159 1.305 0.301 0.931 1.160 0.000 0.389 0.331 0.155 0.357 0.183 0.339 0.333 -

Marshmallo Sampe w gelatin l1 babi 0.518 0.220 0.579 0.208 1.005 0.416 3.461 1.339 0.210 0.051 1.593 0.463 0.351 0.114 1.012 0.404 1.150 1.024 0.000 0.000 0.388 0,266 0.348 0.180 0.161 0.117 0.275 0.074 0.146 0.079 0.359 0.147 0.419 0.112 -

Berdasarkan penelitian Nhari et al, gelatin dari kulit babi (PSG) mengandung kadar asam amino glisin (239), prolin (151) dan arginin (111) yang lebih tinggi dari pada gelatin dari kulit sapi (BSG) glisin (108), prolin (63), arginin (47). Pada penelitian ini juga dihasilkan asam amino glisin, prolin dan arginin pada gelatin babi yang memiliki kadar yang lebih tinggi

Sampe l2 0.108 0.105 0.205 0.673 0.029 0.239 0.063 0.205 0.524 0.000 0.139 0.104 0.069 0.066 0.036 0.072 0.070 -

jika dibandingkan dengan gelatin sapi. Berdasarkan hasil analisis asam amino gelatin pada tabel diatas diketahui bahwa asam amino triptofan tidak terdeteksi. Hal ini disebabkan karena asam amino triptofan tidak terkandung dalam gelatin (Hafidz, et all).

4.4 Analisis komponen utama (PCA) dari gelatin standar dan sampel marshmallow yang dibuat di laboratorium dari gelatin standar Pengelompokan gelatin yang bersumber dari sapi dan babi selanjutnya dilakukan dengan principal component analysis (PCA). Dalam PCA dibuat suatu variabel baru yang merupakan kombinasi linier dari variabel asal. Variabel baru tersebut disebut principal component. PCA merupakan suatu teknik untuk mengurangi dimensi dari sekumpulan data yang terdiri dari sebagian besar variabel yang saling berhubungan, ketika terdapat adanya kemungkinan variasi dalam sekumpulan data (Jolliffe, 2002). Prinsip dari metode

PCA adalah

melakukan pengurangan terhadap variabel variabel yang mempunyai korelasi (Miller dan Miller, 2005). Score plote mampu mengungkapkan perbedaan karakteristik variabel dari suatu data, yang mana score plot ini menyatakan nilai nilai komponen utama (PC1) dan komponen utama kedua (PC2). Dari proses PCA (principal component analysis) dihasilkan beberapa komponen utama (Principal components) yang dapat mengekstrak informasi keragaman data sampai jumlah tertentu. Nemati et al menggunakan PCA untuk pengolahan parameter puncak kromatogram dalam mengekstrak komponen utama dan mengklasifikasikan gelatin sapi dan babi. Dalam penelitian ini variabel adalah % tinggi puncak masing masing asam amino dalam kromatogram. Variabel % tinggi puncak dipilih karena % tinggi puncak berbanding lurus dengan konsentrasi asam amino pada sampel. Jumlah variabel pada penelitian ini adalah 17 variabel (% tinggi puncak 17 asam amino). Hasil pembedaan sumber hewan penghasil gelatin (sapi atau babi) akan disajikan dalam kurva score plot yang menyatakan nilai nilai pada principal component 1 (PC1) dan principal component 2 (PC2). Dalam penelitian ini

dimasukkan data % tinggi puncak masing masing asam amino dari kromatogram hasil analisis marshmallow sapi, analisis marshmallow babi, sampel uji coba marshmallow serta gelatin sapi dan gelatin babi kemudian dimasukkan dalam worksheet Minitab gambar 11. Setelah itu dilakukan proses PCA.

Gambar 11. Worksheet pada penyusunan data variabel tinggi puncak asam amino dengan principal component analysis (PCA) Hasil proses PCA akan ditampilkan dalam jendela window session sebagaimana gambar 12. Dari gambar 12 dapat diketahui bahwa ada dua principal component yang memiliki nilai eigenvalue lebih dari satu, sehingga dapat disimpulkan bahwa sebanyak dua principal component sudah dapat digunakan untuk menganalisis data tersebut. Principal component ketiga memiliki eigenvalue lebih kecil dari satu sehingga kurang bermakna untuk menganalisis pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi. Principal component keempat dan seterusnya memiliki eigenvalue 0, artinya beberapa principal component tersebut dapat diabaikan. PC1 dapat mengekstrak sebanyak 85,9 % informasi (0,859 bagian) dan PC2 dapat mengekstrak 13,3 % informasi. Secara kumulatif, kedua principal component dapat mengekstrak sebanyak

99,1 % dari keseluruhan

informasi yang disediakan oleh data. Hubungan antara nilai eigenvalue dengan principal component dapat dilihat dalam scree plot yang dihasilkan pada gambar 13.

Variable Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Iso Leu Phe

PC1 0.261 0.258 0.261 0.260 0.261 0.248 0.257 0.259 -0.262 0.237 -0.229 0.261 -0.024 0.256 0.210 0.258 0.210

Variable Asp Ser Glu Gly His Arg Thr Ala Pro Cys Tyr Val Met Lys Iso Leu Phe

PC9 0.248 0.558 0.219 -0.006 -0.138 -0.150 -0.059 -0.352 -0.159 0.342 -0.066 -0.145 -0.017 -0.014 -0.192 -0.233 -0.388

PC2 0.012 0.019 -0.013 0.074 -0.054 -0.208 -0.106 0.094 0.013 -0.242 -0.307 -0.021 0.659 0.110 0.396 0.110 -0.397 PC10 0.135 0.150 -0.332 -0.263 0.237 -0.316 -0.020 -0.169 -0.497 -0.258 0.125 -0.295 -0.070 0.295 0.114 0.120 0.243

PC3 0.150 -0.427 0.192 -0.067 -0.054 -0.157 -0.241 0.044 -0.054 0.568 0.356 -0.094 0.282 0.298 0.102 -0.081 0.141

PC11 0.150 0.054 -0.090 -0.328 -0.049 -0.411 0.028 0.359 -0.021 0.117 -0.271 0.264 0.227 -0.209 -0.499 0.094 0.219

PC4 0.032 -0.129 0.074 0.014 -0.235 -0.016 -0.013 0.016 -0.043 0.119 0.012 -0.328 -0.180 -0.120 -0.108 0.827 -0.234

PC12 -0.166 0.028 -0.073 0.411 -0.608 -0.369 -0.068 -0.012 -0.041 -0.045 -0.147 0.190 -0.255 0.344 0.040 -0.034 0.198

PC5 0.041 0.077 -0.161 -0.489 -0.200 -0.132 0.349 -0.040 0.248 0.275 -0.041 0.136 -0.214 -0.101 0.577 0.015 -0.026

PC13 0.682 -0.145 0.109 -0.045 -0.108 -0.013 0.125 -0.158 0.252 -0.391 0.247 0.292 -0.046 0.218 -0.123 0.067 -0.127

PC6 0.120 0.211 0.231 0.023 -0.192 0.094 -0.098 -0.347 0.246 -0.100 -0.073 -0.222 0.294 -0.251 0.119 0.123 0.639

PC14 -0.056 -0.341 0.175 0.248 0.262 -0.390 0.614 -0.293 0.059 0.044 -0.202 -0.200 0.026 -0.052 -0.092 -0.078 0.014

PC7 0.286 -0.100 -0.451 0.376 -0.178 0.067 0.138 -0.046 -0.359 0.119 0.215 0.117 0.164 -0.511 0.112 -0.056 -0.002

PC15 -0.066 0.427 -0.088 0.274 0.144 -0.283 0.164 0.360 0.390 0.014 0.530 -0.172 0.082 0.015 0.003 0.067 0.006

PC8 -0.265 0.082 -0.019 -0.207 -0.383 0.338 0.523 -0.019 -0.182 -0.039 0.199 -0.043 0.365 0.279 -0.240 -0.001 -0.000

PC16 0.136 0.008 -0.619 0.118 0.116 0.222 -0.039 -0.187 0.386 0.286 -0.289 -0.121 0.087 0.328 -0.187 0.072 0.017

Gambar 12.Window session hasil PCA gelatin standar dan marshmallow yang dibuat dengan gelatin standar.

Scree Plot of Asp; ...; Phe 16 14

Eigenvalue

12 10 8 6 4 2 0 2

4

6

8 10 Component Number

12

14

16

Gambar13. Hubungan antara principle component dan eigenvalue pada analisis gelatin dan marshmallow Score Plot of Asp; ...; Phe 2 1

Second Component

1

3

0

4

-1 2

-2 -4

-3

-2

-1 0 1 First Component

2

3

4

Gambar 14. Kurva yang menyatakan score plot PC1 dan PC2 berbagai sampel Keterangan: 1: Gelatin sapi ; 2: Gelatin babi ; 3: Marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi ; 4: Marshmallow yang dibuat dari gelatin babi

Berdasarkan hasil yang dapat dilihat pada gambar 14 dihasilkan suatu kurva score plot yang memuat nilai PC1dan PC2 untuk berbagai

sampel (gelatin standar dan marshmallow yang dibuat dari gelatin standar). Pada score plot, nilai PC1 dan PC2 dari berbagai sampel digunakan sebagai dasar pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi. Sebagai absis pada score plot adalah hasil perhitungan PC1 dari masing masing sampel dan sebagai ordinat adalah hasil perhitungan PC2 dari masing masing sampel. Semakin dekat letak antar sampel pada score plot, makin besar pula kemiripannya berdasarkan perhitungan PC1 dan PC2. Sampel dengan nilai score plote yang hampir sama mempunyai sifat fisika kimia yang hampir sama. Pada minitab, pengelompokan dilakukan berdasarkan posisi sampel pada score plot, apakah memiliki nilai PC1 dan PC2 yang positif ataukah negatif. Gambar 14 merupakan kurva yang menyatakan score plot PC1 dan PC2 dari berbagai sampel diantaranya : gelatin sapi, gelatin babi dan marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi dan babi. Dari score plot yang dihasilkan pada gambar 14, tampak bahwa marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi (titik 3) berada pada kuadran kiri atas yang memiliki nilai PC1 negatif dan PC2 positif. Marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi tersebut dapat terbedakan dari marshmallow yang dibuat dari gelatin babi (titik 4) yang berada pada kuadran kiri bawah yang keduanya memiliki nilai PC1 dan PC2 yang negatif. Dapat disimpulkan bahwa marshmallow yang terbuat dari gelatin sapi dan babi memiliki perbedaan sifat fisika kimia. Hal ini dapat dibedakan dengan baik oleh sistem HPLC dan dengan principal component analysis (PCA). Sementara itu gelatin sapi dan gelatin babi standar yang tidak diformulasi menjadi marshmallow (titik 1 dan 2) berada pada kuadran yang berbeda dengan marshmallow yang dibuat dari kedua gelatin tersebut. Hal ini berarti bahwa gelatin sapi dan gelatin babi memiliki sifat fisika kimia yang berbeda dengan marshmallow yang dibuat dari gelatin yang sama. Hal ini dapat disebabkan karena pada saat formulasi dilakukan pemanasan, pengadukan dan penambahan bahan bahan tambahan yang dapat mempengaruhi komposisi asam amino. Untuk melihat variabel asam

amino apa saja yang menyumbangkan nilai negatif atau positif terhadap principal component pertama dan kedua, dapat dilihat pada kurva biplot yang dihasilkan oleh proses PCA dengan Minitab gambar 15.

Biplot of Asp; ...; Phe 2 Met

Iso

Second Component

1

0

Lys Leu Ala Gly Ser Asp Glu Val His Thr

Pro

Arg Cys

Tyr Phe

-1

-2 -4

-3

-2

-1 0 1 First Component

2

3

4

Gambar 15. Kurva biplot

Variabel asam amino yang berkontribusi terhadap pembentukan besarnya nilai PC1 dan PC2 dapat dilihat dari kurva biplot gambar 15. berdasarkan kurva biplot tersebut, variabel yang berkontribusi positif terhadap pembentukan principal component pertama (PC1) adalah asam aspartat, serin, asam glutamat, glisin, histidin, arginin, treonin, alanin, sistein,valin, lisin, isoleusin, leusin, dan fenilalanin. Dan variabel yang berkontribusi negatif adalah prolin, tirosin dan metionin. Sementara itu untuk PC2 variabel- variabel yang memberikan nilai positif adalah asam aspartat, serin, glisin, alanin, prolin, metionin, lisin, isoleusin dan leusin. Asam amino lainnya seperti asam glutamat, histidin, arginin, treonin, sistein, tirosin, valin, dan fenilalanin berkontribusi negatif terhadap pembentukan principal component kedua.

Berkontribusi negatif, bukan berarti variabel - variabel tersebut akan mengganggu analisis pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi dalam marshmallow, melainkan hal ini disebabkan karena variabel- variabel yang berkontribusi negatif tersebut memiliki % tinggi puncak asam amino yang besar. Jadi semakin besar nilai % tinggi puncak asam amino tersebut, maka akan menghasilkan nilai PC1 dan PC2 yang semakin negatif. Untuk mengetahui variabel asam amino yang paling berpengaruh terhadap pembedaan gelatin sapi dan gelatin babi dapat dilihat dari kurva loading plot yang dihasilkan dari proses PCA. Loading plot ini digunakan untuk menentukan variabel asam amino yang paling berkontribusi dalam pembentukan nilai principal component. Semakin jauh suatu variabel dari titik asalnya (0,0) ,maka kontribusinya terhadap proses PCA akan semakin besar (Widyaninggar et al., 2011). Gambar 16 adalah kurva yang menunjukkan loading plot untuk PC1 dan PC2. Dari loading plot diketahui bahwa variabel asam aspartat, histidin, valin dan prolin memiliki jarak horisontal terjauh dari garis x = 0. Artinya variabel tersebut memiliki kontribusi paling besar terhadap pembentukan nilai PC1. Hal ini dapat dibuktikan dengan melihat window session (gambar12), yang mana asam aspartat, histidin, valin dan prolin merupakan variabel yang memiliki nilai koefisien yang paling mendekati ( + 1 ) atau

( - 1) dibandingkan variabel variabel lain, masing masing

bernilai 0.261, 0.261, 0.261 dan – 0.262. Sedangkan variabel – variabel yang berkontribusi paling besar terhadap pembentukan PC2 (memiliki jarak terjauh vertikal dari garis y = 0 adalah metionin, isoleusin dan fenilalanin dengan nilai koefisien masing masing 0.659, 0.396 dan - 0.397. Variabel variabel lain dengan nilai koefisien yang lebih kecil juga tetap berpengaruh pada nilai PC1 dan PC2 yang akhirnya juga berpengaruh pada score plot dan menentukan hasil pembedaan

gelatin

sapi

dan

gelatin

babi.

Walaupun

kontribusinya tidak sebesar variabel variabel utama diatas.

demikian

Loading Plot of Asp; ...; Phe 0.75

Met

Second Component

0.50

Iso

0.25 Lys Leu Ala Gly Ser Asp Glu Val His Thr

Pro

0.00

Arg Cys

-0.25

Tyr Phe

-0.50 -0.3

-0.2

-0.1

0.0 First Component

0.1

0.2

0.3

Gambar 16. Loading plot profil asam amino yang menyusun marshmallow

4.5 Analisis sampel marshmallow uji coba 1. Komposisi asam amino marshmallow uji coba Setelah dilakukan pembedaan terhadap marshmallow yang terbuat dari gelatin sapi dan gelatin babi, dilakukan pula analisis asam amino dalam marshmallow uji coba dengan teknik PCA. Sebelumnya telah dilakukan

perhitungan

konsentrasi

asam

amino

dalam

sampel

marshmallow uji coba. Hasil perhitungan disajikan dalam tabel 1.

2. Principal Component Analysis marshmallow uji coba Hasil analisa data PCA dari sampel marshmallow uji dapat dilihat pada kurva score plot yang dapat dilihat pada gambar 17. Score plot inilah yang menentukan dalam pembedaan atau pengklasifikasian hewan penghasil gelatin dalam marshmallow. Jika suatu sampel berada pada kuadran yang sama dengan kuadran dimana marshmallow gelatin sapi berada, hal ini berarti bahwa

berdasarkan analisis PCA yang dihasilkan dapat disimpulkan bahwa sampel tersebut memiliki kemiripan profil asam amino dengan marshmallow yang terbuat dari gelatin sapi. Begitu pula sebaliknya jika suatu sampel berada pada kuadran yang sama dengan marshmallow yang terbuat dari gelatin babi, maka hal ini berarti bahwa sampel tersebut memiliki kemiripan dengan gelatin babi. Score plot yang dihasilkan dari data profil asam amino marshmallow yang yang dibuat dari gelatin standar dan marshmallow uji coba akan ditampilkan dalam gambar 17.

Score Plot of Asp; ...; Phe

Second Component

2

1

1

3 6

0

5

4

-1

2

-2 -5.0

-2.5

0.0 First Component

2.5

5.0

Gambar 17. Kurva yang menyatakan score plot sampel marshmallow uji coba Keterangan: 1: Gelatin sapi ; 2: Gelatin babi ; 3: Marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi ; 4: Marshmallow yang dibuat dari gelatin babi ; 5: sampel 1 ; 6: sampel 2

Dari score plot diatas dapat dilihat bahwa sampel marshmallow gambar segitiga5 berada pada kuadran yang sama dengan dengan marshmallow yang dibuat dari gelatin babi. Hal ini berarti bahwa sampel 1 memiliki kemiripan secara fisika kimia dengan gelatin babi. Selain itu juga

sampel 2 gambar segitiga6 berada pada kuadran yang sama dengan sampel marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi. Hal ini menunjukkan bahwa sampel 2 memiliki kemiripan secara fisika kimia dengan gelatin sapi.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1

Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan sebagai berikut : 1. Sampel marshmallow yang dibuat dari gelatin sapi dan gelatin babi memiliki komposisi asam amino yang sama dengan kadar yang berbeda. Marshmallow yang terbuat dari gelatin babi memiliki kadar asam amino serin, asam aspartat, asam glutamat, glisin, histidin, arginin, treonin, alanin, valin, metionin, leusin dan fenilalanin yang lebih tinggi dibanding marshmallow dari gelatin sapi. 2. Analisis perbedaan gelatin babi dan gelatin sapi dengan metode HPLC yang dikombinasikan dengan PCA pada penelitian ini mampu membedakan komposisi asam amino pada sampel marshmallow uji coba dan sampel marshmallow yang dibuat di laboratorium dari gelatin sapi standar dan gelatin babi standar.

5.2

Saran 1.

Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap analisa komposisi asam amino pada marshmallow yang dibuat dari campuran gelatin sapi dan gelatin babi standar.

2.

Mencoba mengkombinasikan dengan analisis multivariat lainnya untuk

menjelaskan

marshmallow uji coba.

hewan

penghasil

gelatin

pada

sampel

DAFTAR PUSTAKA Abdi,H dan Williams,L.J. 2010. Principal component analysis. Willey interdisciplinary reviews. Amiza.M.A dan Aishah S.D.2011. Effect of Drying and freezing of Cobia (Rachycentron canadum) skin on its gelatin properties. International Food Research Journal 18 : 159 -166 Azira.N, Amin dan Che Man, Y.B.2012. Differentiation of bovine and porcine gelatins in processed products via sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis and principal component analysis (PCA) techniques. International Food Research Journal 19(3): 11751180 (2012) Bailey ,P.D.1990. An Introduction to peptide Chemistry. Wiley Interscience. New York Cai,H, Gu,X, Scanlan,M.S, Ramatlapeng,D.H, Lively,C.R. 2011. Real time PCR assays for detection and quantitation of porcine and bovine DNA in gelatin mixtures and gelatin capsules. Journal of food composition and analysis. YJFCA- 2154 Copeland,R.A. 1994.Methods for Protein Analysis : A Practical Guide to Laboratory Protocols.New York: Chapman & Hall Fadzlillah, N.A dan Che Man Y.B ., 2011. Halal Food Issues From Islamic and Modern Science Perspectives.International Conference onHumanities, Historical and Social Science.IPEDR vol 17.IACSIT Press, Singapore. Gilberga,Mariona Pinart. 2004. Time course of biochemical and histological changes for the assesment of inflammation and remodelling in a bleomycin induced murine model of lung injury. University of Barcelona. Hafidz,R.M, Che Man,Y.B.,Amin,I., Norfaizan,A. 2011. Chemical and functional properties of bovine and porcine skin gelatin. International Food Research Journal 18: 813- 817. Hou,S., Hehongbo., Zhang,W., Xie,H., Zhang,S. 2009. Determination of soil amino acids by high performance liquid chromatography- electro

spray ionization- mass spectrometry derivatized with 6- aminoquinolyl- Nhydroxysuccinimidyl carbamate.Journal talanta TAL -10657. Hilman,Y., Rahim,A.B., Musa,M.H dan Hashim,A. 2007. Principal Component Analysis of factors determining phospate rock dissolution on acid soils. Indonesian journal of agricultural science 8(1),2007;10-16. Jaswir,Irwandi.2007.Memahami gelatin , http//www.BeritaIptek.com Johnson,E.L dan Stevenson,R.1991.Dasar Kromatografi Cair. Bandung: ITB Jolliffe,I.T, 2002. Principal component analysis.2th edition.Springer: New York Karim,A.A dan Bhat.R.2009. Fish gelatin;properties,challeges,and prospects as an alternative to mammalian gelatin,Trends in food science and technology 19 (2008) 644 – 656. Khiari,Z. 2010. Functional and bioactive components from mackerel and blue whiting processing waste.School of food science and enviromental health Dublin Institute of Technology. Koolman,J dan Heinrich,K.1995.Biokimia.germany :Hipokrates. Masuda,A dan Dohmae,N. 2011. Amino acid analysis of sub- picomolar amounts of proteins by precolom fluoresence derivatization with 6 – aminoquinolyl –N- hydroxysuccinimidyl carbamate. Jepang. Bioscience Trends; 5(6):231 – 238. DOI: 10.5582/bst.v5.6.231 Miller,J.N, Miller,J.C. 2005. Statistics and chemometrics for analytical chemistry 5th edition.Pearson education prentice hall england. Munson,James.W. 1991.Analisis farmasi metode modern. Volume 11. Surabaya : Airlangga university press. Mursydi, Achmad. 2012. The Role of Chemical Analysis in the Halal Authentication of Food and Pharmaceutical Products.Journal Food Pharm.Sci,1 (2012).

Nemati,M, Oveisi,M.R., Abdollahi, H., Sabzevari,O., 2004, Differentiation of Bovine and Porcine Gelatins Using Principal Component Analysis, JPharm. Biomed. Anal. 34: 485 Nhari, R.M.H.R ., Ismail,A ., Che Man,Y.B. Analytical Methods for Gelatin Differentiation from Bovine and Porcine Origins and Food products,Journal in food science vol 71, Nr.1,2012. Norakasha,R., Hashim,D.M., Che Man,Y.B., Shuhaimi,M. 2009.Potential use of amino acids analysis for distinguishing bovine and porcine gelatins.International simposium on halal science and management. Perwitasari,D.S. 2008. Hidrolisis tulang sapi menggunakan HCl untuk pembuatan gelatin. Makalah seminar nasional soebardjo brotohardjono.ISSN 1978-0427. Poedjiadi,A dan Supriyanti,F.M.T.1997.Dasar dasar biokimia.Jakarta: UI press Rediatning,W, dan Kartini,N. 1987. Analisis Asam Amino dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi secara Derivatisasi Prakolom dan Pascakolom.Procedings ITB vol 20. Rohman,A dan Che Man,Y.B. 2011. Analysis of Pig Derivatives for Halal Authentication Studies,Food review international, 28:97-112. Rohman,A dan Sumantri, 2007. Analisis Makanan.Jogjakarta :Gadjah Mada University press. Roth,H.J dan Blaschke,G. 1988. Analisis farmasi. Gadjah Mada University press. Sartika,D. 2009. Pengembangan produk marshmallow dari gelatin kulit ikan kakap merah.Institut pertanian Bogor. Sahilah,A.M., Fadly,M.L., Norrakiah,A.S., Aminah,A., Aida,W., Khan,M.A .2012. Halal market surveillance of soft and hard gel capsules in pharmaceutical products using PCR and southern-hybridization on the biochip analysis.International Food Research Journal 19 (1) : 371-375 (2012).Malaysia.

See S.F., Hong P.K., Aida,W., Babji A.S. 2010. Physicochemical properties of gelatins extracted from skins of different freshwater fish species.International Food Research Journal 17:809-816 ( 2010). Singh,S., Rao,K.V.R., Venugopal,K., Manikandan,R. 2002. Alteration in dissolution characteristics of gelatin containing formulation.Pharmaceutical analysis of the national institute of pharmaceutical education and research. Sitompul,S. 2004. Analisis asam amino dalam tepung ikan dan bungkil kedelai. Buletin teknik pertanian Vol.9.Nomor 1. Stathis,D dan Myronidis,P. 2009. Principal component analysis of precipitation in thessaly region. Global NEST Journal, Vol 11, No 4, pp 467-476 Greece. Sudjadi.2007.Kimia farmasi analisis.yogyakarta:pustaka pelajar. Tavakolipour,H. 2011. Extraction and Evaluation of Gelatin From Silver Carp Waste. World Journal of Fish and Marine Science 3 ( 1 ) : 10 – 15 ,2011. Widyaninggar,A., Triwahyudi, Triyana,K., Rohman,A. 2012. Differentiation between porcine and bovine gelatin in commercial capsule shelss based on amino acid profiles and principal component analysis. Indonesian journal pharmacy Vol 23 No 2: 96-101.ISSN-p: 01261037.Yogyakarta. Winarno,F.G.1997.Kimia pangan dan gizi.jakarta.PT.gramedia pustaka utama. Wolinsky,I dan Driskel,J.A. 2005.Nutritional ergogenic aids: CRC press Yetim,H. 2011. International Journal of Health and Nutrition.Turki. Department of Medical Biochemistry.

LAMPIRAN 1 Sample name Injection volume Run time No

: std asam amino 100 pmol : 5 µl : 45 minutes

Peak Name

RT

Area

1 2 3 4

AMQ L- aspartic acid L- serine L- glutamic acid

10.084 12.658 13.964 14.861

796163 4725358 7375208 4940839

% Area 0.38 2.28 3.57 2.39

Height

Amount

39155 328333 476251 324100

% Height 0.22 1.88 2.73 1.86

5 6 7 8 9

Glycine L- Histidine NH3 L- agrinine L- threonine

15.999 16.569 17.806 20.150 20.629

5923590 8534760 20395978 7570931 8316656

2.86 4.13 9.86 3.66 4.02

356319 507073 858944 571513 603889

2.05 2.91 4.93 3.28 3.47

100.000 100.000 1.000 100.000 100.000

10 11 12

L- alanine L- proline AABA

21.941 24.128 25.583

8842355 5041137 11363621

4.27 2.44 5.49

584596 405750 1071118

3.36 2.33 6.15

100.000 100.000 1.000

13 14 15 16 17

L- cystine L- tyrosine L- valine L- metheonine L- lysin HCl

27.633 27.699 28.594 29.078 31.091

1019268 8231930 14748268 12584381 7599370

0.49 3.98 7.13 6.08 3.67

497306 986863 1495937 1262562 809252

2.85 5.67 8.59 7.25 4.65

50.000 100.000 100.000 100.000 100.000

18 19 20 21

L- isoleucine L- leucine L- phenylalanine Tryptophan

31.865 32.300 33.152 33.819

19617019 20950991 26845888 1437266

9.48 10.13 12.98 0.69

1826814 1796157 2492196 125251

10.49 10.31 14.31 0.72

100.000 100.000 100.000 49.160

1.000 100.000 100.000 100.000

LAMPIRAN 2

Sample name Injection volume Run time

: Gelatin sapi : 5 µl : 45 minutes

No

Peak Name

RT

Area

9.761 11.881 13.177 13.997

708258 16039621 21394630 24918290

% Area 0.12 2.79 3.72 4.33

1 2 3 4

AMQ L- aspartic acid L- serine L- glutamic acid

5 6 7 8 9

Glycine L- Histidine NH3 L- agrinine L- threonine

15.096 15.677 16.778 19.436 20.002

10 11 12

L- alanine L- proline AABA

13 14 15 16 17 18 19 20 21

Height

Amount

36095 1009473 1603097 1830570

% Height 0.08 2.28 3.62 4.14

16338949 28.38 8625827 1.50 10548343 1.83 40903415 7.11 13644046 2.37

9896232 453580 468553 3332733 1060693

22.35 1.02 1.06 7.53 2.40

2758.285 101.067 0.517 540.269 164.057

21.346 23.799 25.238

62042819 10.78 42216812 7.33 9215166 1.60

4464725 3933371 913612

10.09 8.88 2.06

701.655 837.446 0.811

L- cystine L- tyrosine L- valine L- metheonine L- lysin HCl

27.283 27.338 28.307 28.787 30.947

342014 2174592 30034506 7294368 13905875

0.06 0.38 5.22 1.27 2.42

172384 298158 2921563 722400 1520145

0.39 0.67 6.60 1.63 3.43

16.777 26.417 203.648 57.964 182.987

L- isoleucine L- leucine L- phenylalanin Tryptophan

31.659 32.105 32.963 33.823

24414185 46463888 37367547 -

4.24 8.07 6.49 -

2108369 4056106 3467990 -

4.76 9.16 7.83 -

124.454 221.774 139.193 -

0.890 339.437 290.088 504.333

LAMPIRAN 3 Sample name Injection volume Run time

: Gelatin babi : 5 µl : 45 minutes

No

Peak Name

RT

Area

1 2 3 4

AMQ L- aspartic acid L- serine L- glutamic acid

9.811 11.878 13.171 13.999

1123855 15116735 18256802 22348579

5 6 7 8 9

% Area 0.22 2.94 3.55 4.35

Height

Amount

69220 902904 1354318 1681012

% Height 0.17 2.28 3.42 4.24

Glycine L- Histidine NH3 L- agrinine L- threonine

15.084 140207575 27.27 8449729 15.672 7314828 1.42 414597 16.773 16400618 3.19 780853 19.440 40268248 7.83 3290739 19.994 13339987 2.59 982882

21.31 1.05 1.97 8.30 2.48

2366.936 85.706 0.804 531.880 160.401

10 11 12

L- alanine L- proline AABA

21.343 23.795 25.234

53510016 36426441 6475360

10.41 3830751 7.09 3377286 1.26 636306

9.66 8.52 1.60

605.156 722.584 0.570

13 14 15 16 17

L- cystine L- tyrosine L- valine L- metheonine L- lysin HCl

27.283 27.334 28.303 28.786 30.941

628498 3404317 26857898 4427060 11663669

0.12 0.66 5.22 0.86 2.27

300107 473287 2617457 427162 1274958

0.76 1.19 6.60 1.08 3.22

30.831 41.355 182.109 35.179 153.482

18 19

L- isoleucine L- leucine

31.652 32.098

16306635 37498003

3.17 7.29

1385449 3351937

3.49 8.45

83.125 178.980

20 21

L- phenylalanin Tryptophan

32.954 33.823

42496995 -

8.27 -

4045880 -

10.20 -

158.300 -

1.412 319.907 247.543 452.324

LAMPIRAN 4 Sample name Injection volume Run time

: marshmallow sapi : 5 µl : 45 minutes

No

Peak Name

RT

Area 614435 1696954 2883258 3265268

% Area 0.46 1.26 2.14 2.42

1 2 3 4

AMQ L- aspartic acid L- serine L- glutamic acid

10300 12.991 14.310 15.225

5 6 7 8 9

Glycine L- Histidine NH3 L- agrinine L- threonine

16.404 16.954 18.251 20.516 21.002

23926178 885442 4489223 6035782 2122878

10 11 12

L- alanine L- proline AABA

22.247 24.472 25.763

13 14 15 16 17

L- cystine L- tyrosine L- valine L- metheonine L- lysin HCl

18 19 20 21

L- isoleucine L- leucine L- phenylalanin Tryptophan

Height

Amount

33203 121715 191559 219331

% Height 0.37 1.36 2.14 2.45

17.73 0.66 3.33 4.47 1.57

1414275 53444 213447 482774 154007

15.80 0.60 2.38 5.39 1.72

388.533 9.333 0.506 68.004 22.962

7986963 47211480 8840363

5.92 34.98 6.55

680987 2240749 896721

7.61 25.03 10.02

94.950 51.747 0.200

27.714 27.851 28.765 29.263 31.240

2272961 5112206 1629194 1914926

1.68 3.79 1.21 1.42

139602 433820 141072 186584

1.56 4.85 1.58 2.08

19.480 25.695 9.424 22.158

32.136 32.589 33.505 34.163

2944106 5616870 5505656 -

2.18 4.16 4.08 -

275688 535437 537811 -

3.08 5.98 6.01 -

12.651 23.465 18.308 -

0.885 33.862 42.083 58.500

LAMPIRAN 5 Sample name Injection volume Run time No

Peak Name

: marshmallow babi : 5 µl : 45 minutes RT

Area

1 2 3 4

AMQ L- aspartic acid L- serine L- glutamic acid

10.307 12.991 14.330 15.230

519099 1660265 3215796 3245493

% Area 0.39 1.25 2.42 2.44

Height

Amount

29216 119040 218664 213891

% Height 0.33 1.32 2.43 2.38

5 6 7 8 9

Glycine L- Histidine NH3 L- agrinine L- threonine

16.398 16.970 18.254 20.518 20.988

24165712 1094526 5235244 6906986 2317577

18.17 0.82 3.94 5.19 1.74

1421537 58717 243553 550386 169445

15.81 0.65 2.71 6.12 1.89

392.423 11.537 0.591 77.820 25.068

10 11 12

L- alanine L- proline AABA

22.231 24.448 25.745

8132140 43840269 8237657

6.12 32.97 6.20

669202 2208364 837161

7.44 24.57 9.31

96.676 48.052 0.187

13 14 15 16 17

L- cystine L- tyrosine L- valine L- metheonine L- lysin HCl

27.714 27.843 28.750 29.244 31.218

2127837 5032998 1588133 1382216

1.60 3.79 1.19 1.04

146228 451998 108705 159938

1.63 5.03 1.21 1.78

18.236 25.297 9.186 15.994

18 19 20 21

L- isoleucine L- leucine L- phenylalanin Triptophan

32.104 32.557 33.469 34.163

2203661 5570354 6488936

1.66 4.19 4.88

214150 529916 638522

2.38 5.90 7.10

9.470 23.270 21.578

0.748 33.130 46.937 58.146

LAMPIRAN 6 Sample name Injection volume Run time

: sampel 1 : 5 µl : 45 minutes

No

Peak Name

RT

Area 692934 925023 1518456 1764392

% Area 0.63 0.84 1.39 1.61

1 2 3 4

AMQ L- aspartic acid L- serine L- glutamic acid

10.217 12.892 14.233 15.130

5 6 7 8 9

Glycine L- Histidine NH3 L- agrinine L- threonine

16.256 16.794 18.054 20.335 20.841

12288803 348373 5458137 2635256 989098

10 11 12

L- alanine L- proline AABA

22.114 24.325 25.700

13 14 15 16 17

L- cystine L- tyrosine L- valine L- metheonine L- lysin HCl

27.714 27.793 28.721 29.206 31.203

18 19 20 21

L- isoleucine L- leucine L- phenylalanine Tryptophan

32.071 32.525 33.428 34.163

Height

Amount

35881 68990 105020 119335

% Height 0.52 1.00 1.52 1.72

11.22 0.32 4.98 2.41 0.90

759326 22107 254717 209317 80404

10.96 0.32 3.68 3.02 1.16

199.556 3.672 0.616 29.691 10.698

4264615 51300574 13123427

3.89 46.84 11.98

372183 2360301 1346368

5.37 34.06 19.43

50.698 56.228 0.298

1918958 3425789 1512996 490735

1.75 3.13 1.38 0.45

110915 266197 87827 60104

1.60 3.84 1.27 0.87

16.446 17.219 8.752 5.678

1577141 3010512 2283866

1.44 2.75 2.09

148253 292498 230200

2.14 4.22 3.32

6.777 12.576 7.595

0.998 18.458 22.163 31.611

LAMPIRAN 7 Sample name Injection volume Run time

: sampel 2 : 5 µl : 45 minutes

No

Peak Name

RT

Area 709492 798024 1341155 1520600

% Area 0.74 0.83 1.39 1.58

1 2 3 4

AMQ L- aspartic acid L- serine L- glutamic acid

10.195 12.871 14.180 15.072

5 6 7 8 9

Glycine L- Histidine NH3 L- agrinine L- threonine

16.230 16.767 18.022 20.347 20.852

10796436 347133 4182220 2377408 960800

10 11 12

L- alanine L- proline AABA

22.117 24.325 25.690

13 14 15 16 17

L- cystine L- tyrosine L- valine L- metheonine L- lysin HCl

27.714 27.776 28.715 29.206 31.199

18 19 20 21

L- isoleucine L- leucine L- phenylalanin Tryptophan

32.067 32.521 33.423 34.163

Height

Amount

35772 57364 89683 104768

% Height 0.58 0.94 1.46 1.71

11.23 0.36 4.35 2.47 1.00

657630 21928 198957 193300 73993

10.72 0.36 3.24 3.15 1.21

175.321 3.659 0.472 26.786 10.392

3787271 45852955 9653326

3.94 47.68 10.04

329845 2268709 970262

5.38 36.98 15.82

45.023 50.258 0.219

1744029 3442218 1570664 767050

1.81 3.58 1.63 0.80

108454 251121 93239 65002

1.77 4.09 1.52 1.06

14.947 17.301 9.085 8.876

1261312 2560646 2500534

1.31 2.66 2.60

118193 250148 245873

1.93 4.08 4.01

5.420 10.697 8.315

1.022 15.924 19.575 27.243

LAMPIRAN 8 Rekaman pengujian asam amino HPLC Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : (gelatin sapi)

Analit

Cstd

BM

AMQ

Area std

Area sampel

796163

708258

mg/100 gr

AA (mg/kg)

AA (%)

L-aspartic acid

100

133.1

4725358

16039621

4471.29

44712.91

4.471

L-serine

100

105.09

7375208

21394630

3017.08

30170.84

3.017

L-glutamic acid

100

147.13

4940839

24918290

7343.69

73436.89

7.344

Glycine

100

75.07

5923590

16338949

20492.79

204927.8

20.49

L-histidine

100

155.16

8534760

8625827

1551.98

15519.75

1.552

20395978

10548343

NH3 L-arginine

100

174.29

7570931

40903415

9319.19

93191.93

9.319

L-threonine

100

119.12

8316656

13644046

1934.08

19340.81

1.934

L-alanine

100

89.1

8842355

62042819

6187.24

61872.38

6.187

L-proline

100

115.13

5041137

42216812

9542.03

95420.34

9.542

11363621

9215166

AABA L-cystine

50

121.16

1019268

342014

201.18

2011.78

0.201

L-tyrosine

100

181.19

8231930

2174592

473.70

4737.03

0.474

L-valine

100

117.15

14748268

30034506

2361.12

23611.16

2.361

L-methionine

100

149.21

12584381

7294368

855.95

8559.52

0.856

L-lysine HCl

100

146.19

7599370

13905875

2647.49

26474.88

2.647

L-isoleucine

100

131.18

19617019

24414185

1615.74

16157.43

1.616

L-leucine

100

131.18

20950991

46463888

2879.22

28792.15

2.879

L-phenylalanine

100

165.19

26845888

37367547

2275.60

22756.01

2.276

Triptophan

49.1 6

204.23

1437266

0

0.00

0.00

0.000 77.169

Bobot sampel

0,1178

Volu m 1µl 5000 0

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

500

1000

Total asam amino tanpa tryptophan

LAMPIRAN 9

Rekaman pengujian asam amino HPLC Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : (gelatin babi) Analit

Cstd

BM

AMQ

Area std

Area sampel

796163

1123855

mg/100 gr

AA (mg/kg)

AA (%)

L-aspartic acid

100

133.1

4725358

15116735

5258.48

52584.78

5.258

L-serine

100

105.09

7375208

18256802

3212.70

32127.03

3.213

L-glutamic acid

100

147.13

4940839

22348579

8218.81

82188.15

8.219

Glycine

100

75.07

5923590

14020757

21943.79

219437.9

21.94

L-histidine

100

155.16

8534760

7314828

1642.30

16422.96

1.642

20395978

16400618

NH3 L-arginine

100

174.29

7570931

40268248

11448.40

114483.9

11.44

L-threonine

100

119.12

8316656

13339987

2359.66

23596.64

2.360

L-alanine

100

89.1

8842355

53510016

6658.92

66589.17

6.659

L-proline

100

115.13

5041137

36426441

10273.90

102739.0 4

10.27

11363621

6475360

AABA L-cystine

50

121.16

1019268

628498

461.32

4613.21

0.461

L-tyrosine

100

181.19

8231930

3404317

925.38

9253.83

0.925

L-valine

100

117.15

14748268

26857898

2634.71

26347.05

2.635

L-methionine

100

149.21

12584381

4427060

648.25

6482.47

0.648

L-lysine HCl

100

146.19

7599370

11663669

2770.98

27709.8

2.771

L-isoleucine

100

131.18

19617019

16306635

1346.66

13466.59

1.347

L-leucine

100

131.18

20950991

37498003

2899.55

28995.4

2.900

L-phenylalanine

100

165.19

26845888

42496995

3229.41

32294.08

3.229

Triptophan

49.1 6

204.23

1437266

0

0.00

0.00

0.00 85.93

Bobot sampel

0,1178

Volu m 1µl 5000 0

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

500

1000

Total asam amino tanpa tryptophan

LAMPIRAN 10 Rekaman pengujian asam amino HPLC Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : 209.2239 (marshmallow sapi) Analit

Cstd

BM

AMQ

Area std

Area sampel

694072

614435

mg/100 gr

AA (mg/kg)

L-aspartic acid

100

133.1

5011375

1696954

496.18

L-serine

100

105.09

6851302

2883258

486.88

4868.80

0.487

L-glutamic acid

100

147.13

5581628

3265268

947.57

9475.65

0.948

Glycine

100

75.07

6158082

23926178

3211.03

32110.29

3.211

L-histidine

100

155.16

9487098

885442

159.42

1594.25

0.159

NH3

8864900

4961.82

AA (%)

0.496

4489223

L-arginine

100

174.29

8875606

6035782

1304.84

13048.42

1.305

L-threonine

100

119.12

9245295

2122878

301.12

3011.19

0.301

L-alanine

100

89.1

8411766

7986963

931.37

9313.70

0.931

L-proline

100

115.13

51570488

47211480

1160.34

11603.39

1.160

13820010

8840363

AABA L-cystine

50

121.16

1432643

0

0.00

0.00

0.000

L-tyrosine

100

181.19

11668301

2272961

388.57

3885.69

0.389

L-valine

100

117.15

19895558

5112206

331.39

3313.94

0.331

L-methionine

100

149.21

17288139

1629194

154.80

1548.01

0.155

L-lysine HCl

100

146.19

8642058

1914926

356.62

3566.17

0.357

L-isoleucine

100

131.18

23270818

2944106

182.71

1827.09

0.183

L-leucine

100

131.18

23937655

5616870

338.87

3388.68

0.339

L-phenylalanine

100

165.19

30072227

5505656

332.95

3329.49

0.333

Triptophan

49.1 6

204.23

1275052

0

0.00

0.00

0.000 11.08

Bobot sampel

0.1420

Volu m 1µl 5000 0

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

500

1000

Total asam amino tanpa tryptophan

LAMPIRAN 11 Rekaman pengujian asam amino hplc Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : 209.2240 (marshmallow babi) Analit

Cstd

BM

AMQ

Area std

Area sampel

694072

519099

mg/100 gr

AA (mg/kg)

L-aspartic acid

100

133.1

5011375

1660265

518.05

L-serine

100

105.09

6851302

3215796

579.50

5795.00

0.579

L-glutamic acid

100

147.13

5581628

3245493

1005.07

10050.73

1.005

Glycine

100

75.07

6158082

24165712

3460.96

34609.63

3.461

L-histidine

100

155.16

9487098

1094526

210.30

2103.05

0.210

NH3

8864900

5180.54

AA (%)

0.518

5235244

L-arginine

100

174.29

8875606

6906986

1593.45

15934.54

1.593

L-threonine

100

119.12

9245295

2317577

350.81

3508.12

0.351

L-alanine

100

89.1

8411766

8132140

1011.98

10119.80

1.012

L-proline

100

115.13

51570488

43840269

1149.84

11498.39

1.150

13820010

8237657

AABA L-cystine

50

121.16

1432643

0

0.00

0.00

0.000

L-tyrosine

100

181.19

11668301

2127837

388.19

3881.87

0.388

L-valine

100

117.15

19895558

5032998

348.17

3481.68

0.348

L-methionine

100

149.21

17288139

1588133

161.03

1610.32

0.161

L-lysine HCl

100

146.19

8642058

1382216

274.70

2746.96

0.275

L-isoleucine

100

131.18

23270818

2203661

145.94

1459.41

0.146

L-leucine

100

131.18

23937655

5570354

358.63

3586.29

0.359

L-phenylalanine

100

165.19

30072227

6488936

418.76

4187.63

0.419

Triptophan

49.1 6

204.23

1275052

0

0.00

0.00

0.000 11.97

Bobot sampel

0.1428

Volu m 1µl 5000 0

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

500

1000

Total asam amino tanpa tryptophan

LAMPIRAN 12 Rekaman pengujian asam amino hplc Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : 209.2236 ( sampel 1)

Analit

Cstd

BM

AMQ

Area std

Area sampel

694072

692934

mg/100 gr

AA (mg/kg)

AA (%)

L-aspartic acid

100

133.1

5011375

925023

219.63

2196.29

0.220

L-serine

100

105.09

6851302

1518456

208.21

2082.12

0.208

L-glutamic acid

100

147.13

5581628

1764392

415.77

4157.68

0.416

Glycine

100

75.07

6158082

12288803

1339.20

13392.03

1.339

L-histidine

100

155.16

9487098

348373

50.93

509.34

0.051

8864900

5458137

NH3 L-arginine

100

174.29

8875606

2635256

462.61

4626.08

0.463

L-threonine

100

119.12

9245295

989098

113.93

1139.25

0.114

L-alanine

100

89.1

8411766

4264615

403.82

4038.18

0.404

L-proline

100

115.13

51570488

51300574

1023.82

10238.24

1.024

13820010

13123427

AABA L-cystine

50

121.16

1432643

0

0.00

0.00

0.000

L-tyrosine

100

181.19

11668301

1918958

266.38

2663.84

0.266

L-valine

100

117.15

19895558

3425789

180.33

1803.28

0.180

L-methionine

100

149.21

17288139

1512996

116.74

1167.36

0.117

L-lysine HCl

100

146.19

8642058

490735

74.21

742.10

0.074

L-isoleucine

100

131.18

23270818

1577141

79.48

794.77

0.079

L-leucine

100

131.18

23937655

3010512

147.48

1474.83

0.147

L-phenylalanine

100

165.19

30072227

2283866

112.15

1121.51

0.112

Triptophan

49.1 6

204.23

1275052

0

0.00

0.00

0.000 5.215

Bobot sampel

0,1178

Volu m 1µl 5000 0

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

500

1000

Total asam amino tanpa tryptophan

LAMPIRAN 13 Rekaman pengujian asam amino hplc Metode acuan : Waters AccQ.Tag Chemistry Package Instructur Manual No.sampel : 209.2237 (sampel 2) Analit

Cstd

BM

AMQ

Area std

Area sampel

694072

709492

mg/100 gr

AA (mg/kg)

AA (%)

L-aspartic acid

100

133.1

5011375

798024

108.45

1084.48

0.108

L-serine

100

105.09

6851302

1341155

105.26

1052.57

0.105

L-glutamic acid

100

147.13

5581628

1520600

205.09

2050.87

0.205

Glycine

100

75.07

6158082

10796436

673.42

6734.18

0.673

L-histidine

100

155.16

9487098

347133

29.05

290.49

0.029

8864900

4182220

NH3 L-arginine

100

174.29

8875606

2377408

238.87

2388.70

0.239

L-threonine

100

119.12

9245295

960800

63.34

633.40

0.063

L-alanine

100

89.1

8411766

3787271

205.26

2052.58

0.205

L-proline

100

115.13

51570488

45852955

523.77

5237.67

0.524

13820010

9653326

AABA L-cystine

50

121.16

1432643

0

0.00

0.00

0.000

L-tyrosine

100

181.19

11668301

1744029

138.57

1385.68

0.139

L-valine

100

117.15

19895558

3442218

103.71

1037.07

0.104

L-methionine

100

149.21

17288139

1570664

69.36

693.61

0.069

L-lysine HCl

100

146.19

8642058

767050

66.39

663.91

0.066

L-isoleucine

100

131.18

23270818

1261312

36.38

363.80

0.036

L-leucine

100

131.18

23937655

2560646

71.80

717.99

0.072

L-phenylalanine

100

165.19

30072227

2500534

70.28

702.80

0.070

Triptophan

49.1 6

204.23

1275052

0

0.00

0.00

0.000 2.709

Bobot sampel

0.2798

Volu m 1µl 5000 0

Pemipet an (µl)

Volume 2(µl)

500

1000

Total asam amino tanpa tryptophan

LAMPIRAN 14 Pembuatan Larutan Baku Pipet 40 µl mix standar asam amino, lalu tambahkan 40 µl standar internal AABA, 920 µl aquabides kemudian di homogenkan. Ambil 10 µl standar, lalu tambahkan 70 µl AccQ.Fluor borat , vortex dan diamkan selama 1 menit. Kemudian inkubasi selama 10 menit pada suhu 550 C lalu suntikkan pada HPLC.

Perhitungan kadar asam amino gelatin sapi: Kadar asam amino dalam (mg / 100 gram) (Area komponen / area AABA)sampel x Cstd x BM x fp

x 100%

(Area komponen / area AABA)standar x 1000000 x gr x 1000 Asam aspartat = 16039621 /9215166 x 100 x 133.1 x100.000 x 100 % 4725358 /11363621 x 1000000 x 0.1246 x 1000 = 231.669 / 5.1812 x 100% = 4471.3 mg /100 gr